AT205173B - Verfahren zur Herstellung von Laevanen bestimmter Molekulargewichte - Google Patents

Description

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  Verfahren zur Herstellung von Laevanen bestimmter
Molekulargewichte 
In letzter Zeit sind Laevan-Präparate für verschiedene pharmazeutische Anwendungsgebiete vorgeschlagen worden (vgl. deutsche Patentschrift Nr. 948910 und deutsche Patentschrift Nr. 1011578),   z. B.   als Verdickungsmittel, Blutersatzflüssigkeiten, Zuschläge für Tabletten usw. 



   Die Verwendung von Laevanen für pharmazeutische und technische Zwecke ist in erster Linie von der Molekülgrösse der verwendeten Präparate abhängig. 



   Zur Kennzeichnung der Molekülgrösse werden im folgenden die Begriffe"niedermolekulare Laevane", "Laevane für Blutersatzzwecke" und "hochmolekulare Laevane" verwendet werden. Sie werden durch ihre Methanollöslichkeit und die Ausscheidung aus der Blutbahn des Kaninchens definiert. 



   "Niedermolekulare   Laevane" sind nach Entfernung   von dialysablenStoffen in   70-80'. gem Methanol   
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 bahn ausgeschieden. 



   "Hochmolekulare Laevane" sind bereits in niedrigeren Methanol-Konzentrationen unlöslich und wer- 
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 zen kann man die relative Viskosität gegen Wasser als ungefähres Mass für die   Molekülgrösse   heranziehen, jedoch ist zu beachten, dass im Falle des Laevans die Viskosität wahrscheinlich auch von der   MolekUlgestalt   abhängig ist. 



     "Niedermolekulare*'und"hochmolekulare Laevane"können   als Verdickungsmittel, Zuschläge für Tabletten usw. verwendet werden. 



   Es ist bekannt, zur Herstellung relativ einheitlicher Fraktionen von Laevan dem Laevansucrase-Rohrzuckergemisch   sogenannte"Primer-Laevane"-das   sind Laevane verschiedenen, jedoch definierten Molekulargewichts - als Fructosylacceptoren zuzusetzen (vgl. Appl. Microbiology 3, 321-333 (1955)). Ferner ist es möglich, innerhalb gewisser Grenzen Jaevane höheren oder niederen Molekulargewichts durch Variation des pH. der Enzymkonzentration, Rohrzuckerkonzentration und Temperatur des Reaktidnsgemisches zu erhalten. Mit diesen Verfahren ist es jedoch nicht in jedem Falle möglich, ein   Laevan-Prä-   parat mit bestimmtem gewünschten Molekulargewicht in brauchbarer Ausbeute zu gewinnen. 



   Demgegenüber betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren, das es ermöglicht, die Biosynthese des Laevans so zu lenken, dass vorwiegend Laevane gewünschter   Molekülgrösse   gebildet werden. Es ist dabei möglich, die Reaktion auf Gewinnung entweder niedermolekularer oder Laevane mittleren oder höheren Molekulargewichts auszurichten. 



   Der Erfindung liegt die Beobachtung zugrunde, dass das Laevan synthetisierende Ferment, die Laevansucrase, an verschiedene Stoffe adsorbiert werden und in diesem Zustand in Gegenwart von-Rohrzucker Laevan bilden kann, und dass die adsorptive Bindung des Ferments durch anorganische und organische Ionen gelockert bzw. aufgehoben werden kann. 

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   Ist das Adsorptionsmittel im Überschuss vorhanden und somit das Ferment nahezu quantitativ adsorbiert, so erhält man ein Laevan mit extrem hohem Molekulargewicht. 



   Sehr niedermolekulares Laevan erhält man mit   nichtadsorbierter Laevansucrase.   



   Zur Erzeugung von   Laevanen   eines Molekulargewichtes, wie es für Blutersatzzwecke geeignet ist, ist es erforderlich, nur einen Teil der Laevansucrase zu adsorbieren, indem man entweder die Menge an adsorbierenden Stoffen verringert oder die Konzentrationan Ionen erhöht. 



   An Polysaccharide, die für Blutersatzpräparate benötigt werden, sind die höchsten Anforderungen in bezug auf Reinheit zu stellen. Unter konsequenter Anwendung kolloidchemischer Verfahren ist es möglich, das erfindungsgemäss hergestellte Laevan soweit zu reinigen, dass alle Träger unerwünschter biologischer Reaktionen entfernt werden. An solchen Stoffen sind in erster Linie zu nennen : Pyrogene, Antigene, unspezifische stickstoffhaltige Verbindungen, Schwermetalle usw. Eine 6,0   sigle   Lösung von reinem Laevan in Tyrode-Lösung oder physiologischer Kochsalzlösung wird von folgenden Versuchstieren ohne jede Reaktion vertragen: Hund, Katze, Kaninchen, Meerschweinchen, Ratte, Maus. 



   Die Stoffe, welche Laevansucrase adsorbieren, können ausserordentlich verschiedenartiger Natur sein. 



  Sehr geeignet ist frisch gefälltes Calciumphosphat-Gel. Weitere Adsorptionsmittel für Laevansucrase, durch die die Laevanbildung spezifisch beeinflusst wird, sind in der Tabelle des Beispiels 5 dargestellt. Für die Praxis ist es wichtig, dass komplexe, denaturierte Eiweissstoffe, wie sie   z. B.   beim Erhitzen neutralisierten Maisquellwassers ausflocken, ein gutes Adsorptionsvermögen für Laevansucrase besitzen. Abgestufte Mengen dieses   denaturierten Eiweisses   in der   Nährlösung   kann man leicht dadurch   erhalten, dass   man einen Teil des Maisquellwasser : nach einer separaten Sterilisation filtriert. 



   Prinzipiell kann das erfindungsgemässe Verfahren entweder aufwachsende Kulturen solcher Mikroorganismen angewendet werden, die Laevansucrase ausscheiden oder aber auf zellfreie Enzymlösungen. In der Praxis wird man allerdings berücksichtigen müssen, dass in wachsenden Kulturlösungen   vonLaevanbild-   nern komplexe und sich ständig ändernde Reaktionsverhältnisse vorliegen. 



     Bei s Die 1 1 :   Eine Nährlösung folgender Zusammensetzung wird 40   Minuten bei 1100C sterilisiert :     1'ge   Maisquellwasserlösung (bezogen auf Trockensubstanz) vor der Herstellung der   Närhlösung   mit 
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    PHl'ge Maisquellwasserlösung (bezogen   auf Trockensubstanz) mit KOH auf PH 6,8-7, 0 eingestellt :
4 Liter = Lösung B 
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<tb> 
<tb> Rohrzucker <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> kg <SEP> 
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 20 <SEP> g
<tb> sekundäres <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Ammoniumsulfat <SEP> 30 <SEP> g
<tb> 
   Die : le   sterilisierte Nährlösung wird nach Abkühlung mit einer Suspension von Bac. subtilis beimpft. 



  Nach der Beimpfund des Fermentationsansatzes wird 1,0% CaCC3 in Form einer 50%igen sterilen Suspension in Wasser zugesetzt. Nach   16-stündiger Kultivierung   bei 28, 5 C mit Belüftung erfolgt ein unsteriler Zusatz von 2, 0 kg trockenen Rohrzuckers und der auf 5, 4-5, 6 abgesunkene pH-Wert der Kultur wird von diesem Zeitpunkt an durch häufige Zusätze von 25%iger Na2CO3-Lösungs auf pH 6,3-6, 6 gehalten. Nach einer Kulturdauer von 23 Stunden erfolgt ein weiterer Zusatz von 3,0 kg Rohrzucker. Nach einer Kulturdauer von insgesamt 39 Stunden ist die Fermentation beendet. 



   Die Kulturlösung wird   liner   Kieselgur filtriert und das Laevan nach üblichen Methoden rein dargestellt und getrocknet. 



   Die relative   Viskosität   einer 6,   0'gen Lösung   dieses Präparates in 0,   9o/aiger NaCl-Lösung   bei   210C   gegen Wasser betrug 5,2. 



   Einem Kaninchen wurden 25 cm3 dieser Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren 40% des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 



   Beispiel 2 : Versuchsanordnung wie in Beispiel 1; jedoch 100% Maisquellwasserlösung B. 



   Die relative Viskosität einer   6% gen   Lösung dieses Präparates in 0, 9%iger NaC1-Lösung bei   210C   gegen Wasser betrug 19, 1, die einer   gen   Lösung in 0,   9%iger NaCl-Lösung 4,   7. 



   Einem Kaninchen wurden 50   cm'der 3%igen   Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren 16% des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 

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   Beispiel 3 : Versuchsanordnung wie in Beispiel 1 ; jedoch 100% Maisquellwasserlösung A. 



   Die relative Viskosität einer 6%igen Lösung dieses Präparates in 0,   9%figer     Na Cl-Lösung   bei   210C   geen Wasser betrug 3,   0.   



   Einem Kaninchen wurden 25 cm dieser Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren 72   %   des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 



   Beispiel 4: 1 1 zellfreies, Laevansucrase enthaltendes Kulturfiltrat vom Bac. subtilis (=Enzymlörung) wird mit 200 cm abgeschleudertem, frisch gefälltem, durch mehrfaches   Zentrifugieren und Re-   iuspendieren in Wasser gewaschenem Calciumphosphat-Gel zirka 10 Minuten ausgerührt. Die so ge-   wonnene   Suspension wird wiederum zentrifugiert, die überstehende Lösung verworfen und der Niederschlag   Ln 11   Wasser resuspendiert. In dieser Suspension werden 300 g Rohrzucker gelöst und der Ansatz 20 Stunlen bei 290C gehalten. Das durch das entstandene Laevan stark viskos gewordene Reaktionsgemisch wird wie die Kulturlösung des Beispiels 1 auf trockenes Laevan aufgearbeitet. 



   Die relative Viskosität einer 3%igen Lösung dieses Präparates in 0, piger   NaCl-Lösung   bei   21 C   ge-   en   Wasser betrug 7,7. 



   Einem Kaninchen wurden 50 cm3 einer   zogen   Lösung in 0,   91piger     NaCl-Lösung 1. v.   gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren 11% des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 



     Beispiel 5 :   In der gleichen Versuchsanordnung wie in Beispiel 4 wurde eine Reihe weiterer Substanzen zur Anwendung gebracht. Die genaueren Versuchsbedingungen und die Ergebnisse sind in der Folgenden Tabelle zusammengestellt : 
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<tb> 
<tb> Adsorptionsmittel <SEP> g <SEP> Adsorptions- <SEP> g <SEP> Rohrzucker <SEP> Relative <SEP> Viskosität
<tb> für <SEP> Laevansucrase <SEP> mittel <SEP> pro <SEP> l <SEP> pro <SEP> l <SEP> Adsor- <SEP> einer <SEP> 3-bzw.

   <SEP> 6%igen
<tb> Enzymlösung <SEP> bat-Suspension <SEP> Lösung <SEP> des <SEP> isolierten
<tb> Laevans
<tb> Aktiv-Bentonit <SEP> 40 <SEP> 150 <SEP> 6%= <SEP> 4,0
<tb> Aktiv-Kohle <SEP> 30 <SEP> 300 <SEP> 3%= <SEP> 8, <SEP> 1
<tb> Asbest <SEP> 5 <SEP> 300 <SEP> 6%= <SEP> 15,3
<tb> Zellulosepulver <SEP> 80 <SEP> 300 <SEP> 3%= <SEP> 8,0
<tb> Kieselgur <SEP> 40 <SEP> 150 <SEP> 6% <SEP> = <SEP> 3,5
<tb> Silicagel <SEP> 40 <SEP> 150 <SEP> 3% <SEP> = <SEP> 3, <SEP> 1 <SEP> 
<tb> Al-hydroxyd <SEP> 80 <SEP> 150 <SEP> 3%= <SEP> 8, <SEP> 1
<tb> Stärke <SEP> 80 <SEP> 150 <SEP> 6% <SEP> = <SEP> 7,5
<tb> Sojamehl <SEP> 80 <SEP> 150 <SEP> 6% <SEP> = <SEP> 7, <SEP> 3
<tb> Mg-Phosphat <SEP> 40 <SEP> 150 <SEP> 6% <SEP> = <SEP> 6, <SEP> 4
<tb> La-ribonucleat <SEP> 40 <SEP> 150 <SEP> 6% <SEP> = <SEP> 6,2
<tb> 
 
Beispiel 6 :

   Versuchsanordnung wie in Beispiel 4 ; jedoch erhält der Ansatz zusätzlich 50 gNaCl. 



    ! s   entsteht ein relativ niederviskoses Reaktionsgemisch, welches wie die Kulturlösung des Beispiels 1 auf : rockenes Laevan aufgearbeitet wird. 



   Die relative Viskosität einer   61eigen   Lösung dieses Präparates in 0,9%iger NaC1-Lösung bei 210C ge-   en   Wasser betrug 3,   8.   



   Einem Kaninchen wurden 25 cm dieser Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion wa- 'en 69% des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 



     Beispiel 7 : In 11 Hnzyrnlösung,   wie sie in Beispiel 4 verwendet wurde, werden 40 en gewascheles, zentrifugiertes Calciumphosphat-Gel suspendiert und in der erhaltenen Suspension 300 g Rohrzucker 
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 les Beispiels 1 auf trockenes Laevan aufgearbeitet. 



   Die relative Viskosität einer 6%igen Lösung dieses Präparates in 0,   zeiger   NaC1-Lösung bei   21 C   geyen Wasser betrug 4,9. 



   Einem Kaninchen wurden 25 cms dieser Lösung i. v. gespritzt. Drei Stunden nach der Injektion waren   t6%   des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 



   Beispiel 8: In 1 1 Enzymlösung werden ohne weitere Zusätze 300 g   Rohrzucker gelöst.   Der Ansatz   njd   20 Stunden bei 29 C gehalten. Das recht nieder-viskose Reaktionsgemisch wird wie die Kulturlösung 

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 des Beispiels 1 auf trockenes Laevan aufgearbeitet. Die relative Viskosität einer   6% eigen   Lösung dieses Präparates in 0,   9% tger Nad-Lösung   gegen Wasser bei   210C   betrug 2,9. 



   Einem Kaninchen wurden 25   cms   dieser Lösung   1. v. gespritzt. Drei Stunden   nach der Injektion waren 72% des insgesamt gespritzten Laevans aus der Blutbahn ausgeschieden. 



   Beispiel 9 : Der Fermentationsansatz wird wie in Beispiel   1,   jedoch statt im 20 Liter-Massstab in einem   200 Liter-Ansatz durchgeführt. Nach Beendigung der   Fermentation wird   der Kulturlösung   die gleiche Volumenmenge Methanol zugesetzt. Das Volumen beträgt nun zirka 400 1. Diese Lösung wird mit zirka 10   l   abgeschleudertem, frisch gefälltem, durch mehrfaches Zentrifugieren und Resuspendieren in Wasser gewaschenem Calciumphosphatgel ausgerührt und über ein   Kiese1gurfilter   filtriert. 



  Die so geklärte Lösung wird solange unter Rühren mit weiterem Methanol versetzt, wie noch Laevan ausfällt. Der Niederschlag wird isoliert, in 200   l   Wasser gelöst und nacheinander über einen Kationen- und Anionen-Austauscher entsalzt. Aus der ionenfreien Lösung gewinnt man das Laevan als 
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  Der Aufarbeitungsvorgang ist in der Zeichnung schematisch dargestellt. 



   60 g des gewonnenen Laevans werden mit Tyrodelösung auf 1, 01 aufgefüllt. Nach Lösung des Präparates wird sterilisiert. 



   Die relative Viskosität dieser Lösung   gegen Wasser b. eträgt 4, 8. Im Kaninchenversuch wurden nach   Injektion von 25   cm5 38So   des insgesamt je Tier verabfolgten Laevans nach drei Stunden aus der Blutbahn ausgeschieden. 



   Dieses Gesamtverfahren wird an Hand der Zeichnung verdeutlicht. 



   Das Impfgut gelangt aus dem Kulturgefäss 1 in den Fermenter 2. Von dort wird die Kulturbrühe nach beendeter Fermentation in den Kessel   t   geleitet, und dort mit   Calciumphosphatgel   und Methanol gerührt. 



  Das Gemisch wird sodann über das Kieselgurfilter 4 in den Fällkessel 5 übergeführt. Es wird mit Methanol gefällt und das Sediment nach Entfernung der überstehenden Lösung im gleichen Kessel in Wasser gelöst. 



  Die Lösung gelangt über die Ionenaustauscher 6 und 7 in die Sprühtrocknungsapparatur 8. Schliesslich wird das getrocknete Produkt konfektioniert (9). 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung von Laevanen, insbesondere für Blutersatzzwecke, durch gelenkte biologische Synthese, wobei Kulturen laevanbildender Mikroorganismen bzw. die aus solchen Kulturen gewonnenen zellfreie Enzymansätze Verwendung finden, und gegebenenfalls daraus hergestellten therapeutisch verwendbaren Lösungen, dadurch gekennzeichnet, dass durch die Menge eines den Kulturen zugesetzten Laevansucrase-Adsorptionsmittels, beispielsweise AkLivbentonit, Aktivkohle, Asbest, Zellulosepulver, Kieselgur, Silicagel, Aluminiumhydroxyd,   Stärke,-Sojamehl,   Magnesiumphosphat oder Lanthanribonucleat, insbesondere die beim Erwärmen, vorzugsweise Sterilisieren von Maisquellwasser ausfallenden Denaturierungsprodukte oder Calciumphosphatgel, die Grösse eines vorzugsweise mittleren Molekulargewichtes, von z.

   B. 65000, der Laevane und insbesondere damit deren Ausscheidungszeit eingestellt wird, wobei umsomehr Adsorptionsmittel verwendet wird, je grösser das gewünschte Molekulargewicht ist, und dass gegebenenfalls weitere Ionen beigegeben werden.

Claims (1)

1. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass zur Herstellung von therapeutisch verwendbaren Lösungen der Laevane diese nach an sich bekannten Methoden gereinigt und in blutisotonischen Lösungen gelöst werden.