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Verfahren zur Herstellung von Streptomycin Die Erfindung betrifft
die Herstellung von Streptomycin durch Fermentierung von Streptomycin erzeugenden
Stämmen von S.griseus, in wäßrigem Nährmedium, welche submers und unter Belüftung
durchgeführt wird.
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Während der Zusatz von Sojabohnenmehl zu Nährmedien bekannt ist, haben
Untersuchungen ergeben, daß es besonders vorteilhaft ist, die submerse Fermentierung
unter Belüftung in einem wäßrigen Medium durchzuführen, das neben Sojabohnenmehl
noch lösliche Anteile von Schlempe enthält, wie solche bei der Herstellung von Trinkalkohol
durch Hefefermentation von Getreidekörnern anfallen und in großen Mengen zu niedrigen
Preisen im Handel sind. Mit Bezug auf die erfindungsgemäß anzuwendenden löslichen
Schlempeanteile und Verfahren zu ihrer industriellen Gewinnung sei verwiesen auf
die Veröffentlichung von C. S. B o r o f f in der Zeitschrift Industrial and Engeneering
chemistry, Bd. 39, S. 6o2 (Mai 19q.7).
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Erfindungsgemäß erfolgt die Züchtung von Streptomycin erzeugenden
Stämmen von S.griseus und die Gewinnung von Streptomycin durch metabolische Wirkung
der darin befindlichen Mikroorganismen unter Verwendung eines Nährmediums, das als
Quelle für den notwendigen, die Streptomycinbildung begünstigenden Faktor Sojabohnenmehl,
gegebenenfalls in Kombination mit anderen komplexen, stickstoffhaltigen organischen
Stoffen, welche den Streptomycin bildenden Faktor aufweisen, außerdem lösliche Anteile
von Schlempe und vorteilhaft noch weitere Bestandteile, wie Kohlehydrate und Chlornatrium,
enthält.
Ein Nährmedium gemäß Erfindung kann z. B. etwa 2 Gewichtsteile
Sojabohnenmehl, etwa o,25 Gewichtsteile getrocknete, wasserlösliche Schlempeanteile,
etwa i Gewichtsteil Dextrose und etwa i Gewichtsteil Natriumchlorid enthalten.
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Das Nährmedium wird vor Impfung mit einem Streptomycin erzeugenden
Stamm von S.griseus sterilisiert, was z. B. durch Erhitzen auf i2o° und etwa
30 Minuten dauerndes Halten bei dieser Temperatur erfolgen kann. Nach Abkühlung
kann das Medium mit Sporen oder mit vegetativem Impfstoff des Streptomycin erzeugenden
Stammes geimpft und zwecks Herstellung von Streptomycin fermentiert werden. a Die
Konzentration des Sojabohnenmehls kann etwa i bis 5 °/o, vorzugsweise etwa i bis
2 0/0, die Konzentration an löslichen Schlempeanteilen in getrocknetem Zustand etwa
o,i bis 2 0/0, vorzugweise etwa i bis 1,5 °/o, der Natriumchloridgehalt bis zu etwa
3 °/o, vorzugsweise etwa o,fo bis i,i °/o, betragen.
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Dextrose kann in Beträgen bis zu etwa 4 g in foo ccm des Mediums vorhanden
sein, eine Konzentration, welche der Einfachheit halber als bis zu 4 °/o bezeichnet
werden soll. Im allgemeinen werden die besten Ergebnisse mit Dextrosekonzentrationen
von 0,75 bis 2 0/0 erzielt.
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Wie gefunden wurde, kann man an Stelle von Dextrose mit Vorteil ein
billigeres, Dextrose enthaltendes Material, z. B. die unter dem Handelsnamen Hydrol
bekannte, Melasse ähnliche Mutterlauge verwenden, welche nach der Kristallisation
und Abtrennung der handelsüblichen Dextrose aus hydrolisierten Stärkelösungen zurückbleibt.
Hydrol wird in Beträgen angewendet, die den für Dextrose in Betracht kommenden Beträgen
äquivalent sind. Als andere brauchbare Kohlenwasserstoffquellen kommen Stärke, Maltose
sowie die verschiedenen Dextrose und Maltose enthaltenden, handelsüblichen Sirupe
in Betracht. Auch diese werden in der Dextrose entsprechenden Mengen angewendet.
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Die Gewinnung des Streptomycins aus der fermentierten Nährflüssigkeit
kann in vier Stufen vorgenommen werden, nämlich erstens Abtrennung der Mikroorganismen
aus der Kulturflüssigkeit, zweitens-Behandlung der Kulturflüssigkeit mit Aktivkohle
zwecks Adsorbtion des aktiven Produktes, drittens Behandlung des Adsorbats mit einer
zur Lösung des aktiven Produktes geeigneten Flüssigkeit, z. B. einer alkoholischen
Lösung einer Mineralsäure, wie Chlorwässerstoffsäure von niedrigem Normalitätsgrad,
und viertens Gewinnung des Streptomycins aus der Waschflüssigkeit.
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Die Erfindung umfaßt selbstverständlich die Anwendung von Standardimpfstoff
oder technisch gebräuchlichem Impfstoff, die Präparation einer wäßrigen Suspension
von Sporen Streptornycin erzeugender Stämme von S.griseus aus einem mit Sporen durchsetzten
Agar und die Anwendung der Sporensuspension zur Beimpfung von Kulturen, z. B. Schüttelflaschenkulturen
für die Züchtung eines für die Fermentation in großem Maßstabe geeigneten Impfstoffs.
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Die Erfindung sei nachstehend an einigen Beispielen erläutert, bei
denen die Fermentation unter Tauchbedingungen und Belüftung durchgeführt wird. Beispiel
i Es wurde ein Nährmedium hergestellt, das in foo ccm der wäßrigen Flüssigkeit
0,5 g lösliche Schlempeanteile in getrockneter Form, 2 g Sojabohnenmehl,
i g Dextrose, i g Chlornatrium enthielt.
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Die löslichen Schlempeanteile wurden in Trockenform von einer Whiskyfabrik
bezogen.
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Eine geeignete Menge des Nährmediums wurde in einen Kohlenstahlfermentator
gepumpt, der für betriebsmäßiges Arbeiten geeignet ist und durch 30 Minuten
langes Erhitzen auf i--o° sterilisiert. Nach Abkühlung wurde die Nährflüssigkeit
mit einer vegetativen Kultur eines Streptomycin erzeugenden Stammes von S.griseus
geimpft und alsdann bei 25° unter Tauchbedingungen und Belüftung und mechanischer
Durchmischung 84 Stunden lang fermentiert. Die Kulturflüssigkeit enthielt alsdann
dreihundertfünfundsechzig Streptomycineinheiten je Kubikzentimeter Flüssigkeit.
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Beispiel 2 Ein Nährmedium, das in foo ccm 0,2,5 g getrocknete lösliche
Schlempeanteile, 2 g Sojabohnenmehl, i g Dextrose, i g Natriumchlorid enthielt,
ergab nach Sterilisation, Kühlen und Beimpfung durch Fermentierung in rotierenden
Schüttelflaschen bei 27° eine Kulturflüssigkeit, die vierhundertachtzig Streptomycineinheiten
je Kubikzentimeter enthielt.
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Beispiel 3 Die nachfolgend beschriebenen Nährmedien wurden nach Sterilisation,
Kühlen und Beimpfung in rotierenden Schüttelaschen bei 27° fermentiert. Das Nährmedium
enthielt 1,5)/, Sojabohnenmehl (Staeley's Special Nutrient 48), 10/, Dextrose und
0,25 % Na Cl.
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Diesen Ansätzen wurden verschiedene Mengen von löslichen Schlempeanteilen
zugesetzt, so daß die einzelnen Ansätze o,5 bzw. o,75 bzw. i bzw. 1,25 bzw. 1,5
hzw. 2 % an löslichen Schlempeanteilen in Trockenform enthielten. Die Mischungen
wurden mit Wasser auf roo % aufgefüllt.
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Nach 5 Tagen enthielten die einzelnen Proben die in der folgenden
Zusammenstellung angegebenen Streptomycin-Einheiten j e Kubikzentimeter.
| Konzentration |
| an löslichen Schlempe- - St'eptomycinausbeuten |
| anteilen Einheiten |
| °% je Kubikzentimeter |
| o,5 590 |
| 0,75 500 |
| i 550 |
| i,25 640 |
| 1,5 640 |
| 2 " 490 |
Beispiel q.
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Die nachfolgend gekennzeichneten Nährmedien wurden sterilisiert, gekühlt,
beimpft und in umlaufenden Schüttelaschen bei 27° fermentiert. Die Nährmedien enthielten
1,5"/o Sojabohnenmehl, 1,50/, Dextrose,
o,25 % NaCl; sie
wurden mit verschiedenen Beträgen von löslichen Schlempeanteilen in Trockenform
versetzt, und zwar derart, daß die einzelnen Ansätze die folgenden Konzentrationen
an löslichen Schlempeanteilen enthielten: 0, 0,25, o,5, o,75, 1, 1,25, und 1,5 °/a.
Es wurde mit Wasser auf Zoo °/o aufgefüllt.
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Nach 3tägiger Fermentierung enthielten die Kulturflüssigkeiten der
einzelnen Proben Streptomycinausbeuten, die in der folgenden Zusammensetzung durch
Angabe der Einheiten je Kubikzentimeter gekennzeichnet sind:
| Konzentration |
| an löslichen Schlempe- Streptomycinausbeuten |
| anteilen Einheiten |
| % je Kubikzentimeter |
| 0 305 |
| 0,25 440 |
| 0,5 495 |
| 0,75 570 |
| 1 475 |
| 1,25 470 |
| 1,5 530 |