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Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden
Carotinoide bilden eine Klasse von stark gefärbten Verbindungen mit den Farbtönen von gelb bis rot und sind in der Natur sehr weit verbreitet. Viele der Carotinoide sind in isoliertem Zustand wegen ihrer starken Pigmentierungskraft oder infolge ihrer wachstumsfördernden Eigenschaften und/oder Vitaminakti- vität als Färbemittel von Bedeutung. Xanthophylle, die Sauerstoff enthaltenden Carotinoide, sind von besonderem Interesse.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Kultivieren eines Pilzes der Familie Dacrymycetaceae. Aus Bioch. Journ. 53 [1953], S. 538-540, ist bereits ein biologisches Carotinoidherstellungsverfahren bekanntgeworden, bei welchem Dacrymyces stillatus verwendet wird, also ein Organismus der Familie Dacrymycetaceae. In dieser Literatur ist jedoch auch ausgeführt, dass dieses bekannte Verfahren durch das langsame Wachstum des verwendeten Organismus und die mangelnde Reproduzierbarkeit schlecht durchführbar ist.
Durch eigene Versuche konnten die Angaben in der Literatur bestätigt werden, wobei bei einer Reihe von Pilzen der Familie Dacrymycetaceae bei einer Kultivierung gemäss den Angaben in der zitierten Literatur nur sehr geringe Wachstumsausbeuten und Pigmentproduktionen und bei manchen Kulturen Überhaupt kein Wachstum festgestellt wurde. Es wurde nun festgestellt, dass Pilze der Familie Dacrymycetaceae eine Gruppe von Organismen darstellen, welche unter richtig kontrollierten Bedingungen hohe Ausbeuten an Carotinoiden und insbesondere an Xanthophyllen ergeben. Diese Bedingungen bestehen darin, dass man über die Lehre, die das bekannte Verfahren bietet, hinausgehend den Organismus reichlich mit Sauerstoff versorgt, die. Kultur in Bewegung hält und sie mit Licht des sichtbaren Spektrums bestrahlt.
Selbstverständlich ist auch die Zusammensetzung des Nährmediums von besonderer Wichtigkeit. Die erfindungsgemäss verwendete Zusammensetzung des Nährmediums unterscheidet sich jedoch im wesentlichen weder in qualitativer noch in quantitativer Hinsicht von derjenigen, die gemäss dem obzitierten bekannten Verfahren verwendet wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren besteht demnach darin, dass man einen Pilz der Familie Dacrymycetaceae unter submersen Bedingungen in einem wässerigen Medium kultiviert, welches Quellen verwertbaren organischen Stickstoffs, Ammoniakstickstoffs, verwertbaren Kohlenstoffs, verwertbaren Phosphors und Spurenmineralien enthält, wobei die Kultur unter Belüftung und Bewegung gehalten wird, und dass man auf die Pilzkultur Licht des sichtbaren Spektrums einwirken lässt.
Durch die vorstehend angefuhrten Massnahmen lassen sich Xanthophylle, wie Zeaxanthin, Canthaxanthin, Cryptoxanthin, Violaxanthin, Torulen, Torularhodin und Rhodotorulin, welche von besonderem Interesse sind, sowie auch die andern dieser Klasse zugehörenden Verbindungen in einer den praktischen Bedürfnissen entsprechenden Weise herstellen. Natürlich werden auch ss-Carotin und andere Carotine im Verfahren gemäss der Erfindung erzeugt, jedoch kann man unter geeigneten Bedingungen sehr leicht Ausbeuten von über 60% von Xanthophyllen zur Gesamtproduktion an Pigmenten erhalten. Die in der Literatur rapportierten Versuche mit dem bekannten Verfahren lassen erkennen, dass mit diesem höchstens 35% Xanthophylle erzeugt werden.
EMI1.1
Der Fermentierungsprozess muss unter submersen Bedingungen durchgeführt werden, d. h. die Organismen müssen in einem flüssigen Medium unter Rühren und unter geeigneter Zufuhr von Sauerstoff gezüchtet wer-
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den. Sauerstoffzufuhr und fortgesetztes Ruhren sind während des Fermentationsprozesses bei jedem der
Organismen erforderlich. Die Mycelbildung wird stark gefördert, wenn das Kulturmedium gerührt und in Bewegung gehalten wird. Die Sauerstoffzufuhr kann so durchgeführt werden, dass man Luft, insbeson- dere sterile Luft, mittels einer Vorrichtung einführt, welche eine gute Dispersion gewährleistet und kleine Bläschen verursacht.
Dies kann man erreichen, indem man komprimierte Luft durch perforierte Röhren oder Platten, poröse Keramikgasverteiler oder andere Übliche Mittel presst, welche innerhalb des Fermentationsmediums angeordnet sind. Die anzuwendende Luftmenge hängt von der angewendeten Technik ab ; jedoch werden üblicherweise Mengen im Bereich von etwa 0, 1 bis 2, 5 Raumteilen Luft je Minute und Raumeinheit Kulturflüssigkeit ausreichen. Die Belüftung wird während des gesamten Fermentationsverlaufes aufrechterhalten.
Es ist notwendig, die Kulturflüssigkeit durch irgendeine geeignete Vorrichtung in Bewegung zu halten, z. B. mittels eines Rührers oder durch Umwälzen der Flüssigkeit mittels einer Pumpe. Das Ausmass der Bewegung soll hoch genug sein, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten, ohne jedoch eine unnötige Mazeration des Pilzgewebes zu verursachen. Es ist zweckmässig, die Fermentation vollständig in einem wässerigen Medium durchzuführen, das in einem geschlossenen Behälter enthalten ist, welcher mit einer Luftdispersionsvorrichtung und einem üblichen, mit etwa 50 - 400 Umdr/miIl" laufen- den Rührer versehen ist.
Eine Bestrahlung mit elektromagnetischer Energie im Wellenlängenbereich von etwa 3200 bis 7600 während der Entwicklung der Pilzkultur ist notwendig, um eine maximale Pigmentproduktion zu erreichen. Es ist nicht notwendig, kontinuierlich zu bestrahlen, jedoch ist dies gegen Ende der Entwicklung der Kultur wesentlich, d. h. während den letzten 30-50% der Fermentationsdauer. Eine Bestrahlung während der gesamten Fermentationsdauer ist jedoch von Vorteil, wobei die Bestrahlung intermittierend sein kann. Jede Organismenart hat besondere Erfordernisse in bezug auf die Bestrahlung, jedoch fallen diese in den vorerwähnten Bereich und können leicht bestimmt werden. Die Bestrahlungsintensität kann innerhalb des Bereiches von 500 bis 10000 Lux variieren.
Nicht nur die Gesamtmenge der erzeugten Xanthophylle wird durch Bestrahlung beeinflusst. Das Verhältnis von Xanthophyllen zur Gesamtmenge an Carotinoiden, welche durch jeden Organismus erzeugt werden, ist abhängig von der für die Bestrahlung verwendeten Wellenlänge. Zum Beispiel erhält man bei Verwendung von Dacrymyces deliquescens mit grünem Licht entsprechend einer Wellenlänge von etwa 5300 das höchste Verhältnis von Xanthophyllen zur Gesamtmenge an Carotinoiden. Die höchste Gesamtausbeute an Xanthophyllen erhält man mit Rosalicht von etwa 6200 . Bei Dacryopinax spathularia werden die höchsten Ausbeuten an Xanthophyllen und auch das höchste Verhältnis von Xanthophyllen zur Gesamtmenge der Carotinoide mit Licht von etwa 5800 erhalten.
Die Versorgung der Organismen mit Nährstoffen ist ein sehr wichtiger Faktor. Quellen von verwertbarem organischem Stickstoff, Ammoniakstickstoff, verwertbarem Kohlenstoff, verwertbarem Phosphor und Spurenmineralien stellen die minimalen Erfordernisse dar, wie vorstehend ausgeführt. Weitere Nährmedien können mit Vorteil zugesetzt werden, wie dies nachstehend ausgeführt ist. Die Nährstoffe sollten in den folgenden Mengen vorhanden sein :
Organischer Stickstoff : 0, 025-2, 5 g Stickstoff/l Medium
EMI2.1
: 0, 025 - 2Phosphar : 0, 1 - 2 g/l Medium
Spurenmineralien, wie Zink, Magnesium und Eisen : 1 - 500 mg/l Medium.
Die gesamten Nährstoffe können bei Beginn des Fermentationsprozesses oder in Portionen zu verschiedenen Zeiten des Fermentationsprozesses zugesetzt werden.
Aminosäuren sind die bevorzugten Quellen für verwertbaren organischen Stickstoff. So können Serin, Lysin, Leucin, Isoleucin, Arginin, Asparaginsäure, Tryptophan, Prolin, Threonin, Methionin, Cystin, Cystein, Phenylalanin, Tyrosin, Histidin, Valin, Glycin, Alanin, Hydroxyprolin, Homoserin, Allo-hy- droxyprolin, Äthionin, Asparagin, Glutaminsäure, Glutamin usw., allein oder in Kombination verwendet werden. Glutaminsäure, ein Glutamatsalz oder Glycin sind bevorzugt. Die Zufuhr von L-Tryptophan zu einem Medium, welches Glutaminsäure enthält, ist besonders wirkungsvoll.
Ammoniumhydroxyd oder Ammoniumsalze, wie z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumsulfat, Ammoniumtartrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumphosphat, Ammoniumcarbonat usw., können als Ammoniakstickstoffquellen verwendet werden. Ammoniumnitrat ist bevorzugt. Harnstoff und Acetamid sind ebenfalls geeignete Stickstoffquellen.
Verwertbare Kohlenstoffquellen für das Nährmedium sind vor allem Kohlehydrate, obwohl auch an-
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dere Stoffe, wie Proteine, hydrolysierte Proteine, Lipoide usw., verwendet werden können. Kohlehydrate, wie Glucose, Saccharose, Invertzucker, Maltose, Fructose, Xylose, Arabinose, Cellobiose, Melezitose, Galactose,. Glycerin, Rohzucker, Melasse (black strap molasses), invertiert Melasse, Mannit, Sorbit, Lactose, Cellulose, Stärke, Amylose und Dextrine, fördern alle das Wachstum und die Pigmentproduktion. Glucose, Saccharose und Invertzucker sind bevorzugt.
Geringe Mengen von Phosphor sind ebenfalls für das Wachstum wesentlich. Dieser kann in den oben angegebenen Mengen in Form von anorganischen Phosphaten zugefuhrt werden, wie saures Kaliumphosphat, Dinatriumphosphat od. dgl. Die Spurenmetalle Zink, Magnesium und Eisen in Mengen von etwa 0, 1 bis etwa 50 mg% müssen anwesend sein, damit ein Wachstum in praktischem Ausmass erreicht wird.
Diese können als anorganische Salze, als metallorganische Komplexe oder als organisch gebundene Metalle eingeführt werden. Andere Metalle wie Calcium, Bor, Kupfer, Mangan und Molybdän wirken ebenfalls stimulierend und können daher in Spuren zugesetzt werden.
Vitamin B, (Thiamin) kann ebenfalls in geringen Mengen zur Erzielung guter Wirkungen in das Medium einverleibt werden. Als Vitamin Bl-aktives Material können z. B. reine Substanzen, wie Thiaminchlorid-hydrochlorid, Thiaminbromid-hydrobromid, Thiaminnitrat, Thiaminsulfat, oder rohe Substanzen unter Einschluss von natürlichem, diese Substanzen enthaltendem Material biologischen Ursprungs verwendet werden.
Der Zusatz von geringen Mengen verschiedener anderer Vitamine und ähnlicher Mittel, wie Pantothensäure, Lactoflavin, Nicotinsäure, Inosit, p-Aminobenzoesäure, Biotin, Pyridoxin, Folsäure, Liponsäure und Vitamin B., zu dem Medium, einzeln oder in Kombination, verursachen ebenfalls eine Wachstumsstimulierung und eine Pigmentproduktion bei verschiedenen Pilzen.
Bei gewissen Organismen wirkt sich ein Zusatz geringer Mengen von Proteinen oder hydrolysierten Proteinen ebenfalls stimulierend aus. Zum Beispiel stimuliert bei Dacrymyces deliquescens ein Zusatz von 0, 05 bis l% von hydrolysiertem oder unhydrolysiertem Milchalbumin, Trockenmilchpulver, Soyabohnenprotein, Baumwollsamenprotein, Casein, Hefe, getrocknete Brauereiabwässer, Maisquellwasser, Weizenprotein, Fleischabfälle, Fischmehl und andere pflanzliche oder tierische Produkte das Wachstum und die Pigmentproduktion.
Während jeder der Organismen einen individuellen Bedarf an einem besonderen Nährmedium hat, um ein maximales Wachstum und eine maximale Pigmentproduktion zu erzeugen, ergibt ein Nährmedium mit der folgenden Zusammensetzung im allgemeinen gute Resultate :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Konzentration <SEP> Bevorzugte <SEP> Konzenin <SEP> Vol. <SEP> tration <SEP> in <SEP> Vol.
<tb>
Glucose <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 10 <SEP> 1. <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 5 <SEP>
<tb> Konzentriertes <SEP> Maisquellwasser <SEP> 0, <SEP> 02-2 <SEP> 0,3
<tb> Enzymatisch <SEP> hydrolysierte <SEP> Hefe <SEP> 0, <SEP> 01 <SEP> - <SEP> 1 <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Glutaminsäure <SEP> 0, <SEP> 02-1 <SEP> 0, <SEP> 1-0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Vitamin <SEP> 3 <SEP> 0, <SEP> 05-5, <SEP> 0 <SEP> mg10 <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> - <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> ms* <SEP>
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0, <SEP> 05-1 <SEP> 0, <SEP> 10-0, <SEP> 20 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0, <SEP> 05-1 <SEP> 0, <SEP> 10-0, <SEP> 20
<tb> Ammoniumnitrat <SEP> 0, <SEP> 02-1 <SEP> 0, <SEP> 1-0, <SEP> 2 <SEP>
<tb>
Eine andere Zusammensetzung, die gute Resultate gibt, ist die folgende :
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<tb>
<tb> Substanz <SEP> Konzentration <SEP> in <SEP> Vol. <SEP> -0 <SEP> ; <SEP> 0 <SEP>
<tb> Glucose <SEP> 3, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Konzentriertes <SEP> Maisquellwasser <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Diammoniumphosphat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> Saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0, <SEP> 15 <SEP>
<tb> Magnesiumsulfat <SEP> 0,15
<tb> Kaliumchlorid <SEP> 0, <SEP> 10
<tb> Enzymatisch <SEP> hydrolysiertes <SEP> Lactalbumin <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> Enzymatisch <SEP> hydrolysiertes <SEP> Soyabohnenprotein <SEP> 0, <SEP> 10 <SEP>
<tb> Calciumpantothenat <SEP> 1 <SEP> mg
<tb>
Maximale Ausbeuten werden im allgemeinen nach 90 - 144 Stunden erhalten, obwohl es gelegentlich vorteilhaft ist, die Fermentationszeit auf 240 Stunden auszudehnen.
Die die besten Ergebnisse ergebende Fermentationszeit für einen besonderen Organismus kann durch häufiges Sammeln der Kultur bestimmt werden. Die optimale Temperatur für das Wachstum und die Carotinoidproduktion variiert etwas für jeden Organismus. Eine Temperatur zwischen 20 und 32 , vorzugsweise 25 - 280, gibt im allgemeinen gute Ergebnisse.
Vorteilhaft beginnt man die Fermentationbei einem anfänglichen PH von etwa 6. Während der Fermentation vermehren sich die Säuren, wodurch das PH auf etwa 2, 1 - : l, 5 erniedrigt wird. Obwohl ein derart niederer pH-Wert nicht besonders nachteilig für das Pilzwachstum und die Pigmentbildung ist, hat er einen stark korrodierenden Einfluss auf die Metallapparatur. Es ist deshalb üblicherweise von Vorteil, den PH- Wert der Kultur innerhalb des Bereiches von etwa 3, 5 bis 5, 5 zu halten, indem man portionsweise oder kontinuierlich Alkali, wie z. B. Natriumhydroxyd, Kaliumhydroxyd, Calciumhydroxyd, Ammoniumhydroxyd, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat usw., zusetzt. Im allgemeinen wird durch ein PH im Bereich von etwa 2, 1 bis 8, 5 die Fermentation nicht beeinträchtigt.
Kulturen von Organismen der Familie Dacrymycetaceae können für lange Zeit auf MalzextraktSchrägagar der folgenden Zusammensetzung konserviert werden :
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<tb>
<tb> Konzentration <SEP> in <SEP> Vol, <SEP> -.'10 <SEP>
<tb> Malzextrakt <SEP> (Difco) <SEP> 1, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Pepton <SEP> (Difco) <SEP> 0, <SEP> 7 <SEP>
<tb> Agar <SEP> 2,0
<tb> Vitamin <SEP> B <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP> mg% <SEP>
<tb> PH <SEP> vor <SEP> der <SEP> Sterilisation <SEP> 6,0
<tb>
Das Impfpräparat für die Fermentation kann von Oberflächenkulturen auf Schrägagar gewonnen werden, indem man diese Kulturen mit etwa 10 - 15 ml sterilem destilliertem Wasser zu einer feinen Pulpe verarbeitet, z. B. in einem Gewebehomogenisator. Etwa 25 - 50 ml der fein homogenisierten Suspension von Mycelgewebe werden hierauf in eine grosse Flasche übertragen, welche z.
B. etwa 6 1 Gärflüssigkeit der folgenden ungefähren Zusammensetzung hat :
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<tb>
<tb> Konzentration <SEP> in <SEP> Vol, <SEP> -0/0 <SEP>
<tb> Melasse <SEP> 3, <SEP> 6
<tb> hydrolysiertes <SEP> Casein <SEP> 1, <SEP> 0
<tb> Maisquellwasser <SEP> 0, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Ammoniumacetat <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP>
<tb> saures <SEP> Kaliumphosphat <SEP> 0, <SEP> 1
<tb> PH <SEP> vor <SEP> der <SEP> Sterilisation <SEP> mit <SEP> verdünntem <SEP> Alkali <SEP> auf <SEP> 5, <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 6 <SEP>
<tb> eingestellt
<tb>
Das Medium wird vor der Einführung der Suspension, die das Pilzgewebe enthält, durch Erhitzen während 15 Minuten auf 1200 im Autoklaven sterilisiert und hierauf gekühlt.
Nach dem Beimpfen wird die Flasche des Impfmediums bei 280 stehen gelassen und unter diffuser Beleuchtung während 2 - 3 Tagen ohne Bewegung und Belüftung kultiviert. Hierauf wird die Kultivierung während 2 - 3 Tagen bei derselben Temperatur unter kontinuierlicher Bestrahlung, Belüftung und Bewegung fortgesetzt. Es entwickelt sich eine dichte, tiefgelb bis rötlich orange gefärbte, fadenförmige Kultur, welche nun für die Verwendung als Impfmittel geeignet ist.
Die Fermentation wird hierauf in grossen Kesseln durchgeführt, welche das vorstehend beschriebene Nährmedium enthalten. Dem Fermentationsgefäss setzt man etwa 3 - 10 Raumteile submerses Impfmittel auf 100 Raumteilen Fermentationsmedium zu. Die Fermentation wird wie vorstehend beschrieben unter Belüftung, Bewegung und Bestrahlung durchgeführt.
Nach Beendigung der Fermentation kann das Mycel vom Fermentationsmedium durch Dekantieren, Zentrifugieren oder Filtrieren abgetrennt werden. Das carotinoidreiche Mycel kann hierauf durch Lyophilisation, Sprühtrocknung, Trommeltrocknung, Trocknung mit heisser Luft oder durch andere geeignete Mittel getrocknet werden.
Die Xanthophylle und die andern Carotinoide, welche durch den Pilz erzeugt werden, können ohne Abtrennung von der Pilzkultur verwendet werden, oder sie können angereichert und als Konzentrat verwendet werden. Als Zusatz zu Tier- und Geflügelfutter verwendet man vorteilhaft das gesamte getrocknete Mycel als Träger der Carotinoidpigmente. In diesem Fall wird das trockene Gewebe durch Mahlen in einer Hammermühle, Kugelmühle, Reibungsmuhle oder in einer andern ähnlichen Vorrichtung fein zerrieben und eine Menge dieses gemahlenen Gewebes gründlich mit einem grösseren Teil eines üblichen Tierfutters vermischt.
Wenn ein konzentrierteres Produkt erwünscht wird, so kann das Xanthophyll-enthaltende Mycel mit organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Aceton, Chloroform, Benzol oder andere organische Lösungsmittel oder Lösungsmittelkombinationen, zur Entfernung der Pigmente extrahiert werden. Nach Verdampfen des Lösungsmittels erhält man ein sirupöses, öliges Konzentrat oder ein festes trockenes Konzentrat.
Dieses Konzentrat kann dem Grundfutter zugemischt oder daran absorbiert oder für andere Zwecke verwendet werden.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen das erfindungsgemässe Verfahren. Die Kulturen der Organismen sind In der Sammlung von Mikroorganismen der American Type Culture Collection, Washington, D. C., hinterlegt worden, wo ihnen die angegebenen Bezeichnungen zugeteilt wurden.
Beispiel l : Malzextrakt-Schrägagars werden in 33 x 200 mm Versuchsröhren hergestellt. Der Agar hat die folgende Zusammensetzung :
Difco Malzextrakt 15 g/1
Difco Pepton 7 g/l
Agar 20 g/l
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und bei einer Temperatur von 25 bis 280 in diffusem Licht während 10 --15 Tagen bebrütet. Während dieser Zeit bedeckt sich die gesamte Oberfläche mit einer verfilzten, runzeligen, tiefgelbe bis orange gefärbten Kultur.
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Die Kultur eines Agars wird mit etwa 10 - 15 ml sterilisiertem, destilliertem Wasser in einem Glashomogenisator homogenisiert. 6 1 Medium der folgenden Zusammensetzung werden in je zwei 9 1-Fla- schen gegeben :
Melasse 36 g/l hydrolysiertes Casein 10 g/l
Maisquellwasser 5 g/l
Ammoniumacetat 2 g/l saures Kaliumphosphat 1 g/l
PH mit verdünntem Alkali auf 5, 6-6, 0 eingestellt.
Man setzt 10 ml Specköl als Antischaummittel zu jeder Flasche zu und versieht die Fermentationsflaschen mit Anschlüssen für die Beimpfung, Luftzufuhr, Luftabfuhr und die Probenentnahme. Die so ausgestatteten Flaschen mit dem vorstehend beschriebenen Medium werden im Autoklaven bei 1200 während 30 Minuten sterilisiert. Nach Abkühlen wird jede Flasche mit einer Menge einer homogenisierten Suspension beimpft, welche der Kultur entspricht, die von einem halben Schrägagar erhalten wurde. Jede Flasche wird hierauf ruhig bei 280 während 48 - 72 Stunden unter diffuser Bestrahlung stehen gelassen. Nach der anfänglich ruhigen Kultivierungsperiode beginnt man mit der Belüftung und führt diese während zusätzlichen 48 - 72 Stunden mit etwa 5 l/Minute kontinuierlich durch.
Während der Kultivationsperiode mit Luftzufuhr bestrahlt man jede Flasche mit Licht von etwa 2700 Lux Intensität, welche von einer 500 W-G1tihlampe erzeugt werden. Nach einer Kultivationsdauer von insgesamt 4 bis 6 Tagen wird die Kultur dicht und fadenförmig und ändert die Farbe in tiefgelb bis rötlich-orange. Das so erhaltene Präparat ist fertig für Beimpfungszwecke.
Zwei Flaschen Impfflüssigkeit (121 Gesamtvolumen) werden unter aseptischen Bedingungen auf 220 l steriles Fermentationsmedium übertragen, welches in einem 300 1-Fermentationsgefäss enthalten ist und die folgende Zusammensetzung hat :
Glucose 3,5%
Maisquellwasser 0, 3%
Natriumglutamat 0, 2r1/0
Ammoniumnitrat 0, 2r1/0
Enzymatisch hydrolysierte Hefe 0, 15r1/0
Saures Kaliumphosphat 0, 15%
EMI6.1
100/0PH eingestellt auf 5, 5
Man setzt 50 ml Silikonentschäumer zu und sterilisiert die Fermentationsgefässe während 20 Minuten bei 1200.
Der Inhalt des Fermentationsgefässes wird mit zwei 400 W-Quecksilberdampflampen beleuchtet, welche in Schutzhüllen angeordnet sind, welche durch den Mantel in das Innere des Fermentationsgefä- sses vorstehen.
Nach den ersten 24 Stunden der Fermentation wird das Fermentationsgefäss während 168 Stunden kontinuierlich bestrahlt, belüftet und bewegt. Die Luft wird dem Fermentationsgefäss in einer Menge von 0, 15 bis 0, 7 nf'/Minute zugeführt und die Bewegung durch einen Rührer mit 600 Umdr/min erzeugt. Die Temperatur hält man dabei bei 25-28 C.
Die vergärte Lösung wird hierauf in eine Korbzentrifuge gegeben und der Feststoff gewonnen. Man erhält 12 kg nasses Mycel.
10 kg nasses, frisch filtriertes Mycel, welches etwa 2 kg trockenem Mycel entspricht, werden grundlich mit 20 l Leitungswasser vermischt und in einer Kolloidmühle zu einer feinen Pulpe vermahlen. Das gemahlene Mycel wird abfiltriert und in einen Behälter übertragen, welcher 40 1 Aceton enthält. Nach Rührung während etwa 8 Stunden wird das Aceton abfiltriert und durch 40 l frisches Aceton ersetzt. Die Masse wird während weiteren 8 Stunden gerührt, das Aceton entfernt und durch 20 1 frisches Aceton ersetzt. Hierauf wird abermals filtriert und die tiefgefärbten Acetonfiltrate vereinigt. Die extrahierten Stoffe, welche nach der Extraktion fast farblos sind, werden verworfen.
Die vereinigten Acetonextrakte werden durch Verdampfen bei niederer Temperatur im Vakuum auf etwa 20 l eingeengt. Dieses Konzentrat wird hierauf in einen Extraktionskessel gebracht, mit etwa 50 1 Wasser verdünnt und zweimal mit je 20 1 einer n-Hexan-Fraktion (Skellysolve B) extrahiert. Der Extrakt
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wird mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum bei niederer Temperatur eingedampft, wobei man ein dickes, sirupöses Konzentrat mit einem Gehalt von 4920 mg Carotinoiden erhält. Durch chromatographische Analyse des Carotinoidanteiles des Konzentrates werden 3050 mg Xanthophylle, 1590 mg 8-Carotin und 280 mg andere Carotine festgestellt.
Beispiel 2 : Man stellt Malzextrakt-Pepton-Schrägagar in mit Schraubendeckel verschlossenen 18 X 150 mm Versuchsröhren her. Das Medium hat die folgende Zusammensetzung :
Agar 20 gl1
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Saures Kaliumphosphat 1,0 g/l
Magnesiumsulfat-heptahydrat 0, 5 g/l
Mangansulfat-heptahydrat 50 mg/l
Zinksulfat-heptahydrat 25 mg/1
Eisensulfat-heptahydrat 25 mg/l
Thiamin 0, 1 mg/1
Biotin 0,045 mg/l
Das PH wird vor der Sterilisation auf 6, 5 eingestellt.
Die Schrägagars werden mit einer Kultur von Dacrymyces deliquescens (ATCC Nr. 13292) beimpft und hierauf in diffusem Licht bei etwa 220 Lux und einer Raumtemperatur von 26 bis 280 bebrütet. Nach 10 - 15 Tagen ist die gesamte Oberfläche des Agars mit einer zähen, verfilzen, runzeligen, tiefgelb bis orange gefärbten Kultur bedeckt.
Die Kultur eines Schrägagars wird in kleinen Stückchen mit einer steifen Drahtnadel entfernt und in einen sterilen Gewebehomogenisator übertragen, in welchem sie mit 10 - 15 ml sterilem destilliertem Wasser zu einer feinen Pulpe verrieben wird.
Die feine Pulpe wird unter aseptischen Bedingungen in eine sterile Flasche übertragen und mit sterilem destilliertem Wasser auf 25 ml verdünnt. Ein aliquoter Anteil von 5 ml dieser Suspension wird in eine 500 ml-Flasche übertragen, welche 100 ml Impfmedium der folgenden Zusammensetzung enthält :
Glucose (handelsüblich) 25 g/l
Glycerin 5, 0 g/l
Enzymatisch hydrolysierte Hefe 3, 0 g/l L- (+)-Glutaminsäure 2, 0 g/l
Maisquellwasser 3 ml/l
Thiamin 1, 0 g/l
Saures Kaliumphosphat 1, 5 g/l
Magnesiumsulfat 0, 25 g/l
Das PH wird vor der Sterilisation mit
Ammoniumhydroxyd auf 6, 0 eingestellt.
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ohne Bewegung bebrütet.
Die Flasche wird hierauf auf einem mit 300 Umdr/min laufenden Schüttler unter aeroben Bedingungen weiter unter Bestrahlung mit 860 - 1300 Lux bebrütet, welche von einer 300 WGlühlampe emittiert werden. Nach 3 Tagen entwickelt sich im Medium eine schwere rötlich-orange Kultur.
5 ml Impfflüssigkeit werden unter aseptischen Bedingungen in eine 500 ml-Flasche übertragen, welche 100 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthält :
Glucose (technisch) 2, 5 g konz. Maisquellwasser 0,3 ml
Natriumglutamat 0, 3 g
Saures Kaliumphosphat 0, 15 g
Magnesiumsulfat 0, 05 g
Stärke (enzymatisch hydrolysiert) 0, 1 g
Ammoniumnitrat 0, 2 g
Thiamin 0, 1 mg
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Das Medium wird vor der Autoklavenbehandlung auf PH 6, 1 eingestellt und hierauf durch Erhitzen auf 1200 während 15 Minuten sterilisiert.
Nach Beimpfung wird die Flasche auf einem rotierenden Schutter mit 300 Umdr/min unter aeroben Bedingungen bewegt, wobei die Temperatur bei 26 - 280 gehalten und-die Flasche samt Inhalt mit etwa 220 - 860 Lux bestrahlt wird, welche von einer Bank von 40 W kaltweissen Fluoreszenzlampen emittiert werden.
Nach 12 Stunden Kultivierung ist der Zucker im Medium vollständig verbraucht. Der PH- Wert des Mediums ist 4, 5. Das Mycel wird abfiltriert und gewogen. Das Nassgewicht ist etwa 4,5 g und entspricht li g Trockensubstanz.
Ein Anteil des Mycels, welcher 420 mg Trockensubstanz entspricht, wird mit Aceton extrahiert. Das Aceton wird verdampft und der Rückstand in trockenem Petroläther gelöst. Die Petrolätherlösung wird mit
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Alle Lösungsmittellösungen werden colorimetrisch analysiert, wobei insgesamt 1630 y Carotinoid-
Material pro 420 mg trockenes Mycel festgestellt werden. Dies entspricht 3890 y Carotinoiden je g trokkenes Mycel. Von diesen sind 3350 y eine Mischung von Xanthophyllen und 540 y ss-Carotin und andere Carotine.
Beispiel 3 : Man arbeitet entsprechend den Angaben in Beispiel 2, nur setzt man dem Fermentationsmedium Glycerin in einer Menge von 1 g/100 ml Medium zu.
Nach 121 Stunden kann man aus der Flasche ungefähr 4, 6 g nasses Mycel gewinnen. Das Mycel wird im Vakuum bei 40 getrocknet und wiegt 1, 03 g.
Ein aliquoter Anteil, welcher 460 mg trockenem Mycel entspricht, wird untersucht, wobei insgesamt 2010 r Carotinoidpigmente festgestellt werden, welche 4370 y Pigmente pro g trockenem Mycel entsprechen. Von diesen sind 3920 y Xanthophyllpigmente und 450 y ss-Carotin und andere Carotine.
Beispiel 4 : Guepiniopsis torta (ATCC Nr. 13300) wird auf Schrägagar der folgenden Zusammensetzung geimpft :
Agar 20 g/I
Rohzucker 20 g/l
Glycerin 10 g/l
Maisquellwasser 4,1 g/l
Enzymatisch hydrolysierte Hefe 2, 0 g/l
Thiamin 10 mg/l
Das PH wird vor der Sterilisation auf 6, 5 eingestellt.
Nach dem Beimpfen werden die Schrägagars unter diffuser Beleuchtung während 14 Tagen bei einer konstanten Raumtemperatur von 26 bis 280 bebrütet.
Während dieser Zeit entwickelt sich eine gelb-orange, runzelige, verfilzte Kultur. Die Kultur eines Schrägagars wird entfernt und in einem Gewebehomogenisator zu einer feinen Pulpe verrieben. Die fein verriebene Kultur wird mit destilliertem Wasser auf 20 ml verdünnt und ein 5 ml-Anteil in eine 500 mlFlasche übertragen, welche 100 ml Medium der folgenden Zusammensetzung enthält :
Difco Malzextrakt 15 g/l
Difco Pepton 7 g/l
Thiamin 1 mg/l
Biotin 0, 01 mg/l
Nach Beimpfung lässt man die Flasche während 72 Stunden in der Nähe des Fensters bei 24-26 ruhig stehen. Die Flasche wird hierauf auf einem mit 270 Umdr/min rotierenden Schtittler unter aeroben Bedingungen während zusätzlichen 75 Stunden bei 22 kultiviert, wobei man eine diffuse Beleuchtung durch eine warmweisse Fluoreszenzlampe aufrechterhält.
Ein 5 ml-Anteil der gebildeten Impffltissigkeit wird in eine 500 ml-Flasche übertragen, die 100 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthält :
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Glucose (technisch) 35 g/l
Maisquellwasser 3 g/l L- (+)-Glutaminsäure 2 g/l
Ammoniumnitrat 2 g/l
Saures Kaliumphosphat 1, 5 g/l
Magnesiumsulfat 1, 0 g/l
Enzymatisch hydrolysierte Hefe 1, 0 g/l
Thiamin 1,0 mg/l
Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 6, 1 eingestellt.
Die beimpfte Flasche wird auf einem mit 270 Umdr/min rotierenden Schutter unter aeroben Bedingungen und unter diffuser Beleuchtung während 5 Tagen bei 25 kultiviert. Hierauf wird das erzeugte Mycel von dem Kulturmedium abfiltriert, wobei ein Nassgewicht an Mycel von 5, 2 g erhalten wird. Nach Trocknen erhält man 1, 04 g.
Ein aliquoter Anteil des frisch gewonnenen Mycels wird auf Carotinoide untersucht, wobei 1185 r Gesamtcarotinoide je g Trockensubstanz festgestellt werden. Von dieser Gesamtmenge beträgt der Xanthophyllanteil 813 y/g. Die restlichen 372 y/g bestehen aus B-Carotin und andern Carotinen.
Beispiel 5 : Eine Kultur von Femsjonia luteoalba (A TCC Nr. 13299) wird entsprechend dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren behandelt, wobei insgesamt 18,8 g trockenes Mycel/l Kultur erhalten werden. Das Mycel enthält 1571 y/g Gesamtcarotinoide, von denen 766 y/g aus einer Mischung von Xanthophyllen besteht und 805 y/g B-Carotin und andere Carotine sind.
Beispiel 6 : Eine Kultur von Dacryomitra nuda (ATCC Nr. 13296) wird in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass die Kultur während der submersen Phase ihres Wachstums mit einer Lampe, welche im wesentlichen 5800 emittiert, bestrahlt wird.
Die Ausbeute an trockenem Mycel beträgt 8,7 g/l. Das Mycel enthält 2540 y/g Gesamtcarotinoide, von denen 1220 r Ig verschiedene Xanthophylle und 1320 r Ig ss-Carotin und andere Carotine sind.
Beispiel 7 : Dacryomitra nuda wird in der in Beispiel 6 beschriebenen Weise kultiviert, mit der
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denen 1240 y/g Xanthophylle und 2020 y/g ss-Carotin und andere Carotine sind.
Beispiel 8 : Calocera cornea (ATCC Nr. 13291) wird in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise behandelt, mit der Ausnahme, dass die Kultur während der Bebrütung mit Strahlungsenergie einer Lampe, welche im wesentlichen im Bereich von 5800 A emittiert, bestrahlt wird. Die Ausbeute an trockenem Mycel ist 13,4 g/l. Das Mycel enthält 1710 y/g Gesamtcarotinoide, von denen 430 y/g Xanthophyllpigmente sind. Der Rest von 1280 y/g besteht aus ss-Carotin und andern Carotine.
Beispiel 9 : Ein 16 Tage alter Schrägagar von Dacrymyces deliquescens wird zur Beimpfung einer 500 ml-Flasche verwendet, welche 100 ml eines Mediums der folgenden Zusammensetzung enthält :
Glucose (technisch) 15 g/l
Ammoniumnitrat 1, 0 g/l
Magnesiumsulfat 1, 5 g/l
Enzymatisch hydrolysierte Hefe l, 0 g/l
Saures Kaliumphosphat 1, 5 g/l
Maisquellwasser 1,0 g/l
Enzymatisch hydrolysiertes Lactalbumin l, 0 g/l L- (+)-Glutaminsäure l. 0 g/l
Zinksulfat-heptahydrat 20 mg/l
Thiamin 5 mg/l
Der PH-Wert wird vor der Sterilisation mit Natriumhydroxyd auf 6,0 eingestellt.
Die beimpfte Flasche wird in einem Raum, der auf konstanter Temperatur von 260 gehalten wird, während 71 1/2 Stunden unbeweglich stehen gelassen. Die Flasche wird hierauf auf einem mit 260 Umdr/min rotierenden Schutter unter aerober Bewegung bei 260 kultiviert, wobei die Flasche der Bestrahlung einer Anlage ausgesetzt wird, welche zwei Fluoreszenzlampen enthält, die im wesentlichen bei 4800 A emittieren.
Nach 41 1/2 Stunden Kultivieren werden 60 ml (3 Vol.-%) der entwickelten Kultur in 2500 ml des folgenden in einer 4000 ml Flasche enthaltenden Mediums übertragen :
<Desc/Clms Page number 10>
Glucose (technisch) 5,0 g/l
Ammoniumnitrat 1, 0 g/l
Magnesiumsulfat 1, 5 g/1
Enzymatisch hydrolysierte Hefe 1, 0 g/l
Saures Kaliumphosphat 1, 5 g/l
Maisquellwasser 1, 0 g/l
Enzymatisch hydrolysiertes Lactalbumin 1, 0 g/l L- (+)-Glutaminsäure l, 0 g/l
Thiamin 5 mg/l
Der pH-Wert wird mit Natriumhydroxyd vor der Sterilisation auf 6, 0 eingestellt.
Die beimpfte Flasche wird auf einem mit 220 Umdr/min rotierenden Schüttler unter aeroben Bedingungen bei 260 und unter Bestrahlung mit Licht von einer matten Glühlampe von 300 W kultiviert.
Ein aliquoter Anteil von 350 ml der entwickelten Kultur wird in ein kolbenförmige Fermentationsgefäss von 7500 ml Inhalt übertragen, welches 5000 ml des folgenden Mediums enthält :
Glucose (technisch) 35 g/l
Maisquellwasser 3 g/l
Diammoniumphosphat 2 g/l
Saures Kaliumphosphat. 1, 5 g/l
Magnesiumsulfat 1, 5 g/l
Kaliumchlorid 1, 0 g/l
Enzymatisch hydrolysiertes Lactalbumin 1, 0 g/l
Enzymatisch hydrolysiertes Soyabohnen- protein 1, 0 g/l
Calciumpantothenat 10 mg/l
Der pH-Wert wird vor der Sterilisation mit Natriumhydroxyd auf 6, 0 eingestellt und 3 ml Siliconentschäumer zugesetzt.
Nach Beimpfen wird der Kolben mit 3 l Luft je Minute belüftet und mit zwei Rührern mit 350 Umdr/min bewegt. Man hält eine Temperatur von 25 bis 270 aufrecht und beleuchtet den Kolben kontinuierlich mit dem Licht einer matten Glühlampe von 500 W, welche 75 cm entfernt ist.
Nach einer Kultivationsdauer von 163 Stunden entwickelt der Pilz eine überreichliche Kultur, welche tief orange-rot gefärbt ist. Die Ausbeute an trockenem Pilz entspricht 10,3 g/l. Man erhält insgesamt 3360 y/g Carotinoidpigmente. Diese enthalten 1600 y/g Xanthophyllpigmente und 1760 y/g 6-Ca- rotin und andere Carotine. Die gesamte Trockensubstanz wiegt 51, 5 g und enthält insgesamt 173500 y Carotinoidpigmente, von denen 82500 y Xanthophyllpigmente und 91000 y 6-Carotin und andere Carotine sind.
Beispiel 10 : Das Verfahren gemäss Beispiel 9 wird wiederholt, mit der Ausnahme, dass die Zusammensetzung des Fermentationsmediums die folgenden Bestandteile enthält :
Glucose (technisch) 50 g/l
Maisquellwasser 3 g/l
Enzymatisch hydrolysiertes Lactalbumin 3 g/l
Diammoniumsulfat 4 g/l
Saures Kaliumphosphat 1, 5 g/l
Magnesiumsulfat l, 5 g/l
Glycin 1, 0 g/l
Kaliumchlorid 1, 0 g/l
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Nach einer Kultivationsdauer von 163 Stunden entspricht das erzeugte Mycel einem Trockengewicht von 18 g/l, enthaltend insgesamt 3140 y/g Carotinoidpigmente, von denen 1550 y/g Xanthophylle und 1590 y/g ss-Carotin und andere Carotine sind.
Das gesamte Myceltrockengewicht beträgt 90,2 g, enthaltend insgesamt 283230 y Carotinoidpigmente, von denen 139810 y Xanthophyllpigmente und 143420 y 8-Carotin und andere Carotine sind.
Beispiel 11 : Ein submerses Impfpräparat von Dacrymyces deliquescens wird in 60 l eines Mediums der folgenden Zusammensetzung entwickelt, welches in einem glasgefütterten Fermentationsgefäss von 150 1 enthalten ist :
<Desc/Clms Page number 11>
Glucose (technisch) 15 g/l
Saures Kaliumphosphat 1, 5 g/l
Magnesiumsulfat-heptahydrat 1, 5 g/l
Enzymatisch hydrolysierte Hefe 1, 0 g/l L- (+)-Glutaminsäure 1. 0 g/l
Ammoniumnitrat'1, 0 g/l
Maisquellwasser 1, 0 g/l
Zinksulfat-heptahydrat 20 mg/l
Thiamin 5 mg/l
Der PH-Wert wird vor der Sterilisation mit Ammoniak auf 6,0 eingestellt und 50 ml Sillkonentschäumer zugesetzt.
Der Ansatz wird bei 1200 während 20 Minuten sterilisiert und unmittelbar hierauf gekühlt. Nach der Beimpfung wird der Ansatz kontinuierlich bewegt und mit 0,3 nr'/Minute steriler Luft belüftet. Man hält eine Temperatur von 25 bis 27 aufrecht und sieht keine Beleuchtung vor.
Nach 72 Stunden hat sich eine schwere dichte Kultur entwickelt. 36 l dieser Kultur werden auf 240 l Fermentationsmedium Ubertragen, welches in einem glasgefutterten Fermentationsgefäss von 380 l enthalten ist. Das Fermentationsmedium hat dieselbe Zusammensetzung wie das Beimpfungsmedium mit der Ausnahme, dass die Konzentration des Zinksulfat-heptahydrates auf 50 mg/l gesteigert wird und Natriumborat-decahydrat in einer Menge von 20 mg/l zugesetzt wird.
Das Innere des Fermentationsgefässes wird durch zwei 400 W-Quecksilberdampflampen beleuchtet, welche durch hitzebeständige Glashüllen geschützt werden, welche sich vom Behälterdeckel bis in die Mitte des Behälters erstrecken.
Der Inhalt des Fermentationsgefässes wird kontinuierlich bewegt und kontinuierlich mit steriler Luft in Mengen von 0,15 bis 0,60 m*/Minute belüftet, wobei man einen geringen Überdruck im Fermenta-
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Nach einer Kultivationsdauer von 164 Stunden erhält man durch Filtration mit einer Korbzentrifuge 8,87 kg Substanz. Ein aliquoter Anteil wird untersucht, wobei 23% Feststoff festgestellt wird. Die trokkene Substanz enthält 2460 y/g Carotinoidpigmente, so dass die Gesamtausbeute an Carotinoidpigmenten für den Ansatz 5000 mg beträgt. Diese enthalten 2710 mg Xanthophylle und 2290 mg 8-Carotin und andere Carotine.
1000 g des nassen Mycels werden mit Wasser in einer Homogenisiermühle zu einer feinen Pulpe verrieben. Das Wasser wird abfiltriert und das Mycel zweimal mit je 6 l Aceton extrahiert. Hierauf führt man zwei weitere Extraktionen mit je 31 Aceton durch. Die vereinigten Acetonextrakte werden bei niederer Temperatur zu einem dicken Sirup von etwa 11 eingedampft. Dieser Sirup enthält insgesamt 66, 2 g Feststoffe, von denen 1167 mg Carotinoide und verwandte Substanzen sind.
Der konzentrierte Extrakt wird mit 5 1 Skellysolve B geschüttelt, mit Wasser versetzt, um die Emulsion zu brechen, und die Skellysolve-Schicht abgetrennt. Hierauf wird eine weitere Extraktion mit 3 l Skellysolve B durchgeführt. Die Skellysolve-Extrakte werden vereinigt und zu einem dicken sirupösen Konzentrat eingedampft.
Das Gewicht des Konzentrates ist 43,2 g, von denen insgesamt 853 mg Carotinoidpigmente sind.
Man erhält so ein angereichertes Produkt, das 19800 y/g Gesamtcarotinoide enthält, von denen 10800 t/g Xanthophyllpigmente sind.
Beispiel 12 : Weitere Arten der Familie Dacrymycetaceae werden gemäss dem Verfahren in Bei- spiel 3 kultiviert, wobei die folgenden Ausbeuten an Carotinoiden erhalten werden :
<Desc/Clms Page number 12>
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> y/gCarotinoide <SEP> (Trockengewicht) <SEP> g <SEP> Mycel/l <SEP>
<tb> Xanthophylle <SEP> Carotine <SEP> Insgesamt <SEP> (Trockengewicht)
<tb> Dacrymyces <SEP> ellisii
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 13293 <SEP> 470 <SEP> 156 <SEP> 626 <SEP> 17, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Dacrymyces <SEP> palmatus
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 13294 <SEP> 90 <SEP> 90 <SEP> 180 <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Dacrymyces <SEP> minor
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 13295 <SEP> 520 <SEP> 1110 <SEP> 1630 <SEP> 5, <SEP> 8 <SEP>
<tb> Dacryopinax <SEP> spathularia
<tb> ATCC <SEP> Nr.
<SEP> 13297 <SEP> 320 <SEP> 590 <SEP> 910 <SEP> 8,1
<tb> Ditiola <SEP> radicata
<tb> ATCC <SEP> Nr. <SEP> 13298 <SEP> 430 <SEP> 250 <SEP> 680 <SEP> 15, <SEP> 1 <SEP>
<tb>
PATENTANSPRÜCHE :
1. Verfahren zur Herstellung von Carotinoiden durch Kultivieren eines Pilzes der Familie Dacrymycetaceae, dadurch gekennzeichnet, dass man den Pilz unter submersen Bedingungen in einem wässerigen Medium kultiviert, welches Quellen verwertbaren organischen Stickstoffs, Ammoniakstickstoffs, verwertbaren Kohlenstoffs, verwertbaren Phosphors und essentielle Spurenmineralien enthält, wobei die Kultur unter Belüftung und Bewegung gehalten wird, und dass man auf die Pilzkultur Licht des sichtbaren Spektrums einwirken lässt.