DE1767260C3 - Verfahren zur Herstellung von Riboflavin - Google Patents

Description

Die Zuchteag kann in einem mit Rühr- und Be- „ · · , ,

lüftmigseinrichtungen ausgestatteten Behälter durch- Beispiel ζ

geführt werde^wobei zweckmäßig Luft in das Kultur- Der Versuch wurde wie im Beispiel 1, jedoch mit der

medium nut Hflfe eines Verteilers eingeleitet wird. Ausnahme wiederholt, daß etwa 30% mehr Fettsäure-

Dk Züchtung wird so lange fortgesetzt, bis ein Maxi- 5 quelle verwendet wurden. Die Hälfte der Fettsäure-

mum der Ribofiavinproduktion erreicht ist, was durch quelle war Linolsäure und die Hälfte Glycerintrioleat.

periodische Probenuntersuchungen nach bekannten Dabei erhielt man die folgenden Ribofiavinausbeuten:

Methoden bestimmt werden kann. Im allgemeinen

ist die Züchtung nach etwa 5 bis 6 Tagen beendet, Kolben Nr. Ausbeute Durchschnittliche

in dieser Zeit wird die Temperatur auf 25 bis 35 ⁰C, 10 Ausbeute vorzugsweise auf 28 bis 30⁰C, gehalten.

Sodann kann aus dem Kulturmedium das Ribo- 1 3570 mg/1 3600 mg/I

flavin nach bekannten Methoden isoliert werden, wie 2 3710 mg/1

durch Ausfällung oder Umkristallisation, oder es 3 3520 mg/1

kann das gesamte riboflavinhaltige Kulturmedi\jm 15

getrocknet werden, wie durch Sprühtrocknung oder B e i s d i e 1 3

Trommeltrocknung, um als Beifuttennittel verwendet

zu werden, das beispielsweise 12 bis 18 Gew.-% Der Versuch wurde wie im Beispiell, jedoch mit der

Riboflavin enthält Ausnahme wiederholt, daß die Fettsäurequelle aus

ao 2,5% Glycerintrioleat bestand und als Aminosäure-Beispiel 1 quelle 1,5% Asparaginsäure an Stelle der Kombination von Ammoniumglutamat und Mononatrium-

Ein Kulturmedium wurde in der Weise hergestellt, glutamat verwendet wurden. Man erhielt Ausbeuten daß man die folgenden Bestandteile in den angegebe- von 2925 und 2875 mg/1 Riboflavin, nen Mengen in Wasser dispergierte: «5

Glucose, analytisch rein 3,3 Gew.-% ei spie Linolsäure, 98%ig 1,25 Gew.-% Der Versuch wurde wie im Beispiel 3, jedoch mit Ülycerintrioleat, gereinigt 1,25 Gew.-% der Ausnahme wiederholt, daß 0,8% Mononatrium- Ammoniumglutamat, 99%ig 0,9 Gew.-% 30 glutamat und 0,8% Asparaginsäure als Aminosäure- Mononatriumglutamat, 99%ig .... 0,8 Gew.-% quelle verwendet wurden. Dabei erhielt man die KH₁PO₁, analytisch rein 0,15 Gew.-% folgenden Ausbeuten: K₁SO₄, analytisch rein 0,08 Gew.-% CaQ₁ · 2H₁O, analytisch rein 0,1 Gew.-% Kolben Nr. Ausbeute Durchschnittliche MgSO₄ · 7 H₁O, analytisch rein 0,08 Gew.-% 35 Ausbeute ZnSO₄ · 7H₁O, analytisch rein 20 ppm FeSO₄ · 7H₁O, analytisch rein .... 20 ppm 1 2950 mg/1 3085 mg/1

i-Inositol 100 mg/1 2 3045 mg/1

Biotin ^g/l 3 3055 mg/l Ammoniumhydroxid 7,0 pH 40 4 3290 mg/1 Destilliertes Wasser in einer Menge auf 100% Beispiel 5

Je etwa 80 ml dieses Kulturmediums wurden in zwei Der Versuch des Beispiels 1 wurde mit der Ausnahme Weithals-Erlenmeyer-Kolben mit einem Fassungsver- 45 wiederholt, daß an Stelle von Linolsäure ölsäure vermögen von 500 ml gegeben. Dann wurde jedem der wendet wurde. Dabei erhielt man die folgenden AusKolben eine zusätzliche Menge von 15 ml destilliertem beuten:

Wasser zugesetzt, um die Verdampfung während der Züchtung auszugleichen. Die Kolben wurden mit Kolben Nr. Ausbeute Durchschnittliche

ihrem Inhalt in einem Autoklav während 20 Minuten 50 Ausbeute bei einer Temperatur von 110⁰C sterilisiert. Dann

wurden die Kolben durch Zugabe von 1 ml einer 1 3670 mg/1 3663 mg/1

auf dem gleichen Kulturmedium 18 bis 24 Stunden 2 3910 mg/1

gezüchteten Kultur von Eremothecium ashbyii geimpft. 3 3410 mg/1

Die Kolben wurden mit fünf Milchfilterscheiben ver- 55

schlossen und dann bei einer Temperatur von 29 ⁰C Beispiele inkubiert Belüftung und Rühren erfolgte durch

Schütteln der Kolben auf einem Rotationsschüttler Um die Bedeutung einer Quelle für ungesättigte

mit 300 U/Min, in Gegenwart von Luft. Die Züchtung Fettsäuren als Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff

war nach 6 Tagen beendet, und dabei wurden die 60 zu zeigen, wurden vier Versuche mit variierenden

folgenden Ribofiavinausbeuten erhalten: Mengen Glycerintrioleat als Fettsäurequelle durchgeführt. Hierzu wurde das folgende Kulturmedium

bereitet:

Kolben Nr. Ausbeute Durchschnittliche ^Ausbeule 65 Glucose 3,3 Gew.-% Ammoniumglutamat 0,9 Gew.- %

1 3640 mg/1 3800 mg/1 Mononatriumglutamat 0,8 Gew.- %

2 3960 mg/1 KH,PO₄, analytisch reim 0,15 Gew.-%

5 6

K₁SO₄, analytisch rein 0,08 Gew.- % Glycerintrioleat die Riboflavinausbeute durch den CaCl, - 2H₂O, analytisch rein 0,10 Gew.-% Organismus. Man erhielt die folgenden Ausbeuten: MgSO₄ · 7H₁O, analytisch rein.... 0,05 Gew.-% '■ . ■ ZnSO₄ · TH₂O, analytisch rein 20 ppm Glycerin- Kolben Riboflavin- Durchschnittliche FeSO₄-7H₁O :..10ppm 5 ^«α Nr. ausbeute Ausbeute

i-Inositol 60 μg/l ■

Biotin. 4,5μ§/1 2,5Gew.-% 1 2480mg/I Destilliertes Wasser auf 100% 2 2525 mg/1 Mit ΝΡ,ΟΗ auf 6,5 eingestellt 3 2710 mg/1

¹⁰ 4 2000 mg/1 2429 mg/1

Jeweils gleiche Mengen dieses Kulturmediums .„_{r o/} <- i7fi0ini»/l

wurden in 500-Jril-Weithals-Erlenmeyer-Kolben gege- ^1>auew'"·' j! 1400 mg/1

ben, die vorbestimmte Menge an Glycerintrioleat _

wurde zugesetzt, dann wurden die Kolben sterilisiert, _g

gekühlt und mit einer aktiven Kultur von Eremo- 15 _

thecium ashbyii beimpft. Nun wurden sie mit fünf 0,6 Gew.- /₀ 9 11U5 mg/1

MilchSlterscheiben verschlossen, in einen Labora- ¹⁰ ii!J;^mg'_#!

toriumsschuttler gegeben und 5 Tage bei 28 bis 30⁰C ⁿ }\^ ^m»|

gezüchtet. Man erhielt in allen Kolben starkes Wachs- ¹² 1250 mg/1 I23I mg/l

tum, was zeigte, daß das Glycerintrioleat nicht für das 20 0,0 Gew.- % 13 420 mg/1

Wachstum erforderlich war, doch steigerte das 14 295 mg/1 357 mg/1

Claims (2)

·■>■*■ 2 das Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, assi- Patentansprüche: , milierbaren Stickstoff- wesentliche Mineralien und Wachstumsfaktoren-enthält, sind in den Ansprüchen

1. Verfahren zur Herstellung von Riboflavin definiert.

durch Züchtung des Organismus Eremothecium 5 Mit diesen Verfahren bekommt man überraschenderashbyii auf einem Kulturmedium, das Quellen weise höhere und gut reproduzierbare Riboflavinfür assimilierbaren Kohlenstoff, assimilierbaren ausbeuten mit vergleichsweise geringen Mengen unver-Stickstoff, wesentliche Mineralien und Wachs- gärbarer Bestandteile, so daß das unmittelbar getumsfaktoren enthält, dadurch gekenn- trocknete gesamte Kulturmedium ein Beifuttermittel zeichnet, daß man ein Kulturmedium ver- io mit hohem Riboflavingehalt ergibt,
wendet, in .dem die QueJIe für assimilierbaren Als Saccharidquelle kann beispielsweise Glucose, Kohlenstoff cijjs 0,5 bis 5,& Gew.-% einer Quelle Saccharose, Maltose, Maiszucker, Melasse, wie Invertfür ungesättigte Fettsäure, 'aus 0 bis 4,5 Gew.-% melasse, zugegeben werden. Technisch reine Glucose einer Saccharidquelle und aus 1,5 bis 2,0 Gew.-% ist als Saccharidquelle bevorzugt, doch können auch Glutaminsäure, Asparaginsäure, Ammonium- oder 15 beispielsweise Rohrzucker, Maiszuckermelasse oder Natriumsalz dieser Aminosäuren oder Gemischen andere saccharidhaltige Materialien verwendet werden, hiervon besteht oder daß man ein Kulturmedium Geeignete Quellen für ungesättigte Fettsäuren sind verwendet, in dem die Quelle für assimilierbaren beispielsweise ungesättigte Fettsäuren selbst und deren Kohlenstoff aus 3,0 bis 4,0 Gew.-% einer Saccharid- Ester mit 18 Kohlenstoffatomen, wie ölsäure, Linolquelle, aus 2,0 bis 3,0 Gew.-% einer Quelle für ao säure oder Linolensäure, die leicht und billig erhältungesättigte Fettsäuren und aus einer Amino- Hch sind. Gereinigte ungesättigte C₁₈-Fettsäuren sind säurequelle besteht, die 0,7 bis 0,8 Gew.-% Glut- besonders bevorzugt. Andere geeignete ungesättigte aminsäure und 0,7 bis 0,9 Gew.-% Mononatrium- Fettsäureester sind beispielsweise natürlich vorkomglutamat enthält. mende Glyceride, wie pflanzliche und tierische öle

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- 25 mit hohem Gehalt an Glyceridestern ungesättigter zeichnet, daß man als Quelle für ungesättigte Fettsäuren, wie Sojabohnenöl, Maisöl, Erdnußöl, Fettsäure Ölsäure, Linolsäure, Linolensäure, Ester Leinsamenöl, Senföl, Fischöle oder Schmalzöl. Wenn dieser Säuren oder Gemische hiervon oder Soja- natürlich vorkommende Glyceride verwendet werden, bohnenöl, Maisöl, Erdnußöl, Leinsamenöl, Senföl, nutzt der Organismus auch den Glycerinanteil des Fischöle oder Schmalzöl verwendet. 3° Moleküls als Kohlenstoffquelle aus.

Die Aminosäurequelle wird gleichzeitig dazu verwendet, dem Organismus assimilierbaren Kohlen·

stoff und assimilierbaren Stickstoff zuzuführen. Wenn

sie Ammoniumionen enthält, können diese in ge-35 wissem Umfang ebenfalls als Stickstoffquelle ausgenutzt werden. Zweckmäßig liegt etwa die Hälfte der

Aus den US-PS 23 74 503, 24 73 818, 24 93 274 verwendeten Aminosäuren als Mononatriumsalz vor, und 26 05 210 ist es bekannt, Riboflavin durch Züch- wobei der Rest als Ammoniumsalz oder freie Aminotung des Organismus Ereraothecium ashbyii auf einem säure vorliegen kann. Gewöhnlich werden technisch Kulturmedium, das Quellen für assimilierbaren Koh- 40 reine Aminosäuren verwendet, doch läßt sich auch rohe fcnstoff, assimilierbaren Stickstoff, wesentliche Mine- Glutaminsäure aus Gärverfahren oder Hydrolyseverralien und Wachstumsfaktoren enthält, herzustellen. fahren verwenden. Wenn erforderlich, um den pH-Wert In diesen Verfahren werden teilweise als Quelle für des Kulturmediums vor der Beimpfung oder während »ssimilierbaren Kohlenstoff ungesättigte Fettsäuren der Züchtung des Organismus einzustellen, kann dies verwendet, als Quellen für assimilierbaren Stickstoff 45 durch Zugabe von Ammoniumhydroxid geschehen, werden aber Proteinmaterialien, wie Fleischmehl, Die Aminosäuren und ihre Salze können bei der Fischmehl, Fleischstückchen, Hautstückchen, Pepton Züchtung des Organismus vollständig verbraucht und Eieralbumin, oder Ammoniumverbindungen oder werden, ohne unvergärbare Rückstände zu hinterKasein verwendet. Die Ausbeuten dieser bekannten lassen.

Verfahren waren relutiv gering und sehr schwankend, 50 Als wesentliche Mineralien kann das Kulturmedium d. h. schlecht reproduzierbar, und die Kulturmedien Phosphor-, Kalium-, Sulfat-, Calcium-, Magnesium-, enthielten am Ende der Züchtung des Organismus Zink- und Eisenverbindungen enthalten. Als Wachsrelativ große Mengen unvergärbarer Bestandteile, tumsfaktoren kann es i-Inositol, Phytinsäure oder so daß bei Trocknung des gesamten Kulturmediums Biotin enthalten.

zur Erzeugung eines trockenen riboflavinreichen 55 Andere Spurenelemente, die nach dem Stand der Beifuttermittels dessen Riboflavingehalt ziemlich ge- Technik empfohlen wurden, wie Kupfersulfat, Naring war. triumchJcrid, Mangansulfat und Borsäure, und andere

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe Substanzen, wie Thiamin, sind hier jedoch überflüssig, bestand somit darin, Riboflavin durch Züchtung des was einen weiteren Vorteil dieses Verfahrens darstellt. Organismus Eremothecium ashbyii nach einem Ver- 60 Die Züchtung kann nach an sich bekannten Verfahren herzustellen, das bessere und besser reprodu- fahren erfolgen, wie gemäß der US-PS 24 93 274. Dazierbare Riboflavinausbeuten ergibt und bei dem am bei wird das gemäß den obigen Angaben hergestellte Ende der Züchtung des Organismus im Kulturmedium Kulturmedium mit Ammoniumhydroxid auf einen kleinere Menge unvergärbarer Bestandteile zurück- pH-Wert im Bereich von 5,5 bis 8,0, vorzugsweise bleiben. 65 von 6,7 bis 7,3, eingestellt, wonach beispielsweise

Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung während 20 Minuten bei 113 C unter Druck sterilivon Riboflavin durch Züchtung des Organismus siert, sodann gekühlt und mit etwa 1% einer Kultur Eremothecium ashbyii auf einem Kulturmedium, von Eremothecium ashbyii geimpft wird.