DE69333026T2 - Verfahren zur heterotrophen herstellung von mikrobiellen produkten mit hohen gehalte an stark ungesättigten omega-3-fettsäuren - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung:
  • Das Gebiet der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Kultivierung heterotropher Organismen für die Produktion von Lipiden mit hohen Konzentrationen an hochgradig ungesättigten Fettsäuren (highly unsaturated fatty acid, HUFA) des Omega-3-Typs, die als Nahrungsmittelzusatzstoffe oder zur Verwendung in pharmazeutischen und industriellen Produkten geeignet für den Konsum durch Mensch und Tier sind.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Hochgradig ungesättigte Fettsäuren (HUFAs) des Omega-3-Typs sind von erheblichem kommerziellen Interesse, weil sie unlängst als wichtige Nahrungsbestandteile zur Verhinderung von Arteriosklerose und koronarer Herzerkrankung, zur Linderung entzündlicher Zustände und zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen erkannt worden sind. Diese segensreichen Wirkungen sind im Ergebnis sowohl darin begründet, dass Omega-3-HUFAs eine kompetitive Inhibition der aus Omega-6-Fettsäuren produzierten Fettsäuren bewirken, als auch in den nutzbringenden Verbindungen, die direkt aus den Omega-3-HUFAs produziert werden (Simopoulos et al., 1986). Omega-6-Fettsäuren sind die vorherrschenden HUFAs, die in Pflanzen und Tieren gefunden wurden. Derzeit besteht eine kommerziell verfügbare Nahrungsmittelquelle der Omega-3-HUFAs in bestimmten Fischölen, die bis zu 20–30% dieser Fettsäuren enthalten können. Die wohltuenden Effekte dieser Fettsäuren können erhalten werden, indem man mehrmals pro Woche Fisch isst oder täglich konzentriertes Fischöl zu sich nimmt. Entsprechend große Mengen an Fischöl werden jedes Jahr zum Verkauf als Nahrungsergänzung verarbeitet und in Kapseln verpackt. Es gibt jedoch mehrere signifikante Probleme mit diesen Fischöl-Nahrungsergänzungen, einschließlich der Bioakkumulation von fettlöslichen Vitaminen und hohen Spiegeln gesättigter Fettsäuren und Omega-6-Fettsäuren, die beide schädliche Auswirkungen auf die Gesundheit haben.
  • Eine andere Quelle von Omega-3-HUFAs sind die Mikroflora-Organismen Thrausfochytrium und Schizochytrium, die detailliert im verwandten US-Patent Nr. 5,130,242 diskutiert werden. Diese Mikroflora hat die Vorteile, heterotroph und zur Produktion hoher Gehalte an Omega-3-HUFA befähigt zu sein. Kendrick et al. (1992) Lipids 27(1), 15–19 weisen in eine Methode ein, Thraustochytrium spp. in einem Medium mit Na2HPO4 zu kultivieren. Es besteht jedoch nach wie vor ein Bedarf für verbesserte Verfahren der Fermentation dieser Mikroflora und der Identifikation verbesserter Anwendungen des Mikroflora-Produktes.
  • Kurze Zusammenfassung der Erfindung
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereit gestellt, um Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemische davon zu züchten, was beinhaltet, Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemische davon in einem Kulturmedium zu züchten, welches ein Natriumsalz, das nicht Chlorid ist, enthält und weniger als 500 Milligramm Chlorid pro Liter des Kulturmediums aufweist.
  • Somit ist die vorliegende Erfindung auf ein neues Verfahren gerichtet, um die Mikroflora Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemische davon zu züchten, bei dem man die Mikroflora in einem Kulturmedium züchtet, welches Natriumsalze, die nicht Chlorid sind, enthält, wobei insbesondere Natriumsulfat eingeschlossen ist. Genauer gesagt, wird ein signifikanter Anteil des Natriumbedarfs der Fermentation als ein Natriumsalz bereitgestellt, das nicht Chlorid ist. Das vorliegende Verfahren ist besonders nützlich bei der kommerziellen Produktion, da der Chloridanteil im Medium signifikant vermindert werden kann, wodurch die korrosiven Effekte von Chlorid auf die Fermentationsgeräte vermieden werden. Zusätzlich ist die vorliegende Erfindung besonders nützlich zur Herstellung von Lebensmittelprodukten bei der Verwendung in der Wasserkultur, da Thraustochytrium und Schizochytrium, die in solchen Medien kultiviert werden, viel kleinere Klumpen bilden als jene, die in Medien mit hohem Chloridgehalt kultiviert werden und dadurch besser als Nahrungsquelle für Shrimpslarven verfügbar sind. Insbesondere können Thraustochytrium und Schizochytrium, die in Medium mit Natriumsulfat gezüchtet werden, Zellaggregate mit einer durchschnittlichen Größe von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) im Durchmesser aufweisen.
  • Eine weitere Ausführung der vorliegenden Erfindung ist die Produktion einer Mikroflora-Biomasse, die Thrausfochytrium, Schizochytrium und Gemische davon enthält, die eine durchschnittliche Zellaggregatgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) aufweisen.
  • Die Mikroflora-Biomasse ist nützlich für die Wasserkultur und insbesondere dazu, um Shrimpslarven zu füttern, da die Mikroflora die für Shrimps benötigten primären Nahrungsvorteile eines hohen Sterolgehaltes und eines hohen Gehalts an hochgradig ungesättigten Omega-3-Fettsäuren (HUFA) aufweist. Zusätzlich kann die Mikroflora aufgrund der kleinen Zellaggregatgröße von den Shrimpslarven, den Salzwassershrimps, Rotatorien und Mollusken als Nahrung aufgenommen werden. Die vorliegende Erfindung beinhaltet ferner ein Verfahren zur Produktion dieser Organismen, welches beinhaltet, Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemische davon zu verfüttern, die gemäß der vorliegenden Erfindung gezüchtet wurden und eine durchschnittliche Zellgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) aufweisen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf ein Futterprodukt, das sich aus Mikroflora zusammensetzt, die aus der Gruppe bestehend aus Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemischen davon ausgewählt ist und gemäß der vorliegenden Erfindung gezüchtet wurde, sowie aus einer zusätzlichen Komponente, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Flachssamen, Rapssamen, Sojabohnen, Avocadomehl und Gemischen davon. Ein besonderer Vorteil dieses Futterproduktes besteht darin, das es einen hohen Anteil an langkettigen Omega-3-Fettsäuren aufweist, sowie einen hohen Anteil kurzkettiger Omega-3-Fettsäuren aus der zusätzlichen Komponente.
  • In einer weiteren Ausführungsform wird das Futterprodukt durch Extrusion hergestellt. Das Extrusionsverfahren beinhaltet das Mischen der Mikroflora mit der zusätzlichen Komponente, wodurch der Feuchtigkeitsgehalt des Futterproduktes reduziert wird. Das Futterprodukt wird dann unter Hitze extrudiert, wodurch ein signifikanter Anteil der reduzierten Feuchtigkeit entfernt wird. Der verbleibende Anteil des ursprünglichen Feuchtigkeitsgehaltes wird problemlos durch Lufttrocknung oder kurze Erhitzungsphasen entfernt, wodurch die allgemeinen Energieerfordernisse des Trocknens und die potentielle Zersetzung der omega-3-HUFAs durch ausgedehnte Trocknung bei hohen Temperaturen vermindert werden.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 ist eine graphische Darstellung der HUFA-Produktion in neu isolierten Stämmen der Erfindung, repräsentiert durch ∎, und in zuvor isolierten Stämmen, repräsentiert durch +. Jeder Punkt repräsentiert einen Stamm, wobei die Position jedes Punktes durch die Gewichtsprozent der gesamten Fettsäuren, die zu den Omega-3-HUFAs gehören (Abszisse), und die Gewichtsprozent der gesamten Fettsäuren, die zu den Omega-6-Fettsäuren gehören (Ordinate), bestimmt wird. Es wurden nur die Stämme der Erfindung aufgetragen, bei denen weniger als 10,6 Gewichts-% der gesamten Fettsäuren Omega-6-Fettsäuren und mehr als 67% der gesamten Fettsäuren Omega-3-Fettsäuren waren.
  • 2 ist eine graphische Darstellung der HUFA-Produktion in neu isolierten Stämmen der Erfindung, dargestellt durch ∎, sowie in zuvor isolierten Stämmen, dargestellt durch +. Jeder Punkt repräsentiert einen Stamm, wobei die Position jedes Punktes durch die Gewichtsprozent der gesamten Fettsäuren, die zu den Omega-3-HUFAs gehören (Abszisse), und die Gewichtsprozent der gesamten Fettsäuren, die Eicosapentaensäure (EPA C20:5n-3) waren (Ordinate), bestimmt wird. Es wurden nur die Stämme der Erfindung aufgetragen, bei denen mehr als 67 Gewichts-% der gesamten Fettsäuren Omega-3-Fettsäuren und mehr als 7,8 Gewichts-% der gesamten Fettsäuren C20:5n-3 waren.
  • 3 ist eine graphische Darstellung der Omega-3-HUFA-Zusammensetzung in neu isolierten Stämmen der Erfindung, dargestellt durch σ, und zuvor isolierten Stämmen, dargestellt durch +. Jeder Punkt repräsentiert einen separaten Stamm. Die Werte auf der Abszisse sind Gewichtsanteile sämtlicher Omega-3-HUFAs, die C20:5n-3 waren, und auf der Ordinate die Gewichtsanteile sämtlicher hoch ungesättigter Omega-3-Fettsäuren, die C22:6n-3 waren. Es wurden nur Stämme der Erfindung aufgetragen, die entweder einen Gewichtsanteil an C20:5n-3 von 28% oder mehr, oder die einen Gewichtsanteil an C22:6n-3 von über 93,6% aufwiesen.
  • 4 ist ein Graph, der das Wachstum verschiedener neu isolierter Stämme der Erfindung sowie zuvor isolierter Stämme bei 25°C und bei 30°C zeigt. Die Wachstumsraten sind gegenüber der Wachstumsrate des Stammes U-30 bei 25°C normalisiert. Zuvor isolierte Stämme sind durch ihre ATCC-Zugangsnummern bezeichnet.
  • 5 ist ein Graph der Gesamtausbeuten der zellulären Produktion nach Induktion durch Stickstoffbegrenzung. Es wurde jeweils das aschefreie Trockengewicht, die gesamten Fettsäuren und Omega-3-HUFAs wie angezeigt aufgetragen und im Bezug auf den entsprechenden Wert für den Stamm 28211 normalisiert. Alle Stämme werden durch ATCC-Zugangsnummern identifiziert.
  • 6 ist ein Graph der Fettsäureausbeuten nach Wachstum in Kulturmedien mit der auf der Abszisse angezeigten Salzkonzentration. Die dargestellten Stämme sind die neu isolierten Stämme S31 (ATCC 20888) (⧠) und U42-2 (ATCC 20891) (+) und die zuvor isolierten Stämme ATCC 28211 (♢) und ATCC 28209 (Δ). Fettsäureausbeuten werden als relative Ausbeuten aufgetragen, die gegenüber einem willkürlichen Wert von 1,00, basierend auf der von S31 (ATCC 20888) (⧠) gezeigten durchschnittlichen Wachstumsrate, über den getesteten Salzbereich normalisiert sind.
  • 7 ist ein Graph der Steigerungen des Omega-3-HUFA-Gehalts in den Gesamtlipiden des Salzwasserkrebschens Artemia salina, das mit dem Thraustochytriden Stamm (ATCC 20890) gefüttert wurde, wobei die Isolation mittels des Verfahrens in Beispiel 1 erfolgte. EPA = C20:5n-3; DNA = C22:5n-3.
  • 8 ist ein Graph der Steigerungen des Omega-3-HUFA-Gehalts in den Gesamtlipiden des Salzwasserkrebschens Artemia salina, das mit dem Thraustochytriden Stamm (ATCC 20888) gefüttert wurde, wobei die Isolation mittels des Verfahrens in Beispiel 1 erfolgte. EPA = C20:5n-3; DHA = C22:5n-3.
  • Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Zum Zweck der Definition in der gesamten Anmeldung ist zu verstehen, dass es sich bei einer Fettsäure um eine aliphatische Monocarboxylsäure handelt. Lipide sind als Fette oder Öle zu verstehen, welche die Glycerid-Ester von Fettsäuren zusammen mit assoziierten Phosphatiden, Sterolen, Alkoholen, Kohlenwasserstoffen, Ketonen und verwandten Verbindungen einschließen.
  • Es wird ein üblicherweise verwendetes Kurzschrift-System in dieser Beschreibung verwendet, um die Struktur der Fettsäuren zu bezeichnen (z. B. Weete, 1980). Dieses System verwendet den Buchstaben „C" in Begleitung einer Nummer, die die Anzahl der Kohlenstoffe in der Kohlenwasserstoffkette darstellt, gefolgt von einem Doppelpunkt und einer Zahl, die die Zahl der Doppelbindungen anzeigt, wie z. B. bei C20:5, Eicosapentaensäure. Fettsäuren werden nummeriert, wobei bei dem Kohlenstoffatom der Carboxygruppe begonnen wird. Die Position der Doppelbindungen wird durch Hinzufügen des griechischen Buchstabens Delta (Δ), gefolgt von der Kohlenstoffnummer der Doppelbindung, angezeigt, z. B. C20:5 omega-3Δ5,8,11,14,17. Die „omega"-Bezeichnung ist ein Kurzschriftsystem für ungesättigte Fettsäuren, wobei eine Zählweise ab/nach dem carboxyterminalen Kohlenstoff verwendet wird. Zur Vereinfachung wird n-3 verwendet, um „omega-3" zu symbolisieren, insbesondere bei Verwendung der hier beschriebenen numerischen Kurzschrift-Nomenklatur. Hochgradig ungesättigte Omega-3-Fettsäuren sind als polyethylenische Fettsäuren zu verstehen, bei denen die letzte Ethylenbindung 3 Kohlenstoffe von der terminalen Methylgruppe der Fettsäure entfernt und in Verbindung zu dieser auftritt. Somit wäre die vollständige Nomenklatur für Eicosapentaensäure, eine hochgradig ungesättigte Omega-3-Fettsäure, C20:5n-3Δ5,8,11,14,17. Zur Abkürzung wird die Position der Doppelbindungen (Δ5,8,11,14,17) Weggelassen. Eicosapentaensäure wird somit als C20:5n-3, Docosapentaen-Säure (C22:5n-3Δ7,10,13,16,19) ist folglich C22:5n-3 und Docosahexaen-Säure (C22:6n-3Δ4,7,10,13,16,18) ist C22:6n-3. Die Bezeichnung „hochgradig ungesättigte Fettsäure" bedeutet eine Fettsäure mit 4 oder mehr Doppelbindungen. „Vielfach ungesättigte Fettsäuren" bezeichnen eine Fettsäure mit 1 bis 3 Doppelbindungen.
  • Ein Verfahren des Sammelns und Testens ist entwickelt worden, um auf einfachem Weg viele Stämme von Mikroorganismen mit der folgenden Kombination ökonomisch erstrebenswerter Merkmale für die Produktion von Omega-3-HUFAs zu isolieren: 1) Fähigkeit zu heterotrophem Wachstum; 2) hoher Gehalt an Omega-3-HUFAs; 3) einzellig; 4) vorzugsweise niedriger Gehalt an gesättigten und Omega-6-HUFAs; 5) vorzugsweise ohne Pigmente, weiße oder im wesentlichen farblose Zellen; 6) vorzugsweise thermotolerant (Fähigkeit, bei Temperaturen über 30°C zu wachsen); und 7) vorzugsweise euryhalin (fähig, über einen weiten Bereich von Salzkonzentrationen zu wachsen, insbesondere jedoch bei niedrigen Salzkonzentrationen). Dieses Verfahren ist im Detail im verwandten US-Patent Nr. 5,130,242 beschrieben.
  • Mittels Verwendung des Sammel- und Test-Verfahrens können Stämme einzelliger Mikroflora isoliert werden, die Fettsäuregehalte von bis zu 45% des gesamten zellulären Trockengewichts (% dry weight, %dwt) aufweisen, die Wachstum über einen Temperaturbereich von 15–48°C zeigen und in einem Kulturmedium mit sehr geringem Salzgehalt wachsen. Viele der Stämme mit sehr hohem Omega-3-Gehalt wachsen sehr langsam. Stämme, die gemäß des oben dargestellten Verfahrens isoliert wurden, und die schnelles Wachstum, gute Produktivität und hohen Gehalt an Omega-3-HUFA zeigen, weisen Gehalte an ungesättigten Omega-3-Fettsäuren von bis zu etwa 12% des Trockengewichts auf.
  • Die vorliegende Endung stellt das Wachstum von Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemischen davon mit hohem Omega-3-HUFA-Gehalt in Fermentationsmedium bereit, das Natriumsalze enthält, die nicht Chlorid sind, bevorzugt Natriumsulfat. Genauer gesagt, wird ein signifikanter Anteil des Natriumbedarfs bei der Fermentation in Form von Natriumsalzen zur Verfügung gestellt, die nicht Chlorid sind. Zum Beispiel werden weniger als 75% des Natriums im Fermentationsmedium in Form von Natriumchlorid zur Verfügung gestellt, in bevorzugterer Weise weniger als 50% und noch bevorzugter weniger als 25%. Ein besonderer Vorteil der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Medium die von der Mikroflora zum Wachstum benötigte Natriumquelle in Abwesenheit signifikanter Mengen an Chlorid bereit stellt, welches das Gefäß, in dem die Mikroflora gezüchtet wird, ebenso wie andere Gerätschaften der Fermentation oder späteren Weiterverarbeitung korrodieren kann. Es wurde überraschender Weise herausgefunden, dass die Mikroflora der vorliegenden Erfindung bei Chloridkonzentrationen von weniger als 500 mg/l, bevorzugt von weniger als 250 mg/l und noch bevorzugter bei einer Konzentration zwischen 60 mg/l und 120 mg/l gezüchtet werden kann, während weiterhin hohe Ausbeuten an Biomasse pro Zucker von 50% oder mehr erzielt werden. Wie unten stehend diskutiert, besteht ein zusätzlicher Vorteil der vorliegenden Erfindung in der Herstellung von Mikroflora, die einen hohen Gehalt an Omega-3-HUFA aufweist, jedoch eine ausreichend kleine Zellaggregatgröße aufweist, um von Shrimpslarven, Salzwassershrimps, Rotatorien und Mollusken aufgenommen zu werden.
  • Natriumsalze, die kein Chlorid enthalten, können Sodaasche (eine Mischung aus Natriumcarbonat und Natriumoxid), Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Natriumsulfat und Gemische davon umfassen, bevorzugt beinhalten sie Natriumsulfat. Sodaasche, Natriumcarbonat und Natriumbicarbonat neigen dazu, den pH des Fermentationsmediums zu erhöhen und erfordern somit Kontrollschritte, um den richtigen pH des Mediums aufrecht zu erhalten. Die Konzentration an Natriumsulfat ist wirksam in der Lage, den Natriumsalz-Bedürfnissen der Mikroflora zu entsprechen, wobei die Natriumkonzentration (ausgedrückt als Na in g/l) bevorzugt größer ist als 1,0 g/l, bevorzugter liegt sie zwischen 1,0 g/l und 50 g/l, und noch bevorzugter zwischen 2,0 g/l und 25 g/l.
  • Es ist überraschender Weise festgestellt worden, dass die Fermentation der Stämme in Anwesenheit eines nicht chloridhaltigen Natriumsalzes und insbesondere von Natriumsulfat, die Zellaggregatgröße der Stämme auf weniger als 150 μm (150 Mikrometer), bevorzugt auf weniger als 100 μm (100 Mikrometer) und bevorzugter auf weniger als 50 μm (50 Mikrometer) limitiert. Wie hier verwendet, bezieht sich der Begriff der Zellaggregatgröße auf den ungefähren durchschnittlichen Durchmesser von Klumpen oder Zellaggregaten in einem Fermentationsmedium einer mikrofloralen Kultur. Typischer Weise haben mehr als 25% der Zellaggregate in einer mikrofloralen Kultur eine Zellaggregatgröße unterhalb der Durchschnittsgröße, bevorzugter mehr als 50% und noch bevorzugter mehr als 75%. Mikroflorale Zellen, die in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung hergestellt wurden, werden den oben beschriebenen Parametern der Zellaggregatgröße gerecht, während sie sich im Fermentationsmedium befinden, und ebenso nach dem Einfrieren und/oder Trocknen der Biomasse, wenn sie in Flüssigkeit resuspendiert oder physikalisch geschüttelt werden, so etwa in einem Mischgerät oder einem Vortexer. Das vorliegende Verfahren ist besonders wichtig für Mikroflora, die sich durch sukzessive Zweiteilung repliziert (wobei sich eine einzelne Zelle repliziert, indem sie sich in zwei Zellen teilt, die sich jeweils in zwei weitere teilen, etc.), da die Zellen zum Zusammenklumpen unter Ausbildung multizellulärer Aggregate neigen, die oft außerhalb der oben definierten Größenparameter der Zellaggregate liegen, wenn die Zellen den Teilungsprozess schnell und wiederholt durchlaufen. Schizochytrium repliziert durch sukzessive Zweiteilung und durch Ausbildung von Sporangien, die Zoosporen freisetzen. Thraustochytrium jedoch repliziert nur durch die Ausbildung von Sporangien und die Freisetzung von Zoosporen. Für Thrausfochytrium, das durch Ausbildung von Sporangien/Zoosporen repliziert, kann das Verklumpen – trotz einer möglichen kleineren Zellzahl im Aggregat als bei den durch sukzessive Zweiteilung gebildeten Aggregaten – ebenfalls ein Problem sein, insbesondere da die individuellen Zellgrößen von Thraustochytrium dazu neigen, größer zu sein und somit Klumpen aus einer kleinen Zellzahl größer sind. Es ist jedoch ein hinterlegter Stamm von Thraustochytrium, ATCC 26185, identifiziert worden, der keine signifikante Aggregation zeigt.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist herausgefunden worden, dass der Lipidgehalt der Stämme durch Begrenzung des Sauerstoffgehalts des Fermentationsmediums während des Wachstums von Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemischen davon gesteigert werden kann. Die optimale Sauerstoffkonzentration zur Lipidproduktion kann für jede spezifische Mikroflora durch Variation des Sauerstoffgehalts im Medium bestimmt werden. Insbesondere wird der Sauerstoffgehalt des Fermentationsmediums bei einem Sauerstoffgehalt von weniger als 40% der Sättigung und bevorzugt zwischen 5% und 40% der Sättigung gehalten.
  • Das Wachstum der Stämme durch das erfinderische Verfahren kann bei jeder Temperatur erreicht werden, die einem befriedigenden Wachstum der Stämme förderlich ist, z. B. zwischen 5°C und 48°C, bevorzugt zwischen 15°C und 40°C und bevorzugter zwischen 25°C und 35°C. Das Kulturmedium wird während der Kultur typischer Weise alkalischer, wenn der pH nicht durch Säurezugabe oder Puffer kontrolliert wird. Die Stämme werden über einen pH-Bereich von 5,0–11,0 wachsen, mit einem bevorzugten Bereich von 6,0–8,5.
  • Verschiedene Fermentations-Parameter für die Animpfung, das Wachstum und die Gewinnung von Mikroflora werden im Detail im US-Patent Nr. 5,130,242 diskutiert. Die in einem Fermentationsdurchlauf geerntete Biomasse kann getrocknet werden (z. B. durch Sprühtrocknung, Tunneltrocknung, Vakuumtrocknung oder ein ähnliches Verfahren) und als Futter oder Futterzusatzstoff für jedes Tiere verwendet werden, dessen Fleisch oder Produkte vom Menschen konsumiert werden. In ähnlicher Weise können extrahierte omega-3-HUFAs als Futter oder Futterzusatz verwendet werden. Alternativ kann die geerntete und gewaschene Biomasse direkt (ohne Trocknung) als Futterergänzung verwendet werden. Um ihre Lagerdauer zu verlängern, kann die feuchte Biomasse angesäuert (ungefähr pH = 3,5–4,5) und/oder pasteurisiert oder blitzerhitzt werden, um Enzyme zu inaktivieren, und kann dann in Büchsen oder Flaschen eingebracht oder unter Vakuum oder nicht-oxidierender Atmosphäre (z. B. N2 oder CO2) verpackt werden. Der Begriff „Tier" meint jeden Organismus, der zur Obergruppe (Königreich) der Animalia gehört und beinhaltet ohne Beschränkung hierauf jedes Tier, von dem Geflügelfleisch, Fleisch von Meeresfrüchten, Rindfleisch, Schweinefleisch oder Lammfleisch stammt. Fleisch von Meeresfrüchten stammt, ohne Beschränkung hierauf, von Fisch, Shrimps/Krebsen und Schellfisch. Der Begriff „Produkte" beinhaltet jedes Produkt außerhalb von Fleisch, das von solchen Tieren gewonnen wird, einschließlich – jedoch ohne Beschränkung hierauf – Eier oder andere Produkte. Bei Verfütterung an solche Tiere werden omega-3-HUFAs in der geernteten Biomasse oder extrahierte Omega-3-HUFAs in das Fleisch, die Eier oder andere Produkte solcher Tiere eingebaut, um deren Gehalt an omega-3-HUFA zu steigern.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der geernteten Biomasse als Futterprodukt für Shrimpslarven, Salzwassershrimps, Rotatorien und Mollusken und insbesondere für Shrimpslarven. Während des Larvenstadiums der Entwicklung sind Shrimpslarven nicht fähig, einige Futterquellen zu nutzen, weil die Futterquelle zu groß ist. Insbesondere sind Shrimpslarven in bestimmten Stadien der Entwicklung nicht in der Lage, eine Futterquelle zu nutzen, die einen Durchmesser von über 150 μm (150 Mikrometer) aufweist. Somit ist Mikroflora, die in Fermentationsmedium, enthaltend ein Natriumsalz, das nicht Chlorid ist, und das insbesondere Natriumsulfat ist, gemäß der obigen umfänglichen Diskussion zur Verwendung als Futterprodukt für Shrimps geeignet. Wie oben diskutiert, besitzt unter solchen Bedingungen gezüchtete Mikroflora typischer Weise eine Zellaggregatgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer), bevorzugt von weniger als 100 μm (100 Mikrometer) und bevorzugter von weniger als 50 μm (50 Mikrometer).
  • Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der Mikroflora gemäß der vorliegenden Erfindung als Futterquelle für Shrimps besteht darin, dass solche Mikroflora einen signifikanten Gehalt an Sterol einschließlich Cholesterin aufweist, das einen primären erforderlichen Nahrungsbestandteil für Shrimps darstellt. Die Mikroflora der vorliegenden Erfindung hat typischerweise einen Sterolgehalt von vorzugsweise mindestens 0,1% aschefreiem Trockengewicht (ash-free dry weight, afdw), bevorzugter von mindestens 0,5% afdw und noch bevorzugter von mindestens 1,0% afdw. Zusätzlich weist die Mikroflora der vorliegenden Erfindung typischerweise einen Cholesteringehalt von vorzugsweise mindestens 15% des gesamten Sterolgehaltes, bevorzugter von mindestens 25% des gesamten Sterolgehaltes und noch bevorzugter von mindestens 40% des gesamten Sterolgehaltes auf. Darüber hinaus versorgt die mikroflorale Biomasse der vorliegenden Erfindung die Shrimps auch mit weiteren erforderlichen Nährstoffen wie Omega-6-Fettsäuren, Protein, Kohlenhydraten, Pigmenten und Vitaminen.
  • Das mikrobielle Produkt der vorliegenden Erfindung ist wertvoll als Quelle von Omega-3-HUFAs für Fisch, Shrimps und andere Erzeugnisse, die durch Wasserkultur gewonnen werden. Das Produkt kann, wie oben beschrieben, als Futtermittel für Shrimps verwendet werden; alternativ kann es direkt als Zusatz zu den Futtermitteln für Shrimps und Fisch allgemein hinzu gegeben werden; weiterhin alternativ kann es an Salzwassershrimps oder andere lebende Futterorganismen, die für den Verbrauch durch einen in Wasserkultur gehaltenen Organismus vorgesehen sind, verwendet werden. Die derartige Verwendung solcher Mikroflora erlaubt es dem Shrimpszüchter, signifikant höhere Wachstums- und/oder Überlebensraten für Shrimpslarven zu erhalten und postlarvale Shrimps zu produzieren, die widerstandsfähiger und robuster sind.
  • Für die meisten Futterverwendungen wird der Fettsäuregehalt der geernteten Zellen etwa 15–50% dwt betragen, wobei das verbleibende Material im wesentlichen aus Proteinen und Kohlenhydraten besteht. Das Protein kann wesentlich zum Nahrungswert der Zellen beitragen, da verschiedene der getesteten Stämme alle essentiellen Aminosäuren aufweisen und als ernährungsbezogen ausgewogenes Protein zu betrachten sind.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung eines Futterproduktes unter Verwendung von Thraustochytrium, Schizochytrium und Gemischen davon gemäß der vorliegenden Erfindung, kombiniert mit einem zusätzlichen Bestandteil, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rapssamen, Flachssamen, Sojabohnen und Avocadomehl. Ein besonderer Vorteil dieser Ausführungsform besteht darin, dass das Futterprodukt sowohl kurzkettige Omega-3-HUFAs aus der Zusatzkomponente und langkettige Omega-3-HUFAs aus der Mikroflora enthält. Nahrungsmittelprodukte, die Flachssamen, Rapssamen, Sojabohnen und Avocadomehl aufweisen, sind als nützlich zur Bereitstellung einer Quelle kurzkettiger Omega-3-HUFAs und zur zusätzlichen Bereitstellung einer Quelle kurzkettiger Omega-3-HUFAs, die beim Verzehr von Menschen und Tieren verlängert werden können, bekannt. Solche Nahrungsmittelprodukte haben jedoch die Nachteile, dass hohe Gehalte an Cholin aus der Zusatzkomponente vorhanden sind, die primäre Amine bilden können und in einem unangenehmen Fischgeruch resultieren, und dass außerdem giftige Verbindungen aus der Zusatzkomponente vertreten sind, die bei hohen Gehalten z. B. die Eiablage bei Hühnern hemmen oder die Tiere dazu bringen können, das Futter nicht mehr anzunehmen. Als solche haben die Nahrungsmittelprodukte der vorliegenden Erfindung den Vorteil eines verringerten Gehalts an Flachssamen, Rapssamen, Sojabohnen oder Avocadomehl, da der das Nahrungsmittelprodukt aufnehmende Organismus keine hohen Gehalte kurzkettiger Omega-3-HUFAs zum Zweck einer Umwandlung in langkettige HUFAs benötigt. Somit resultiert der verminderte Gehalt des Nahrungsmittelproduktes an Flachssamen und Rapssamen in verminderten Mengen an Cholin und/oder im Nahrungsmittelprodukt vorhandenen inhibitorischen giftigen Verbindungen.
  • Die in dem Nahrungsmittelprodukt verwendete Menge an Thraustochytrium, Schizochytrium und den Gemischen davon können zwischen 5% und 95% Gewichtsanteil betragen. Die zusätzliche Komponente kann in dem Nahrungsmittelprodukt in einem Bereich zwischen 5% und 95% Gewichtsanteil vorhanden sein. Zusätzlich kann das Nahrungsmittelprodukt ebenso andere Komponenten einschließlich Getreide, bzw. Samenkörnern, Zusatzmitteln, Vitaminen, Binde- und Konservierungsmitteln beinhalten. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das obige Nahrungsmittelprodukt unter Verwendung eines Extrusionsverfahrens hergestellt. Das Extrusionsverfahren beinhaltet das Mischen der Mikroflora mit der Zusatzkomponente, wobei der Feuchtigkeitsgehalt der mikrofloralen Biomasse durch die Menge der zusätzlich eingemischten Komponente reduziert wird. Das Nahrungsmittelprodukt wird unter Hitze extrudiert, wobei weitere Feuchtigkeit aus dem Nahrungsmittelprodukt entfernt wird. Das resultierende Produkt mit niedrigem Feuchtigkeitsgehalt kann luftgetrocknet oder durch relativ kurze Erhitzungszeiten getrocknet werden, wodurch der allgemeine Energiebedarf des Trocknens und der potentielle Abbau der Omega-3-HUFAs aufgrund langer Zeitspannen bei hohen Temperaturen reduziert werden. Zusätzlich kann die Hitze des Extrusionsprozesses einige der unerwünschten giftigen Verbindungen abbauen, die üblicher Weise in der Zusatzkomponente gefunden werden, und die z. B. die Eiablage bei Hennen inhibieren oder Tiere zur Verweigerung ihres Futters bewegen können.
  • Die vorliegende Erfindung wird anhand von Ausführungsbeispielen detaillierter beschrieben. Arten, welche die oben beschriebenen Auswahlkriterien erfüllen, sind im Stand der Technik nicht beschrieben worden. Unter Anwendung dieser Auswahlkriterien sind über 25 potentiell vielversprechende Stämme aus etwa 1000 getesteten Proben isoliert worden. Aus den etwa 20.500 Stämmen in der „American Type Culture Collection" (ATCC) wurden später 10 Stämme als zu den selben taxonomischen Gruppen wie die isolierten Stämme gehörend, identifiziert. Die noch lebensfähigen Stämme in der Sammlung wurden beschafft und dazu verwendet, um sie mit den isolierten Stämmen zu vergleichen und sie mittels der offenbarten Verfahren zu kultivieren. Die Ergebnisse dieses Vergleichs sind in den Beispielen 4 und 5 unten dargestellt.
  • Die modernsten taxonomischen Theoretiker ordnen die Thraustochytriden bei den Algen oder algenartigen Protisten ein. Alle hier offenbarten und beanspruchten Stämme einzelliger Mikroorganismen sind Mitglieder der Ordnung Thraustochytriales (Ordnung: Thraustochytriales; Familie: Thraustochytriaceae; Gattung: Thraustochytrium oder Schizochytrium). Zu allgemeinen Zwecken der Diskussion werden diese Mikroorganismen hier als Mikroflora bezeichnet, um ihre nicht gesicherte exakte taxonomische Einordnung besser zu kennzeichnen.
  • Die unten stehenden neu identifizierten Stämme wurden gemäß des Budapester Vertrages über die Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen zum Zweck des Patentverfahrens hinterlegt.
  • Bevorzugte Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, besitzen alle Identifizierungsmerkmale der hinterlegten Stämme, insbesondere die Identifizierungsmerkmale, Omega-3-HUFAs wie hier beschrieben produzieren zu können, und bei Kultivierung unter den hier beschriebenen Bedingungen die genannten Merkmale der Zellaggregatgröße aufzuweisen. Insbesondere beziehen sich die bevorzugten Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung auf die folgenden hinterlegten Mikroorganismen und deren Mutanten.
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  • Die vorliegende Erfindung, obwohl in Begriffen spezifischer Organismenstämme offenbart, soll alle derartigen Verfahren und Stämme beinhalten, die gemäß der hier offenbarten Lehren erhältlich und nützlich sind, einschließlich all jener Substitutionen, Modifikationen und Verbesserungen, die für den Durchschnittsfachmann verfügbare Mittel, bzw. Hilfsmittel darstellen.
  • Die folgenden Beispiele und Testergebnisse werden zum Zweck der Illustration bereit gestellt und sind nicht dazu gedacht, den Schutzbereich der Erfindung einzuschränken (Die Beispiele 1–12 sind präparative Beispiele).
  • Beispiel 1. Sammlung und Test
  • Eine 150 ml Wasserprobe wurde aus einem seichten Inland-Salzwassertümpel entnommen und in einer sterilen Polyethylenflasche aufbewahrt. Es wurden besondere Anstrengungen unternommen, um etwas von dem lebenden Pflanzenmaterial und dem natürlich vorkommenden Detritus (absterbendes Material von Pflanzen und Tieren) in die Wasserprobe einzubeziehen. Die Probe wurde bis zur Rückkehr ins Labor auf Eis gehalten. Im Labor wurde die Wasserprobe für 15–30 Sekunden geschüttelt und 1–10 ml der Probe wurden in eine Filtereinheit pipettiert oder gegossen, die 2 Arten von Filtern enthielt, nämlich 1) auf der Oberseite einen sterilen Whatman #4-Filter mit einer Porengröße von etwa 25 μm und 47 mm Durchmesser und 2) unter dem Whatman-Filter einen 47 mm Durchmesser aufweisenden Polycarbonat-Filter mit einer Porengröße von etwa 1,0 μm. Die gegebenen geringfügigen Abweichungen der nominalen Porengrößen der Filter und der auf dem Polycarbonat-Filter gesammelten Zellen liegen in ihrer Größe etwa zwischen 1,0 μm bis etwa 25 μm.
  • Der Whatman-Filter wurde entfernt und verworfen. Der Polycarbonat-Filter wurde auf festem F-1-Medium in einer Petrischale platziert, wobei das besagte Medium (pro Liter) bestand aus: 600 ml Meerwasser (es kann künstliches Meerwasser verwendet werden), 400 ml destilliertem Wasser, 10 g Agar, 1 g Glucose, 1 g Proteinhydrolysat, 0,2 g Hefeextrakt, 2 ml 0,1 M KH2PO4, 1 ml einer Vitaminlösung (A-vits) (Enthaltend 100 mg/l Thiamin, 0,5 mg/l Biotin und 0,5 mg/l Cyanocobalamin), 5 ml einer Spurenmetall-Mischung (PII-Metalle, enthaltend pro Liter: 6,0 g Na2EDTA, 0,29 g FeCl36H2O, 6,84 g H3BO3, 0,86 MnCl24H2O, 0,06 g ZnCl2, 0,026 g CoCl26H2O, 0,052 g NiSO4H2O, 0,002 g CuSO45H2O und 0,005 g Na2MoO42H2O) und jeweils 500 mg Streptomycinsulfat und Penicillin-G. Die Agarplatte wurde im Dunklen bei 30°C inkubiert. Nach 2–4 Tagen erschienen zahlreiche Kolonien auf dem Filter. Kolonien einzelliger Mikroflora (außer Hefe) wurden von der Platte gepickt und auf einer neuen Platte mit ähnlicher Medienzusammensetzung wieder ausgestrichen. Es wurde besondere Aufmerksamkeit darauf verwendet, alle Kolonien zu picken, die aus farblosen weißen Zellen bestanden. Die neue Platte wurde bei 30°C inkubiert und Einzelkolonien nach einer Inkubationsphase von 2–4 Tagen gepickt. Einzelne Kolonien wurden dann gepickt und in 50 ml Flüssigmedium eingebracht, das die gleichen organischen Zusätze wie die Agarplatten enthielt. Diese Kulturen wurden für 2–4 Tage bei 30°C auf einem Rotationsschütteltisch (100–200 rpm) inkubiert. Wenn die Kulturen ihre offensichtlich größte Dichte erreicht hatten, wurden 20–40 ml der Kultur geerntet, zentrifugiert und lyophilisiert. Die Probe wurde dann durch wohlbekannte Standardtechniken der Gaschromatographie untersucht (z. B. Lepage und Roy, 1984), um den Fettsäuregehalt der Stämme zu bestimmen. Dabei wurden die Stämme mit Omega-3-NUFAs identifiziert und Kulturen dieser Stämme für weitere Testung aufrecht erhalten.
  • Unter Verwendung der oben geschilderten Sammlungs- und Testverfahren wurden über 150 Stämme einzelliger Mikroflora isoliert, die hohe Gehalte an Omega-3-HUFA als Prozentanteil der Gesamt-Fettsäuren aufwiesen und die Wachstum über einen Temperaturbereich von 15–48°C zeigten. Es können ebenfalls für einige Anwendungen Stämme isoliert werden, die weniger als 1% (als % der Gesamtfettsäuren) der unerwünschten C20:4n-6 und C22:5n-6 HUFAs aufweisen. Stämme mit hohem Omega-6-Gehalt können ebenfalls isoliert werden. Stämme dieser Mikroflora können unter Verwendung der oben geschilderten Vorgehensweise wiederholt aus der gleichen Lokalität isoliert werden. Einige wenige der neu isolierten Stämme haben sehr ähnliche Fettsäureprofile. Die Möglichkeit, dass einige Doppelisolate des selben Stammes sind, kann zur Zeit nicht ausgeschlossen werden. Eine weitere Testung anderer erwünschter Merkmale wie etwa der Salztoleranz oder der Fähigkeit, vielfältige Kohlenstoff- und Stickstoffquellen zu nutzen, können dann unter Verwendung eines ähnlichen Verfahrens durchgeführt werden.
  • Beispiel 2. Aufrechterhaltung von unbeschränktem Wachstum: PO4 und Hefeextrakt
  • Zellen von Schizochytrium aggregatum (ATCC 28209) wurden von festem F-1-Medium gepickt und in 50 ml FFM-Medium angeimpft (Fuller et al., 1964). Dieses Medium enthält: Meerwasser, 1000 ml; Glukose, 1,0 g; Gelatine-Hydrolysat, 1,0 g; Leberextrakt, 0,01 g; Hefeextrakt, 0,1 g; PII-Metalle, 5 ml; 1 ml B-Vitamin-Lösung (Goldstein et al., 1969) und 1 ml einer Antibiotika-Lösung (25 g/l Streptomycinsulfat und Penicillin-G). 1,0 ml der Vitaminmischung (pH 7,2) enthalten: Thiamin-HCl, 200 μg; Biotin, 0,5 μg; Cyanocobalamin, 0,05 μg; Nikotinsäure, 100 μg; Calcium-Panthotenat, 100 μg; Riboflavin, 5,0 μg; Pyridoxin-HCl, 40,0 μg; Pyridoxamin-2HCl, 20,0 μg; p-Aminobenzoesäure, 10 μg; Chlor-HCl, 500 μg; Inositol, 1,0 mg; Thymin, 0,8 mg; Orotsäure, 0,26 mg; Folinsäure, 0,2 μg; und Folsäure, 2,5 μg. Die Kultur wurde auf einem Rotationsschüttler (200 rpm) bei 27°C platziert. Nach 3–4 Tagen wurde 1 ml dieser Kultur in 50 ml jeder der folgenden Behandlungen überführt: 1) FFM-Medium (als Kontrolle); und 2) FFM-Medium mit dem Zusatz von 250 mg/l KH2PO4 und 250 mg/l Hefeextrakt. Diese Kulturen wurden auf einem Rotationsschüttler (200 rpm) bei 27°C für 48 Stunden platziert. Die Zellen wurden geerntet und die Ausbeute der Zellen quantifiziert. Bei Behandlung 1 betrug die Endkonzentration der Zellen auf Basis des aschefreien Trockengewichts 616 mg/l. Bei Behandlung 2 betrug die Endkonzentration der Zellen 1675 mg/l, was den gesteigerten Effekt zunehmender Konzentrationen an PO4 und Hefeextrakt im Kulturmedium demonstriert.
  • Beispiel 3. Aufrechterhaltung von unbeschränktem Wachstum: Ersatz von Hefeextrakt durch Getreideeinweichlösung
  • Zellen von Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888) wurden von festem F-1-Medium gepickt und in 50 ml M-5-Medium eingebracht. Dieses Medium besteht aus (pro Liter): Hefeextrakt, 1g; NaCl, 25 g; MgSO4 × 7 H2O, 5 g; KCl, 1 g; CaCl2, 200 mg; Glucose, 5 g; Glutamat, 5 g; KH2PO4, 1 g; PII-Metalle 5 ml; A-Vitamine-Lösung, 1 ml; und Antibiotika-Lösung, 1 ml. Der pH der Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert. Sterile Lösungen von Getreideeinweichlösung (4 g/40 ml; pH 7,0) und Hefeextrakt (1 g/40 ml; pH 7,0) wurden hergestellt. Zu einer Reihe von Kolben mit M-5-Medium wurden die folgenden Mengen an Hefeextraktlösung hinzu gegeben: 1) 2 ml; 2) 1,5 ml; 3) 1 ml; 4) 0,5 ml; und 5) 0,25 ml. Zu einer anderen Reihe von Kolben mit M5-Medium wurden der Hefeextrakt und die Getreideeinweichlösung in folgenden Mengen hinzu gegeben: 1) 2 ml Hefeextrakt; 2) 1,5 ml Hefeextrakt und 0,5 ml Getreideeinweichlösung; 3) 1,0 ml Hefeextrakt und 1,0 ml Getreideeinweichlösung; 4) 0,5 ml Hefeextrakt und 1,5 ml Getreideeinweichlösung; und 5) 2,0 ml Getreideeinweichlösung. Ein Milliliter der Kultur im F-1-Medium wurde verwendet, um jeweils einen Kolben anzuimpfen. Diese wurden dann für 48 Stunden bei 27°C auf einem Rotationsschüttler platziert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet und die Ausbeute der Zellen (als aschefreies Trockengewicht) bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen an, dass die Zugabe von Hefeextrakt bis zu 0,8 g/l des Mediums die Zellausbeute erhöhen kann. Jedoch ist die Zugabe von Getreideeinweichlösung wirkungsvoller und resultiert mit zugegebenem Hefeextrakt in der doppelten Ausbeute bei den Behandlungen. Dies ist sehr vorteilhaft, da die wirtschaftliche Herstellung von Zellen mit Getreideeinweichlösung viel kostengünstiger ist als mit Hefeextrakt.
  • Tabelle 1
    Figure 00150001
  • Beispiel 4. Erhöhter HUFA-Gehalt von Stämmen, die durch das Verfahren in Beispiel 1 isoliert wurden im Vergleich zu ATCC-Stämmen (zuvor bekannte Stämme)
  • Eine Reihe von 151 neu isolierten Stämmen, die gemäß des in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrens ausgewählt wurden, wurden bis zur späten exponentiellen Wachstumsphase gebracht und mittels Gas-Flüssig-Chromatographie quantitativ auf ihren HUFA-Gehalt hin analysiert. Alle Stämme wurden entweder in M1-Medium oder flüssigem FFM-Medium gezüchtet, welche jeweils die höchsten Zellausbeuten ergaben. M1-Medium hat die gleiche Zusammensetzung wie M5-Medium, mit der Ausnahme, dass die Konzentrationen von Glukose und Glutamat bei 1 g/l liegen. Zusätzlich wurden 5 zuvor isolierte Arten von Thraustochytrium und Schizochytrium von der American Type Culture Collection erhalten, die alle Stämme repräsentierten, die in lebensfähiger Form aus der Sammlung erhalten werden konnten. Diese Stämme waren: T. aureum (ATCC Nr. 28211), T. aureum (ATCC Nr. 34304), T. roseum (ATCC Nr. 28210), T. straitum (ATCC Nr. 34473) und S. aggregatum (ATCC Nr. 28209). Diese Stämme zeigten alle verkürztes Wachstum in konventionellen Medien und zeigten allgemein verbessertes Wachstum in Medien der vorliegenden Erfindung, einschließlich M5-Medium und FFM-Medium. Die Fettsäure-Produktion jedes dieser bekannten Stämme wurde wie beschrieben gemessen, basierend auf dem verbesserten Wachstum der Stämme in Medien der Erfindung.
  • Fettsäure-Peaks wurden unter Verwendung reiner Verbindungen bekannter Struktur identifiziert. Die Quantifizierung auf Basis der Gewichtsprozente bezogen auf die gesamten Fettsäuren wurde durch Integration der chromatographischen Peaks durchgeführt. Identifizierte Verbindungen waren: Palmitinsäure (C16:0), C20:4n-6 und C22:1 (die von dem verwendeten System nicht separat aufgeschlüsselt wurden), C20:5n-3, C22:5n-6, C22:5n-3 und C22:6n-3. Die verbleibende Fettsäuren, im allgemeinen von niedrigerem Molekulargewicht, wurden in der kombinierten Kategorie der „anderen Fettsäuren" zusammengefasst. Die Gesamtmenge an Omega-3-Fettsäuren wurde als Summe von 20:5n-3, 22:5n-3 und 22:6n-3 berechnet. Die Gesamtheit der Omega-6-Fettsäuren wurde als Summe des 20:4/22:1-Peaks und des 22:5n-6-Peaks berechnet.
  • Die Ergebnisse sind in den Tabellen 2–3 dargestellt und in den 1–3 illustriert. Aus Tabelle 2 ist zu sehen, dass große Zahlen an Stämmen durch das Verfahren der Erfindung isoliert werden können, und dass eine große Anzahl an Stämmen die zuvor bekannten Stämme in verschiedenen wichtigen Merkmalen übertrifft. Zum Beispiel produzierten 102 Stämme mindestens 7,8 Gewichts-% der Gesamt-Fettsäuren in Form von C20:5w3, ein höherer Prozentanteil dieser Fettsäure als bei jedem zuvor bekannten Stamm. Die Stämme 23B (ATCC Nr. 20892) und 12B (ATCC Nr. 20890) sind Beispiele solcher Stämme. Dreißig (30) Stämme der Erfindung produzierten wenigstens 68% Gewichtsanteil der Gesamt-Fettsäuren als Omega-3-Fettsäuren, mehr als irgendein zuvor bekannter Stamm. Stamm 23B (ATCC Nr. 20892) ist ein Beispiel für einen solchen Stamm. Sechsundsiebzig (76) Stämme der Erfindung ergaben nicht mehr als 10 Gewichts-% der Gesamtfettsäuren als Omega-6-Fettsäuren, die als unerwünschte Bestandteile der menschlichen Nahrung angesehen werden, weniger als irgendein zuvor bekannter Stamm. Die Stämme 23B (ATCC Nr. 20892) und 12B (ATCC Nr. 20890) sind Beispiele für solche Stämme. Zusätzlich gibt es 35 Stämme der Erfindung, die mehr als 25 Gewichts-% der Gesamt-Fettsäuren als Omega-6-Fettsäuren produzieren, mehr als jeder zuvor bekannte Stamm. Obwohl solche Stämme einen engeren Anwendungsbereich für diätetische Zwecke haben können, sind sie als Ausgangsmaterial für chemische Synthesen der Eicosanoide, die von Omega-6-Fettsäuren ausgehen, nützlich.
  • Zusätzlich enthüllen die Daten zahlreiche Stämme der Erfindung, die einen hohen Anteil der gesamten Omega-3-Fettsäuren als C22:6n-3 produzieren. In Tabelle 3 wurden 48 der in Tabelle 2 gezeigten Stämme mit den zuvor bekannten Stämmen verglichen, wobei C20:5n-3, C22:5n-3 und C22:6n-3 jeweils in Gewichts-% bezogen auf den gesamten Omega-3-Gehalt dargestellt sind. Bei fünfzehn Stämmen lagen wenigstens 94 Gewichts-% der gesamten Omega-3-Fettsäuren als C22:6n-3 vor, mehr als bei jedem zuvor bekannten Stamm. Stamm S8 (ATCC Nr. 20889) ist ein Beispiel für solche Stämme. Bei achtzehn Stämmen lagen wenigstens 28 Gewichts-% der gesamten Omega-3-Fettsäuren als C20:5n-3 vor, mehr als bei jedem zuvor bekannten Stamm. Stamm 12B (ATCC Nr. 20890) ist ein Beispiel für solche Stämme.
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Figure 00200001
  • Figure 00210001
  • Figure 00220001
  • Tabelle 3: Zusammensetzung der Omega-3-Fettsäurefraktion
    Figure 00230001
  • Tabelle 3: Zusammensetzung der Omega-3-Fettsäurefraktion
    Figure 00240001
  • Tabelle 3: Zusammensetzung der Omega-3-Fettsäurefraktion
    Figure 00250001
  • Tabelle 3: Zusammensetzung der Omega-3-Fettsäurefraktion
    Figure 00260001
  • Tabelle 3: Zusammensetzung der Omega-3-Fettsäurefraktion
    Figure 00270001
  • 1 zeigt die Gruppe von Stämmen, isoliert durch das Verfahren in Beispiel 1, die mehr als 67% an Omega-3-Fettsäuren (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) und die weniger als 10,6% an Omega-6-Fettsäuren (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) aufweisen. Alle früher bekannten Stämme wiesen weniger als 67% Omega-3-Fettsäuren (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) und mehr als 10,6% Omega-6-Fettsäuren (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) auf.
  • 2 zeigt die Gruppe von Stämmen, isoliert durch das Verfahren in Beispiel 1, die mehr als 67% an Omega-3-Fettsäuren (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) und die mehr als 7,5% an C20:5n-3 (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) aufweisen. Alle früher bekannten Stämme wiesen weniger als 67% Omega-3-Fettsäuren (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) und weniger als 7,8% C20:5n-3 (in % bezogen auf die Gesamt-Fettsäuren) auf.
  • Beispiel 5. Verstärkte Wachstumsraten von Stämmen, die durch das Verfahren in Beispiel 1 isoliert wurden im Vergleich zu ATCC-Stämmen (zuvor bekannte Stämme)
  • Zellen von Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888), Schizochytrium sp. S8 (ATCC Nr. 20889), Thraustochytrium sp. S42, Thraustochytrium sp. U42-2, Thraustochytrium sp. S42 und U30 (alle gemäß des Verfahrens nach Beispiel 1 isoliert) und Thraustochytrium aureum (ATCC #28211) und Schizochytrium aggregatum (ATCC #28209) (zuvor bekannte Stämme) wurden von festem F-1-Medium gepickt und in 50 ml M-5-Medium eingebracht. Der pH der Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung sterilfiltriert. Nach drei Tagen Wachstum auf einem Drehschüttler (200 rpm, 27°C) wurden 1–2 ml jeder Kultur in einen anderen Kolben mit M-5 Medium überführt und für zwei Tage auf den Schüttler gestellt. Die Kulturen (1–2 ml) wurden dann in einen anderen Kolben mit M-5-Medium transferiert und für 1 Tag auf den Schüttler gestellt. Dieses Verfahren stellte sicher, dass sich alle Kulturen in der exponentiellen Wachstumsphase befanden. Diese späteren Kulturen wurden dann verwendet, um zwei 250 ml Kolben mit M-5-Medium für jeden Stamm anzuimpfen. Diese Kolben wurden dann bei 25°C und 30°C auf Schüttler gestellt, und Änderungen in ihrer optischen Dichte wurden auf einem Beckmann DB-G Spektralphotometer (660 nm, 1 cm Weglänge) überwacht. Das Ablesen der optischen Dichte erfolgte zu den folgenden Zeitpunkten: 0; 6; 10; 14; 17, 25; 20, 25 und 22,75 Stunden. Die exponentiellen Wachstumsraten (Verdopplungen/Tag) wurden dann mittels des Verfahrens von Sorokin (1973) aus den Daten der optischen Dichte berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt und in 4 illustriert (gegenüber dem Wachstum des Stammes U30 bei 25°C normalisiert). Diese Daten zeigen, dass die mittels des Verfahrens in Beispiel 1 isolierten Stämme sowohl bei 25°C als auch bei 30°C viel höhere Wachstumsraten als die zuvor bekannten ATCC-Stämme aufweisen, selbst wenn diese bei den für kontinuierliches Wachstum essentiellen optimierten Phosphatkonzentrationen gehalten wurden. Für Stämme von Thraustochytriales, die aus kalten antarktischen Gewässern isoliert wurden, wurde bei 30°C kein Wachstum gezeigt.
  • Tabelle 4. Exponentielle Wachstumsraten (Verdopplungen/Tag)
    Figure 00290001
  • Beispiel 6. Gesteigerte Produktions-Eigenschaften (Wachstum und Lipid-Induktion) von Stämmen, die gemäß des Verfahrens in Beispiel 1 isoliert wurden im Vergleich zu ATCC-Stämmen (Frühere Stämme)
  • Zellen von Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888), Schizochytrium sp. S8 (ATCC Nr. 20889) (beide mittels des Verfahrens aus Beispiel 1 isoliert) und Thraustochytrium aureum (ATCC #28211) und Schizochytrium aggregatum (ATCC #28209) (zuvor bekannte Stämme) wurden von festem F-1-Medium gepickt und in 50 ml M-5-Medium (siehe Beispiel 3) eingebracht. Der pH der Lösung wurde auf 7,0 eingestellt und die Lösung wurde sterilfiltriert. Nach dreitägigem Wachstum auf einem Drehschüttler (200 rpm, 27°C) wurden 1–2 ml jeder Kultur in einen anderen Kolben mit M-5-Medium transferiert und für 2 Tage auf den Schüttler gestellt. Die aschefreien Trockengewichte von jeder dieser Kulturen wurden dann rasch bestimmt und dann 3,29 mg jeder Kultur in zwei 250 ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml M-5-Medium pipettiert. Diese Kolben wurden auf einen Drehschüttler (200 rpm, 27°C) gestellt. Nach 24 Stunden wurden 20 ml-Portionen jeder Kultur zentrifugiert, die Überstände verworfen, und die Zellen auf 250 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 50 ml M-5-Medium ohne Glutamat (N-Quelle) überführt. Die Kolben wurden wiederum auf den Schüttler gestellt, und nach weiteren 12 Stunden wurden sie gemessen, um die aschefreien Trockengewichte zu bestimmen und die Fettsäuregehalte durch das Verfahren von Lepage und Roy (1984) zu quantifizieren. Die Ergebnisse (normalisiert gegenüber den Erträgen von ATCC Nr. 28211, zuvor bekannter Stamm) sind in 5 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass die mittels des Verfahrens aus Beispiel 1 isolierten Stämme in der gleichen Zeitspanne und unter Kombination aus exponentiellem Wachstum und Stickstofflimitierung (zur Lipidinduktion) 2–3 mal mehr aschefreies Trockengewicht produzierten als die ATCC-Stämme aus dem Stand der Technik. Zusätzlich wurden höhere Ausbeuten an Gesamtfettsäuren und Omega-3-Fettsäuren aus den Stämmen der vorliegenden Erfindung erhalten, wobei Stamm S31 (ATCC Nr. 20888) 3–4 mal mehr Omega-3-Fettsäuren als die ATCC-Stämme aus dem Stand der Technik produzierte.
  • Beispiel 7. Erhöhte Toleranz gegenüber vermindertem Salzgehalt und Fettsäureproduktion durch Stämme, die mittels des Verfahrens in Beispiel 1 isoliert wurden
  • Stämme von 4 Arten der Thraustochytriden, nämlich Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888) und Thraustochytrium sp. U42-2 (ATCC Nr. 20891) (beide mittels des Verfahrens aus Beispiel 1 isoliert und getestet), sowie S. aggregatum (ATCC 28209) und T. aureum (ATCC 28210) (bezogen von der American Type Culture Collection) wurden von festem F-1-Medium gepickt und für 3–4 Tage bei 27°C auf einem Drehschüttler (200 rpm) inkubiert. Eine Reihe von Medien mit unterschiedlichem Salzgehalt wurde durch Ansetzen der folgenden Verdünnungen von M-Medium-Salzen hergestellt (NaCl, 25 g/l; MgSO4 × 7H2O, 5 g/l; KCl, 1 g/l; CaCl2, 200 mg/l):1) 100% (w/v M-Medium-Salze); 2) 80% (v/v) M-Medium, 20% (v/v) destilliertes Wasser; 3) 60% (v/v) M-Medium, 40% (v/v) destilliertes Wasser; 4) 40% (v/v) M-Medium, 60% (v/v) destilliertes Wasser; 5) 20% (v/v) M-Medium, 80% destilliertes Wasser; 6) 15% (v/v) M-Medium, 85% (v/v) destilliertes Wasser; 7) 10% (v/v) M-Medium, 90% (v/v) destilliertes Wasser; 8) 7% (v/v) M-Medium, 93% (v/v) destilliertes Wasser; 9) 3% (v/v) M-Medium, 97% (v/v) destilliertes Wasser; 10) 1,5% (v/v) M-Medium, 98,5% (v/v) destilliertes Wasser. Die folgenden Nähstoffe wurden zu den Behandlungen hinzu gegeben (pro Liter): Glukose, 5g; Glutamat, 5g; Hefeextrakt, 1g; (NH4)2SO4, 200 mg; NaHCO3, 200 mg; PII-Metalle, 5 ml; A-Vitamine-Lösung, 1 ml; und Antibiotikalösung, 2 ml. Fünfzig ml jeder dieser Behandlungen wurde mit 1 ml der in dem F-1-Medium wachsenden Zellen angeimpft. Diese Kulturen wurden auf einen Drehschüttler (200 rpm) gestellt und bei 27°C für 48 Stunden aufrecht erhalten. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation geerntet und die Gesamt-Fettsäuren durch Gaschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in 6 dargestellt. Thraustochytrium sp. U42-2 (ATCC Nr. 20891), das durch das Verfahren in Beispiel 1 isoliert wurde, kann nahezu die doppelte Menge der von T. aureum (ATCC 28211) produzierten Fettsäuren ergeben, sowie über 8-mal größere Mengen an Fettsäuren im Vergleich zur Produktion von S. aggregatum (ATCC 28209). Zusätzlich scheint U42-2 eine größere Salztoleranz im oberen Bereich der getesteten Bandbreite der Salzkonzentrationen aufzuweisen. Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888), ebenfalls durch das Verfahren in Beispiel 1 isoliert, zeigte sowohl eine hohe Fettsäureausbeute (2,5 bis 10 mal höher die zuvor bekannten ATCC-Stämme) als auch einen viel größeren Bereich der Salztoleranz als die ATCC-Stämme. Hinzu kommt, dass Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888) am besten bei sehr niedrigen Salzgehalten wächst. Diese Eigenschaft stellt einen großen ökonomischen Vorteil im Hinblick auf die kommerzielle Herstellung dar, sowohl auf Grund der korrosiven Wirkungen der wässrigen Salzlösungen auf Metallreaktoren als auch auf Grund der mit der Entsorgung dieser Salzlösungen verbundenen Probleme.
  • Beispiel 8. Kultivierung/niedriger Salzgehalt
  • Fünfzig ml M/10-5-Kulturmedien in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben wurden mit einer Kolonie von Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888), die von einer schrägen Agarplatte gepickt wurde, angeimpft. Das M/10-5-Medium enthält: 1000 ml deionisiertes Wasser; 2,5 g NaCl; 0,5 g MgSO4 × 7H2O; 0,1 g KCl; 0,02 g CaCl2; 1,0 g KH2PO4; 1,0 g Hefeextrakt; 5,0 g Glukose; 5,0 g Glutaminsäure; 0,2 g NaHCO3; 5 ml PII-Spurenmetalle, 2 ml Vitamingemisch; und 2 ml Antibiotikagemisch. Die Kultur wurde bei 30°C auf einem Drehschüttler (200 rpm) inkubiert. Nach 2 Tagen befand sich die Kultur bei mäßiger Dichte und aktivem Wachstum. 20 ml dieser aktiv wachsenden Kultur wurden verwendet, um einen 2 Liter-Fermenter anzuimpfen, der 1700 ml des gleichen Kulturmediums mit Ausnahme einer auf 40 g/l erhöhten Konzentration von Glukose und Glutamat (M/10-40-Medien) enthielt. Der Fermenter wurde auf 30°C gehalten, bei einer Belüftung von 1 Vol/min und einer Mischgeschwindigkeit von 300 rpm. Nach 48 Stunden betrug die Konzentration der Zellen im Fermenter 21,7 g/l. Die Zellen wurden durch Zentrifugation geerntet, lyophilisiert und unter N2 gelagert.
  • Der Gehalt an Gesamt-Fettsäuren und der Gehalt an Omega-3-Fettsäuren wurden mittels Gaschromatographie bestimmt. Der Gesamt-Fettsäuregehalt des Endproduktes betrugt 39,0% aschefreies Trockengewicht. Der Omega-3-HUFA-Gehalt (C20:5n-3, C22:5n-3 und C22:6n-3) des mikrobiellen Produkts betrug 25,6% des Gesamt-Fettsäuregehaltes. Der Ascheanteil der Probe betrug 7,0%.
  • Beispiel 9. Diversität des Fettsäuregehaltes
  • Die Wachstumsanalyse und die gaschromatographische Analyse der Fettsäureproduktion durch verschiedene Stämme gemäß Beschreibung in Beispiel 4 offenbarte Unterschiede in der Mannigfaltigkeit der Fettsäuren. Stämme der vorliegenden Erfindung synthetisierten weniger verschiedenartige Fettsäuren als zuvor verfügbare Stämme. Eine geringere Diversität der Fettsäuren ist vorteilhaft bei der Fettsäurereinigung, da weniger Verunreinigungen abzutrennen sind. Für Zwecke der Nahrungsergänzung ist eine geringere Zahl verschiedener Fettsäuren vorteilhaft, da die Wahrscheinlichkeit, unerwünschte Fettsäuren aufzunehmen, reduziert wird. Tabelle 5 zeigt die Anzahl unterschiedlicher vorliegender HUFAs für Konzentrationen über 1 Gewichts-% der Gesamt-Fettsäuren für zuvor bekannte Stämme (bezeichnet durch die jeweilige ATCC-Nummer) und für verschiedene Stämme der vorliegenden Erfindung.
  • Tabelle 5
    Figure 00320001
  • Beispiel 10. Gewinnung
  • Fünfzig ml an M5-Kulturmedium in einem 250 ml Erlenmeyer-Kolben wurden mit einer Kolonie von Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888), die von einer schrägen Agarplatte gepickt wurde, angeimpft. Die Kultur wurde bei 30°C auf einem Drehschüttler (200 rpm) inkubiert. Nach 2 Tagen befand sich die Kultur bei moderater Dichte und aktivem Wachstum. 20 ml dieser aktiv wachsenden Kultur wurden verwendet, um einen 1 Liter-Fermenter anzuimpfen, der 1000 ml des – mit Ausnahme einer auf 40 g/l erhöhten Konzentration an Glukose und Glutamat (M20 Medien) – gleichen Kulturmediums enthielt. Der Fermenter wurde bei 30°C und pH 7,4 gehalten, bei einer Belüftung von 1 Vol/min und einer Mischgeschwindigkeit von 400 rpm. Nach 48 Stunden betrug die Konzentration der Zellen in dem Fermenter 18,5 g/l. Die Belüftung und Durchmischung des Fermenters wurde abgeschaltet. Innerhalb von 2–4 Minuten flockten die Zellen aus und setzten sich in den unteren 250 ml des Fermenters ab. Dieser konzentrierte Bereich der Zellen hatte eine Zellkonzentration von 72 g/l. Diese Zellzone kann über eine Saugvorrichtung aus dem Fermenter entnommen werden, und (1) für eine Phase der Stickstofflimitierung auf einen anderen Reaktor übertragen werden (z. B. unter Kombination der hoch konzentrierten Produktion verschiedener Fermenter); oder (2) direkt durch Zentrifugation oder Filtration geerntet werden. Durch eine vorab in dieser Weise stattfindende Konzentrierung der Zellen müssen 60–80% weniger Wasser verarbeitet werden, um die Zellen zu gewinnen.
  • Beispiel 11. Nutzung einer Vielzahl an Kohlenstoff- und Stickstoffquellen
  • Fünfzig ml an M5-Kulturmedium in einem 250 ml-Erlenmeyerkolben wurden mit einer Kolonie von Schizochytrium sp. S31 (ATCC Nr. 20888) oder Thraustochytrium sp. U42-2 (ATCC Nr. 20891) angeimpft, die von einer schrägen Agarplatte gepickt wurden. Das M5-Medium entsprach dem in Beispiel 3 beschriebenen, mit der Ausnahme, dass 2 ml Vitamingemisch und 2 ml Antibiotikagemisch zugegeben wurden. Die Kultur wurde bei 30°C auf einem Drehschüttler (200 rpm) inkubiert. Nach 2 Tagen befand sich die Kultur bei moderater Dichter und aktivem Wachstum. Diese Kultur wurde verwendet, um Kolben mit M5-Medium anzuimpfen, die einen der folgenden Glukose-Ersatzstoffe enthielten (in einer Konzentration von 5 g/l): Dextrin, Sorbit, Fruktose, Laktose, Maltose, Sucrose, Maisstärke, Weizenstärke, Kartoffelstärke, Maismehl; oder die einen der folgenden Ersatzstoffe für Glutamat enthielten (in einer Konzentration von 5 g/l): Gelysate, Pepton, Trypton, Casein, Getreideeinweichlösung, Harnstoff, Nitrat, Ammonium, Molke oder Maisgluten-Mehl. Die Kulturen wurden für 48 Stunden auf einem Drehschüttler inkubiert (200 rpm, 27°C). Die relativen Kulturdichten, die das Wachstum auf den verschiedenen organischen Substraten repräsentieren, sind in den Tabellen 6–7 dargestellt.
  • Tabelle 6: Verwertung von Sticktoffquellen
    Figure 00340001
  • Tabelle 7: Verwertung organischer Kohlenstoffquellen
    Figure 00350001
  • Beispiel 12. Verfütterung von auf Thraustochytriden basierender Nahrungsergänzung an Salzwassershrimps zur Steigerung deren Omega-3-HUFA-Gehaltes
  • Zelluläre Biomasse von Thraustochytrium sp. 12B (ATCC 20890) wurde in Schüttelkolben in M-5-Medium (siehe Beispiel 3) bei 25°C hergestellt. Zelluläre Biomasse von Thraustochytrium sp. S31 (ATCC 20888) wurde in Schüttelkolben in M/10-5-Medium (siehe Beispiel 8) bei 27°C hergestellt. Die Zellen jedes Stammes wurden durch Zentrifugation geerntet. Das Pellet wurde einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert, um eine Paste mit 50% Trockenmasse herzustellen. Die resultierende Paste wurde in Meerwasser resuspendiert und dann als Nahrungsergänzung einer Kultur von adulten Salzwassershrimps zugegeben. Die Salzwassershrimps waren zuvor mit landwirtschaftlichen Abfallprodukten ernährt worden und ihr Omega-3-HUFA-Gehalt war infolge dessen sehr niedrig und betrug nur 1,3–2,3% der Gesamt-Fettsäuren (wild gefangene Salzwassershrimps haben einen durchschnittlichen Omega-3-HUFA-Gehalt von 6–8% der Gesamt-Fettsäuren). Die Salzwassershrimps (2–3/ml) wurden in einem 1-Liter-Becher gehalten, der mit Meerwasser gefüllt war, und ein Luftstein wurde verwendet, um die Kultur zu durchlüften und zu durchmischen. Nach Zugabe der Nahrungsergänzung wurden periodisch Proben der Salzwassershrimps geerntet, gewaschen und ihr Fettsäuregehalt mittels Gaschromatographie bestimmt. Die Ergebnisse sind in den 7 und 8 dargestellt. Wenn die auf Thraustochytriden basierende Nahrungsergänzung als abschließende Nahrung gefüttert wird, kann der Omega-3-Gehalt der Salzwassershrimps im Fall von Stamm 12B innerhalb von 5 Stunden, und im Fall von Stamm S31 innerhalb von 11 Stunden auf den Gehalt der wilden Salzwassershrimps angehoben werden. Der Omega-3-HUFA-Gehalt der Salzwassershrimps kann weit über den der wilden Shrimps gesteigert werden, wenn diese Nahrungsergänzungen für bis zu 24 Stunden gefüttert werden. Zusätzlich steigern diese Nahrungsergänzungen in hohem Maße den DHA-Gehalt der Salzwassershrimps, dessen Gehalt bei wild gefangenen Salzwassershrimps allgemein nur als im Spurenbereich liegend beschrieben wird.
  • Beispiel 13. Verwendung von Natriumsulfat im Kulturmedium
  • Dieses Beispiel zeigt, dass die Omega-3-Produktion und der Gehalt an Gesamt-Fettsäuren nicht beeinträchtigt wird, und der selbe oder besser sein kann, wenn Natriumsulfat anstelle von Natriumchlorid als das Natriumsalz in einem Fermentationsmedium verwendet wird.
  • Schizochytrium ATCC Nr. 20888 wurde in einem Medium gezüchtet, das einen pH von 7,0 aufwies, und pro Liter Medium 2,36 Gramm Natrium, 1,5–3,0 Gramm einer Stickstoffquelle und 3,0 Gramm Glukose enthielt. Die Zellen wurden bei 28°C und 200 Umdrehungen pro Minute für 48 Stunden inkubiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 8 dargestellt.
  • Tabelle 8: Wirkung von Natriumsulfat im Vergleich zu Natriumchlorid auf den Fettsäuregehalt A) Na-Salz = Natriumchlorid; N-Quelle = Natriumglutamat
    Figure 00360001
  • B) Na-Salz = Natriumchlorid; N-Quelle = Pepton
    Figure 00370001
  • C) Na-Salz = Natriumsulfat; N-Quelle = Natriumglutamat
    Figure 00370002
  • Wie in Tabelle 8 zu sehen, ist die Produktion an Omega-3-Fettsäuren und Gesamt-Fettsäuren bei Verwendung von Natriumsulfat vergleichbar oder besser als bei der Verwendung von Natriumchlorid als Natriumsalz.
  • Beispiel 14. Produktion von Schizochytrium in Kulturmedium mit niedrigem Salzgehalt
  • Dieses Beispiel zeigt die Fermentation von Schizochytrium in einem Kulturmedium mit niedrigem Salzgehalt bei Aufrechterhaltung hoher Erträgnisse der Biomasse und hoher Produktionsrate an Omega-3-Fettsäuren und Fettsäuren.
  • Schizochytrium ATCC Nr. 20888 wurde in Medium gezüchtet, das 3,33 g/l Pepton als Stickstoffquelle und 5,0 g/l Glukose als Kohlenstoffquelle bei variablen Natriumkonzentrationen enthält. Die Zellen wurden bei 30°C mit einer Animpfungsmenge von etwa 40 mg/l an Trockengewicht (dwt) über eine Zeitspanne von 48 Stunden fermentiert. Das Natrium wurde als Natriumchlorid zur Verfügung gestellt. Die Ergebnisse dieses Durchlaufs sind in Tabelle 9 dargestellt.
  • Tabelle 9. Produktion von Schizochytrium in Kulturmedium mit niedrigem Salzgehalt
    Figure 00380001
  • Wie aus den Ergebnissen der Tabelle 9 ersichtlich ist, können hohe Ausbeuten an Biomasse und hohe Produktionsraten an Omega-3-Fettsäuren und Gesamt-Fettsäuren bereits bei Natriumkonzentrationen, die etwa über 1, 0 g/l liegen, erzielt werden.
  • Beispiel 15. Kultivierung von Schizochytrium in Medium mit niedrigem Chloridgehalt
  • Dieses Beispiel zeigt die Fermentation der Mikroflora der vorliegenden Erfindung bei minimalen Chloridkonzentrationen bei Erreichen hoher Biomasse-Erträgnisse im Bezug auf die anfängliche Zuckerkonzentration.
  • Schizochytrium ATCC Nr. 20888 wurde in Schüttelkolben bei 28°C und 200 rpm in 50 ml-Aliquots des folgenden Mediums kultiviert: 1000 ml deionisiertes Wasser; 1,2 g MgSO4 × 7 H2O; 0,067 g CaCO3; 3,0 g Glukose; 3,0 g Mono-Natrium-Glutamat; 0,2 g KH2PO4; 0,4 g Hefeextrakt; 5, 0 ml PII-Metalle; 1,0 ml Vitaminmischung; und jeweils 0,1 g Penicillin-G und Streptomycinsulfat. Die Chloridkonzentration wurde variiert, indem unterschiedliche Mengen an KCl zu jeder Behandlung hinzu gegeben wurden. Die Kaliumkonzentration wurde in allen Behandlungen durch Zugabe von Kaliumcitrat konstant gehalten. Die Natriumkonzentration betrug durch Zugabe von Natriumsulfat entweder 2,37 g/l oder 4,0 g/l. Die Ergebnisse dieser Fermentation sind unten in Tabelle 10 dargestellt.
  • Tabelle 10. Fermentation von Schizochytrium bei minimalen Chlorid-Konzentrationen
    Figure 00390001
  • Wie aus den in Tabelle 10 gezeigten Ergebnissen zu sehen ist, können hohe Erträgnisse an Biomasse pro Zucker bei niedrigen Chloridkonzentrationen erreicht werden. So werden z. B. bei einer Chloridkonzentration von über 59,1 mg/l Ausbeuten von mehr als 50% erzielt.
  • Beispiel 16. Variation der Natriumsulfat-Konzentration bei niedrigen Chloridkonzentrationen
  • Dieses Beispiel verdeutlicht den Effekt variabler Konzentrationen an Natriumsulfat in einer Fermentation bei niedriger Chlorid-Konzentration.
  • Schizochytrium ATCC 20888 wurde bei 28°C und 200 rpm in 50 ml-Aliquots des folgenden Mediums kultiviert: 1000 ml deionisiertes Wasser; 1,2 g MgSO4 × 7H2O; 0,125 g KCl; 0,067 g CaCO3; 3,0 g Glukose; 3,0 g Mono-Natrium-Glutamat; 0,2 g KH2PO4; 0,4 g Hefeextrakt; 5,0 ml PII-Metalle; 1,0 ml Vitamingemisch; und jeweils 0,1 g Penicillin-G und Streptomycinsulfat. Die Konzentration an Natriumsulfat wurde in den Behandlungen zwischen 3,0 g/l und 30,2 g/l variiert. Die Ergebnisse der Fermentationsdurchläufe sind unten in Tabelle 11 dargestellt.
  • Tabelle 11. Variation der Natriumsulfat-Konzentration bei niedrigem Chloridgehalt
    Figure 00400001
  • Die in Tabelle 11 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass bei einer niedrigen Chloridkonzentration von etwa 59 mg/l durch Auswahl einer geeigneten Natriumsulfat-Konzentration hohe Erträgnisse an Biomasse im Bezug auf Glukose von über 50% erhalten werden können.

Claims (20)

  1. Verfahren zum Züchten von Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemischen davon, bei dem man Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemische davon in einem Kulturmedium züchtet, welches ein Natriumsalz, das nicht das Chlorid ist, enthält und weniger als 500 Milligramm Chlorid pro Liter des Kulturmediums aufweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, welches das Züchten von Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemischen davon bei einer Temperatur von 5°C bis 48°C und bei einem pH-Wert von pH 5,0 bis pH 11,0 umfaßt.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Natriumsalz unter Natriumsulfat, Sodaasche, Natriumoxid, Natriumkarbonat, Natriumbikarbonat, Natriumsulfat und Gemischen davon ausgewählt ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des Natriumsulfats, ausgedrückt in Gramm Natrium pro Liter des Kulturmediums, größer als 1,0 ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des Natriumsulfats, ausgedrückt in Gramm Natrium pro Liter des Kulturmediums, zwischen 1,0 und 50,0 beträgt.
  6. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Konzentration des Natriumsulfats, ausgedrückt in Gramm Natrium pro Liter des Kulturmediums, zwischen 2,0 und 25,0 beträgt.
  7. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Thraustochytrium, das Schizochytrium und/oder die Gemische davon sämtliche der identifizierenden Eigenschaften eines biologisch reinen Mikroorganismus aufweisen, der unter ATCC Nr. 20888 und 20889 und Mutantenstämmen, die von einem unter ATCC Nr. 20888 und 20889 ausgewählten Mikroorganismus abgeleitet sind, ausgewählt ist und einen Gehalt an hochgradig ungesättigter Omega-3-Fettsäure von wenigstens 0,5% Trockengewicht haben.
  8. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Thraustochytrium, das Schizochytrium und/oder die Gemische davon einen Sterolgehalt von wenigstens 0,1% aschefreies Trockengewicht haben.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemische davon einen Cholesteringehalt von wenigstens 15% des gesamten Sterolgehaltes aufweisen.
  10. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Thraustochytrium, das Schizochytrium und/oder die Gemische davon eine Zellaggregatgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) im Durchmesser aufweisen.
  11. Verfahren nach einem der vorangegangen Ansprüche, wobei das Thraustochytrium, das Schizochytrium und/oder die Gemische davon eine Zellaggregatgröße von weniger 100 μm (100 Mikrometer) im Durchmesser aufweisen.
  12. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Thraustochytrium, das Schizochytrium und/oder die Gemisch davon eine Zellaggregatgröße von weniger als 50 μm (50 Mikrometer) im Durchmesser aufweisen.
  13. Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Kulturmedium eine Chloridkonzentration von weniger als 250 Milligramm Chlorid pro Liter Kulturmedium aufweist.
  14. Mikroflorale Biomasse, gezüchtet nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 13, welche Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemische davon enthält, wobei das Thraustochytrium, das Schizochytrium und/oder die Gemische davon eine Zellaggregatgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) aufweisen.
  15. Verfahren zur Herstellung von Shrimps, welches das Verfüttern von Mikroflora, die nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 13 gezüchtet und unter Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemischen davon ausgewählt ist, an Shrimpslarven umfaßt, wobei die Mikroflora eine Zellaggregatgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) aufweist.
  16. Nahrungsmittelprodukt mit (a) einer Mikroflora, die nach dem Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 13 gezüchtet und unter Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemischen davon ausgewählt ist, und (b) einem Nährstoff, der unter Flachssamen, Rapssamen, Sojabohnen, Avocadomehl und Gemischen davon ausgewählt ist.
  17. Nahrungsmittelprodukt nach Anspruch 16, wobei die Zusammensetzung zwischen 5 und 95 Gew.-% der Mikroflora enthält.
  18. Nahrungsmittelprodukt nach einem der Ansprüche 16 und 17, wobei die Zusammensetzung zwischen 5 und 95 Gew.-% des Materials enthält, welches unter Flachssamen, Sojabohne, Avocadomehl und Gemischen davon ausgewählt ist.
  19. Nahrungsmittelprodukt nach einem der Ansprüche 16 bis 18, wobei das Nahrungsmittelprodukt ein extrudiertes Produkt ist.
  20. Wasserkulturverfahren, welches das Verfüttern von Mikroflora, die nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 gezüchtet und unter Thraustochytrium, Schizochytrium und/oder Gemischen davon ausgewählt ist, an Organismen, die unter Shrimpslarven, Salzwassershrimps, Rotatorien und Mollusken ausgewählt sind, wobei die Mikroflora eine Zellaggregatgröße von weniger als 150 μm (150 Mikrometer) aufweist.
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