CN107523504A - 裂殖壶菌突变株 - Google Patents

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Abstract

裂殖壶菌突变株，所述裂殖壶菌突变株于2012年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO:M2012494。利用本发明裂殖壶菌突变株生产微生物油脂的方法，微生物油脂中DHA的含量不低于50wt%。油脂中含有适量的β‑胡萝卜素，由于β‑胡萝卜素具有清除自由基等抗氧化特性，因此可以提高二十二碳六烯酸油脂的稳定性。

Description

裂殖壶菌突变株
技术领域
本发明涉及一种裂殖壶菌突变株。
背景技术
二十二碳六烯酸（DHA）是一种具有重要生理功能的长链多不饱和脂肪酸，可以促进大脑和视力发育，提高智力，因此广泛添加于婴幼儿奶粉中。此外，DHA具有预防及治疗心血管疾病、防止老年痴呆、抑制细胞癌变等生理功能，因而广泛应用于食品工业。
DHA在人体内不能大量合成，但又不可缺少，需从食物中摄取。传统的DHA来源于深海鱼油，但存在资源有限、生产成本偏高等缺陷，其产量已远不能满足市场需求。目前，海洋微藻，包括裂殖壶菌、破囊壶菌、隐甲藻等都能合成DHA，且其具有生长快、营养要求低、易于大规模培养等优势，已成为规模化生产DHA的重要途径。研究发现，裂殖壶菌能大量积累DHA，藻油中DHA含量较其它微藻高。为了实现裂殖壶菌工业化生产DHA，提高其DHA含量已成为当前的研究热点。
中国发明专利公开号为CN101892160A的专利申请公开了一种裂殖壶菌及其工业应用。该发明所述的裂殖壶菌通过补料发酵，发酵液的细胞干重可达72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L，但DHA含量较低，仅为35-40%。
中国发明专利公开号为CN102888348A的专利申请公开了一种裂殖壶菌及利用其高密度发酵生产DHA油脂的方法。该发明从发酵控制角度优化菌株发酵条件，并结合补糖操作，实现高密度发酵，最终油脂含量达50g/L，DHA产量为17.5g/L。该菌株虽然DHA产量较高，具有工业化应用的潜力，但油脂中DHA含量偏低，仅为35%。
作为一种多不饱和脂肪酸，二十二碳六烯酸油脂在长期储藏的过程中，由于温度、光照、氧气等因素的存在，易被氧化而变质。因此，改良DHA油脂生产菌株，在提高DHA产量、DHA含量的同时，提高DHA油脂的氧化稳定性，是大规模工业化发酵生产DHA急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种可生产稳定性高的二十二碳六烯酸的裂殖壶菌突变株。
为实现上述主要目的，本发明提供一种裂殖壶菌突变株，所述裂殖壶菌突变株于2012年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO: M2012494。
按上述方案，所述利用上述裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸油脂的方法的具体步骤为：
（1）种子活化培养：将上述裂殖壶菌突变株接种于活化培养基中振摇培养获得种子活化培养液；
（2）种子扩大培养：将上述步骤（1）振摇培养的种子培养液接种到扩大培养基中振摇培养获得种子扩大培养液；
（3）发酵培养：将上述步骤（2）振摇培养的种子培养液接种到装有发酵培养基的发酵瓶中发酵培养；
或根据最终发酵罐的大小，将上述步骤（2）摇瓶培养的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液，然后接种到发酵罐中进行发酵培养。
（4）将发酵液经后处理得到二十二碳六烯酸油脂。
按上述方案，所述的步骤（1）中：将裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度25-28℃，摇床振摇转速为150-250r/min，培养时间40-48h，所述活化培养基为：葡萄糖10-20g/L，谷氨酸钠20-30g/L，酵母浸膏5-10g/L，氯化钠10-20g/L，硫酸镁0. 5-1g/L，pH自然。
按上述方案，所述的步骤（2）中：当步骤（1）中种子活化培养液菌浓达到5-10%（体积浓度）时，按照10-20%（体积比）接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度25-30℃，培养时间40-48 h，摇床振摇转速为150-250转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖30-50g/L，谷氨酸钠20-40g/L，酵母浸膏5-10g/L，氯化钠10-20g/L，硫酸镁5-10g/L，磷酸二氢钾5-10g/L，氯化钙0.5-1g/L，pH自然。
按上述方案，所述步骤（3）也可以是：根据最终发酵罐的大小，将上述步骤（2）摇瓶培养的种子培养液逐级扩大培养，获得种子扩大培养液，当种子扩大培养液的菌浓达到5%~10%（体积浓度）时，接种到发酵罐中进行发酵培养，接种量10-20%（体积比），发酵罐温度25-30℃，搅拌速度100-300转/分钟，通气量1-2 vvm（L/L.min）即每升发酵液中每分钟所需要的空气通入量为1-2L，罐压0.05-0.1Mpa，培养80-120 h，并在发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中碳源浓度在10-20 g/L，所述发酵罐中的发酵培养基为：葡萄糖40-60g/L，酵母浸膏4-6g/L，谷氨酸钠20-40g/L，氯化钠1-5g/L，磷酸二氢钾1-5g/L，硫酸镁5-10g/L，氯化钙0.5-1g/L，碳酸氢钠0.5-1g/L，硫酸钠5-10g/L，硫酸铵5-20g/L，氯化钾0.5-1g/L，pH自然。
本发明具有如下有益效果：
（1）利用本发明裂殖壶菌突变株生产微生物油脂的方法，微生物油脂中DHA的含量不低于50wt%。
（2）油脂中含有适量的β-胡萝卜素，由于β-胡萝卜素具有清除自由基等抗氧化特性，因此可以提高二十二碳六烯酸油脂的稳定性。
（3）利用本发明裂殖壶菌突变株进行发酵，发酵过程中pH无需调控，生产工艺简单，发酵周期短，已成功应用于50m3规模的发酵生产，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
以下实施例用来详细说明本发明的具体内容，但本发明并不限于以下实施例的内容。
实施例1. 裂殖壶菌突变株的选育方法
（1）取CCTCC NO: M2012074菌种作为出发菌株。
（2）将上述菌株接到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养48h至对数生长期。
（3）取1ml上述步骤（2）的活化种子培养液注入到无菌培养皿上经过紫外灯照射,紫外灯照射距离为30厘米，照射时间为60秒，紫外灯的功率为30瓦。
（4）经过紫外诱变后的菌液经无菌风风干，成为菌斑。将含菌斑的培养皿无菌移入高能粒子束注入机中，经过能量为20KeV的高能N+离子束注入诱变，N+离子束注入剂量为100*1017ions/cm2。
（5）将上述诱变处理后的菌膜用无菌水洗脱，稀释，涂布于活化培养基平板上进行培养，所述固体活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0. 5g/L，琼脂粉20g/L，pH自然。
（6）挑取较大的单菌落，分别接入含有1.5ml活化培养基的96孔高通量筛选设备中，在28℃、200r/min条件下振摇培养60h，筛选获得10株生物量较高的菌株，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0. 5g/L，pH自然。
(7)将上述10株菌株进行液体摇瓶培养，根据各菌获得的微生物油脂的脂肪酸分布，选取DHA产量高于20g/L及DHA含量高于50wt％的菌株。将该菌株连续传代培养10次，并进行摇瓶发酵培养，DHA含量稳定在50wt％以上，并得到本发明的裂殖壶菌突变株，该菌株于2012年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，分类命名为：裂殖壶菌CABIO-1(Schizochytrium sp.CABIO-1)，保藏编号为CCTCCNO:M2012494。
上述裂殖壶菌菌株CCTCC NO: M2012494具有以下生理生化特性：
（1）生长于固体活化培养基，在28℃生长6天后，在培养基表面形成乳白色菌落，菌落直径11-12mm，菌落质地呈粘稠状；
（2）营养细胞为单细胞，近球形，直径5-12μm，进行典型的二分裂方式增殖；
（3）菌体一般聚集成大的集合体；
（4）最适宜培养温度为28℃ ；
实施例2 利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
（1）种子活化培养：取本发明所述的保藏编号：CCTCC NO: M2012494的裂殖壶菌突变株-接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为200r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
（2）种子扩大培养：将上述步骤（1）振摇培养的活化种子培养液按照10%（体积比）接种量接种到扩大培养基中进行培养，培养温度28℃，培养时间48 h，摇床振摇转速为200转/分钟，所述摇瓶中的扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
（3）发酵瓶培养：将上述步骤（2）振摇培养的扩大种子培养液按照10%（体积比）接种量接种到装有发酵培养基的1L发酵瓶中发酵培养，培养温度28℃，培养时间120 h，摇床振摇转速为220转/分钟，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏4g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L ，pH自然。
（4）后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油脂。
经检测，上述微生物油脂中，DHA含量为50.26wt%，β-胡萝卜素含量为1398μg/kg。
实施例3 利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
（1）种子活化培养：取本发明所述的保藏编号：CCTCC NO: M2012494的裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为150-250r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
（2）种子扩大培养：将上述步骤（1）振摇培养的活化种子培养液按照10%（体积比）接种量接种到扩大培养基中进行培养，所用种子罐容积为10L，种子罐中培养基装量为60%（体积比），培养过程工艺控制为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1vvm（L/L.min），培养时间44 h，所述扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
（3）发酵罐培养：将上述步骤（2）振摇培养的扩大种子培养液按照10%（体积比）接种量接种到装有发酵培养基的50L发酵瓶中发酵培养，培养过程工艺控制为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1.5vvm（L/L.min），罐压0.1MPa培养时间90 h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20 g/L，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏6g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
（4）后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油脂。
经检测，上述微生物油脂中，DHA含量为53.65wt%，β-胡萝卜素含量为2133μg/kg。
实施例4 利用裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸
（1）种子活化培养：取本发明所述的保藏编号：CCTCC NO: M2012494的裂殖壶菌突变株接种到活化培养基中培养，培养温度28℃，摇床振摇转速为150-250r/min，培养时间48h，所述活化培养基为：葡萄糖10g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠20g/L，硫酸镁0.5g/L，pH自然。
（2）种子扩大培养：将上述步骤（1）振摇培养的活化种子培养液按照10%（体积比）接种量接种到扩大培养基中进行培养，所用种子罐容积为10L，50L，5m3，种子罐中培养基装量为60%（体积比），培养过程工艺控制为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1vvm（L/L.min），培养时间44h，所述扩大培养基为：葡萄糖40g/L，谷氨酸钠25g/L，酵母浸膏10g/L，氯化钠10g/L，硫酸镁5g/L，磷酸二氢钾1g/L，氯化钙0.5g/L，pH自然。
（3）发酵罐培养：将上述步骤（2）振摇培养的扩大种子培养液按照10%（体积比）接种量接种到装有发酵培养基的50m3发酵罐中发酵培养，培养过程工艺控制为：培养温度28℃，搅拌速度150转/分钟，通气量1.5vvm（L/L.min），罐压0.1MPa培养时间90 h，发酵过程中通过流加葡萄糖来控制发酵液中葡萄糖浓度在10-20 g/L，所述发酵培养基为：葡萄糖40g/L，酵母浸膏6g/L，谷氨酸钠30g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾1g/L，硫酸镁5g/L，氯化钙0.5g/L，碳酸氢钠0.5g/L，硫酸钠8g/L，硫酸铵6g/L，氯化钾0.5g/L，pH自然。
（4）后处理：将发酵培养得到的发酵液经碱性蛋白酶破壁后，加入萃取剂正己烷进行萃取，萃取后分离得到的固相物转入萃取容器中进行重复萃取，如此，直至萃取液中无油时结束萃取过程，第一次萃取时加入200毫升正己烷，之后每次加入150毫升正己烷，将每次萃取充后过滤分离得到的混合油，脱溶，得到微生物油脂。
经检测，上述微生物油脂中，DHA含量为55.18wt%，β-胡萝卜素含量为3012μg/kg。
实施例5 二十二碳六烯酸油脂氧化稳定性测定
（1）取保藏编号CCTCC NO: M2012074菌种发酵，收集发酵产物，后处理即得二十二碳六烯酸油脂，检测后发现，油脂中β-胡萝卜素含量为256μg/kg。
（2）取本发明所述的保藏编号：CCTCC NO: M2012494的裂殖壶菌突变株发酵，收集发酵产物，后处理即得二十二碳六烯酸油脂。
（3）将上述油脂在常温下（25℃）储藏，定时取样测定油脂中的过氧化值POV，结果如下：
表一 实施例5中油脂POV变化趋势
从上表可以看出，出发菌株CCTCC NO: M2012074发酵得到的DHA油脂，在前3个月过氧化值POV无明显变化，随着储藏时间的延长POV值不断升高。保藏编号：CCTCC NO: M2012494的裂殖壶菌突变株发酵得到的DHA油脂，由于β-胡萝卜素的存在，在6个月的储藏期内，POV值无明显变化，氧化稳定性较出发菌株CCTCC NO: M2012074明显提高。
本发明的突变株适应性强，发酵培养基成分简单。在发酵DHA油脂的过程中，pH无需调控，仅需补糖操作，生产工艺简单，且发酵周期短，可成功应用于50m3规模的发酵生产，适合大规模工业化生产。

Claims (2)

1. 裂殖壶菌突变株，其特征在于：所述裂殖壶菌突变株于2012年12月3日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO:M2012494。
2.一种利用权利要求1所述的裂殖壶菌突变株生产二十二碳六烯酸油脂的方法，其特征在于：将裂殖壶菌突变株发酵，收集发酵产物，后处理即得二十二碳六烯酸油脂。
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