JP6947941B2

JP6947941B2 - 新規なスラウストキトリウム属菌株及びそれを用いた多価不飽和脂肪酸生産方法

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Publication number: JP6947941B2
Application number: JP2020545479A
Authority: JP
Inventors: ヤングキムジ; ゲウンパークミュング; ミンパークヒエ; ウォオンチョイジュング; ミンパークサング; ヤングバエサング; ソオクチャングジン
Original assignee: シージェイチェイルジェダングコーポレイション
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-10-13
Anticipated expiration: 2039-06-26
Also published as: US11773417B2; AR115667A1; TWI715088B; BR112020019053B1; DK3760705T3; KR102100650B1; JP2021514645A; FI3760705T3; CN112513247A; CN112513247B; US20210002680A1; KR20200002448A; HUE060352T2; DK3760705T5; AU2019292277A1; CA3095279C; EP3760705A4; UY38286A; AU2019292277B2; EP3760705B1

Description

本出願は、高含有量の多価不飽和脂肪酸を含有する新規スラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）菌株、並びにそれから生産されるバイオマス、それを含む脂質及び多価不飽和脂肪酸の製造方法に関する。

多価不飽和脂肪酸であるドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid: DHA）は、頭脳、眼球組織及び神経系に必須の脂肪酸であり、特に乳児の視力及び運動神経能力の開発に重要な機能を果たすことが知られており、認知症患者の脳ではその量が著しく減少することが報告され、加齢黄斑変性の抑制などの様々な抗老化機能も新たに報告されている。また、ＤＨＡは、養魚飼料添加剤として用いられることも報告されている（特許文献１）。ヒトをはじめとするほとんどの高等動物は正常な生体機能に必要な多価不飽和脂肪酸を独自には円滑に合成することができないので、多価不飽和脂肪酸を必須栄養素として必ず摂取しなければならず、世界保健機構は１日１ｇ以上のＤＨＡ含有多価不飽和脂肪酸を続けて摂取することを推奨している。従来から、ＤＨＡ多価不飽和脂肪酸の供給源は、マグロ、サケなどの海洋生態系の上位に位置する深海性魚類であった。しかし、海洋環境の汚染の深刻化に伴って、深海性魚類の体内に水銀をはじめとする重金属、環境ホルモン、放射性物質などの汚染物質が蓄積し、それにより深海魚類の摂取における危険性が大きくなっている。よって、ＤＨＡ多価不飽和脂肪酸オイルを安全に安定して供給できる新たな手段として、スラウストキトリウム属微細藻類は産業的に非常に重要な価値を有する。

スラウストキトリウム属微細藻類において遺伝子を過剰発現させる様々な方法が提示されている。アセト乳酸シンターゼ（acetolactate synthase）を選択マーカーとして用いたスラウストキトリウム属微細藻類の遺伝子形質転換方法がマーテック社により最初に提示され、その後、様々な抗生剤耐性遺伝子を選択マーカーとして用いたスラウストキトリウム属微細藻類の形質転換技術が報告されている。具体的には、特許文献２に「微細藻類のバイオマスと脂質生産性を向上させるための組換えベクター及びその用途」が開示されている。

しかし、現在までにスラウストキトリウム属微細藻類に関して開発された遺伝子形質転換技術は、共通して導入遺伝子が染色体ＤＮＡに挿入される方法（chromosomal integration）であり、挿入された遺伝子が安定して維持されるという利点があるが、自己複製能力を有するｃｅｎｔｒｏｍｅｒｉｃ又はｅｐｉｓｏｍａｌプラスミドを用いた遺伝子発現方法に比べて、遺伝子コピー数（copy number）、発現調節などに制約がある。

韓国公開特許第１０−２００７−００４０７５１号公報韓国公開特許第１０−２０１５−００８４１４８号公報

Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717 Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17:33-39 and Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6(4):269-274 Minowa et al. 1995, Fuel 74(12): 1735-1738 Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356:328-334 Miao and Wu, Biosource Technology (2006) 97:841-846

本発明者らは、スラウストキトリウム属ＫＣ０１微細藻類を突然変異させることにより、ドコサヘキサエン酸含有量及び生産性が向上した微細藻類を開発し、前記微細藻類を培養してドコサヘキサエン酸含有脂質を含むバイオマス及びバイオオイルの製造方法を確立し、本出願を完成するに至った。

本出願は、野生型に比べてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産量が増加し、アミノ酸生産量が減少したスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５３８ＢＰ）を提供することを目的とする。

また、本出願は、前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有バイオマスを回収するステップとを含むバイオマス製造方法を提供することを目的とする。

さらに、本出願は、前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有脂質を回収するステップとを含むバイオオイル製造方法を提供することを目的とする。

本出願の新規なスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、アミノ酸生成量は大幅に減少し、バイオマス中の脂肪の含有量及びドコサヘキサエン酸などの不飽和脂肪酸の含有量が増加するので、それ自体、又は培養及び発酵により生産されたバイオマス、前記バイオマスの濃縮物及び乾燥物は、飼料用組成物として非常に有用である。

スラウストキトリウム属（Thraustochytrium Genus）ＫＣ０１菌株を光学顕微鏡で観察した写真である。スラウストキトリウム属（Thraustochytrium Genus）ＫＣ０１菌株、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）菌株、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium genus）菌株及びシゾキトリウム属（Schizochytrium genus）菌株の系統樹を示す図である。

以下、本出願をより詳細に説明する。

なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。さらに、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

上記目的を達成するための本出願の一態様は、野生型に比べてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産量が増加し、アミノ酸生産量が減少したスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類を提供する。

本出願における「スラウストキトリウム属（Thraustochytrid genus）」菌株は、有機従属栄養微細藻類であり、ドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid: DHA）をはじめとする様々な多価不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid）を高濃度で含有するトリアシルグリセロール（triacylglycerol）の供給源として重要な役割を果たす。また、前記「微細藻類（microalgae）」とは、葉緑素で光合成をする植物のうち、肉眼では見ることができず、顕微鏡でのみ見ることができ、水中で自由に浮遊して生活する生物を意味し、植物プランクトン（Phytoplankton）ともいう。

本出願においては、一例として、野生型スラウストキトリウムＫＣ０１菌株にガンマ線を照射して突然変異を発生させ、前記突然変異菌株のうち多価不飽和脂肪酸含有オイルの生産能が向上した菌株を選択し、それをスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１と命名し、２０１８年５月３０日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国生命工学研究院生物資源センター（Korean Collection for Type Cultures: KCTC）に受託番号ＫＣＴＣ１３５３８ＢＰとして寄託した。

また、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、配列番号１の１８ｓｒＲＮＡ塩基配列を有してもよいが、これに限定されるものではない。

本出願における「ドコサヘキサエン酸（docosahexaenoic acid: DHA）」とは、Ｃ_２２Ｈ_３２Ｏ_２の化学式を有する多価不飽和脂肪酸の一つであり、背の青い魚であるマグロやイワシから多く抽出される物質である。また、ドコサヘキサエン酸は、エイコサペンタエン酸（eicosapentaenoic acid: EPA）やα−リノレン酸（α-linolenic acid: ALA）と共にω−３に属する。

本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、親株であるスラウストキトリウム属ＫＣ０１に比べて多量のドコサヘキサエン酸を含み、具体的には前記微細藻類に含まれる脂肪酸総重量に対して３０〜６５重量％、３０〜６０重量％、４０〜６５重量％、又は４０〜６０重量％のドコサヘキサエン酸を含むが、これらに限定されるものではない。

また、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、親株であるスラウストキトリウム属ＫＣ０１に比べてドコサヘキサエン酸生産性が向上したものであり、前記生産性は１時間に生産されるドコサヘキサエン酸の濃度（ｇ／Ｌ）で測定することができる。具体的には、本出願の微細藻類は、０．４〜０．８（ｇ／ｌ／ｈ）、０．４〜０．７（ｇ／ｌ／ｈ）、０．５〜０．８（ｇ／ｌ／ｈ）、又は０．５〜０．７（ｇ／ｌ／ｈ）のドコサヘキサエン酸生産性を有するが、これらに限定されるものではない。

なお、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、親株であるスラウストキトリウム属ＫＣ０１に比べてアミノ酸生産量が減少したものであってもよい。具体的には、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類又はその培養液は、アスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リシン及びアルギニンからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸を含まないものであってもよい。例えば、実施例２で確認されるように、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類の培養液中にアスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リシン及びアルギニンが検出されないものであってもよい。

例えば、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類のアミノ酸総生産量は、親株であるスラウストキトリウム属ＫＣ０１に比べて９０％以上、９５％以上、９７％以上又は９９％以上低減したものであってもよい。よって、ＣＪＭ０１菌株は、ＫＣ０１親株に比べて、供給される炭素源をドコサヘキサエン酸生合成経路においてより効果的に用いることが分かる。具体的には、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、アミノ酸をほとんど生産しないので、前記菌株の培養液は、０．１〜２０ｍｇ／Ｌ、０．１〜１５ｍｇ／Ｌ以下、０．１〜１０ｍｇ／Ｌ以下、０．１〜７ｍｇ／Ｌ、又は０．１〜５ｍｇ／Ｌのアミノ酸のみ含有する。

本出願の他の態様は、前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含むバイオマスを回収するステップとを含むバイオマス製造方法を提供する。また、前記バイオマスは乾燥菌体の形態であってもよいが、これに限定されるものではない。

本出願は、上記方法により製造されたバイオマスを提供する。前記バイオマスは、総重量に対して１５〜４０重量％、２０〜３５重量％、又は２５〜３０重量％のドコサヘキサエン酸を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願のさらに他の態様は、前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有脂質を回収するステップとを含むバイオオイル製造方法を提供する。

本出願は、上記方法により製造されたバイオオイルを提供する。前記バイオオイルは、脂肪酸総重量に対して３０〜６５重量％、３０〜６０重量％、４０〜６５重量％、又は４０〜６０重量％のドコサヘキサエン酸を含んでもよいが、これらに限定されるものではない。

具体的には、本出願のバイオオイル製造方法は、前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含むバイオマスを製造するステップと、前記製造したバイオマスからドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有脂質を回収するステップとを含むが、これに限定されるものではない。

前記「スラウストキトリウム属」及び「ドコサヘキサエン酸」については前述した通りである。

本出願における「バイオオイル」は、生物学的、熱化学的及び物理化学的抽出工程によりバイオマスから得られたものであり、本出願において製造されたバイオオイルは、多価不飽和脂肪酸を含有するものであってもよく、具体的にはドコサヘキサエン酸を含有するものであってもよいが、これらに限定されるものではない。

また、前記「バイオマス」とは、化学的エネルギーとして用いることのできる植物、動物、微生物などの生物体、すなわちバイオエネルギーのエネルギー源を意味し、生態学的には単位時間及び空間内に存在する特定生物体の重量又はエネルギー量を意味する。さらに、前記バイオマスには、細胞により分泌される化合物が含まれるが、これに限定されるものではなく、細胞外物質以外に、細胞及び／又は細胞内の内容物が含まれてもよい。本出願における前記バイオマスは、スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類自体、その培養物、その乾燥物、その破砕物、又は前記微細藻類を培養もしくは発酵させて生産した産物であってもよく、前記バイオマスの濃縮物又は乾燥物であってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願におけるスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類の培養物とは、前記微細藻類を培養して生成した産物を意味し、具体的には微細藻類を含む培養液又は微細藻類が除去された培養液であってもよいが、これらに限定されるものではない。本出願におけるスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類の乾燥物とは、前記微細藻類から水分を除去したものであり、具体的には乾燥菌体の形態であるが、これに限定されるものではない。また、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類の破砕物とは、前記微細藻類を破砕した結果物を総称するものであり、破砕した微細藻類の上清又はペレットであってもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類自体、その培養物、その乾燥物又はその破砕物は、ドコサヘキサエン酸を含有するものであり、それらからバイオマス又はバイオオイルを製造することができる。

本出願における「培養」とは、前記微細藻類を好適に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される微細藻類に応じて容易に調整して用いることができる。

具体的には、本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類の培養は、従属栄養条件下で行うものであってもよいが、これに限定されるものではない。

本出願における「従属栄養」とは、エネルギー（栄養）源を体外から得られる有機物に依存する栄養形式であり、独立栄養の対義語である。本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、従属栄養条件下での炭素源又は窒素源の培地組成最適化によりドコサヘキサエン酸の含有量及び生産性を向上させることができる。また、本出願における「従属栄養」は、「暗培養」と混用されてもよい。

また、前記微細藻類を培養するステップは、特にこれらに限定されるものではないが、公知の回分培養法、連続培養法、流加培養法などにより行われてもよい。本出願の微細藻類の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微細藻類の培養に用いられるものであればいかなるものでもよく、具体的には好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願の微細藻類を培養することができる。

具体的には、塩基性化合物（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム又はアンモニア）又は酸性化合物（例えば、リン酸又は硫酸）を用いて適正ｐＨ（例えば、ｐＨ５〜９、具体的にはｐＨ６〜８、最も具体的にはｐＨ６．８）に調節することができるが、これらに限定されるものではない。

また、培養物の好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

さらに、培養温度は２０〜４５℃、具体的には２５〜４０℃に維持し、約１０〜１６０時間培養してもよいが、これらに限定されるものではない。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよいが、これに限定されるものではない。

本出願のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類の培養は、炭素源及び窒素源を含む培地を用いて行うことができる。

本出願における「培地」とは、本願の微細藻類を培養する培養培地、及び／又は培養して得られた産物を意味する。前記培地は、微細藻類を含む形態、及び前記微細藻類を含む培養液から遠心分離、濾過などにより微細藻類を除去した形態のいずれも含む概念である。

また、本出願に用いられる培養用培地は、炭素源として糖及び炭水化物（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、ガラクトース、マンノース、マルトース、アラビノース、キシロース、モラセス、デンプン及びセルロース）、油脂（例えば、大豆油、ヒマワリ油、落花生油及びココナッツ油）、脂肪酸（例えば、パルミチン酸、ステアリン酸及びリノール酸）、アルコール（例えば、グリセリン及びエタノール）、有機酸（例えば、酢酸）などを個別に又は混合して用いることができ、具体的には、前記炭素源は、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、アラビノース、キシロース及びグリセリンからなる群から選択される少なくとも１種であってもよいが、微細藻類の培養に用いられる炭素源であればこれらに限定されるものではない。さらに、本出願に用いられる培養用培地は、炭素源として１０〜５０ｇ／Ｌ、１０〜４０ｇ／Ｌ、２０〜５０ｇ／Ｌ、２０〜４０ｇ／Ｌ、又は２５〜３５ｇ／Ｌの濃度のグルコースを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願に用いられる培養用培地の窒素源は、有機窒素源と無機窒素源に区別されるが、有機窒素源又は無機窒素源を個別に又は混合して用いることができる。具体的には、前記窒素源は、酵母抽出物、牛肉抽出物（beef extract）、ペプトン（peptone）及びトリプトン（tryptone）からなる群から選択される有機窒素源であってもよく、酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ウレア及びＭＳＧ（Monosodium glutamate）からなる群から選択される無機窒素源であってもよい。

例えば、本出願に用いられる培養用培地は、窒素源として酵母抽出物、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム及びＭＳＧを含むが、微細藻類の培養に用いられる窒素源であればこれらに限定されるものではない。

具体的には、前記酵母抽出物は、培地中に０．１〜１０ｇ／Ｌ、０．５〜１０ｇ／Ｌ、０．５〜７ｇ／Ｌ、０．５〜５ｇ／Ｌ、０．５〜３ｇ／Ｌ、０．５〜２ｇ／Ｌ、又は０．５〜１．５ｇ／Ｌの濃度で含まれてもよく、前記硫酸アンモニウムは、培地中に１〜５ｇ／Ｌ、１〜４ｇ／Ｌ、２〜５ｇ／Ｌ、２〜４ｇ／Ｌの濃度で含まれてもよく、前記硝酸ナトリウムは、培地中に０．１〜１０ｇ／Ｌ、０．５〜９ｇ／Ｌ、１〜９ｇ／Ｌ、２〜９ｇ／Ｌ、３〜９ｇ／Ｌ、５〜９ｇ／Ｌ、又は７〜９ｇ／Ｌの濃度で含まれてもよく、前記ＭＳＧは、培地中に０．１〜２ｇ／Ｌ、０．１〜１．５ｇ／Ｌ、０．５〜２ｇ／Ｌ、０．５〜１．５ｇ／Ｌの濃度で含まれてもよいが、これらに限定されるものではない。

本出願の目的上、ＣＪＭ０１菌株は、アンモニア阻害が生じず、広い塩濃度で成長可能であるという特徴があるので、それを考慮して炭素源及び窒素源を培地において適切に調節することができる。

本出願に用いられる培養用培地は、リン供給源としてリン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、それらに相当するナトリウム含有塩などを個別に又は混合して用いることができるが、これらに限定されるものではない。また、培地は、その他金属塩（例えば、硫酸マグネシウム又は硫酸鉄）、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長促進物質を含んでもよい。

本出願の前記培養ステップで培養された微細藻類、それから生産された培養物、その乾燥物又はその破砕物からバイオマスを回収するステップは、当該分野で公知の好適な方法を用いて目的とするバイオマスを回収することができる。

また、本出願の前記培養ステップで生産されたドコサヘキサエン酸を回収するステップは、培養方法に応じて、当該分野で公知の好適な方法を用いて微細藻類自体又はその培養物から目的とするドコサヘキサエン酸を回収（collect）することができる。例えば、遠心分離、濾過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化、ＨＰＬＣなどが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培養された微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物から目的とするバイオマス又はドコサヘキサエン酸を回収することができる。前記バイオマス又はドコサヘキサエン酸を回収するステップは、分離工程及び／又は精製ステップをさらに含んでもよい。

例えば、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、炭化水素（例えば、アルカン）などの脂質及び脂質誘導体は、ヘキサンなどの疎水性溶媒で抽出することができる（非特許文献１）。また、脂質及び脂質誘導体は、液化（非特許文献２）、オイル液化（非特許文献３）、超臨界ＣＯ_２抽出（非特許文献４）を用いて抽出することができる。さらに、公知の微細藻類脂質回収のプロトコルは、ｉ）遠心分離により細胞を回収して蒸留水で洗浄し、その後凍結乾燥により乾燥させ、ｉｉ）得られた細胞粉末をモルタルで粉砕し、次にｎ−ヘキサンで脂質を抽出する方法を開示している［非特許文献５］。

本出願のさらに他の態様は、前記スラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物を含む組成物を提供する。前記組成物は、前記微細藻類を用いて製造されたバイオマス又はバイオオイルを含んでもよい。

スラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物については前述した通りである。前記微細藻類を用いて製造されたバイオマス又はバイオオイルについても前述した通りである。高含有量のドコサヘキサエン酸を含有する組成物を製造するために、本出願の微細藻類を用いることができる。前記組成物は、溶液、粉末又は懸濁液の形態であってもよいが、これらに限定されるものではない。より具体的には、前記スラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物を含む食品組成物、飼料組成物又は飼料添加剤を提供することができる。

本出願における「飼料」とは、動物が食べて摂取し、消化させるための、もしくはそれに適した任意の天然もしくは人工の規定食、一食など、又は前記一食の成分を意味し、本出願による代謝疾患の予防又は治療用組成物を有効成分として含む飼料は、当該技術分野で公知の様々な形態の飼料に製造することができ、具体的には濃厚飼料、粗飼料及び／又は特殊飼料に製造することができる。

本出願における「飼料添加剤」には、栄養素補充及び体重減少予防、飼料中の繊維素の消化利用性向上、乳質改善、繁殖障害予防及び受胎率向上、夏期高温ストレス予防など様々な効果を目的として飼料に添加する物質が含まれる。本出願の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助詞料に該当し、炭酸水素ナトリウム、ベントナイト（bentonite）、酸化マグネシウム、複合鉱物質などの鉱物質製剤、亜鉛、銅、コバルト、セレンなどの微量鉱物質であるミネラル製剤、カロテン、ビタミンＥ、ビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、ニコチン酸、ビタミンＢ複合体などのビタミン剤、メチオニン、リシンなどの保護アミノ酸剤、脂肪酸カルシウム塩などの保護脂肪酸剤、生菌剤（乳酸菌剤）、酵母培養物、カビ発酵物などの生菌、酵母剤などがさらに含まれてもよい。

本出願における「食品組成物」には、機能性食品（functional food）、栄養補助剤（nutritional supplement）、健康食品（health food）、食品添加剤（food additives）などのあらゆる形態が含まれ、上記タイプの食品組成物は、当該技術分野で公知の通常の方法で様々な形態に製造することができる。

本出願は、前記バイオマス又はバイオオイルを含む組成物を製造する方法を提供する。前記バイオマス、バイオオイル及び組成物については前述した通りである。

このようなバイオオイル製造方法は、ドコサヘキサエン酸生産性に優れるスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を従属栄養条件下で特定組成の炭素源及び窒素源を含む培地を用いて培養するステップにより、高含有量のドコサヘキサエン酸を含有するバイオオイルを製造することができる。

以下、実施例を挙げて本出願の構成及び効果をより詳細に説明する。これらの実施例はあくまで本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例に限定されるものではない。

本出願のＣＪＭ０１微細藻類は、スラウストキトリッドファミリーに属する微細藻類であり、高含有量のドコサヘキサエン酸を含む多価不飽和脂肪酸生産能を有する。配列番号１で表される１８ＳｒＲＮＡ遺伝子のＤＮＡ塩基配列を有し、一般的な光培養下の成長条件ではない従属栄養条件下で高いバイオマス含有量を示す。

以下、実施例を挙げてより具体的に実験方法について説明する。

スラウストキトリッド（Thraustochytrid）ファミリー微細藻類ＫＣ０１の分離
スラウストキトリッドファミリー微細藻類菌株を分離するために、次の実験を行った。

具体的には、韓国慶尚南道巨済、統営地域の海岸の計２０カ所で海水、土壌及び木の葉の環境試料を採取した。採取直後から各サンプルを１０℃のアイスボックスに保管して実験室に運搬し、前記サンプルを２〜３日以内に菌分離作業に用いた。菌分離作業においては、寒天培地に直接塗抹し、その後水中松花粉釣餌法によりスラウストキトリッド菌株を分離した。顕微鏡観察によりスラウストキトリッド微細藻類の類似形態を含む試料を微生物分離用ＩＹＰ培地（酵母抽出物（Yeast extract）１ｇ／Ｌ，ペプトン（Peptone）１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２ｇ／Ｌ，天日塩（Sea salt）２０ｇ／Ｌ，Ｈ_３ＢＯ_３５．０ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ_２３．０ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ_４０．２ｍｇ／Ｌ，ＮａＭｏ_４・２Ｈ_２Ｏ０．０５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ_４０．０５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．７ｍｇ／Ｌ，寒天（Agar）１５ｇ／Ｌ）に塗抹した。得られたコロニーを数回の継代培養により純粋分離し、その後スラウストキトリッド微細藻類の典型的な特徴である遊走子（zoospore）嚢を形成する菌株のみ選択及び分離した。顕微鏡観察により確認できない環境試料は、塩度１．５％の滅菌海水を用いて希釈及び洗浄し、その後サンプル５０ｍｌに松花粉を撒いて培養した。各採集環境と同程度の温度及びｐＨ条件で培養して得られた微生物群集を微生物分離用ＩＹＰ培地に塗抹及び継代培養して純粋分離した。ここで、各時期毎に抗生剤のカクテルミックス（cocktail mix）溶液（硫酸ストレプトマイシン（Streptomycin sulfate）０〜５００ｍｇ／Ｌ，アンピシリン（Ampicillin）０〜５００ｍｇ／Ｌ，ペニシリン（Penicillin）Ｇ０〜５００ｍｇ／Ｌ，硫酸カナマイシン（Kanamycin sulfate）０〜５００ｍｇ／Ｌ）の濃度を調節して投入した。こうすることにより、他の微生物の成長及び汚染を制御した。

分離したコロニーは、ＩＧＧＹＰ培地（グリセリン（Glycerol）１０ｇ／Ｌ，グルコース（Glucose）１０ｇ／Ｌ，酵母抽出物１ｇ／Ｌ，ペプトン１ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ２ｇ／Ｌ，天日塩２０ｇ／Ｌ，Ｈ_３ＢＯ_３５．０ｍｇ／Ｌ，ＭｎＣｌ_２３．０ｍｇ／Ｌ，ＣｕＳＯ_４０．２ｍｇ／Ｌ，ＮａＭｏ_４・２Ｈ_２Ｏ０．０５ｍｇ／Ｌ，ＣｏＳＯ_４０．０５ｍｇ／Ｌ，ＺｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．７ｍｇ／Ｌ，ビタミン混合溶液１０ｍｌ／Ｌ）を用いて、５００ｍＬフラスコにて１５〜２８℃、５０〜２００ｒｐｍで約７日間培養した。それらのうち、成長速度が速く、培養条件が複雑でない微細藻類１種を最終的に選択し、菌体を回収した。選択した菌株の形態は光学顕微鏡を用いて観察した（図１）。回収した菌体をＰＢＳバッファ（Phosphate buffered solution, ｐＨ７．５）で３回洗浄し、その後Ｄｒｙｏｖｅｎにて５５℃で１６時間乾燥させて乾燥菌体を得た。

最終的に選択した微細藻類菌株の分子生物学的同定のために、１８ｓｒＲＮＡ遺伝子配列を分析した。選択した菌種の純粋分離コロニーからＤＮＡを分離し、その後１８ｓｒＲＮＡ領域の遺伝子増幅用プライマーを用いて、ＰＣＲ法により１８ｓｒＲＮＡを増幅した。遺伝子増幅用プライマーを表１に示す。

ここで、ＰＣＲ反応は、９５℃で５分間の変性後、９５℃で３０秒間の変性、５２℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の重合を２５サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。

増幅した反応液を用いて塩基配列を分析した結果、約１７９２ｂｐのサイズの塩基配列１（配列番号１）が確保された。これをＮＣＢＩＢＬＡＳＴ検索した結果、従来から報告されているスラウストキトリウム（Thraustochytrium）属菌株と約９９％の相同性を有し、オーランチオキトリウム属（Aurantiochytrium genus）及びシゾキトリウム属（Schizochytrium genus）菌株と約８４％の相同性を有することが確認された。

その結果を図２の菌株間系統樹に示す。当該菌株は、新たなスラウストキトリッド（Thraustochytrid）ファミリー（family）のスラウストキトリウム属に該当する微細藻類であることが確認されたので、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium Genus）ＫＣ０１と命名した。

突然変異微細藻類の開発
実施例２−１：人為突然変異法による変異株の選択
本出願においては、実施例１で分離したスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＫＣ０１菌株のガンマ線照射変異によりドコサヘキサエン酸（Docosahexaenoic acid: DHA）の生産がさらに向上した菌株を分離するために、次の実験を行った。

具体的には、スラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＫＣ０１菌株をＧＹＥＰ培地（グルコース２％，ペプトン１％，酵母エキス０．５％，天日塩２％）で２４時間培養して活性化した菌株を、１２１℃で１５分間滅菌した種培地（グルコース５％，ペプトン１％，酵母抽出物０．５％，天日塩２％）に接種して１４時間培養し、その後菌体を回収した。回収した菌体をＰＢＳバッファ５０ｍｌに懸濁し、ガンマ線を１〜５ｋＧｙの線量で１時間照射し、その後５０ｍｌの基本培地（グルコース５％，ペプトン１％，酵母エキス０．５％，天日塩２％）を用いて、５００ｍｌフラスコにて２８℃、１２０ｒｐｍで２日間培養し、その後死滅率９９％の懸濁した菌体を好適に希釈してＧＹＥＰ平板培地（グルコース２％，ペプトン１％，酵母抽出物０．５％，天日塩２％，寒天２％，ｐＨ７．０）で２回継代した。

まず、多価不飽和脂肪酸含有オイル以外に生産される抗酸化色素が減少したものと予測される菌株を選択するために、コロニーの色が白く変化したコロニーを選択した。上記方法で得た変異株をスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１と命名し、２０１８年５月３０日付けでブダペスト条約上の国際寄託機関である韓国生命工学研究院生物資源センター（Korean Collection for Type Cultures: KCTC）に受託番号ＫＣＴＣ１３５３８ＢＰとして寄託した。

実施例２−２：新規に分離した微細藻類及び突然変異菌株の多価不飽和脂肪酸含有オイル生産能の分析
実施例２−１で選択したＣＪＭ０１とＫＣ０１菌株の多価不飽和脂肪酸含有オイル生産能を比較するために、次のように培養した。

具体的には、本出願のスラウストキトリウム属微細藻類であるＫＣ０１とＣＪＭ０１菌株の培養のために、ＭＪＷ０１培地（グルコース３０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ３．０ｇ／Ｌ，Ｎａ_２ＳＯ_４１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１．０ｇ／Ｌ，酵母抽出物９．０ｇ／Ｌ，ＭＳＧ・１Ｈ_２Ｏ１．０ｇ／Ｌ，ＮａＮＯ_３１．０ｇ／Ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０．１ｇ／Ｌ，Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ_２０．５ｇ／Ｌ，ビタミン混合溶液１０ｍｌ／Ｌ）を基本培養培地条件において２８℃、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、ｐＨ７．５で約４日間培養した。遠心分離法で菌体を回収し、その後ＰＢＳバッファで３回洗浄し、５５℃で１２時間乾燥させて菌体の重量を測定した。

乾燥菌体を用いたドコサヘキサエン酸含有オイルの含有量は、次の方法で測定した。具体的には、乾燥菌体２ｇに８．３Ｍ塩酸溶液を加えて８０℃で微細藻類菌体の細胞壁を加水分解し、その後エチルエーテル（Ethyl ether）３０ｍＬ及び石油エーテル（Petroleum ether）２０ｍＬを添加して３０秒間混合し、遠心分離する過程を３回以上繰り返した。その後、分離した溶媒層を回収し、予め重量を測定しておいたラウンドフラスコに移し、次に窒素パージにより溶媒を除去し、湿気を除去した容器に入れて乾燥させた。乾燥させたオイルの重量を測定し、総オイル含有量を算出した。オイル中に含まれるＤＨＡ含有量は、０．５Ｎメタノール性ＮａＯＨ及び１４％三フッ化ホウ素メタノール（ＢＦ_３）で前処理し、ガスクロマトグラフィー法で測定した。

上記方法で培養したスラウストキトリウム属ＫＣ０１菌株及びガンマ線照射を用いて選択したＣＪＭ０１突然変異菌株の培養成績を表２及び表３に示す。同表から、高機能性オメガ−３オイルのＤＨＡを生産することが確認された。

表２及び表３の「Ｂｉｏｍａｓｓ」とは、培養液中の菌体濃度を意味し、ＤＣＷ（dry cell weight）と混用されてもよく、ＤＨＡの含有量をバイオマス又はＴＦＡ（total fatty acid）に対する含有量で表示した。

下記の結果から分かるように、ＣＪＭ０１突然変異菌株のＤＨＡ生産量は、親株（スラウストキトリウム属ＫＣ０１）より向上することが確認された（表２，表３）。具体的には、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）含有量において、ＣＪＭ０１菌株は生産がＫＣ０１菌株の約１．３倍に増加した。また、確保される菌体が減少することなく、培養時間が大幅に短縮され、ドコサヘキサエン酸生産性においても、ＣＪＭ０１変異菌株はＫＣ０１親株の約１．７倍に向上することが確認された。

これらの結果から分かるように、突然変異菌株であるＣＪＭ０１が親株であるＫＣ０１菌株に比べてＤＨＡ含有量及び生産性が向上した菌株であることが確認された。

実施例２−３：新規に分離した微細藻類及び突然変異菌株のアミノ酸生産能の分析
また、ＣＪＭ０１菌株の培養特性を確認するために、前記培養液における総アミノ酸含有量を確認した。

具体的には、前述した各培養液から１０ｍｌのサンプルを採取し、蒸留水で２０倍に希釈して濾過し、液体クロマトグラフィーを用いて総アミノ酸の分析を行った。総アミノ酸濃度を確認したところ、ＫＣ０１親株の培養液中に分析されたアスパラギン酸、セリン、グルタミン酸、グリシン、アラニン、バリン、メチオニン、イソロイシン、ロイシン、チロシン、フェニルアラニン、リシン、アルギニンが全て１０ｍｇ／Ｌ以上検出されるのに対して、ＤＨＡ含有量が向上したＣＪＭ０１菌株の培養液中にアミノ酸はほとんど検出されなかった。

具体的には、ＣＪＭ０１変異菌株において、生産されるＤＨＡ以外の副産物として生産される総アミノ酸濃度がＫＣ０１親株に対して平均約９９％以上低減することが確認された（表４）。

これは、ＣＪＭ０１突然変異菌株において、ＫＣ０１親株と比較して菌体成長が同等のレベルであり、菌体量に対する総脂質含有量もそれほど減少しないので、ＣＪＭ０１菌株は、供給される炭素源をＫＣ０１親株に比べてＤＨＡ生合成経路で効果的に用いることを示すものである。

培地条件の最適化
実施例２で選択したアミノ酸低減及びＤＨＡ含有量が向上したＣＪＭ０１菌株を用いて、ＤＨＡ含有量及び生産性をさらに向上させるために、培地条件の最適化を行った。

具体的には、実施例２−２で用いたＭＪＷ０１培地に基づいて、培地中の窒素源含有量を増大させると共に生産コストを低減させるために、有機窒素源である酵母抽出物の濃度を低下させ、無機窒素源である（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４を追加し、ＮａＮＯ_３の濃度を上昇させ、最終的にＭＪＷ０２培地（グルコース３０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ５．０ｇ／Ｌ，Ｎａ_２ＳＯ_４３ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ０．５ｇ／Ｌ，酵母抽出物１．０ｇ／Ｌ，ＭＳＧ・１Ｈ_２Ｏ１．０ｇ／Ｌ，ＮａＮＯ_３８．０ｇ／Ｌ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４３．０ｇ／Ｌ，ＫＨ_２ＰＯ_４０．１ｇ／Ｌ，Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ／Ｌ，ＣａＣｌ_２０．１ｇ／Ｌ，ビタミン混合溶液１０ｍｌ／Ｌ）に変更した。

前記ＭＪＷ０１及びＭＪＷ０２培地の条件を比較するために、前記培地でＣＪＭ０１菌株の培養を行った。その結果、次の表５から分かるように、有機窒素源である酵母抽出物の濃度が低下するにつれて菌体量は減少したが、無機窒素源の増加により培養時間が大幅に短縮された。その結果、ＤＨＡ含有量は同等以上であり、ＤＨＡ生産性が１．１３倍に向上することが確認された。

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
野生型に比べてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産量が増加し、アミノ酸生産量が減少したスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５３８ＢＰ）。
（態様２）
前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、脂肪酸総重量に対して４０〜６０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、態様１に記載の微細藻類。
（態様３）
前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、ドコサヘキサエン酸生産性が０．５〜０．７（ｇ／ｌ／ｈ）である、態様１に記載の微細藻類。
（態様４）
態様１に記載のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸含有バイオマスを回収するステップとを含むバイオマス製造方法。
（態様５）
前記培養は、従属栄養条件下で行うものである、態様４に記載のバイオマス製造方法。
（態様６）
前記培養は、炭素源及び窒素源を含む培地を用いて行うものである、態様４に記載のバイオマス製造方法。
（態様７）
前記炭素源は、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、アラビノース、キシロース及びグリセリンからなる群から選択される少なくとも１種である、態様６に記載のバイオマス製造方法。
（態様８）
前記窒素源は、ｉ）酵母抽出物、牛肉抽出物（beef extract）、ペプトン（peptone）及びトリプトン（tryptone）からなる群から選択される有機窒素源、又はｉｉ）酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ウレア及びＭＳＧ（Monosodium glutamate）からなる群から選択される無機窒素源である、態様６に記載のバイオマス製造方法。
（態様９）
態様１に記載のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸含有脂質を回収するステップとを含むバイオオイル製造方法。

Claims

野生型に比べてドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）生産量が増加し、アミノ酸生産量が減少したスラウストキトリウム属（Thraustochytrium genus）ＣＪＭ０１微細藻類（寄託番号：ＫＣＴＣ１３５３８ＢＰ）。
前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、脂肪酸総重量に対して４０〜６０重量％のドコサヘキサエン酸を含む、請求項１に記載の微細藻類。
前記スラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類は、ドコサヘキサエン酸生産性が０．５〜０．７（ｇ／ｌ／ｈ）である、請求項１に記載の微細藻類。
請求項１に記載のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸含有バイオマスを回収するステップとを含むバイオマス製造方法。
前記培養は、従属栄養条件下で行うものである、請求項４に記載のバイオマス製造方法。
前記培養は、炭素源及び窒素源を含む培地を用いて行うものである、請求項４に記載のバイオマス製造方法。
前記炭素源は、グルコース、フルクトース、マルトース、ガラクトース、マンノース、スクロース、アラビノース、キシロース及びグリセリンからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項６に記載のバイオマス製造方法。
前記窒素源は、ｉ）酵母抽出物、牛肉抽出物（beef extract）、ペプトン（peptone）及びトリプトン（tryptone）からなる群から選択される有機窒素源、又はｉｉ）酢酸アンモニウム、硝酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸ナトリウム、ウレア及びＭＳＧ（Monosodium glutamate）からなる群から選択される無機窒素源である、請求項６に記載のバイオマス製造方法。
請求項１に記載のスラウストキトリウム属ＣＪＭ０１微細藻類を培養するステップと、前記微細藻類、その培養物、その乾燥物又はその破砕物からドコサヘキサエン酸含有脂質を回収するステップとを含むバイオオイル製造方法。