KR20230066973A - 세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법 - Google Patents

세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 출원은 세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 신규한 스키조키트리움 속 미세조류는 바이오매스 중 지방 함량이 높고, 그 중에서도 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산과 같은 불포화지방산의 함량이 높아, 그 자체 또는 배양 및 발효에 의해 생산된 바이오매스 및 바이오매스로부터의 불포화지방산을 포함한 지방 성분의 추출이 매우 용이하다. 이에, 상기 미세조류, 이로부터 제조되는 바이오매스 건조물 및 바이오오일은 사료용 조성물 또는 식품용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법{Novel strain of Schizochytrium sp. with easy intracellular oil extraction and a method for producing oil containing omega3 using the same}
본 출원은 세포 내 오일 함유량이 높은 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 및 이를 이용한 오메가3를 함유한 오일 생산방법에 관한 것이다.
트라우스토키트리드(Thraustochytrid)는 자연계 내의 다양한 환경에서 생존 및 분포하고 있다. 유기체에 부착하여 공생을 하거나, 해양 환경 또는 담수, 기수 환경에 부유하기도 하며, 다양한 퇴적지형 층에 분포하여 생존한다. 이러한 트라우스토키트리드는 해양 생태 먹이사슬의 최하위 계층에 속하며, 식물성 플랑크톤으로서 유기종속영양 원생생물 미세조류로 분류되기도 한다. 자연 환경 내에서의 트라우스토키트리드는 기능적으로 황(Sulfur), 질소(Nitrogen), 인(Phosphorous), 칼륨(Potassium)등의 자연계 순환 원소의 순환과 정화 역할을 담당한다. 또한, 오메가-3로 분류되는 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)을 포함하는 다중불포화지방산(polyunsaturated fatty acid: PUFA)을 고농도로 함유하여 해양생태계에 공급원으로서 기능을 한다.
사람을 포함한 대부분의 고등생물은 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 포함하는 다중불포화지방산을 자체적으로 합성하지 못하기 때문에 필수영양소로 섭취해야 한다. 다중불포화지방산 중 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산은 두뇌, 안구조직 및 신경계에 필수적인 지방산으로 특히 유아의 시력 및 운동신경능력 등 신경체계 발달 및 심혈관 질환 예방에 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있으며, 뇌의 구조적 지질에 가장 풍부한 구성요소이다.
지금까지 다중불포화지방산의 주요 공급원은 고등어, 꽁치, 참치, 전갱이, 정어리, 청어 등과 같은 등 푸른 생선의 기름에서 추출된 어유이며, 이는 해수 어류 초기 먹이와 같은 양어 사료로서도 매우 유용하다. 어유로부터의 다중불포화지방산 추출 및 섭취는 산업적으로 발달되었으나 단점 역시 존재한다. 어유의 품질은 어종, 계절, 어획 위치에 따라서 다양하며, 어획을 통해 발생되기 때문에 지속적으로 공급하는 데에 어려움이 있다. 또한, 어유 내 포함된 중금속 및 유기화학 물질에 의한 오염 문제, 어유 특유의 비린내는 물론 가공 공정 중에 이중결합이 산화되는 문제 등으로 제조 과정 및 생산량의 제한이 있다.
이와 같은 문제점을 해결하기 위하여 최근 미생물 배양에 의한 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 포함한 다중불포화 지방산의 제조방법에 대한 연구가 진행되고 있다. 특히, 미세조류는 자연적으로 지방산을 새로이 합성한다는 능력 외에도 어유에 비해 여러가지 이점을 제공할 수 있다. 산업적 스케일의 배양을 통해 안정적으로 공급이 가능하며, 상대적으로 일정한 생화학적 조성을 갖는 바이오매스의 제조를 가능하게 한다. 어유와는 달리, 미세조류에 의해 제조되는 지질은 임의의 불쾌한 취를 갖지 않는다. 또한, 어유에 비해 단순한 지방산 조성을 갖으며, 이는 주요한 지방산을 분리하기 위한 단계를 수월하게 한다.
이러한 장점을 바탕으로, 최근 미세조류를 이용한 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid, DHA), 에이코사펜타엔산 (Eicosapentaenoic aicd, EPA), 아라키돈산(Arachidonic acid, ARA), 도코사펜타엔산 (Docosapentaenoic aicd, DPA), 및 α-리놀렌산 등과 같은 오메가-3 불포화 지방산(ωunsaturated fatty acid)을 포함하는 다중불포화 지방산 생산에 관한 연구 및 산업화가 매우 빠르게 진행되고 있으며, 주로 해양미세조류의 일종인 트라우스토키트리움(Thraustochytrium) 속 및 스키조카이트리움(Schizochytrium) 속 미생물에 의한 다중불포화지방산 생산이다. 실례로, 스키조카이트리움속 미생물인 스키조카이트리움 sp. ATCC20888 (Schizochytrium sp. ATCC20888) 및 스키조카이트리움 sp. PTA10208 (Schizochytrium sp. PTA10208)를 이용하여 오메가-3 다중불포화지방산을 제조하는 방법이 개시되었으며 (미국특허 제5,130,242호), 추가적으로 트라우조카이트리드 계 트라우조카이트리움 속 미생물인 트라우조카이트리움 sp. ATCC10212 (Thraustochytrium sp. PTA10212)를 이용하여 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산을 제조하는 방법이 개시되었다.
미국 공개특허 US 5130242 A
본 출원의 일 예는 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 제공한다. 일 구체에서, 상기 신규한 스키조키트리움 속 미세조류는 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류(기탁번호: KCTC14660BP)일 수 있다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 또는 바이오오일을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 출원의 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 식품 조성물을 제공한다.
본 출원의 또 다른 예는 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 또는 바이오오일 제조방법을 제공한다.
본 출원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시 형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다. 또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 출원의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 출원에 포함되는 것으로 의도된다.
본 출원의 일 예는 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "트라우스토키트리드(Thraustochytrid)"는 트라우스토키트리알레스(Thraustochytriales) 목의 미세조류를 의미한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어, "스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.)"은 트라우스토키트리알레스 목의 트라우스토키트리아세애(Thraustochytriaceae) 과에 속하는 속명 중 하나로, 용어 "스키조키트리움 속(genus Schizochytrium)"과 혼용될 수 있다. 또한, 상기 용어 "미세조류(microalgae)"는 엽록소로 광합성을 하는 식물 중 육안으로 볼 수 없어 현미경을 통해서만 볼 수 있으며 물속에서 자유로이 부유하여 살아가는 생물을 의미하며, 식물플랑크톤(Phytoplankton)이라고도 불린다.
본 출원에서는 일 예로, 해안 일대 지역의 환경 시료를 채취하여 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열의 순수 분리 콜로리를 얻은 후, 조지방 및 지방산 분석 결과 세포 내 DHA 함량이 우수한 CD01-1821 및 CD01-1822 2종의 균주를 얻었으며, 배양 평가 결과, CD01-1821 균주가 동일 발효 조건 내 바이오매스 총 생산량과 총 오일함량이 높아 스케일업(Scale-up) 공정에 보다 용이함을 확인하였다.
따라서, 본 명세서에 있어서, 상기 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 미세조류는 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류(기탁번호: KCTC14660BP)일 수 있다.
또한, 상기 스키조키트리움 속 균주는 서열번호 1의 18s rRNA 염기서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 미세조류는 서열번호 1의 염기서열과 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 염기서열로 구성되는 18S rRNA를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA)"은 C22H32O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, 알파-리놀렌산(α-linolenic acid: ALA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)과 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 관용명은 세르본산(cervonic acid)이고, 약칭으로 22:6 n-3으로도 표기될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)"은 C20H30O2의 화학식을 갖는 다중불포화지방산 중 하나로, ALA 및 DHA와 함께 오메가-3 지방산에 해당하며, 약칭으로 20:5 n-3으로도 표기될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 60 중량%의 DHA를 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 40 내지 65 중량%, 45 내지 65 중량%, 50 내지 65 중량%, 40 내지 60 중량%, 45 내지 60 중량%, 50 내지 60 중량%, 또는 55 내지 60 중량%의 DHA를 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%의 EPA를 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 상기 스키조키트리움 속 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 0.2 내지 2 중량%, 0.2 내지 1.5 중량%, 0.2 내지 1 중량%, 0.3 내지 2 중량%, 0.3 내지 1.5 중량%, 0.3 내지 1 중량%, 0.5 내지 2 중량%, 0.5 내지 1.5 중량%, 0.5 내지 1 중량%, 0.5 내지 0.9 중량%, 또는 0.6 내지 0.8 중량%의 EPA를 생산 및/또는 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 상기 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 또는 바이오오일을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오매스(biomass)"는 화학적 에너지로 사용 가능한 식물, 동물, 미생물 등의 생물체, 즉 바이오에너지의 에너지원을 의미하며, 생태학적으로 단위 시간 및 공간 내에 존재하는 특정 생물체의 중량 또는 에너지량을 의미하기도 한다. 또한, 상기 바이오매스는 세포에 의해 분비되는 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않고, 세포외 물질뿐만 아니라 세포 및/또는 세포 내 내용물을 함유하는 것일 수 있다. 본 출원에서 상기 바이오매스는 스키조키트리움 속 미세조류 그 자체, 이의 배양물, 이의 건조물, 이의 파쇄물, 또는 상기 미세조류를 배양하거나 발효하여 생산된 산물일 수 있으며, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류의 "배양물"은 상기 미세조류를 배양하여 생성된 산물을 지칭하는 것으로, 구체적으로 미세조류를 포함하는 배양액 또는 상기 배양액에서 미세조류가 제거된 배양여액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 미세조류 배양물의 "건조물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 것으로, 예를 들어 상기 미세조류의 건조 균체 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 건조물의 "파쇄물"은 상기 미세조류 배양물에서 수분이 제거된 건조물을 파쇄한 결과물을 총칭하는 것으로, 예를 들어 건조 균체 분말일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 스키조키트리움 속 미세조류의 배양물은 미세조류 배양 배지에 상기 미세조류를 접종하고, 당업계에 공지된 배양 방법에 따라 제조될 수 있고, 상기 배양물의 건조물 및 이의 파쇄물 역시 당업계에 공지된 미세조류 또는 배양액의 처리 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 총 중량을 기준으로 40 내지 85 중량%, 45 내지 80 중량%, 50 내지 75 중량%, 50 내지 70 중량%, 는 54 내지 66 중량%의 조지방을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 바이오매스 총 중량을 기준으로 5 내지 25 중량%, 5 내지 20 중량%, 10 내지 20 중량%, 또는 15 내지 20 중량%의 조단백을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스는 지방산 총 중량을 기준으로 35 중량% 이상, 또는 35 내지 60 중량%의 DHA를 포함하는 것일 수 있고, 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 중량% 이상, 또는 0.1 내지 2 중량%의 EPA를 포함하는 것일 수 있고, 지방산 총 중량을 기준으로 30 내지 40 중량% 이상의 팔미트산을 포함하는 것일 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류는 오일 함유량이 높고, 그 중 오메가-3 함량이 높아 복합당 내에서 배양 시간을 단축하여 스케일업 공정에 유리하다.
본 명세서에 있어서 상기 “오일 함유량”은 “조지방 함량”과 혼용되어 사용될 수 있다.
상기 바이오매스는 일 양상에 따른 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스의 제조방법에 의해 제조되는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-1821 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 상기 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 바이오오일, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-1821 미세조류 유래 바이오매스, 또는 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오매스, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상기한 바와 같다.
상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물은 당업계에 공지된 미생물 바이오매스의 처리, 농축 또는 건조 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "바이오오일(bio-oil)"은 생물학적, 열화학 그리고 물리화학 추출공정에 의해 바이오매스로부터 얻어지는 오일을 의미하며, 본 출원에서 제조된 바이오오일은 다중불포화지방산을 함유하는 것일 수 있고, 구체적으로 DHA 및 EPA를 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 상기 바이오오일은 바이오매스의 추출물을 포함하는 것일 수 있다.
상기 바이오오일 추출물을 제조하는 방법으로, 세포막 또는 세포벽 성분을 파쇄 또는 용해시키는 방법에 따라 프로테아제, 셀룰라아제, 펙티나아제 또는 키티나아제 등의 효소를 활용하는 방법, 호모게나이저, 초음파 분쇄기, 비드 처리 등을 이용하여 물리적으로 세포막 또는 세포벽 성분을 파쇄하는 방법, 용매를 직접 첨가하여 세포 내 투과하여 추출하는 방법, 다양한 파쇄 공정 후에 원심분리 과정을 통해 분리하는 무용매 추출 공정 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 용액, 분말, 또는 현탁액 형태일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 조성물은 예를 들어, 식품 조성물, 사료 조성물 또는 사료 첨가제 조성물일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 조성물"은 동물에게 급여되는 먹이를 지칭한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료 조성물은 동물의 생명 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는 필요한 영양성분을 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 사료 조성물은 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조 가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "사료 첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내 섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "식품 조성물"은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
본 출원의 조성물은 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 사료; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조 성분 등을 더 포함할 수 있으며, 이외에도 영양 보충제, 소화 및 흡수 향상제, 성장 촉진제 등을 더 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물은 동물에게 단독으로 투여하거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합하여 투여할 수도 있다. 또한, 상기 조성물은 탑 드레싱으로서 또는 이들을 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도의 경구 제형으로 용이하게 동물에게 투여할 수 있다. 상기 조성물을 사료와 별도로 투여할 경우, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 약제학적으로 허용 가능한 식용 담체와 조합하여, 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 이러한 식용 담체는 고체 또는 액체, 예를 들어 옥수수 전분, 락토오스, 수크로오스, 콩 플레이크, 땅콩유, 올리브유, 참깨유 및 프로필렌글리콜일 수 있다. 고체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 정제, 캡슐제, 산제, 트로키제 또는 함당정제 또는 미분산성 형태의 탑 드레싱일 수 있다. 액체 담체가 사용될 경우, 상기 조성물은 젤라틴 연질 캡슐제, 또는 시럽제나 현탁액, 에멀젼제, 또는 용액제의 제형일 수 있다.
본 출원의 조성물은, 예를 들어, 보존제, 안정화제, 습윤제 또는 유화제, 동결보호제, 또는 부형제 등을 함유할 수 있다. 상기 동결보호제는, 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 보존제, 안정화제, 또는 부형제는 상기 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하(deterioration)를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다. 또한, 상기 동결보호제는 상기 조성물이 건조된 상태일 때 조성물에 포함되는 스키조키트리움 속 미세조류의 저하를 감소시키는데 충분한 유효량으로 조성물에 포함되는 것일 수 있다.
상기 조성물은 침주, 분무 또는 혼합하여 동물의 사료에 첨가하여 이용될 수 있다.
본 출원의 조성물은 포유류, 조류, 어류, 갑각류, 두족류, 파충류 및 양서류를 포함하는 다수의 동물 식이에 적용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 상기 포유류는 돼지, 소, 양, 염소, 실험용 설치 동물, 또는 애완 동물 등을 포함할 수 있고, 상기 조류는 가금류를 포함할 수 있고, 상기 가금류는 닭, 칠면조, 오리, 거위, 꿩, 또는 메추라기 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 어류는 상업적 축양 어류 및 이의 치어류, 관상어 등을 포함할 수 있고, 상기 갑각류는 새우, 따개비 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 조성물은 동물성 플랑크톤인 로티퍼(rotifer)의 식이에도 적용될 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-1821 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오매스, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물은 상기한 바와 같다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "배양"은 상기 미세조류를 적당히 조절된 환경 조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원의 배양 과정은 당업계에 알려진 적당한 배지와 배양 조건에 따라 이루어질 수 있다. 이러한 배양 과정은 선택되는 미세조류에 따라 당업자가 용이하게 조정하여 사용할 수 있다.
구체적으로, 본 출원의 스키조키트리움 속 미세조류의 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "종속영양"은 에너지원 또는 영양원을 체외에서 얻어낸 유기물에 의존하는 영양 방식으로, 독립영양에 대응되는 용어이며, 용어 '암배양'과 혼용될 수 있다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계는, 특별히 이에 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 본 출원의 미세조류의 배양에 사용되는 배지 및 기타 배양 조건은 통상의 미세조류의 배양에 사용되는 배지라면 특별한 제한 없이 어느 것이나 사용할 수 있다. 구체적으로, 본 출원의 미세조류를 적당한 탄소원, 질소원, 인원, 무기화합물, 아미노산 및/또는 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 호기성 조건 하에서 온도, pH 등을 조절하면서 배양할 수 있다.
구체적으로, 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH(예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양물의 호기상태를 유지하기 위하여, 배양물 내로 산소 또는 산소 함유 기체를 주입하거나, 혐기 및 미호기 상태를 유지하기 위해 기체의 주입 없이 혹은 질소, 수소 또는 이산화탄소 가스를 주입할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 배양온도는 20 내지 45℃ 또는 25 내지 40℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 배양 중에는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 탄소원은 글루코스, 프럭토스, 말토스, 갈락토스, 만노스, 수크로스, 아라비노스, 자일로스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 탄소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에 포함되는 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아 및 MSG(Monosodium glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원일 수 있으나, 미세조류를 배양하는데 사용되는 질소원이라면 이에 제한되지 않는다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류를 배양하는 단계에서 사용되는 배지에, 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유염 등을 개별적으로 포함하거나 또는 혼합하여 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 바이오매스를 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 바이오매스를 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 양태는 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-1821 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오오일 제조방법을 제공한다.
상기 스키조키트리움 속 미세조류, 바이오오일, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 및 상기 건조물의 파쇄물, 상기 미세조류를 배양하는 단계는 상기한 바와 같다.
상기 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물로부터 지질을 회수하는 단계는 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 목적하는 지질을 수집하는 것일 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있고, 정제 공정을 더 포함하는 것일 수 있다.
예를 들면, 지방 알데하이드, 지방 알콜 및 탄화수소(예를 들어, 알칸)와 같은 지질 및 지질 유도체는 헥산과 같은 소수성 용매로 추출할 수 있다. 지질 및 지질 유도체는 또한 액화, 오일 액화 및 초임계 CO2 추출 등 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 또한, 공지된 미세조류 지질 회수 방법은 예를 들어, i) 원심분리에 의해 세포를 수거하고 증류수로 세척한 후, 동결 건조에 의해 건조시키고, ii) 수득한 세포 분말을 분쇄한 후, n-헥산으로 지질을 추출하는 방법이 있다(Miao, X and Wu, Q, Biosource Technology (2006) 97:841-846).
본 발명의 신규한 트라우스토키트리드 계열의 미세조류는 바이오매스 중 지방 함량이 높고, 그 중에서도 도코사헥사엔산 및 에이코사펜타엔산과 같은 불포화지방산의 함량이 높아, 그 자체 또는 배양 및 발효에 의해 생산된 바이오매스 및 바이오매스로부터의 불포화지방산을 포함한 지방 성분의 추출이 매우 용이하다. 이에, 상기 미세조류, 이로부터 제조되는 바이오매스 건조물 및 바이오오일은 사료용 조성물 또는 식품용 조성물 등으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 트라우스토키트리드 계열 미세조류 균주를 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 2는 분리된 트라우스토키트리드 계열 미세조류 29종의 총 지질 함량, 오메가-3 중 도코사헥사엔산(docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA) 함량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 야생형 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 CD01-1821을 광학현미경으로 관찰한 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시에에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류의 분리
트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류를 분리하기 위하여, 대한민국 서해안 지역, 서천, 군산, 부안 및 영광군 해안 일대의 총 40여개 지역으로부터 해수, 나뭇잎 및 퇴적물 형태의 환경 시료를 채취하였다. 유기퇴적물이 발달되고 관찰되는 특정 지역을 중심으로 샘플링을 실시하였으며 채취된 환경 샘플은 실험실 환경으로 7일 이내 운반되어 분리하고자 하는 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 계열 미세조류를 제외한 박테리아류 미생물 및 곰팡이, 원생생물 등의 기타 오염원 제거 작업을 진행하였다. 지속적인 현미경 검경을 통하여 트라우스토키트리드 계열 미세조류 특징적인 형태(Morphology)를 보이며 생태 주기(Life cycle) 내에서 관찰 가능한 유주자(Zoospore)를 형성하거나, 발달 단계상 생성되는 외형질 망(Ectoplasmic network)이 구성되는 시료를 중심으로 트라우스토키트리드 계열 미세조류 세포를 분리하였다(도 1). 상기 분리 과정에서 활용한 분리 및 배양 배지로는 변형된 YEP 배지(효모 추출물(Yeast extract) 0.1g/L, 펩톤 0.5g/L, MgSO4·7H2O 2g/L, 해염(Sea salt) 50g/L, H3BO3 5.0mg/L, MnCl2 3.0mg/L, CuSO4 0.2mg/L, NaMo4·2H2O 0.05mg/L, CoSO4 0.05mg/L, ZnSO4·7H2O 0.7mg/L, 아가(Agar) 15g/L)를 활용하였다. 수회에 걸친 분리 및 계대 배양 과정을 통해 오염원이 제거된 순수 분리 콜로니를 얻을 수 있었으며, 분리된 콜로니는 항생제 칵테일 믹스 용액(스트렙토마이신 설페이트(Streptomycin sulfate) 0-50mg/L, 암피실린(Ampicillin) 0-30mg/L, 페니실린(Penicillin) G 0-30mg/L, 카나마이신 설페이트(Kanamycin sulfate) 0-30mg/L)을 포함한 고체 배지에서 재차 오염원 제어 및 제거 과정을 거쳐 순수 분리 가능한 콜로니를 획득하였다.
실시예 2. 분리된 미세조류의 배양 평가 및 우수 균주 선별
상기 실시예 1에서 순수 분리된 콜로니들을 대상으로 배양 평가를 수행하고, 이를 통해 우수한 균주를 선별하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 순수 분리된 콜로니들을 변형된 GGYEP 배지(글루코스 5g/L 글리세롤 5g/L, 효모 추출물 0.1g/L, 펩톤 0.5g/L, MgSO4·7H2O 2g/L, 해염 50g/L, H3BO3 5.0mg/L, MnCl2 3.0mg/L, CuSO4 0.2mg/L, NaMo4·2H2O 0.05mg/L, CoSO4 0.05mg/L, ZnSO4·7H2O 0.7mg/L)를 이용하여 250mL 플라스크에서 10-35℃, 100-200rpm 조건으로 약 2일간 배양하였다. 진행된 배양 결과를 토대로, 30℃ 이상의 온도 조건에서 성장이 가능하며, 성장 속도가 우수하고 균체량이 확보 가능한 미세조류 29종을 선별하였다. 선별된 미세조류 균주를 대상으로 30g/L의 글루코스를 탄소원으로 포함하는 변형된 GYEP 배지 및 배양 조건 30℃, 150rpm, 500ml 플라스크 스케일 배양을 2일간 진행하였다. 2일 동안의 배양 환경에서 투입된 탄소원을 모두 소모함을 확인한 후, 배양액 전체를 회수하여 60℃ 드라이오븐에서 밤새 건조하여 바이오매스를 수득하였다.
상기 배양한 미세조류 균체의 지질 및 다중불포화지방산 함량을 분석하기 위해 아래와 같은 방법을 이용하였고, 건조균체를 활용한 미세조류 유래 지방산 함유 오일은 다음의 방법으로 측정하였다. 건조균체 5g에 8.3M 염산용액(HCl)을 가하여 80℃에서 미세조류 균체의 세포벽을 가수분해한 후, 에틸 에테르 30mL 및 석유 에테르(Petroleum ether) 20mL을 첨가하고 30초간 섞어준 후 원심분리하는 과정을 3회 이상 반복하였다. 분리된 용매 층을 회수하여, 미리 무게를 측정해 둔 라운드 플라스크에 옮긴 뒤 질소퍼징을 통해 용매를 제거하고 데시게이터(Desicator)에서 냉각 항량하였다. 건조 후 플라스크 무게에서 빈 플라스크 무게를 뺀 값으로 건조된 건조된 오일의 무게를 측정하여, 전체 오일 함량을 산출하였다. 오일 중에 포함된 도코사헥사엔산(DHA)함량은 메탄올성 0.5N NaOH 및 14% 트리플루오로보란메탄올(BF3)을 통해 전처리하여 기체크로마토그래피법으로 측정하여 나타내었다.
[계산식 1]
전체 오일 함량(%)= (*오일 g/건조균체량 g) X 100
*오일 g: 산 가수분해 및 용매 제거 후 플라스크 무게 - 공 플라스크 무게
하기 표 1의 “바이오매스”는 배양액 내의 균체 농도를 의미하는 것으로서, 하기 표 2의 DCW(dry cell weight)와 혼용되어 사용될 수 있다.
　 총 오일 (%/바이오매스) 지방산함량 (%/TFA)
DHA EPA
1811 40.01 19.46 1.72
1812 36.03 17.90 1.80
1813 34.21 19.40 2.10
1814 38.67 18.90 1.98
1815 28.89 17.90 2.92
1816 23.84 17.64 3.38
1821 31.53 57.25 0.71
1822 43.18 58.68 0.53
1831 29.80 29.38 1.98
1832 31.50 33.35 1.61
1833 22.36 37.26 2.83
1834 23.44 36.12 2.22
1835 39.03 29.85 0.70
1836 21.73 35.77 2.76
1837 18.39 33.30 2.96
1838 19.81 38.77 2.76
1839 20.76 37.91 3.06
18310 20.65 39.93 2.85
18311 22.96 40.17 2.70
18312 18.26 39.27 3.31
18313 21.99 36.68 2.69
1841 26.33 19.40 1.06
1842 35.53 21.75 1.38
1843 34.83 18.67 1.02
1844 29.74 23.92 1.65
1845 33.23 19.89 0.89
1846 28.23 20.63 1.13
1847 31.37 18.56 0.91
1848 30.51 42.74 1.06
1849 29.19 20.46 1.50
18410 24.63 25.17 1.84
18411 21.93 25.75 1.96
(상기 표에서 TFA는 총지방산을 의미하고, 조지방량 또는 총 지질과 혼용되어 사용될 수 있다.)그 결과, 표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 및 CD01-1822 2종의 균주가 세포 내 DHA 함량이 50% 이상으로 매우 높게 나타났다.
상기 지방산 분석 결과 세포 내 DHA 함량이 우수한 CD01-1821, CD01-1822 2종의 균주를 대상으로 5L 스케일 배양기에서 배양 평가를 진행하였다. 종균 배양(Seed culture)은 500mL 플라스크에서 멸균된 MJW02 배지(글루코스 30g/L, MgSO4·7H2O 3.0g/L, Na2SO4 15g/L, NaCl 0.8g/L, 효모 추출물 1.0g/L, MSG·1H2O 1.0g/L, NaNO3 1.0g/L, KH2PO4 0.8g/L, K2HPO4 1.5g/L, CaCl2 0.5g/L, 비타민 혼합 용액 10ml/L)를 이용하여 30℃, 150rpm 조건으로 약 24시간 배양하였다. 종균 배양된 플라스크는 5L 배양기로 분주 및 접종하였다. 총 배양액 대비 28%의 글루코스 탄소원을 공급하고 약 72시간 배양을 진행하며, 멸균된 MJW02 배지 및 배양환경 30℃, 500rpm, 1.5vvm, pH 5-8 조건에서 배양을 진행하였다.
Schizochytrium sp. CD01-1821 Schizochytrium sp. CD01-1822
배양시간 (hr) 71.5 71.5
O.D (680nm) 154.2 103
DCW (g/L) 139.5 103
조지방량 (%) 58.6 49.7
그 결과, 표 2에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 균주가 동일 발효 조건 내 바이오매스 총 생산량과 조지방량이 CD01-1822 균주보다 높아 스케일업(Scale-up) 공정에 보다 용이함을 확인하였다. 이에 CD01-1821 균주를 선정하여 균주 서열 동정 및 추가 균주 개발에 활용하였다. 상기 선정된 CD01-1821 균주의 형태는 광학현미경을 이용하여 관찰하여 도 3에 나타내었다.
실시예 3. 복합 탄소원 조건 하에서 CD01-1821 균주의 배양 특성 확인
종속 영양 미생물 기반의 발효에서는 주로 글루코스 성분을 탄소원의 원재료로 활용한다. 이때의 글루코스는 90% 이상 정제된 형태의 단당류로, 다른 탄소원 원재료 성분에 비해 산업적 스케일의 발효 시 그 비용이 더 발생된다. 저렴한 탄소원 원재료 활용 및 이를 통한 가격 경쟁력 확보를 위하여, 정제된 형태의 글루코스가 아닌 미생물이 발효 시 이용이 가능하되 저렴한 탄소원 성분에서 정상 배양이 가능한 균주를 발굴하는 것이 중요하다.
이에, 상기 실시예 2에서에서 선별한 CD01-1821 균주와 CJM01(등록특허 10-2100650)균주를 글루코스(Glucose), 프럭토스(Fructose) 또는 원당(Sucrose)을 주성분으로 하는 원당에서의 발효 배양 평가를 수행하여 배양 특성을 확인하였다. 배양은 30L 배양기에서 진행하였으며, 변형된 MJW02 배지를 기반으로 주요 탄소원 성분을 글루코스 450 g/L, 글루코스 225 g/L 와 프럭토스 225 g/L의 혼합물, 글루코스 225 g/L, 프럭토스 220 g/L 및 황산염(sulfate) 1.51 g/L를 포함하는 원당 분해물로 각각 실험하였다. 배양 조건은 30℃, 500rpm, 1.5vvm, pH 5-8 조건으로 동일하게 설정하였으며, 총 배양액 부피의 35%의 탄소원을 각각 공급하였다.
　 Schizochytrium sp. CD01-1821 Thraustochytrium sp. CJM01
탄소원 글루코스 글루코스+프럭토스 혼합물 원당(Sucrose) 분해물 글루코스 글루코스+프럭토스 혼합물 원당(Sucrose) 분해물
배양시간 (hr) 54.7 56.1 47.3 60 66.83 83.3
O.D (680nm) 169.3 143.7 177.9 152.7 180.4 155.7
DCW (g/L) 163 160 161 130 150 138
조지방량 (%) 60.7 60.1 60.3 61.2 61.7 59.3
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 균주는 글루코스 단일성분이 아닌 프럭토스 혼합물 또는 원당 분해물 배지 조건의 발효에서도 동등 이상 수준의 총 바이오매스 생산량 및 조지방량을 나타냈다. 반면, CJM01 균주는 글루코스 성분 이외의 당 성분이 배지 내 첨가되면서 이원화된 탄소원 소모 및 세포 성장 패턴의 이단계적응성장(Diauxic growth) 형태를 보이며 총 배양시간이 길어지는 현상을 나타냈다. 해당 실험 결과를 통해, CD01-1821 균주는 복합 탄소원 조건에서의 스케일업화된 발효 가능성을 확인할 수 있었다.
실시예 4. 신규한 스키조키트리움 속 균주 CD01-1821의 동정
상기 실시예 1 및 실시예 2에서 분리 및 선정된 미세조류 균주 CD01-1821의 문자생물학적 동정을 위하여 18S rRNA 유전자 서열을 분석하였다.
구체적으로, 순수 분리된 미세조류 CD01-1821의 콜로니로부터 gDNA 를 추출 및 분리한 후, 표 4에 기재된 18s rRNA 부위의 유전자 증폭용 프라이머 18s-Fwd, LABY-ARev를 이용하여 PCR 증폭 반응을 수행하였다.
서열번호 프라이머 서열 (5' - 3')
1 18S-Fwd AAC CTG GTT GAT CCT GCC AGT
2 LABY-ARev GGG ATC GAA GAT GAT TAG
PCR 반응은 택 폴리머라제(taq polymerase)를 함유하는 반응 용액을 사용하여 95℃에서 5분간 변성 후, 95℃ 30초 변성, 50℃ 30초 어닐링, 72℃ 2분 중합을 35회 반복한 후, 72℃에서 5분간 중합반응을 수행하였다. PCR 과정을 통하여 증폭된 반응액은 1% 아가로즈겔에 전기영동하여 약 1000 bp size의 DNA단편이 증폭되었음을 확인하였고, 염기서열 시퀀싱 분석을 진행하였다. 분석 결과 확보된 해당 서열은 NCBI BLAST 검색을 통하여, 트라우스토키트리드(Thraustochytrid) 과(科) 계열 미세조류에 속하는 스키조키트리움 리마시눔(Schizochytrium limacinum) 균주 OUC109의 18S rRNA 유전자 염기서열과 95.11%의 상동성을 나타내고, 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) 균주 LY-2012의 18S rRNA 유전자 염기서열과 95.0%의 상동성을 보임을 확인하였다. 이를 통하여, 분리된 미세조류 CD01-1821은 신규한 스키조키트리움 속 균주임을 확인하여, 이를 스키조키트리움 속 (Schizochytrium sp.) CD01-1821 균주로 명명하고, 2021년 8월 23일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터 (KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC14660BP를 부여받았다.
실시예 5. CD01-1821 균주 배양액 샘플의 조단백 함량 분석
Schizochytrium sp. CD01-1821 균주 배양액 샘플의 조단백 함량을 분석하기 위해 하기와 같은 방법을 이용하였다.
구체적으로, 건조 균체, 약 20~30mg에 해당하는 각각의 발효액 건조물(검체)을 정밀히 측정하여 분해튜브에 넣고 분해촉진제 2알을 넣었다. 상기 분해촉진제는 황산(H2SO4)과 황산칼륨(K2SO4)의 비율이 1.4~2.0:1.0 이 되어야 분해가 효율적으로 이뤄진다. 그런 다음, 분해튜브에 진한 황산(H2SO4) 12~15mL을 첨가하고, 420℃의 분해장치에서 45 내지 60분간 분해하여 분해액의 색이 투명한 연푸른색(구리 촉매제를 사용한 경우) 또는 투명한 노란색(셀레늄 촉 매제를 사용한 경우)이 되면 상온으로 냉각시켰다. 식힌 다음, 분해된 시험용액에 80mL의 증류수를 첨가하였다. 25mL의 혼합지시약이 섞인 포집용액을 삼각 플라스크에 넣은 후, 이를 증류장치에 놓고 증류 시 증류액이 포집용액으로 들어가도록 삼각플라스크 받침대를 들어 올렸다. 수산화나트륨용액(NaOH) 50mL (분해시 사용한 황산의 4배에 해당하는 양)을 분해튜브에 넣고, 증류장치에서 3 내지 4분간 증류하였다. 증류장치의 삼각 플라스크에 있는 포집용액이 증류액에 함유되어 있는 암모니아(NH3)를 포집하면서 녹색으로 변하는 것을 확인하였다. 증류액을 염산용액(일반적으로 0.1N 또는 0.2N)을 이용하여, 종말점이 엷은 핑크빛에 도달할 때까지 적정하고, 적정에 사용된 산의 양을 기록하였다. 자동장치인 경우 증류, 적정, 계산과정이 모두 자동으로 수행된다. 상기 실험 결과를 이용하여 하기 계산식 2에 의해 질소%를 도출하였다. 단백질 정량은 앞서 도출한 질소%에 평균 질소계수인 6.25를 곱하여 표기하였다.
[계산식 2]
질소(%) = {(HCl 양 mL - 공시험 mL) x M x 14.01/검체량 mg} x 100
* 14.01: 질소의 원자량
* M: HCl의 몰농도
* 분해촉진제: Kjeltabs 또는 이와 동등한 것
* 붕산용액: H3BO3 100g(또는 400g), 0.1% 브로모크레졸그린용액 100mL 및 0.1% 메틸레드용액 100mL을 넣어 10L로 정용한 1% (또는 4%) 붕산용액
아미노산 함량 분석을 위하여, CD01-1821 균주 배양액으로부터 약 1g의 발효액 건조물(검체) 샘플을 채취하였다. 6N 농도의 HCl 용액을 활용하여 세포 내 단백질의 산 가수분해를 진행한 후, 증류수로 희석 및 여과하여 액체 크로마토그래피를 수행하였다.
　 Schizochytrium sp. CD01-1821
조단백량 (%) 17
아미노산량 (mg/L) 　
아스파르트산 78.44
트레오닌 0
세린 108.65
글루탐산 790.8
글라이신 165.08
알라닌 172.72
시스테인 0
발린 96.35
메티오닌 46.54
이소류신 16.88
류신 13.17
타이로신 229.64
페닐알라닌 166.55
리신 85.83
히스티딘 0
아르기닌 114.15
그 결과, 표 5에 나타낸 바와 같이, CD01-1821 건조 균체 내의 조단백 함량은 17%임을 확인하였다. 또한, 건조 균체 내 아미노산 함량은 글루탐산이 가장 높았으며, 타이로신, 알라닌, 페닐알라닌, 글라이신, 아르기닌, 세린, 발린, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 이소류신, 류신의 순서로 높았다. 이를 통해, CD01-1821 건조 균체 내 아미노산은 글루탐산, 타이로신, 알라닌, 페닐알라닌, 글라이신, 아르기닌, 세린, 발린, 리신, 아스파르트산, 메티오닌, 이소류신, 류신으로 구성됨을 확인하였다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 KCTC14660BP 20210823
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> Novel strain of Schizochytrium sp. with easy intracellular oil extraction and a method for producing oil containing omega3 using the same <130> DPP20213976KR <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 850 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 18s rRNA sequence of CD01-1821 <400> 1 aagcttgttt caaagattac catgcatgtg taagtataag cgattgtact gtgagactgc 60 gaacggctca ttatatcagt aataatttct tcggtagttt cttttatagg atacctgcag 120 taattctgga aataatacat gctgtaagag ccctgtatgg ggctgcactt attagattga 180 agccgatttt attggtgaat catgataatt gagcagattg acttttttgt catgaatcgt 240 ttgagtttct gccccatcag ttgtcacggt agtgtattgg actacggtga ctataacggg 300 tgacggaagt tagggctgac tccggaaggg agcctgaaac ggctaccata tccaaggata 360 gcacaggccg taaattaccc actgtggact ccacaggtag tgacagaaat atcgatgcaa 420 gcgtgtatgc gttttgctat cggaatgaag caatgtaaaa ccctcatcga ggatcaactg 480 gagggcaagt ctggtgccag cagccgcggt aattccagct ccagaagcat atgctaaagt 540 tgttgcagtt aaaaagctgt agttgaattt tggcatgggc accggtgctt tccctgaatg 600 gggattgatt gttgtgttgc cttggccatc tttttcttct tttttggaat ctttcactgt 660 aatcaaagca agtgttccaa gcaggcgatg accggtatgt ttattatggg atgataaata 720 ggacttgggt gctattttgt tggtttgcac gcctgagtaa ggttaatagg aacagttggg 780 ggtattcgta tttaggagct agaggtgaaa ttcttgattc caaaagacaa acagaggaaa 840 ggcattccca 850 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_18S Fwd primer <400> 2 aacctggttg atcctgccag t 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic_LABY-ARev primer <400> 3 gggatcgaag atgattag 18

Claims (13)

  1. 신규한 스키조키트리움 속(Schizochytrium sp.) CD01-1821 미세조류(기탁번호: KCTC14660BP).
  2. 제1항에 있어서, 상기 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류는 오메가-3 불포화 지방산 생산능을 가지는, 스키조키트리움 속 미세조류.
  3. 제2항에 있어서, 상기 오메가-3 불포화 지방산은 도코사헥사엔산(Docosahexaenoic acid: DHA) 및 에이코사펜타엔산(eicosapentaenoic acid: EPA)인, 스키조키트리움 속 미세조류.
  4. 제3항에 있어서, 상기 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 35 내지 60 중량%의 도코사헥사엔산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류.
  5. 제3항에 있어서, 상기 미세조류는 지방산 총 중량을 기준으로 0.1 내지 2 중량%의 에이코사펜타엔산을 생산하는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류.
  6. 제1항의 스키조키트리움 속 미세조류, 상기 미세조류의 배양물, 상기 배양물의 건조물, 또는 상기 건조물의 파쇄물을 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스.
  7. 제6항의 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스, 상기 바이오매스의 농축물 또는 건조물, 또는 상기 바이오매스의 추출물을 포함하는 사료 조성물.
  8. 제1항의 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 이의 건조물, 또는 이의 파쇄물로부터 도코사헥사엔산 함유 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 배양은 종속영양 조건 하에서 수행되는 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 배양은 탄소원 및 질소원을 포함하는 배지를 사용하여 수행하는 것인, 바이오매스 제조방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 말토오스, 갈락토오스, 만노오스, 수크로오스, 아라비노오스, 자일로오스 및 글리세롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 바이오매스 제조방법.
  12. 제10항에 있어서, 상기 질소원은 i) 효모 추출물(yeast extract), 우육 추출물(beef extract), 펩톤 및 트립톤으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유기질소원, 또는 ii) 암모늄 아세테이트, 암모늄 나이트레이트, 암모늄 클로라이드, 암모늄 설페이트, 소듐 나이트레이트, 우레아 및 MSG(Monosodium glutamate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 무기질소원인 것인, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오매스 제조방법.
  13. 제1항의 스키조키트리움 속 CD01-1821 미세조류를 배양하는 단계; 및 상기 미세조류, 이의 건조물, 또는 이의 파쇄물로부터 도코사헥사엔산 함유 바이오매스를 회수하는 단계를 포함하는, 스키조키트리움 속 미세조류 유래 바이오오일 제조방법.
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