BR112020019053A2

BR112020019053A2 - Microalgas, método de produção de uma biomassa, e, método de produção de um bio-óleo

Info

Publication number: BR112020019053A2
Application number: BR112020019053-5A
Authority: BR
Inventors: Ji Young Kim; Myung Geun Park; Hye Min Park; Jung Woon Choi; Sang Min Park; Sang Young Bae; Jin Sook CHANG
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2018-06-29
Filing date: 2019-06-26
Publication date: 2021-01-12
Also published as: EP3760705B1; KR20200002448A; WO2020004924A1; AR115667A1; FI3760705T3; MY194114A; CN112513247A; ES2932536T3; US20210002680A1; UY38286A; DK3760705T3; CL2020002416A1; BR112020019053B8; RU2754686C1; CN112513247B; EP3760705A1; AU2019292277B2; TWI715088B; JP6947941B2; BR112020019053B1

Abstract

a presente revelação se refere a cepas de gênero thraustochytrium que incluem um alto teor de ácidos graxos poli-insaturados e um método de produção de uma biomassa com uso do mesmo. de acordo com as microalgas cjm01 inovadoras de gênero thraustochytrium da presente revelação, o teor de lipídios na biomassa e o teor de ácido graxo insaturado como ácido docosa-hexaenoico na biomassa são altos, para que as próprias microalgas, uma biomassa produzida pelo cultivo e fermentação de microalgas, um condensado da biomassa e um produto seco da biomassa sejam muito úteis como composição alimentar.

Description

1 / 24 MICROALGAS, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UMA BIOMASSA, E, MÉTODO DE PRODUÇÃO DE UM BIO-ÓLEO

CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente revelação refere-se a cepas de gênero Thraustochytrium que inclui um alto teor de ácidos graxos poli-insaturados, uma biomassa produzida a partir das cepas, um lipídio que inclui as cepas e um método de produção de ácidos graxos poli-insaturados.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] O ácido docosa-hexaenoico (DHA), que é um ácido graxo poli- insaturado, é um ácido graxo essencial para o cérebro, os tecidos oculares e o sistema nervoso, e é conhecido por desempenhar um papel importante no desenvolvimento da acuidade visual e capacidade dos neurônios motores de bebês. Foi relatado que a quantidade de DHA é significativamente reduzida no cérebro de um paciente com demência, e foi recentemente constatado que o DHA tem várias funções antienvelhecimento, como supressão de degeneração macular em presbiopia. Além disso, foi relatado que o DHA também pode ser usado como um aditivo de alimentação para peixes (Publicação de Pedido de Patente número KR 10-2007-0040751). Visto que a maioria dos animais superiores, incluindo humanos, não podem sintetizar suavemente os ácidos graxos poli-insaturados necessários para as funções biológicas normais, devem ingerir ácidos graxos poli-insaturados como nutrientes essenciais, e a Organização Mundial da Saúde recomenda um consumo constante de ácidos graxos poli-insaturados que contenha DHA pelo menos 1 g/dia. Tradicionalmente, as fontes de fornecimento de ácidos graxos poli-insaturados de DHA são peixes de águas profundas, como atum e salmão, que ocupam o nível superior do ecossistema marinho. No entanto, à medida que a poluição do ambiente marinho se agrava, o risco de ingestão de peixes de águas profundas aumenta devido ao acúmulo de poluentes como mercúrio, metais pesados, hormônios ambientais e substâncias radioativas no corpo dos peixes de águas

2 / 24 profundas. Portanto, como um novo meio de fornecer óleo de ácido graxo poli- insaturado de DHA de maneira segura e confiável, as microalgas do gênero Thraustochytrium têm valores industriais muito importantes.

[003] Vários métodos para a superexpressão de genes foram sugeridos em microalgas do gênero Thraustochytrium . Tecnologias de transformação de microalgas do gênero Thraustochytrium que usa vários genes de resistência a antibióticos como marcadores de seleção foram relatadas desde que métodos de transformação genética de microalgas do gênero Thraustochytrium que usa acetolactato sintase como marcador de seleção foram introduzidos pela primeira vez pela Martec Corporation. Especificamente, a Publicação do Pedido de Patente número KR 2015-0084148 revela "um vetor recombinante para aumentar a produtividade da biomassa de microalgas e lipídio e um uso do mesmo".

[004] No entanto, até agora, uma tecnologia de transformação genética desenvolvida a partir de microalgas do gênero Thraustochytrium é um método de integração cromossômica em que genes introduzidos em comum são inseridos no DNA cromossômico e tem a vantagem de os genes inseridos serem mantidos de forma estável, mas tem limitações no número de cópias de genes e controle de expressão em comparação com um método de expressão de genes com uso de plasmídeo centromérico ou epissomal com capacidade de autorreplicação.

REVELAÇÃO PROBLEMA DA TÉCNICA

[005] Consequentemente, os presentes inventores desenvolveram microalgas que melhoraram o teor e a produtividade do ácido docosa- hexaenoico mutando-se microalgas KC01 do gênero Thraustochytrium e estabeleceram uma biomassa que inclui um lipídio que contém ácido docosa- hexaenoico e um método de produção de um bio-óleo cultivando-se essas microalgas. Com base neste desenvolvimento e estabelecimento, a presente

3 / 24 revelação foi concluída.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[006] Um objetivo da presente revelação deve fornecer microalgas CJM01 (número de depósito: KCTC 13538BP) do gênero Thraustochytrium através da qual aumenta a produção de ácido docosa-hexaenoico (DHA) e diminui a produção de aminoácidos em comparação as microalgas selvagens.

[007] Outro objetivo da presente revelação deve fornecer um método de produção de biomassa, que inclui etapas de: cultivar microalga CJM01 de gênero Thraustochytrium ; e recuperar uma biomassa que contém ácido docosa- hexaenoico (DHA) da microalga, um produto cultivado da mesma, um produto seco da mesma ou um produto pulverizado da mesma.

[008] Ainda outro objetivo da presente revelação deve fornecer um método de produção de um bio-óleo, que inclui as etapas de: cultivar as microalgas CJM01 de gênero Thraustochytrium ; e recuperar um lipídio que contém ácido docosa-hexaenoico (DHA) das microalgas, um produto cultivado do mesmo, um produto seco do mesmo ou um produto pulverizado do mesmo.

EFEITOS VANTAJOSOS

[009] De acordo com as microalgas CJM01 inovadoras do gênero Thraustochytrium da presente revelação, a produção de um aminoácido é notavelmente reduzida e o teor de uma gordura na biomassa e o teor de um ácido graxo insaturado, como o ácido docosa-hexaenoico, são elevados, para que as próprias microalgas, biomassa produzida pela cultura e fermentação de microalgas, um condensado da biomassa e um produto seco da biomassa sejam muito úteis como composição alimentar.

BREVE DESCRIÇÃO DE DESENHOS

[0010] A Figura 1 é uma fotografia que mostra cepas KC01 de gênero Thraustochytrium observadas por um microscópio óptico.

[0011] A Figura 2 mostra uma árvore filogenética entre cepas KC01 de gênero Thraustochytrium, cepas de gênero Thraustochytrium, cepas de gênero

4 / 24 Aurantiochytrium, e cepas de gênero Schizochytrium .

MELHOR MODO PARA A INVENÇÃO

[0012] Doravante, a presente revelação será descrita em detalhes.

[0013] Enquanto isso, as descrições estruturais e funcionais específicas das modalidades reveladas no presente documento são apenas para fins ilustrativos de outras modalidades. A presente revelação pode ser incorporada em muitas formas diferentes sem se afastar do espírito e das características significativas da presente revelação. Portanto, as modalidades da presente revelação são reveladas apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitantes da presente revelação.

[0014] Para realizar os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium pelas quais a produção de ácido docosa-hexaenoico (DHA) aumenta e a produção de aminoácidos diminui, em comparação com microalgas selvagens.

[0015] Conforme usado no presente documento, o termo "cepas do gênero Thraustochytrium " se refere às microalgas heterotróficas orgânicas, que desempenham um papel importante como fontes de fornecimento de triacilglicerol que contém vários ácidos graxos poli-insaturados, o que inclui ácido docosa-hexaenoico (DHA) em uma alta concentração. Além disso, as “microalgas” se referem a organismos vivos que podem ser vistos apenas através de um microscópio porque não podem ser vistos a olho nu e que flutuam livremente na água, e também são chamados de fitoplâncton.

[0016] Conforme usado no presente documento, por exemplo, cepas KC01 selvagens do gênero Thraustochytrium são irradiadas com raios gama para gerar cepas mutantes, sendo que as cepas têm produtividade melhorada de óleo que contém ácidos poli-insaturados são selecionadas a partir das cepas mutantes, e essas cepas foram chamadas de cepas CJM01 do gênero Thraustochytrium, depositado em 30 de maio de 2018 com a Korean Collection for Type Cultures (KCTC), uma organização internacional de depósito sob o

5 / 24 Tratado de Budapeste, e recebeu o número de depósito KCTC 13538BP.

[0017] Além disso, as microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação podem ter um rRNA 18s de SEQ ID NO. 1, mas a presente revelação não se limita ao mesmo.

[0018] Conforme usado no presente documento, o termo "ácido docosa-hexaenoico (DHA)" é um dos ácidos graxos poli-insaturados representados pela Fórmula C22H32O2e é um material extraído extensivamente de peixes azuis, como atum ou sardinha. Além disso, o ácido docosa- hexaenoico (DHA) pertence ao ômega 3 junto com o ácido eicosapentaenoico (EPA) e o ácido α-linolênico (ALA).

[0019] As microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação podem incluir uma grande quantidade de ácido docosa-hexaenoico (DHA), em comparação com as cepas KC01 do gênero Thraustochytrium que são cepas parentais. Especificamente, as microalgas CJM01 podem incluir ácido docosa-hexaenoico (DHA) em uma quantidade de 30% em peso a 65% em peso, 30% em peso a 60% em peso, 40% em peso a 65% em peso ou 40% em peso a 60% em peso, com base no peso total de ácidos graxos incluídos nas microalgas, mas a presente revelação não está limitada aos mesmos.

[0020] Adicionalmente, as microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação podem ter produtividade melhorada do ácido docosa-hexaenoico (DHA), em comparação com as cepas KC01 do gênero Thraustochytrium que são cepas parentais. A produtividade do ácido docosa-hexaenoico (DHA) pode ser medida pela concentração (g/l) de ácido docosa-hexaenoico (DHA) produzida por 1 hora. As microalgas da presente revelação podem ter uma produtividade de ácido docosa-hexaenoico (DHA) de 0,4 a 0,8 (g/l/h), 0,4 a 0,7 (g/l/h), 0,5 a 0,8 (g/l/h), ou 0,5 a 0,7 (g/l/h), mas a presente revelação não está limitada às mesmas.

[0021] Enquanto isso, nas microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação, a produção de um aminoácido pode

6 / 24 ser reduzida, em comparação com as cepas KC01 do gênero Thraustochytrium que são cepas parentais. Especificamente, as microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação ou uma solução de cultura das mesmas podem não incluir pelo menos um aminoácido selecionado do grupo que consiste em aspartato, serina, glutamato, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, lisina e arginina. Por exemplo, como pode ser visto no Exemplo 2, aspartato, serina, glutamato, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, lisina e arginina podem não ser detectados a partir da solução de cultura das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação.

[0022] Por exemplo, a produção total de um aminoácido pela microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação pode ser reduzida em 90% ou mais, 95% ou mais, 97% ou mais, ou 99% ou mais, em comparação com as cepas KC01 do gênero Thraustochytrium que são cepas parentais. Isso indica que as cepas CJM01 são usadas de forma mais eficaz na via de biossíntese do ácido docosa-hexaenoico em comparação com as cepas parentais KC01. Especificamente, visto que as microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium da presente revelação raramente produzem aminoácidos, a solução de cultura das cepas pode incluir aminoácidos apenas em uma quantidade de 0,1 a 20 mg/l, 0,1 a 15 mg/l, 0,1 a 10 mg/l, 0,1 a 7 mg/l ou 0,1 a 5 mg/l.

[0023] Outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de biomassa, que inclui: cultivar microalga CJM01 de gênero Thraustochytrium ; e recuperar uma biomassa que contém ácido docosa- hexaenoico (DHA) da microalga, um produto cultivado da mesma, um produto seco da mesma ou um produto pulverizado da mesma. Além disso, a biomassa pode ser produzida na forma de um corpo de fungo seco, mas a presente revelação não está limitada a isso.

[0024] A presente revelação fornece uma biomassa produzida pelo

7 / 24 método. A biomassa pode incluir ácido docosa-hexaenoico (DHA) em uma quantidade de 15 a 40% em peso, 20 a 35% em peso ou 25 a 30% em peso, com base no seu peso total, mas a presente revelação não é limitada a isso.

[0025] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método de produção de um bio-óleo, que inclui: cultivar as microalgas CJM01 de gênero Thraustochytrium ; e recuperar um lipídio que contém ácido docosa- hexaenoico (DHA) das microalgas, um produto cultivado do mesmo, um produto seco do mesmo ou um produto pulverizado do mesmo.

[0026] A presente revelação fornece um bio-óleo produzido pelo método. O bio-óleo pode incluir ácido docosa-hexaenoico (DHA) em uma quantidade de 30 a 65% em peso, 30 a 60% em peso, 40 a 65% em peso ou 40 a 60% em peso, com base no peso total de ácidos graxos, mas a presente revelação não está limitada a isso.

[0027] Especificamente, o método de produção de um bio-óleo de acordo com a presente revelação pode incluir etapas de: cultivar as microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium ; produzir uma biomassa que contém ácido docosa-hexaenoico (DHA) a partir das microalgas, um produto cultivado da mesma, um produto seco da mesma ou um produto pulverizado da mesma; e recuperar um lipídio que contém ácido docosa-hexaenoico (DHA) a partir da biomassa produzida. No entanto, a presente revelação não se limita aos mesmos.

[0028] O “gênero Thraustochytrium” e “ácido docosa-hexaenoico” são como descritos acima.

[0029] Conforme usado no presente documento, o "bio-óleo" é obtido a partir de uma biomassa por um processo de extração biológica, termoquímica ou físico-química. O bio-óleo produzido de acordo com a presente revelação pode incluir ácido graxo poli-insaturado, especificamente, ácido docosa- hexaenoico, mas a presente revelação não está limitada aos mesmos.

[0030] Adicionalmente, a “biomassa” se refere a organismos como

8 / 24 plantas, animais e microrganismos que podem ser usados como energia química, ou seja, fontes de energia de bioenergia. Além disso, a biomassa ecologicamente também se refere ao peso ou quantidade de energia de um organismo específico que sai dentro de uma unidade de tempo e espaço. Além disso, embora a biomassa inclua compostos secretados por células, também pode incluir materiais extracelulares, bem como células e/ou teor intracelular. Conforme usado no presente documento, a biomassa pode ser as próprias microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium, um produto cultivado da mesma, um produto seco da mesma, um produto pulverizado da mesma, um produto produzido pela cultura ou fermentação das microalgas, ou pode ser um condensado da biomassa ou um produto seco da biomassa. No entanto, a biomassa não se limita a isso.

[0031] Conforme usado no presente documento, o produto cultivado das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium se refere a um produto obtido pela cultura das microalgas e, especificamente, pode ser uma solução de cultura que inclui as microalgas ou uma solução de cultura que não inclui as microalgas, mas a presente revelação não é limitada a isso. Conforme usado no presente documento, o produto cultivado das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium se refere a um produto obtido pela remoção da umidade das microalgas e, especificamente, pode ser produzido na forma de um corpo de fungo seco, mas a presente revelação não é limitada a isso. Conforme usado no presente documento, o produto pulverizado das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium coletivamente se refere a um produto obtido por pulverização das microalgas e pode ser produzido na forma de sobrenadante ou pelete, mas a presente revelação não é limitada a isso.

[0032] As próprias microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium, o produto cultivado das mesmas, o produto seco das mesmas ou o produto pulverizado das mesmas inclui ácido docosa-hexaenoico e pode ser usado para produzir uma biomassa ou um bio-óleo.

9 / 24

[0033] Conforme usado no presente documento, o termo "cultivo" significa que as microalgas são cultivadas sob condições ambientais moderadamente controladas. O processo de cultura de acordo com a presente revelação pode ser realizado dependendo do meio de cultura apropriado e das condições de cultura. Esse processo de cultura pode ser facilmente ajustado por aqueles versados na técnica de acordo com as microalgas selecionadas.

[0034] Especificamente, o cultivo das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium de acordo com a presente revelação pode ser realizada sob condições heterotróficas, mas a presente revelação não está limitada às mesmas.

[0035] Conforme usado no presente documento, a "nutrição heterotrófica" é uma forma nutricional que depende da matéria orgânica obtida a partir de uma fonte de energia (nutrição) in-vitro e é um termo que corresponde à nutrição independente. As microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium de acordo com a presente revelação podem melhorar a quantidade e a produtividade do ácido docosa-hexaenoico otimizando a composição de um meio de cultura de uma fonte de carbono ou uma fonte de nitrogênio sob condições heterotróficas. Adicionalmente, conforme usado no presente documento, o termo “nutrição heterotópica” pode ser usado de forma intercambiável com “cultura escura”.

[0036] Adicionalmente, a etapa de cultivo das microalgas não é particularmente limitada e pode ser realizada por um método de cultura em lote conhecido, um método de cultura contínua conhecido, um método de cultura em lote alimentado ou semelhantes. O meio de cultura e outras condições de cultura usados na cultura das microalgas da presente revelação podem ser usados sem limitações, desde que possam ser geralmente usados para cultivar as microalgas. Especificamente, as microalgas da presente revelação podem ser cultivadas em um meio de cultura geral, que inclui uma fonte de carbono, uma fonte de nitrogênio, uma fonte de fósforo, um composto inorgânico,

10 / 24 aminoácidos e/ou vitaminas enquanto se ajusta a temperatura, pH e semelhantes sob condições aeróbicas.

[0037] Especificamente, um pH otimizado (por exemplo, um pH de 5 a 9, especificamente um pH de 6 a 8, e mais especificamente um pH de 6,8) pode ser ajustado usando-se um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, um ácido fosfórico ou um ácido sulfúrico), mas a presente revelação não está limitada aos mesmos.

[0038] Além disso, oxigênio ou gás que contém oxigênio pode ser injetado em uma cultura para manter o estado aeróbio da cultura, ou gás nitrogênio, gás hidrogênio ou gás dióxido de carbono podem ser injetados na cultura sem injetar oxigênio ou gás que contém oxigênio para manter o estado anaeróbio ou não aeróbio da cultura, mas a presente revelação não está limitada ao mesmo.

[0039] Além disso, a temperatura de cultivo pode ser mantida de 20 °C a 45 °C, especificamente, 25 °C a 40 °C, e o cultivo pode ser realizada por cerca de 10 a 160 horas, mas a presente revelação não é limitada a isso. Além disso, durante o cultivo, a formação de bolhas pode ser inibida pelo uso de um agente deformador, como éster de poliglicol de ácido graxo, mas a presente revelação não está limitada a isso.

[0040] O cultivo das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium de acordo com a presente revelação pode ser realizado com uso de um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio.

[0041] Conforme usado no presente documento, o termo "meio de cultura" se refere a um meio para cultivar as microalgas da presente revelação e/ou um produto obtido após o cultivo das microalgas. O meio de cultura pode ter uma forma que inclui as microalgas e uma forma obtida pela remoção das microalgas de uma solução de cultura que inclui as microalgas por centrifugação, filtração ou semelhantes.

11 / 24

[0042] Adicionalmente, no meio de cultura usado na presente revelação, como fontes de carbono, açúcares e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, galactose, manose, maltose, arabinose, xilose, melaço, amido e celulose), gorduras e óleos (óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco), ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linoléico), álcoois (por exemplo, glicerol e etanol) e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético) pode ser usado individualmente ou em combinação. Especificamente, a fonte de carbono pode ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, frutose, maltose, galactose, manose, sacarose, arabinose, xilose e glicerol, mas não é limitada, desde que possa ser usada para cultivar microalgas. Além disso, no meio de cultura usado na presente revelação, como fonte de carbono, glicose com uma concentração de 10 a 50 g/l, 10 a 40 g/l, 20 a 50 g/l, 20 a 40 g/l, ou 25 a 35 g/l podem ser usados, mas a presente revelação não está limitada aos mesmos.

[0043] As fontes de nitrogênio do meio de cultura usado na presente revelação podem ser classificadas em fontes de nitrogênio orgânico e fontes de nitrogênio inorgânico, mas essas fontes de nitrogênio orgânico e fontes de nitrogênio inorgânico podem ser usadas individualmente ou em combinação. Especificamente, a fonte de nitrogênio pode ser uma fonte de nitrogênio orgânico selecionada a partir do grupo que consiste em um extrato de levedura, um extrato de carne bovina, peptona e triptona, ou pode ser uma fonte de nitrogênio inorgânico selecionada a partir do grupo que consiste em acetato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, sulfato de amônio, nitrato de sódio, ureia e glutamato monossódico (MSG).

[0044] Além disso, no meio de cultura usado na presente revelação, os exemplos da fonte de nitrogênio podem incluir um extrato de levedura, sulfato de amônio, nitrato de sódio e MSG, mas não estão limitados aos mesmos, desde que possam ser usados para cultivar microalgas.

12 / 24

[0045] Especificamente, o extrato de levedura pode ser incluído no meio de cultura em uma concentração de0,1 a 10 g/l, 0,5 a 10 g/l, 0,5 a 7 g/l, 0,5 a 5 g/l, 0,5 a 3 g/l, 0,5 a 2 g/l, ou 0,5 a 1,5 g/l, o sulfato de amônio pode ser incluído no meio de cultura em uma concentração de 1 a 5 g/l, 1 a 4 g/l, 2 a 5 g/l, ou 2 a 4 g/l, o nitrato de sódio pode ser incluído no meio de cultura em uma concentração de 0,1 a 10 g/l, 0,5 a 9 g/l, 1 a 9 g/l, 2 a 9 g/l, 3 a 9 g/l, 5 a 9 g/l, ou 7 a 9 g/l e o MSG pode ser incluído no meio de cultura em uma concentração de 0,1 a 2 g/l, 0,1 a 1,5 g/l, 0,5 a 2 g/l, ou 0,5 a 1,5 g/l. No entanto, a presente revelação não se limita aos mesmos.

[0046] Para o propósito da presente revelação, uma vez que as cepas CJM01 são caracterizadas por não terem inibição de amônia e podem crescer em uma ampla concentração de sal, fontes de carbono e fontes de nitrogênio podem ser adequadamente ajustadas em consideração a essas características.

[0047] No meio de cultura usado na presente revelação, como a fonte de fósforo, di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico e sais que contêm sódio correspondentes aos mesmos podem ser usados individualmente ou em combinação, mas a presente revelação não está limitada aos mesmos. O meio de cultura pode incluir outros sais metálicos (por exemplo, sulfato de magnésio e sulfato de ferro), aminoácido e um material promotor de crescimento essencial, como vitamina.

[0048] Na etapa de recuperação de uma biomassa das microalgas cultivadas na etapa de cultura, o produto cultivado da mesma, o produto seco ou o produto pulverizado da mesma, uma biomassa desejada pode ser coletada usando-se um método adequado conhecido na técnica.

[0049] Na etapa de recuperação do ácido docosa-hexaenoico produzido na etapa de cultura, o ácido docosa-hexaenoico desejado pode ser coletado da própria microalgas ou do produto cultivado da mesma, usando-se um método adequado conhecido na técnica. Por exemplo, uma biomassa desejada ou ácido docosa-hexaenoico desejado pode ser recuperado das microalgas cultivadas por

13 / 24 um método adequado conhecido na técnica, o produto cultivado da mesma, o produto seco da mesma ou o produto pulverizado da mesma e, neste caso, centrifugação, filtração, cromatografia de troca aniônica, cristalização, HPLC ou semelhantes podem ser usados. A etapa de recuperação da biomassa ou docosa-hexaenoico pode incluir adicionalmente uma etapa de separação e/ou uma etapa de purificação.

[0050] Por exemplo, lipídios e derivados de lipídios, como aldeídos graxos, álcoois graxos e hidrocarbonetos (por exemplo, alcanos) podem ser extraídos por um solvente hidrofóbico, como hexano (Frenz et al. 1989, Enzyme Microb. Technol., 11:717). Lipids and lipid derivatives may also be extracted by using liquefaction (Sawayama et al. 1999, Biomass and Bioenergy 17: 33 a 39 and Inoue et al. 1993, Biomass Bioenergy 6 (4): 269 a 274); oil liquefaction (Minowa et al. 1995, Fuel 74 (12): 1735 a 1738); and supercritical CO2 extraction (Mendes et al. 2003, Inorganica Chimica Acta 356: 328 a 334). Além disso, o protocolo de recuperação de lipídeos de microalgas conhecido revela um método que inclui as etapas de i) coletar células com uso de centrifugação, lavar as células coletadas com água destilada e, em seguida, liofilizar as células lavadas para obter pó celular e ii) pulverizar o pó de célula obtido em um almofariz e, em seguida, extração de lipídios com uso de n- hexano [Miao e Wu, Biosource Technology (2006) 97: 841 a 846].

[0051] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece uma composição que inclui microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium, um produto cultivado da mesma, um produto seco da mesma ou um produto pulverizado da mesma. A composição pode incluir uma biomassa ou bio-óleo produzido com uso das microalgas.

[0052] As microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium, o produto cultivado, o produto seco e o produto pulverizado são conforme descritos acima. A biomassa ou bio-óleo produzido com uso das microalgas também são conforme descrito acima. Com a finalidade de preparar uma composição que

14 / 24 inclui um alto teor de ácido docosa-hexaenoico, as microalgas da presente revelação podem ser usadas. A composição pode ser produzida na forma de uma solução, um pó ou uma suspensão, mas a presente revelação não está limitada aos mesmos. Mais especificamente, uma composição alimentar, uma composição alimentar ou um aditivo alimentar, que inclui microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium, o produto cultivado da mesma, o produto seco da mesma ou o produto pulverizado da mesma, podem ser fornecidos.

[0053] Conforme usado no presente documento, o termo "alimentação" se refere a um alimento animal para comer, ingerir e digerir, ou se refere a qualquer dieta natural ou artificial adequada, uma refeição ou um ingrediente de uma refeição. A alimentação de acordo com a presente revelação, que inclui uma composição para prevenir ou tratar doenças metabólicas como um ingrediente ativo, pode ser produzida em vários tipos de alimentações conhecidas na técnica e exemplos específicos dos mesmos podem incluir alimentação concentrada, alimentação grossa e/ou alimentação especial.

[0054] Conforme usado no presente documento, o termo "aditivo de alimentação" se refere a um material que é adicionado a uma alimentação para fins de vários efeitos, como reposição de nutrientes, prevenção de perda de peso, melhoria na utilização digestiva de celulose na alimentação, melhoria da qualidade do óleo, distúrbio reprodutivo prevenção, melhoria da taxa de concepção e prevenção de tração de alta temperatura no verão. O aditivo de alimentação da presente revelação corresponde a uma alimentação suplementar sob a lei de gerenciamento de alimentação e pode incluir ainda uma preparação mineral, como hidrogenocarbonato de sódio, bentonita, óxido de magnésio ou mineral complexo; preparação mineral que é um mineral traço, como zinco, cobre, cobalto ou selênio; preparação de vitaminas, como caroteno, vitamina E, vitaminas A, vitamina D, vitamina E, ácido nicotínico ou complexo de vitamina B; preparação de aminoácidos protetores, como metionina ou lisina; preparação de ácido graxo protetora, como sal de cálcio de ácido graxo; preparação de

15 / 24 bactérias vivas, como bactérias probióticas (bactérias de ácido láctico), culturas de leveduras ou produtos de fermentação de fungos; e preparação de fermento.

[0055] Conforme usado no presente documento, o termo "composição alimentar" inclui todos os tipos de alimentos, como alimentos funcionais, suplementos nutricionais, alimentos saudáveis e aditivos alimentares. A composição alimentar acima pode ser produzida em várias formas de acordo com métodos comumente conhecidos na técnica.

[0056] A presente revelação fornece um método de produção de uma composição que inclui a biomassa ou bio-óleo. A biomassa, bio-óleo e composição são como descritos acima.

[0057] No método acima de produção de um bio-óleo, um bio-óleo que inclui um alto teor de ácido docosa-hexaenoico pode ser produzido pela etapa de cultivo das microalgas CJM01 do gênero Thraustochytrium, que tem alta produtividade de ácido docosa-hexaenoico, em um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono de uma composição específica e uma fonte de nitrogênio de uma composição específica sob condições heterotróficas.

MODO PARA A INVENÇÃO

[0058] Doravante, a presente invenção será descrita em mais detalhes com referência aos Exemplos. No entanto, esses exemplos são apenas ilustrativos da presente revelação e o escopo da presente revelação não está limitado a esses exemplos.

[0059] As microalgas CJM01 da presente revelação são microalgas pertencentes à família Thraustochytrid e têm uma capacidade de produzir ácidos graxos poli-insaturados, que inclui um alto teor de ácido docosa- hexaenoico. As microalgas CJM01 da presente revelação têm uma sequência de nucleotídeos de DNA do gene 18S rRNA representado por SEQ ID NO. 1, e têm um alto teor de biomassa sob condições heterotróficas, não sob condições de crescimento em cultura leve.

[0060] Nos exemplos a seguir, os métodos experimentais serão

16 / 24 descritos em mais detalhes. EXEMPLO 1: SEPARAÇÃO DAS MICROALGAS KC01 DA FAMÍLIA

THRAUSTOCHYTRID

[0061] Para separar as cepas de microalgas da família Thraustochytrid, os seguintes experimentos foram executados.

[0062] Especificamente, amostras ambientais de água do mar, solo e folha foram coletadas de 20 áreas costeiras de Geoje e áreas Tongyeong de Gyeongsangnam-do, Coreia. Em seguida, as amostras foram armazenadas em uma caixa de gelo a 10 °C e transportadas para o laboratório. As amostras foram usadas em um trabalho de separação de bactérias de 2 a 3 dias. Essas amostras foram espalhadas diretamente em meio de ágar e, em seguida, as cepas Thraustochytrid foram separadas com uso de um método de aplicação de pó de pinho líquido. As amostras, sendo que cada uma inclui uma forma semelhante a microalga observada por um microscópio, foram manchadas em um meio de cultura IYP para separação microbiana (1 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de peptona, 2 g/l de MgSO4⋅7H2O, 20 g/l de sal marinho, 5,0 mg/l de H3BO3, 3,0 mg/l de MnCl2, 0,2 mg/l de CuSO4, 0,05 mg/l de NaMo4⋅⋅2H2O, 0,05 mg/l de CoSO4, 0,7 mg/l de ZnSO4⋅7H2O e 15 g/l de ágar) para obter colônias. As colônias obtidas foram submetidas a subcultivos várias vezes para serem purificadas e separadas, sendo então selecionadas e separadas apenas as cepas formadoras de zoosporângios que são características típicas de microalgas Thraustochytrid . Amostras ambientais que não puderam ser confirmadas por observação microscópica foram diluídas e lavadas com água do mar esterilizada que tem salinidade de 1,5%, e então pulverizadas com pó de pinho e cultivadas. Comunidades microbianas obtidas cultivando-se em condições de temperatura e pH semelhantes a cada ambiente de coleta foram manchadas em um meio de cultura IYP para separação microbiana e subcultivadas para serem purificadas e separadas. Nesse caso, uma solução de mistura de coquetel de antibióticos (0 a 500 mg/l de sulfato de estreptomicina, 0 a 500 mg/l de

17 / 24 ampicilina, 0 a 500 mg/l de penicilina G e 0 a 500 mg/l de sulfato de canamicina) foi introduzido durante o ajuste de sua concentração, e assim o crescimento e a poluição de outros micróbios foram controlados.

[0063] As colônias separadas foram cultivadas em um frasco de 500 ml a uma temperatura de 15 °C a 28 °C e uma velocidade de rotação de 50 a 200 rpm por cerca de 7 dias com uso de um meio de cultura IGGYP (0 g/l de glicerol, 10 g/l de glicose, 1 g/l de extrato de levedura, 1 g/l de peptona, 2 g/l de MgSO4⋅7H2O, 20 g/l de sal solar, 5,0 mg/l de H3BO3, 3,0 mg/l de MnCl2, 0,2 mg/l de CuSO4, 0,05 mg/l de NaMo4∙2H2O, 0,05 mg/l de CoSO4, 0,7 mg/l de ZnSO4⋅7H2O e 10 ml/l de solução mista de vitaminas). Um tipo de microalga, cuja taxa de crescimento era rápida e cujas condições de cultivo não eram complicadas, foi finalmente selecionado e os corpos dos fungos foram recuperados. As formas das cepas selecionadas foram observadas com uso de um microscópio óptico (mostrado na Figura 1). Os corpos de fungos selecionados foram lavados com solução tamponada de fosfato (PBS, pH 7,5) e, em seguida, secos em estufa a 55 °C por 16 horas para obtenção dos corpos de fungos secos.

[0064] A sequência de gene 18s rRNA foi analisada para a identificação molecular de cepas das microalgas finalmente selecionadas. O DNA é separado das colônias puramente separadas das espécies selecionadas e, em seguida, o rRNA 18s foi amplificado por reação em cadeia de polimerase (PCR) com uso de iniciadores para amplificação de gene em uma região de rRNA 18s. Os iniciadores para amplificação de genes são resumidos na Tabela 1 abaixo. TABELA 1 Iniciador Sequência (5' - 3') SEQ ID NO. 18s-001F AACCTGGTTGATCCTGCCAGTA 2 18s-013R CCTTGTTACGACTTCACCTTCCTCT 3

[0065] Nesse caso, após desnaturação a 95 °C por 5 minutos, a PCR foi executada em um total de 25 ciclos nas seguintes condições: desnaturação a 95 °C por 30 segundos; hibridização a 52 °C por 30 segundos; e polimerização

18 / 24 a 72 °C durante 1 minuto e 30 segundos. Depois disso, a reação de polimerização foi executada a 72 °C durante 7 minutos.

[0066] Como resultado da análise da sequência de nucleotídeos com uso da solução de reação amplificada, a sequência de nucleotídeos 1 (SEQ ID NO. 1) que tem um tamanho de cerca de 1.792 bp foi obtido. Como resultado da pesquisa do NCBI BLAST, foi constatado que a sequência de nucleotídeos 1 tinha cerca de 99% de homologia com as cepas do gênero Thraustochytrium relatadas anteriormente e tinha cerca de 84% de homologia com as cepas do gênero Aurantiochytrium e gênero Schizochytrium .

[0067] Assim, a árvore filogenética entre as cepas é expressa e os resultados das mesmas são mostrados na Figura 2. As cepas correspondentes foram identificadas como microalgas do gênero Thraustochytrium da família Thraustochytrid e, portanto, denominadas KC01 do gênero Thraustochytrium . EXEMPLO 2: DESENVOLVIMENTO DE MICROALGAS MUTANTES EXEMPLO 2-1: SELEÇÃO DE MICROALGAS MUTANTES ATRAVÉS

DE UM MÉTODO DE MUTAÇÃO ARTIFICIAL

[0068] Na presente revelação, o seguinte experimento foi executado de modo a separar cepas com produtividade melhorada de ácido docosa- hexaenoico (DHA) por mutação de irradiação de raios gama das cepas KC01 do gênero Thraustochytrium, que foram separadas no Exemplo 1.

[0069] Especificamente, as cepas KC01 do gênero Thraustochytrium foram cultivadas em meio de cultura GYEP (2% de glicose, 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 2% de sal solar) por 24 horas para ativar as cepas. As cepas ativadas foram inoculadas em um meio de subcultura (5 % de glicose, 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 2% de sal solar), que foram esterilizadas a 121 °C por 15 minutos e cultivadas por 14 horas, e então os corpos dos fungos foram recuperados. Os corpos de fungos recuperados foram suspensos em 50 ml de um tampão PBS, irradiados com raios gama a uma dose de 1 a 5 kGy por 1 hora, e então cultivados em 50 ml de um meio de cultura

19 / 24 básico (5% de glicose, 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 2% de sal solar) com uso de um frasco de 500 ml a uma temperatura de 28 °C e uma revolução de 120 rpm por 2 dias. Em seguida, os corpos de fungos suspensos foram adequadamente diluídos quando a taxa de mortalidade é de 99% e subcultivados em um meio de cultura de placa plana GYEP (2% de glicose, 1% de peptona, 0,5% de extrato de levedura e 2% de sal solar, 2% de ágar, pH 7,0) duas vezes.

[0070] Primeiramente, as colônias, cuja cor se torna branca, foram selecionadas para selecionar cepas previstas para ter pigmentos sulfatados reduzidos produzidos, além de óleos que contêm ácidos graxos poli- insaturados. As cepas mutantes obtidas pelo método acima foram chamadas de cepas CJM01 do gênero Thraustochytrium, depositadas em 30 de maio de 2018 com a Korean Collection for Type Cultures (KCTC), uma organização depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, e recebeu o número de depósito KCTC 13538BP. EXEMPLO 2-2: ANÁLISE DAS CAPACIDADES DE MICROALGAS

RECÉM SEPARADAS E CEPAS MUTANTES PARA PRODUZIR ÓLEO QUE CONTÉM ÁCIDOS GRAXOS POLIINSATURADOS.

[0071] As cepas CJM01 e KC01 selecionadas do Exemplo 2-1 foram cultivadas como se segue, para comparar a capacidade das cepas CJM01 de produzir óleo que contém ácidos graxos poli-insaturados com a capacidade das cepas KC01 de produzir óleo que contém ácidos graxos poli-insaturados.

[0072] Especificamente, para cultivar as cepas CJM01 e KC01, que são microalgas do gênero Thraustochytrium de acordo com a presente revelação, as cepas CJM01 e KC01 foram cultivadas em meio de cultura MJW01 (30 g/l de glicose, 3,0 g/l de MgSO4⋅7H2O, 10 g/l de Na2SO4, 1,0 g/l de NaCl, 9,0 g/l de extrato de levedura, 1,0 g/l de MSG⋅1H2O, 1,0 g/l de NaNO3, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de K2HPO4, 0,5 g/l de CaCl2 e 10 ml/l de solução mista de vitaminas) sob condições básicas de meio de cultura de 28 °C, 300 rpm, 1vvm

20 / 24 e pH 7,5 por 4 dias. Os corpos dos fungos foram recuperados por centrifugação, lavados com tampão PBS três vezes e, em seguida, secos a 55 °C por 12 horas para medir o peso dos corpos dos fungos.

[0073] O teor de óleo que contém ácido docosa-hexaenoico que utiliza os corpos de fungos secos foi medido como segue. Especificamente, 8,3 M de solução de ácido clorídrico foram aplicados a 2 g dos corpos de fungos secos para hidrolisar as paredes celulares dos corpos de fungos de microalgas a 80 °C, 30 ml de éter etílico e 20 ml de éter de petróleo foram adicionados aos corpos de fungos secos e agitada durante 30 segundos e, em seguida, a mistura foi separada centrifugamente 3. Esse procedimento foi repetido três vezes ou mais. Em seguida, a camada de solvente separada foi recuperada, colocada em um frasco redondo cujo peso foi medido previamente, purgado com nitrogênio para remover um solvente e, em seguida, o resultante foi colocado em um recipiente, cuja umidade foi removida e seca. O peso do óleo seco foi medido para calcular o teor total de óleo. O teor de DHA no óleo foi medido por cromatografia após pré-tratamento do óleo com NaOH metanólico 0,5 N e metanol trifluoroborano 14% (BF3).

[0074] O desempenho da cultura das cepas KC01 do gênero Thraustochytrium, cultivadas pelo método acima, e o desempenho da cultura das cepas mutantes CJM01 selecionadas por irradiação de raios gama são dados nas Tabelas 2 e 3. Foi constatado nas Tabelas 2 e 3 que o DHA, que é óleo ômega-3 altamente funcional, foi produzido.

[0075] A "biomassa" nas Tabelas 2 e 3 se refere à concentração dos corpos de fungo em uma solução de cultura e pode ser usada em combinação com o peso celular seco (DCW). O teor de DHA é expresso como o seu teor em relação à biomassa ou ácido graxo total (TFA).

[0076] Conforme mostrado nos resultados a seguir, a produção de DHA pelas cepas mutantes CJM01 foi melhorada em comparação com a das cepas parentais (cepas KC01 do gênero Thraustochytrium ) (consulte as

21 / 24 Tabelas 2 e 3). Especificamente, a produção de DHA pelas cepas mutantes CJM01 foi aumentada em cerca de 1,3 vezes em comparação com a das cepas KC01. Além disso, foi constatado que a produtividade de DHA pelas cepas mutantes CJM01 foi aumentada em cerca de 1,7 vezes em comparação com a das cepas KC01 porque o tempo de cultivo foi significativamente reduzido sem uma diminuição nos corpos de fungos obtidos. TABELA 2 TEOR E PRODUTIVIDADE DE ÁCIDO DOCOSA-HEXAENOICO (DHA)

DE ACORDO COM O CULTIVO DO GÊNERO THRAUSTOCHYTRIUM DE CEPAS PARENTAIS KC01 Produtividade de Tempo Biomassa DHA Lipídio Entrada DHA (h) g/l (%/Biomassa) (%/TFA) % (g/l/h) 1 71,5 115,2 22,7 35,6 63,7 0,365 2 73,0 127,5 21,6 33,6 64,3 0,377 3 78,5 141,8 22,3 36,8 60,5 0,402 Média 74,3 128,2 22,2 35,3 62,8 0,381 TABELA 3 TEOR E PRODUTIVIDADE DE ÁCIDO DOCOSA-HEXAENOICO (DHA)

DE ACORDO COM O CULTIVO DO GÊNERO THRAUSTOCHYTRIUM DE CEPAS MUTANTES CJM01 Tempo Biomassa DHA Lipídio Produtividade de DHA Entrada (h) g/l (%/Biomassa) (%/TFA) % (g/l/h) 1 57,3 123,0 29,3 47,6 61,5 0,629 2 55,5 133,5 27,5 45,5 60,4 0,661 3 54,8 133,5 28,0 57,1 49,0 0,682 Média 55,9 130,0 28,3 50,1 57,0 0,657

[0077] A partir dos resultados acima, foi constatado que as cepas CJM01, que são cepas mutantes, tinham um teor aumentado de DHA e melhor condutividade de DHA em comparação com as cepas KC01, que são cepas parentais. EXEMPLO 2-3: ANÁLISE DAS CAPACIDADES DE MICROALGAS

RECÉM SEPARADAS E CEPAS MUTANTES PARA PRODUZIR AMINOÁCIDOS.

[0078] Para avaliar as características da cultura das cepas CJM01, o

22 / 24 teor total de aminoácidos na solução de cultura acima foi determinado.

[0079] Especificamente, 10 ml de amostra foram coletados de cada uma das soluções de cultura acima, diluídos em água destilada por 20 vezes e filtrados, e então o teor total de aminoácidos foi analisado com uso de cromatografia líquida. Como resultado da análise da concentração total de aminoácidos, aspartato, serina, glutamato, glicina, alanina, valina, metionina, isoleucina, leucina, tirosina, fenilalanina, lisina e arginina foram detectados respectivamente na solução de cultura das cepas parentais KC01 em uma quantidade de 10 mg/l, enquanto a maioria dos aminoácidos não foram detectados na solução de cultura das cepas CJM01 com um teor de DHA melhorado.

[0080] Especificamente, foi constatado que, no caso das cepas mutantes CJM01, a concentração total de aminoácidos como produtos colaterais diferentes de DHA é reduzida em cerca de 99% ou mais, em comparação com as cepas parentais KC01 (consulte a Tabela 4).

[0081] Assim, foi constatado que, no caso das cepas mutantes CJM01, o crescimento dos corpos do fungo está em um nível equivalente, em comparação com as cepas parentais KC01, e o teor total de lipídios não é muito reduzido em comparação com o teor de corpos de fungos e, portanto, as cepas mutantes CJM01 usaram a fonte de carbono fornecida para um mecanismo biossintético de DHA de forma mais eficaz em comparação com as cepas parentais KC01. TABELA 4

ANÁLISE DO TOTAL DE AMINOÁCIDOS NA SOLUÇÃO DE CULTURA DE ACORDO COM O CULTIVO DE CEPAS PARENTAIS KC01 DO GÊNERO THRAUSTOCHYTRIUM E CEPAS MUTANTES CJM01 DO

GÊNERO THRAUSTOCHYTRIUM Aminoácido Cepas parentais T. KC01 Cepas mutantes T. CJM01 (mg/l) 1 2 3 Média 1 2 3 Média Asp 20,3 28,9 12,3 20,5 0,0 0,0 0,0 0,0 Ser 49,5 85,2 28,6 54,4 0,0 0,0 0,0 0,0 Glu 91,6 108,4 193,0 131,0 0,0 0,0 0,0 0,0

23 / 24 Gly 32,4 52,8 28,7 38,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Ala 72,6 104,4 41,1 72,7 0,0 0,0 0,0 0,0 Val 83,0 130,8 59,5 91,1 10,1 0,0 0,0 3,4 Met 32,1 58,2 16,0 35,4 0,0 0,0 0,0 0,0 Ile 42,1 77,0 18,8 46,0 0,0 0,0 0,0 0,0 Leu 93,0 166,9 41,8 100,6 0,0 0,0 0,0 0,0 Tyr 51,7 86,5 0,0 46,1 0,0 0,0 0,0 0,0 Phe 83,4 129,9 58,4 90,5 0,0 0,0 0,0 0,0 Lys 45,9 83,3 20,2 49,8 0,0 0,0 0,0 0,0 His 15,9 25,0 0,0 13,6 0,0 0,0 0,0 0,0 Arg 57,0 93,7 24,0 58,2 0,0 0,0 0,0 0,0 Sum 770,5 1231,1 542,5 848,0 10,1 0,0 0,0 3,4 EXEMPLO 3: OTIMIZAÇÃO DE CONDIÇÕES DE MEIO DE CULTURA

[0082] Para melhorar ainda mais o teor e a produtividade de DHA com uso das cepas CJM01 com um teor de aminoácido reduzido e um teor de DHA melhorado, as cepas foram selecionadas a partir do Exemplo 2, as condições do meio de cultura foram otimizadas.

[0083] Especificamente, com base no meio de cultura MJW01 usado no Exemplo 2-2, para aumentar o teor de fontes de nitrogênio no meio de cultura e reduzir os custos de produção, a concentração de extrato de levedura como uma fonte de nitrogênio orgânico foi diminuída, (NH4)2SO4 como uma fonte de nitrogênio inorgânico foi adicionado, e a concentração de NaNO3 foi aumentada para converter o meio de cultura MJW01 em um meio de cultura MJW02 (30 g/l de glicose, 5,0 g/l de MgSO4⋅7H2O, 3 g/l de Na2SO4, 0,5 g/l de NaCl, 1,0 g/l de extrato de levedura, 1,0 g/l de MSG⋅1H2O, 8,0 g/l de NaNO3, 3,0 g/l de (NH4)2SO4, 0,1 g/l de KH2PO4, 0,5 g/l de K2HPO4, 0,1 g/l de CaCl2 e 10 ml/l de solução mista de vitaminas).

[0084] Para comparar as condições do meio de cultura MJW01 com as condições do meio de cultura MJW02, as cepas CJM01 foram respectivamente cultivadas nos meios de cultura acima. Como resultado, conforme mostrado na Tabela 5 abaixo, a quantidade de corpos de fungos diminuiu conforme a concentração de extrato de levedura diminuiu, mas o tempo de cultivo foi significativamente reduzido com um aumento de uma fonte de nitrogênio inorgânico. Consequentemente, foi constatado que o teor de DHA no meio de cultura MJW02 é igual ou superior ao teor de DHA no meio de cultura MJW01,

24 / 24 e a produtividade de DHA no meio de cultura MJW02 foi aumentada em 1,13 vezes em relação à produtividade de DHA no meio de cultura MJW01. TABELA 5 TEOR E PRODUTIVIDADE DE ÁCIDO DOCOSA-HEXAENOICO (DHA)

DE ACORDO COM CONDIÇÕES DE MEIO DE CULTURA Condições de Tempo Biomassa DHA Lipídio Produtividade meio de cultura (h) g/l (%/Biomassa) (%/TFA) % (g/l/h) MJW01 59,3 133,4 26,0 42,6 61,0 0,584 MJW02 52,1 124,3 27,7 49,0 56,6 0,661

[0085] Conforme descrito acima, aqueles versados na técnica serão capazes de compreender que a presente revelação pode ser facilmente executada em outras formas detalhadas sem alterar o espírito técnico ou um recurso essencial da mesma. Portanto, deve ser entendido que as modalidades acima mencionadas são ilustrativas em todos os aspectos e não são restritas. O escopo da presente revelação é representado por reivindicações a serem descritas abaixo em vez da descrição detalhada, e deve ser interpretado que o significado e escopo das reivindicações e todas as mudanças ou formas modificadas derivadas de seus equivalentes estão dentro do escopo da presente revelação.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Microalgas CJM01 (número de depósito: KCTC 13538BP) do gênero Thraustochytrium, caracterizadas por aumentar a produção de ácido docosa-hexaenoico (DHA) e diminuir a produção de aminoácidos em comparação as microalgas selvagens.

2. Microalgas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por as microalgas CJM01 de gênero Thraustochytrium incluírem ácido docosa- hexaenoico em uma quantidade de 40% em peso a 60% em peso com base em um peso total de ácidos graxos.

3. Microalgas, de acordo com a reivindicação 1, caracterizadas por as microalgas CJM01 de gênero Thraustochytrium terem uma produtividade de ácido docosa-hexaenoico de 0,5 a 0,7 g/l/h.

4. Método de produção de uma biomassa caracterizado por compreender: cultivar as microalgas CJM01 de gênero Thraustochytrium, de acordo com a reivindicação 1; e recuperar uma biomassa que contém ácido docosa-hexaenoico das microalgas, um produto cultivado das mesmas, um produto seco das mesmas ou um produto pulverizado das mesmas.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o cultivo ser realizado sob condições heterotróficas.

6. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o cultivo ser realizado com uso de um meio de cultura que inclui uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a fonte de carbono ser pelo menos uma selecionada a partir do grupo que consiste em glicose, frutose, maltose, galactose, manose, sacarose, arabinose, xilose e glicerol.

8. Método de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a fonte de nitrogênio ser i) uma fonte de nitrogênio orgânico selecionada a partir do grupo que consiste em um extrato de levedura, um extrato de carne bovina, peptona e triptona, ou ii) fonte de nitrogênio inorgânico selecionada a partir do grupo que consiste em acetato de amônio, nitrato de amônio, cloreto de amônio, sulfato de amônio, nitrato de sódio, ureia e glutamato monossódico (MSG).

9. Método de produção um bio-óleo caracterizado por compreender: cultivar as microalgas CJM01 de gênero Thraustochytrium, de acordo com a reivindicação 1; e recuperar um lipídio que contém ácido docosa- hexaenoico (DHA) das microalgas, um produto cultivado das mesmas, um produto seco das mesmas ou um produto pulverizado das mesmas.