BR112019012421A2 - Cultura, microrganismo eucariótico, métodos para fazer uma composição lipídica e para produzir uma biomassa rica em proteínas - Google Patents

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Abstract

microrganismos eucarióticos com um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (lcfas) são fornecidos neste documento. também são fornecidas composições e culturas compreendendo os microrganismos eucarióticos, bem como métodos de utilização dos microrganismos eucarióticos.

Description

CULTURA, MICRORGANISMO EUCARIÓTICO, MÉTODOS PARA FAZER UMA COMPOSIÇÃO LIPÍDICA E PARA PRODUZIR UMA BIOMASSA RICA EM PROTEÍNAS
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO [001] Os peixes constituem uma grande porção da proteína dietética e fornecem lipídios essenciais ômega-3 nas dietas humanas. O aumento da demanda está impulsionando o crescimento nos mercados de frutos do mar a uma taxa anual de 6%. A aquicultura é parte integrante deste mercado, já que a captura selvagem não pode mais satisfazer a demanda do consumidor. Historicamente, a farinha de peixe (proteína) e o óleo de peixe (ácidos graxos e ácidos graxos ômega-3 em particular) têm sido usados extensivamente. O crescimento da aquicultura requer que sejam desenvolvidas novas fontes sustentáveis de alimentos para a aquicultura, fornecendo carboidratos, proteínas e ácidos graxos ômega-3. Devido às limitações tecnológicas, microalgas têm sido usadas como micro-ingrediente para melhorar propriedades específicas, mas não como um macronutriente (proteína, gordura ou carboidrato). Assim, embora conhecido por ser adequado como um componente de alimentação, o uso de microalgas é atualmente limitado como um meio para abordar sustentabilidade.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [002] Microrganismos eucarióticos com um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs) são fornecidos neste documento. Composições e culturas compreendendo os microrganismos eucarióticos e o meio heterotrófico também são fornecidas. Também são fornecidos neste documento métodos para se fazer uma composição lipídica usando os microrganismos eucarióticos divulgados e métodos para se utilizar as composições lipídicas incorporando-as em produtos alimentícios. Também são fornecidos métodos de produção de biomassa rica em proteínas utilizando os microrganismos divulgados e, opcionalmente, incorporando a biomassa
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2/63 rica em proteínas em produtos alimentares.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [003] A Figura 1 é um gráfico que mostra a produção de biomassa e
TFA pela cepa G3-1 em meio líquido: meio basal (B) e de fermentação completa (FF).
[004] A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito da composição do meio no perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1: meio basal (B), de fermentação completa (FF).
[005] A Figura 3 é um gráfico que mostra o efeito dos tratamentos de TCA quente na eficiência da extração de proteínas (teor de proteína em %) na biomassa de G3-1 liofilizada de fase exponencial inicial (T16h e T22h) e estacionária (T139h e T189h).
[006] A Figura 4 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1 em diferentes composições de meio líquido. [007] A Figura 5 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1. As células foram cultivadas em fermentadores de 2E usando um meio basal selecionado.
[008] A Figura 6 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1. As células foram cultivadas em fermentadores de 2E usando um meio de fermentação completa modificado.
[009] A Figura 7 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1. As células foram cultivadas em fermentadores de 2 E utilizando metade da concentração de sulfato de amônio num meio de fermentação completa modificado.
[0010] A Figura 8 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1 em diferentes composições de meio líquido. [0011] A Figura 9 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1. As células foram cultivadas em um fermentador de 30E usando meio VU1.
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3/63 [0012] A Figura 10 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1. As células foram cultivadas em um fermentador de 30L usando meio VU2.
[0013] A Figura 11 é um gráfico que mostra o perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1. As células foram cultivadas em um fermentador de 2L usando meio VU3 e glicerol bruto como fonte de carbono. DESCRIÇÃO DETALHADA [0014] As microalgas são os principais produtores dos ecossistemas aquáticos e representam a origem dos nutrientes essenciais (por exemplo, proteínas e ácidos graxos ômega-3), que são metabolizados e/ou bioacumulados na cadeia alimentar aquática. Como tal, produtos com alto teor de proteínas e ácidos graxos poliinsaturados ômega-3 de cadeia longa (LCPUFA) derivados de microalgas têm um enorme potencial para atender de forma sustentável as demandas dietéticas do setor de rápido crescimento que é a aquicultura. Entre a grande variedade de microalgas, o uso de microalgas heterotróficas tem o maior potencial de fornecer insumos de alimentos para a aquicultura que estão livres das restrições de oferta e demanda de produtos vegetais e animais. A produção de microalgas heterotróficas requer significativamente menos terra e água, tem melhor economia de processo e é independente das condições ambientais (isto é, independente do clima). Por exemplo, a produtividade volumétrica de biomassa de microalgas heterotróficas pode ser duas ordens de magnitude maior do que a de microalgas fotos sintéticas. O uso de microalgas heterotróficas também oferece a oportunidade de alavancar fontes de carbono não-alimentares baratas e abundantes, convertendo-as diretamente em produtos de alto valor por meio da fermentação. Tais processos de produção também podem ser mais facilmente ampliados, como seria necessário para um produto de alimentação de aquicultura.
[0015] Microrganismos eucarióticos com um perfil lipídico simples
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4/63 compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs) são fornecidos neste documento. Microrganismos, incluindo os Traustoquitrídios, produzem uma variedade de lipídios, incluindo ácidos graxos em várias formas e quantidades. Tal como utilizado neste documento, o termo lipídio inclui fosfolipídios, ácidos graxos livres, ésteres de ácidos graxos, triglicerídeos, esteróis e ésteres de esteróis, carotenoides, xantofilas (por exemplo, oxicarotenoides), hidrocarbonetos, e outros lipídios conhecidos por uma pessoa ordinariamente versada na técnica. Os ácidos graxos são cadeias de hidrocarbonetos que terminam em um grupo carboxil, sendo denominados insaturados se contiverem pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono, e poliinsaturados quando contêm múltiplas ligações duplas carbono-carbono. Por exemplo, microrganismos podem produzir (i) ácidos graxos de cadeia curta (SCFA), que são ácidos graxos com caudas alifáticas de menos de seis carbonos (por exemplo, ácido butírico); (ii) ácidos graxos de cadeia média (MCFA), que são ácidos graxos com caudas alifáticas de 6 a 12 carbonos; (iii) ácidos graxos de cadeia longa (LCFA), que são ácidos graxos com cauda alifática de 13 a 21 carbonos; e ácidos graxos de cadeia muito longa (VLCFA), que são ácidos graxos com caudas alifáticas com mais de 22 carbonos. Vários microrganismos produzem vários tipos e quantidades desses ácidos graxos. Os tipos e quantidades específicos de ácidos graxos são referidos coletivamente neste documento como o perfil lipídico do microrganismo. Assim, tal como utilizado neste documento, o termo “perfil lipídico” refere-se aos tipos de lipídios e quantidades de lipídios produzidos num microrganismo.
[0016] Como utilizado neste documento, um “perfil lipídico simples” refere-se a um microrganismo tendo 95% ou mais dos triglicerídeos no microrganismo sendo constituído por 1, 2, 3 ou 4 dos principais ácidos graxos de cadeia longa. Opcionalmente, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos triglicerídeos no microrganismo compreendem 1, 2, 3 ou 4 dos principais
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5/63 ácidos graxos de cadeia longa. Opcionalmente, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos triglicerídeos no microrganismo compreendem miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6) e ácido docosa-hexaenoico (C22:6n-3, DHA). Como utilizado neste documento, um triglicerídeo refere-se a uma molécula composta por três ácidos graxos covalentemente ligados a uma molécula de glicerídeo. Assim, a fração de triglicerídeos dos ácidos graxos totais no microrganismo pode ser composta de 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6) e ácido docosa-hexaenoico (C22:6n-3, DHA).
[0017] Os ácidos graxos de cadeia longa (LCFA) incluem, mas não estão limitados a, miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6), ácido docosa-hexaenoico (C22: 6n-3, DHA), ácido láurico (Cl2:0), ácido pentadecílico (Cl5:0), ácido palmitoleico (C16:l), ácido margárico (C17:0), ácido esteárico (C18:0), ácido vacênico (C18:ln-7), ácido oleico (C18:ln-9), ácido γ-linolênico (C18:3n-6), ácido α-linolênico (C18:3n-3), ácido estearidônico (C18:4), ácido araquídico (C20:0), ácido di-homo-y-linolênico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n6, ARA), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3, EPA),ácido beênico (C22:0), ácido docosatetraenoico (C22:4), ácido docosapentaenoico n3 (C22:5n-3, DPAn3), e ácido lignocérico (C24:0). Opcionalmente, os quatro LCFA principais compreendem miristato, ácido palmítico, DPA e DHA.
[0018] Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende mais de 3% de cada um dentre miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6), e ácido docosaexanoico (C22:6n3, DHA). Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende triglicerídeos e 95% dos triglicerídeos são compostos por miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6) e ácido docosahexaenoico. (C22:6n-3, DHA). Opcionalmente, o perfil lipídico
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6/63 simples compreende menos de 3% de cada um dentre ácido láurico (C12:0), ácido pentadecílico (C15:0), ácido palmitoleico (C16:l), ácido margárico (C17:0), ácido esteárico (C18:0), ácido vacênico (C18:ln-7), ácido oleico (C18:ln-9), ácido γ-linolênico (C18:3n-6), ácido α-linolênico (C18:3n-3), ácido estearidônico (Cl8:4), ácido araquídico (C20:0), ácido di-homo-γlinolênico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n-6, ARA), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3, EPA),ácido beênico (C22:0), ácido docosatetraenoico (C22:4), ácido docosapentaenoico n3 (C22:5n-3, DPAn3), e ácido lignocérico (C24:0).
[0019] Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende menos de 0,02% de ácidos graxos de cadeia curta. Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende pelo menos 35% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende 35-40%, 35-45%, 35-50%, 40-45%, 40-50%, ou 50%-60% de DHA nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Dito de outra forma, na fração triglicerídica dos ácidos graxos totais no microrganismo, os triglicerídeos podem compreender 35-40%, 35-45%, 35-50%, 40-45%, 40-50% ou 50% 60% de DHA.
[0020] Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz uma biomassa de pelo menos 20% de proteína, pelo menos 40% de proteína, ou pelo menos 20-40% de proteína.
[0021] Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz pelo menos cerca de 10% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz pelo menos 30% de ácido palmítico nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz pelo menos 40% de ácido palmítico nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz um ou mais carotenoides. Opcionalmente, o um ou mais carotenoides compreende β-caroteno. Opcionalmente, o β-caroteno compõe
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7/63 pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos carotenoides produzidos no microrganismo.
[0022] São divulgados microrganismos eucarióticos que produzem lipídios, em que o microrganismo eucariótico tem um perfil lipídico simples. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produtor de lipídios tem uma sequência 18S com pelo menos 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO:1. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico possui o N° de Acesso ID AC 220716-01, que foi depositado junto ao International Depositary Authority of Canada (IDAC), National Microbiology Laboratory, Public Health Agency of Canada, 1015 Arlington Street, Winnipeg, Manitoba, R3E 3R2, Canadá, em 22 de julho de 2016, e recebeu o N° de Acesso 220716-01. Este depósito será mantido sob os termos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para Fins do Procedimento de Patentes. Este depósito tem caráter de exemplo e foi feito meramente como uma conveniência para os versados na técnica e não é uma admissão de que é necessário um depósito para patenteabilidade (por exemplo, sob 35 U.S.C. §112). Os termos G3-1 ou cepa G3-1 ou cepa G3-1 são utilizados indistintamente neste documento para se referir ao microrganismo eucariótico depositado no IDAC e de N° de Acesso IDAC 220716-01.
[0023] Os microrganismos fornecidos têm características distintivas em relação aos microrganismos de tipo selvagem em seu ambiente natural. Microrganismos de tipo selvagem podem ser encontrados em ambientes aquáticos naturais que se estendem de ambientes oceânicos a lagos e rios de água doce, e também incluem ambientes salgados, como estuários e fozes de rios. Tais ambientes não são considerados englobados pelo termo meio heterotrófico. Os microrganismos fornecidos produzem, em meio heterotrófico, diferentes quantidades de um ou mais lipídios e/ou teor de proteína em relação aos microrganismos em seu ambiente natural.
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8/63 [0024] Ácido nucleico, tal como utilizado neste documento, refere-se a desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos e polímeros e complementos destes. O termo inclui desoxirribonucleotídeos ou ribonucleotídeos na forma de fita simples ou dupla. O termo engloba ácidos nucleicos contendo análogos de nucleotídeos ou resíduos ou resíduos ou ligações de estrutura modificados que são sintéticos, são de ocorrência natural e de ocorrência não natural, que têm propriedades de ligação similares ao ácido nucleico de referência e que são metabolizados de um modo semelhantes aos nucleotídeos de referência. Exemplos de tais análogos incluem, mas não se limitam a, fosforotioatos, fosforamidatos, fosfonatos de metil, fosfonatos de metil quirais, 2-O-metilribonucleotídeos, ácidos nucleicos peptídicos (PNAs). Salvo indicação em contrário, variantes modificadas conservativamente de sequências de ácido nucleico (por exemplo, substituições de códon degenerado) e sequências complementares podem ser utilizadas em vez de uma sequência de ácido nucleico particular citada neste documento. Especificamente, substituições de códon degenerado podem ser alcançadas por meio da geração de sequências em que a terceira posição de um ou mais códons selecionados (ou todos) é substituída por resíduos de base mista e/ou desoxi-inosina (Batzer et al, Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al, J. Biol. Chem. 260:26052608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)). O termo ácido nucleico é utilizado intercambiavelmente com gene, cDNA, mRNA, oligonucleotideo e polinucleotideo.
[0025] Os termos idêntico ou identidade percentual, no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências de polipeptídeos, referem-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm um percentual especificado de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos que são iguais (ou seja, com cerca de 60% de identidade, preferivelmente, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade ao longo de uma região especificada, quando comparadas e
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9/63 alinhadas para correspondência máxima em uma região designada ou em uma janela de comparação), conforme medido utilizando algoritmos de comparação de sequência BLAST ou BLAST 2.0 com parâmetros padrão descritos abaixo, ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, o site NCBI ou similares). Diz-se então que estas sequências são substancialmente idênticas. Esta definição também se refere ou pode ser aplicada ao cumprimento de uma sequência de teste. A definição também inclui sequências que possuem eliminações e/ou adições, bem como aquelas que têm substituições. Como descrito abaixo, os algoritmos preferidos podem ser responsáveis por intervalos e semelhantes. Preferivelmente, existe identidade em relação a uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento ou, mais preferivelmente, em relação a uma região que tem 50-100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento.
[0026] Para comparação de sequências, tipicamente uma sequência atua como uma sequência de referência, com a qual as sequências de teste são comparadas. Ao usar um algoritmo de comparação de sequência, o teste e as sequências de referência são inseridos em um computador, coordenadas de subsequência são designadas, se necessário, e os parâmetros do programa de algoritmo da sequência são projetados. Preferencialmente, parâmetros de programa padrão podem ser usados, ou parâmetros alternativos podem ser designados. O algoritmo de comparação de sequência então calcula o percentual de identidades de sequência para a sequência de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa.
[0027] Uma janela de comparação, como usado neste documento, inclui referência a um segmento de qualquer uma da série de posições contíguas selecionadas do grupo consistindo de 20 a 600, geralmente cerca de 50 a cerca de 200, mais habitualmente cerca de 100 a cerca de 150 em que uma sequência pode ser comparada com uma sequência referência com o
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10/63 mesmo número de posições contíguas após as duas sequências serem alinhadas de forma ideal. Métodos de alinhamento de sequências para comparação são bem conhecidos na técnica. O alinhamento ideal de sequências para a comparação pode ser realizado, por exemplo, pelo algoritmo de homologia local de Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981); pelo algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970); pela busca por método por similaridade de Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sei. EUA 85: 2444 (1988); por implementações computadorizadas destes algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA em Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) ou por alinhamento manual e inspeção visual (ver, por exemplo, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., suplemento de 1995)).
[0028] Um exemplo preferido de algoritmo que é adequado para determinar a identidade de sequência percentual e a similaridade de sequência são os algoritmos BLAST e BLAST 2.0, que são descritos em Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977), e Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), respectivamente. BLAST e BLAST 2.0 são utilizados, com os parâmetros descritos neste documento, para determinar o percentual de identidade de sequência de ácidos nucleicos ou proteínas. O programa para a realização de análises por BLAST está disponível publicamente por meio do National Center for Biotechnology Information, como conhecido na técnica. Este algoritmo envolve primeiramente a identificação de pares de sequência de alta semelhança (HSPs) por meio da identificação de palavras curtas de um comprimento selecionado (W) na sequência de consulta, que correspondem ou satisfazem alguma pontuação T com limite de valor positivo quando alinhadas com uma palavra do mesmo comprimento em uma sequência da base de dados. T é referido como o limite de pontuação de palavras próximas (Altschul et al.). Estes resultados iniciais de palavras próximas atuam como
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11/63 sementes para iniciar buscas para encontrar HSPs mais longos que os contenham. Os resultados de palavras são então estendidos em ambas as direções ao longo de cada sequência na medida em que a pontuação de alinhamento cumulativa pode ser aumentada. As pontuações cumulativas são calculadas usando, para sequências de nucleotídeos, os parâmetros M (pontuação de recompensa para um par de resíduos de correspondência; sempre > 0) e N (pontuação de penalidade para resíduos de desalinhamento; sempre < 0). Para sequências de aminoácidos, uma matriz de pontuação é usada para calcular a pontuação cumulativa. A extensão de resultados de palavra em cada direção é interrompida quando: a pontuação de alinhamento cumulativa cai pela quantidade X de seu valor máximo alcançado; a pontuação cumulativa vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de pontuação negativa; ou a extremidade de qualquer sequência é alcançada. Os parâmetros de algoritmo de BLAST W, T e X determinam a sensibilidade e a velocidade do alinhamento. O valor de Expectativa (E) representa o número de alinhamentos diferentes com pontuações equivalentes ou melhores do que o esperado em uma pesquisa de banco de dados por sorteio. O programa BLASTN (para sequências nucleotídicas) usa como padrão um comprimento de palavra (W) de 11, uma expectativa (E) de 10, M = 5, N = -4 e uma comparação de ambas as fitas. Para sequências de aminoácidos, o programa BLASTP usa como padrão um comprimento de palavra de 3, e expectativa (E) de 10, e a matriz de pontuação BLOSUM62 (consulte Henikoff e Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:10915, 1989)) alinhamentos (B) de 50, expectativa (E) de 10, M=5, N=-4 e uma comparação de ambas as fitas.
[0029] O termo polipeptídeo, tal como utilizado neste documento, tem geralmente o seu significado reconhecido na técnica de um polímero de pelo menos três aminoácidos e pretende incluir peptídeos e proteínas. No entanto, o termo é também utilizado para se referir classes funcionais específicas de
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polipeptídeos, tais como, por exemplo, dessaturases, elongases, etc. Para cada uma dessas classes, a presente divulgação fornece vários exemplos de sequências conhecidas desses polipetídeos. Aqueles versados na técnica apreciarão, no entanto, que o termo polipeptídeo destina-se a ser suficientemente geral de modo a abranger não apenas os polipeptídeos tendo a sequência completa relatada neste documento (ou em uma referência ou base de dados especificamente mencionados neste documento), mas também abranger os polipeptídeos que representam fragmentos funcionais (isto é, fragmentos que retêm pelo menos uma atividade) desses polipeptídeos completos. Além disso, aqueles versados na técnica entendem que as sequências de proteína geralmente toleram alguma substituição sem que seja destruída a atividade. Assim, qualquer polipeptídeo que retém atividade e compartilha pelo menos cerca de 30-40% de identidade de sequência geral, muitas vezes mais que cerca de 50%, 60%, 70% ou 80%, e ainda inclui geralmente pelo menos uma região de identidade bem maior, muitas vezes maior que 90% ou mesmo 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% em uma ou mais regiões altamente conservadas, geralmente abrangendo pelo menos 3-4 e muitas vezes até 20 ou mais aminoácidos, com outro polipeptídeo da mesma classe, é abrangido dentro do termo polipeptídeo relevante conforme usado neste documento. Aqueles versados na técnica podem determinar outras regiões de similaridade e/ou identidade por análise das sequências de vários polipeptídeos descritos neste documento. Como é conhecido pelos versados na técnica, são conhecidas várias estratégias e estão disponíveis ferramentas para realizar comparações de sequências de aminoácidos ou de nucleotídeos de modo a avaliar graus de identidade e/ou semelhança. Estas estratégias incluem, por exemplo, alinhamento manual, alinhamento de sequência assistido por computador e combinações dos mesmos. Um certo número de algoritmos (que são geralmente implementados por computador) para realizar o alinhamento de sequências estão amplamente disponíveis, ou podem ser
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13/63 produzidos por um especialista na técnica. Algoritmos representativos incluem, por exemplo, o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2: 482); o algoritmo de alinhamento por homologia de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol., 1970, 48: 443); a busca pelo método de similaridade de Pearson and Lipman (Proc. Natl. Acad. Sei. (EUA), 1988, 85: 2444); e/ou por implementações computadorizadas desses algoritmos (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA no Wisconsin Genetics Software Package, versão 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wisconsin). Os programas de computador disponíveis, incluindo esses algoritmos, incluem, por exemplo, BLASTN, BLASTP, Gapped BLAST, PILEUP, CLUSTALW, etc. Ao utilizar os programas BLAST e Gapped BLAST, os parâmetros padrão dos respectivos programas podem ser usados. Altemativamente, o profissional pode usar parâmetros não padrão, dependendo de seus requisitos experimentais e/ou outros (ver, por exemplo, o site de URL www.ncbi.nlm.nih.gov).
[0030] Os microrganismos eucarióticos fornecidos podem ser cultivados em meio heterotrófico. Assim, microrganismos eucarióticos que possuem, em um meio heterotrófico, um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs) são fornecidos neste documento. Também são fornecidas culturas compreendendo o microrganismo eucariótico produtor de lipídios com uma sequência 18S, em que a sequência 18S tem pelo menos 98% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO:1, e o meio heterotrófico que tem por resultado que o microrganismo eucariótico produtor de lipídios tenha um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs). Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende mais de 3% de cada um dentre ácido mirístico (Cl 4:0), ácido palmítico (Cl 6:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6), e ácido docosaexanoico (C22:6n3, DHA). Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende menos de 3%
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14/63 de cada um dentre ácido láurico (C12:0), ácido pentadecílico (C15:0), ácido palmitoleico (C16:l), ácido margárico (C17:0), ácido vacênico (C18:ln-ll), ácido oleico (C18:ln-9), ácido γ-linolênico (C18:3n-6), ácido a-linolênico (C18:3n-3), ácido estearidônico (Cl8:4), ácido araquídico (C20:0), ácido dihomo-y-linolênico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n-6, ARA), (C20:3n-3), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3, EPA),ácido beênico (C22:0), ácido docosatetraenoico (C22:4), ácido docosapentaenoico n-3 (C22:5n-3, DPAn3), e ácido lignocérico (C24:0). Opcionalmente, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos triglicerídeos no microrganismo compreendem miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAn6) e ácido docosa-hexaenoico (C22:6n-3, DHA). Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende menos de 0,02% de ácidos graxos de cadeia curta. Opcionalmente, o perfil lipídico simples compreende pelo menos 35% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 20% de proteína em toda a biomassa de algas. Opcionalmente, o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 20 a 40% de proteína da biomassa. Opcionalmente, o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos cerca de 40% de proteína. Opcionalmente, o meio heterotrófico também resulta na produção de pelo menos cerca de 10% de C22:6n-3 (DHA). Opcionalmente, o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 30% de ácido palmítico. Opcionalmente, o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 40% de ácido palmítico. Opcionalmente, o meio heterotrófico resulta na produção de um ou mais carotenoides. Opcionalmente, os um ou mais carotenoides compreendem β-caroteno, e em que o β-caroteno compõe pelo menos 95% do total de carotenoides. Opcionalmente, o β-caroteno compõe pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos carotenoides produzidos no microrganismo.
[0031] Os microrganismos fornecidos produzem mais de 50% de
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DHA em fermentadores pequenos. Opcionalmente, os microrganismos fornecidos produzem mais de 50% de DHA em fermentadores de 2 litros (L) ou 5 litros (L). Opcionalmente, a produtividade de biomassa do microrganismo é de 0,5 a 0,8 g/l/h em fermentadores pequenos, por exemplo, fermentadores de 2L ou 5L. Opcionalmente, a produtividade total de ácidos graxos do microrganismo é de 0,3 a 0,6 g/l/h em fermentadores pequenos, por exemplo, fermentadores de 2L ou 5L. Opcionalmente, a produtividade de DHA do microrganismo é de 0,1 a 0,4 g/l/h em fermentadores pequenos, por exemplo, fermentadores de 2L ou 5L. Opcionalmente, a produtividade de C:16 do microrganismo é de 0,1 a 0,3 g/l/h em fermentadores pequenos, por exemplo, fermentadores de 2L ou 5L.
[0032] O meio heterotrófico provê vários componentes nutricionais, incluindo uma fonte de carbono e uma fonte de nitrogênio, para o microrganismo. O meio para cultura pode incluir qualquer uma dentre uma variedade de fontes de carbono. Exemplos de fontes de carbono incluem ácidos graxos, lipídios, gliceróis, triacilgliceróis, carboidratos, polióis, açúcares aminados, e qualquer tipo de biomassa ou fluxo de resíduos. Os ácidos graxos incluem, por exemplo, ácido oleico. Os hidratos de carbono incluem, mas não estão limitados a, glicose, celulose, hemicelulose, a frutose, dextrose, xilose, lactulose, galactose, maltotriose, maltose, lactose, glicogênio, gelatina, amido (milho ou trigo), acetato, m-inositol (por exemplo, derivado de licor de milho), ácido galacturônico (por exemplo, derivado de pectina), L-fucose (por exemplo, derivado de galactose), gentiobiose, glucosamina, alfa-D-glicose-1-fosfato (por exemplo, derivados de glicose), celobiose, dextrina, alfa-ciclodextrina (por exemplo, derivado de amido), e a sacarose (por exemplo, a partir de melaço). Os polióis incluem, mas não estão limitados a, maltitol, eritritol e adonitol. Açúcares amino incluem, mas não estão limitados a, N-acetil-D-galactosamina, N-acetil-D-glucosamina e Nacetil-beta-D-manosamina. Opcionalmente, a fonte de carbono está presente
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16/63 no meio heterotrófico a uma concentração inferior a 60 g/L. Opcionalmente, a fonte de carbono está presente no meio heterotrófico a uma concentração de 1 a 60 g/L. Opcionalmente, a fonte de carbono está presente no meio heterotrófico a uma concentração de 5 a 60 g/L. Opcionalmente, a fonte de carbono está presente no meio heterotrófico a uma concentração de 20 a 40 g/L.
[0033] Opcionalmente, os microrganismos podem ser cultivados em meio com uma concentração de cloreto de cerca de 0,5 g/L a cerca de 50,0 g ZL. Opcionalmente, microrganismos são cultivados em meio com uma concentração de cloreto de cerca de 0,5 g/L a cerca de 35 g/L (por exemplo, de cerca de 18 g/L a cerca de 35 g/L). Opcionalmente, os microrganismos são cultivados num meio com uma concentração de cloreto de cerca de 2 g/L a cerca de 35 g/L. Opcionalmente, os microrganismos descritos neste documento podem ser cultivados em condições de baixo teor de cloreto. Por exemplo, os microrganismos podem ser cultivados num meio que tem uma concentração de cloreto de cerca de 0,5 g/L a cerca de 20 g/L (por exemplo, de cerca de 0,5 g/L a cerca de 15 g/L). O meio de cultura inclui opcionalmente NaCl. O meio de cultura pode incluir sais de sódio que não contêm cloreto como fonte de sódio. Os exemplos de sais de sódio sem cloreto adequados para uso, de acordo com os presentes métodos, incluem, entre outros, carbonato de sódio (uma mistura de carbonato de sódio e óxido de sódio), carbonato de sódio, bicarbonato de sódio, sulfato de sódio e suas misturas. Ver, por exemplo, as Patentes U.S. Nos 5,340,742 e 6,607,900, o conteúdo integral de cada uma incorporado a este documento por referência. Opcionalmente, o meio compreende 9 g/L de cloreto quando se utiliza 20 g/1 de carbono, 20 g/1 de peptona de soja e 5 g/1 de extrato de levedura. Opcionalmente, o meio compreende 35 g/1 de cloreto quando o meio contém 10 g/1 de carbono, 5 g/1 de peptona de soja, 5 g/1 de extrato de levedura e 10 g/1 de ágar. Opcionalmente, o meio compreende 2 g/L de cloreto quando o
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17/63 meio contém 20-40 g/L de carbono, 1 g/L de extrato de levedura, 1-20 g/L de glutamato monossódico (MSG), 0,3-2,0 g/L de fosfatos, 4 g/L de sulfato de magnésio, 5-10 g/L de sulfato de amônio, 1,5 mL/L de solução de oligoelementos, 1 mL/L de solução de vitamina B, 0,1 g/L de CaCL.
[0034] O meio para uma cultura de traustoquitrídios pode incluir qualquer uma dentre uma variedade de fontes de nitrogênio. Fontes de nitrogênio exemplares incluem soluções de amônio (por exemplo, NH4 in H2O), sais de amônio ou amina (por exemplo, (NH^SCU, (NHriaPCU, NH4NO3, NH4OOCH2CH3 (NH4AC)), peptona, triptona, extrato de levedura, extrato de malte, farinha de peixe, glutamato de sódio, extrato de soja, ácidos casaminos e grãos de destilação. Concentrações de fontes de nitrogênio em meio adequado tipicamente variam entre, e incluindo, cerca de 1 g/L e cerca de 25 g/L. Opcionalmente, a concentração de nitrogênio no meio é de cerca de 5 a 20 g/1. Opcionalmente, a concentração de nitrogênio no meio é de cerca de 10 a 15 g/1. Opcionalmente, a concentração de nitrogênio no meio é de cerca de 20 g/L. Opcionalmente, a concentração de nitrogênio é de cerca de 10 a 15 g/L quando o extrato de levedura é a fonte de nitrogênio complexo no meio. Opcionalmente, a concentração de nitrogênio é de cerca de 1 a 5 g/L quando a peptona de soja está no meio, juntamente com o hidrato de sal monossódico de ácido L-glutâmico (MSG) ou sulfato de amônio.
[0035] O meio inclui opcionalmente um fosfato, tal como fosfato de potássio ou fosfato de sódio. Opcionalmente, a cultura ou meio heterotrófico compreende fosfato de potássio monobásico.
[0036] Os sais inorgânicos e micro nutrientes no meio podem incluir sulfato de amônio, bicarbonato de sódio, ortovanadato de sódio, cromato de potássio, molibdato de sódio, ácido selenoso, sulfato de níquel, sulfato de cobre, sulfato de zinco, cloreto de cobalto, cloreto de ferro, cloreto de cálcio, cloreto de manganês, e EDTA. Opcionalmente, o meio inclui pelo menos 1,5 ml/L de uma solução de oligoelementos. Opcionalmente, a solução de
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18/63 oligoelementos compreende 2 mg/mL de sulfato de cobre (II) penta-hidratado, 2 mg/mL de sulfato de zinco hepta-hidratado, 1 mg/mL de cloreto de cobalto (II) hexa-hidratado, 1 mg/mL de cloreto de manganês (II) tetra-hidratado, 1 mg/mL de di-hidrato de molibdato de sódio, 1 mg/mL de sulfato de níquel (II).
[0037] Opcionalmente, o meio inclui sulfato de magnésio. Opcionalmente, a cultura ou meio heterotrófico compreende sulfato de magnésio, solução de oligoelementos e fosfato de potássio monobásico.
[0038] Vitaminas tais como hidrocloreto de piridoxina, hidrocloreto de tiamina, pantotenato de cálcio, ácido p-aminobenzoico, riboflavina, ácido nicotínico, biotina, ácido fólico e vitamina B12 podem ser incluídas.
[0039] O pH do meio pode ser ajustado para estar entre e incluir 3,0 e 10,0 com o uso de ácido ou base, se necessário, e/ou uso da fonte de nitrogênio. Opcionalmente, o meio pode ser esterilizado.
[0040] Opcionalmente, o meio compreende hidrato de sal monossódico de ácido L-glutâmico ou glutamato monossódico (MSG). Opcionalmente, o meio compreende 1-20 g/L de MSG. Opcionalmente, o meio compreende 1 g/L de MSG quando o meio compreende pelo menos 1 g/L de extrato de levedura, 40 g/L de carbono, 0,3 g/L de KH2PO4, 4 g/L de sulfato de magnésio e 1,5 mL/L de solução de oligoelementos. Opcionalmente, o meio compreende 20 g/L de MSG quando o meio compreende 5-15 g/L de extrato de levedura, 0-10 g/L de sulfato de amônio, 20-40 g/L de carbono, 2 g/L de cloreto, 4 g/L de sulfato de magnésio, 1,5 mL/L de solução de oligoelementos, 0,3-2,0 g/L de fosfatos, 1 mL/L de solução de vitaminas e 0,1 g/L de CaCL.
[0041] Geralmente um meio utilizado para a cultura de um microrganismo é um meio líquido. No entanto, o meio utilizado para a cultura de um microrganismo pode ser um meio sólido. Além das fontes de carbono e de nitrogênio, tal como discutido neste documento, um meio sólido pode
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19/63 conter um ou mais componentes (por exemplo, ágar e/ou agarose) que proporcionem suporte estrutural e/ou permitam que o meio esteja em forma sólida.
[0042] O cultivo dos microrganismos pode ser realizado utilizando condições conhecidas, por exemplo, as descritas nas Publicações Internacionais Nos WO 2007/069078 e WO 2008/129358. Por exemplo, o cultivo pode ser realizado durante 1 a 30 dias, 1 a 21 dias, 1 a 15 dias, 1 a 12 dias, 1 a 9 dias ou 3 a 5 dias. Opcionalmente, o cultivo é realizado a temperaturas entre 4 a 30° C. Opcionalmente, a cultura é realizada por cultura com agitação e aeração, cultura com agitação, cultura estacionária, cultura descontínua, cultura contínua, cultura descontínua de rotação, cultura com oscilação ou similares. Opcionalmente, o cultivo é realizado com um teor de oxigênio dissolvido do meio de cultura entre 1 e 20%, entre 1 e 10%, ou entre 1 e 5%.
[0043] São fornecidos neste documento métodos de produção de uma composição lipídica. Os métodos incluem a cultura dos microrganismos eucarióticos produtores de lipídios, fornecidos num meio heterotrófico, para produzir um perfil lipídico simples e isolar a composição lipídica. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produtor de lipídios tem uma sequência 18S, em que a sequência 18S tem pelo menos 98% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1, e o meio heterotrófico tem por resultado que o microrganismo eucariótico produtor de lipídios tenha um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs). Opcionalmente, o meio heterotrófico contém menos que 3,75 g/L de cloreto. Opcionalmente, a produtividade de biomassa dos microrganismos cultivados é superior a 0,65 g/L/h. Opcionalmente, a produtividade de triglicerídeos dos microrganismos cultivados é superior a 0,3 g/L/h. Opcionalmente, o meio heterotrófico contém menos de 3,75 g/L de cloreto e a produtividade de biomassa dos microrganismos cultivados é superior a 0,65
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20/63 g/L/h e a produtividade de triglicerídeos dos microrganismos cultivados é superior a 0,3 g/L/h. Opcionalmente, o perfil lipidico simples do microrganismo utilizado nos métodos de produção de uma composição lipídica compreende mais de 3% de cada um dentre miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n -6, DPAn6) e ácido docosa-hexaenoico (C22:6n-3, DHA). Opcionalmente, o perfil lipidico simples compreende menos de 3% de cada um dentre ácido láurico (C12:0), ácido pentadecílico (C15:0), ácido palmitoleico (C16:l), ácido margárico (C17:0), ácido esteárico (C18:0), ácido vacênico (C18:ln-7), ácido oleico (C18:ln-9), ácido γ-linolênico (C18:3n-6), ácido α-linolênico (C18:3n-3), ácido estearidônico (Cl8:4), ácido araquídico (C20:0), ácido di-homo-γlinolênico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n-6, ARA), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3, EPA),ácido beênico (C22:0), ácido docosatetraenoico (C22:4), ácido docosapentaenoico n3 (C22:5n-3, DPAn3), e ácido lignocérico (C24:0).
[0044] Opcionalmente, o perfil lipidico simples do microrganismo utilizado nos métodos de produção de uma composição lipídica compreende menos de 0,02% de ácidos graxos de cadeia curta. Opcionalmente, o perfil lipidico simples compreende pelo menos 35% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o perfil lipidico simples compreende 35-40%, 35-45%, 35-50%, 40-45%, 40-50% ou 50-60% de DHA nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico como descrito neste documento produz uma biomassa de pelo menos 20% de proteína. Opcionalmente, a biomassa é pelo menos 20 a 40% de proteína. Opcionalmente, a biomassa é pelo menos cerca de 40% de proteína. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico como descrito neste documento produz pelo menos cerca de 10% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico utilizado de acordo com os métodos divulgados
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21/63 produz pelo menos 30%, pelo menos 40%, ou pelo menos 30-40% de ácido palmítico nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
[0045] Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz um ou mais carotenoides. Opcionalmente, o um ou mais carotenoides compreende βcaroteno. Opcionalmente, o β-caroteno compõe pelo menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% dos carotenoides produzidos no microrganismo.
[0046] São também fornecidos métodos de produção de uma biomassa rica em proteínas compreendendo cultivar os microrganismos eucarióticos produtores de lipídios fornecidos em um meio heterotrófico e isolar a biomassa rica em proteínas. Opcionalmente, o método compreende ainda incorporar a biomassa rica em proteína num produto alimentício. Opcionalmente, o produto alimentício é alimento para animais de estimação, ração para gado ou ração para aquicultura. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico tal como utilizado nos presentes métodos produz uma biomassa de pelo menos cerca de 20% de proteína, pelo menos cerca de 40%, ou pelo menos cerca de 20 a 40% de proteína. Opcionalmente, o microrganismo eucariótico produz pelo menos cerca de 10% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
[0047] Opcionalmente, os lipídios produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento podem ser incorporados em um produto final (por exemplo, um alimento ou suplemento alimentar, uma fórmula infantil, um produto farmacêutico, um combustível e similares). Assim, é fornecido um método de utilização da composição lipídica feita de acordo com os métodos descritos neste documento, em que o método de utilização compreende a incorporação da composição lipídica num produto alimentício.
[0048] Além disso, a biomassa rica em proteínas fornecida pode ser incorporada em um produto final (por exemplo, alimento ou suplemento alimentar, biocombustível, etc.). Assim, é fornecido um método de utilização da biomassa rica em proteínas compreendendo a incorporação da biomassa
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22/ 63 rica em proteínas num produto alimentício (por exemplo, um alimento para animais de estimação, uma ração para gado ou uma ração para aquicultura).
[0049] Suplementos alimentares ou de ração adequados nos quais os lipídios podem ser incorporados incluem bebidas como leite, água, bebidas esportivas, bebidas energéticas, chás e sucos; doces, como balas, geleias e biscoitos; alimentos e bebidas contendo gordura, tais como produtos lácteos; produtos alimentícios processados, tais como o arroz cremoso (ou mingau); fórmulas infantis; cereais matinais; ou similares. Opcionalmente, um ou mais lipídios produzidos podem ser incorporados em um suplemento dietético, como por exemplo, uma vitamina ou multivitamínico. Opcionalmente, um lipídio produzido de acordo com o método descrito neste documento pode ser incluído em um suplemento alimentar e, opcionalmente, pode ser diretamente incorporado num componente de alimento ou alimento (por exemplo, um suplemento alimentar).
[0050] Exemplos de alimentos em que os lipídios produzidos pelos métodos descritos neste documento podem ser incorporados incluem alimentos para animais, como alimentos para gatos; alimentos para cães; rações para peixes de aquário, peixes cultivados ou crustáceos, etc.; rações para animais criados em explorações pecuárias (incluindo gado e peixe ou crustáceos criados em aquicultura). O alimento ou ração em que os lipídios produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento podem ser incorporados é de preferência palatável para o organismo que é o beneficiário pretendido. Este alimento ou ração pode ter quaisquer propriedades físicas conhecidas atualmente para um material alimentar (por exemplo, sólido, líquido, macio).
[0051] Opcionalmente, um ou mais dos compostos produzidos (por exemplo, PUF A) podem ser incorporados em um produto nutracêutico ou farmacêutico. Exemplos de tais produtos nutracêuticos e farmacêuticos incluem vários tipos de comprimidos, cápsulas, agentes bebíveis, etc.
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Opcionalmente, o produto farmacêutico ou nutracêutico é adequado para aplicação tópica. As formas de dosagem podem incluir, por exemplo, cápsulas, óleos, grânulos, granulados, pós, comprimidos, pílulas, pastilhas ou similares.
[0052] Os lipídios ou óleos produzidos de acordo com os métodos descritos neste documento podem ser incorporados em produtos em combinação com qualquer um de uma variedade de outros agentes. Por exemplo, tais compostos podem ser combinados com um ou mais aglutinantes ou agentes de preenchimento, agentes quelantes, pigmentos, sais, surfactantes, hidratantes, modificadores de viscosidade, espessantes, emolientes, fragrâncias, conservantes, etc. ou qualquer combinação dos mesmos.
[0053] São divulgados materiais, composições e componentes que podem ser usados para, podem ser usados em conjunto com, podem ser usados em preparação para, ou são produtos dos métodos e composições divulgados. Estes e outros materiais são divulgados neste documento, e compreende-se que quando combinações, subconjuntos, interações, grupos, etc. destes materiais são divulgados que, enquanto referência específica das várias combinações individuais e coletivas e permutação desses compostos não pode ser explicitamente divulgada, cada uma é especificamente contemplada e descrita neste documento. Por exemplo, se um método é divulgado e discutido e um certo número de modificações que podem ser feitas a uma série de moléculas, incluindo o método são discutidos, cada uma e todas as combinações e permutações do método, e as modificações que são possíveis são especificamente contempladas, a menos que especificamente indicado em contrário. Da mesma forma, qualquer subconjunto ou combinação destes também é especificamente contemplado e divulgado. Este conceito aplica-se a todos os aspectos desta divulgação, incluindo, mas não se limitando a, etapas nos métodos utilizando as composições divulgadas. Assim, se houver uma variedade de etapas adicionais que podem ser
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ΊΜ 63 executadas, compreende-se que cada uma dessas etapas adicionais pode ser realizada com quaisquer etapas de método específicas ou combinação de etapas dos métodos divulgados, e que cada tal combinação ou subconjunto de combinações é especificamente contemplado e deve ser considerado divulgado.
[0054] As publicações citadas neste documento e os materiais citados são especificamente incorporados por referência, em sua totalidade, neste documento.
[0055] Os exemplos a seguir destinam-se a ilustrar adicionalmente certos aspectos dos métodos e composições descritos neste documento e não se destinam a limitar o escopo das reivindicações.
Exemplos
Exemplo 1. Identificação e análise preliminar da cepa G3-1 semelhante a traustoquitrídio.
[0056] Após dois dias de incubação, a cepa G3-1 apresentou acúmulo significativo de biomassa. Em contraste, outros traustoquitrídios, nas condições utilizadas, exigiram pelo menos três dias de incubação para atingir um nível similar de acúmulo de biomassa. Análises preliminares também indicaram que a cepa G3-1 semelhante a traustoquitrídio foi capaz de acumular altas concentrações de óleo rico em ácido docosahexaenoico (DHA) e ácido palmítico (Cl6:0). O DHA é um ácido graxo de alto valor devido ao uso em nutrição humana e animal. O ácido palmítico também é valioso quando empregado como matéria-prima para a produção de biocombustível. Além disso, tendo a aplicação da nutrição animal em mente e a aquicultura em particular, a cepa G3-1 semelhante a traustoquitrídio demonstrou acumular proteína a um nível que compõe cerca de 30% do seu peso seco de biomassa. Devido a essas propriedades, a cepa G3-1 similar a traustoquitrídio foi escolhida para se desenvolver um método para produzir biomassa rica em DHA, ácido palmítico e proteína em um curto período de tempo.
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Exemplo 2. Avaliação da cepa G3-1 em duas composições de meios.
[0057] Para avaliar a cepa G3-1 semelhante a traustoquitrídio, esta foi cultivada sob duas condições: meio de fermentação completa (FF) e meio Basal (B). O meio FF é um meio complexo e o meio B é um meio mínimo usado na análise e desenvolvimento de diferentes processos, cepas e condições.
[0058] Uma comparação da produtividade de G3-1 em meios FF vs. B demonstrou que o teor de biomassa era maior em meio B, com G3-1 produzindo 53% mais biomassa (Tabela 1). Também o rendimento total de ácidos graxos (TFA) aumentou em uma base volumétrica em 49%, devido ao maior acúmulo de biomassa. Além disso, numa base de peso de células secas, a produção de TFA também aumentou. No meio FF, os ácidos graxos compunham 289 mg g'1 de biomassa, enquanto no meio B este aumentou para 312 mg g'1 de biomassa, um aumento de 8% (Tabela 1). Os resultados obtidos sugerem que a cepa G3-1 pode ser sensível à pressão osmótica, devido à alta concentração de glicose no meio FF. O teor de proteína também foi analisado, revelando que até 30% do peso seco das células é atribuído à proteína.
Detalhes Experimentais [0059] Crescimento e cultivo - Culturas de sementes foram produzidas pelo acréscimo de 1 mL de ASW contendo cultura pura da cepa G3-1 ou de dois ciclos de colônias puras retiradas de uma placa de ágar, em alíquotas de 30 mL de meio B em frascos Erlenmeyer de 150 mL. Os frascos foram incubados a 25° C e 200 rpm durante 2 dias. Alíquotas de 5 mL de culturas de sementes (previamente ajustadas com meio B fresco estéril para DO600 nm = 1,5) foram colhidas sob condições assépticas e adicionadas a 95 mL de meio de teste estéril em frascos Erlenmeyer de 500 mL. A composição do meio de teste e as condições de cultura para estes frascos foram avaliadas usando um meio B (descrito acima) e meio FF, composto por 60 g L1 de glicose, 2 g L1 de sal marinho, 4 g L1 de peptona de soja, 1 g L1 de extrato
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26/63 de levedura, 4 g L1 de sulfato de magnésio, 2 g L1 de cloreto de sódio, 5 mg L·1 de cloreto férrico, 3 mg L1 de sulfato de cobre, 2 mg L1 de molibdato de sódio, 3 mg L1 de sulfato de zinco, 2 mg L1 de cloreto de cobalto (II), 2 mg L·1 de cloreto de manganês, 2 mg L1 de sulfato de níquel, 1,6 g L1 de fosfato de potássio monobásico, 1,75 g L1 de fosfato de potássio dibásico, 6,8 g L1 de sulfato de amônio, 0,1 g L1 de cloreto de cálcio desidratado, 0,01 g L1 de cobalamina, 0,01 g L1 de biotina e 2 g L'1 de cloridrato de tiamina. Após dois dias de fermentação, amostras de caldo foram retiradas de cada frasco e as células foram colhidas por centrifugação a 4150 rpm durante 20 min a 2o C. O sedimento foi enxaguado com água destilada para remover os sais e o substrato residual e, em seguida, foi novamente centrifugado. Os péletes foram congelados a -80, liofilizados e armazenados a -20 antes da análise de biomassa e ácido graxo. Os péletes de células liofilizadas foram pesados para determinar a biomassa da cultura da cepa G3-1 e relatados como peso seco de células por unidade de volume de meio (g L'1). Um método direto de transesterificação em uma etapa foi realizado para preparar ésteres metílicos de ácidos graxos (FAMEs) da biomassa liofilizada para estimar o teor de óleo dentro das células. A Figura 1 demonstra que a composição do meio teve um efeito significativo (p <0,05) na produção de biomassa e TFA pelo G3-1. Veja também a Tabela 1.
Tabela 1. Produção de biomassa e TFA pela cepa G3-1 em meio líquido.
Meio Biomassa (g L-1) TFA (g L-1)
Fermentação completa (FF) 6,9 + 0,3 2,0 + 0,1
Basal (B) 13,1+0,3 4,1 +0,3
[0060] Esta investigação também demonstrou que a composição da mídia foi capaz de modificar o perfil de ácidos graxos do óleo produzido pelo G3-1 (Figura 2). Quando G3-1 foi cultivado em meio B, a composição de ácidos graxos mudou ligeiramente em comparação com o meio FF. No entanto, o DHA ainda era produzido em alta concentração, o G3-1 produzia DHA a 47,1% e 46,9% do conteúdo total de ácidos graxos, quando cultivado em meio FF e B, respectivamente. Veja Tabela 2.
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Tabela 2. Efeito da composição do meio no perfil de ácidos graxos do óleo
intracelular da cepa G3-1: meio Dasal (B), de fermentação completa (FF)
Ácidos graxos FF B FF B
mg/g mg/g % %
C14:0 6,4 + 0,4 6,6 + 0,4 2,2 + 0,0 2,1+0,0
C15:0 2,3 + 0,1 47,1+0,7 0,8+0,1 15,1+0,9
C16:0 105,2 + 6,6 63,1+4,5 36,7 + 0,3 20,1+0,6
C17:0 1,0 + 0,1 9,5+0,1 0,4 + 0,0 3,0 + 0,1
C18:0 3,2 + 0,2 1,9 + 0,1 1,1+0,0 0,6 + 0,0
C20:4 -6 1,2 + 0,3 2,2 + 0,1 0,4 + 0,1 0,7 + 0,0
EPA 1,1+0,3 0,8 + 0,0 0,4 + 0,1 0,3 + 0,0
C22:5 n-6 DPA 29,8 + 1,9 31,0+ 1,4 10,4 + 0,1 9,9 + 0,0
DHA 134,9 + 9,4 146,9 + 7,4 47,1+0,2 46,9 + 0,3
FFA 285,1 309,1
[0061] Para analisar o conteúdo proteico da biomassa da cepa G3-1 foi adaptado da literatura um método de TCA quente e otimizado com cultura de G3-1 envelhecida por 16 e 22 h. Quatro combinações de condições de TCA quente foram avaliadas e o teor de proteína resultante é mostrado na Figura 3. Utilizando a condição 4, detectou-se mais de 30% de conteúdo proteico em G3-1, revelando o potencial destas cepas para produzir quantidades significativas de proteína (isto é, >40%) e, portanto, podendo servir como um produto parcial de substituição de farinha de peixe.
Exemplo 3. Exigências nutricionais para o aumento da produção de biomassa e acúmulo de lipídios pela cepa G3-1 semelhante a traustoquitrídio.
[0062] Análises prévias comparando os meios FF e B demonstraram que os requerimentos nutricionais do G3-1 diferem daqueles de outros traustoquitrídio. Uma série de experimentos foi desenvolvida para entender melhor quais aspectos do meio B afetam o crescimento e a produção de lipídios do G3-1. Para isso, foi aplicada uma abordagem experimental de design fatorial padrão, também chamada de Plackett-Burman.
[0063] Os resultados mostram que as exigências nutricionais da cepa
G3-1 diferem daquelas de outros traustoquitrídio, que G3-1 tem a capacidade de produzir ácidos graxos saturados de cadeia curta (ácido palmítico) e ácidos graxos poliinsaturados de cadeia longa (DHA), provavelmente por meio de
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28/63 vias independentes, uma via clássica de alongamento e dessaturação, mais uma via de policetídeo sintase independente. Eles também demonstram que a peptona de soja e o sal marinho juntos têm um impacto significativo na produtividade do G3-1.
Detalhes Experimentais.
[0064] Um design fatorial de fração irregular (2Λ4*3/4) foi utilizado para explorar a significância de quatro variáveis independentes, componentes do meio B, na produção de biomassa e ácidos graxos. Variáveis independentes foram testadas em concentrações altas (+1) e baixas (-1) (Tabela 3). Um total de doze ensaios experimentais foram concluídos em duplicata, conforme descrito na Tabela 4.
Tabela 3. Variáveis independentes e seus níveis utilizados no design fatorial de fração irregular.________________________________________________
Variáveis Xi Codificado Nível codificado
-1 +1
Glicose (g L-1) XI 20 40
Peptona de soja (g L-1) X2 4 20
Extrato de levedura (g L-1) X3 1 5
Sal marinho (g L1) X4 2 9
Tabela 4. Matriz de design fatorial de fração irregular.
Execução Bloco Variável Codificada Variável de Processo
XI X2 X3 X4 XI X2 X3 X4
1 1 -1 -1 -1 -1 20 4 1 2
2 1 -1 -1 -1 +1 20 4 1 9
3 1 -1 -1 + 1 -1 20 4 5 2
4 1 -1 -1 + 1 +1 20 4 5 9
5 1 -1 +1 -1 -1 20 20 1 2
6 1 -1 +1 -1 +1 20 20 1 9
7 1 -1 +1 + 1 -1 20 20 5 2
8 1 -1 +1 + 1 +1 20 20 5 9
9 1 + 1 -1 -1 +1 40 4 1 9
10 1 + 1 -1 + 1 -1 40 4 5 2
11 1 + 1 +1 -1 -1 40 20 1 2
12 1 + 1 +1 + 1 +1 40 20 5 9
[0065] Este experimento demonstrou que a concentração de peptona de soja (X2) e a interação entre a peptona de soja e a concentração de sal marinho (X2*X4) tiveram um efeito significativo (p <0,05) na capacidade do G3-1 de produzir biomassa. Adicionalmente, a quantidade de ácidos graxos intracelulares acumulados pela cepa G3-1 foi significativamente (p <0,05)
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29/63 afetada por peptona de soja (X2), extrato de levedura (X3) e sal marinho (X4), e a interação entre as concentrações de glicose e sal marinho (XI * X4). Além de afetar a biomassa e a produtividade lipídica, o perfil de ácidos graxos também foi influenciado pelas mudanças impostas (Figura 4). De um modo geral, quantidades elevadas de DHA, 47,7 a 51,0% de TF A, foram sintetizadas por células de G3-1 nesta experiência para a seguinte combinação de ingredientes para as séries 6, 7, 8 e 12 (na Tabela 4). Assim, G3-1 tem a capacidade metabólica de produzir facilmente biomassa composta por >50% de DHA. Igualmente importante, esta série de experimentos identificou condições que resultam na produção de quantidades menores de ácidos graxos saturados e afetam a produtividade geral (Tabela 5, Figura 4). A composição do meio líquido selecionado para aumentar a produção de biomassa, o rendimento de TF A e o DHA pela cepa G3-1 em escala laboratorial foi de 20 g L1 de glicose, 20 g L1 de peptona de soja, 5 g L1 de extrato de levedura e 9 g L1 de sais marinhos. Isso é o mesmo que a mídia Basal (B) descrita anteriormente.
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Tabela 5. Perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1 sob diferentes composições de meios líquidos testadas usando um design fatorial de fração irregular.
Ácidos Graxos (%)
Execução C14:0 C15:0 C16:0 C16:l C17:0 C18:0 C18:l Ole C18:l Vac C20:0 C20:4 n-6 EPA C22:5 n-6 DPA DHA SFA MUFA PUFA Biomassa (g/L) TFA (g/L/d)
1 2,9 6 41,1 0,3 1,7 1,1 0,1 0,4 0,2 1,7 0,5 4,5 38,7 53 0,8 45,4 5,1+0,09 2,26+0,08
2 3,6 5,1 39,7 0,3 1,3 1,1 0,1 0,4 0,3 1,6 0,5 5,6 40,2 51,1 0,8 47,9 5,7+0,12 2,59+0,04
3 3 6,7 37,3 0,3 1,6 1 0,2 0,5 0,2 1,4 0,4 5,7 41 49,8 1 48,5 5,3+1,00 1,82+0,34
4 3,9 12 30,5 0,3 2,3 0,9 0,2 0,5 0,2 1,4 0,5 6 40,6 49,8 1 48,5 5,9+0,12 1,89+0,06
5 1,7 29,1 11,1 0,2 4,6 0,3 0,3 0,3 0 1 0,4 7,7 42,1 46,8 0,8 51,2 7,6+0,43 1,27+0,06
6 1,2 20,5 12,3 0,2 5 0,3 0,5 1,1 0 1,3 0,6 8,3 47,8 39,3 1,8 58 6,0+0,50 0,64+0,08
7 1 18,4 11,9 0 4,5 0,1 0,7 0,9 0 1,4 0,6 8,7 51 35,9 1,6 61,7 7,2+0,85 0,71+0,04
8 1,1 17 12,9 0 4,8 0,2 0,6 1,2 0 1,4 0,7 8,9 50,5 36 1,8 61,5 6,6+1,05 0,69+0,11
9 3,5 4,2 40,9 0,2 1,1 1,1 0,1 0,3 0,2 1,1 0,4 6,5 40 51 0,6 48 5,8+0,69 3,02+0,47
10 2,8 26,9 15,1 0,4 4,4 0,4 0,4 0,9 0 1,7 0,8 4,6 40,4 49,6 1,7 47,5 5,0+0,66 0,90+0,13
11 1,9 21,9 11,9 0,5 4,3 0,4 0,7 1,1 0 1,7 0,8 6,9 46 40,4 2,3 55,4 6,8+0,81 0,68+0,07
12 1,2 18 15,2 0 5 0,5 0,3 0,5 0 0,9 0,5 9,1 47,7 39,9 0,8 58,2 7,8+0,27 0,90+0,02
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Exemplo 4. Avaliação da cepa G3-1 similar a traustoquitrídio em fermentadores de laboratório.
[0066] A formulação do meio basal (B) da execução 8, descrita acima, foi selecionada para conduzir fermentações utilizando fermentadores de 2 L para avaliar o potencial da cepa G3-1 de produzir biomassa rica em DHA e ácido palmítico.
[0067] Numa fermentação de 88 horas, a cepa G3-1 similar a traustoquitrídio produziu 51,8 g L1 de biomassa composta por 67,3% de TFA. DHA e ácido palmítico constituíram 38,8% e 44,7% de TFA, respectivamente. A produtividade de TFA foi de 0,398 g L·1 hr1, o que excedeu os exemplos publicados em >32%.
Detalhes Experimentais [0068] G3-1 foi pré-cultivado em frascos Erlenmeyer contendo 500 mL de meio líquido (20 g L1 de glicose, 20 g L1 de peptona de soja, 5 g L1 de extrato de levedura e 9 g L'1 de sais marinhos). Os frascos foram incubados sob agitação a 25° C e 200 rpm durante 2 dias. Após o período de incubação, 200 mL da pré-cultura foram transferidos para 1,8 L do mesmo meio, em um vaso de fermentação de 2 L. As condições de cultura descontínua foram aplicadas como se segue: 25° C, agitação começando a 400 rpm e atingindo 600 rpm, aeração a 0,3 VVM com ar atmosférico e pH 6,8. As células foram coletadas em intervalos de 10-15 h e crescimento, teor de óleo (TFA) e de DHA foram examinados.
[0069] A glicose no meio foi completamente consumida após 20 h de fermentação. Culturas semidescontínuas foram realizadas por um total de 88 h. Após 65 horas de fermentação semidescontínua, G3-1 produziu 34,7 g L1 de biomassa e 77,1% de TFA. DHA (40,6%) e ácido palmítico (42,7%) foram os principais ácidos graxos encontrados no lipídio produzido por essa cepa. Após 88 h de fermentação, a biomassa total acumulada foi de 51,8 g L1. No final da fermentação, 88 horas, biomassa seca, TFA e DHA foram medidos
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32/ 63 como 51,8 g L1, 70% e 38,8%, respectivamente. Assim, para esta fermentação, a produtividade total de ácidos graxos foi de 0,396 g L1 h'1 e a produtividade de DHA foi de 0,154 g L1 h’1. A Tabela 6 e a Figura 5 apresentam o perfil de ácidos graxos do G3-1 quando cultivado sob as condições de fermentação descritas. Como ponto de partida com otimização mínima do processo, o G3-1 é considerado uma cepa de produção de DHA muito alta.
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Tabela 6. Produção de óleo e perfil de ácidos graxos do óleo intracelular de cepa G3-1. As células foram cultivadas em fermentadores de 2L usando um meio basal selecionado.
Ácidos Graxos (%) Produtividade (g L1 h1)
Tempo (h) TFA (%) C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C20:5 (n-3) EPA C22:5 (n-6) DPA C22:6 (n-3) DHA Biomassa (g/L) TFA (mg/g) Biomassa TFA DHA C16:0
Semente 19,6 2,8 10,6 26,3 0,9 1,7 5,6 44,3 13,1 196,3
21,34 24,0 2,7 15,5 25,7 0,8 0,5 7,9 42,4 14,7 240,2
40,28 49,5 2,9 3,9 35,8 1,0 0,3 8,4 45,5 28,1 495,4
47 55,6 3,1 3,1 38,3 1,1 0,3 8,2 43,9 34,8 555,7
65 77,1 3,8 2,1 42,7 1,1 0,3 7,7 40,6 34,7 770,9
71 74,2 3,9 2,0 44,1 1,1 0,3 7,5 39,5 36,9 742,0
88 67,3 3,9 2,0 44,7 1,1 0,4 7,4 38,8 51,8 672,6 0,589 0,396 0,154 0,177
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Exemplo 5. Melhorando o processo por intermédio do uso de um meio de fermentação completa modificado.
[0070] A fim de alcançar uma maior produtividade de biomassa, o efeito de um meio de fermentação completa modificado (MFF) foi avaliado quanto ao impacto na biomassa e no acúmulo de ácidos graxos em relação à cepa G3-1. O meio de fermentação modificado (MFF) é um meio complexo rico em minerais e vitaminas que é idêntico ao empregado anteriormente, isto é, FF, exceto que a glicose foi reduzida de 60 g L1 para 20 g L1, para reduzir a pressão osmótica. Foram realizadas fermentações semidescontínuas de 2L e mudanças no teor de ácidos graxos e biomassa foram monitorados. Nesta fermentação de 115 horas, a cepa G3-1 similar a traustoquitrídio produziu 85,4 g L1 de biomassa composta por 63,6% de TFA. DHA e ácido palmítico constituíram 43,4% e 41,0% de TFA, respectivamente. A produtividade de TFA foi de 0,471 g L1 h’1, o que excedeu os exemplos publicados em >56%.
Detalhes Experimentais [0071] Um meio de fermentação completa modificado (MFF) foi usado para cultivar a cepa G3-1 em um fermentador de 2 L para aumentar a produção de biomassa e ácidos graxos. G3-1 foi pré-cultivado em frascos Erlenmeyer contendo 500 mL do meio basal selecionado (20 g L1 de glicose, 20 g L1 de peptona de soja, 5 g L1 de extrato de levedura e 9 g L·1 de sais marinhos). Os frascos foram incubados sob agitação a 25° C e 200 rpm durante 2 dias. Após o período de incubação, 200 mL das células précultivadas foram transferidos para 1,8 L de meio MFF (20 g L1 de glicose, 2 g L 1 de sal marinho, 4 g L1 de peptona de soja, 1 g L1 de extrato de levedura, 4 g L1 de sulfato de magnésio, 2 g L1 de cloreto de sódio, 5 mg L1 de cloreto férrico, 3 mg L1 de sulfato de cobre, 2 mg L1 de molibdato de sódio, 3 mg L1 de sulfato de zinco, 2 mg L1 de cloreto de cobalto (II), 2 mg L·1 de cloreto de manganês, 2 mg L1 de sulfato de níquel, 1,6 g L1 de fosfato de potássio monobásico, 1,75 g L1 de fosfato de potássio dibásico, 6,8 g L1
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35/63 de sulfato de amônio, 0,1 g L1 de cloreto de cálcio desidratado, 0,01 g L1 de cobalamina, 0,01 g L 1 de biotina e 2 g L·1 de cloridrato de tiamina) cultivados em fermentadores de 2 L a condições de 25° C, agitação iniciando a 450 rpm e atingindo 500 rpm, aeração a 0,3 VVM com ar atmosférico e pH 6,8. As células foram coletadas em intervalos de 10-15 horas e a biomassa, TFA e DHA foram medidos. A glicose no meio foi completamente consumida após 18-20 h de fermentação e naquele momento. A cultura foi então alimentada semidescontinuamente com 75% (p/v) de glicose, até 115,38 h, quando a fermentação terminou. No final da fermentação (115,38 h) a biomassa, o TFA e o DHA foram medidos como 85,4 g L-l, 63,6% e 43,4% de DHA (Tabela 7, Figura 6). Para esta fermentação, a produtividade para biomassa, TFA e DHA foi de 0,740 g L1 h’1, 0,471 g L1 h’1 e 0,204 g L1 h’1, respectivamente. O óleo obtido sob estas condições era rico em DHA.
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Tabela 7 Produção de óleo e perfil de ácidos graxos do óleo intracelular de MARA G3-1. As células foram cultivadas em fermentadores de 2L usando um meio de fermentação completa modificado.
Ácidos Graxos (%) Produtividade (g/L/h)
Tempo (h) TFA (%) C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C20:5 (n-3) EPA C22:5 (n-6) DPA C22:6 (n-3) DHA Biomassa (g/L) TFA (mg/g) Biomassa TFA DHA C16:0
18,25 13,8 1,7 2,0 30,2 0,8 0,9 10,1 52,2 16,6 137,5
40,36 46,2 3,4 0,5 37,6 1,0 0,4 9,1 46,7 42,0 462,3
46,22 50,1 3,4 0,4 37,4 1,0 0,3 9,0 47,0 49,3 501,1
70,43 60,3 3,8 0,3 38,7 1,0 0,4 8,7 45,6 67,5 603,1
96,45 66,0 4,0 0,3 39,4 1,0 0,4 8,3 45,0 80,4 659,9
115,38 63,6 4,2 0,3 41,0 1,0 0,4 8,1 43,4 85,4 636,3 0,740 0,471 0,204 0,193
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37/63 [0072] A produção de biomassa foi aumentada com sucesso quando um meio MFF foi usado para cultivar G3-1 em fermentadores de 2L. No entanto, após 115,38 horas de fermentação semidescontínua, o TFA atingiu 63,6% do peso seco de biomassa. Uma possível explicação para isso é que o MFF continha menos peptona de soja e sal marinho do que o meio B. Componentes que foram considerados importantes no experimento de planejamento fatorial inicial.
Exemplo 6. O efeito da limitação de nitrogênio no acúmulo de óleo pela cepa G3-1 similar a traustoquitrídio.
[0073] O meio de fermentação completa modificado (MFF), descrito acima, foi ajustado para reduzir a concentração de nitrogênio inorgânico (na forma de sulfato de amônio) no meio líquido em 50%. A cepa G3-1 foi cultivada em fermentadores de 2L. O consumo de glicose foi monitorado e, quando as células apresentaram sinais de inanição, as fermentações foram alimentadas descontinuamente com 75% (p/v) de glicose.
[0074] Nesta fermentação de 112 horas, a cepa G3-1 similar a traustoquitrídio produziu 79,5 g L1 de biomassa composta por 77,4% de TFA. DHA e ácido palmítico constituíram 36,9% e 48,2% de TFA, respectivamente. A produtividade de TFA foi de 0,548 g L1 h’1, o que excede os exemplos publicados em >82%.
Detalhes experimentais [0075] G3-1 foi pré-cultivado seguindo as mesmas condições descritas anteriormente. 200 mL de células pré-cultivadas foram transferidos para meios de 1,8 L de MFF com metade da quantidade normal de nitrogênio inorgânico (fermentador de vasos de 2 L). O meio foi formulado usando 3,4 g L·1 de sulfato de amônio e todos os outros ingredientes foram mantidos na mesma concentração descrita anteriormente. As condições de cultura foram de 25, a agitação foi iniciada a 480 rpm e aumentou 500 rpm ao longo da fermentação, a alimentação foi mantida a 0,3 VVM com ar atmosférico e o
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38/63 pH 6,8 foi mantido. As células foram coletadas em intervalos de 10-15 horas e os conteúdos de biomassa, TFA e DHA foram analisados.
[0076] A Figura 7 mostra que o uso de metade da concentração de sulfato de amônio em meio MFF acelerou a taxa de produção de ácido palmítico (Cl6:0) pela cepa empregada. As 40 h, o nitrogênio foi esgotado. Os dados da Tabela 8 mostram que tanto a biomassa quanto o TFA continuaram a acumular na cultura de G3-1. Também é aparente que pequenas mudanças no perfil de TFA ocorreram após a limitação de nitrogênio (Figura 7).
[0077] Nesta investigação, o TFA aumentou de 18,3 para 75,9% (maximamente) do peso seco das células, uma vez que o percentual de ácido palmítico do TFA aumentou de cerca de 45% para 48% ao longo da fermentação. Durante o mesmo período de tempo, o DHA diminuiu ligeiramente de 45% para 36,9% (Tabela 8). Isto corresponde à biossíntese de 372,7 mg g'1 de ácido palmítico e 285,3 mg g'1 de DHA. A taxa de produção para estes dois ácidos graxos é de 0,264 g L1 h'1 de ácido palmítico e 0,202 g L·1 h'1 de DHA. O aumento observado na biossíntese de ácido palmítico não é surpreendente porque o estresse de nitrogênio é conhecido por induzir a expressão de genes na clássica via de síntese de ácidos graxos responsável pela produção de ácido palmítico. No entanto, é animador ver que a produção de DHA permanece aproximadamente a mesma, independentemente do estresse de nitrogênio.
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Tabela 8. Produção de óleo e perfil de ácidos graxos do óleo intracelular de cepa G3-1. As células foram cultivadas em fermentadores de 2 L utilizando metade da concentração de sulfato de amônio num meio de fermentação completa modificado.
Ácidos Graxos (%) Produtividade (g/L/h)
Tempo (h) TFA (%) C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C20:5 (n-3) EPA C22:5 (n-6) DPA C22:6 (n-3) DHA Biomassa (g/L) TFA (mg/g) Biomassa TFA DHA C16:0
16 18,3 2,6 1,2 37,1 1,0 0,7 9,0 45,2 16,41 183,5
23,16 37,7 3,4 0,7 46,0 1,2 0,4 7,7 38,7 23,7 376,9
40,00 59,0 4,8 0,4 45,2 1,1 0,3 7,2 38,7 37,8 589,8
47,07 62,5 4,9 0,4 45,2 1,1 0,3 7,2 38,8 44,0 624,6
64,18 70,1 5,0 0,3 45,5 1,1 0,3 7,2 38,6 55,9 700,8
70,15 73,1 4,8 0,3 46,0 1,1 0,3 7,1 38,2 58,5 730,9
88,09 73,8 4,8 0,2 46,8 1,1 0,3 7,1 37,7 70,0 738,0
94,45 75,9 4,7 0,2 47,0 1,1 0,3 7,1 37,6 73,5 759,1
112,19 77,4 4,6 0,2 48,2 1,1 0,3 7,0 36,9 79,5 773,5 0,709 0,548 0,202 0,264
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Exemplo 7. Caracterização taxonômica da cepa G3-1 similar a traustoquitrídio.
[0078] Uma abordagem padrão para caracterizar a cepa G3-1 foi aplicada. A sequência de rDNA 18S foi amplificada a partir de DNA genômico de G3-1 utilizando DNA polimerase Taq e primers JBoll9 (5’CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’ (SEQ ID NO:2)) e JBol20(5’TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3’ (SEQ ID NO:3)). A reação de 50 μΐ de PCR continha 1,25 Unidades Taq de DNA polimerase (New England Biolabs, M0273 (IpSwich, MA)), Ix tampão de reação padrão, 200 μΜ de cada dNTP (A, G, C, T), 0,2 μΜ de cada primer (JBoll9 e JBol20) e 3% de DMSO. Esta reação de PCR foi incubada a 95 durante 4 min, depois submetida a 35 ciclos de 95°C por 30 s, 52°C por 30 s e 68°C por 1:45 min, seguidos por uma incubação final a 68°C por 30 min., antes de ser mantida a 4°C. O âmplicon ~1,7 kb foi purificado em gel e este grupamento de fragmentos amplificados foi clonado no vetor pCR2.1 por clonagem TA para produzir o plasmídeo pJB84. Dez clones individuais de pJB84 (#1,2, 5, 6, 7, 10, 12, 13, 14 e 15) foram isolados e enviados para Genewiz (South Plainfield, NJ) para sequenciamento. A sequência rRNA 18S de cada clone é fornecida nas SEQ ID NOs:10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18 e 19. Cada clone foi sequenciado com 8 primers no total: 4 forward primers e 4 reverse primers. Dois dos primers de sequenciamento, M13R e T7, são primers universais que se ligam a sequências de vetores que flanqueiam o sítio de clonagem TA e foram fornecidos por Genewiz. Os outros 6 primers, incluindo os JBoll9 e JBol20 utilizados para amplificar o rDNA 18S, ligam-se à sequência de rDNA 18S e foram concebidos com base nas sequências iniciadoras anteriormente relatadas (Burja, AM, Radianingtyas, H., Windust, A. e Barrow, CJ (2006). Isolation and characterization of polyunsaturated fatty acid producing Thraustochytrium species: screening of strains and optimization of omega-3 production. Appl. Microbiol. Biotechnol. 72, 1161—
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1169; Mo, C., J., D., e B., R. (2002). Desenvolvimento de uma estratégia de PCR para a identificação de traustoquitrídio baseada na sequência de rDNA 18S. Mar. Biol. 140, 883-889). As 8 sequências de primers são:
M13R5’-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3’ (SEQ ID NO:4)(primer universal)
T75’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG-3’ (SEQ ID NO:5)(primer universal)
JBoll95’-CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTA-3’ (SEQ ID NO:2)(Burja et al. 2006)
JBol205’-TCACTACGGAAACCTTGTTACGAC-3’ (SEQ ID NO:3)(Burja et al. 2006)
JBol215’-GTCTGGTGCCAGCAGCCGCG-3’ (SEQ ID NO:6)(Mo et al. 2002)
JBo 1225’-CTTAAAGGAATTGACGGAAG-3’ (SEQ ID NO:7)(Mo et al. 2002)
JBol235’-AGCTTTTTAACTGCAACAAC-3’ (SEQ ID NO:8)(Mo et al. 2002)
JBol245’-GGCCATGCACCACCACCC -3’ (SEQ ID NO:9)(Mo et al. 2002) [0079] As 8 reações de sequenciamento para cada clone foram aparadas deletando-se as sequências 5 'e 3' contendo Ns (nucleotideos ambíguos) deixando apenas as porções bem-sucedidas de cada leitura de sequenciamento. Estes foram montados em um único contíguo para cada clone usando o software ChromasPro (Technelysium Pty Ltd, South Brisbane, Austrália). Estes contíguos continham as sequências de rDNA 18S, bem como sequências de vetores flanqueadores. As sequências de vetores foram cortadas a partir do contíguo, deixando apenas a sequência de rDNA 18S amplificada por JBoll9 e JBo 120. Quaisquer nucleotideos ambíguos indicados pelo ChromasPro foram determinados manualmente, mas havia muito poucos, se algum. Em todos os casos, a sequência de rDNA 18S foi coberta por pelo
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42/63 menos 2 leituras de sequenciamento ao longo de todo o seu comprimento, mas teve pelo menos três leituras de cobertura para a grande maioria de seu comprimento, com mais de 3 leituras cobrindo algumas extensões mais curtas. Todas as 10 sequências eram pelo menos 98% idênticas uma à outra. A maior variabilidade entre qualquer par de clones é entre # 5 e # 6, que são 98,19% idênticos. Existem dois pares de clones que são 100% idênticos, # 1 e 7, e #12 e 13, e esses pares idênticos são 98,98% idênticos entre si. Uma sequência consenso foi criada. A sequência consenso de rDNA G3-1 18S baseada em 10 clones individualmente sequenciados é mostrada abaixo. Os nucleotídeos degenerados foram curados manualmente usando a anotação padrão IUPAC (A, Adenina; C, Citosina; G, Guanina; T, Tiamina; W, A ou T; S, C ou G; M, A ou C; K, G ou T; R, A ou G; Y, C ou T; B, não A; D, não C; H, não G; V, não T; N, qualquer Nucleotídeo).
CAACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTCGTCTCAAAGATT AAGCCRTGCATGTGTAAGTATAAGCGATTGTACTGTGAGACTGCG AACGGCTCATTATATCAGTAATAATTWCTTCGGTARYTTCTTTTAT ATGGATACCTGCAGTAATTCTGGAAATAATACATGCTGTAAGAGC CCTRTATGGGGCTGCACTTATTAGATTGAAGCCGATTTTATTGGTG AATCATGATAATTGAGCAGATTGACTWTTTTTDGTCGATGAATCG TTTGAGTTTCTGCCCCATCAGTTGTCGACGGTAGTGTATTGGACTA CGGTGACTATAACGGGTGACGGAGAGTTAGGGCTCGACTCCGGAG AGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCATATCCAAGGATAGCAGCAGGC GCGTAAATTACCCACTGTGGACTCCACGAGGTAGTGACGAGAARY ATCGATGCGAAGCGTGTATGCGTTTTGCTATCGGAATGAGARYAA TGTAAAACCCTCATCGAGGATCAACTGGAGGGCAAGTCTGGTGCC AGCAGCCGCGGTRATTCCAGCTCCRGAAGCATATGCTAAAGTTGT TGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAATTTCTGGCATGGGCGACCGGT GCTTTCCCTGAATGGGGATWGATTGTCTGTGTTGCCTTGGCCATCT TTYTCWTKYYDTTWTWGRKRWGARATCTTTCACTGTAATCAAAG
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CAGAGTGTTCCAAGCAGGTCGTATGACCGGTATGTTTATTATGGGA TGATAAGATAGGACTTGGGTGCTATTTTGTYGGTTTGCACGCCTGA GTAATGGTTAATAGGAACAGTTGGGGGTATTCGTATTTAGGAGCT AGAGGTGAAATTCTTGGATTTCCGAAAGACGAACTAGAGCGAAGG
CATTTACMAAGCATGTTYTCATTAATCAAGAACGAAAGTCTGGGG ATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTAGACCGTAAACGATG CCRACTTGCGATTGTTGGGTGCTTTWTTDTATGGGCCTCAGCAGC
RGCACATGAGARATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGT CGCAAGGCTGAAACTTRAAGGAATTGACGGAAGGGCACCACCAG GAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTAC
CAGGTCCAGACATAGGTAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCAT GATTCTATGGGTGGTRGTGCATGGCCKTTCTTAGTTGGTGGAGTGA TTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCTCGGCCTACTAAA
TAGTGCGTGGTATGGCAACATAGTRCGTTTTWAACTTCTTAGAGG GACATGTCCGGTTTACGGGCAGGAAGTTCGAGGCAATAACAGGTC YGTGATGCCCTTAGATGYTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGAT
GGGTTCATCGGGTTTTRATTYYAWTTWWTGGAATTGAGTGCTTGG TCGGAAGGCCTGGCTAATCCTTGGAACGCTCATCGYGCTGGGGCT AGATTTTYGCAATTATTAATCTCCRACGAGGAATTCCTAGTAAACG
CAAGTCATCAGCTTGCATTGAATACGTCCCTGCCCTTTGTACACAY CGCCCGTCGCACCTACCGATTGAACGGTCCGATGAAACCATGGGA TGWTTSTGTTTGGATTVATTTTTSGACAKAGGCAGAACTCGGGTGA
ATCTTATTGTTTAGAGGAAGGTGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTA
GTGA (SEQ ID NO:1)
Exemplo 8. Caracterização carotenoide da cepa G3-1 tipo traustoquitridio.
[0080] A análise do teor de carotenoides da biomassa e do óleo G3-1 foi realizada. A análise de carotenoides, realizada em biomassa de três fermentações de 2L separadas, demonstrou que a cepa G3-1 sintetiza e
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44/63 armazena uma pequena quantidade de carotenoides, sendo β-caroteno o principal componente (Tabela 9). Isso contrasta com outros traustoquitrídios, nos quais a cantaxantina é o principal carotenoide, mas é similar às observações publicadas para outras cepas do tipo traustoquitrídio (em Lee Chang et al.,“Biodiscovery of New Australian Thraustochytrids for Production of Biodiesel and Long-Chain Omega-3 Oils.”).
Tabela 9. Resumo do teor de carotenoides para a cepa do tipo Traustoquitrídio G3-1.
Concentração de Carotenoides (por Peso seco (pg g’1))
Dia de Amostra Astaxantina Zeaxantina Cantaxantina β-Criptoxantina Licopeno Equinenona β-Caroteno
Replicata 1
1 0 0 0 0 0 0 20,37
7 0 0 0 0 0 0 10,37
9 0 0 5,14 0 0 0 9,26
Replicata 2
1 0 0 0 0 0 0 23,35
7 0 0 0 0 0 0 6,42
9 0 0 0 0 0 0 7,54
Replicata 3
1 0 0 0 0 0 0 10,77
7 0 0 0 0 0 0 4,68
9 0 0 0 0 0,13 0 7,37
Detalhes experimentais [0081] Para a análise dos carotenoides, a biomassa foi extraída utilizando pequenos grânulos de vidro e um batedor de grânulos, na presença de acetona:metanol resfriados (1:1 v/v) duas vezes, seguido por duas extrações utilizando hexano. O sobrenadante combinado foi seco sob nitrogênio e ressuspenso em acetona com antioxidantes (0,5% de hidroxianisol butilado (BHA) e hidroxitoluneno butilado (BHT). A análise foi conduzida num Agilent HPLC utilizando uma coluna Phenomenex 5 μ Luna C18(2).
[0082] Em resumo, por meio de quatro experimentos, que incluem otimização de um único meio e três fermentações de 2L, foram identificadas condições que aumentaram a produtividade de biomassa de 0,589 g L1 h'1 para 0,740 g L1 h’1, e separadamente um aumento da síntese de TFA de 0,396 g L1 h'1 para 0,548 g L1 h’1. Isto, isoladamente, excede a melhor
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45/63 produtividade de TFA publicada em >80%, que é de 0,301 g L1 h’1. Além disso, a produção de DHA em óleo produzido é de 0,202 g L1 hr'1 e de ácido palmítico é de 0,264 g L1 h’1. Nossa análise sugere que a produtividade de DHA se compara favoravelmente a métodos altamente otimizados baseados em traustoquitrídios, que quando cultivados sob condições para alta produção de óleo DHA, podem produzir em torno de 0,3 g L1 h’1.
Exemplo 9. Identificação de ingredientes essenciais para a biomassa G3-1 e acúmulo de lipídios em diferentes formulações de meios contendo glutamato monossódico (MSG) como a fonte de nitrogênio orgânico definida e avaliação do perfil de ácidos graxos dos lipídios de G3-1 sintetizados nessas condições.
[0083] Exemplos anteriores mostraram que G3-1 requer uma fonte complexa de nitrogênio (peptona de soja e extrato de levedura) para crescer e acumular biomassa. No entanto, a peptona de soja não é apenas uma fonte cara de nitrogênio orgânico complexo, como o uso de altas concentrações de peptona de soja nos meios para cultivar algumas cepas de microalgas levou à síntese de ácidos graxos saturados de cadeia ímpar (particularmente C15:0 e C17:0) na fração lipídica das células de microalgas. Por exemplo, as células de G3-1 acumulam 15,1% dos seus ácidos graxos totais como C15:0, quando 20 g de peptona L-l de soja estavam presentes no meio basal que foi utilizado para cultivar G3-1 (Exemplo 3). Para diminuir o custo dos meios de G3-1 e evitar ácidos graxos saturados de cadeia ímpar na fração lipídica das células de G3-1, um experimento Plackett-Burman foi usado para identificar os principais ingredientes que suportam a proliferação de células de G3-1 e que devem estar presentes em um meio em que o uso de peptona de soja foi substituído por MSG e extrato de levedura.
Detalhes experimentais [0084] Um design de Plackett-Burman foi usado para identificar a significância de seis ingredientes do meio na biomassa de G3-1 e na
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46/63 acumulação lipídica. Os seis ingredientes do meio (variáveis independentes) foram testados em um nível alto (+) e baixo (-) (Tabela 10). Um total de doze composições de meios diferentes para o crescimento de G3-1 tendo diferentes combinações de ingredientes foram testadas em duplicata, como descrito na Tabela 11. Com base em experimentos prévios e com o intuito de favorecer a proliferação celular e a síntese lipídica, para cada uma das doze composições de meio testadas, as concentrações de glicose e cloreto de sódio (NaCl) foram mantidas a 40 g L1 e 2, respectivamente.
[0085] 95 mL de cada meio testado foram preparados seguindo a combinação de ingredientes mostrados na Tabela lie foram inoculados com alíquotas de 5 mL de um frasco de semente de G3-1. A composição dos meios utilizados para o frasco de sementes foi de 20 g de glicose L1, 30 g de extrato de levedura L'1 e 9 g de sais marinhos L1.
Tabela 10. Variáveis independentes e seus níveis utilizados no design
Plackett-Burman.
Variáveis Código Xi Nível codificado
-1 ι-l
MSG (g L-1) XI 0 1
Extrato de levedura (g L-1) X2 0 1
KH2PO4 (g L1) X3 0,1 0,3
Solução de oligoelementos (mL L-1) X4 0 1,5
FeCl3(g L-1) X5 0 5
MgSO4’7H2O(g L1) X6 0 4
abela 11. Matriz de design de Plackett-Burman.
Execução Bloco Variável Codificada Variável de Processo
XI X2 X3 X4 X5 X6 XI X2 X3 X4 X5 X6
1 1 +1 -1 +1 -1 -1 -1 1 0 0,3 0 0 0
2 1 +1 + 1 -1 + 1 -1 -1 1 1 0,1 1,5 0 0
3 1 -1 + 1 +1 -1 +1 -1 0 1 0,3 0 5 0
4 1 +1 -1 +1 + 1 -1 + 1 1 0 0,3 1,5 0 4
5 1 +1 + 1 -1 + 1 +1 -1 1 1 0,1 1,5 5 0
6 1 +1 + 1 +1 -1 +1 + 1 1 1 0,3 0 5 4
7 1 -1 + 1 +1 + 1 -1 + 1 0 1 0,3 1,5 0 4
8 1 -1 -1 +1 + 1 +1 -1 0 0 0,3 1,5 5 0
9 1 -1 -1 -1 + 1 +1 + 1 0 0 0,1 1,5 5 4
10 1 +1 -1 -1 -1 +1 + 1 1 0 0,1 0 5 4
11 1 -1 + 1 -1 -1 -1 + 1 0 1 0,1 0 0 4
12 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 0 0 0,1 0 0 0
[0086] Além de glicose (40 g L'1), cloreto de sódio (2 g L'1), extrato de levedura e MSG, os ingredientes mais significativos (p < 0,05) que devem
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47/63 ser adicionados ao meio para favorecer a proliferação de células de G3-1 foram: MgSCU’VHiO (X6), oligoelementos (X4) e KH2PO4 (X3). O maior acúmulo de biomassa (13,2 ± 0,1 g L'1) foi obtido utilizando-se meio contendo pelo menos 1 g de extrato de levedura L1, 1 g de MSG L1, 0,3 g de KH2PO4 L1, 1,5 mL L1, 4 g de MgSO4«7H2O L1, 40 g de glicose L1 e 2 g de NaCl L1. FeCh não mostrou um efeito significativo (p > 0,05) no acúmulo de biomassa de G3-1, então foi eliminado da formulação de meio para cultivar G3-1.
[0087] Por outro lado, ANOVA dos dados de acumulação lipídica para cada um dosa meios testados usando o design de Plackett-Burman mostrou que MgSO4*7H2O (X6), oligoelementos (X4) e KH2PO4 (X3) tiveram um efeito significativo positivo (p < 0,05) na acumulação de lipídios expressa como ácidos graxos totais (TFA). O MSG também teve um efeito estatisticamente significativo na concentração de TFA, no entanto, seu efeito sobre o TFA foi negativo, o que significa que o G3-1 sintetizou menos lipídios quando a concentração de MSG nos meios era alta. Isso era esperado, porque baixas taxas de carbono para nitrogênio (C/N) afetam a biossíntese lipídica em células de G3-1. A melhor combinação de ingredientes do meio para obter o maior TFA (789 mg g'1) foi: pelo menos 1 g de extrato de levedura L1, 0,3 g de KH2PO4 L1, 1,5 mL de oligoelementos L1, 4 g de MgSO4*7H2O L1, 40 g de glicose L4 e 2 g de NaCl L1. Além de afetar a produção de biomassa e TFA, o perfil de ácidos graxos também foi influenciado pelas diferentes composições de meios testados usando o desenho de Plackett-Burman (Figura 8). Por exemplo, as formulações de meios para as execuções 10, 11 e 12 da matriz de desenho de PlackettBurman (Tabela 12) mostraram um teor muito baixo de DHA: 1, 1,5 e 3,5, respectivamente; enquanto o teor de C16:0 (%) foi de 87,5, 82,9 e 80,9, respectivamente. Os meios para as execuções 10, 11 e 12 não possuem solução de oligoelementos, este ingrediente não é apenas necessário para a
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48/63 proliferação de células de G3-1, mas também deve ser adicionado aos meios para aumentar a biossíntese lipídica e favorecer o acúmulo de lipídios com um perfil de ácidos graxos mais equilibrado, tal como a biomassa oleosa obtida nas execuções 4 e 7 (Tabela 12, Figura 8).
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Tabela 12. Perfil de ácidos graxos do óleo intracelular da cepa G3-1 em diferentes composições de meios líquidos testadas utilizando um desenho de Plackett-Burman.
Ácidos Graxos (%)
Execução C10:0 C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C22:5 n-6 DPA C22:6 n-3 DHA SFA MUFA PUFA Biomassa (g/L) TFA (g/L d)
1 3,2 3,9 3,0 78,0 2,7 1,6 6,0 92,3 0 7,7 0,5+0,02 0,04
2 1,0 4,2 1,9 77,3 1,7 2,3 9,6 87,3 0,2 12,5 3,5+0,2 0,5
3 1,3 5,1 8,1 73,4 1,6 1,5 5,9 92,5 0 7,5 1,3+0,05 0,2
4 0,1 4,8 0,4 51,9 1,1 7,4 32,5 58,9 0,2 41,0 13,2+0,1 3,5
5 0,8 3,9 1,7 73,8 1, 3,3 12,6 83,2 0,3 16,5 3,5+0,1 0,4
6 1,0 6,6 1,1 85,5 2,1 0,5 2,1 97,5 0 2,5 5,8+0,01 0,9
7 0,1 4,4 1,0 53,2 1,1 7,1 31,3 60,4 0,1 39,5 9,4+0,1 2,6
8 0,4 5,2 2,4 76,8 1,5 2,5 9,3 87,6 0,1 12,2 3,3+0,1 0,6
9 0,2 5,6 0,6 67,2 1,3 3,5 18,9 75,5 0,1 24,3 6,2+0,2 1,4
10 1,2 6,2 1,0 87,5 1,9 0,3 1,0 98,6 0,2 1,3 5,9+0,2 0,9
11 3,1 6,1 3,3 82,9 2,0 ND 1,5 98,5 0 1,5 3,1+0,2 0,5
12 1,6 5,9 4,2 80,9 1,6 0,9 3,5 95,6 0 4,4 2,5+0,04 0,4
ND não detectável
49/63
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Exemplo 10. O efeito de uma fonte complexa de nitrogênio (extrato de levedura), uma fonte de nitrogênio orgânico simples (MSG) e uma fonte de nitrogênio inorgânico simples (sulfato de amônio, (NH4) 2SO4) sobre o acúmulo de biomassa de G3-1.
[0088] As células de G3-1 mostraram a capacidade de acumular biomassa em meio líquido sem peptona de soja, mas tendo MSG e extrato de levedura como fontes de nitrogênio orgânico simples e complexo, respectivamente. Os exemplos anteriores descritos neste documento demonstraram que G3-1 requer altas concentrações de nitrogênio orgânico complexo e simples para acumular uma quantidade razoável de biomassa. A formulação de meios e o desenvolvimento de estratégias de fermentação para produzir altas concentrações de biomassa de G3-1 oleosa são imperativos no desenvolvimento de tecnologias de fermentação de microalgas para produzir produtos de valor agregado, como DHA, proteínas, carotenoides, etc.
Detalhes experimentais [0089] Neste exemplo, o efeito de três diferentes fontes de nitrogênio (extrato de levedura, MSG e (NH^SCU) no acúmulo de biomassa por G3-1 foi testado usando um design fatorial completo de dois níveis (23). A concentração das três fontes de nitrogênio (variáveis independentes) foi testada em nível alto (+) e baixo (-) (Tabela 13). Um total de oito diferentes composições de meios para o cultivo de G3-1 tendo diferentes combinações de extrato de levedura, MSG e (NH4)2SO4 foram testadas em duplicata, como descrito na Tabela 14. Com base nos exemplos anteriores e para favorecer a proliferação celular, para cada uma das oito composições dos meios testados, a concentração de glicose, NaCl, MgSCU’VHzO, solução de oligoelementos, <KH2PO4, K2HPO4, CaCl2 e vitamina B foram mantidos a 40 g L1, 2 g L1, 4 g L1, 1,5 mL L1, 1,6 g L1, 1,74 g L1, 0,5 mL L1 e 1 mL L1, respectivamente.
[0090] 95 mL de cada meio testado foram preparados seguindo a
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51/63 combinação de ingredientes mostrados na Tabela 14 e foram inoculados com alíquotas de 5 mL de culturas de G3-1 puras enxaguadas.
Tabela 13. Variáveis independentes e seus níveis utilizados no design fatorial completo (23).
Variáveis Código Xi Nível codificado
-1 + 1
Extrato de levedura (g L-1) XI 5 15
MSG (g L-1) X2 1 20
(NH4)2SO4 (g L-1) X3 5 10
abela 14. Matriz de design 23 fatorial completo e resultados de biomassa.
Execução Bloco Variável Codificada Variável de Processo Biomassa (g/L)
XI X2 X3 XI X2 X3
1 1 -1 -1 -1 5 1 5 11,5+0,2
2 1 +1 -1 -1 15 1 5 18,5+0,2
3 1 -1 +1 -1 5 20 5 29,5+0,6
4 1 +1 +1 -1 15 20 5 32,5+0,2
5 1 -1 -1 +1 5 1 10 10,5+1,0
6 1 +1 -1 +1 15 1 10 19,0+0,3
7 1 -1 +1 +1 5 20 10 29,8+0,3
8 1 +1 +1 +1 15 20 10 30,7+0,4
[0091] ANOVA dos dados de biomassa mostrou que as fontes de nitrogênio mais significativas estatisticamente (p <0,05) que influenciam o acúmulo de biomassa foram: MSG e extrato de levedura. A interação entre o MSG e o extrato de levedura também foi significativa (p <0,05), o que significa que as células de G3-1 preferem absorver o MSG primeiro e depois começam a usar o extrato de levedura como fonte de nitrogênio. A maior concentração de biomassa para este exemplo (32,5 ± 0,5 g L'1) foi obtida quando o G3-1 foi cultivado em meio contendo 15 g de extrato de levedura L’ \ 20 g de MSG L'1 e 5 g de (Nl-UhSOq L1 (execução 4, Tabela 14). A execução 8 também mostrou um bom acúmulo de biomassa (30,7 ± 0,4 g L'1), entretanto essa formulação de meio requer 50% mais de (NI-L^SOq em comparação com a corrida 4.
[0092] Com base nos resultados descritos neste exemplo, as formulações de meio para a execução 4 e 8 foram denominadas VU1 e VU2, respectivamente, e foram selecionadas para desenvolver processos de fermentação para obter dois produtos diferentes de biomassa de G3-1: (1)
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52/63 biomassa oleosa com pelo menos 60% de lipídeos e 35% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerideos nos ácidos graxos totais e (2) biomassa com pelo menos 18% de proteína verdadeira em toda a biomassa de algas. A proteína verdadeira é expressa como a soma das concentrações de aminoácidos na amostra de biomassa.
Exemplo 11. Produção de biomassa oleosa rica em ômega-3.
[0093] A formulação do meio VU1 foi selecionada para realizar uma fermentação usando um fermentador de 30 L para se obter biomassa rica em ômega-3 com aplicações em alimentos aquícolas. Nesta fermentação de 116,5 h, G3-1 produziu 98,4 g L1 de biomassa composta por 66,2% de TFA e 8% de proteína verdadeira. DHA e ácido palmítico constituíram 39,4% e 46,1% de TFA, respectivamente.
Detalhes experimentais [0094] O G3-1 foi pré-cultivado em frascos Erlenmeyer contendo 500 mL de meio de cultura (20 g de glicoseL'1, 5 g de extrato de levedura L1, 2 g de NaCl L1, 4 g de MgSO4 L1, 3 mg de sulfato de cobre L1, 2 mg de molibdato de sódio L1, 3 mg de sulfato de zinco L1, 2 mg de cloreto de cobalto (II) L1, 2 mg de cloreto de manganês L1 e 2 mg de sulfato de níquel L'1). Os frascos foram incubados sob agitação a 25° C e 200 rpm durante 2 dias. Após o período de incubação, 1 L das células pré-cultivadas foram transferidas para um meio de 19 L de VU1. A composição do meio VU1 por litro foi de: 15 g de extrato de levedura, 20 g de MSG, 5 g de (NFLhSO^ 40 g de glicose, 2 g de NaCl, 4 g de MgSO4, 1,6 g de KH2PO4, 1,75 g de K2HPO4, 3 mg de sulfato de cobre, 2 mg de molibdato de sódio, 3 mg de sulfato de zinco, 2 mg de cloreto de cobalto (II), 2 mg de cloreto de manganês, 2 mg de sulfato de níquel, 0,1 g de cloreto de cálcio desidratado, 0,01 g de cobalamina, 0,01 g de biotina e 2 g de cloridrato de tiamina. Uma fermentação descontínua foi realizada num fermentador de 30 L sob as seguintes condições: 25° C, pH 6,8, aeração a 0,5 VVM com ar atmosférico, agitação iniciando a 357 rpm e
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53/63 atingindo 447 rpm. As células foram coletadas em intervalos de 10-18 h e a biomassa, TFA, DHA e proteína foram medidos. A glicose inicial no meio foi completamente esgotada após 24 h de fermentação e nesse momento a cultura foi então alimentada com 75% (p/v) de glicose, até 116,5 h quando a fermentação foi terminada. Para esta fermentação, a produtividade para biomassa, TFA e DHA foi de: 0,84 g L1 h’1, 0,56 g L1 h'1 e 0,22 g L1 h’1, respectivamente (Tabela 15, Figura 9). Por outro lado, a biomassa no final da fermentação tinha 8% de proteína verdadeira.
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Tabela 15. Produção de óleo e perfil de ácidos graxos do óleo intracelular de MARA G3-1. As células foram cultivadas em um fermentador de 30L usando meio YU 1.
Ácidos Graxos (%) Produtividade (g/L h)
Tempo (h) TFA (%) C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C20:5 (n- 3) EPA C22:5 (n6) DPA C22:6 (n3) DHA Biomassa (g/L) TFA (mg/g) Biomassa TFA DHA C16:0
22 27 2,7 0,6 43,4 1,3 0,3 6,7 42 26 269,5
48 44,1 3,3 0,4 44,5 1,3 0,4 6,7 40,4 57 441,3
72,5 57,7 2,8 0,2 42,4 1,3 0,4 7,3 42,5 87,4 577,3
96 60,6 3,2 0,2 46,7 1,4 0,4 6,7 38,6 96,8 605,9
116,5 66,2 3,1 0,2 46,1 1,4 0,5 6,7 39,4 98,4 662,2 0,84 0,56 0,22 0,26
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55/63 [0095] A tecnologia de fermentação desenvolvida para produzir biomassa oleosa rica em ômega-3 de G3-1 pode atingir facilmente uma produtividade de > 15 g/L d em biomassa, 66% de lipídios e > 39% de DHA em 4,9 dias. Uma biomassa com esta composição poderia ser usada para alimentar peixes em ensaios in vivo para avaliar sua adequação como um produto alimentício de aquicultura rico em DHA para peixes de viveiro.
Exemplo 12. Produção de biomassa de microalgas rica em ômega-3 com maior teor de proteína [0096] A formulação do meio VU2 foi selecionada para realizar uma fermentação usando um fermentador de 30 L para se obter biomassa rica em ômega-3 rica em proteína. Um produto de biomassa com alto teor de DHA e alto teor de proteína contendo ainda 30-45% de lipídios tem o potencial de ser usado como um produto alimentício de aquicultura. Nesta fermentação de 72 h, G3-1 produziu 93,4 g L1 de biomassa composta por 43,6% de TFA, 47,8% de DHA, 36,9% de ácido palmítico e 18,6% de proteína verdadeira.
Detalhes experimentais [0097] O G3-1 foi pré-cultivado em frascos Erlenmeyer contendo 500 mL de meio de cultura (20 g de glicoseL’1, 5 g de extrato de levedura L1, 2 g de NaCl L1, 4 g de MgSCU L1, 3 mg de sulfato de cobre L1, 2 mg de molibdato de sódio L1, 3 mg de sulfato de zinco L1, 2 mg de cloreto de cobalto (II) L1, 2 mg de cloreto de manganês L1 e 2 mg de sulfato de níquel L·1). Os frascos foram incubados sob agitação a 25° C e 200 rpm durante 2 dias. Após o período de incubação, 1 L das células pré-cultivadas foram transferidas para um meio de 19 L de VU2. A composição do meio VU2 por litro foi de: 15 g de extrato de levedura, 20 g de MSG, 10 g de (NH^SO^ 40 g de glicose, 2 g de NaCl, 4 g de MgSO4, 1,6 g de KH2PO4, 1,75 g de K2HPO4, 3 mg de sulfato de cobre, 2 mg de molibdato de sódio, 3 mg de sulfato de zinco, 2 mg de cloreto de cobalto (II), 2 mg de cloreto de manganês, 2 mg de sulfato de níquel, 0,1 g de cloreto de cálcio desidratado,
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0,01 g de cobalamina, 0,01 g de biotina e 2 g de cloridrato de tiamina. Uma fermentação descontínua foi realizada num fermentador de 30 L sob as seguintes condições: 25° C, aeração a 0,5 VVM com ar atmosférico, agitação iniciando a 357 rpm e atingindo 370 rpm. Finalmente, o pH da cultura foi mantido em tomo de 6,2 usando-se uma solução aquosa de hidróxido de amônio. As células foram coletadas em intervalos de 6-18 h e a biomassa, TFA, DHA e proteína foram medidos. A glicose inicial no meio foi completamente esgotada após 22 h de fermentação e nesse momento a cultura foi então alimentada com 75% (p/v) de glicose, até 72 h quando a fermentação foi terminada. Para esta fermentação, a produtividade para biomassa, TFA e DHA foi de: 1,3 g L1 h’1, 0,57 g L1 h'1 e 0,27 g L1 h’1, respectivamente (Tabela 16, Figura 10).
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Tabela 16. Produção de óleo e perfil de ácidos graxos do óleo intracelular de MARA G3-1. As células foram cultivadas em um fermentador de 30 L usando meio VU2.
Ácidos Graxos (%) Produtividade (g/L h) Proteína verdadeira (%)
Tempo (h) TFA (%) C14:0 C15:0 C16:0 C18:0 C20:5 (n- 3) EPA C22:5 (n-6) DPA C22:6 (n3) DHA Biomassa (g/L) TFA (mg/g) Biomassa TFA DHA C16:0
24 17 1,9 0,4 37,1 1,2 0,3 8,2 47,4 27,8 170,4
42 25,8 2,5 0,3 39,6 1,2 0,4 7,7 44,9 54,2 257,8
48 30,2 2,5 0,2 37,7 1,1 0,4 8,0 46,9 62,4 302,2
66 42,7 3,0 0,2 37,3 1,0 0,4 7,5 47,5 86,0 426,6
72 43,6 2,9 0,2 36,9 1,0 0,4 7,6 47,8 93,4 435,6 1,3 0,57 0,27 0,21 18,6
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58/63 [0098] O processo de fermentação descrito neste exemplo produziu um produto de biomassa de G3-1 não só rico em ômega-3 DHA mas também com um maior teor de proteína comparado com o produto descrito como biomassa oleosa de G3-1 rica em ômega-3. O cultivo de G3-1 em meios VU2 e uso de uma solução aquosa de hidróxido de amônio para controlar o pH e também para pulsar nitrogênio no recipiente não só modificou a razão C/N no caldo de fermentação, como também favoreceu as vias metabólicas de nitrogênio nas células, o que, por sua vez, limitou a capacidade de G3-1 em sintetizar lipídios, aumentando o teor de proteína de G3-1. 31,1 g/L d de produtividade em biomassa, 43,6% de lipídio, > 47% de DHA e 18,6% de proteína verdadeira podem ser facilmente alcançados em 3 dias seguindo-se a tecnologia de fermentação descrita neste exemplo.
Exemplo 13. Produção de biomassa de G3-1 com baixo teor de lipídios e aumento de DHA e EPA (expresso em percentual do total de ácidos graxos) pelo uso de glicerol bruto proveniente da produção de biodiesel.
[0099] O uso potencial de glicerol bruto para cultivar microrganismos oleaginosos tem crescido em popularidade, essencialmente para reduzir os custos de cultivo. Simultaneamente, a necessidade de valorizar o glicerol como um coproduto do biodiesel surgiu como resultado do boom do biocombustível. Dependendo da matéria-prima e do processo usado para produzir biodiesel, os contaminantes presentes no glicerol bruto variam. Os mais comuns são metanol e sabão, mas também alta salinidade. Como consequência, toneladas de glicerol bruto precisam ser valorizadas ou classificadas como resíduos industriais. A alta salinidade do glicerol bruto tem efeitos indesejáveis em muitos organismos, no entanto, favorece o uso de microalgas marinhas. Processos de fermentação baseados em glicerol bruto como fonte de carbono visando obter maiores quantidades de metabólitos de valor agregado, como PUFAs, particularmente EPA e DHA, são os de maior valor (Abad e Turon, Mar. Drugs. 13:7275 (2015)). Esforços anteriores para
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59/63 usar glicerol bruto em bioprocessos de fermentação de microalgas marinhas focaram na produção de altas concentrações de lipídios intracelulares, entretanto, há pouca informação sobre o uso de um processo de fermentação para retardar a acumulação de óleo em microrganismos oleaginosos usando glicerol bruto como fonte de carbono. Neste exemplo, utilizou-se uma matéria prima de glicerol em bruto com 1120 g de glicerol L1 em combinação com uma formulação de meio líquido denominada VU3 para cultivar G3-1 sob condições heterotróficas. Nesta fermentação de 118,5 h, G3-1 produziu 61,7 g L·1 de biomassa composta por 15,6% de TFA, 55% de DHA, 19,7% de ácido palmítico e 4,1 % de EPA.
Detalhes experimentais [00100] O G3-1 foi pré-cultivado em frascos Erlenmeyer contendo 250 mL de meio de frasco de semente (20 g de glicose L1, 5 g de extrato de levedura L1, 2 g de NaCl L1, 4 g de MgSCU L1, 1 g de MSG L1, e 3 mg de sulfate de cobre L1, 2 mg de molibdato de sódio L1, 3 mg de sulfato de zinco L·1, 2 mg de cloreto de cobalto (II) L1, 2 mg de cloreto de manganês L1 e 2 mg de sulfato de níquel L’1). Os frascos foram incubados sob agitação a 25° C e 200 rpm durante 2 dias. Após o período de incubação, 0,14 L das células pré-cultivadas foram transferidas para 1,26 L de meio VU3. A composição do meio VU3 por litro foi de: 2 g de extrato de levedura, 5 g de MSG, 10 g de (NI-LhSOq, 66 g de glicerol bruto, 2 g de NaCl, 4 g de MgSOq, 1,6 g de KH2PO4, 1,75 g de K2HPO4, 3 mg de sulfato de cobre, 2 mg de molibdato de sódio, 3 mg de sulfato de zinco, 2 mg de cloreto de cobalto (II), 2 mg de cloreto de manganês, 2 mg de sulfato de níquel, 0,1 g de cloreto de cálcio desidratado, 0,01 g de cobalamina, 0,01 g de biotina e 2 g de cloridrato de tiamina. Uma fermentação descontínua foi realizada num fermentador de 2L sob as seguintes condições: 25° C, aeração a 1 VVM com ar atmosférico, agitação iniciando a 550 rpm e atingindo 710 rpm. Durante as primeiras 65,75 h de fermentação, o pH da cultura foi mantido em tomo de 6,16-6,26, por
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60/63 meio da utilização de uma solução aquosa de hidróxido de amônio. Em seguida, a solução de hidróxido de amônio foi trocada por NaOH 5 M para manter o pH em tomo de 6,05 até 188,5 h de fermentação. As células foram coletadas em intervalos de 6-18 h e a biomassa, TFA, ácido palmítico, DHA e EPA foram medidos. A glicose inicial no meio foi completamente depletada após 40 h de fermentação e então a cultura foi então alimentada com 1120 g de glicerol bruto L1 até 188,5 h, quando a fermentação foi interrompida. No final do processo, a produtividade para biomassa e TFA foi de 0,33 g L1 h'1 e 0,05 g L1 h’1. Por outro lado, o teor de DHA e EPA (expresso em % de TFA) foi de 55% e 4,1%. Nos exemplos anteriores, o G3-1 mostrou baixa capacidade de acumular EPA na sua fração lipídica com teores variando de 0,5 a 1% de TFA quando a glicose foi usada como fonte de carbono. Entretanto, nas condições descritas neste exemplo, a quantidade de EPA sintetizada por G3-1 foi 3 vezes maior (Tabela 17, Figura 11). Condições adversas de cultura tais como deficiência de nutrientes ou compostos tóxicos no meio líquido estimularam a síntese de EPA pelos traustoquitrídios. Supõese que a bios síntese de EPA e outros PUF As por traustoquitrídios fornece poder antioxidante para proteger as células quando submetidas a estresse oxidativo (Ugalde et al., J. Appl. Phycol. (2017)).
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Tabela 17. Produção de óleo e perfil de ácidos graxos do óleo intracelular de MARA G3-1. As células foram cultivadas em um fermentador de 2L usando meio VU3 e bruto como fonte de car bono.
Ácidos Graxos (%) Produtividade (g/L h)
Tempo (h) TFA (%) C14:0 C16:0 C18:0 C18:l oleico C20:5 (n-3) EPA C22:5 (n-6) DPA C22:5 (n-3) DPA C22:6 (n-3) DHA Biomassa (g/L) TFA (mg/g) Biomassa TFA DHA C16:0
40,5 17,9 2,0 30,8 1,1 0,2 0,8 9,5 0,3 51,7 36,9 178,7
65,75 12,4 1,0 20,8 0,7 0,2 2,8 11,6 0,8 58,8 27,8 124,2
92,50 13,3 1,6 24,1 0,8 0,7 3,5 10,9 1,0 53,0 47,6 132,7
113,5 14,4 1,4 22,6 0,8 1,1 3,8 11,0 1,1 53,2 53,9 143,5
137 15,1 1,3 21,7 0,8 1,2 4,0 11,1 1,2 53,6 57,4 151,0
163,75 15,1 1,2 20,3 0,8 1,2 4,1 11,4 1,3 54,6 59,8 151,3
188,5 15,6 1,2 19,7 0,8 1,2 4,1 11,5 1,4 55,0 61,7 155,9 0,33 0,05 0,03 0,01
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62/63 [00101] 74,5 mL de uma solução de hidróxido de amônio foram pulsados no recipiente de 2 L durante as primeiras 65,75 h de fermentação. De 65,75 h a 188,5 h, a solução de hidróxido de amônio foi trocada por uma solução de NaOH 5 M para manter o pH em tomo de 6,05 e fazer com que as células de G3-1 acumulassem lipídios. Como visto na Tabela 17, pulsar o nitrogênio na forma de hidróxido de amônio ajudou a aumentar o conteúdo de biomassa, no entanto, a troca da solução de hidróxido de amônio por NaOH 5M e manutenção da fermentação por cinco dias não favoreceu o acúmulo de lipídios nas células de G3-1. As células de G3-1 captam nitrogênio na forma de hidróxido de amônio, mas parece que o catabolismo do hidróxido de amônio interfere nas vias de biossíntese lipídica em G3-1. Por outro lado, não apenas o sulfato de amônio, mas o glicerol bruto usado como matéria-prima de carbono podería ter estressado as células de G3-1. O glicerol bruto usado no presente exemplo contém 0,8% de metanol e alta salinidade, e essas impurezas atuam como fatores de estresse mesmo para microalgas marinhas que podem tolerar ambientes de alta salinidade. Foi relatado que o estresse abiótico frequentemente faz com que os aminoácidos, que servem como potenciais atenuadores de estresse, se acumulem. Além de serem os blocos construtivos das proteínas, os aminoácidos servem como precursores de moléculas contendo N, tais como ácidos nucleicos, poliaminas, compostos de amônio quaternários e alguns hormônios. Sob estresse ambiental, a síntese proteica de novo é geralmente inibida e a movimentação proteica e a atividade proteolítica são aumentadas, resultando em um aumento de aminoácidos livres totais. Os metabolismos N e C estão intimamente ligados; a assimilação de N e a biossíntese de aminoácidos requerem equivalentes redutores do metabolismo de carbono (por exemplo, glicose, glicerol, etc.) e esqueletos C do ciclo de ácido tricarboxílico (TCA) (Chen et al., Biotechnol. Biofuels 10:153 (2017)). No final da fermentação (por exemplo, às 188,5 h), as células de G3-1 acumularam 15,6% de lipídios intracelulares (Tabela 17), embora as
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63/63 células de G3-1 tenham consumido 160,5 g de glicerol bruto. Parece que a energia e os esqueletos C gerados a partir do metabolismo de glicerol bruto não foram utilizados para o acúmulo de lipídios, mas foram redirecionados para diferentes vias metabólicas nas células de G3-1.

Claims (36)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Cultura, caracterizada pelo fato de que compreende (a) um microrganismo eucariótico produtor de lipídios com uma sequência 18S, em que a sequência 18S tem pelo menos 98% de identidade com a sequência apresentada na SEQ ID NO: 1, e (b) um meio heterotrófico que traz por resultado o microrganismo eucariótico produtor de lipídios possuir um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs).
  2. 2. Cultura de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende triglicerídeos e em que mais de 95% dos triglicerídeos são constituídos por ácido mirístico (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAnó) e ácido docosa-hexaenoico (C22:6n-3, DHA).
  3. 3. Cultura de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende menos de 3% de cada um dentre ácido láurico (Cl2:0), ácido pentadecílico (Cl5:0), ácido palmitoleico (C16:l), ácido margárico (C17:0), ácido esteárico (C18:0), ácido vacênico (C18:ln-7), ácido oleico (C18:ln-9), ácido γ-linolênico (C18:3n-6), ácido α-linolênico (C18:3n-3), ácido estearidônico (C18:4), ácido araquídico (C20:0), ácido di-homo-y-linolênico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n6, ARA), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3, EPA),ácido beênico (C22:0), ácido docosatetraenoico (C22:4), ácido docosapentaenoico n3 (C22:5n-3, DPAn3), e ácido lignocérico (C24:0).
  4. 4. Cultura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
    3, caracterizada pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende menos de 0,02% de ácidos graxos de cadeia curta.
  5. 5. Cultura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a
    4, caracterizada pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende pelo menos 35% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
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    2/5
  6. 6. Cultura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 20% de proteína em toda a biomassa de algas.
  7. 7. Cultura de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 20 a 40% de proteína da biomassa.
  8. 8. Cultura de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos cerca de 40% de proteína.
  9. 9. Cultura de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta ainda na produção de pelo menos cerca de 10% de C22:6n-3 (DHA).
  10. 10. Cultura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 30% de ácido palmítico.
  11. 11. Cultura de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta na produção de pelo menos 40% de ácido palmítico.
  12. 12. Cultura de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o meio heterotrófico resulta na produção de um ou mais carotenoides.
  13. 13. Cultura de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que o um ou mais carotenoides compreende β-caroteno, e em que β-caroteno compreende pelo menos 95% do total de carotenoides.
  14. 14. Microrganismo eucariótico, caracterizado pelo fato de que possui, num meio heterotrófico, um perfil lipídico simples compreendendo ácidos graxos de cadeia longa (LCFAs).
  15. 15. Microrganismo eucariótico de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende mais
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    3/5 de 3% de cada um dentre miristato (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido docosapentaenoico n-6 (C22:5n-6, DPAnó), e ácido docosaexanoico (C22:6n3, DHA).
  16. 16. Microrganismo eucariótico acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende menos de 3% de cada um dentre ácido láurico (Cl2:0), ácido pentadecílico (C15:0), ácido palmitoleico (C16:l), ácido margárico (C17:0), ácido esteárico (C18:0), ácido vacênico (C18:ln-7), ácido oleico (C18:ln-9), ácido γlinolênico (C18:3n-6), ácido α-linolênico (C18:3n-3), ácido estearidônico (C18:4), ácido araquídico (C20:0), ácido di-homo-y-linolênico (C20:3n-6), ácido araquidônico (C20:4n-6, ARA), ácido eicosapentaenoico (C20:5n-3, EPA),ácido beênico (C22:0), ácido docosatetraenoico (C22:4), ácido docosapentaenoico n3 (C22:5n-3, DPAn3), e ácido lignocérico (C24:0).
  17. 17. Microrganismo eucariótico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizado pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende menos de 0,02% de ácidos graxos de cadeia curta.
  18. 18. Microrganismo eucariótico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 17, caracterizado pelo fato de que o perfil lipídico simples compreende pelo menos 35% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
  19. 19. Microrganismo eucariótico de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 18, caracterizado pelo fato de que o microrganismo eucariótico produz uma biomassa de pelo menos 20% de proteína.
  20. 20. Microrganismo eucariótico de acordo com a reivindicação
    19, caracterizado pelo fato de que a biomassa é pelo menos 20 a 40% de proteína.
  21. 21. Microrganismo eucariótico de acordo com a reivindicação
    20, caracterizado pelo fato de que a biomassa é pelo menos cerca de 40% de proteína.
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    4/5
  22. 22. Microrganismo eucariótico de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o microrganismo eucariótico produz pelo menos cerca de 10% de C22:6n-3 (DHA) nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
  23. 23. Microrganismo eucariótico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 22, caracterizado pelo fato de que o microrganismo eucariótico produz pelo menos 30% de ácido palmítico nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
  24. 24. Microrganismo eucariótico de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o microrganismo eucariótico produz pelo menos 40% de ácido palmítico nos triglicerídeos nos ácidos graxos totais.
  25. 25. Microrganismo eucariótico de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 24, caracterizado pelo fato de que o microrganismo eucariótico produz um ou mais carotenoides.
  26. 26. Microrganismo eucariótico de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que o um ou mais carotenoides compreende βcaroteno, e em que β-caroteno compreende pelo menos 95% dos carotenoides.
  27. 27. Microrganismo eucariótico, caracterizado pelo fato de que possui o N° de Acesso ID AC 220716-01.
  28. 28. Método para fazer uma composição lipídica, caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultivar o microrganismo eucariótico como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 27 num meio heterotrófico para produzir pelo menos 35% de DHA, (b) e isolar a composição lipídica.
  29. 29. Método de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o meio heterotrófico contém menos de 3,75 g/L de cloreto.
  30. 30. Método de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que a produtividade de biomassa dos
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    5/5 microrganismos cultivados é superior a 0,65 g/L/h.
  31. 31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 30, caracterizado pelo fato de que a produtividade de triglicerídeos dos microrganismos cultivados é superior a 0,3 g/L/h.
  32. 32. Método de utilização da composição lipídica de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que compreende incorporar a composição lipídica num produto alimentício.
  33. 33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é uma ração para animais de estimação, uma ração para gado ou uma ração para aquicultura.
  34. 34. Método para produzir uma biomassa rica em proteínas, caracterizado pelo fato de que compreende (a) cultivar o microrganismo como definido em qualquer uma das reivindicações 14 a 27 num meio heterotrófico e (b) isolar a biomassa rica em proteínas.
  35. 35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que compreende ainda incorporar a biomassa rica em proteína num produto alimentício.
  36. 36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o produto alimentício é uma ração para animais de estimação, uma ração para gado ou uma ração para aquicultura.
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