JP5451387B2 - グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ｇｐａｔ）ホモログとその利用 - Google Patents

グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ｇｐａｔ）ホモログとその利用 Download PDF

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Description

本出願は、２００７年６月１８日に出願された日本国特許出願２００７−１６００４２に基づく優先権を主張する。
本発明は、新規なグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素遺伝子に関する。
脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等、脂質を構成する重要な成分である。不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と総称され、アラキドン酸やジホモγリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が知られており、様々な生理活性が報告されている（非特許文献１）。この高度不飽和脂肪酸は様々な分野での利用が期待されているが、動物体内で合成できないものも含まれている。そこで、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。また、植物で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。こうした場合、高度不飽和脂肪酸は、例えばトリアシルグリセロール等の貯蔵脂質の構成成分として、微生物の菌体内若しくは植物種子中に蓄積されることが知られている。
より詳細には、トリアシルグリセロールは、生体内で以下のとおり生成される。すなわち、グリセロール−３−リン酸がグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素によりアシル化されてリゾホスファチジン酸となり、このリゾホスファチジン酸がリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりアシル化されてホスファチジン酸となり、このホスファチジン酸がホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されてジアシルグリセロールとなり、このジアシルグリセロールがジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりアシル化されてトリアシルグリセロールとなる。また、アシルＣｏＡ：コレステロールアシル基転移酵素やリゾホスファチジルコリンアシル基転移酵素等が間接的にトリアシルグリセロールの生合成に関与することが知られている。
上述のトリアシルグリセロール生合成経路やリン脂質生合成経路において、グリセロール−３−リン酸のアシル化によりリゾホスファチジン酸（lysophosphatidic acid）が生成する反応には、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（以下、「GPAT」と記載する場合もある。：EC 2.3.1.15）が介在することが知られている。
GPAT遺伝子はこれまでにいくつかの生物で報告されている。哺乳動物由来のGPAT遺伝子として、小胞体型（膜結合型）とミトコンドリア型（膜結合型）の２種類がクローン化されている（非特許文献２）。また、植物由来のGPAT遺伝子として小胞体型（膜結合型）、ミトコンドリア型（膜結合型）及び葉緑体型（遊離型）の３種類がクローン化されている（非特許文献３）。その他、真菌であるSaccharomyces cerevisiae 由来のGPAT遺伝子として、小胞体型（膜結合型）のGPT2（GAT1）及びSCT1（GAT2）の２種類がクローン化されている（非特許文献４）。ここで、GPT2はパルミチン酸（16:0）からオレイン酸（18:1)に至るまで、幅広い範囲の脂肪酸を基質として利用できる活性を有するのに対し、SCT1はパルミチン酸（16:0）、パルミトレイン酸（16:1）といった炭素数１６の脂肪酸を基質とすることに強い選択性を有することが示されている（非特許文献４）。また、その他多くの生物からGPAT遺伝子はクローン化されている。
脂質生産菌であるモルティエレラ（Mortierella）属微生物由来のGPATも報告されている。Mortierella ramanniana由来のGPATについては、小胞体型GPATが単離され、これがパルミチン酸（16:0）よりもオレイン酸（18:1）を５．４倍多く選択的にアシル基供与体として利用することが示されている（非特許文献５）。Mortierella alpina（以下、「M. alpina」と記載する場合もある。）由来のGPATについては、ミクロソーム画分にグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性があることが報告されている（非特許文献６）。また、M. alpinaのミクロソームに存在するGPAT（膜に結合している状態）と種々のアシルＣｏＡをインビトロで反応させると高い活性を維持したまま、オレイン酸（18:1）、リノール酸（18:2）、ジホモγリノレン酸（DGLA）（20:3）、アラキドン酸（20:4）といったＰＵＦＡを広く基質として用いることが示されている（特許文献１）。さらに、M. alpina (ATCC #16266）からクローニングされたGPATを、エイコサペンタエン酸（EPA）まで生合成できるよう形質転換されたYarrowia lipolyticaで発現させたところ、総脂肪酸の内、ジホモγリノレン酸（DGLA）（20:3）の組成が大きくなり、オレイン酸（18:1）の組成が小さくなることが示された。この結果は、より長鎖で不飽和度の高いＰＵＦＡが選択的に取り込まれていることを示すものである（特許文献２）。
国際公開第ＷＯ２００４／０８７９０２号パンフレット 米国特許出願公開第２００６／００９４０９１号明細書 Lipids, 39, 1147 (2004) Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 17-26, 1997 Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 10-16, 1997 The Journal of Biological Chemistry, 276 (45), 41710-41716, 2001 The Biochemical Journal, 355, 315-322, 2001 Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000
しかしながら、これまでに報告されているGPAT遺伝子は、宿主細胞に導入して発現させても、その基質特異性により、宿主が産生する脂肪酸組成物は限られていた。そこで、これまでとは異なる組成の脂肪酸組成物を産生しうる、新規な遺伝子を同定することが求められている。
本発明の目的は、宿主細胞で発現又は導入することで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりできるようなタンパク質及び核酸を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Mortierella alpinaのＥＳＴ解析を行い、そのなかから既知のGPAT遺伝子と同一性の高い配列を抽出した。さらに、GPATをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより遺伝子をクローニングした。それを酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して所望の脂肪酸組成物の産生を試みた発明者は、従来のGPATが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、異なる脂肪酸組成物を生成させることができる、基質特異性が異なる新規なGPATに関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１） 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（２） 以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれかである塩基配列を含む、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
（３） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の塩基配列又はそのフラグメントを含む核酸。
（ａ）配列番号４で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列
（４） 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
（ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｃ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｄ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（５） 以下の(ａ)〜(ｃ)のいずれかである塩基配列を含む、（４）に記載の核酸。
（ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｃ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（６） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（７） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（８） 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（９） （１）〜（５）のいずれか１つに記載の核酸を含有する組換えベクター。
（１０） （９）に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
（１１） （１０）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物であって、前記脂肪酸組成物の脂肪酸組成において、以下のi)〜v)のうちの少なくとも一つ以上が、（９）の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物の前記比率より高いことを特徴とする、前記脂肪酸組成物。
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
（１２） （１０）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、（１１）に記載の脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法。
（１３） （１１）に記載の脂肪酸組成物を含む、食品。
本発明のGPATは、従来のGPATとは基質特異性が異なり、従来のGPATが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物とは組成が異なる脂肪酸組成物を宿主中に産生させることができる。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
また、本発明のGPATは脂肪酸や貯蔵脂質の生産能の向上を図ることができるため、微生物や植物中での高度不飽和脂肪酸の生産性を向上させるものとして、好ましい。
【００１８】
【図１】 図１は、本発明のGPAT2のｃＤＮＡ配列（配列番号１）と推定アミノ酸配
列（配列番号２）を示す。図中、＊はGPAT活性に重要であると考えられるアミノ酸残基を示し、＋はグリセロール−３−リン酸との結合に重要であると考えられるアミノ酸残基を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
本発明は、グリセロール−３−リン酸をアシル化して、リゾホスファチジン酸を生成させることを特徴とする、Mortierella属由来の新規なグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素遺伝子に関する。
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（GPAT）は、グリセロール−３−リン酸をアシル化して、リゾホスファチジン酸を生成する反応を触媒する酵素である。アシル基供与体は、通常、アシルＣｏＡであるが、これに限定されない。また、本発明に係るタンパク質が作用することによるアシル基転移反応のアシル基受容体は、グリセロール−３−リン酸であるが、これに限定されない。
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（GPAT）には、GPAT2が含まれる。GPAT2をコードする核酸のｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及びアミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。
Figure 0005451387
つまり、本発明のGPAT2に関連する配列としては、GPAT2のアミノ酸配列である配列番号２、GPAT2のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号４、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号３、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号１があげられる。このうち、配列番号３は配列番号１の第１１３−１８９１番目の塩基配列に相当し、配列番号４は配列番号１の第１１３−１８８８番目の塩基配列、及び配列番号３の１−１７７６番目の塩基配列に相当する。
本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号４で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号１で示される塩基配列等があげられる。
配列番号４で示される塩基配列及び配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、及び、配列番号１で示される塩基配列は、表１に記載したとおりである。
上記塩基配列を得るためには、GPAT活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のGPAT活性を有するタンパク質と同一性の高いタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。GPAT活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これに限定されない。
ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてpoly（Ａ）＋ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
ＯＲＦの塩基配列で比較すると、本発明のGPAT2遺伝子と公知のM. alpina（ATCC #16266）由来のGPAT1遺伝子との同一性は４２．０％である。なお、本発明のGPAT2遺伝子をBLASTX解析した結果、最もE-valueの低かった、すなわち同一性の高かったAspergillus nidulans由来の１−アシル−sn−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素様の推定タンパク質配列（GBアクセッションNo. EAA62242）、及び機能が明らかにされているタンパク質で最も同一性の高かったSaccharomyces cerevisiae由来のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素であるSct1p（GBアクセッションNo. CAC85390）、をコードする塩基配列との同一性は、それぞれ３６．９％と３６．６％である。
同様に、本発明のGPAT2と公知のM. alpina（ATCC #16266）由来のGPAT1との間のアミノ酸配列の同一性は１５．７％である。なお、本発明のGPAT2遺伝子をBLASTX解析した結果、最もE-valueの低かった、すなわち同一性の高かったAspergillus nidulans由来の１−アシル−sn−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素様の推定タンパク質配列（GBアクセッションNo. EAA62242）、及び機能が明らかにされているタンパク質で最も同一性の高かったSaccharomyces cerevisiae由来のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素であるSct1p（GBアクセッションNo. CAC85390）、との同一性は、それぞれ１７．０％と１５．０％である。
本発明はまた、上記配列番号４で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）、並びに、配列番号２で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が、GPAT活性を有することを意味する。また、このGPAT活性に加えて、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は、本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下の
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率、並びに
v） アラキドン酸および／またはジホモγリノレン酸の含有量の比率
のうちの少なくとも一つ以上が、上記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質（以下、「本発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質」という場合もある）である場合も含まれる。
具体的には、上記本発明の塩基配列等を発現ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）に挿入したものを、酵母Saccharomyces cerevisiae EH13-15株(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)を宿主として形質転換させ、得られた形質転換体を培養して回収した菌体を、以下の実施例６等に記載の方法で脂肪酸解析をした場合の上記本発明のGPATの脂肪酸組成が、具体的に、以下の
i) オレイン酸含有量が４７％以上、好ましくは４８％以上、４９％以上、５０％以上、５１％以上；
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率が８．０以上、好ましくは９．０以上、１０．０以上、１０．５以上；
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の含有量の比率が８．５以上、好ましくは９．０以上、１０．０以上、１１．０以上、１１．５以上；並びに
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率が１．２以上、好ましくは１．３以上、１．４以上；並びに
ｖ） アラキドン酸の含有率が、０．４７以上、好ましくは０．５０以上、０．５５以上、０．６０以上、及び／または、ジホモγリノレン酸の含有率が、０．３４以上、好ましくは０．４０以上、０．５０以上、０．５５以上
のうちの少なくとも一つ以上の数値を満たす脂肪酸組成を形成できるような活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸である。さらに好ましくは、本発明の塩基配列等は、GPAT活性及び上記本発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
本発明の脂肪酸組成物の特徴の一つとして、アラキドン酸含有率が高いことがあげられる。アラキドン酸は、化学式Ｃ２０Ｈ３２Ｏ２で示される、分子量３０４．４７の物質で、４つの二重結合を含む２０個の炭素鎖からなるカルボン酸（〔２０：４（ｎ−６）〕）で、（ｎ−６）系に分類される。アラキドン酸は、動物の細胞膜中の重要なリン脂質（特にホスファチジルエタノールアミン・ホスファチジルコリン・ホスファチジルイノシトール）として存在し、脳に多く含まれる。またアラキドン酸は、アラキドン酸カスケードにより生成するプロスタグランジン・トロンボキサン・ロイコトリエンなど一連のエイコサノイドの出発物質であり、細胞間のシグナル伝達におけるセカンドメッセンジャーとしても重要である。一方、アラキドン酸は、動物ではリノール酸を原料として体内で合成される。しかし、動物の種あるいは年齢等によっては、この機能が十分でないため必要な量を生産することかできないか、あるいは全く生産する機能がないため、食物からアラキドン酸を摂取しなければならず、アラキドン酸は必須脂肪酸であるといえる。
本発明の脂肪酸組成物中のアラキドン酸含有率は、例えば、以下のように測定することができる。すなわち、本発明のGPAT2のプラスミドを、例えば、実施例８に記載の方法によりpDuraSCやpDura5MCS等のベクターに挿入し、M. alpina株で形質転換して得られた形質転換体を発現させて、実施例８に記載した培養方法等に従って得られた培養菌体を用いて菌体内の脂肪酸含有率や培地あたりのアラキドン酸の含有量等を測定する方法である。アラキドン酸の含有量等の分析方法としては、例えば、得られた培養菌体の脂肪酸を塩酸メタノール法により脂肪酸メチルエステルに誘導したあと、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで行う方法があげられる。これによれば、本発明のGPAT2をM. alpinaで形質転換させた場合は、菌体内の脂肪酸含有率も培地あたりのアラキドン酸生産量も高いことが示されている。このように、アラキドン酸含有率が高い本発明の脂肪酸組成物は、アラキドン酸を効率よく摂取できるため、好ましい。
また、本発明の脂肪酸組成物の特徴の一つとして、ジホモγリノレン酸含有率が高いことがあげられる。ジホモγリノレン酸（ＤＧＬＡ）は、化学式Ｃ２０Ｈ３４Ｏ２で示される、分子量３０６．４８の物質で、３つの二重結合を含む２０個の炭素鎖からなるカルボン酸（〔２０：３（ｎ−６）〕）で、（ｎ−６）系に分類される。ＤＧＬＡは、γ−リノレン酸（１８：３（ｎ−６））が伸張することによって得られる。ＤＧＬＡの二重結合が１つ増えるとアラキドン酸が生成される。
このような本発明の核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。なお、以下にあげる塩基配列の記載において、「本発明の上記活性」とは、上記の「GPAT活性及び/又は上記本発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性」を意味する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
具体的には、
(i) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜180個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば1〜180個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２に示すアミノ酸配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば1〜180個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
保存的置換は、一般的には、生物学的合成系や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。特に、本発明では、図１中に二重下線で示したように、本発明のGPATのアミノ酸配列中の第８７〜９３残基に、グリセロリン脂質アシル基転移酵素（Glycerolipid acyltransferase）に必須の保存モチーフである「ＨＸＸＸＸＤ（ＨＸ４Ｄ）」（J. Bacteriology, 180, 1425-1430, 1998）に類似のモチーフが存在する（保存されるヒスチジン及びアスパラギン酸を＊で示す）。なお、上記保存モチーフ中で、Ｘはいかなるアミノ酸残基であってもよいことを示している。このモチーフは本発明のGPATにとっても、GPAT活性を維持するために重要であると考えられる。また、図１中において＊で示した、本発明のGPATのアミノ酸配列中の第８７残基、第９３残基、及び第１７２残基は、本発明のGPATの活性に重要であると考えられる。さらに、第１３８残基及び第１７４残基は、本発明のGPATとグリセロール−３−リン酸との結合に重要であると考えられる。従って、本発明の変異体は、上記保存モチーフ及び上記に示した残基が保存されている限り、いかなる変異体であってもよい。
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
上記したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、GPAT活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
また、本発明の核酸に含まれる塩基配列には、配列番号２において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、GPAT活性、又は本発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性が保持される限り制限はない。
本発明のGPAT活性、又は本発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性は、公知の方法を用いて測定することが可能である。例えば、以下の文献：Biochem. J., 355, 315-322, 2001を参照することができる。
例えば、本発明の「GPAT活性」は以下の通り測定してもよい。本発明のGPATを発現させた酵母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)に記載の方法等によりミクロソーム画分を調製する。そして、反応液である、０．４４ｍＭ グリセロール−３−リン酸 、０．３６ｍＭ アシル−ＣｏＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に上記ミクロソーム画分を添加し、２８℃で適当な時間反応させ、クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したリゾホスファチジン酸量を定量することができる。
また、本発明の「GPATの脂肪酸組成を形成できる活性」は、例えば以下のように測定してもよい。本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。
（ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。配列番号４及びGPAT活性については上記のとおりである。
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
本発明に含まれる塩基配列としては、好ましくは、配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、GPAT活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
（ｃ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号４に示される核酸配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
好ましくは、配列番号４に示される核酸配列に対して少なくとも７５％、さらに好ましくは８０％（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。本発明の核酸がコードするタンパク質は、本発明の上記活性を有するタンパク質と同等の機能を有する限り、GPAT2のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。
具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％（例えば、９５％、さらには、９８％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。さらに好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びClustalW等があげられる。特に、BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI(Infomax)等のプログラムを用いて決定することもできる。
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。本発明の核酸に含まれる塩基配列としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
また、本発明の核酸には、配列番号４からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号４に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜540個、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号４に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜540個、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号４に示す塩基配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜540個、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、1〜10個、さらに好ましくは1〜5個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
本発明の核酸の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の塩基配列のフラグメントを含む核酸も含まれる。
（ａ）配列番号４で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号１で示される塩基配列
（ａ）配列番号４で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号１で示される塩基配列については、表１に記載したとおりである。上記配列のフラグメントとは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素タンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおり、「本発明の上記活性」を有するタンパク質を意味する。
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
上記のうち、配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列については、上記、『本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「本発明の上記活性を有するタンパク質」は、配列番号４の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、GPAT活性を有するタンパク質であるか、及び／又は、本発明のGPATの脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質も含まれる。
また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
GPATの核酸のクローニング
本発明のGPATの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
例えば、pBlue-Script TM SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogen)等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号１等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、配列番号１に対しては、
上流側用プライマーとしてE-1: 5'-CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC-3'（配列番号６）を、
下流側プライマーとして、E-2: 5'-GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC-3'（配列番号７）等を
用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃
サイクル数：１０回以上
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquickPCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、核酸断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquickGel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて塩基配列を決定することができる。
GPAT発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
本発明はまた、本発明のGPAT2をコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のGPATをコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後の核酸断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。この核酸断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、GPAT発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等があげられる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、TEF（Translation elongation factor）遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来するプロモーターが用いられる。
M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられる。また、pYES（Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
本発明の脂肪酸組成物の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
GPATを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してGPATを発現させた場合は、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する：１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）。
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
以下に、本発明の脂肪酸組成物の具体的な製造方法として、宿主として酵母を用いて２段階培養を行った場合を例示して説明する。すなわち、前培養として、上記で得られたコロニーを、例えば上記のSC-Trp培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、YPD5（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う方法である。
本発明の脂肪酸組成物
本発明はまた、本発明のGPAT2が発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。脂肪酸は、遊離脂肪酸でもよいし、トリグリセリド、リン脂質等でもよい。特に、本発明の脂肪酸組成物は、その脂肪酸組成において、以下の
i) オレイン酸含有量
ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、並びに
iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
のうちの少なくとも一つ以上が、本発明の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物の前記比率より高いことを特徴とする。ここで、「本発明の組換えベクターで形質転換されていない宿主」とは、例えば、本明細書中の「本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」の項目で記載した核酸が組み込まれていないベクター（空ベクター）で形質転換された宿主である。
本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）(14:0)、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（14：1）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）(16:0)、パルミトレイン酸（9−ヘキサデセン酸）(16:1)、ステアリン酸（オクタデカン酸）(18:0)、オレイン酸（cis−9−オクタデセン酸）(18:1(9))、バクセン酸（11−オクタデセン酸）(18:1(11))、リノール酸（cis, cis−9,12 オクタデカジエン酸）(18:2(9,12))、α−リノレン酸（9,12,15−オクタデカントリエン酸）(18:3(9,12,15))、γ−リノレン酸（6,9,12−オクタデカントリエン酸）(18:3(6,9,12))、ステアリドン酸(6,9,12,15-オクタデカンテトラエン酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸（イコサン酸）(20:0)、（8,11−イコサジエン酸）(20:2(8,11))、ミード酸（5,8,11−イコサトリエン酸）(20:3(5,8,11))、ジホモγ-リノレン酸（8,11,14-イコサトリエン酸）(20:3(8,11,14))、アラキドン酸（5,8,11,14−イコサテトラエン酸）(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸（8,11,14,17-イコサテトラエン酸）（20:4(8,11,14,17)、エイコサペンタエン酸（5,8,11,14,17-イコサペンタエン酸）（20:5(5,8,11,14,17)）、ベヘン酸（ドコサン酸）(22:0)、（7,10,13,16-ドコサテトラエン酸）(22:4(7,10,13,16))、（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）(22:5(7,10,13,16,19))、（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,10,13,16))、（4,7,10, 13,16,19-ドコサヘキサエン酸）(22:6(4,7,10, 13,16,19))、リグノセリン酸（テトラコサン酸）(24:0)、ネルボン酸（cis−15−テトラドコサン酸）(24:１)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）(26:0)、等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
このような本発明の脂肪酸組成物が得られたこと、つまり、本発明のGPAT2が発現したことの確認は、公知の一般的な方法を用いて行うことができる。例えば、酵母でGPATを発現させた場合は、脂肪酸組成の変化として確認することができる。すなわち、上記本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。
その結果、上記の脂肪酸組成を有する脂肪酸組成物が得られた場合は、本発明の脂肪酸組成物が得られたと判断することができる。なお、本発明のGPATは、公知のGPAT脂肪酸組成物の脂肪酸組成とは脂肪酸組成が異なることから、本発明のGPATは公知のGPATと基質特異性が異なることが示される。
本発明の脂肪酸組成物を含む食品等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
さらに、本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
本発明のGPATをコードする核酸又はGPATタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
本発明はまた、本発明のGPATをコードする核酸又はGPATタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
（１）評価方法
本発明の一態様として、本発明のGPATをコードする核酸又はGPATタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。本発明の上記評価方法としては、まず、本発明の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株の本発明の上記活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
本発明の塩基配列、好ましくは、配列番号４に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５〜２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００塩基が適当である。
上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明の塩基配列と特異的な配列が存在するか否かを調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の塩基配列に特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。
本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株の本発明の上記活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらに本発明の上記活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、本発明の上記活性の評価方法は、上記のとおりである。
また、本発明の上記評価方法としては、被検菌株を培養し、配列番号４等の本発明の塩基配列がコードするGPATの発現量を測定することによって、被検菌株の本発明の上記活性を評価することもできる。なお、GPATの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、GPATのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。また、上記活性の評価方法として、本発明のGPATが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法をあげることもできる。脂肪酸組成物の組成の測定方法は上記のとおりである。
（２）選択方法
本発明の他の態様として、本発明のGPATをコードする核酸又はGPATタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号４等の本発明の塩基配列がコードするGPATの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、GPATの発現量及びGPATが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、GPATの発現量及びGPATが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、本発明のGPAT活性及びGPATの脂肪酸組成物を形成できる活性は、例えば本明細書中の「本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」、「本発明の脂肪酸組成物」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。
なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種や属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
（１）ＥＳＴ解析
M. alpina 1S-4株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、３日間２８℃で前培養した。１０ｌ培養槽（Able Co., 東京）に５ｌの培地（１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０）を入れ、前培養物を全量植菌し、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃の条件で８日間通気攪拌培養した。培養１、２、及び３日目に各々２％、２％、及び１．５％相当のグルコースを添加した。培養１、２、３、６、及び８日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法で全ＲＮＡを調製した。Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、全ＲＮＡからpoly（Ａ）＋ＲＮＡの精製を行った。各ステージのｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA Synthesis Kit（STRATAGENE）を用いて作製し、ｃＤＮＡの５’側からのワンパスシーケンス解析（8000クローン×５ステージ）を行った。得られた配列をクラスタリングした。その結果、約5000の配列を得た。
（２）GPAT遺伝子ホモログの探索
ＥＳＴ解析で得られた塩基配列をGENBANKに登録されているアミノ酸配列に対して相同性検索プログラムであるBLASTXで検索し、GPAT遺伝子のホモログを抽出した。その結果、１つのGPATのホモログの配列（配列番号５）を見出した。
上記検索で最も同一性の高かったのは、S. cerevisiae由来のグリセロール‐３−リン酸アシル基転移酵素であるSct1p（YBL011wにコードされるタンパク質）であった。
M. alpinaのGPATホモログについては、米国特許出願公開第US2006/0094091号明細書にすでに記載されている。この既知のM. alpina由来の配列（GPAT1と呼ぶ）と、ここで得られた配列を比較すると、配列番号５とは有意な同一性を示さなかった。従って、配列番号５はM. alpinaの公知のGPATとは別のホモログのＥＳＴであると考えられ、当該GPATホモログをGPAT2と呼ぶことにした。
（１）GPATホモログのクローニング
配列番号５には、GPATホモログをコードすると考えられるＣＤＳが存在しなかったため、この遺伝子の全長をコードするｃＤＮＡをクローン化するために配列番号５の配列に基づき、以下のとおりプライマーを作製した。
配列番号５に基づき設計したプライマー：
プライマーE-1：CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC（配列番号６）
プライマーE-2：GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC（配列番号７）
このプライマー対を用いて、配列番号５を構成するＥＳＴを含む８日目ｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、ExTaq（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行った。得られたＤＮＡ断片をTOPO-TA cloning Kit（INVITROGEN CORPORATION）を用いてＴＡ−クローニングを行い、インサート部分の塩基配列を決定した。
その結果、配列番号５の５番目から２４３番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片がクローン化されたことを確認し、このプラスミドをpCR-E-Pとした。次に、このプラスミドを鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応には、ExTaq（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノスティックス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（DIG）ラベルし、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするのに用いるプローブを作製した。このプローブを用いて、ＥＳＴ解析で配列番号５を構成するＥＳＴを得たｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄：０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回；
検出は、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）により行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivoエキシジョンにより、プラスミドを切り出し、プラスミドＤＮＡを得た。
配列番号５を含むｃＤＮＡをスクリーニングして得られたクローンのインサートの塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１には、第113番目から第1891番目までの1779 bpからなるＣＤＳが含まれており、GPATホモログ（GPAT2）の全長をコードしている配列が得られたと考えられた。この遺伝子によってコードされるタンパク質の推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。配列番号１を含むプラスミドをpB-GPAT2とした。
一方、M. alpina 1S-4株由来のGPAT1をクローン化するために、米国特許出願公開第2006/0094091号明細書の配列番号１で示されているGPATホモログのＯＲＦ配列をもとに、以下のプライマーを作製した。
プライマーGPAT1-1 ggatccatggcccttcagatctacga (配列番号８)
プライマーGPAT1-2 gtcgacctaaatgtcttttgacttggc (配列番号９)
上記プライマーの下線部分は、付加した制限酵素認識部位である。
これらのプライマーを用いてｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、KOD -Plus- (東洋紡績) によりＰＣＲを行った。増幅された断片をpCR4 Blunt-TOPO (Invitrogen) にサブクローニングし、塩基配列を確認し、この遺伝子の正しい塩基配列と考えられるクローンをpCR4-GPAT1とした。このようにしてクローニングされたM. alpina 1S-4株由来のGPAT1のｃＤＮＡの塩基配列を配列番号１０に、そしてそのｃＤＮＡによってコードされるGPAT1の推定アミノ酸配列を配列番号１１に示した。
（２）配列解析
上記のようにして得られたM. alpina由来のGPATホモログ(GPAT2)のｃＤＮＡ配列をGENEBANKに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTXにて相同性解析を行った。その結果、当該ホモログの配列に対して最もE-valueの低かった、すなわち同一性の高かったアミノ酸配列はAspergillus nidulans由来の１−アシル−sn−グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素様の推定タンパク質配列（GBアクセッションNo. EAA62242）であった。機能が明らかにされているタンパク質で最も同一性の高かったものは、Saccharomyces cerevisiae由来のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素であるSct1p（GBアクセッションNo. CAC85390）であった。当該ホモログ配列のＯＲＦと、上記の同一性の高かった配列に係る塩基配列の同一性、及びアミノ酸配列の同一性をclustalWにて求めた。その結果、ＯＲＦの塩基配列の同一性はそれぞれ３６．９％と３６．６％、アミノ酸配列の同一性はそれぞれ１７．０％と１５．０％であった。
クローニングした配列番号１の塩基配列及びその推定アミノ酸配列である配列番号２は、既知の塩基配列及びアミノ酸配列と比較しても同一性の著しく高いものはなく、M. alpina由来の新規GPATであることと考えられた。
一方、上述のようにクローン化したM. alpina 1S-4株由来のGPAT1（ｃＤＮＡ配列は配列番号１０に、その推定アミノ酸配列は配列番号１１に示される）とM. alpina（ATCC #16266）由来のGPAT1 (米国特許出願公開第2006/0094091号明細書)を比較したところ、塩基配列で９０．４％、アミノ酸配列で９７．９％の同一性であることが確認された。
酵母発現ベクターの構築
GPAT2を酵母で発現させるために、以下のとおり酵母発現用ベクターを構築した。すなわち、プラスミドpB-GPAT2を制限酵素KpnIで消化した後、制限酵素SacIで部分消化して得られた約２kbのDNA断片を酵母用発現ベクターpYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)のSacI-KpnIサイトに挿入し、プラスミドpYE-MAGPAT2を構築した。
一方、GPAT1を酵母で発現させるために以下の通り酵母発現ベクターを構築した。プラスミドpCR4-GPAT1を制限酵素BamHＩとSalＩで消化して得られた約２．２ｋｂのＤＮＡ断片を酵母用発現ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）のBamHＩ-SalＩサイトに挿入し、プラスミドpYE-MAGPAT1を構築した。
酵母の形質転換
プラスミドpYE22m、pYE-MAGPAT1又はpYE-MAGPAT2を用いて酢酸リチウム法により、酵母Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)に形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO) ６．７ｇ、グルコース２０ｇアミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）、寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。
酵母の培養
酵母発現ベクターでの形質転換株のうち任意の２株ずつ（c-1株及びc-2株、GPAT1-1株及びGPAT1-2株、並びに、GPAT2-1株及びGPAT2-2株）を選択して、以下の条件で培養した。
すなわち、前培養として、SC-Trp培地１０ｍｌに酵母をプレートから１白金耳植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。本培養は、YPD5（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、グルコース５％）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振とう培養を行った。
酵母の脂肪酸分析
酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体にクロロホルム：メタノール（２：１）を４ｍｌ添加し、激しく攪拌した後、７０℃で１時間処理した。遠心分離により菌体を分離し、溶媒を回収した。残った菌体に再度クロロホルム：メタノール（２：１）を４ｍｌ添加し、同様に溶媒を回収した。スピードバックで脂質を乾固したのち、２ｍｌのクロロホルムを添加して脂質を溶解した。この試料のうち、200μｌを分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
その結果を表２に示す。
表２ 形質転換株の脂肪酸組成（ホストEH13-15）
Figure 0005451387
M. alpina由来の２つのGPATホモログを導入した酵母と、コントロールの酵母の脂肪酸組成を比較した。GPAT1を導入した酵母の脂肪酸組成は、パルミチン酸の割合がコントロール株に比して上昇する一方、パルミトレイン酸含量の割合は減少した。また、ステアリン酸及びオレイン酸の割合はコントロール株と同程度であった。よって、パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率、パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに、パルミチン酸含有量に対するステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率は、コントロール株に比して低くなった。
一方、GPAT2を導入した酵母ではオレイン酸の割合がコントロール株に比べて１割以上上昇した。パルミチン酸、パルミトレイン酸の割合はコントロール株に比していずれも減少する一方、パルミチン酸含有量に対するパルミトレイン酸含有量の比率はコントロール株に比して若干上昇した。また、GPAT2を導入した酵母における、パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率、並びに、パルミチン酸含有量に対するステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率は、コントロール株に比して上昇した。また、GPAT2を導入した酵母では炭素数１６の脂肪酸に対する炭素数１８の脂肪酸の比が上昇しており、より長鎖の脂肪酸を生成した。
以上の結果から、M. alpina由来の２つのGPATホモログは、その基質のアシル基の特異性が異なるためにこれらの遺伝子を導入した酵母では各々のホモログで脂肪酸組成が異なっていることが示された。また、上記ホモログを随時使い分けることにより、目的とする脂肪酸組成の生物を育種することができることが示された。
アラキドン酸生産酵母での発現解析
（１）アラキドン酸生産酵母の育種
アラキドン酸生産酵母（Saccharomyces cerevisiae）を育種するために、以下のプラスミドを構築した。
まず、M. alpina 1S-4株から調製したｃＤＮＡを鋳型として、Δ12-fとΔ12-r、Δ6-fとΔ6-r、GLELO-fとGLELO-r又はΔ5-fとΔ5-rといった、プライマーの組み合わせでExTaqを用いてＰＣＲを行い、M. alpina 1S-4株のΔ12脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、Δ6脂肪酸不飽和化酵素遺伝子、GLELO脂肪酸鎖長延長酵素遺伝子及びΔ5脂肪酸不飽和化遺伝子を増幅した。
Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg（配列番号１２）
Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC（配列番号１３）
Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag（配列番号１４）
Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG（配列番号１５）
GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc（配列番号１６）
GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC（配列番号１７）
Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc（配列番号１８）
Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC（配列番号１９）
これらをTOPO-TA-cloning Kitによりクローン化した。塩基配列を確認し、配列番号２０−２３の塩基配列を含むクローンをそれぞれプラスミドpCR-MAΔ12DS（配列番号２０の塩基配列を含む）、pCR-MAΔ6DS（配列番号２１の塩基配列を含む）、pCR-MAGLELO（配列番号２２の塩基配列を含む）、pCR- MAΔ5DS（配列番号２３の塩基配列を含む）とした。
一方、プラスミドｐURA34（特開2001-120276）を制限酵素HindIIIで消化して得られた約1.2ｋｂのDNA断片を、ベクターｐUC18を制限酵素EcoRIとSphIで消化したあと末端を平滑化し、セルフライゲーションして得られたベクターのHindIIIサイトに挿入し、ベクターのEcoRIサイト側がURA3の5’側であるクローンをｐUC-URA3とした。また、YEｐ13を制限酵素SalIとXhoIで消化して得られた約2.2ｋｂのDNA断片をベクターｐUC18のSalIサイトに挿入し、ベクターのEcoRI側がLUE2の5’側であるクローンをｐUC-LEU2とした。
次に、プラスミドpCR-MAΔ12DSを制限酵素HindIIIで消化したあと末端を平滑化したものを制限酵素XbaIで消化して得られた約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ベクターpESC-URA（STRATAGENE）を制限酵素SacIで消化した後、末端を平滑化したものを、制限酵素SpeIで消化した約６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドpESC-U-Δ12を得た。プラスミドpCR-MAΔ6DSを制限酵素XbaIで消化した後、末端を平滑化したものを、制限酵素HindIIIで消化して得られた約１．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドpESC-U-Δ12を制限酵素SalIで消化した後、末端を平滑化したものを、制限酵素HindIIIで消化した約８ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結し、プラスミドpESC-U-Δ12:Δ6を得た。これを制限酵素PvuIIで部分消化して得られた約4.2ｋｂの断片をｐUC-URA3のSmaIサイトに挿入し、プラスミドｐUC-URA-Δ12:Δ6を得た。
また、プラスミドpCR-MAGLELOを制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約０．９５ｋｂｐのＤＮＡ断片と、ベクターpESC-LEU（STRATAGENE）を制限酵素XbaIとSacIで消化して得られた約７．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と連結し、プラスミドpESC-L-GLELOを得た。プラスミドpCR- MAΔ5DSを制限酵素XbaIで消化した後、末端を平滑化したものを、制限酵素HindIIIで消化して得られた約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドpESC-L-GLELOを制限酵素ApaIで消化した後、末端を平滑化したものを、制限酵素HindIIIで消化して得られた約８．７ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結して、プラスミドpESC-L-GLELO:Δ5を得た。これを制限酵素PvuIIで消化して得られた約3.2ｋｂ断片をｐUC-LEU2のSmaIサイトに挿入し、プラスミドｐUC-LEU-GLELO:Δ5を得た。S. cerevisiae YPH499株（STRATAGENE）をプラスミドｐUC-URA-Δ12:Δ6とプラスミドｐUC-LEU-GLELO:Δ5でco-transformationした。形質転換株は、SC-Leu、Ura（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン1.2ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。こうして得られた株のうち、任意の一株をARA3-1株とした。
（２）アラキドン酸生産酵母の形質転換株の取得と解析
ARA3-1株をプラスミドpYE22m、pYE-MAGPAT1、pYE-MAGPAT2でそれぞれ形質転換した。形質転換株は、SC-Trp、Leu、Ura（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。各プラスミドを導入した株から、それぞれ任意の４株を選択した。
これらの株を上記SC-Trp、Leu、Ura液体培地１０ｍｌで３０℃、１日間培養し、そのうち１ｍｌをSG-Trp、Leu、Ura（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、ガラクトース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ）液体培地１０ｍｌで１５℃、７日間培養し、菌体の脂肪酸分析を行った。菌体の脂肪酸組成を表３に、菌体内の油脂含有率を表４に示した。
Figure 0005451387
Figure 0005451387
【０１５１】
アラキドン酸生産酵母で、M. alpina由来のGPAT2を発現させた場合、コントロールと比較して、ＤＧＬＡ、アラキドン酸といったＰＵＦＡの比率が高くなった。また、菌体内の脂肪酸含有率が高くなった。
【実施例８】
M.alpina発現用ベクターの構築
M.alpina発現用ベクターとして、GAPDHプロモーターから目的遺伝子を発現させるpDuraSCとヒストンプロモーターから目的遺伝子を発現させるpDuraMCSを用いた。
GPAT2をM.alpinaで発現させるために、以下のとおりベクターを構築した。プラスミドpB-GPAT2を制限酵素PstIで消化し、続いて、制限酵素XhoIで部分分解した。得られたDNA断片のうち約1.7ｋｂのものを切り出し、ベクターpDuraSCまたはベクターpDura5MCSのマルチクローニングサイトのPstIサイト、XhoIサイトに挿入し、各々プラスミドpDuraSC-GPAT2、プラスミドpDura5MCS-GPAT2とした。
M.alpina形質転換株の取得
これらのプラスミドで、M. alpinaより特許文献（ＷＯ２００５０１９４３７「脂質生産菌の育種方法」）方法にしたがって誘導したウラシル要求性株Δｕｒａ−３を宿主としてパーティクルデリバリー法で形質転換を行った。形質転換株の選択には、ＳＣ寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）０．５％、硫酸アンモニウム０．１７％、グルコース２％、アデニン０．００２％、チロシン０．００３％、メチオニン０．０００１％、アルギニン０．０００２％、ヒスチジン０．０００２％、リジン０．０００４％、トリプトファン０．０００４％、スレオニン０．０００５％、イソロイシン０．０００６％、ロイシン０．０００６％、フェニルアラニン０．０００６％、寒天２％）を用いた。
形質転換M.alpinaの評価
得られた形質転換株を、ＧＹ培地（グルコース２％、酵母エキス１％）４ｍｌに植菌し、２８℃で３日間もしくは４日間振とう培養を行った。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステム for RT-PCR（インビトロジェン）によりｃＤＮＡを合成した。導入したコンストラクトからの各遺伝子の発現と、トータルの各遺伝子の発現を確認するため、以下のプライマーの組み合わせでRT-PCRを行った。
○プラスミドpDuraSC-GPAT2導入株
導入コンストラクトからの発現確認に使用したプライマー
MaGAPDHpfw：CACACCACACATTCAACATC（配列番号２４）
E2:GGCAATTTCATCCAAGTTGTCCTCC（配列番号２５）
トータルのGPAT2の発現確認に使用したプライマー
E1:CTGACTACCAAAACCAGCTGGACTTC（配列番号２６）
E2
○プラスミドpDura5MCS-GPAT2導入株
導入コンストラクトからの発現確認に使用したプライマー
PD4P:CGCATCCCGCAAACACACAC（配列番号２７）とプライマーE2）、
トータルのGPAT2の発現確認に使用したプライマー
プライマーE1とプライマーE2
上記RT-PCRの結果より、各遺伝子の導入コンストラクトからの発現およびトータルの発現の高かったものとして、プラスミドpDuraSC-GPAT2導入株からGp-GPAT2-30株を、プラスミドpDura5MCS-GPAT2導入株からHp-GPAT2-9株をそれぞれ選抜した。
これらの株を、GY培地4mlに植菌し、28℃、125rpmで振とう培養した。培養３日目に、２０％グルコース４００μｌ添加し、さらに培養を続けた。または培養6日目に菌体の全量を濾過により回収し、凍結乾燥した。乾燥菌体の一部（約１０−２０ｍｇ程度）をとり、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出して、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。菌体内の脂肪酸含有率と、培地あたりのアラキドン酸生産量を以下の表５−６にまとめた。
Figure 0005451387
Figure 0005451387
このように、ＧＰＡＴ２遺伝子をＭ．ａｌｐｉｎａで高発現させることによって、菌体内の脂肪酸含有率が上昇し、培地あたりのアラキドン酸生産量も増加させることができた。
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２４：プライマー
配列番号２５：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー

Claims (10)

  1. 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
    （ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６８℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
    （ｃ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
  2. 以下の(ａ)である塩基配列を含む、請求項１に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列
  3. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
    （ａ）配列番号４で示される塩基配列
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
    （ｃ）配列番号１で示される塩基配列
  4. 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸。
    （ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
    配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
    （ｂ）配列番号４からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６８℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
    前記タンパク質が発現している酵母Saccharomyces cerevisiaeEH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
    （ｃ）配列番号４からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のタンパク質をコードする塩基配列
    前記タンパク質が発現している酵母Saccharomyces cerevisiaeEH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
    （ｄ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
    配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
  5. 以下の(ａ)である塩基配列を含む、請求項４に記載の核酸。
    （ａ）以下のタンパク質をコードする塩基配列
    配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜１０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記タンパク質が発現している酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
  6. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性を有するタンパク質
  7. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、前記アミノ酸配列からなるタンパク質が発現している酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成において、以下のi)〜iv)のうちの少なくとも一つ以上が、前記タンパク質を発現していない酵母Saccharomycescerevisiae EH13-15株の脂肪酸組成よりも高い比率である脂肪酸組成を形成する活性を有するタンパク質
    i) オレイン酸含有量
    ii) パルミチン酸含有量に対するオレイン酸含有量の比率
    iii) パルミチン酸含有量に対する、ステアリン酸及びオレイン酸の合計含有量の比率、及び
    iv) 炭素数１６の脂肪酸の含有量に対する、炭素数１８の脂肪酸の含有量の比率
  8. 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
  9. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
  10. 請求項９に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
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