JP5890687B2 - グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ホモログとその利用 - Google Patents

グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ホモログとその利用 Download PDF

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Description

本発明は、新規なアシル基転移酵素遺伝子とその利用に関する。本発明のアシル基転移酵素遺伝子は、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ＧＰＡＴ）遺伝子及び／又はグリセロンホスフェート Ｏ−アシル基転移酵素（ＧＮＰＡＴ）遺伝子であってよい。
脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等脂質を構成する重要な成分である。不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と総称される。具体例としては、アラキドン酸やジホモγ−リノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が知られており、様々な生理活性が報告されている（非特許文献１）。この高度不飽和脂肪酸のうち、いくつかの種類は、動物が体内で合成することができない。従って、このような高度不飽和脂肪酸については、必須脂肪酸として食物から摂取する必要がある。
動物体内において、高度不飽和脂肪酸は多種多様な臓器及び組織に含まれている。例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離される。しかしながら、動物臓器には高度不飽和脂肪酸は少量しか含まれていないため、動物臓器から抽出・分離される高度不飽和脂肪酸だけでは、十分な供給量を得ることができない。そのため、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ（Mortierella）属微生物は、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を効率的に生産する微生物として知られている。また、植物で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。高度不飽和脂肪酸は、トリアシルグリセロール等の貯蔵脂質を構成し、微生物の菌体内若しくは植物種子中に蓄積されることが知られている。
貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、生体内で以下のように生成される。グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素によりグリセロール−３−リン酸にアシル基が転移されてリゾホスファチジン酸が生じる。次に、リゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりリゾホスファチジン酸にアシル基が転移されてホスファチジン酸が生じる。そして、ホスファチジン酸が、ホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されることによってジアシルグリセロールが生じる。最後に、ジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりジアシルグリセロールにアシル基が転移されてトリアシルグリセロールが生じる。
上記のトリアシルグリセロール生合成経路やリン脂質生合成経路において、グリセロール−３−リン酸のアシル化によりリゾホスファチジン酸（lysophosphatidic acid）が生成する反応には、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（以下、「ＧＰＡＴ」と記載する場合もある。：EC 2.3.1.15）が介在することが知られている。
ＧＰＡＴ遺伝子の存在はこれまでにいくつかの生物で報告されている。哺乳動物由来のＧＰＡＴ遺伝子として、小胞体型（膜結合型）とミトコンドリア型（膜結合型）の２種類がクローン化されている（非特許文献２）。また、植物由来のＧＰＡＴ遺伝子として小胞体型（膜結合型）、ミトコンドリア型（膜結合型）及び葉緑体型（遊離型）の３種類がクローン化されている（非特許文献３）。
真菌であるSaccharomyces cerevisiae 由来のＧＰＡＴ遺伝子として、小胞体型（膜結合型）のGPT2/GAT1(YKR067w)とSCT1/GAT2(YBL011w)の２種類がクローン化されており、これらを同時に欠失させると致死であることが知られている。（非特許文献４）。ここで、GPT2はパルミチン酸（16:0）からオレイン酸（18:1)に至るまで、幅広い範囲の脂肪酸を基質とする活性を有するのに対し、SCT1はパルミチン酸（16:0）、パルミトレイン酸（16:1）といった炭素数１６の脂肪酸を基質とすることに強い選択性を有することが示されている（非特許文献４）。
上記の他にも多くの生物種からＧＰＡＴ遺伝子はクローン化されている。特に、脂質生産菌であるモルティエレラ（Mortierella）属微生物由来のＧＰＡＴについても以下のような報告がある。
Mortierella ramanniana由来のＧＰＡＴについては、小胞体型ＧＰＡＴが単離され、これがパルミチン酸（16:0）よりもオレイン酸（18:1）を５．４倍高い選択性をもってアシルドナーとして利用することが示されている（非特許文献５）。Mortierella alpina（以下、「M. alpina」又は「モルティエレラ アルピナ」と記載する場合もある）由来のＧＰＡＴについては、ミクロソーム画分にグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性があることが報告されている（非特許文献６）。
M. alpinaのミクロソームに存在するＧＰＡＴ（膜に結合している状態）と種々のアシルＣｏＡをインビトロで反応させると、ＧＰＡＴは、高い活性を維持したまま、オレイン酸（18:1）、リノール酸（18:2）、ジホモγ−リノレン酸（DGLA）（20:3）、アラキドン酸（20:4）といった高度不飽和脂肪酸を広く基質として用いることが示されている（特許文献１）。
M. alpina (ATCC ＃16266）からクローニングされたＧＰＡＴ（以下、本明細書ではMaGPAT1(ATCC #16266）と記載する）を、エイコサペンタエン酸（EPA）まで生合成できるように形質転換されたYarrowia lipolytica内で発現させたところ、総脂肪酸の内、ジホモγ−リノレン酸（DGLA）（20:3）の組成が増加し、オレイン酸（18:1）の組成が減少することが示された。この結果は、より長鎖で不飽和度の高い高度不飽和脂肪酸が選択的に取り込まれていることを示すものである（特許文献２）。
近年、M. alpina（1S-4株）からＧＰＡＴホモログであるMaGPAT2が単離され、MaGPAT1とは異なる基質特異性を示すことが報告されている（特許文献３）。即ち、酵母で発現させた場合に、MaGPAT1は酵母が生産する脂質中のパルミチン酸の含有比率を増加させるのに対して、MaGPAT2は酵母が生産する脂質中のオレイン酸の含有比率を増加させる。
国際公開第WO2004／087902号パンフレット 米国特許出願公開第2006／0094091号明細書 国際公開第WO2008／156026号パンフレット
Lipids, 39, 1147-1161, 2004 Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 17-26, 1997 Biochimica et Biophysica Acta, 1348, 10-16, 1997 The Journal of Biological Chemistry, 276 (45), 41710-41716, 2001 The Biochemical Journal, 355, 315-322, 2001 Biochemical Society Transactions, 28, 707-709, 2000
これまでに報告されているＧＰＡＴ遺伝子は、宿主細胞に導入して発現させても、その基質特異性により、宿主が産生する脂質組成物は限られていた。宿主細胞に導入する又は発現させることで所望の組成の脂肪酸組成物を産生しうる、新規な遺伝子を同定することが求められている。
本発明の目的は、宿主細胞で発現又は導入することで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたり、貯蔵脂質であるトリアシルグリセロール（ＴＧ）量を増加させたりできるようなタンパク質及び核酸を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Mortierella alpinaのゲノムを解析し、この中から既知のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ＧＰＡＴ）遺伝子と同一性の高い配列を抽出した。さらに、ＧＰＡＴをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより全長ｃＤＮＡをクローニングした。それを酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して脂肪酸組成物の産生を試みた発明者は、従来のＧＰＡＴが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、異なる脂肪酸組成物を生成させることができる、基質特異性が異なる新規なＧＰＡＴに関する遺伝子のクローニングに成功し、発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
（２）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
（３）以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号３、配列番号６又は配列番号１１で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（ｄ）配列番号７又は配列番号１２で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（４）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素欠損（以下、「ＧＰＡＴ欠損」と記載する場合もある）を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（５）以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかである、（４）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（６）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（７）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
（８）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（９）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
（１０）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
（１１）（１）〜（５）のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
（１２）（１１）に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
（１３）（１２）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸又は脂質を含む脂肪酸組成物。
（１４）（１２）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸又は脂質を採取することを特徴とする、脂肪酸組成物の製造方法。
（１５）（１３）に記載の脂肪酸組成物を含む食品。
本発明のＧＰＡＴは、従来のＧＰＡＴとは基質特異性が異なり、従来のＧＰＡＴが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物とは組成が異なる脂肪酸組成物を宿主中に産生させることができる。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
また、本発明のＧＰＡＴは脂肪酸や貯蔵脂質の生産能の向上を図ることができるため、微生物や植物中での高度不飽和脂肪酸の生産性を向上させるものとして、好ましい。
図１−１は、M. alpina 1S-4株由来のMaGPAT4のゲノム配列（配列番号７）とＣＤＳ配列（配列番号３）を比較した図である。 図１−２は、図１−１の続きである。 図１−３は、図１−２の続きである。 図２−１は、M. alpina 1S-4株由来のMaGPAT4のＣＤＳ配列（配列番号３）及びそれから導かれる推定アミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。二重下線部は、pfamのアシル基転移酵素（accession No.PF01553）のモチーフと高い相同性を有するものとしてヒットした領域である。 図２−２は、図２−１の続きである。 図３−１は、M. alpina 1S-4株由来のMaGPAT5のゲノム配列（配列番号１２）とＣＤＳ配列（配列番号１０）を比較した図である。 図３−２は、図３−１の続きである。 図４−１は、M. alpina 1S-4株由来のMaGPAT5のｃＤＮＡ配列（配列番号１１）及びそれから導かれる推定アミノ酸配列（配列番号９）を示した図である。 図４−２は、図４−１の続きである。 図５は、M. alpina 1S-4株由来のMaGPAT4の推定アミノ酸配列（配列番号２）と、子嚢菌Chaetomium globosum CBS 148.51由来の推定タンパク質のアミノ酸配列（配列番号２１；GenBank accession No. XP 001224211）及びE. coli由来のＧＰＡＴであるplsBタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２２；GenBank accession No. BAE78043）を比較した図である。一重下線部はpfamのアシル基転移酵素（accession No.PF01553）のモチーフと相同性が高い領域。中でも、二重下線部はＧＰＡＴホモログでよく保存されている領域であり、＊はアシル基転移酵素活性に重要なアミノ酸残基、＋はＧ３Ｐとの結合に必要なアミノ酸残基を示す。 図６−１は、M. alpina 1S-4株由来のMaGPAT5の推定アミノ酸配列（配列番号９）と、担子菌Ustilago maydis 521由来の推定タンパク質UM03369のアミノ酸配列（配列番号２３；GenBank accession No. XP 759516）並びに、S. cerevisiae由来のＧＰＡＴであるSCT1（YBL011W）（配列番号２４）及びGPT2（YKR067W）（配列番号２５Ｗ）のアミノ酸配列を比較した図である。二重下線部は、ＧＰＡＴホモログでよく保存されている領域であり、＊はアシル基転移酵素活性に重要なアミノ酸残基、＋はＧ３Ｐとの結合に必要なアミノ酸残基を示す。 図６−２は、図６−１の続きである。 図７は、ガラクトース誘導型のプロモーターに連結されたMaGPAT4-long又はMaGPAT4を有するプラスミドで形質転換した酵母について、ＳＧ−Ｔｒｐ培地で培養することにより、ガラクトースで発現誘導させた場合の脂質画分の脂肪酸組成を示すグラフである。 図８は、ガラクトース誘導型のプロモーターに連結されたMaGPAT4-long又はMaGPAT4を有するプラスミドで形質転換した酵母について、ガラクトースを含まないＳＣ−Ｔｒｐ培地で培養した場合の総脂肪酸の組成を示すグラフである。 図９は、GPAT4をM. alpinaで過剰発現させた場合の乾燥菌体あたりのアラキドン酸の生産量の経時変化を示すグラフである。
本発明は、Mortierella由来の新規なアシル基転移酵素遺伝子とその利用に関する。本発明のアシル基転移酵素は、グリセロール−３−リン酸をアシル化してリゾホスファチジン酸を生成させる、及び／又は、グリセロンホスフェートの水酸基にアシル基を転移させる、ことを特徴とするアシル基転移酵素であってよい。
本発明のアシル基転移酵素は、グリセロール−３−リン酸及び／又はグリセロンホスフェートにアシル基を転移させる反応を触媒する酵素である。本発明の酵素のアシル基受容体は、通常、グリセロール−３−リン酸及び／又はグリセロンホスフェートであるが、これらに限定されない。
したがって本発明のアシル基転移酵素は、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ＧＰＡＴ）及び／又はグリセロンホスフェート Ｏ−アシル基転移酵素（ＧＮＰＡＴ）としての活性を有し得る。しかしながら、本明細書においては本発明の酵素について、実際に有する活性の如何に問わず、便宜的に「グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素」又は「ＧＰＡＴ」と記載する場合もある。
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ＧＰＡＴ）には、MaGPAT4、MaGPAT4-long、及びMaGPAT5が含まれる。MaGPAT4、MaGPAT4-long、及びMaGPAT5をコードするｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及び推定アミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。
本発明のMaGPAT4に関連する配列として、MaGPAT4のアミノ酸配列である配列番号２、並びに、MaGPAT4のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号１、及びそのＣＤＳ又はｃＤＮＡの領域を示す配列である配列番号３があげられる。このうち、配列番号１は配列番号３の第１−２４７５番目の塩基配列に相当する。本発明のMaGPAT4-longに関連する配列として、MaGPAT4-longのアミノ酸配列である配列番号５、並びに、MaGPAT4-longのＯＲＦの領域を示す配列である配列番号４、及びそのＣＤＳ又はｃＤＮＡの領域を示す配列である配列番号６があげられる。このうち、配列番号４は配列番号６の第１−２６４３番目の塩基配列に相当する。ここで、上述の表において示したように、MaGPAT4のアミノ酸配列及び塩基配列は、それぞれMaGPAT4-longのアミノ酸配列及び塩基配列の一部を構成している。また、本発明のMaGPAT4及びMAGPAT4-longをコードするゲノム配列として配列番号７があげられる。MaGPAT4をコードする場合、配列番号７のゲノム配列は、エクソン１０個とイントロン９個からなっており、エクソン領域は配列番号７の第５９６〜７４４番目、第８５０〜９２４番目、第１３０２〜１３９６番目、第１４８０〜１７２６番目、第１８５４〜２２７９番目、第２３７０〜２６３２番目、第２７２４〜３２９９番目、第３３９０〜３４７１番目、第３５７５〜４０２４番目、第４１３３〜４２４８番目である。あるいは、MaGPAT4-longをコードする場合、配列番号７のゲノム配列は、エクソン１０個とイントロン９個からなっており、エクソン領域は配列番号７の第４２８〜７４４番目、第８５０〜９２４番目、第１３０２〜１３９６番目、第１４８０〜１７２６番目、第１８５４〜２２７９番目、第２３７０〜２６３２番目、第２７２４〜３２９９番目、第３３９０〜３４７１番目、第３５７５〜４０２４番目、第４１３３〜４２４８番目である。
本発明のMaGPAT5に関連する配列として、MaGPAT5のアミノ酸配列である配列番号９、並びに、MaGPAT5のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号８、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号１０、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号１１があげられる。このうち、配列番号１０は配列番号１１の第２２５−２５９１番目の塩基配列に相当し、配列番号８は配列番号１１の第２２５−２５８８番目の塩基配列及び配列番号１０の１−２３６４番目の塩基配列に相当する。また、本発明のMaGPAT5をコードするゲノム配列として配列番号１２があげられる。配列番号１２のゲノム配列は、エクソン３個とイントロン２個からなっており、エクソン領域は配列番号１２の第１〜３０２番目、第４５７〜１６７６番目、第１７５４〜２５９８番目である。
本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１、配列番号４、若しくは配列番号８で示される塩基配列を含む核酸、（ｂ）配列番号２、配列番号５、若しくは配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）配列番号３、配列番号６、若しくは配列番号１１で示される塩基配列を含む核酸、又は（ｄ）配列番号７若しくは配列番号１２で示される塩基配列を含む核酸等があげられる。
上記塩基配列を得るためには、ＧＰＡＴ活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のＧＰＡＴ活性を有するタンパク質と相同性のあるタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＧＰＡＴ活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これに限定されない。
ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３〜４日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％ Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてpoly（Ａ）＋ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
ゲノムＤＮＡを解析する場合は、ＧＰＡＴ活性を有する生物の細胞を培養し、当該細胞からゲノムＤＮＡを調製する。得られたゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、決定した塩基配列をアッセンブリした。最終的に得られたスーパーコンティグの配列から、既知のＧＰＡＴ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列と相同性のあるアミノ酸配列をコードする配列を探索する。このようなアミノ酸配列をコードするものとしてヒットしたスーパーコンティグの配列からプライマーを作製し、上述したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込み、クローン化する。クローン化されたプラスミドを鋳型として、上述のプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりプローブを作製する。作製したプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
本発明のMaGPAT4及びMaGPAT5の推定アミノ酸配列を、GenBankに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpプログラムで相同性検索を行った。MaGPAT4に対して同一性の高かったアミノ酸配列は、子嚢菌Chaetomium globosum CBS 148.51由来の推定タンパク質のアミノ酸配列（GenBank accession No. XP 001224221）であり、同一性は３９．３％である。また、MaGPAT4はヒト由来のグリセロンホスフェート Ｏ−アシル基転移酵素（ＧＮＰＡＴ；GenBank accession No. AAH00450）とも相同性があり、アミノ酸同一性は２２．６％である。さらに、MaGPAT4は、大腸菌（E. coli）由来のＧＰＡＴであるplsBタンパク質（GenBank accession No. BAE78043）とのアミノ酸同一性は、１７．６％である。一方、MaGPAT5に対して同一性の高かったアミノ酸配列は、担子菌Ustilago maydis 521由来の推定タンパク質のアミノ酸配列（GenBank accession No. XP 759516）であり、同一性は１５．４％である。
本発明はまた、上記配列番号１、配列番号４又は配列番号８で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）、並びに、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ＧＰＡＴ）活性及び／又はグリセロンホスフェート Ｏ−アシル基転移酵素（ＧＮＰＡＴ）活性を有することを意味する。また、「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が発現している宿主の脂肪酸組成において、以下：
i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性；
ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性；
iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性；
iv) 酵母（S. cerevisiae）のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素欠損（ＧＰＡＴ欠損）を相補する活性、好ましくは前記ＧＰＡＴ欠損は、酵母のＳＣＴ１遺伝子及びＧＰＴ２遺伝子両方の欠損によるものである；及び／又は
v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
のいずれかの活性を有することを意味してもよい。
このような本発明の核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。なお、以下に挙げる塩基配列の記載において、「本発明の上記活性」とは、上記の「ＧＰＡＴ活性、ＧＮＰＡＴ活性、上記ｉ）ないしｖ）の活性から選択されるいずれか１以上の活性」を意味する。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
具体的には、
(i) 配列番号２、配列番号５又は配列番号９に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜80個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２、配列番号５又は配列番号９に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜80個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２、配列番号５又は配列番号９に示すアミノ酸配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜80個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
保存的置換は、一般的には、生物学的合成系や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
保存的置換及び非保存的置換いずれにおいても、配列番号２における３１６番目、３１９番目、及び３５１番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基は、それぞれ、グリシン、セリン、及びプロリンであることが望ましい。配列番号９については、４３０番目、４３２番目、及び４６５番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基は、それぞれ、グリシン、セリン、及びプロリンであることが望ましい。
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
上記したように、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２、配列番号５又は配列番号９に示されるアミノ酸配列において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＧＰＡＴ活性及び／又はＧＮＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
また、本発明の核酸に含まれる塩基配列には、好ましくは、配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、本発明の上記活性が保持される限り制限はない。
本発明のタンパク質のＧＰＡＴ活性をはじめ、本発明の上記活性は、公知の方法を用いて測定することが可能である。例えば、以下の文献：Biochem. J., 355, 315-322, 2001を参照することができる。
例えば、本発明の「ＧＰＡＴ活性」は以下の通り測定してもよい。本発明のＧＰＡＴを発現させた酵母から、J. Bacteriology, 173, 2026-2034(1991)に記載の方法等によりミクロソーム画分を調製する。そして、反応液である、０．４４ｍＭ グリセロール−３−リン酸 、０．３６ｍＭ アシル−ＣｏＡ、０．５ｍＭ ＤＴＴ、１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に上記ミクロソーム画分を添加し、２８℃で適当な時間反応させ、クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したリゾホスファチジン酸量を定量することができる。
また、本発明の上記ｉ）、ｉｉ）又はｖ）に示した活性は、例えば以下のようにして、本発明のタンパク質を発現させた宿主細胞（例えば、酵母、M. alpina）の脂肪酸組成又は脂肪酸含有率を測定することにより測定してもよい。本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。
本発明の上記ｉｉｉ）に示した活性は、例えば以下のようにして、本発明のタンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量を測定することにより測定してもよい。上記のように脂質を菌体から抽出・回収した後、例えば薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）を行って分画し、ＴＧ画分を回収する。そして、塩酸メタノール法により、回収したＴＧ画分についてＴＧを構成する脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで定量する。
本発明の上記ｉｖ）に示した活性は、例えば以下のようにして、導入した本発明のタンパク質が酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補できるか否かを確認することにより測定してもよい。酵母では、ＧＰＡＴ活性を担う遺伝子としてＳＣＴ１とＧＰＴ２が知られており、これらを同時に欠失させると致死であることが知られている。すなわち、ＳＣＴ１遺伝子及びＧＰＴ２遺伝子が欠失した酵母は、通常は生育できないが、これらの遺伝子と同等の働きをする遺伝子、すなわちＧＰＡＴ活性を有するタンパク質を発現させた場合、相補され、生育することが可能になる。ここで、本発明のＧＰＡＴについて、酵母のＧＰＡＴ欠損が相補されたことを確認する方法としては、酵母のＳＣＴ１遺伝子及びＧＰＴ２遺伝子が欠損した株において、本発明のＧＰＡＴ遺伝子を発現させた場合、当該酵母のＧＰＡＴ活性が回復されたことを確認する方法であれば、いかなる方法でもよい。例えば、以下の実施例８でも具体的に説明しているように、Δｇｐｔ２ホモ接合２倍体酵母において、ＳＣＴ１遺伝子の対立遺伝子の１つのみを欠損させた異型接合株を作製し、続いて当該異型接合株に本発明のＧＰＡＴ遺伝子の発現カセットをＳＣＴ１が載っている染色体とは別の染色体上に１つ挿入した株、あるいは、当該異型接合株に本発明のＧＰＡＴ遺伝子の発現カセットを有するプラスミド型ベクターを挿入した株、を作製する。当該菌株を胞子形成培地上に塗布し、子嚢胞子を形成させる。得られた菌体を、ランダム胞子分析、あるいは四分子分析により、胞子由来の１倍体株を得ることができる。このようにして得られた１倍体酵母の遺伝子型を調べ、本来生育できないΔｇｐｔ２Δｓｃｔ１株において、本発明のＧＰＡＴ遺伝子の発現カセットが存在する場合にのみ生育できることが確認できれば、本発明のＧＰＡＴが酵母中でＧＰＡＴ活性を相補できたと判断できる。
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
本発明に含まれる塩基配列としては、好ましくは、配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ＧＰＡＴ活性及び／又はＧＮＰＡＴ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１、配列番号４又は配列番号８に示される塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
好ましくは、配列番号１、配列番号４又は配列番号８に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。本発明の核酸がコードするタンパク質は、本発明の上記活性を有するタンパク質と同等の機能を有する限り、MaGPAT4、MaGPAT4-long、又はMaGPAT5のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。
具体的には、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％（例えば、９５％、さらには、９８％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。さらに好ましくは、配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びClustalW等があげられる。特に、BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI(Infomax)等のプログラムを用いて決定することもできる。
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。本発明の核酸に含まれる塩基配列としては、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列は、それぞれ本発明のMaGPAT4（及びMaGPAT4-long）又はMaGPAT5をコードするゲノムＤＮＡ配列である。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む。
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ゲノムライブラリー等から得ることができる。ハイブリダイズの条件は、上記の通りである。
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。好ましくは、配列番号７又は配列番号１２に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは、９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列が挙げられる。２つの塩基配列の同一性％は、上述したように決定することができる。
また、配列番号７のゲノムＤＮＡ配列は、エクソン１０個とイントロン９個からなっており、エクソン領域は配列番号７の第４２８〜７４４番目又は第５９６〜７４４番目、第８５０〜９２４番目、第１３０２〜１３９６番目、第１４８０〜１７２６番目、第１８５４〜２２７９番目、第２３７０〜２６３２番目、第２７２４〜３２９９番目、第３３９０〜３４７１番目、第３５７５〜４０２４番目、及び第４１３３〜４２４８番目である。そして、配列番号１２のゲノムＤＮＡ配列は、エクソン３個とイントロン２個からなっており、エクソン領域は配列番号１２の第１〜３０２番目、第４５７〜１６７６番目、及び第１７５４〜２５９８番目である。
別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号７又は配列番号１２に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号７又は配列番号１２に示される配列に対して１００％同一であり、そして、エクソン領域の塩基配列が配列番号７又は配列番号１２に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列が挙げられる。
また別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号７又は配列番号１２に示されるゲノムＤＮＡ配列において、エクソン領域の塩基配列が配列番号７又は配列番号１２に示される配列に対して１００％同一であり、そして、イントロン領域の塩基配列が配列番号７又は配列番号１２に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それによりエクソン領域が連結して本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、が挙げられる。
さらに別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号７又は配列番号１２に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号７又は配列番号１２に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、そして、エクソン領域の塩基配列が配列番号７又は配列番号１２に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それにより連結したエクソン領域が本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする、塩基配列が挙げられる。
２つの塩基配列の同一性％は、上述した方法により決定することができる。
また、本発明の核酸には、配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号１、配列番号４又は配列番号８に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜720個、1〜600個、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号１、配列番号４又は配列番号８に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜720個、1〜600個、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号１、配列番号４又は配列番号８に示す塩基配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜720個、1〜600個、1〜500個、1〜400個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
本発明の核酸の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列のフラグメントを含む核酸も含まれる。
（ａ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号３、配列番号６又は配列番号１１で示される塩基配列
（ｄ）配列番号７又は配列番号１２で示される塩基配列
（ａ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号３、配列番号６又は配列番号１１で示される塩基配列については、表１に記載したとおりである。また、配列番号７又は配列番号１２で示される塩基配列についても上述の通りである。上記配列のフラグメントとは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
また、本発明の核酸には以下の核酸も含まれる。
（１） 以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列を含む核酸
（２） 以下の(ａ)〜（ｇ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列を含む核酸
本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素
本発明のタンパク質は、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおり、「本発明の上記活性」を有するタンパク質を意味する。
本発明において、配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
上記のうち、配列番号２、配列番号５若しくは配列番号９において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２、配列番号５若しくは配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列については、上記『本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「本発明の上記活性を有するタンパク質」には、配列番号１、配列番号４若しくは配列番号８の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２、配列番号５若しくは配列番号９に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、ＧＰＡＴ活性、ＧＮＰＡＴ活性及び／若しくは、上記『本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸』の項に記載したｉ）の活性、又は上記ｉｉ）の活性を有するタンパク質も含まれる。
また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
（１） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかである、（１）に記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
本発明の核酸のクローニング
本発明のＧＰＡＴの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
例えば、pBlue-Script TMSK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号３、６又は１１等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができる。例えば、後述する実施例に記載のプライマーを用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃
サイクル数：１０回以上
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
ＧＰＡＴ発現用ベクター構築及び形質転換体の作成
本発明はまた、本発明のＧＰＡＴをコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のＧＰＡＴをコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このＤＮＡ断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、ＧＰＡＴ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等があげられる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、TEF（Translation elongation factor）遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来するプロモーターが用いられる。
M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられる。また、pYES（Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
本発明の脂肪酸組成物の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。脂肪酸組成物は、１又はそれ以上の脂肪酸の集合体を含む組成物である。ここで、脂肪酸は遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリドやリン脂質等の脂肪酸を含む脂質として存在していてもよい。本発明の脂肪酸組成物は、具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
ＧＰＡＴを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してＧＰＡＴを発現させた場合は、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する：１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ。
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
宿主として酵母を用いて２段階培養を行う場合、本発明の脂肪酸組成物の製造方法は以下のように行うことができる。前培養として、形質転換体のコロニーを、上記のSC-Trp培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、YPD5（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う。
本発明の脂肪酸組成物
本発明はまた、本発明のＧＰＡＴが発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、本発明のＧＰＡＴが発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリド、リン脂質等の脂肪酸を含む脂質の形で存在していてもよい。
本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）(14:0)、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（14：1）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）(16:0)、パルミトレイン酸（9−ヘキサデセン酸）(16:1)、ステアリン酸（オクタデカン酸）(18:0)、オレイン酸（cis−9−オクタデセン酸）(18:1(9))、バクセン酸（11−オクタデセン酸）(18:1(11))、リノール酸（cis, cis−9,12 オクタデカジエン酸）(18:2(9,12))、α−リノレン酸（9,12,15−オクタデカントリエン酸）(18:3(9,12,15))、γ−リノレン酸（6,9,12−オクタデカントリエン酸）(18:3(6,9,12))、ステアリドン酸(6,9,12,15-オクタデカンテトラエン酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸（イコサン酸）(20:0)、（8,11−イコサジエン酸）(20:2(8,11))、ミード酸（5,8,11−イコサトリエン酸）(20:3(5,8,11))、ジホモγ-リノレン酸（8,11,14-イコサトリエン酸）(20:3(8,11,14))、アラキドン酸（5,8,11,14−イコサテトラエン酸）(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸（8,11,14,17-イコサテトラエン酸）（20:4(8,11,14,17)、エイコサペンタエン酸（5,8,11,14,17-イコサペンタエン酸）（20:5(5,8,11,14,17)）、ベヘン酸（ドコサン酸）(22:0)、（7,10,13,16-ドコサテトラエン酸）(22:4(7,10,13,16))、（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）(22:5(7,10,13,16,19))、（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,10,13,16))、（4,7,10,13,16,19-ドコサヘキサエン酸）(22:6(4,7,10,13,16,19))、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）(24:0)、ネルボン酸（cis−15−テトラドコサン酸）(24:１)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）(26:0)、等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
本発明の脂肪酸組成物の組成を測定するには、本明細書中の「本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」の項目で記載した、脂肪酸組成又は脂肪酸含有率の測定方法を利用することができる。
本発明の脂肪酸組成物を含む食品等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
さらに、本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
本発明のＧＰＡＴをコードする核酸又はＧＰＡＴタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
本発明はまた、本発明のＧＰＡＴをコードする核酸又はＧＰＡＴタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
（１）評価方法
本発明の一態様として、本発明のＧＰＡＴをコードする核酸又はＧＰＡＴタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。本発明の上記評価方法としては、まず、本発明の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株の本発明の上記活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
本発明の塩基配列、好ましくは、配列番号１、配列番号４又は配列番号８に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５〜２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００塩基が適当である。
上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明の塩基配列と特異的な配列が存在するか否かを調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の塩基配列に特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。
本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株の本発明の上記活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらに本発明の上記活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、本発明の上記活性の評価方法は、上記のとおりである。
また、本発明の上記評価方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１又は配列番号６等の本発明の塩基配列がコードするＧＰＡＴの発現量を測定することによって、被検菌株の本発明の上記活性を評価することもできる。なお、ＧＰＡＴの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、ＧＰＡＴのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
（２）選択方法
本発明の他の態様として、本発明のＧＰＡＴをコードする核酸又はＧＰＡＴタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１、配列番号４又は配列番号８等の本発明の塩基配列がコードするＧＰＡＴの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、ＧＰＡＴの発現量及びＧＰＡＴが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、ＧＰＡＴの発現量及びＧＰＡＴが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、本発明の上記活性は、例えば本明細書中の「本発明のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素をコードする核酸」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。
なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
実施例１： モルティエレラ アルピナのゲノム解析
M. alpina 1S-4株を１００ｍｌのＧＹ２：１培地（２％グルコース、１％酵母エキス ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy（QIAGEN）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
上記ゲノムＤＮＡの塩基配列を、Roche 454 GS FLX Standardを用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を３ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、３００個のスーパーコンティグが得られた。
実施例２： ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラリーの作製
M. alpina 1S-4株を４ｍｌの培地（２％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、４日間２８℃で培養した。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステムfor RT-PCR（インビトロジェン）によりｃＤＮＡを合成した。また、Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、トータルＲＮＡからpoly(A)＋RNAの精製を行った。ｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（STRATAGENE）を用いて作製した。
実施例３： ＧＰＡＴホモログの探索
まず、大腸菌（Escherichia coli）由来のＧＰＡＴであるｐｌｓＢのアミノ酸配列（GenBank accession No. BAE78043）を、M.alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、tblastnにより検索した結果、配列番号７を含むスーパーコンティグがヒットした。一方、酵母（S.cerevisiae）由来のＧＰＡＴであるＳＣＴ１（YBL011W）又はＧＰＴ２（YKR067W）のアミノ酸配列を、M.alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、tblastnにより検索した結果、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、又は配列番号１５を含むスーパーコンティグがヒットした。
配列番号１３はMaGPAT1のゲノム配列、配列番号１５はMaGPAT2のゲノム配列（ＷＯ２００８／１５６０２６）であった。配列番号１４は、本発明者らが先に別途同定していたMaGPAT3のゲノム配列であった（本願出願時未公開）。
配列番号７と配列番号１２に係る遺伝子は新規のものであると考えられた。配列番号７に係る遺伝子をMaGPAT4、配列番号１２に係る遺伝子をMaGPAT5と命名した。
実施例４： MaGPAT4及びMaGPAT5のクローニング
（１）MaGPAT4のｃＤＮＡのクローン化
MaGPAT4のｃＤＮＡをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
配列番号４を含むスーパーコンティグの塩基配列をＢＬＡＳＴ解析し、既知のＧＰＡＴホモログと比較したところ、配列番号４の４２４６−４２４８番目のＴＡＡが終止コドンであると考えられた。一方、開始コドンは、既知のホモログとの比較からでは推定するのが難しかった。そこで、５’−ＲＡＣＥ法により、ｃＤＮＡの５’端のクローン化を試みた。すなわち、Gene Racer Kit（インビトロジェン）を用いて、
プライマーＧＰＡＴ４−Ｓ：５’−CAAGGATGTTGTTGATGAGGAAGGCGAAG−３’（配列番号１６）
を５’遺伝子特異的プライマーとして、上記プライマーより５’上流のｃＤＮＡのクローン化を試みた。その結果、得られた配列は、配列番号３の９３番目−５９５番目の塩基配列を含んでいた。しかしながら、開始コドンと考えられる配列がないことと、他のＧＰＡＴホモログとの比較から、得られた配列もMaGPAT4の開始コドンを含まない可能性が考えられた。そこで、ゲノム配列である配列番号７と配列番号３の９３番目−５９５番目の配列を比較し、一致する領域の５’上流を詳細に調べたところ、ゲノム配列上のMaGPAT4をコードすると考えられるフレーム上に最初に出現する終止コドンより下流に、開始コドンとなりうるＡＴＧが、５９６−５９８番目と４２８−４３０番目の２箇所見つかった。まず、５９６−５９８番目のＡＴＧを開始コドンとして、MaGPAT4のＣＤＳをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
プライマーＳａｃＩ−ＧＰＡＴ４−１：５’−GAGCTCATGCCCATCGTTCCAGCTCAGC−３’（配列番号１７）
プライマーＳａｌ−ＧＰＡＴ４−２：５’−GTCGACTTATAATTTCGGGGCGCCATCGC−３’（配列番号１８）
ｃＤＮＡを鋳型、プライマーＳａｃＩ−ＧＰＡＴ４−１とプライマーＳａｌ−ＧＰＡＴ４−２の組み合わせで、ExTaq（タカラバイオ）を用いて、９４℃ ２分、（９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分）３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。増幅された約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を使ってクローン化し、インサート部分の塩基配列を決定し、配列番号３の塩基配列を有するプラスミドをpCR-MaGPAT4とした。MaGPAT4をコードしているＣＤＳの塩基配列を配列番号３、ＯＲＦの塩基配列を配列番号１、これらの塩基配列から導かれるMaGPAT4のアミノ酸配列を配列番号２に示した。
一方、４２８−４３０番目のＡＴＧを開始コドンとした場合を、MaGPAT4-longと表記する。MaGPAT4-longをコードしているＣＤＳの塩基配列を配列番号６、ＯＲＦの塩基配列を配列番号４、これらの塩基配列から導かれるMaGPAT4-longのアミノ酸配列を配列番号５として示した。
（２）MaGPAT5のｃＤＮＡのクローン化
MaGPAT5のｃＤＮＡをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
プライマーＧＰＡＴ５−１Ｆ： ５’−TTCCCTGAAGGCGTATCGAGCGACGATT−３’（配列番号１９）
プライマーＧＰＡＴ５−３Ｒ： ５’−CAAATGTTGACAGCAGCCAGAACG−３’（配列番号２０）
上記のとおり作製したライブラリーを鋳型、プライマーＧＰＡＴ５−１ＦとプライマーＧＰＡＴ５−３Ｒの組み合わせでExTaq（タカラバイオ）を用いて、９４℃ ２分、（９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分）３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。得られた約０．９ｋｂｐのＤＮＡ断片を、TOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を使ってクローン化し、インサート部分の塩基配列を決定した。配列番号８の１５０３−２３８５番目の塩基配列を有するプラスミドをpCR-MaGPAT5-Pとした。
次に、このプラスミドを鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲによりプローブを作製した。反応には、ExTaq（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルしたプローブを作製し、ＭａＧＰＡＴ５プローブとした。これらのプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回；
検出は、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンにより、プラスミドを切り出し、各プラスミドＤＮＡを得た。MaGPAT5プローブでスクリーニングして得られたプラスミドのうち、最もインサート長の長いものは、配列番号１１の塩基配列を含ん
でおり、プラスミドpB-MaGPAT5と名づけた。配列番号１１の塩基配列中のＯＲＦ検索を行った。その結果、配列番号１１の２２５−２２７番目を開始コドン、２５８９−２５９１番目を終止コドンとするＣＤＳが存在した。この配列より導かれるアミノ酸配列のblastp検索の結果などから、このＣＤＳがMaGPAT5をコードしていると考えられた。MaGPAT5をコードする遺伝子のＣＤＳを配列番号１０、ＯＲＦを配列番号８、これらの塩基配列から導かれるMaGPAT5のアミノ酸配列を配列番号９に示した。
（３）配列解析
MaGPAT4遺伝子のゲノム配列（配列番号７）とＣＤＳ配列（配列番号３）を比較したところ、本遺伝子のゲノム配列は、エクソン１０つ、イントロン９つからなり、８２５個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていると考えられた（図１及び図２）。一方、MaGPAT5遺伝子のゲノム配列（配列番号１２）とＣＤＳ配列（配列番号１０）を比較したところ、本遺伝子のゲノム配列は、エクソン３つ、イントロン２つからなり、７８８個のアミノ酸残基からなるタンパク質をコードしていると考えられた（図３、図４）。
MaGPAT4、MaGPAT5と既知のモルティエレラ アルピナ由来のＧＰＡＴホモログとを比較した。ＣＤＳ配列とＣＤＳ配列から導かれるアミノ酸配列の同一性を表２及び表３にそれぞれ示した。
MaGPAT4の推定アミノ酸配列（配列番号２）をGenBank nrに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpにて相同性解析を行ったところ、この配列に対して最もE-valueの低かった、すなわち同一性の高かったアミノ酸配列は、子嚢菌Chaetomium globosum CBS 148.51由来の推定タンパク質のアミノ酸配列（GenBank accession No. XP 001224211）であり、同一性は３９．３％であった。また、動物由来のGlyceronephosphate O-acyltransferase（GNPAT）とも相同性があり、ヒト由来のＧＮＰＡＴ（GenBank accession No. AAH00450）とは同一性が２２．６％であった。さらに、大腸菌E.coli由来のＧＰＡＴであるｐｌｓＢタンパク質とのアミノ酸配列（GenBank accession No. BAE78043）の同一性は、１７．６％であった。MaGPAT4とこれらのアミノ酸配列とのアライメントを図５に示した。
一方、MaGPAT5の推定アミノ酸配列（配列番号９）をGenBank nrに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpにて相同性解析を行ったところ、この配列に対して最もE-valueの低かった、すなわち同一性の高かったアミノ酸配列は、担子菌Ustilago maydis 521由来の推定タンパク質UM03369のアミノ酸配列（GenBank accession No. XP 759516）であり、同一性は１５．４％であった。MaGPAT5とこれらのアミノ酸配列とのアライメントを図６に示した。
MaGPAT4、MaGPAT5ともに、アシル基転移酵素で保存されている領域が保存されており、特にアシル基転移酵素活性に重要であると考えられている＊印で示したるグリシン残基（Ｇ）とプロリン残基（Ｐ）が保存されていた。さらに、Ｇ３Ｐとの結合に重要であると考えられている＋印で示したセリン残基（Ｓ）も保存されていた（図５及び図６）。
実施例５： MaGPAT4の機能解析
（１）MaGPAT4の酵母用発現ベクターの構築
酵母発現用ベクターpYE22m（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）を制限酵素EcoRIとSalIで消化したＤＮＡ断片と、プラスミドpCR-MaGPAT4を制限酵素EcoRIと制限酵素SalIで消化し、得られた約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片をligation high（TOYOBO）で連結し、プラスミドpYE-MaGPAT4を構築した。
また、比較のために、MaGPAT1、MaGPAT2及びMaGPAT3についても、酵母用発現ベクターを構築した。MaGPAT1及びMaGPAT2の酵母用発現ベクターについては、ＷＯ２００８／１５６０２６に記載されるように構築し、それぞれpYE-MaGPAT1及びpYE-MaGPAT2とした。MaGPAT3の酵母用発現ベクターについては、以下のように調製した。MaGPAT1（ATCC ＃16266）のアミノ酸配列をクエリーとして、上記の実施例１のようにして得られたM. alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、tblastnにより検索した結果、MaGPAT1と相同性を有する遺伝子が得られ、これをMaGPAT3と命名した（本願出願時未公開）。以下のプライマー：
Eco-MaGPAT3-F：５’−GAATTCATGGGTCTCCAGATCTATGACTTCGTCTC−３’（配列番号２６）
Sal-MaGPAT3-R：５’−GTCGACTTATGCCTCCTTAGACTTGACTGCATCC−３’（配列番号２７）
を作成し、上記の実施例２に記載のｃＤＮＡを鋳型として、これらのプライマーでKOD-Plus-（東洋紡）を用いてＰＣＲをしたところ、約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。これをZero Blunt TOPO PCRクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローン化し、得られたプラスミドをpCR-MaGPAT3とした。プラスミドpCR-MaGPAT3を制限酵素EcoRIとSalIで消化して得られた約２．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、酵母発現用ベクターpYE22mのEcoRI、SalIサイトに挿入し、プラスミドpYE-MaGPAT3を得た。
（２）形質転換株の取得
プラスミドpYE22m、pYE-MaGPAT4、pYE-MaGPAT1、pYE-MaGPAT2、pYE-MaGPAT3をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母S. cerevisiae EH13-15株（trp1，MATα）（Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989）を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids（DIFCO）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）上で生育するものとして選抜した。
（３）酵母の培養
プラスミドpYE22mを用いて形質転換して得られた任意の２株をＣ−１株、Ｃ−２株とし、またプラスミドpYE-MaGPAT4を用いて形質転換して得られた任意の２株をMaGPAT4-1株、MaGPAT4-2株として、以下の培養実験に供した。また、比較のために、プラスミドpYE-MaGPAT1を用いて形質転換して得られた任意の２株をMaGPAT1-1株、MaGPAT1-2株とし、プラスミドpYE-MaGPAT2を用いて形質転換して得られた任意の２株をMaGPAT2-1株、MaGPAT2-2株とし、及びプラスミドpYE-MaGPAT3を用いて形質転換して得られた任意の２株をMaGPAT3-1株、MaGPAT3-2株として、MaGPAT4-1株及びMaGPAT4-2株と同様に以下の培養実験に供した。
前培養として、SC-Trp培地１０ｍｌに酵母をプレートから１白金耳植菌し、３０℃で１日間振とう培養を行った。本培養は、SC-Trp培地又はＹＰＤ（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、グルコース２％）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振とう培養を行った。
（４）菌体の脂肪酸分析
酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。凍結乾燥菌体にクロロホルム：メタノール（２：１）を４ｍｌ添加し、激しく攪拌した後、７０℃で１時間処理した。遠心分離により菌体を分離し、溶媒を回収した。残った菌体に再度クロロホルム：メタノール（２：１）を４ｍｌ添加し、同様に溶媒を回収した。スピードバックで脂質を乾固したのち、２ｍｌのクロロホルムを添加して脂質を溶解した。この試料のうち、２００μｌを分取し、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出、ヘキサンを留去し、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
結果を表４、表５、表６及び表７に示す。
表４及び表５に示したとおり、MaGPAT4を高発現させた株の菌体内の脂質を構成する脂肪酸組成は、ベクターのみを導入したコントロール株と比較して、パルミチン酸（16:0）の比率が上昇し、パルミトレイン酸（16:1）の比率が低下していた。この傾向は、モルティエレラ アルピナ由来の他のＧＰＡＴであるMaGPAT1、MaGPAT2、及びMaGPAT3を用いた場合の傾向とは異なる。したがって、本発明のMaGPAT4は他のモルティエレラ アルピナ由来のＧＰＡＴとは異なる基質特異性を有している。
また、表６及び表７に示したとおり、菌体内の脂肪酸含有率は、MaGPAT4を高発現させた株では、コントロール株に比べておよそ２倍に上昇していた。
実施例６： MaGPAT4-long及びMaGPAT4の機能解析
（１）ガラクトース誘導型発現ベクターの構築
MaGPAT4-long又はMaGPAT4をガラクトースで発現誘導させるために、以下のとおり、ガラクトース誘導型のプロモーターを持つプラスミドを構築した。
実施例２で調製したｃＤＮＡを鋳型として、プライマーNot-MaGPAT4-F1とプライマーBam-MaGPAT4-R、又はプライマーNot-MaGPAT4-F2とプライマーBam-MaGPAT4-Rの組み合わせで、ExTaq（タカラバイオ）を用いて、９４℃ ２分、（９４℃ １分、５５℃ １分、７２℃ １分）３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。増幅された約２．7ｋｂｐ又は約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO-TAクローニングキット（Invitrogen）を使ってクローン化し、それぞれ、配列番号６のGPAT4-longのＣＤＳ配列、又は、配列番号３のGPAT4のＣＤＳ配列を有することを確認し、それぞれプラスミドpCR-MaGPAT4-long-1又はプラスミドpCR-MaGPAT4-1とした。ベクターpESC-TRP（ストラタジーン）を、制限酵素NotIとBglIIで消化して得られた約６．５ｋｂｐのDNA断片と、プラスミドpCR-MaGPAT4-long-1又はプラスミドpCR-MaGPAT4-1を制限酵素NotIとBamHIで消化して得られた約２．７ｋｂｐ又は２．５ｋｂｐのDNA断片を、ligation high（TOYOBO）を用いて連結し、プラスミドｐESC-T-MaGPAT4-long又はプラスミドｐESC-T-MaGPAT4を得た。
プライマー Not-MaGPAT4-F1： ５’−GCGGCCGCATGACAACCGGCGACAGTACCG−３’（配列番号２８）
プライマー Not-MaGPAT4-F2： ５’−GCGGCCGCATGCCCATCGTTCCAGCTCAG−３’（配列番号２９）
プライマー Bam-MaGPAT4-R： ５’−GGATCCTTATAATTTCGGGGCGCCATCG−３’（配列番号３０）
（２）形質転換株の取得
pESC-TRP、ｐESC-T-MaGPAT4-long、ｐESC-T-MaGPAT4をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母S. cerevisiae EH13-15株を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp寒天培地上で生育するものとして選抜した。
（３）酵母の培養
各プラスミドで形質転換して得られた任意の４株ずつを、前培養として、SD-Trp液体培地１０ｍｌにそれぞれ植菌し、３０℃で１日間、振とう培養した。本培養として、得られた前培養液のうち１ｍｌを、それぞれSG-Trp（１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids（DIFCO）６．７ｇ、ガラクトース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）液体培地１０ｍｌに、各株２本ずつ植菌し、３０℃で２日間振とう培養し、MaGPAT4-long又はMaGPAT4の発現を誘導した。
（４）脂質分析
酵母の培養液を遠心分離することにより、菌体を回収した。１０ｍｌの滅菌水で洗浄し、遠心分離により再び菌体を回収し、凍結乾燥した。各株の１本の菌体の脂肪酸を塩酸メタノール法によりメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、菌体内に含まれる総脂肪酸を分析した（表８）。
一方、各株の残りの１本の菌体から、以下のとおり、脂質を抽出した。すなわち、１ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）とガラスビーズを加え、ビーズビーターにて菌体を破砕したあと、遠心分離して上清を回収した。残った菌体にさらに１ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）を加え、同様にして、上清を回収することを繰り返し、総量４ｍｌのクロロホルム：メタノール（２：１）で脂質を回収した。スピードバックを使って、溶媒を留去し、残渣を少量のクロロホルムに溶かした。シリカゲル６０ プレート（メルク）、展開溶媒ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸 ７０：３０：１の条件で薄層クロマトグラフィーを行い、脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧し、紫外線を照射することにより脂質を検出した。トリアシルグリセロール（ＴＧ）画分、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）画分、ジアシルグリセロール（ＤＧ）画分とリン脂質（ＰＬ）画分をそれぞれかきとって試験管に集め、塩酸メタノール法により脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った（表９、図７）。
以下に、各遺伝子導入株の分析結果を示す。ベクターであるpESC-TRP導入株をコントロールとした。
総脂肪酸量は、コントロールと比べて、MaGPAT4-long又はMaGPAT4を発現させた株では、それぞれ、１．７倍、２．０倍に増加した（表８）。
ＰＬの量は、MaGPAT4-long、MaGPAT4を発現させた株でも、コントロールに対して、それぞれ１．１倍、１．２倍と、差がほとんどなかった。一方、ＴＧ量は、MaGPAT4-long又はMaGPAT4を発現させた株では、コントロールに比べてMaGPAT4-long、MaGPAT4を発現させた株で、２．８倍、３．５倍と、大きく増加していた。すなわち、MaGPAT4-long又はMaGPAT4を発現させることで、脂肪酸の生合成を活性化し、貯蔵脂質であるＴＧの生産性を高めることができた。さらに、ＤＧやＦＦＡも、MaGPAT4-long、MaGPAT4を発現させた株ではコントロールに比べて増加していた（表９）。
各脂質画分の脂肪酸組成を図７に示した。ＦＦＡ画分の組成は、コントロールとMaGPAT4-long又はMaGPAT4を発現させた株でほとんど差がなかった。これに対し、そのほかの画分では、MaGPAT4-long又はMaGPAT4を発現させた株では、飽和脂肪酸が増加し、不飽和脂肪酸が減少する傾向があり、特に１６：０（パルミチン酸）が増加し、１６：１（パルミトレイン酸）が減少していた。
なお、本培養として、SG-Trp液体培地の代わりに、SC-Trp液体培地を使用した場合についても検討した。SC-Trp液体培地はガラクトースを含まないため、この培地を使用して本培養を行う場合は、形質転換により導入したMaGPAT4-long又はMaGPAT4の発現は誘導されない。SC-Trp液体培地を使用した実験では、菌体の総脂肪酸の量、組成とも、コントロールとMaGPAT4-long、MaGPAT4導入株間で、差は認められなかった（表１０、図８）。このことからも、MaGPAT4-long又はMaGPAT4の発現がガラクトースにより誘導された結果、ＳG-Trp培地においては、菌体内の脂肪酸が増加したといえる。
実施例７： 酵母S.cerevisiae Δｓｃｔ１、Δｇｐｔ２相補実験
酵母S.cerevisiaeでは、ＧＰＡＴ活性を担う遺伝子としてＳＣＴ１とＧＰＴ２が知られており、これらを同時に欠失させると致死であることが知られている。モルティエレラ アルピナ由来のMaGPAT4、MaGPAT4-longの産物がＧＰＡＴ活性を有するかどうかを確認するため、Δｓｃｔ１、Δｇｐｔ２の相補実験をおこなった。表１１に、以下のとおり作製した株の遺伝子型をまとめた。
（１）ＧＰ−１株の作製
Yeast knock out strain collection（オープンバイオシステムズ）のΔｇｐｔ２ホモ接合２倍体酵母（カタログNo.YSC1021-663938）のＳＣＴ１遺伝子を以下のとおり破壊した。まず、S.cerevisiae S288C株の菌体から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（タカラバイオ）を用いてＤＮＡを抽出した。これを鋳型として、プライマーXba1-Des-SCT1-F：５’−TCTAGAATGCCTGCACCAAAACTCAC−３’（配列番号３１）とプライマーXba1-Des-SCT1-R：５’−TCTAGACCACAAGGTGATCAGGAAGA−３’（配列番号３２）で、KOD-Plus-(東洋紡)を用いてＰＣＲをし、ＳＣＴ１遺伝子の部分配列を増幅した。増幅された約１．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Zero Blunt TOPO PCRクローニングキット（インビトロジェン）を用いてクローン化し、得られたプラスミドをpCR-SCT1Pとした。続いて、プラスミドＹＥｐ１３を制限酵素SalIとXhoIで消化して得られたＬＥＵ２遺伝子のＣＤＳを含む約２．２ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドｐCR-SCT1PをSalIで消化して得られた約４．４ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ligation high(東洋紡)により連結し、ＳＣＴ１遺伝子に対してＬＥＵ２遺伝子が逆向きに挿入されたプラスミドをpCR-Δsct1：LEU2とした。これを制限酵素XbaIで消化し、上記Δｇｐｔ２ホモ接合２倍体酵母を酢酸リチウム法により形質転換して、SD-Leu（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）で生育できるものを選抜した。得られた形質転換株の菌体から上述の方法でＤＮＡを抽出した。（ａ）プライマー SCT1outORF-F：５’−AGTGTAGGAAGCCCGGAATT−３’（配列番号３３）とプライマー SCT1inORF-R：５’−GCGTAGATCCAACAGACTAC−３’（配列番号３４）（０．５ｋｂｐ）、（ｂ）プライマー SCT1outORF-Fとプライマー LEU2inORF-F：５’−TTGCCTCTTCCAAGAGCACA−３’（配列番号３５）（１．２ｋｂｐ）の組み合わせでＰＣＲを行うことで遺伝子型を確認、すなわち、ＳＣＴ１／Δｓｃｔ１：ＬＥＵ２であることを確認し、ＧＰ−１株とした。
（２）ＵＲＡ３をマーカーとするガラクトース誘導型発現ベクターの構築
ベクターpESC-URA(ストラタジーン)を、制限酵素NotIとBglIIで消化して得られた約６．６ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドpCR-MaGPAT4-long-1又はプラスミドpCR-MaGPAT4-1を制限酵素NotIとBamHIで消化して得られた約２．７ｋｂｐ又は２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、ligation high（TOYOBO）を用いて連結し、プラスミドｐESC-U-MaGPAT4-long又はプラスミドｐESC-U-MaGPAT4を得た。
（３）形質転換株の取得
ｐESC-URA、pESC-U-MaGPAT4-long又はpESC-U-MaGPAT4をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母ＧＰ−１株を形質転換した。形質転換株は、SC-Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ロイシン１．８ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）で生育できるものを選抜した。ｐESC-URAで形質転換して得られた株を、C-D株、pESC-U-MaGPAT4-long、pESC-U-MaGPAT4で形質転換して得られた株を、それぞれMaGPAT4-long-D株、MaGPAT4-D株とした。
（４）胞子形成と四分子分析
C-D株とMaGPAT4-long-D株、MaGPAT4-D株をそれぞれＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で１日間培養した。生育した菌体を、胞子形成用寒天培地（０．５％酢酸カリウム、２％アガー）に塗布し、２０℃で７日間培養した。得られた菌体を適当量掻きとって、１００μｌのザイモリアーゼ溶液（０．１２５ｍｇ／ｍｌ ザイモリアーゼ１００Ｔ、１Ｍ ソルビトール、４０ｍＭ リン酸カリウムバッファー（ｐＨ６．８））に懸濁し、室温で３０分間インキュベートしたあとチューブを氷中に移した。顕微鏡下で、子嚢胞子が形成されていることを確認した後、ＹＰＧａｌ（酵母エキス ２％、ペプトン １％、ガラクトース ２％）寒天培地上でマイクロマニピュレーションにより４個の子嚢胞子を分離し、３０℃で２日間インキュベートし、それぞれの胞子に由来するコロニーを得た。
得られた胞子クローンを、SG-Ura（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、ガラクトース ２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ロイシン１．８ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）、及びSG-Leu（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、ガラクトース ２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）寒天培地（２％アガー）にレプリカし、３０℃で３日間インキュベートして、ウラシル要求性とロイシン要求性を調べた。ウラシル要求性を示す場合、導入したプラスミドが脱落したものと考えられたので、以下の解析からは除いた。
C-D株から分離した４個の子嚢胞子のうち、ＹＰＧａｌ寒天培地上で生育できたものは、いずれも２個で、すべての株がロイシン要求性であった。一方、MaGPAT4-long-D株とMaGPAT4-D株から分離した４個の子嚢胞子は、いずれも４個ともＹＰＧａｌ寒天培地上で生育できた。ロイシン要求性を調べたところ、ロイシン要求性株とロイシン非要求性株がそれぞれ２個ずつであった。
得られた株の遺伝子型を調べるため、、菌体より上述のとおりＤＮＡを抽出し、（ａ）プライマーSCT1outORF-FとプライマーSCT1inORF-R、（ｂ）プライマーSCT1outORF-FとプライマーLEU2in ORF-Fの組み合わせでＰＣＲを行った。その結果、ロイシン非要求性株では（ａ）ではＰＣＲによる増幅がみられず（ｂ）では増幅がみられたことから、これらの株はΔｓｃｔ１：ＬＥＵ２アレルを有する株であることが確認できた。また、ロイシン要求性株では（ａ）ではＰＣＲによる増幅がみられ（ｂ）では増幅がみられなかったことから、これらの株はＳＣＴ１アレルを有する株であることが確認できた。
さらに、MaGPAT4-long-D株とMaGPAT4-D株から分離した４個の子嚢胞子由来の株をＹＰＤ寒天培地上に塗布すると、生育のよい株と著しく生育の悪い株がそれぞれ２個ずつであり、生育の悪い株はΔｓｃｔ１：ＬＥＵ２アレルを有するロイシン非要求性株と一致していた。
これらのことから、酵母のGPAT活性を担う２つの遺伝子を破壊したΔｓｃｔ１、Δｇｐｔ２株は致死であるが、MaGPAT4-longあるいはMaGPAT4を発現させることで、生育が可能になることが確認できた。すなわち、MaGPAT4-longタンパク質及びMaGPAT4タンパク質はＧＰＡＴ活性を有することが強く示唆された。
実施例８： モルティエレラ アルピナにおけるGPAT4の過剰発現
（１）M. alpina用発現ベクターの構築
GPAT4をM.alpinaで発現させるために、以下のとおり、ベクターを構築した。
まず、ベクターｐＵＣ１８を制限酵素EcoRIとHindIIIで消化し、オリゴＤＮＡ MCS-for-pUC18-F2とMCS-for-pUC18-R2をアニーリングさせたアダプターを挿入し、プラスミドpUC18-RF2を構築した。
MCS-for-pUC18-F2：５’−AATTCATAAGAATGCGGCCGCTAAACTATTCTAGACTAGGTCGACGGCGCGCCA−３’（配列番号３６）
MCS-for-pUC18-R2：５’−AGCTTGGCGCGCCGTCGACCTAGTCTAGAATAGTTTAGCGGCCGCATTCTTATG−３’（配列番号３７）
M.alpinaのゲノムを鋳型として、プライマーNot1-GAPDHt-FとプライマーEcoR1-Asc1-GAPDHt-Rを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたＰＣＲで増幅した約０．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン）にてクローン化した。インサート部分の塩基配列を確認したあと、制限酵素NotIとEcoRIで消化して得られた約０．９ｋｂｐのDNA断片をプラスミドpUC18-RF2のNotI、EcoRIサイトに挿入し、プラスミドpDG-1を構築した。
プライマー Not1-GAPDHt-F：５’−AGCGGCCGCATAGGGGAGATCGAACC−３’（配列番号３８）
プライマー EcoR1-Asc1-GAPDHt-R：５’−AGAATTCGGCGCGCCATGCACGGGTCCTTCTCA−３’（配列番号３９）
M.alpinaのゲノムを鋳型として、プライマーURA5g-F1とプライマーURA5g-R1を使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片を、Zero Blunt TOPO PCR Cloning Kit（インビトロジェン）にてクローン化した。インサート部分の塩基配列を確認したあと、制限酵素SalIで消化して得られた約２ｋｂｐのＤＮＡ断片をプラスミpDG-1のSalIサイトに挿入し、ＵＲＡ５遺伝子の５’側がベクターのEcoRI側になる向きで挿入されたものをプラスミドpDuraGとした。
プライマー URA5g-F1：５’−gtcgaccatgacaagtttgc−３’（配列番号４０）
プライマー URA5g-R1：５’−GTCGACTGGAAGACGAGCACG−３’（配列番号４１）
続いて、M.alpinaのゲノムを鋳型プライマーhisHp+URA5-FとプライマーhisHp+MGt-Fを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたＰＣＲで増幅した約１．０ｋｂｐのＤＮＡ断片と、pDuraGを鋳型として、プライマーpDuraSC-GAPt-FとプライマーURA5gDNA-Fを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたＰＣＲで増幅した約５．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を、In-Fusion（登録商標） Advantage PCR Cloning Kit （タカラバイオ）を使って連結し、プラスミドpDUra-RhGを得た。
プライマー hisHp+URA5-F：５’−GGCAAACTTGTCATGAAGCGAAAGAGAGATTATGAAAACAAGC−３’（配列番号４２）
プライマー hisHp+MGt-F：５’−CACTCCCTTTTCTTAATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGT−３’（配列番号４３）
プライマー pDuraSC-GAPt-F：５’−TAAGAAAAGGGAGTGAATCGCATAGGG−３’（配列番号４４）
プライマー URA5gDNA-F：５’−CATGACAAGTTTGCCAAGATGCG−３’（配列番号４５）
プラスミドpDUra-RhGを鋳型として、プライマーpDuraSC-GAPt-FとプライマーpDurahG-hisp-Rを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたＰＣＲで約６．３ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
プライマー pDurahG-hisp-R：５’−ATTGTTGAGAGAGTGTTGGGTGAGAGTG−３’（配列番号４６）
プラスミドpCR-MaGPAT4-1を鋳型として、プライマー MaGPAT4+hisp-Fとプライマー MaGPAT4+MGt-Rを使って、KOD-plus-（TOYOBO）を用いたＰＣＲで約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片を増幅した。
プライマー MaGPAT4+hisp-F：５’−CACTCTCTCAACAATATGACAACCGGCGACAGTACCGC−３’（配列番号４７）
プライマー MaGPAT4+MGt-R：５’−CACTCCCTTTTCTTATTATAATTTCGGGGCGCCATCGC−３’（配列番号４８）
得られた２．５ｋｂｐ断片を、上記６．３ｋｂｐのＤＮＡ断片と、In-Fusion（登録商標） Advantage PCR Cloning Kit （タカラバイオ）を使って連結し、プラスミドpDUraRhG-GPAT4を得た。
（２）M.alpina形質転換株の取得
特許文献（WO2005/019437、発明の名称：「脂質生産菌の育種方法」）に記載の方法にしたがってM. alpina 1S-４株より誘導したウラシル要求性株Δｕｒａ−３を宿主としてパーティクルデリバリー法で、プラスミドpDUraRhG-GPAT4を用いて、それぞれ形質転換を行った。形質転換株の選択には、ＳＣ寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）０．５％、硫酸アンモニウム０．１７％、グルコース２％、アデニン０．００２％、チロシン０．００３％、メチオニン０．０００１％、アルギニン０．０００２％、ヒスチジン０．０００２％、リジン０．０００４％、トリプトファン０．０００４％、スレオニン０．０００５％、イソロイシン０．０００６％、ロイシン０．０００６％、フェニルアラニン０．０００６％、寒天２％）を用いた。
（３）形質転換M.alpinaの評価
得られた形質転換株を、ＧＹ培地４ｍｌに植菌し、２８℃で２日間振とう培養を行った。菌体をろ過により回収し、RNeasy plant kit（QIAGEN）を用いてＲＮＡを抽出した。スーパースクリプトファーストストランドシステム for RT-PCR（インビトロジェン）によりｃＤＮＡを合成した。導入したコンストラクトからの各遺伝子の発現を確認するため、以下のプライマーの組み合わせでRT-PCRを行った。
プライマー GPAT4-RT1：５’−gagtgcttcatcgagggcacC−３’（配列番号４９）
プライマー GPAT4-RT2：５’−TCCTTCACTGTCAACCTCGATCAC−３’（配列番号５０）
過剰発現を確認できた株のうち、１株について、ＧＹ培地（グルコース２％、酵母エキス１％）１０ｍｌに植菌し、２８℃、３００ｒｐｍで３日間振とう培養した。これをＧＹ培地５００ｍｌ(２Ｌ坂口フラスコ)に全量移し、２８℃、１２０ｒｐｍで振とう培養した。ここから３日後、７日後、１０日後、１２日後にそれぞれ５ｍｌ、１０ｍｌずつ分取し、濾過した。菌体を１２０℃で乾燥させ、塩酸メタノール法により、脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにより、脂肪酸分析を行った。乾燥菌体あたりのアラキドン酸生産量の経時変化を調べた。なお、形質転換の宿主であるΔｕｒａ−３株をコントロールとした。結果を図９に示す。
GPAT4をM.alpinaで過剰発現させた場合、菌体あたりのアラキドン酸（ＡＡ）量が、コントロールに比べて増加していた。
配列番号１６：プライマー GPAT4-S
配列番号１７：プライマーSacI-GPAT4-1
配列番号１８：プライマー Sal-GPAT4-2
配列番号１９：プライマー GPAT5-1F
配列番号２０：プライマー GPAT5-3R
配列番号２６：プライマー Eco-MaGPAT3-F
配列番号２７：プライマー Sal-MaGPAT3-R
配列番号２８：プライマーNot-MaGPAT4-F1
配列番号２９：プライマーNot-MaGPAT4-F2
配列番号３０：プライマーBam-MaGPAT4-R
配列番号３１：プライマーXba1-Des-SCT1-F
配列番号３２：プライマーXba1-Des-SCT1-R
配列番号３３：プライマーSCT1outORF-F
配列番号３４：プライマーSCT1inORF-R
配列番号３５：プライマーLEU2inORF-F
配列番号３６：オリゴＤＮＡMCS-for-pUC18-F2
配列番号３７：オリゴＤＮＡMCS-for-pUC18-R2
配列番号３８：プライマーNot1-GAPDHt-F
配列番号３９：プライマーEcoR1-Asc1-GAPDHt-R
配列番号４０：プライマー URA5g-F1
配列番号４１：プライマー URA5g-R1
配列番号４２：プライマーhisHp+URA5-F
配列番号４３：プライマーhisHp+MGt-F
配列番号４４：プライマーpDuraSC-GAPt-F
配列番号４５：プライマー URA5gDNA-F
配列番号４６：プライマーpDurahG-hisp-R
配列番号４７：プライマーMaGPAT4+hisp-F
配列番号４８：プライマーMaGPAT4+MGt-R
配列番号４９：プライマー GPAT4-RT1
配列番号５０：プライマー GPAT4-RT2

Claims (13)

  1. 以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
  2. 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかである、請求項１に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
  3. 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８で示される塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号３、配列番号６又は配列番号１１で示される塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号７又は配列番号１２で示される塩基配列を含む核酸
  4. 以下の（ａ）〜（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のグリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素欠損（以下、「ＧＰＡＴ欠損」と記載する場合もある）を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｃ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｄ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｅ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｆ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｇ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
  5. 以下の（ａ）〜（ｄ）のいずれかである、請求項４に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｂ）配列番号１、配列番号４又は配列番号８からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｃ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｄ）配列番号７又は配列番号１２からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質をコードするエクソンを有する塩基配列を含む核酸
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
  6. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
  7. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素活性及び／又はグリセロンホスフェートアシル基転移酵素活性を有するタンパク質
  8. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜８０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
  9. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９において１〜５０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
    （ｂ）配列番号２、配列番号５又は配列番号９からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、以下のi)ないしv)のいずれかの活性を有するタンパク質
    i) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸組成において、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸組成と比較して、パルミチン酸の比率が高く、パルミトレイン酸の比率が低い脂肪酸組成を形成できる活性
    ii) 前記タンパク質を発現させた酵母の脂肪酸含有率が、前記タンパク質を発現していない宿主の脂肪酸含有率と比較して高い含有率を達成する活性
    iii) 前記タンパク質を発現させた酵母のトリアシルグリセロール（ＴＧ）量が、前記タンパク質を発現していない宿主のＴＧ量と比較して高いＴＧ量を達成する活性
    iv) 酵母（S. cerevisiae）のＧＰＡＴ欠損を相補する活性
    v) 前記タンパク質をコードする核酸を含有する組換えベクターによって形質転換された宿主におけるアラキドン酸の生産量を、前記ベクターで形質転換されていない宿主における生産量よりも高めることができる活性
  10. 配列番号２、配列番号５又は配列番号９で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
  11. 請求項１〜５のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
  12. 請求項１１に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
  13. 請求項１２に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸又は脂質を採取することを特徴とする、脂肪酸組成物の製造方法。
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