JP5255695B2 - 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ - Google Patents

新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ Download PDF

Info

Publication number
JP5255695B2
JP5255695B2 JP2011504871A JP2011504871A JP5255695B2 JP 5255695 B2 JP5255695 B2 JP 5255695B2 JP 2011504871 A JP2011504871 A JP 2011504871A JP 2011504871 A JP2011504871 A JP 2011504871A JP 5255695 B2 JP5255695 B2 JP 5255695B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
protein
seq
amino acid
nucleic acid
base sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2011504871A
Other languages
English (en)
Other versions
JPWO2010107070A1 (ja
Inventor
美佐 落合
英治 櫻谷
昌 清水
順 小川
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Suntory Holdings Ltd
Original Assignee
Suntory Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Holdings Ltd filed Critical Suntory Holdings Ltd
Priority to JP2011504871A priority Critical patent/JP5255695B2/ja
Publication of JPWO2010107070A1 publication Critical patent/JPWO2010107070A1/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP5255695B2 publication Critical patent/JP5255695B2/ja
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
    • C12P7/6409—Fatty acids
    • C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
    • C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
    • C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
    • C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/14—Plant cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
    • C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
    • C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)

Description

本発明は、新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼに関する。
脂肪酸は、リン脂質やトリアシルグリセロール等脂質を構成する重要な成分である。不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）と総称され、アラキドン酸やジホモγリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸等が知られており、様々な生理活性が報告されている（非特許文献１）。
このうち、アラキドン酸は、プロスタグランジンやロイコトリエンなどへの中間代謝物として注目され、機能性食品や医薬品の素材に適用する試みが数多くなされている。さらに、アラキドン酸は、母乳中に含まれており乳児の発育、特に、胎児の身長や脳の発育において重要であり、乳児の発育に必要な成分として、ＤＨＡ（ドコサヘキサエン酸）とともに栄養学的見地からも注目されている。
この高度不飽和脂肪酸は様々な分野での利用が期待されているが、動物体内で合成できないものも含まれている。そこで、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。また、植物で高度不飽和脂肪酸を生産させる試みもなされている。こうした場合、高度不飽和脂肪酸は、例えばトリアシルグリセロール等の貯蔵脂質の構成成分として、微生物の菌体内若しくは植物種子中に蓄積されることが知られている。
原核生物と真核生物では、新規脂肪酸合成、脂肪酸鎖長延長に関わる酵素の分子構造は異なっているが、酵素反応のメカニズムはどのタイプの細胞でも同じである。脂肪酸の生合成は、アセチルＣｏＡが出発物質となっており、アセチルＣｏＡからアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ(E.C.6.4.1.2)の触媒作用により、マロニルＣｏＡが生成する。脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）により、アセチルＣｏＡにマロニルＣｏＡが縮合・還元・脱水・還元の一連の反応により脱炭酸的に結合して炭素数が２つずつ伸長していき、各種飽和脂肪酸が合成される。また、脂肪酸鎖長延長反応においても、アシルＣｏＡに、マロニルＣｏＡが縮合・還元・脱水・還元の一連の反応により脱炭酸的に結合して炭素数が２つずつ伸長していく。
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（以後、「ＡＣＣ」と記載する場合もある）は、これまでにいくつかの生物で報告されている。哺乳類のＡＣＣは典型的なアロステリック酵素であり、クエン酸により活性型へ移行し、長鎖脂肪酸ＣｏＡエステルにより阻害され、リン酸化により不活性化されるという性質を有する。菌類では、酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＣＣがよく研究されている。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＡＣＣは、細胞質とミトコンドリアに局在しており、それぞれＡＣＣ１及びＨＦＡ１遺伝子によりコードされている。ＡＣＣ１遺伝子は必須遺伝子であり、欠失させると致死することが知られている（非特許文献２）。変異株の解析から、ＡＣＣ１遺伝子は、核からのポリＡ付加ｍＲＮＡの輸送等にも関与していることが知られている（非特許文献３）。
植物では、ＡＣＣ遺伝子を使って種子中の油脂を増加させる試みがなされている（非特許文献４）。例えばシロイヌナズナのＡＣＣをナタネで発現させた場合は、組換え体の種子において乾燥重量あたりの脂肪酸量が増加し、さらに脂肪酸組成も変化したことが報告されている（非特許文献５）。しかし、宿主生物が本来有する脂肪酸組成によって、また導入するＡＣＣ遺伝子によって、どのように脂肪酸組成が変化するかが異なっている。一方、ＡＣＣの活性は、発現レベルだけではなく、タンパク質レベルでも様々な調節を受けており（非特許文献３及び４）、一連の脂肪酸合成系で機能する他の酵素タンパク質との相互作用も問題となる。ゆえに、所望の脂肪酸組成物を得るには、遺伝子導入の宿主となる生物に応じて、適切なＡＣＣ遺伝子が必要であると考えられる。
脂質生産菌であるＭｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ ａｌｐｉｎａ（以下、「Ｍ．ａｌｐｉｎａ」と記載する場合もある）のＡＣＣ遺伝子については、ＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログとしてＡＣＣ活性を有すると考えられる遺伝子の部分配列が既に公知である（非特許文献６）。しかし、当該配列を含むタンパク質がＡＣＣ活性を有することまでは確認されていない。また、Ｍ．ａｌｐｉｎａ ＣＢＳ６９６．７０株では、油脂の蓄積とアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性について調べられている（非特許文献７）。
Lipids, 39, 1147 (2004) Giaever G, et al. Nature 418, 387-91(2002) O.Tehlivets et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1771, 255-270 (2007) Biosci. Biotechnol. Biochem.,68(6), 1175-1184,(2004) Plant Physiol. 113、75-81(1997) 国際塩基配列データベース アクセッション番号ＡＪ５８６９１５ Microbiology,145,1911-1917(1999)
しかしながら、これまでに報告されているＡＣＣ遺伝子は、宿主細胞に導入して発現させた場合の脂質代謝への影響が不十分であるといわれていた。そして、宿主によっては、油脂や脂肪酸の蓄積量の増減効果が十分に発揮されないという課題があった。そこで、宿主細胞に導入して発現させた場合に宿主の脂質代謝に影響を与えるような新規なタンパク質を同定することが求められている。また、利用価値の高い脂肪酸の含有量が高い油脂を生産しうるタンパク質を同定することが求められている。
本発明の目的は、宿主細胞で発現することで、宿主の脂質代謝に影響を与えたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりして、有用な油脂生産を可能とするタンパク質及び核酸を提供することである。
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Ｍ．ａｌｐｉｎａのＥＳＴ解析を行い、そこから既知のＡＣＣ遺伝子と同一性の高い配列を抽出した。さらに、ＡＣＣをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより全長ｃＤＮＡをクローニングした。それを酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して脂肪酸組成物の産生を試みた発明者は、従来のＡＣＣが発現した宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、異なる脂肪酸組成物を生成することができる新規なＡＣＣに関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１） 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（２） 以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（３） 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（４） 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（５） 以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかである、（４）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（６） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
（７） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
（８） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
（９） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
（１０） 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質
（１１） （１）〜（５）のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。
（１２） （１１）記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
（１３） （１２）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物。
（１４） （１２）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、（１３）記載の脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法。
（１５） （１３）記載の脂肪酸組成物を含む、食品。
（１６） 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（１７） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質
その他、本発明には以下の発明も含まれる。
（Ａ）以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個、好ましくは、１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と、ストリンジェントな条件下、好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上、好ましくは、９０％以上の塩基配列からなり、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上、好ましくは、９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下、好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（Ｂ）以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個、好ましくは、１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上、好ましくは、９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質
さらに、（Ａ）のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター（Ｃ）、当該組換えベクターによって形質転換された形質転換体（Ｄ）、（Ｃ）の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成が変化した当該形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物（Ｅ）、（Ｄ）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、脂肪酸組成物（Ｅ）を採取することを特徴とする、当該脂肪酸組成物（Ｅ）の製造方法（Ｆ）、及び当該脂肪酸組成物（Ｅ）を含む食品（Ｇ）も含まれる。
本発明のＡＣＣは、脂肪酸や貯蔵脂質の生産能の向上を図ることができるため、微生物や植物中での高度不飽和脂肪酸の生産性を向上させるものとして、好ましい。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
図１Ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列（配列番号４）及びそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。 図１Ｂは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列（配列番号４）及びそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。 図１Ｃは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列（配列番号４）及びそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。 図１Ｄは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列（配列番号４）及びそれから導かれるアミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。 図２Ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列及び公知のＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログの部分配列の核酸配列を比較した図である。 図２Ｂは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列及び公知のＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログの部分配列の核酸配列を比較した図である。 図２Ｃは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列及び公知のＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログの部分配列の核酸配列を比較した図である。 図２Ｄは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列及び公知のＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログの部分配列の核酸配列を比較した図である。 図３Ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）とＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣｃＤＮＡ部分配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２５）を比較した図である 図３Ｂは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）とＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣｃＤＮＡ部分配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２５）を比較した図である。 図３Ｃは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）とＭ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣｃＤＮＡ部分配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２５）を比較した図である。 図４Ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）と酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３４）及び同ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３５）を比較した図である。 図４Ｂは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）と酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３４）及び同ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３５）を比較した図である。 図４Ｃは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）と酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３４）及び同ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３５）を比較した図である。 図４Ｄは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）と酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３４）及び同ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３５）を比較した図である。 図４Ｅは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＡＣＣのｃＤＮＡ全長配列から導かれるアミノ酸配列（配列番号２）と酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来の細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３４）及び同ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐのアミノ酸配列（配列番号３５）を比較した図である。 図５は、プラスミドｐＳＤＹ−ＡＣＣを表す模式図である。hisH4.1pはＭ．ａｌｐｉｎａ由来ヒストンＨ４．１遺伝子のプロモーター、trpCtはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ由来trpC遺伝子のターミネーター、ura5はＭ．ａｌｐｉｎａ由来ｕｒａ５遺伝子、rDNAはＭ．ａｌｐｉｎａ由来１８Ｓ ｒＤＮＡの一部を示す。模式図中の矢印（→）は形質転換株の確認に用いたプライマーＡＣＣ−Ｆ７とプライマーｔｒｐＣｔ−Ｒの位置を示す。 図６は、Ｍ．ａｌｐｉｎａ形質転換株の乾燥菌体重量の経時変化を示すグラフである。縦軸は乾燥菌体重量（ｇ／チューブ）、横軸は培養時間（日）を示す。 図７は、Ｍ．ａｌｐｉｎａ形質転換株の脂肪酸生産量の経時変化を示すグラフである。縦軸は脂肪酸生産量（ｍｇ／Ｌ培地）、横軸は培養時間（日）を示す。 図８は、Ｍ．ａｌｐｉｎａ形質転換株の培養８日目における脂肪酸組成を示すグラフである。縦軸は脂肪酸組成、横軸は宿主細胞および各形質転換株を示す。グラフの凡例はそれぞれ以下のものを意味するＥＰＡ：エイコサペンタエン酸；ＡＲＡ：アラキドン酸；ＤＧＬＡ：ジホモ−γ−リノレン酸；ＧＬＡ：γ−リノレン酸；ＬＡ：リノール酸；ＯＡ：オレイン酸；ＳＡ：ステアリン酸；ＰＡ：パルミチン酸。
本発明は、ＡＴＰに依存したアセチルＣｏＡのカルボキシル化によりマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒することを特徴とする、Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ属由来の新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼに関する。
本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（以後、「ＡＣＣ」と記載する場合もある）によってアセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡを生成する反応は、脂肪酸生合成の主要な律速段階である。このことから、ＡＣＣは、脂肪酸合成の重要な中間体であるマロニルＣｏＡの供給を担う重要な酵素である。具体的には、ＡＣＣは、以下の反応を触媒する酵素である。
式１
すなわち、ＡＴＰに依存したアセチルＣｏＡのカルボキシル化によりマロニルＣｏＡを生成する反応を触媒する。この反応は以下の２段階で行われる。
式２
この反応により生成したマロニルＣｏＡが、新規脂肪酸合成反応、あるいは脂肪酸鎖長延長反応の基質となり、各種脂肪酸が生成する。このように、本発明のＡＣＣは脂肪酸生合成や脂質代謝の制御に重要な役割を担っていることが知られている。
本発明のＡＣＣにより生成するマロニルＣｏＡは、上記のように脂肪酸合成の基質であり、このマロニルＣｏＡの生成速度が生体内の脂肪酸生合成の律速となっている。具体的には、新規脂肪酸が合成される場合、アセチルＣｏＡを出発物質として、マロニルＣｏＡが縮合・還元・脱水・還元の一連の反応により脱炭酸的に結合して炭素数が２つずつ伸長して脂肪酸が合成される。例えば、炭素数が１６であるパルミチン酸では、縮合・還元・脱水・還元の一連の反応が７回行われることにより生成するが、このパルミチン酸のメチル末端の２個の炭素原子はアセチルＣｏＡに由来し、その他はマロニルＣｏＡに由来するものである。また、マロニルＣｏＡは脂肪酸生合成の中間体であるだけでなく、ポリケタイド生合成の中間体でもある。
さらに、本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、以下に詳述するように、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有する。
本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸
本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ（ＡＣＣ）に関連する配列としては、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４由来のＡＣＣのＯＲＦの領域を示す配列である配列番号１、アミノ酸配列である配列番号２、ＣＤＳの領域を示す配列である配列番号３及びｃＤＮＡの塩基配列である配列番号４、ゲノム塩基配列を示す配列番号５があげられる。このうち、配列番号３は配列番号４の第４５〜６７３４番目の塩基配列に相当し、配列番号１は配列番号４の第４５〜６７３１番目の塩基配列、及び、配列番号３の第１〜６６８４番目の塩基配列に相当する。配列番号５のゲノム配列はイントロンを５つ含んでおり、エキソン領域は、配列番号５の第１〜２７番目、第３１５〜６６５番目、第１２７１〜２８２８番目、第２９１７〜３４６３番目、第３５９０〜６２３９番目、第６３３９〜７８８９番目である。
本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含む核酸、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）配列番号４で示される塩基配列を含む核酸又は（ｄ）配列番号５で示される塩基配列を含む核酸等があげられる。
上記塩基配列を得るためには、ＡＣＣ活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のＡＣＣ活性を有するタンパク質と同一性の高いタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＡＣＣ活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはＭ．ａｌｐｉｎａがあげられるが、これに限定されない。
ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ2ＰＯ4、０．１％ Ｎａ2ＳＯ4、０．０５％ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．０５％ ＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
本発明のＡＣＣのｃＤＮＡ配列をＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＸを用いて相同性解析を行った結果、真核微生物のＡＣＣホモログと相同性を示した。既知のアミノ酸配列の中で最も同一性の高いのは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来の推定タンパク質ＲＯ３Ｇ＿０４９７７で、当該タンパク質をコードするＣＤＳと本願発明のＡＣＣのＣＤＳの塩基配列の同一性及びアミノ酸配列の同一性をｃｌｕｓｔａｌＷにて求めると、それぞれ６５．５％、６６．３％である。他の菌類由来のＡＣＣホモログの推定アミノ酸配列との同一性としては、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来（アクセッション番号ＥＡＡ３３７８１）のものとの同一性が５８．８％、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来（アクセッション番号ＥＡＬ９３１６３）のものとの同一性が５８．３％、また、酵母Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐ（配列番号３４）との同一性は５５．１％、ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐ（配列番号３５）との同一性は４４．７％である。
なお、Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＡＣＣ遺伝子については、ＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログの部分配列が公知であり、Ｇｅｎｂａｎｋに既に登録されている（核酸配列：アクセッション番号ＡＪ５８６９１５（非特許文献６）、アミノ酸配列：アクセッション番号ＣＡＥ５２９１４）。ＣＢＳ５２８．７２株由来のＣＤＳ部分は、配列番号１の第３４２〜１４３９番目の塩基配列に相当し、そのアミノ酸配列は、配列番号４の第１００〜４６５番目のアミノ酸配列に相当する。当該配列と、今回得られたＭ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４由来ｃＤＮＡ中のＣＢＳ５２８．７２株由来のＣＤＳ部分を比較すると、塩基配列の同一性は９１．３％であり、アミノ酸配列の同一性は９７．８％である。本発明のＭ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４由来ｃＤＮＡ中、公知のＣＢＳ５２８．７２株で開示がない部分の配列については、今までに報告がなく、すなわち、Ｍ．ａｌｐｉｎａのＡＣＣ遺伝子の全配列は、本発明で初めて明らかになった。今回新たに明らかになった部分の配列にはＡＣＣの機能にとって重要な領域等が複数存在しており、具体的には、ＡＣＣの活性に必須のビオチンカルボキシルキャリアープロテインドメイン、カルボキシルトランスフェラーゼドメイン、ビオチンが付加されるタンパク質で保存されている領域及びビオチンが付加される残基が存在することが明らかになった。
本発明はまた、上記配列番号１で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）、並びに、配列番号２で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質がＡＣＣ活性を有することを意味する。ＡＣＣ活性は、公知の方法を用いて測定できるが、例えば、J.B.C.,279, 21779-21786, 2004に記載の方法があげられる。
さらに、上記のＡＣＣ活性に加えて、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質は、酵母のＡＣＣ欠損を相補する活性を有するタンパク質（以下、「本発明の酵母ＡＣＣ欠損相補活性を有するタンパク質」という場合もある）である場合も含まれる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＡＣＣは、細胞質とミトコンドリアに局在しているが、このうち、細胞質に存在しているＡＣＣをコードするＡＣＣ１遺伝子は必須遺伝子であり、欠失させると致死であることが知られている（Biochim. Biophys. Acta, 1771, 255-270, 2007）。すなわち、ＡＣＣ１遺伝子が欠失した酵母は、通常は生育できないが、ＡＣＣ１遺伝子と同等の働きをする遺伝子を発現させた場合、相補され、生育することが可能になる。
ここで、本発明のＡＣＣについて、酵母ＡＣＣ欠損が相補されたことを確認する方法としては、酵母のＡＣＣ欠損株において、本発明のＡＣＣ遺伝子を発現させた場合、当該酵母のＡＣＣ活性が回復されたことを確認する方法であれば、いかなる方法でもよい。具体的な一例としては、例えば、細胞質型ＡＣＣをコードするＡＣＣ１遺伝子について、以下のように実施することができる。
すなわち、以下の実施例４でも具体的に説明しているように、２倍体酵母において、細胞質ＡＣＣをコードするＡＣＣ１遺伝子の対立遺伝子の１つのみを欠損させた異型接合株を作製し、続いてその株に本発明のＡＣＣ遺伝子の発現カセットをＡＣＣ１が載っている染色体とは別の染色体上に１つ挿入した株を作製する。当該菌株を胞子形成培地上に塗布し、子嚢胞子を形成させる。得られた菌体を、ランダム胞子分析、あるいは四分子分析により、胞子由来の１倍体株を得ることができる。このようにして得られた１倍体酵母の遺伝子型を調べ、本来生育できないＡＣＣ１欠損株において、本発明のＡＣＣ遺伝子の発現カセットが存在する場合にのみ生育できることが確認できれば、本発明のＡＣＣがＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中でＡＣＣ活性を相補できたと判断できる。
さらにまた、上記のＡＣＣ活性に加えて、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質は、宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性を有するタンパク質である場合も含まれる。すなわち、本発明のタンパク質は、宿主細胞を該タンパク質をコードする核酸で形質転換し、そして該タンパク質を発現させた場合に、該形質転換細胞が産生する脂肪酸の量や組成を、形質転換していない宿主細胞と比較して変化させることができる。ここで宿主は、後述する「本発明のＡＣＣ発現用ベクター構築及び形質転換体の作製」の項目において例示される宿主を使用してよい。また、宿主が産生する脂肪酸は、後述する「本発明の脂肪酸組成物」の項目において例示される脂肪酸であってよい。
このような本発明の核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸があげられる。なお、以下の記載において、「本発明の上記活性」とは、上記の「ＡＣＣ活性、本発明の酵母ＡＣＣ欠損相補活性、及び／又は宿主が本来有する脂肪酸含有量や脂肪酸組成を変化させることができる活性」を意味する。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
具体的には、
(i) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列；
(ii) 配列番号２に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されたアミノ酸配列；
(iii) 配列番号２に示すアミノ酸配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば1〜400個、1〜200個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列；又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列；
からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
保存的置換は、一般的には、生物学的系合成や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２−アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ−メチルセリン、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２−アミノアジピン酸及び２−アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４−ジアミノブタン酸及び２，３−ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３−ヒドロキシプロリン及び４−ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
Ｄ−アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α−二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
特に、本発明のＡＣＣのアミノ酸配列中にはビオチン含有酵素の保存モチーフである「ＭＫＭモチーフ」が存在する。本モチーフは、ＡＣＣに必須のモチーフであって、ビオチン含有酵素のアミノ酸配列中で保存されており、図４の第７３６〜７３８番目のアミノ酸残基である。なお、図４は、Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＡＣＣと酵母由来のＡＣＣ１のアミノ酸配列を比較したものである。図４のうち、一重下線はビオチンカルホキシラーゼ（ｂｉｏｔｉｎ−ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ；ＢＣ）ドメイン、二重下線はビオチンカルホキシラーゼキャリアプロテイン（ｂｉｏｔｉｎ ｃａｒｂｏｘｙｌ ｃａｒｒｉｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ；ＢＣＣＰ）ドメイン、破線下線はカルボキシルトランスフェラーゼ（ｃａｒｂｏｘｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＣＴ）ドメインを表す。＊印をつけたＫ（Ｌｙｓ）残基はビオチンが付加される残基であり、四角で囲んだ領域はＭＫＭのモチーフであることを示している。
従って、本発明の変異体は上記保存モチーフが保存され、かつ、本発明の上記活性が損なわれない限り、いかなる変異体であってもよい。
当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造−機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
上記したように、配列番号２で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１又は複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＡＣＣ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
また、本発明の核酸に含まれる塩基配列には、配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、本発明の上記活性が保持される限り制限はない。本発明の上記活性の測定方法は上記のとおりである。
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。配列番号１及びＡＣＣ活性については上記のとおりである。
上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４２℃〜５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ〜３×ＳＳＣ、４５℃〜５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ、４０℃〜６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％〜０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５５℃〜６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ〜１×ＳＳＣ、６０℃〜６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ〜２×ＳＳＣ、５０℃〜６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０〜６５℃があげられる。
特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
本発明に含まれる核酸としては、好ましくは、配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ＡＣＣ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸があげられる。
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１に示される核酸配列に対して少なくとも同一性が８０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする。
好ましくは、配列番号１に示される塩基配列に対して少なくとも８０％、さらに好ましくは８５％、さらに一層好ましくは９０％（例えば、９２％以上、より一層好ましくは９５％以上、さらには９７％、９８％又は９９％）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
２つの核酸配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるＢＬＡＳＴＮプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン２．２．７又はＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズム等があげられる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ２．０についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。本発明の核酸がコードするタンパク質は、本発明の上記活性を有するタンパク質と同等の機能を有する限り、ＡＣＣ又はＡＣＣのアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。
具体的には、配列番号２で示されるアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％、さらに好ましくは９５％以上、より一層好ましくは、９７％（例えば、９８％、さらには、９９％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
本発明の核酸は、好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。さらに好ましくは、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９８％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら（Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997）に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．７（ゼネティックス）、ＤＩＮＡＳＩＳ Ｐｒｏ（日立ソフト）、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ（Ｉｎｆｏｍａｘ）等のプログラムを用いて決定することもできる。
複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ−スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ−スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
本発明の核酸は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸である。
配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。本発明の核酸としては、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸があげられる。
また、本発明の核酸には、配列番号１からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号１に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号１に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号１に示す塩基配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば１〜1500個、１〜1000個、１〜500個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
本発明の核酸の好ましい態様としては、以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の核酸も含まれる。
（ａ）配列番号１で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
（ａ）配列番号１で示される塩基配列を含む核酸、（ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）配列番号４で示される塩基配列を含む核酸については、上記のとおりである。上記配列の部分配列とは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
また、本発明の核酸には、以下の核酸も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が８０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、及び、
（２） 以下の(ａ)〜（ｅ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼタンパク質
本発明のタンパク質は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸』の項で説明したとおり、「本発明の上記活性」を有するタンパク質を意味する。
本発明において、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
上記のうち、配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列については、上記、『本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「本発明の上記活性を有するタンパク質」には、配列番号１の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、ＡＣＣ活性及び/又は本発明の酵母ＡＣＣ欠損相補活性及び/又は本発明の脂肪酸組成を形成できる活性を有するタンパク質も含まれる。
また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ−ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２） 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
本発明の核酸のクローニング
本発明のＡＣＣの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
例えば、ｐＢｌｕｅ−Ｓｃｒｉｐｔ（商標）ＳＫ（＋）（Stratagene）、ｐＧＥＭ−Ｔ（Promega）、ｐＡｍｐ（TM: Gibco-BRL）、ｐ−Ｄｉｒｅｃｔ（Clontech）、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ（Invitrogene）等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号１等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、
上流側用プライマー５’−ＧＣＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＣＴＣ−３’(配列番号６)
下流側プライマー５’−ＧＴＣＣＴＣＧＴＴＧＡＴＡＧＴＡＧＧＧＴＣ−３’（配列番号７）等を、各々用いることができる。そして、Ｍ．ａｌｐｉｎａ 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及び耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))』等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、ＤＥＡＥ−セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
本発明のＡＣＣ発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
本発明はまた、本発明のＡＣＣをコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のＡＣＣをコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後の塩基配列断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。この塩基配列断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、ＡＣＣ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるＭ．ａｌｐｉｎａ等の糸状菌、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ (サッカロミセス・セレビシエ)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌やバチルス・ズブチリス等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Ｍ．ｅｌｏｎｇａｔａ）ＩＦＯ８５７０、モルティエレラ・エキシグア（Ｍ．ｅｘｉｇｕａ）ＩＦＯ８５７１、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Ｍ．ｈｙｇｒｏｐｈｉｌａ）ＩＦＯ５９４１、モルティエレラ・アルピナＩＦＯ８５６８、ＡＴＣＣ１６２６６、ＡＴＣＣ３２２２１、ＡＴＣＣ４２４３０、ＣＢＳ２１９．３５、ＣＢＳ２２４．３７、ＣＢＳ２５０．５３、ＣＢＳ３４３．６６、ＣＢＳ５２７．７２、ＣＢＳ５２８．７２、ＣＢＳ５２９．７２、ＣＢＳ６０８．７０、ＣＢＳ７５４．６８等のモルティエレラ亜属に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Ｍ．ｉｓａｂｅｌｌｉｎａ）ＣＢＳ１９４．２８、ＩＦＯ６３３６、ＩＦＯ７８２４、ＩＦＯ７８７３、ＩＦＯ７８７４、ＩＦＯ８２８６、ＩＦＯ８３０８、ＩＦＯ７８８４、モルティエレラ・ナナ（Ｍ．ｎａｎａ）ＩＦＯ８１９０、モルティエレラ・ラマニアナ（Ｍ．ｒａｍａｎｎｉａｎａ）ＩＦＯ５４２６、ＩＦＯ８１８６、ＣＢＳ１１２．０８、ＣＢＳ２１２．７２、ＩＦＯ７８２５、ＩＦＯ８１８４、ＩＦＯ８１８５、ＩＦＯ８２８７、モルティエレラ・ヴィナセア（Ｍ．ｖｉｎａｃｅａ）ＣＢＳ２３６．８２等のマイクロムコール亜属（ｓｕｂｇｅｎｕｓ Ｍｉｃｒｏｍｕｃｏｒ）に属する微生物等があげられる。とりわけ、Ｍ．ａｌｐｉｎａが好ましい。
真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてＭ．ａｌｐｉｎａを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、ｐＤ４、ｐＤｕｒａＳＣ、ｐＤｕｒａ５等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、ｈｉｓｔｏｎＨ４．１遺伝子プロモーター、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、ＴＥＦ（Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ）遺伝子プロモーターといったＭ．ａｌｐｉｎａに由来するプロモーターが用いられる。
Ｍ．ａｌｐｉｎａ等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、ｐＹＥ２２ｍ等があげられる。また、ｐＹＥＳ（Invitrogen）、ｐＥＳＣ(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＥＨ１３−１５株（ｔｒｐ１、ＭＡＴα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＧＡＬ１プロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のｐＧＥＸ、ｐＵＣ１８等があげられる。プロモーターとしては、例えば、ｔｒｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、ＰＬプロモーター、ＰＲプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組み換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
本発明の脂肪酸組成物の製造方法
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
ＡＣＣを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してＡＣＣを発現させた場合は、ＳＣ−Ｔｒｐ培地、ＹＰＤ培地、ＹＰＤ５培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてＳＣ−Ｔｒｐ培地を例示する：１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ）。
培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
以下に、本発明の脂肪酸組成物の具体的な製造方法として、宿主として酵母を用いて２段階培養を行った場合を例示して説明する。すなわち、前培養として、上記で得られたコロニーを、例えば上記のＳＣ−Ｔｒｐ培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、ＹＰＤ５（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う方法である。
本発明の脂肪酸組成物
本発明はまた、本発明のＡＣＣが発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、本発明のＡＣＣが発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸でもよいし、トリグリセリド、リン脂質等でもよい。
本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）（１４：０）、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（１４：１）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）（１６：０）、パルミトレイン酸（９−ヘキサデセン酸）（１６：１）、ステアリン酸（オクタデカン酸）（１８：０）、オレイン酸（ｃｉｓ−９−オクタデセン酸）（１８：１（９））、バクセン酸（１１−オクタデセン酸）（１８：１（１１））、リノール酸（ｃｉｓ，ｃｉｓ−９，１２オクタデカジエン酸）（１８：２（９，１２））、α−リノレン酸（９，１２，１５−オクタデカトリエン酸）（１８：３（９，１２，１５））、γ−リノレン酸（６，９，１２−オクタデカトリエン酸）（１８：３（６，９，１２））、ステアリドン酸（６，９，１２，１５−オクタデカテトラエン酸）（１８：４（６，９，１２，１５））、アラキジン酸（イコサン酸）（２０：０）、（８，１１−イコサジエン酸）（２０：２（８，１１））、ミード酸（５，８，１１−イコサトリエン酸）（２０：３（５，８，１１））、ジホモγ−リノレン酸（８，１１，１４−イコサトリエン酸）（２０：３（８，１１，１４））、アラキドン酸（５，８，１１，１４−イコサテトラエン酸）（２０：４（５，８，１１，１４））、エイコサテトラエン酸（８，１１，１４，１７−イコサテトラエン酸）（２０：４（８，１１，１４，１７）、エイコサペンタエン酸（５，８，１１，１４，１７−イコサペンタエン酸）（２０：５（５，８，１１，１４，１７））、ベヘン酸（ドコサン酸）（２２：０）、（７，１０，１３，１６−ドコサテトラエン酸）（２２：４（７，１０，１３，１６））、（７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸）（２２：５（７，１０，１３，１６，１９））、（４，７，１０，１３，１６−ドコサペンタエン酸）（２２：５（４，７，１０，１３，１６））、（４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸）（２２：６（４，７，１０，１３，１６，１９））、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）（２４：０）、ネルボン酸（ｃｉｓ−１５−テトラコセン酸）（２４：１）、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）（２６：０）等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はＩＵＰＡＣ生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
上記本発明の脂肪酸組成物の製造方法により得られた凍結乾燥した菌体に、適当な比率で調整したクロロホルム：メタノールを添加して攪拌した後、適当な時間、加熱処理をする。さらに遠心分離により菌体を分離して、溶媒を回収することを数回繰り返す。その後、適当な方法を用いて脂質を乾固させてから、クロロホルム等の溶媒を添加して脂質を溶解する。この試料を適当量分取して、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後に、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去してから、ガスクロマトグラフィーで分析を行う。例えば、酵母で本発明のＡＣＣを発現させた場合は、その脂肪酸組成において、本発明の組換えベクターで形質転換されていない宿主を培養して得られる培養物よりもパルミトレイン酸及び／又はドコサン酸の比率が高いか又は、パルミチン酸、ステアリン酸及び／又はヘキサドコサン酸の比率が低いことを特徴する脂肪酸組成物が得られる。
なお、本発明のＡＣＣは、公知のＡＣＣ脂肪酸組成物の脂肪酸組成とは脂肪酸組成が異なる場合があることから、本発明のＡＣＣは公知のＡＣＣとは宿主の脂質代謝への影響が異なることが示される。
本発明の脂肪酸組成物を含む食品等
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
さらに、本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用途食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
本発明のＡＣＣをコードする核酸又はＡＣＣタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
本発明はまた、本発明のＡＣＣをコードする核酸又はＡＣＣタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
（１）評価方法
本発明の一態様として、本発明のＡＣＣをコードする核酸又はＡＣＣタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。本発明の上記評価方法としては、まず、本発明の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質生産菌株の本発明の上記活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットＷＯ０１／０４０５１４号、特開平８−２０５９００号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Ｈｅｒｅｆｏｒｄ法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
本発明の塩基配列、好ましくは、配列番号１に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５〜２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００〜２０００塩基が適当である。
上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明の塩基配列と特異的な配列が存在するか否かを調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の塩基配列に特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。
本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０〜９５℃
アニーリング温度：４０〜６０℃
伸長温度：６０〜７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物である増幅産物を、アガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株の本発明の上記活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらに本発明の上記活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、本発明の上記活性の評価方法は、上記のとおりである。
また、本発明の上記評価方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１等の本発明の塩基配列がコードするＡＣＣの発現量を測定することによって、被検菌株の本発明の上記活性を評価することもできる。なお、ＡＣＣの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、ＡＣＣのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ−ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
（２）選択方法
本発明の他の態様として、本発明のＡＣＣをコードする核酸又はＡＣＣタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１等の本発明の塩基配列がコードするＡＣＣの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、ＡＣＣの発現量を測定する方法があげられる。
また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、ＡＣＣの発現量を測定する方法があげられる。
被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、本発明のＡＣＣ活性及び/又は本発明の酵母ＡＣＣ欠損相補活性は、例えば本明細書中の「本発明のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼをコードする核酸」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39 酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。
なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
〔実施例１〕
（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製とＥＳＴ解析
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、４日間２８℃で振とう培養した。菌体を回収し、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法で全ＲＮＡを調製した。Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、全ＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡの精製を行った。これを用いて、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（STRATAGENE）により、ｃＤＮＡライブラリーを作製した。ｃＤＮＡの５’側からワンパスシーケンス解析（約２０００クローン）を行った。
（２）ＡＣＣホモログの検索
上記ＥＳＴ解析で得られた配列を、ＧＥＮＥＢＡＮＫに登録されているアミノ酸配列に対して相同性検索プログラムであるＢＬＡＳＴＸで検索し、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼのホモログを抽出した。その結果、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ由来のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼホモログ（アクセッション番号Ｐ７８８２０）ともっとも同一性の高い配列、すなわち、配列番号１の第５８３３〜６０２６番目の塩基に相当する配列を見出した。
〔実施例２〕
（１）ＭａＡＣＣのクローニング
実施例１で見出された配列番号１の第５８３３〜６０２６番目の塩基に相当する配列はＭ．ａｌｐｉｎａのアセチルＣｏＡカルボキシラーゼホモログ（ＭａＡＣＣ）の部分配列をコードしていると考えられたので、この配列を元に、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングを行った。まず、ＰＣＲによりプローブを作製するために、プライマー９３１−Ｆと９３１−Ｒを設計した。
９３１−Ｆ：５’−ＧＣＣＡＡＣＴＧＧＣＧＴＧＧＡＴＴＣＴＣ−３’（配列番号６）
９３１−Ｒ：５’−ＧＴＣＣＴＣＧＴＴＧＡＴＡＧＴＡＧＧＧＴＣ−３’ （配列番号７）
ｃＤＮＡライブラリー（２．６×１０6ｐｆｕ／μｌ）を鋳型として、プライマー９３１−Ｆと９３１−Ｒにより、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲの条件は、９４℃２分の後、９４℃１分、５５℃１分、７２℃３分を１サイクルとして３０サイクルで行った。
増幅された断片についてTOPO-TA cloning Kit（INVITROGEN CORPORATION）を用いてＴＡ−クローニングを行った。いくつかのクローンの塩基配列を確認し、配列番号４の第５８３５〜６０１４番目の配列を含むクローンをｐＣＲ−ＭａＡＣＣ−Ｐ１とした。次に、このプラスミドを鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲ反応を行った。反応には、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルし、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングに用いるプローブを作製した。このプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。
ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）を、２０分間×３回；
検出は、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、インビボエキシジョンにより、プラスミドを切り出した。これらのプラスミドのうち、配列番号１の第５８３３〜６０２６番目の塩基に相当する配列を含むものでインサートの長さがもっとも長いプラスミドｐＢＭａＡＣＣ−ｐ３８の塩基配列を決定した。プラスミドｐＢＭａＡＣＣ−Ｐ３８は配列番号４の第１８９２〜６８６５番目の塩基配列を含んでいた。このクローンは、既知のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼホモログとの比較、開始コドンの有無等から、ＭａＡＣＣの全長を含むものではないと考えられた。
そこで、ＭａＡＣＣの全長を取得するため、以下のとおり、5'-Full RACE Core Set（タカラバイオ）を用いてプロトコールに従い、３回の５’−ＲＡＣＥを行った。全ＲＮＡは上記ｃＤＮＡライブラリー作製に使用したものと同じものを使用した。
５’−ＲＡＣＥ（１回目）を行うために、ｐＢＭａＡＣＣ−Ｐ３８のインサートの塩基配列に基づき、以下のプライマーを設計した。
ＡＣＣ−ＲＴ−１プライマー：ｐＴＧＧＴＧＣＣＧＧＧＴＴＧＣＴ（配列番号８）
ＡＣＣ−Ｓ１−１プライマー：ＧＣＡＡＡＣＴＴＧＴＴＣＧＣＴＡＣＣＴＴＧ
（配列番号９）
ＡＣＣ−Ａ１−１プライマー：ＴＣＧＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＡＡ
（配列番号１０）
ＡＣＣ−Ｓ２−１プライマー：ＣＡＧＧＣＣＴＡＴＧＣＴＧＡＧＡＴＴＧＡＧ
（配列番号１１）
ＡＣＣ−Ａ２−１プライマー：ＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＣＣＡＡＣＧＡＧＴＡＡ
（配列番号１２）
５’−ＲＡＣＥ（１回目）は、ＡＣＣ−Ｓ２−１プライマーとＡＣＣ−Ａ２−１プライマーにより増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングし、得られたクローンの中で、ＭａＡＣＣの部分配列を含む最も長いクローンをｐＣＲＭａＡＣＣ−Ｐ２−５とした。このクローンは、配列番号４の第１１８３〜２０１１番目の塩基配列を含んでいた。
この配列に基づき、さらに５’−ＲＡＣＥ（２回目）を行うために、以下のプライマーを設計した。
５’−ＲＡＣＥ（２回目）
ＡＣＣ−ＲＴ−２プライマー：ｐＣＡＧＧＧＣＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧ（配列番号１３）
ＡＣＣ−Ｓ１−２プライマー：ＣＧＡＧＴＡＣＴＴＧＡＴＣＣＧＣＣＴＴＴ
（配列番号１４）
ＡＣＣ−Ａ１−２プライマー：ＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＡＣＧＡＡＴＧＧＡＧ
（配列番号１５）
ＡＣＣ−Ｓ２−２プライマー：ＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＡＡＣＡＣＣＡ
（配列番号１６）
ＡＣＣ−Ａ２−２プライマー：ＴＧＡＣＣＡＣＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡ
（配列番号１７）
５’−ＲＡＣＥ（２回目）で、ＡＣＣ−Ｓ２−２プライマーとＡＣＣ−Ａ２−２プライマーにより増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングし、得られたクローンの中で、ＭａＡＣＣの部分配列を含む最も長いクローンをｐＣＲＭａＡＣＣ−Ｐ７−１５とした。このクローンは、配列番号４の第７３８〜１５２２番目の塩基配列を含んでいた。
この配列に基づき、さらに５’−ＲＡＣＥ（３回目）を行うために、以下のプライマーを設計した。
５’−ＲＡＣＥ（３回目）
ＡＣＣ−ＲＴ−３プライマー：ｐＴＣＧＧＧＣＴＴＧＧＣＡＡＴＧ（配列番号１８）
ＡＣＣ−Ｓ１−３プライマー：ＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＴＴＴＧ
（配列番号１９）
ＡＣＣ−Ａ１−３プライマー：ＧＣＧＴＴＡＣＣＡＧＣＣＡＡＣＴＴＣＡＴ
（配列番号２０）
ＡＣＣ−Ｓ２−３プライマー：ＧＣＧＴＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＡＧＡＴＴＡ
（配列番号２１）
ＡＣＣ−Ａ２−３プライマー：ＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＧＡＡＣＴＴＴＴＣＴ
（配列番号２２）
５’−ＲＡＣＥ（３回目）で、ＡＣＣ−Ｓ２−３プライマーとＡＣＣ−Ａ２−３プライマーにより増幅されたＤＮＡ断片をＴＡクローニングし、得られたクローンの中で、ＭａＡＣＣの部分配列を含む最も長いクローンをｐＣＲＭａＡＣＣ−Ｐ９−２とした。このクローンは、配列番号４の第１〜７９２番目の塩基配列を含んでおり、既知のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼホモログとの比較等から、ＭａＡＣＣの開始コドンを含むものと考えられた。このようにして得られた配列を連結することで、ＭａＡＣＣのＣＤＳ全長を含むｃＤＮＡ配列である配列番号４の配列を得た。
その後,配列番号４を含むプラスミドを以下のとおり作製した。まず、プラスミドｐＢＭａＡＣＣ−Ｐ３８を制限酵素ＮｏｔＩと制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られた約８ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＣＲＭａＡＣＣ−Ｐ２−５を制限酵素ＮｏｔＩ（ベクターｐＣＲ２．１のＭＣＳ、ＭａＡＣＣの５’上流側に位置する）と制限酵素ＢａｍＨＩで消化して得られた約０．８ｋｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションし、プラスミドｐＢＭａＡＣＣ−Ｐ４を得た。一方、上記ｃＤＮＡライブラリー作製に使用したものと同じ全ＲＮＡを使用し、スーパースクリプトファーストストランドシステム for ＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン）により、ランダムプライマーを用いてｃＤＮＡを合成した。
さらに、これを鋳型として、プライマーＡＣＣ−ＮｏｔＩ：ＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＴＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＣＡＡＧＣＧＧ（配列番号２３）とＡＣＣ−Ａ１−２プライマーにより、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をＴＡクローニングした。配列番号４の第１〜１５７８番目の正しい塩基配列を含むクローンを制限酵素ＮｏｔＩと制限酵素ＸｂａＩで消化して得られた約１．５ｋｂのＤＮＡ断片と、プラスミドｐＢＭａＡＣＣ−Ｐ４を制限酵素ＮｏｔＩと制限酵素ＸｂａＩで消化して得られた約８．４ｋｂのＤＮＡ断片をライゲーションし、プラスミドｐＢ−ＭａＡＣＣを得た。
（２）配列解析
上記のようにして得られたＭ．ａｌｐｉｎａ由来のＡＣＣ（ＭａＡＣＣ）のｃＤＮＡ配列（配列番号４）のＯＲＦ解析を行った。その結果、本発明のＡＣＣのＣＤＳ領域は配列番号４の第４５〜６７３４番目の配列（配列番号３）に相当し、ＯＲＦの領域は、配列番号４の第４５〜６７３１番目の配列（配列番号１）に相当すると推定された。Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＡＣＣ（以下、「ＭａＡＣＣ」と記載する場合もある）のｃＤＮＡ配列（配列番号４）と推定アミノ酸配列（配列番号２）を図１に示した。
さらに、配列番号４をＧｅｎＢａｎｋに登録されているアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴＸを用いて相同性解析を行った。その結果、ＭａＡＣＣは真核微生物のＡＣＣホモログと相同性を示したが、既知のアミノ酸配列の中で最も同一性の高かったものは、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来の推定タンパク質ＲＯ３Ｇ＿０４９７７であった。この配列に係る塩基配列のＣＤＳとＭａＡＣＣのＣＤＳの塩基配列の同一性、及びアミノ酸配列とＭａＡＣＣタンパク質の推定アミノ酸の同一性をｃｌｕｓｔａｌＷにて求めたところ、それぞれ６５．５％、６６．３％であった。他の菌類由来のＡＣＣホモログの推定アミノ酸配列との同一性は、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ由来のもの（アクセッション番号ＥＡＡ３３７８１）と５８．８％、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｆｕｍｉｇａｔｕｓ由来のものと（アクセッション番号ＥＡＬ９３１６３）５８．３％、また、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの細胞質ＡＣＣであるＡｃｃ１ｐとは５５．１％、ミトコンドリアＡＣＣであるＨｆａ１ｐとは４４．７％の同一性であった。
一方、Ｍ．ａｌｐｉｎａＣＢＳ５２８．７２株由来のＡＣＣホモログの部分配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに既に登録されている（核酸配列：アクセッション番号ＡＪ５８６９１５（非特許文献６）（配列番号２４）、アミノ酸配列：アクセッション番号ＣＡＥ５２９１４（配列番号２５））。これらの配列と、今回得られたＭ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４由来ｃＤＮＡ全長配列、推定アミノ酸配列を比較した。核酸配列の比較を図２に、アミノ酸配列の比較を図３に示した。上記アクセッション番号ＡＪ５８６９１５の塩基配列のＣＤＳ部分は、配列番号４の第３４２〜１４３９番目の塩基配列に相当し、この部分のみで比較すると同一性は９１．３％であった。また、アクセッション番号ＣＡＥ５２９１４のアミノ酸配列は、配列番号２の第１００〜４６５番目のアミノ酸配列に相当し、この部分のみで比較すると同一性は９７．８％であった。
〔実施例３〕
発現ベクターの構築
酵母発現ベクターｐＹＥ２２ｍを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、Blunting Kit（タカラバイオ）により末端を平滑化した。これにＮｏｔＩリンカー（ｐ−ＧＣＧＧＣＣＧＣ：配列番号２６）を挿入し、ベクターｐＹＥ２２ｍＮを構築した。ベクターｐＹＥ２２ｍＮを制限酵素ＮｏｔＩ、ＳａｌＩで消化したものと、プラスミドｐＢ−ＭａＡＣＣを制限酵素ＮｏｔＩ、ＸｈｏＩで消化して得られた約６．９ｋｂの断片をLigation high（東洋紡）により連結し、プラスミドｐＹＥ−ＭａＡＣＣを得た。次に、プラスミドｐＹＥ−ＭａＡＣＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、Blunting Kit（タカラバイオ）により末端を平滑化したものを、プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３のＳｍａＩサイトに挿入し、プラスミドｐＵＣ−ＵＲＡ３−ＭａＡＣＣを構築した。このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、酵母Δｕｒａ３株を形質転換することで、酵母の染色体上のＵＲＡ３下流にＭ．ａｌｐｉｎａ由来ＡＣＣの発現カセットが挿入されるようになる。
〔実施例４〕
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来ＡＣＣ発現カセット導入酵母の取得とランダム胞子分析
酵母の細胞質ＡＣＣ遺伝子欠損の異型接合体二倍体（Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ Ｄｉｐｌｏｉｄ）である酵母ノックアウト株ＹＳＣ１０２１−６７３４２７株（Δａｃｃ１：ＫａｎＭＸ／ＡＣＣ１、ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０、ｕｒａ３Δ０／ｕｒａ３Δ０、ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０、ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Δ０、open biosystems）を実施列３で構築したｐＵＣ−ＵＲＡ３−ＭａＡＣＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化したＤＮＡ断片を導入して形質転換した。形質転換株は、ＳＤ−Ｕｒａ寒天培地上で生育することを指標に選択した。こうして選択した任意の株をＭａＡＣＣ−ＨＤ−＃１株、ＭａＡＣＣ−ＨＤ−＃２株（Δａｃｃ１：ＫａｎＭＸ／ＡＣＣ１、ｈｉｓ３Δ１／ｈｉｓ３Δ１、ｌｅｕ２Δ０／ｌｅｕ２Δ０、ＭａＡＣＣ−ＵＲＡ３／ｕｒａ３Δ０、ＬＹＳ２／ｌｙｓ２Δ０、ＭＥＴ１５／ｍｅｔ１５Δ０）とした。
ＭａＡＣＣ−ＨＤ−＃１株及びＭａＡＣＣ−ＨＤ−＃２株の胞子を形成させるため、これらの株をＹＰＤ寒天培地に塗布し、３０℃で２日間培養した。生育した菌体を、胞子形成寒天培地（１％酢酸カリウム、０．１％酵母エキス、０．０５％グルコース、２％寒天）に塗布し、２５℃で４日間培養した。得られた菌体を１白金耳とり、ザイモリアーゼ溶液（１．２Ｍソルビトール、５０ｍＭリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．５）、１４ｍＭ２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍｌザイモリアーゼ１００Ｔ（生化学工業））１ｍｌに懸濁し、３０℃で振とうしながら２４時間処理した。その後、遠心分離により菌体を集め上清を除去した。菌体に１ｍｌの滅菌水を加え、激しく攪拌したあと、遠心分離により菌体を集め、上清を除去した。この操作をさらに２回繰り返した。
得られた菌体を適当に滅菌水で希釈し、ＹＰＤ寒天培地上に塗布し、シングルコロニーを形成させた。得られたコロニーをランダムにそれぞれ１００株ずつ（計２００株）を、ＹＰＤ、ＹＰＤ＋Ｇ４１８（２００ｍｇ／Ｌ）、ＳＤ−Ｕｒａ、ＳＤ−Ｍｅｔ、ＳＤ−Ｌｙｓの各寒天培地にレプリカし、それぞれの培地での生育を確認した。結果を表１に示した。
Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＣＣ１遺伝子及びＭａＡＣＣに関する遺伝子型の分離に関しては、
（１）Δａｃｃ１：ＫａｎＭＸ、ＭａＡＣＣ−ＵＲＡ３；
（２）ＡＣＣ１、ｕｒａ３Δ０；
（３）ＡＣＣ１、ＭａＡＣＣ−ＵＲＡ３；及び
（４）Δａｃｃ１：ＫａｎＭＸ、ｕｒａ３Δ０
の４種類が考えられる。各遺伝子型を有する株の表現型は、表１の縦軸の各番号（Ｉ〜ＩＶ）に対応するが、調べたすべての寒天培地上で生育する株の中には二倍体株も含まれる。
そこで、これらの株のうち、８株から、ｇｅｎｅとるくん（酵母用）（タカラバイオ）を使ってゲノムＤＮＡを抽出し、プライマーＳｃＡＣＣ１−１９／ＳｃＡＣＣ１＋６５８、プライマーＳｃＡＣＣ１−１９／ＫａｎＢ、プライマーＡＣＣ１−ｓｃｆ５／ＡＣＣ１−ｓｃｒ５、の組み合わせで、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いてＰＣＲ反応を行った。その結果、８株中３株はすべてプライマーの組み合わせで適当な大きさのＤＮＡの増幅が見られ、二倍体株であることが確認された。なお上記したプライマーの配列は以下のとおりである。
ＳｃＡＣＣ１−１９：ＣＣＣＧＡＡＡＣＡＧＣＧＣＡＧＡＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号２７）
ＳｃＡＣＣ１＋６５８：ＣＣＡＧＡＣＣＧＧＴＴＴＴＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＴＧ
（配列番号２８）
ＫａｎＢ：ＣＴＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＣＧＴＡＡＴ（配列番号２９）
ＡＣＣ１−ｓｃｆ５：ＣＧＣＡＴＴＧＧＴＣＴＴＧＣＴＡＧＴＧＡ（配列番号３０）
ＡＣＣ１−ｓｃｒ５：ＡＡＧＴＧＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧＴＴＣＴＴ（配列番号３１）
このことから、表１のＩの表現型の株７４株中、ハプロイド株はおよそ６０株程度であり、上記の遺伝子型（１）：（２）：（３）：（４）の株はおよそ１：１：１：０の分離比で出現することが示された。
ここで、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅでは、Δａｃｃ１株は、致死であることが知られている。（４）の遺伝子型の株はΔａｃｃ１であるため致死となり、このような株が得られなかった。しかしながら、Δａｃｃ１であるにもかかわらず（１）の遺伝子型の株が得られることから、ＭａＡＣＣがΔａｃｃ１を相補することができたことが明らかである。すなわち、ＭａＡＣＣは、細胞質で機能するＡＣＣ活性を有することが示された。
〔実施例５〕
サザン解析
実施例４で得られた、表１のＩ−ａ（ＰＣＲによりハプロイドであることが確認された株）、ＩＩ−ａ、ＩＩＩ−ａの各群の中から、任意の２株をそれぞれ選択した。上記と同様の方法でゲノムＤＮＡを抽出した。これを制限酵素ＢａｍＨＩ又はＨｉｎｄＩＩＩで消化して、０．８％アガロースゲルにて電気泳動し、ハイボンドＮ＋にＤＮＡを転写して固定した。プローブとして、（１）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＣＣ１遺伝子の上流−５００〜−１５７のＤＮＡ断片、（２）Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅＡＣＣ１遺伝子内の１０１〜６５８のＤＮＡ断片、（３）ＭａＡＣＣ（配列番号４）のＤＮＡ断片を用いた。プローブのラベルと検出には、AlkPhos Direct（ＧＥヘルスケア）を使用した。制限酵素ＢａｍＨＩにて消化したＤＮＡにはプローブ（１）又はプローブ（２）を、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩにて消化したＤＮＡにはプローブ（３）を用いて各々サザン解析を行った。その結果、ＰＣＲによりハプロイドであることが確認された株であるＩ−ａでは、プローブ（１）で３．２ｋｂのシグナル、プローブ（２）でシグナルなし、プローブ（３）で８．２ｋｂシグナルが検出された。一方、ＩＩ−ａでは、プローブ（１）とプローブ（２）で７．６ｋｂのシグナルが検出され、プローブ（３）でシグナルがなく、ＩＩＩ−ａでは、プローブ（１）とプローブ（２）で７．６ｋｂのシグナル、プローブ（３）で８．２ｋｂシグナルが各々検出された。
以上の結果から、それぞれの株は、細胞質ＡＣＣの遺伝子として、Ｉ−ａは、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株由来のＭａＡＣＣのみ、ＩＩ−ａはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＣＣ１のみ、ＩＩＩ−ａは、ＭａＡＣＣとＡＣＣ１を共に有することが示された。
〔実施例６〕
ＭａＡＣＣ発現酵母の解析
実施例４で得られた表１のＩ−ａ（ＰＣＲによりハプロイドであることが確認された株）、ＩＩ−ａ、ＩＩＩ−ａの各群の中から任意の４株ずつを、ＹＰＤ５＋Ｕｒａ培地（（酵母エキス２％、ポリペプトン１％、グルコース５％、ウラシル０．００２％）液体培地１０ｍｌに１白金耳植菌し、３０℃で２４時間又は７２時間、振とう培養を行った。培養終了時に、培養物の６００ｎｍにおける吸光度を測定し、菌体の増殖を調べた（表２）。
遠心分離により菌体を回収し、凍結乾燥した後、塩酸メタノール法により菌体の脂肪酸をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去して、ガスクロマトグラフィーにより分析を行い、培養時間ごとの脂肪酸組成を調べた（表３及び表４）。

この結果、ＡＣＣ遺伝子として、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のもののみを有するＩＩ−ａに比して、Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＭａＡＣＣのみを有するＩ−ａは増殖が優れていた。両方のＡＣＣ遺伝子を有するＩＩＩ−ａは、Ｉ−ａよりさらに増殖が優れていた。
さらに、各遺伝子型の菌株では、脂肪酸組成も異なっており、Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＭａＡＣＣのみを有するＩ−ａとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のもののみを有するＩＩ−ａを比較すると、前者では、飽和脂肪酸のうち、パルミチン酸、ステアリン酸、ヘキサドコサン酸の比率が顕著に低下しており、１価不飽和脂肪酸であるオレイン酸の比率も低下していた。一方、飽和脂肪酸の中でもテトラドコサン酸、また１価不飽和脂肪酸であるパルミトレイン酸の比率が上昇していた。また、Ｍ．ａｌｐｉｎａ由来のＭａＡＣＣとＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＡＣＣ１の両方を持つＩＩＩ−ａは、Ｉ−ａとＩＩ−ａの中間的な脂肪酸組成を示した。
〔実施例７〕
ＡＣＣ遺伝子ゲノム配列の取得
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株を、１００ｍｌの液体培地（グルコース１％、酵母エキス０．５％、ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で４日間振とう培養した。フィルターろ過により菌体を集め、DNeasy plant（キアゲン）によりゲノムＤＮＡを抽出した。
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株のＡＣＣに係るゲノムＤＮＡ配列を決定するために、以下のとおりプライマーを設計した。
ＡＣＣ−Ｇ１：ａｔｇａｃｔａｃｃａａｃｇｔａｃａｇｔｃｃｔｔｃａｔｔｇ
（配列番号３２）
ＡＣＣ−Ｇ２：ｔｔａａａｃｇｇｔｃａｔｃｇｔｇｇｃｇａａｃｔｔｇｇｃ
（配列番号３３）
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株のゲノムＤＮＡを鋳型としてＬＡＴａｑ（タカラバイオ）により９８℃１０秒、６８℃１５分を１サイクルとして、３０サイクルのＰＣＲ反応を行った。得られた約８ｋｂのＤＮＡ断片をＴＡクローニングした。複数のクローンのインサートの塩基配列を決定して、Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株のＡＣＣゲノムＤＮＡ配列（配列番号５）を決定した。
Ｍ．ａｌｐｉｎａ１Ｓ−４株のＡＣＣ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列とｃＤＮＡ配列を比較したところ、イントロンが５つ含まれており、エキソン領域は、配列番号５の第１〜２７番目、第３１５〜６６５番目、第１２７１〜２８２８番目、第２９１７〜３４６３番目、第３５９０〜６２３９番目、第６３３９〜７８８９番目であった。
〔実施例８〕
モルティエレラ アルピナにおけるＡＣＣ高発現
（１）発現ベクターの構築
プラスミドｐＢ−ＭａＡＣＣ（実施例２を参照）を鋳型として、以下に記載のプライマーＡＣＣＥｘＦ−ＳｐｅＩとプライマーＡＣＣＥｘＲ−ＳｐｅＩにより、ＰＣＲを行い、約６．７ｋｂｐのＰＣＲ産物を得た。
プライマーＡＣＣＥｘＦ−ＳｐｅＩ：５’−ＡＴＡＣＴＡＧＴＡＴＧＡＣＴＡＣＣＡＡＣＧＴＡＣＡＧＴＣＣ−３’（配列番号３６）
プライマーＡＣＣＥｘＲ−ＳｐｅＩ：５’−ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＴＴＡＡＡＣＧＧＴＣ ＡＴＣＧＴＧＧＣＧ−３’（配列番号３７）
これを制限酵素ＳｐｅＩで消化し、プラスミドｐＳＤＹを制限酵素ＳｐｅＩで消化したものと連結し、プラスミドｐＳＤＹ−ＡＣＣを得た（図５）。
（２）モルティエレラ アルピナの形質転換
Ｍ．ａｌｐｉｎａより国際公開第ＷＯ２００５／０１９４３７号（発明の名称：「脂質生産菌の育種方法」）に記載の方法にしたがって誘導した、ウラシル要求性株Δｕｒａ−３をホストとしてパーティクルデリバリー法で形質転換を行った。形質転換株の選択には、ＳＣ寒天培地（Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate（Difco）０．５％、硫酸アンモニウム０．１７％、グルコース２％、アデニン０．００２％、チロシン０．００３％、メチオニン０．０００１％、アルギニン０．０００２％、ヒスチジン０．０００２％、リジン０．０００４％、トリプトファン０．０００４％、スレオニン０．０００５％、イソロイシン０．０００６％、ロイシン０．０００６％、フェニルアラニン０．０００６％、寒天２％）を用いた。
（３）形質転換株の選択
約５０株の形質転換株を単離し、ＧＹ（グルコース ２％、酵母エキス １％、ｐＨ６．０）液体培地１５ｍｌに植菌し、２８℃、８日間、振とう培養した。菌体を集菌し、１２０℃にて２時間保持して乾燥させ、塩酸メタノール法により、菌体内の脂肪酸をメチルエステルに誘導し、脂肪酸分析を行った。脂肪酸生産量が多く、アラキドン酸の組成比が高い株、Ａ４、Ｈ９、Ｈ１１、Ｈ２０の４株を選抜し、以下の実験に供した。
（４）ＭａＡＣＣ発現カセット導入の確認
上記のとおり選抜した形質転換株４株をＧＹ液体培地で培養し、ゲノムＤＮＡを抽出した。形質転換株にＭａＡＣＣの発現カセットが導入されたかどうかを調べるため、ゲノムＤＮＡを鋳型として、以下に記載のプライマーＡＣＣ−Ｆ７とプライマーｔｒｐＣｔ−Ｒにより、ＰＣＲを行った。この反応で、ｐＳＤＹ−ＡＣＣを鋳型とした場合、約１．６ｋｂｐのＰＣＲ産物が増幅される。各形質転換株においても、この大きさのＰＣＲ産物が確認できたので、これらの株には、ＭａＡＣＣ発現カセットが導入されたと考えられた。一方、ホストのΔｕｒａ−３株では、同条件でＰＣＲ産物が検出できなかった。
ＡＣＣ−Ｆ７：５’−ＧＣＴＴＧＧＴＣＧＣＧＡＴＧＴＣＴＡＣＡＣＣＴＣＧ−３’（配列番号３８）
ｔｒｐＣｔ−Ｒ：５’−ＡＣＧＴＡＴＣＴＴＡＴＣＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＡＣＡＣＣＡ−３’（配列番号３９）
（５）形質転換株の評価
４つの形質転換株の増殖および脂肪酸生産量の経時変化を調べた。すなわち、ＧＹ液体培地１５ｍｌに、各菌株を植菌し、２８℃で振とう培養した。２日目、４日目、６日目、８日目、１０日目にそれぞれ全量を集菌し、乾燥菌体重量および脂肪酸生産量を調べた（図６および７）。その結果、形質転換株および宿主Δｕｒａ−３株は、いずれも、８日目に脂肪酸生産量が最大であった。
そこで、培養８日目における脂肪酸組成、乾燥菌体重量、総脂肪酸及びアラキドン酸の生産量を比較した（図８、表５）。その結果、ホストΔｕｒａ−３株と形質転換株の乾燥菌体重量は、ほぼ同じであったのに対し、培地あたりの脂肪酸生産量は１．１−１．２倍に上昇し、培地あたりのアラキドン酸生産量は１．２‐１．６倍に上昇していた。
このように、モルティエレラ アルピナでＡＣＣを高発現させることにより、脂肪酸の生産量を向上させることができ、さらに脂肪酸の中でもアラキドン酸の生産量を向上させることができた。
配列番号６：プライマー
配列番号７：プライマー
配列番号８：プライマー
配列番号９：プライマー
配列番号１０：プライマー
配列番号１１：プライマー
配列番号１２：プライマー
配列番号１３：プライマー
配列番号１４：プライマー
配列番号１５：プライマー
配列番号１６：プライマー
配列番号１７：プライマー
配列番号１８：プライマー
配列番号１９：プライマー
配列番号２０：プライマー
配列番号２１：プライマー
配列番号２２：プライマー
配列番号２３：プライマー
配列番号２６：プライマー
配列番号２７：プライマー
配列番号２８：プライマー
配列番号２９：プライマー
配列番号３０：プライマー
配列番号３１：プライマー
配列番号３２：プライマー
配列番号３３：プライマー
配列番号３６：プライマー
配列番号３７：プライマー
配列番号３８：プライマー
配列番号３９：プライマー

Claims (15)

  1. 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
  2. 以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかである、請求項１に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
  3. 以下の（ａ）〜（ｃ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号１で示される塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号４で示される塩基配列を含む核酸
  4. 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
  5. 以下の(ａ)〜(ｅ)のいずれかである、請求項４に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９５％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．１×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
  6. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
  7. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、アセチルＣｏＡカルボキシラーゼ活性を有するタンパク質
  8. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
  9. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１〜２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ欠損を相補する活性を有するタンパク質
  10. 配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
  11. 請求項１〜５のいずれか１項記載の核酸を含有する組換えベクター。
  12. 請求項１１記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
  13. 請求項１２に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から、脂肪酸組成物を採取することを特徴とする、前記脂肪酸組成物の製造方法。
  14. 以下の（ａ）〜（ｅ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と０．２×ＳＳＣ、６５℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
  15. 以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、宿主が本来有するアラキドン酸含有量を上昇させることができる活性を有するタンパク質
JP2011504871A 2009-03-18 2010-03-17 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ Expired - Fee Related JP5255695B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011504871A JP5255695B2 (ja) 2009-03-18 2010-03-17 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2009066147 2009-03-18
JP2009066147 2009-03-18
JP2011504871A JP5255695B2 (ja) 2009-03-18 2010-03-17 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
PCT/JP2010/054582 WO2010107070A1 (ja) 2009-03-18 2010-03-17 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPWO2010107070A1 JPWO2010107070A1 (ja) 2012-09-20
JP5255695B2 true JP5255695B2 (ja) 2013-08-07

Family

ID=42739729

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2011504871A Expired - Fee Related JP5255695B2 (ja) 2009-03-18 2010-03-17 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9051590B2 (ja)
EP (1) EP2410051B1 (ja)
JP (1) JP5255695B2 (ja)
KR (1) KR101646302B1 (ja)
CN (1) CN102395676A (ja)
AU (1) AU2010225738B2 (ja)
BR (1) BRPI1013611A8 (ja)
CA (1) CA2753981C (ja)
DK (1) DK2410051T3 (ja)
RU (1) RU2551779C2 (ja)
WO (1) WO2010107070A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008156026A1 (ja) * 2007-06-18 2008-12-24 Suntory Holdings Limited グリセロール－３－リン酸アシル基転移酵素（gpat）ホモログとその利用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CH680448A5 (ja) * 1990-01-17 1992-08-31 Nestle Sa
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
JP4149007B2 (ja) 1995-02-01 2008-09-10 麒麟麦酒株式会社 酵母の凝集性判定用ｄｎａ分子および凝集性判定方法
CN100415898C (zh) 1999-11-30 2008-09-03 朝日啤酒株式会社 确定底层发酵酵母的絮凝特性的方法
ATE493489T1 (de) 2003-08-22 2011-01-15 Suntory Holdings Ltd Verfahren zur züchtung eines lipidproduzierenden pilzes
US7588931B2 (en) 2004-11-04 2009-09-15 E. I. Du Pont De Nemours And Company High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica
DE102005038036A1 (de) * 2005-08-09 2007-02-15 Basf Plant Science Gmbh Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008156026A1 (ja) * 2007-06-18 2008-12-24 Suntory Holdings Limited グリセロール－３－リン酸アシル基転移酵素（gpat）ホモログとその利用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN6012060950; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４２（３）, 20090305, ｐ．３２７-３２ *
JPN6012060951; Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ １４５, 1999, ｐ．１９１１-１７ *
JPN6012060952; '"Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ　ａｌｐｉｎａ　ｐａｒｔｉａｌ　ａｃｃ１　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ａｃｅｔｙｌ-ＣｏＡ　ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ，ｅｘｏｎｓ　１-２．"' ＮＣＢＩ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ｒｅｖｉｓｉｏｎ　Ｈｉｓｔｏｒｙ［ｏｎｌｉｎｅ］；Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ：ＡＪ５８６９１５ *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102395676A (zh) 2012-03-28
KR20110128286A (ko) 2011-11-29
CA2753981C (en) 2017-10-24
AU2010225738B2 (en) 2015-01-29
AU2010225738A1 (en) 2011-09-22
EP2410051B1 (en) 2014-12-31
JPWO2010107070A1 (ja) 2012-09-20
EP2410051A4 (en) 2013-01-02
RU2551779C2 (ru) 2015-05-27
US9051590B2 (en) 2015-06-09
BRPI1013611A2 (pt) 2015-08-25
KR101646302B1 (ko) 2016-08-05
WO2010107070A1 (ja) 2010-09-23
EP2410051A1 (en) 2012-01-25
DK2410051T3 (en) 2015-03-23
RU2011142010A (ru) 2013-04-27
CA2753981A1 (en) 2010-09-23
US20120264960A1 (en) 2012-10-18
BRPI1013611A8 (pt) 2015-12-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5371749B2 (ja) 新規なリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素遺伝子
JP5346290B2 (ja) 新規な脂肪酸組成を有する脂肪酸組成物
JP5539961B2 (ja) 新規なリゾリン脂質アシル基転移酵素
JP5451387B2 (ja) グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素（ｇｐａｔ）ホモログとその利用
JP5451398B2 (ja) 新規なａｔｐ：クエン酸リアーゼ遺伝子
JP5180960B2 (ja) ホスファチジン酸ホスファターゼホモログとその利用
JP5255695B2 (ja) 新規なアセチルＣｏＡカルボキシラーゼ
JP5890687B2 (ja) グリセロール−３−リン酸アシル基転移酵素ホモログとその利用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20120713

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20120713

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20121121

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20130118

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20130322

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20130419

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Ref document number: 5255695

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20160426

Year of fee payment: 3

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees