RU2551779C2 - Новая ацетил-coa-карбоксилаза - Google Patents
Новая ацетил-coa-карбоксилаза Download PDFInfo
- Publication number
- RU2551779C2 RU2551779C2 RU2011142010/10A RU2011142010A RU2551779C2 RU 2551779 C2 RU2551779 C2 RU 2551779C2 RU 2011142010/10 A RU2011142010/10 A RU 2011142010/10A RU 2011142010 A RU2011142010 A RU 2011142010A RU 2551779 C2 RU2551779 C2 RU 2551779C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- nucleotide sequence
- seq
- amino acid
- protein
- nucleic acid
- Prior art date
Links
- 102000000452 Acetyl-CoA carboxylase Human genes 0.000 title claims abstract description 56
- 108010016219 Acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 108010018763 Biotin carboxylase Proteins 0.000 title claims abstract description 53
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 261
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 261
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 227
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 200
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 196
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 165
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 163
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 163
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 123
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 claims abstract description 112
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 110
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 claims abstract description 110
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 claims abstract description 110
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 72
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims abstract description 63
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims abstract description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 38
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims abstract description 36
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 27
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims abstract description 27
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 claims abstract description 13
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 96
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 74
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 16
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 5
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 abstract description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 175
- 241000907999 Mortierella alpina Species 0.000 description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 56
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 56
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 54
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 50
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 46
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 44
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 35
- 208000020990 adrenal cortex carcinoma Diseases 0.000 description 33
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 33
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 32
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 31
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 31
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 31
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 28
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 28
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N acetyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZSLZBFCDCINBPY-ZSJPKINUSA-N 0.000 description 21
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 20
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 19
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N malonyl-CoA Chemical compound O[C@@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC(=O)NCCSC(=O)CC(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 LTYOQGRJFJAKNA-DVVLENMVSA-N 0.000 description 15
- LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N Malonyl CoA Natural products S(C(=O)CC(=O)O)CCNC(=O)CCNC(=O)[C@@H](O)C(CO[P@](=O)(O[P@](=O)(OC[C@H]1[C@@H](OP(=O)(O)O)[C@@H](O)[C@@H](n2c3ncnc(N)c3nc2)O1)O)O)(C)C LTYOQGRJFJAKNA-KKIMTKSISA-N 0.000 description 14
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 13
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 13
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 12
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 12
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101710190443 Acetyl-CoA carboxylase 1 Proteins 0.000 description 11
- 102100021334 Bcl-2-related protein A1 Human genes 0.000 description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 101150058703 ACC1 gene Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 10
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 10
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 10
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 9
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 9
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 9
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 8
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 8
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 7
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 7
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 6
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 6
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 235000009508 confectionery Nutrition 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N dihomo-γ-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 5
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 5
- HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N (8Z,11Z,14Z)-8,11,14-eicosatrienoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O HOBAELRKJCKHQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000007132 Carboxyl and Carbamoyl Transferases Human genes 0.000 description 4
- 108010072957 Carboxyl and Carbamoyl Transferases Proteins 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 235000020673 eicosapentaenoic acid Nutrition 0.000 description 4
- JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N eicosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 4
- SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N palmitoleic acid Chemical compound CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-FPLPWBNLSA-N 0.000 description 4
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- NTTIDCCSYIDANP-UHFFFAOYSA-N BCCP Chemical compound BCCP NTTIDCCSYIDANP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101710201279 Biotin carboxyl carrier protein Proteins 0.000 description 3
- 101710180532 Biotin carboxyl carrier protein of acetyl-CoA carboxylase Proteins 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 235000021298 Dihomo-γ-linolenic acid Nutrition 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 3
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N Linoleic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-HZJYTTRNSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000235575 Mortierella Species 0.000 description 3
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N all-cis-5,8,11,14,17-icosapentaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O JAZBEHYOTPTENJ-JLNKQSITSA-N 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000014510 cooky Nutrition 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 3
- 238000006114 decarboxylation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 description 3
- 229960005135 eicosapentaenoic acid Drugs 0.000 description 3
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 3
- FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N hydron;methanol;chloride Chemical compound Cl.OC FUKUFMFMCZIRNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N linoleic acid Natural products CCCCC\C=C/C\C=C\CCCCCCCC(O)=O OYHQOLUKZRVURQ-IXWMQOLASA-N 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 235000003441 saturated fatty acids Nutrition 0.000 description 3
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 235000019465 surimi Nutrition 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- -1 triacylglycerides Chemical class 0.000 description 3
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 3-aminoalanine Chemical compound [NH3+]CC(N)C([O-])=O PECYZEOJVXMISF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- 241001225321 Aspergillus fumigatus Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100030981 Beta-alanine-activating enzyme Human genes 0.000 description 2
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N Ethyl methanesulfonate Chemical compound CCOS(C)(=O)=O PLUBXMRUUVWRLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000015303 Fatty Acid Synthases Human genes 0.000 description 2
- 108010039731 Fatty Acid Synthases Proteins 0.000 description 2
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710194321 Histone H4.1 Proteins 0.000 description 2
- 101000773364 Homo sapiens Beta-alanine-activating enzyme Proteins 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241001219224 Mortierella elongata Species 0.000 description 2
- 241000048020 Mortierella exigua Species 0.000 description 2
- 241000133355 Mortierella hygrophila Species 0.000 description 2
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 235000021319 Palmitoleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 2
- 240000005384 Rhizopus oryzae Species 0.000 description 2
- 235000013752 Rhizopus oryzae Nutrition 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 101150044776 URA5 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000306282 Umbelopsis isabellina Species 0.000 description 2
- 241000907980 Umbelopsis nana Species 0.000 description 2
- 241000134363 Umbelopsis ramanniana Species 0.000 description 2
- 241000180122 Umbelopsis vinacea Species 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940091771 aspergillus fumigatus Drugs 0.000 description 2
- 235000013527 bean curd Nutrition 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008429 bread Nutrition 0.000 description 2
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 2
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N cis-palmitoleic acid Natural products CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O SECPZKHBENQXJG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AGDANEVFLMAYGL-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O AGDANEVFLMAYGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N gamma-linolenic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-QNEBEIHSSA-N 0.000 description 2
- 235000020664 gamma-linolenic acid Nutrition 0.000 description 2
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000001497 healthy food Nutrition 0.000 description 2
- XMHIUKTWLZUKEX-UHFFFAOYSA-N hexacosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O XMHIUKTWLZUKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N icosanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O VKOBVWXKNCXXDE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 2
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 2
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 235000020778 linoleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 235000021281 monounsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 description 2
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 2
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 235000019992 sake Nutrition 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000028070 sporulation Effects 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N (2R,3S)-3-Hydroxy-2-pyrolidinecarboxylic acid Natural products OC1CCNC1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SBHCLVQMTBWHCD-METXMMQOSA-N (2e,4e,6e,8e,10e)-icosa-2,4,6,8,10-pentaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O SBHCLVQMTBWHCD-METXMMQOSA-N 0.000 description 1
- YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N (2r)-2-aminooctanedioic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CCCCCC(O)=O YOFPFYYTUIARDI-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 1
- BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N (2s)-2-(cyclohexylazaniumyl)propanoate Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC1CCCCC1 BVAUMRCGVHUWOZ-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- LPBSHGLDBQBSPI-YFKPBYRVSA-N (2s)-2-amino-4,4-dimethylpentanoic acid Chemical compound CC(C)(C)C[C@H](N)C(O)=O LPBSHGLDBQBSPI-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UNSRRHDPHVZAHH-YOILPLPUSA-N (5Z,8Z,11Z)-icosatrienoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O UNSRRHDPHVZAHH-YOILPLPUSA-N 0.000 description 1
- YUFFSWGQGVEMMI-UHFFFAOYSA-N (7Z,10Z,13Z,16Z,19Z)-7,10,13,16,19-docosapentaenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCCC(O)=O YUFFSWGQGVEMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YUFFSWGQGVEMMI-RCHUDCCISA-N (7e,10e,13e,16e,19e)-docosa-7,10,13,16,19-pentaenoic acid Chemical compound CC\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\CCCCCC(O)=O YUFFSWGQGVEMMI-RCHUDCCISA-N 0.000 description 1
- KSDMISMEMOGBFU-UHFFFAOYSA-N (all-Z)-7,10,13-Eicosatrienoic acid Natural products CCCCCCC=CCC=CCC=CCCCCCC(O)=O KSDMISMEMOGBFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HQPCSDADVLFHHO-UHFFFAOYSA-N (all-Z)-8,11,14,17-Eicosatetraenoic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O HQPCSDADVLFHHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJWOMMOEOHPFP-UHFFFAOYSA-N (all-Z)-8,11-Eicosadienoic acid Natural products CCCCCCCCC=CCC=CCCCCCCC(O)=O XUJWOMMOEOHPFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- YZAZXIUFBCPZGB-QZOPMXJLSA-N (z)-octadec-9-enoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O YZAZXIUFBCPZGB-QZOPMXJLSA-N 0.000 description 1
- DHEMVUXAYZGHFQ-QZOPMXJLSA-N (z)-tetracos-15-enoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCCCCCCCC(O)=O DHEMVUXAYZGHFQ-QZOPMXJLSA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N -2-Amino-4-hydroxybutanoic acid Natural products OC(=O)C(N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NUKQEEMKQGMUQH-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1-nitrosoguanidine Chemical compound O=NN(C)C(N)=N NUKQEEMKQGMUQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 2,4-diaminobutyric acid Chemical compound NCCC(N)C(O)=O OGNSCSPNOLGXSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 2-(tert-butylazaniumyl)acetate Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)=O TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 3,5-dimethylcyclopentane-1,2-dione Chemical compound CC1CC(C)C(=O)C1=O MIDXCONKKJTLDX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AVKOENOBFIYBSA-GUTOPQIJSA-N 4,7,10,13,16-Docosapentaenoic acid Chemical compound CCCCC\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\CCC(O)=O AVKOENOBFIYBSA-GUTOPQIJSA-N 0.000 description 1
- AVKOENOBFIYBSA-UHFFFAOYSA-N 4,7,10,13,16-Docosapentaenoic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCC(O)=O AVKOENOBFIYBSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNSRRHDPHVZAHH-UHFFFAOYSA-N 6beta,11alpha-Dihydroxy-3alpha,5alpha-cyclopregnan-20-on Natural products CCCCCCCCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O UNSRRHDPHVZAHH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 7h-purin-6-amine;sulfuric acid;dihydrate Chemical compound O.O.OS(O)(=O)=O.NC1=NC=NC2=C1NC=N2.NC1=NC=NC2=C1NC=N2 MKPCNMXYTMQZBE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJWOMMOEOHPFP-OKLKQMLOSA-N 8,11-Eicosadienoic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCCCC(O)=O XUJWOMMOEOHPFP-OKLKQMLOSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 241000219195 Arabidopsis thaliana Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000351920 Aspergillus nidulans Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 235000021357 Behenic acid Nutrition 0.000 description 1
- UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N Behenic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O UKMSUNONTOPOIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 1
- YGEAFNZJAOQBRP-UHFFFAOYSA-N CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O YGEAFNZJAOQBRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 244000020518 Carthamus tinctorius Species 0.000 description 1
- 235000003255 Carthamus tinctorius Nutrition 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N Fursultiamine hydrochloride Chemical compound Cl.C1CCOC1CSSC(\CCO)=C(/C)N(C=O)CC1=CN=C(C)N=C1N OPGOLNDOMSBSCW-CLNHMMGSSA-N 0.000 description 1
- 101150094690 GAL1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150038242 GAL10 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100028501 Galanin peptides Human genes 0.000 description 1
- 102100024637 Galectin-10 Human genes 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 244000299507 Gossypium hirsutum Species 0.000 description 1
- 101150064509 HFA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100121078 Homo sapiens GAL gene Proteins 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 238000012218 Kunkel's method Methods 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N L-homoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCO UKAUYVFTDYCKQA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 244000294411 Mirabilis expansa Species 0.000 description 1
- 235000015429 Mirabilis expansa Nutrition 0.000 description 1
- YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N Mirin Chemical compound S1C(N)=NC(=O)\C1=C\C1=CC=C(O)C=C1 YBHQCJILTOVLHD-YVMONPNESA-N 0.000 description 1
- KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N O-methylserine Chemical compound COC[C@H](N)C(O)=O KNTFCRCCPLEUQZ-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020001027 Ribosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100386089 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MET17 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235347 Schizosaccharomyces pombe Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 101150078565 TEF gene Proteins 0.000 description 1
- 244000269722 Thea sinensis Species 0.000 description 1
- HXWJFEZDFPRLBG-UHFFFAOYSA-N Timnodonic acid Natural products CCCC=CC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O HXWJFEZDFPRLBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M Vaccenic acid Natural products CCCCCC\C=C/CCCCCCCCCC([O-])=O UWHZIFQPPBDJPM-FPLPWBNLSA-M 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- TWSWSIQAPQLDBP-UHFFFAOYSA-N adrenic acid Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCCC(O)=O TWSWSIQAPQLDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 235000013334 alcoholic beverage Nutrition 0.000 description 1
- HQPCSDADVLFHHO-LTKCOYKYSA-N all-cis-8,11,14,17-icosatetraenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCC(O)=O HQPCSDADVLFHHO-LTKCOYKYSA-N 0.000 description 1
- TWSWSIQAPQLDBP-DOFZRALJSA-N all-cis-docosa-7,10,13,16-tetraenoic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCC(O)=O TWSWSIQAPQLDBP-DOFZRALJSA-N 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000015241 bacon Nutrition 0.000 description 1
- 229940116226 behenic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 235000015895 biscuits Nutrition 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 235000012813 breadcrumbs Nutrition 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 235000012970 cakes Nutrition 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 125000001314 canonical amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 235000013736 caramel Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 235000015218 chewing gum Nutrition 0.000 description 1
- 229940112822 chewing gum Drugs 0.000 description 1
- 235000019219 chocolate Nutrition 0.000 description 1
- BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N cis-3-hydroxy-D-proline zwitterion Chemical compound O[C@H]1CCN[C@H]1C(O)=O BJBUEDPLEOHJGE-IUYQGCFVSA-N 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- MBMBGCFOFBJSGT-SFGLVEFQSA-N docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\C\C=C\CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-SFGLVEFQSA-N 0.000 description 1
- KFEVDPWXEVUUMW-UHFFFAOYSA-N docosanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCCC1=CC=C(O)C=C1 KFEVDPWXEVUUMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000012489 doughnuts Nutrition 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000000678 effect on lipid Effects 0.000 description 1
- IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N eicosatetraenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O IQLUYYHUNSSHIY-HZUMYPAESA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000020882 elemental diet Nutrition 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 235000021107 fermented food Nutrition 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000005454 flavour additive Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000005519 fluorenylmethyloxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000014105 formulated food Nutrition 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 210000000167 fungal chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N gamma-Linolensaeure Natural products CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O VZCCETWTMQHEPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002733 gamolenic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- JYDNQSLNPKOEII-CFYXSCKTSA-N hexadec-9-enoic acid;(z)-hexadec-9-enoic acid Chemical compound CCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O.CCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O JYDNQSLNPKOEII-CFYXSCKTSA-N 0.000 description 1
- KYYWBEYKBLQSFW-UHFFFAOYSA-N hexadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O KYYWBEYKBLQSFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 235000015243 ice cream Nutrition 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000008446 instant noodles Nutrition 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N isoglutamic acid Chemical compound OC(=O)CC(N)CC(O)=O BBJIPMIXTXKYLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 description 1
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037356 lipid metabolism Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 235000020888 liquid diet Nutrition 0.000 description 1
- XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M lithium acetate Chemical compound [Li+].CC([O-])=O XIXADJRWDQXREU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000004668 long chain fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 235000013310 margarine Nutrition 0.000 description 1
- 239000003264 margarine Substances 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 235000010746 mayonnaise Nutrition 0.000 description 1
- 239000008268 mayonnaise Substances 0.000 description 1
- 235000013372 meat Nutrition 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N methyl undecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCC(O)=O POULHZVOKOAJMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 235000013536 miso Nutrition 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012149 noodles Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000008935 nutritious Nutrition 0.000 description 1
- XVEIGUQEXNENQF-HPFCUAHCSA-N octadeca-6,9,12-trienoic acid;(6z,9z,12z)-octadeca-6,9,12-trienoic acid Chemical compound CCCCCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O.CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC(O)=O XVEIGUQEXNENQF-HPFCUAHCSA-N 0.000 description 1
- RQFLGKYCYMMRMC-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O RQFLGKYCYMMRMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 229940094443 oxytocics prostaglandins Drugs 0.000 description 1
- 150000002943 palmitic acids Chemical class 0.000 description 1
- PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N pamp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](C)N)C(C)C)C1=CC=CC=C1 PIRWNASAJNPKHT-SHZATDIYSA-N 0.000 description 1
- 235000015927 pasta Nutrition 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 235000014594 pastries Nutrition 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229930001119 polyketide Natural products 0.000 description 1
- 125000000830 polyketide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 235000021067 refined food Nutrition 0.000 description 1
- 230000031390 regulation of fatty acid biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000028503 regulation of lipid metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 235000019685 rice crackers Nutrition 0.000 description 1
- 235000019991 rice wine Nutrition 0.000 description 1
- 235000014438 salad dressings Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 235000013580 sausages Nutrition 0.000 description 1
- 235000014102 seafood Nutrition 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002893 slag Substances 0.000 description 1
- 235000014214 soft drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 235000014347 soups Nutrition 0.000 description 1
- 235000013555 soy sauce Nutrition 0.000 description 1
- 235000011496 sports drink Nutrition 0.000 description 1
- 239000007361 sporulation-agar Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N stearidonic acid Natural products CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCCC(O)=O JIWBIWFOSCKQMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 235000013616 tea Nutrition 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- APQQZDCQUWIDSV-JXGYXAOLSA-N tetradec-2-enoic acid;(z)-tetradec-9-enoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCC=CC(O)=O.CCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O APQQZDCQUWIDSV-JXGYXAOLSA-N 0.000 description 1
- ZTUXEFFFLOVXQE-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O.CCCCCCCCCCCCCC(O)=O ZTUXEFFFLOVXQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N trans-vaccenic acid Chemical compound CCCCCC\C=C\CCCCCCCCCC(O)=O UWHZIFQPPBDJPM-BQYQJAHWSA-N 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 101150016309 trpC gene Proteins 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 235000021419 vinegar Nutrition 0.000 description 1
- 239000000052 vinegar Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
- DTOSIQBPPRVQHS-UHFFFAOYSA-N α-Linolenic acid Chemical compound CCC=CCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
- C12P7/64—Fats; Fatty oils; Ester-type waxes; Higher fatty acids, i.e. having at least seven carbon atoms in an unbroken chain bound to a carboxyl group; Oxidised oils or fats
- C12P7/6409—Fatty acids
- C12P7/6427—Polyunsaturated fatty acids [PUFA], i.e. having two or more double bonds in their backbone
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
- A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
- A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
- A23L33/115—Fatty acids or derivatives thereof; Fats or oils
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8216—Methods for controlling, regulating or enhancing expression of transgenes in plant cells
- C12N15/8222—Developmentally regulated expression systems, tissue, organ specific, temporal or spatial regulation
- C12N15/823—Reproductive tissue-specific promoters
- C12N15/8234—Seed-specific, e.g. embryo, endosperm
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/14—Plant cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/93—Ligases (6)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y604/00—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4)
- C12Y604/01—Ligases forming carbon-carbon bonds (6.4.1)
- C12Y604/01002—Acetyl-CoA carboxylase (6.4.1.2)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Nutrition Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Botany (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области биотехнологии. Представлена нуклеиновая кислота, кодирующая белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность: (a) кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2; (b) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, комплементарной SEQ ID NO:1; (c) SEQ ID NO:1; и (d) которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок SEQ ID NO:2; где SEQ ID NO:1 и 2 раскрыты в описании. Также описаны: ацетил-СоА-карбоксилаза (SEQ ID NO:2), повышающая содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина; рекомбинантный вектор, содержащий указанную нуклеиновую кислоту; и клетка, которая трансформирована указанным вектором, предназначенные для получения композиции жирных кислот, содержащей повышенный уровень арахидоновой кислоты. Предложен способ получения композиции жирных кислот, включающий культивирование указанной клетки и сбор композиции жирных кислот из культуры трансформированных клеток. Изобретение позволяет получить композицию жирных кислот в клетке-хозяине с повышенным содержанием арахидоновой кислоты. 9 н. и 2 з.п. ф-лы, 8 ил., 5 табл., 8 пр.
Description
Область техники, к которой относится изобретение
Настоящее изобретение относится к новой ацетил-CoA-карбоксилазе.
Предпосылки создания изобретения
Жирные кислоты являются важными составляющими липидов, таких как фосфолипиды и триацилглицериды. Известно, что жирные кислоты, содержащие две или более ненасыщенных связей, которые обобщенно называются полиненасыщенными жирными кислотами (PUFA), включают арахидоновую кислоту, дигомо-γ-линоленовую кислоту, эйкозапентаеновую кислоту и докозагексаеновую кислоту. В литературе опубликованы данные о различных видах физиологической активности таких жирных кислот (непатентный документ 1).
Среди них привлекает внимание арахидоновая кислота в качестве промежуточного метаболита при синтезе простагландинов, лейкотриенов и т.п., и было предпринято множество попыток использовать ее в качестве материала для функциональных продуктов питания и лекарственных средств. Кроме того, арахидоновая кислота содержится в грудном молоке, так что она важна для роста младенцев, особенно, для роста и развития мозга эмбриона, и поэтому она привлекает внимание также как и DHA (докозагексаеновая кислота) в пищевом аспекте как необходимый компонент для роста младенцев.
Предполагается, что такие полиненасыщенные жирные кислоты найдут применение в различных областях, но некоторые из них не могут быть синтезированы in vivo у животных. Это привело к разработке способов получения полиненасыщенных жирных кислот путем культивирования различных микроорганизмов. Также предпринимались попытки продукции полиненасыщенных жирных кислот в растениях. В этом случае известно, что полиненасыщенные жирные кислоты накапливаются в виде компонентов запасных липидов, таких как триацилглицериды, например, в микробных клетках или семенах растений.
Хотя молекулярные структуры ферментов, вовлеченных в de novo синтез жирных кислот и удлинение цепей жирных кислот, отличаются у прокариотов и эукариотов, механизмы ферментативных реакций похожи для любых типов клеток. Биосинтез жирных кислот начинается с ацетил-CoA, и из ацетил-CoA образуется малонил-CoA в результате катализа ацетил-CoA-карбоксилазой (E.C.6.4.1.2). Различные насыщенные жирные кислоты синтезируют путем добавления двух атомов углерода посредством декарбоксилирующего сочетания ацетил-CoA с малонил-CoA в серии реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления, катализируемых синтетазами жирных кислот (FAS). Аналогичным образом, реакции удлинения цепи жирной кислоты включают добавление двух атомов углерода посредством декарбоксилирующего сочетания ацетил-CoA с малонил-CoA в серии реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления.
В настоящее время ацетил-CoA-карбоксилазы (далее также называемые «АСС») известны для нескольких организмов. АСС млекопитающих представляют собой конкретные аллостерические ферменты, активируемые лимонной кислотой, ингибируемые сложными эфирами CoA и длинноцепочечных жирных кислот и инактивируемые фосфорилированием. У грибов интенсивно исследуется АСС из дрожжей (Saccharomyces cerevisiae).
АСС из S. cerevisiae локализована в цитоплазме и митохондриях и кодируется генами ACC1 и HFA1, соответственно. Известно, что ген АСС1 является необходимым геном, делеция которого приводит к гибели клетки (непатентный документ 2). Анализ различных штаммов выявил, что ген АСС1 также вовлечен в транспорт (полиА+)мРНК из ядра, а также имеет другие функции (непатентный документ 3).
Предпринимались попытки увеличить содержание жиров в семенах растений с использованием генов АСС (непатентный документ 4). Например, опубликовано, что содержание жирных кислот в расчете на сухую массу увеличивается, а также изменяется соотношение состава жирных кислот в семенах трансгенной Brassica napus L., экспрессирующей ACC из Arabidopsis thaliana (непатентный документ 5). Однако картина изменения соотношения состава жирных кислот зависит от соотношения состава жирных кислот, присущих организму-хозяину, и трансдуцированного гена АСС. С другой стороны, активность АСС регулируется различным образом не только на уровне экспрессии, но также и на уровне белка (непатентные документы 3 и 4), а также на нее влияют взаимодействия с другими ферментами, функционирующими в ряде систем синтеза жирных кислот. Поэтому, для получения желаемой композиции жирных кислот в зависимости от трансформируемого организма-хозяина может потребоваться соответствующий ген АСС.
Для продуцирующего липиды гриба Mortierella alpina (далее также называемого «M. alpina») в качестве гена АСС ранее был известен фрагмент гена гомолога АСС из штамма CBS 528.72, предположительно обладающего АСС-активностью (ацетил-CoA-карбоксилазной активностью) (непатентный документ 6). Однако до настоящего времени не было подтверждено, что белок, содержащий такой фрагмент, обладает АСС-активностью. Была проведена оценка штамма M. alpina CBS696.70 по накоплению жира и ацетил-CoA-карбоксилазной активности (непатентный документ 7).
Ссылки
Непатентные документы
Непатентный документ 1: Lipids, 39, 1147 (2004)
Непатентный документ 2: Giaever G. et al. Nature 418, 387-91 (2002)
Непатентный документ 3: O. Tehlivets et al., Biochimica et Biophysica Acta, 1771, 255-270 (2007)
Непатентный документ 4: Biosci. Biotechnol. Biochem., 68 (6), 1175-1184, (2004)
Непатентный документ 5: Plant Physiol. 113, 75-81 (1997)
Непатентный документ 6: The International Nucleotide Sequence Database accession number AJ586915
Непатентный документ 7: Microbiology, 145, 1911-1917 (1999)
Краткое описание сущности изобретения
Технические проблемы
Однако известно, что гены АСС, о которых сообщалось до настоящего времени, не обладают достаточным влиянием на метаболизм липидов при их переносе и экспрессии в организмах-хозяевах. Их недостатком также является то, что они недостаточно эффективно увеличивают или уменьшают накопление жиров или жирных кислот в некоторых хозяевах. Поэтому необходим новый белок, который при переносе и экспрессии в клетке-хозяине будет влиять на метаболизм липидов хозяина. Также необходим новый белок, способный продуцировать жиры с высоким содержанием промышленно значимых жирных кислот.
Способ решения проблем
Задачей настоящего изобретения является предоставление белков и нуклеиновых кислот, способных продуцировать ценные жиры путем экспрессии в клетке-хозяине для влияния на метаболизм липидов хозяина или для увеличения содержания желаемой жирной кислоты.
Для достижения поставленной задачи авторы изобретения провели тщательные исследования. Во-первых, с помощью EST-анализа продуцирующего липиды гриба M. alpina были выявлены последовательности, имеющие высокую гомологию с известными генами АСС. Для получения полноразмерной открытой рамки считывания (ORF), кодирующей АСС, при помощи скрининга кДНК-библиотеки или ПЦР была клонирована полноразмерная кДНК. Путем ее трансформации в высокопролиферирующую клетку-хозяина, такую как дрожжевая клетка, авторы изобретения предприняли попытку продуцировать композицию жирных кислот и успешно клонировали ген новой АСС, способной продуцировать композицию жирных кислот, отличающуюся от композиции, продуцируемой хозяевами, экспрессирующими обычные АСС, и в итоге осуществили настоящее изобретение. Соответственно, настоящее изобретение обеспечивает следующие аспекты:
(1) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:
(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;
(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;
(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; и
(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью.
(2) Нуклеиновую кислоту по пункту (1), которой является любая из (а)-(e) ниже:
(а) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;
(b) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; и
(c) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью;
(d) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; и
(e) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью.
(3) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(c) ниже:
(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, или ее фрагмент;
(b) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, или ее фрагмент;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4, или ее фрагмент.
(4) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:
(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;
(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;
(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах; и
(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах.
(5) Нуклеиновую кислоту по пункту (4), которой является любая из (а)-(e) ниже:
(а) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;
(b) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;
(c) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах;
(d) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах; и
(e) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах.
(6) Белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью.
(7) Белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активностью; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий ацетил-CoA-карбоксилазной активность
(8) Белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей.
(9) Белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, восполняющей отсутствие ацетил-CoA-карбоксилазы у дрожжей.
(10) Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2.
(11) Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пунктов (1)-(5).
(12) Клетку, трансформированную рекомбинантным вектором по пункту (11).
(13) Композицию жирных кислот, полученную культивированием трансформированной клетки по пункту (12).
(14) Способ получения композиции жирных кислот по пункту (13), включающий сбор композиции жирных кислот из культуры трансформированных клеток по пункту (12).
(15) Продукт питания, содержащий композицию жирных кислот по пункту (13).
(16) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:
(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина;
(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина;
(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина; и
(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина.
(17) Белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина.
Дополнительно, настоящее изобретение также охватывает следующие аспекты:
(А) Нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже:
(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина;
(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях, предпочтительно, в условиях 2×SSC при 50°C, с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность, предпочтительно, 90% или большую с нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина;
(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую, предпочтительно, 90% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина; и
(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях, предпочтительно, в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина.
(B) Белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую, предпочтительно, 90% или большую с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий активностью, изменяющей содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот, характерное для хозяина.
Дополнительно, настоящее изобретение также охватывает: (C) рекомбинантный вектор, содержащий любую из нуклеиновых кислот, представленных в пункте (А); (D) клетку, трансформированную рекомбинантным вектором; (E) композицию жирных кислот, полученную культивированием трансформированной клетки, имеющей измененное содержание жирных кислот или соотношение состава жирных кислот по сравнению с параметрами, характерными для культур хозяина, не трансформированных рекомбинантным вектором по пункту (C); (F) способ получения композиции жирных кислот по пункту (E), включающий сбор композиции жирных кислот по пункту (E) из культур трансформированных клеток по пункту (D); и (G) продукт питания, содержащий композицию жирных кислот по пункту (E).
Предпочтительные эффекты изобретения
АСС настоящего изобретения улучшает способность продуцировать жирные кислоты и/или запасные липиды и, поэтому, предпочтительна в качестве средства улучшения продукции полиненасыщенных жирных кислот у микроорганизмов и растений. Таким образом, из них можно получить липиды с желаемыми характеристиками или эффектами, которые пригодны для использования в продуктах питания, косметических продуктах, фармацевтических продуктах, мылах и т.д.
Краткое описание фигур
На фиг.1А показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).
На фиг.1В показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).
На фиг.1С показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).
На фиг.1D показана полноразмерная последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из штамма M. alpina 1S-4 и выведенная из нее аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2).
На фиг.2А показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.2В показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.2С показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.2D показано сравнение между полноразмерной последовательностью кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4 и нуклеотидной последовательностью фрагмента гомолога АСС из известного штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.3А показано сравнение между аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:25), образованной из фрагмента кДНК АСС из штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.3В показано сравнение между аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:25), образованной из фрагмента кДНК АСС из штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.3С показано сравнение между аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:25), образованной из фрагмента кДНК АСС из штамма M. alpina CBS528.72.
На фиг.4А показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
На фиг.4В показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
На фиг.4С показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
На фиг.4D показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
На фиг.4Е показано сравнение аминокислотной последовательности (SEQ ID NO:2), образованной из полноразмерной последовательности кДНК ACC из штамма M. alpina 1S-4, с аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:34) цитоплазматической АСС, Асс1р, и аминокислотной последовательностью (SEQ ID NO:35) митохондриальной ACC, Hfa1p, из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Фиг.5 является схематической диаграммой, на которой показана плазмида pSDY-ACC. На данной фигуре hisH4.1p представляет промотор гена гистона H4.1 из M. alpina, trpCt представляет терминатор гена trpC из Aspergillus nidulans, ura5 представляет ген ura5 из M. alpina, и рДНК представляет часть 18S рДНК (рибосомной ДНК) из M. alpina. Стрелки (→) на схеме указывают положения праймеров ACC-F7 и trpCt-R, используемых для идентификации трансформированных штаммов.
Фиг.6 является графиком, показывающим изменение во времени сухой массы клеток трансформированных штаммов M. alpina. Ось ординат: сухая масса клеток (г/пробирка); ось абсцисс: время инкубации (дни).
Фиг.7 является графиком, показывающим изменение во времени количества жирных кислот, продуцируемых трансформированными штаммами M. alpina. Ось ординат: количество продуцируемых жирных кислот (мг/л среды); ось абсцисс: время инкубации (дни).
Фиг.8 является графиком, показывающим соотношение состава жирных кислот трансформированных штаммов M. alpina на 8-й день инкубации. Ось ординат: соотношение состава жирных кислот; ось абсцисс: клетка-хозяин и трансформированные штаммы. Условные обозначения на графике: EPA: эйкозапентаеновая кислота; ARA: арахидоновая кислота; DGLA: дигомо-γ-линоленовая кислота; GLA: γ-линоленовая кислота; LA: линолевая кислота; OA: олеиновая кислота; SA: стеариновая кислота; PA: пальмитиновая кислота.
Описание вариантов осуществления изобретения
Настоящее изобретение относится к новой ацетил-CoA-карбоксилазе из рода Mortierella, характеризуемой катализируемой реакцией получения малонил-CoA посредством АТФ-зависимого карбоксилирования ацетил-CoA.
Реакция получения малонил-CoA из ацетил-CoA, опосредуемая ацетил-CoA-карбоксилазой настоящего изобретения (далее также называемой «АСС»), является ключевой, лимитирующей стадией в биосинтезе жирных кислот. Это означает, что АСС представляет собой ключевой фермент, отвечающий за поставку малонил-CoA, который является важным промежуточным соединением в синтезе жирных кислот. Более конкретно, АСС представляет собой фермент, катализирующий следующую реакцию:
[Формула 1]
АТФ+ацетил-CoA+HCO3 -<=>АДФ+Pi+малонил-CoA
Таким образом, такие ферменты катализируют реакцию получения малонил-CoA посредством АТФ-зависимого карбоксилирования ацетил-CoA. Эта реакция проходит в две стадии, показанные ниже:
[Формула 2]
(1) BCCP*+HCO3 -+Mg2 +-АТФ→BCCP-CO2 -+Mg2 +-АДФ+Pi (биотин-карбоксилтранфераза)
(2) BCCP-CO2 -+ацетил-CoA→BCCP+малонил-CoA (карбоксилтрансфераза)
BCCP*: белок-носитель биотинкарбоксила
Малонил-CoA, продуцируемый по данной реакции, служит в качестве субстрата для de novo реакции синтеза жирных кислот или реакции удлинения цепи жирной кислоты при синтезе различных жирных кислот. Таким образом, известно, что АСС настоящего изобретения играет важную роль в регуляции биосинтеза жирных кислот или метаболизма липидов.
Малонил-CoA, продуцируемый АСС настоящего изобретения, является субстратом в синтезе жирных кислот, описанном выше, и скорость продукции малонил-CoA определяет скорость in vivo биосинтеза жирных кислот. Более конкретно, de novo синтез жирных кислот начинается с ацетил-CoA, к которому для синтеза новых жирных кислот добавляют два атома углерода путем декарбоксилирующего присоединения малонил-CoA в серии реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления. Например, пальмитиновую кислоту, содержащую 16 атомов углерода, синтезируют семью циклами серий реакций конденсации-восстановления-дегидратации-восстановления, при этом два атома углерода на метильном конце данной пальмитиновой кислоты являются производными ацетил-CoA, и другие являются производными малонил-CoA. Малонил-CoA не только является промежуточным соединением в биосинтезе жирных кислот, но также является промежуточным соединением в биосинтезе поликетидов.
Кроме того, ацетил-CoA-карбоксилаза настоящего изобретения обладает активностью, компенсирующей недостаток ацетил-CoA-карбоксилазы в дрожжах, которая подробно описана ниже.
Нуклеиновые кислоты, кодирующие ацетил-CoA-карбоксилазу настоящего изобретения
Последовательности, относящиеся к ацетил-CoA-карбоксилазе настоящего изобретения (АСС), включают SEQ ID NO:1, представляющую собой область открытой рамки считывания (ORF-область) ACC из M. alpina 1S-4; SEQ ID NO:2, представляющую собой ее аминокислотную последовательность; SEQ ID NO:3, представляющую собой область кодирующей последовательности (CDS-область); SEQ ID NO:4, представляющую собой нуклеотидную последовательность кДНК; и SEQ ID NO:5, представляющую собой геномную нуклеотидную последовательность. Более конкретно, SEQ ID NO:3 соответствует нуклеотидам 45-6734 из SEQ ID NO:4, и SEQ ID NO:1 соответствует нуклеотидам 45-6731 из SEQ ID NO:4 и нуклеотидам 1-6684 из SEQ ID NO:3. Геномная последовательность SEQ ID NO:5 содержит пять интронных и экзонных областей, соответствующих нуклеотидам 1-27, 315-665, 1271-2828, 2917-3463, 3590-6239 и 6339-7889 из SEQ ID NO:5.
Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения включают одноцепочечные и двухцепочечные ДНК, а также комплементарную им РНК, и могут быть либо природными, либо полученными искусственно. Например, ДНК включает, но не ограничивается ими, геномную ДНК, кДНК, соответствующую геномной ДНК, химически синтезированную ДНК, ПЦР-амплифицированную ДНК и их комбинации, а также ДНК/РНК-гибриды.
Предпочтительные варианты нуклеиновых кислот настоящего изобретения включают (а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1; (b) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, представленной в SEQ ID NO:2; (c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4; или (d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:5, и т.д.
Для получения вышеперечисленных нуклеотидных последовательностей можно провести поиск нуклеотидных последовательностей, кодирующих белки, имеющие высокий процент идентичности с известным белком с АСС-активностью, по базе данных нуклеотидных последовательностей EST или геномной ДНК из организма, обладающего АСС-активностью. Организмом, обладающим АСС-активностью, предпочтительно, является продуцирующие липиды грибки, такие как, но без ограничения, M. alpina.
Для проведения EST-анализа сначала конструируют кДНК-библиотеку. Методики создания кДНК-библиотеки можно найти в «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)). Также можно использовать коммерчески доступные наборы для создания кДНК-библиотеки. Например, методика создания кДНК-библиотеки, подходящей для настоящего изобретения, является следующей. А именно, соответствующую среду инокулируют соответствующим штаммом продуцирующих липиды грибков M. alpina, и предварительно культивируют в течение соответствующего периода времени. Например, условия культивирования, подходящие для данного предварительного культивирования, включают среду, состоящую из 1,8% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта, рН 6,0, и культивирование в течение 3 дней при температуре инкубации 28°C. Затем из продукта предварительного культивирования получают основную культуру в соответствующих условиях. Например, композиция культуральной среды, подходящей для основной культуры, может содержать 1,8% глюкозы, 1% порошка соевых бобов, 0,1% оливкового масла, 0,01% адеканола, 0,3% KH2PO4, 0,1% Na2SO4, 0,05% CaCl2·2H2O, 0,05% MgCl2·6H2O, pH 6,0. Условия инкубации, подходящие для основной культуры, включают инкубацию при аэрации и встряхивании при 300 об/мин, 1 vvm, 26°C, в течение 8 дней. В ходе инкубации можно добавлять соответствующее количество глюкозы. Культуры собирают в соответствующих временных точках в ходе основного культивирования, и клетки собирают для получения тотальной РНК. Тотальную РНК можно выделить с помощью известной методики, такой как способ с использованием гуанидинхлорида/CsCl. Поли(А)+РНК можно очистить из полученной тотальной РНК с помощью коммерчески доступного набора. Кроме того, кДНК-библиотеку можно создать, используя коммерчески доступный набор. Затем можно получить данные о EST путем определения нуклеотидных последовательностей любых клонов из созданной кДНК-библиотеки, используя праймеры, подобранные для секвенирования вставки в векторе. Например, можно провести направленное клонирование, когда кДНК-библиотеку создают с использованием набора для клонирования ZAP-cDNA GigapackIII Gold (STRATAGENE).
В результате поиска гомологии с использованием BLASTX среди аминокислотных последовательностей, помещенных в базу данных GenBank, было показано, что последовательность кДНК АСС настоящего изобретения имеет гомологию с АСС-гомологами из эукариотических микроорганизмов. Среди известных аминокислотных последовательностей гипотетический белок RO3G_04977 из Rhizopus oryzae имел наиболее высокий процент идентичности, и идентичность нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности между кодирующей этот белок CDS и CDS белка ACC настоящего изобретения, определенные с помощью clustalW, составляли 65,5% и 66,3%, соответственно. Идентичность возможным аминокислотным последовательностям гомологов АСС из других грибов составляла 58,8% для гомолога из Neurospora crassa (номер доступа EAA33781), 58,3% для гомолога из Aspergillus fumigatus (номер доступа EAL93163) и 55,1% для цитоплазматической ACC, Acc1p (SEQ ID NO:34), и 44,7% для митохондриальной ACC, Hfa1p (SEQ ID NO:35), из дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
Что касается гена АСС из M. alpina, то фрагмент гомолога АСС из штамма CBS528.72 был уже известен и ранее помещен в базу данных Genbank (нуклеотидная последовательность: номер доступа AJ586915 (непатентный документ 6); аминокислотная последовательность: номер доступа CAE52914). CDS-область из штамма CBS528.72 соответствует нуклеотидам 342-1439 из SEQ ID NO:1, и ее аминокислотная последовательность соответствует аминокислотам 100-465 из SEQ ID NO:4. По сравнению с этими последовательностями CDS-область из штамма CBS528.72 в недавно полученной кДНК из M. alpina 1S-4 имела 91,3% идентичность нуклеотидной последовательности и 97,8% идентичность аминокислотной последовательности. Для кДНК из M. alpina 1S-4 настоящего изобретения последовательности нераскрытых областей в известном штамме CBS528.72 еще не были опубликованы, и, поэтому, полная последовательность гена ACC из M. alpina впервые была описана настоящим изобретением. Было показано, что недавно описанные последовательности областей содержат ряд областей или других элементов, критичных для функционирования АСС, и более конкретно, домен белка-носителя биотинкарбоксила, карбоксилтрансферазный домен, консервативный домен белка-акцептора биотина и аминокислотные остатки, входящие в состав акцептора биотина, все из которых необходимы для активности АСС.
Настоящее изобретение также охватывает нуклеиновые кислоты, функционально эквивалентные нуклеиновой кислоте, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в приведенной выше SEQ ID NO:1 (далее также называемую как «нуклеотидная последовательность настоящего изобретения»), или нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2 (далее также называемую как «аминокислотная последовательность настоящего изобретения»). Выражение «функционально эквивалентная» означает, что белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, и белок, состоящий из аминокислотной последовательности настоящего изобретения, обладает АСС-активностью. АСС-активность можно оценить с помощью известных способов, включая, например, способ, описанный в J.B.C., 279, 21779-21786, 2004.
В дополнение к указанной выше АСС-активности белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, или белок, состоящий из аминокислотной последовательности настоящего изобретения, могут также представлять собой белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток АСС в дрожжах (далее также называемый «белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток АСС в дрожжах настоящего изобретения»). АСС дрожжей (S. cerevisiae) локализована в цитоплазме и митохондриях, причем известно, что ген АСС1, кодирующий цитоплазматическую АСС, является необходимым геном, чья делеция приводит к гибели клетки (Biochim. Biophys. Acta, 1771, 255-270, 2007). Другими словами, дрожжи, у которых отсутствует ген АСС1, не могут нормально расти, но его функция компенсируется, и они могут расти при экспрессии гена, функционально эквивалентного гену АСС1.
В связи с этим, способом подтверждения компенсации недостатка АСС в дрожжах с помощью АСС настоящего изобретения может быть любой способ, подтверждающий восстановление АСС-активности в штамме дрожжей с отсутствием АСС при экспрессии гена АСС настоящего изобретения. В качестве конкретного примера, для гена АСС1, кодирующего цитоплазматическую АСС, может быть использован следующий способ.
В данном способе получают гетерозиготный штамм, у которого отсутствует один аллель гена АСС1, кодирующего цитоплазматическую АСС в диплоидных дрожжах, и затем получают штамм, несущий экспрессионную кассету с геном АСС настоящего изобретения на хромосоме, отличной от хромосомы, несущей АСС1, как подробно описано в примере 4 ниже. Эти штаммы высевают на чашки для споруляции для образования аскоспор. Полученные клетки могут быть подвергнуты анализу случайной выборки спор или тетрадному анализу для отбора полученных из спор гаплоидных штаммов. Полученные таким образом гаплоидные дрожжи генотипируют для того, чтобы оценить могут ли нежизнеспособные в других случаях штаммы, дефицитные по АСС1, расти только в присутствии экспрессионной кассеты гена АСС настоящего изобретения, указывая на то, что АСС настоящего изобретения может компенсировать АСС-активность в S. cerevisiae.
В дополнение к указанной выше АСС-активности белок, кодируемый нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, или белок, состоящий из аминокислотной последовательности настоящего изобретения, может также представлять собой белок, обладающий активностью, изменяющей содержание арахидоновой кислоты или композицию жирных кислот, характерные для хозяина. Таким образом, при трансформации клетки-хозяина нуклеиновой кислотой, кодирующей белок настоящего изобретения, и экспрессии белка количество или соотношение состава жирных кислот, продуцируемых трансформированной клеткой, могут измениться по сравнению с этими показателями для нетрансформированных клеток-хозяев. Клеткой-хозяином может быть любая клетка из списка, приведенного в разделе «Конструирование векторов для экспрессии АСС настоящего изобретения и получение трансформированных клеток» ниже. Жирными кислотами, продуцируемыми хозяином, могут быть жирные кислоты, приведенные в разделе «Композиции жирных кислот настоящего изобретения» ниже.
Такие нуклеиновые кислоты, функционально эквивалентные нуклеиновым кислотам настоящего изобретения, включают нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(e) ниже. Используемое ниже выражение «указанная выше активность настоящего изобретения» относится к «АСС-активности; активности, компенсирующей недостаток АСС в дрожжах настоящего изобретения; и/или активности, изменяющей содержание арахидоновой кислоты или композицию жирных кислот, характерные для хозяина», определение которых дано выше.
(а) Нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Более конкретно, она содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из:
(i) аминокислотной последовательности с делецией одной или более (предпочтительно, одной или нескольких (например, 1-400, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2;
(ii) аминокислотной последовательности с замещенными другими аминокислотами одной или более (предпочтительно, одной или нескольких (например, 1-400, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2;
(iii) аминокислотной последовательности с добавлением одной или более (предпочтительно, одной или нескольких (например, 1-400, 1-200, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2; или
(iv) аминокислотной последовательности с любой комбинацией (i)-(iii) выше;
и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
В приведенных выше модификациях предпочтительны консервативные замены. Консервативная замена относится к замене конкретного аминокислотного остатка другим аминокислотным остатком, имеющим аналогичные физико-химические характеристики, и может представлять собой любую замену, которая по существу не изменяет структурные характеристики исходной последовательности, например, она может представлять собой любую замену, при условии, что замещенные аминокислоты не разрушают спираль, присутствующую в исходной последовательности, или не разрушают любой другой тип вторичной структуры, присущий исходной последовательности.
Консервативную замену обычно вводят путем синтеза в биологических системах или путем химического пептидного синтеза, предпочтительно, химическим пептидным синтезом. В этом случае заместители могут включать неприродные аминокислотные остатки, а также пептидомиметики, и обратные или инвертированные формы аминокислотных последовательностей, в которых аминокислоты в незамещенных областях расположены в обратном порядке или инвертированы.
Ниже приведен не ограничивающий объем изобретения перечень групп аминокислотных остатков, которые могут быть замещены друг другом.
Группа А: лейцин, изолейцин, норлейцин, валин, норвалин, аланин, 2-аминомасляная кислота, метионин, О-метилсерин, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин и циклогексилаланин;
группа В: аспарагиновая кислота, глутаминовая кислота, изоаспарагиновая кислота, изоглутаминовая кислота, 2-аминоадипиновая кислота и 2-аминосубериновая кислота;
группа С: аспарагин и глутамин;
группа D: лизин, аргинин, орнитин, 2,4-диаминомасляная кислота и 2,3-диаминопропионовая кислота;
группа Е: пролин, 3-гидроксипролин и 4-гидроксипролин;
группа F: серин, треонин и гомосерин; и
группа G: фенилаланин и тирозин.
Неконсервативные замены могут включать любую замену члена одной из вышеперечисленных групп членом другой группы, причем в этом случае для сохранения биологических функций белков настоящего изобретения предпочтительно учитывать индексы гидрофобности аминокислот (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)).
Неконсервативная замена может также включать аминокислотную замену на основе гидрофобности.
В описании и чертежах настоящего изобретения обозначения и сокращения для нуклеотидов и аминокислот основаны на биологической номенклатуре, предложенной комиссией IUPAC и IUB, или протоколах, обычно используемых в данной области, описанных, например, в Immunology-A Synthesis (second edition, edited by E.S. Golub and D.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts (1991)). Любые оптические изомеры аминокислот (если они возможны) относятся к L-изомерам, если не указано иное.
Стереоизомеры приведенных выше аминокислот, такие как D-аминокислоты, неприродные аминокислоты, такие как α,α-дизамещенные аминокислоты, N-алкиламинокислоты, молочная кислота и другие неканонические аминокислоты, могут также входить в состав белков настоящего изобретения.
В настоящем описании последовательности белков приведены с аминоконцом с левой стороны, и карбоксиконцом с правой стороны, в соответствии со стандартным написанием и как общепринято в данной области.
Аналогичным образом и как принято в данной области, одноцепочечные полинуклеотидные последовательности приведены с 5'-концом с левой стороны, и двухцепочечные полинуклеотидные последовательности приведены с 5'-концом одной цепи с левой стороны, если не указано иное.
Специалист в данной области сможет подобрать и создать различные варианты белков, описанных в настоящем описании, используя методики, известные в данной области. Например, специалист сможет идентифицировать подходящие области белковой молекулы, структуру которых можно изменить, не разрушая, при этом, биологическую активность белка настоящего изобретения направленным воздействием на области, которые не считаются важными для биологической активности белка настоящего изобретения. Также, специалист сможет идентифицировать аминокислотные остатки и области, консервативные между гомологичными белками. Кроме того, специалист сможет ввести консервативные аминокислотные замены в области, которые могут быть важны для биологической активности или структуры белка настоящего изобретения без разрушения биологической активности и без отрицательного влияния на полипептидную структуру белка.
В частности, аминокислотная последовательность АСС настоящего изобретения содержит консервативный мотив биотин-содержащих ферментов, называемый «МКМ-мотив». Этот мотив необходим для АСС и является консервативным в аминокислотных последовательностях биотин-содержащих ферментов, и соответствует аминокислотным остаткам 736-738 на фиг.4. На фиг.4 приведено сравнение аминокислотных последовательностей АСС из M. alpina и ACC1 из дрожжей. На фиг.4 одной чертой подчеркнуты биотинкарбоксилазные (ВС) домены, двойной чертой подчеркнуты домены белка-носителя биотинкарбоксила (ВССР), и прерывистой линией подчеркнуты карбоксил-трансферазные (СТ) домены. Остатки лизина (K, Lys), указанные стрелкой, представляют собой акцепторные остатки биотина, и области, соответствующие МКМ-мотиву, заключены в рамки. Соответственно, вариантом настоящего изобретения может быть любой вариант, при условии, что сохраняется указанный выше консервативный мотив, и не нарушается указанная выше активность настоящего изобретения.
Специалист в данной области сможет провести так называемые структурно-функциональные исследования для идентификации аминокислотных остатков в пептиде, аналогичном пептиду или белку настоящего изобретения, которые важны для биологической активности или структуры указанного белка, и провести сравнение аминокислотных остатков у двух пептидов для того, чтобы предсказать, какие остатки в белке, аналогичном белку настоящего изобретения, являются аминокислотными остатками, соответствующими аминокислотным остаткам, важным для биологической активности или структуры. Кроме того, специалист сможет выбрать варианты, которые сохраняют биологическую активность белка настоящего изобретения, выбирая химически аналогичные аминокислотные замены для таких предсказанных аминокислотных остатков. Специалист в данной области также сможет провести анализ трехмерной структуры и аминокислотной последовательности вариантов белка. С учетом аналитических результатов специалист сможет дополнительно предсказать выравнивание аминокислотных остатков в отношении трехмерной структуры белка. Исходя из аналитических результатов, описанных выше, специалист в данной области сможет также создать варианты, не содержащие замен аминокислотных остатков, по предсказанию расположенных на поверхности белка, поскольку такие остатки могут быть вовлечены в важное взаимодействие с другими молекулами. Более того, специалист в данной области сможет создать варианты, содержащие единственную аминокислотную замену среди аминокислотных остатков, составляющих белок настоящего изобретения. Можно провести скрининг вариантов с помощью известных методов анализа для сбора информации об индивидуальных вариантах. В результате, специалист сможет оценить важность индивидуальных аминокислотных остатков, составляющих белок настоящего изобретения, сравнивая варианты, содержащие замену отдельного аминокислотного остатка, для оценки того, имеют ли они пониженную биологическую активность по сравнению с биологической активностью белка настоящего изобретения, или они не имеют такой биологической активности, или они имеют неподходящую активность, ингибируя биологическую активность белка настоящего изобретения. Более того, исходя из информации, собранной из таких рутинных экспериментов, специалист в данной области сможет легко проанализировать нежелательные аминокислотные замены для вариантов белка настоящего изобретения, либо для индивидуальных замен, либо в комбинации с другими мутациями.
Как описано выше, белки, состоящие из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, могут быть получены с помощью таких методик, как сайт-направленный мутагенез, описанный в «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)); «Current Protocols in Molecular Biology» (John Wiley & Sons (1987-1997); Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92; Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6, и т.д. Получение такие вариантов, содержащих аминокислотные делеции, замены или добавления и т.п., может быть осуществлено с помощью известных методик, таких как, например, способ Кункеля или способ дуплексов с разрывом, используя набор для введения мутаций на основе сайт-направленного мутагенеза, такой как, например, QuikChange™ Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor™ Site-Directed Mutagenesis System (Invitrogen) или TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc.; Takara Bio Inc.).
В дополнение к сайт-направленному мутагенезу, приведенному выше, методики введения делеции, замены или добаления одной или нескольких аминокислот в аминокислотные последовательности белков с сохранением их активности могут включать способ обработки гена мутагеном, и способ, включающий селективное расщепление гена для удаления, замены или добавления отдельного нуклеотида с последующим лигированием.
Нуклеотидная последовательность, которую содержит нуклеиновая кислота настоящего изобретения, предпочтительно является нуклеотидной последовательностью, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий АСС-активностью.
Нуклеотидная последовательность, из которой состоит нуклеиновая кислота настоящего изобретения, также содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения. Не существует ограничений по числу или сайтам изменений аминокислот, или модификациям аминокислот в белке настоящего изобретения, при условии сохранения указанной выше активности настоящего изобретения. Способ оценки указанной выше активности настоящего изобретения описаны выше.
(b) Нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения. SEQ ID NO:1 и ACC-активность описаны выше.
Приведенную выше нуклеотидную последовательность можно получить из кДНК-библиотеки, геномной библиотеки и т.п. с помощью известной методики гибридизации, такой как гибридизация колоний, гибридизация бляшек (фаговых) или Саузерн-блоттинг, с использованием зонда, полученной на основе соответствующего фрагмента способом, известным опытным специалистам в данной области.
Подробное описание методов гибридизации можно найти в «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001); в частности, в разделах 6-7); «Current Protocols in Molecular Biology» (John Wiley & Sons (1987-1997); в частности, в разделах 6.3-6.4); «DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.» (Oxford University (1995); в частности, в разделе 2.10, посвященном условиям проведения гибридизации) и т.д.
Жесткость условий гибридизации в основном определяются условиями гибридизации, более предпочтительно, условиями проведения гибридизации и отмывки. Используемый в настоящем описании термин «жесткие условия» включает средние или очень жесткие условия гибридизации.
В частности, средние условия гибридизации включают, например, проведение гибридизации в условиях 1×SSC-6×SSC при 42°C-55°C, более предпочтительно, в условиях 1×SSC-3×SSC при 45°C-50°C, наиболее предпочтительно, в условиях 2×SSC при 50°C. Если гибридизационный раствор содержит, например, около 50% формамида, то используют температуру на 5-15°C ниже указанных температур. Условия проведения отмывки включают отмывку в условиях 0,5×SSC-6×SSC при 40°C-60°C. При проведении гибридизации и отмывки обычно можно добавить 0,05%-0,2%, предпочтительно, около 0,1% ДСН.
Очень жесткие условия гибридизации включают гибридизацию и/или отмывку при более высоких температурах и/или более низких концентрациях соли, чем при средних условиях гибридизации. Например, условия гибридизации включают гибридизацию в условиях 0,1×SSC-2×SSC при 55°C-65°C, более предпочтительно, в условиях 0,1×SSC-1×SSC при 60°C-65°C, наиболее предпочтительно, в условиях 0,2×SSC при 63°C. Условия отмывки включают отмывку в условиях 0,2×SSC при 50°C-68°C, более предпочтительно, в условиях 0,2×SSC при 60°C-65°C.
Например, условия гибридизации, используемые в настоящем изобретении, включают, но не ограничены ими, предварительную гибридизацию в условиях 5×SSC, 1% SDS, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5) и 50% формамида при 42°C с последующей гибридизацией с зондом в течение ночи при 42°C, и последующей трехкратной отмывкой по 20 минут в условиях 0,2×SSC, 0,1% SDS при 65°C.
Также можно использовать коммерчески доступные наборы для гибридизации, в которых не используется радиоактивный зонд. Более конкретно, гибридизацию можно проводить с использованием набора для детекции нуклеиновой кислоты DIG (Roche Diagnostics) или системы для направленного мечения и детекции ECL (Amersham) и т.п.
Нуклеиновые кислоты, входящие в объем настоящего изобретения, предпочтительно, включают нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1, и содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок с АСС-активностью.
(c) Нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Нуклеотидная последовательность, которую содержат нуклеиновые кислоты настоящего изобретения, имеет по меньшей мере 80% идентичность с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1, и кодирует белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, имеющую по меньшей мере 80% идентичность, более предпочтительно, 85% идентичность, еще более предпочтительно, 90% (например, 92% или большую, еще более предпочтительно, 95% или большую, даже 97%, 98% или 99%) идентичность с нуклеотидной последовательностью, приведенной в SEQ ID NO:1, и кодирующую белок с указанной выше активностью настоящего изобретения.
Процент идентичности между двумя последовательностями нуклеиновых кислот можно определить визуально и математически, или, предпочтительно, сравнивая информацию о последовательностях двух нуклеиновых кислот с использованием компьютерной программы. Компьютерные программы для сравнения последовательностей включают, например, программу BLASTN (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10), версия 2.2.7 которой доступна на веб-сайте Национальной медицинской библиотеки США: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html, или алгоритм WU-BLAST 2.0 и т.д. Стандартные параметры по умолчанию для WU-BLAST 2.0 доступны на интернет-сайте: http://blast.wustl.edu/.
(d) Нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения. Белок, кодируемый нуклеиновой кислотой настоящего изобретения, может быть АСС или белком, имеющим идентичность с аминокислотной последовательностью АСС, при условии, что он функционально эквивалентен белку, обладающему указанной выше активностью настоящего изобретения.
Более конкретно, аминокислотная последовательность имеет 80% идентичность или большую, предпочтительно, 85% или большую, более предпочтительно, 90% или большую, еще более предпочтительно, 95% или большую, даже более предпочтительно, 97% (например, 98%, даже 99%) или большую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2 или аналогичной последовательностью.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения предпочтительно содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 95% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения. Более предпочтительно, нуклеиновая кислота содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 98% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Процент идентичности между двумя аминокислотными последовательностями можно определить визуально и математически. Или альтернативно, процент идентичности можно определить с использованием компьютерной программы. Такие компьютерные программы включают, например, BLAST, FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)) и ClustalW, и т.д. В частности, различные условия (параметры) для определения идентичности с помощью программы BLAST описаны в статье Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997) и находятся в общем доступе на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI) или на сайте базы данных ДНК Японии (DDBJ) (BLAST Manual, Altschul et al., NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894; Altschul et al.). Процент идентичности можно также определить с использованием программ для обработки генетической информации, таких как GENETYX Ver.7 (Genetyx), DNASIS Pro (Hitachisoft), Vector NTI (Infomax) и т.п.
Некоторые схемы для выравнивания аминокислотных последовательностей могут определять наличие совпадений даже на определенной короткой области в последовательностях, и, таким образом, можно детектировать области с очень высокой идентичностью по последовательности в такой короткой выровненной области, даже если между используемыми полноразмерными последовательностями не наблюдается значительного сходства. Кроме того, в алгоритме BLAST можно использовать матрицу стоимости аминокислотных замен BLOSUM62 и необязательные параметры: (А) включение фильтра для демаскирования сегментов с низкой композиционной сложностью (определяемых с помощью программы SEG авторов Wootton and Federhen (Computers and Chemistry, 1993); см. также Wootton and Federhen, 1996, «Analysis of compositionally biased regions in sequence databases», Methods Enzymol., 266: 554-71) или сегментов, состоящих из внутренних повторов с короткой периодичностью (определяемых с помощью программы XNU авторов Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)); и (B) порог статистической значимости для выражения совпадений с последовательностями базы данных или Е-оценка (ожидаемая вероятность совпадений, находимых случайно, по стохастической модели Karlin and Altschul, 1990; если статистическая значимость, приписываемая совпадению выше порога Е-оценки, то совпадение не засчитывается).
(e) Нуклеиновая кислота, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и условия гибридизации описаны выше. Нуклеиновая кислота настоящего изобретения включает нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Нуклеиновая кислота настоящего изобретения также включает нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность с делецией, заменой или добавлением одного или нескольких нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения. Более конкретно, также можно использовать нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидные последовательности, выбранные из:
(i) нуклеотидной последовательности с делецией одного или более (предпочтительно, одного или нескольких (например, 1-1500, 1-1000, 1-500, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1;
(ii) нуклеотидной последовательности с заменой другими нуклеотидами одного или более (предпочтительно, одного или нескольких (например, 1-1500, 1-1000, 1-500, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1;
(iii) нуклеотидной последовательности с добавлением одного или более (предпочтительно, одного или нескольких (например, 1-1500, 1-1000, 1-500, 1-300, 1-250, 1-200, 1-150, 1-100, 1-50, 1-30, 1-25, 1-20, 1-15, более предпочтительно, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 или 1)) нуклеотидов в нуклеотидной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:1; или
(iv) нуклеотидной последовательности с любой комбинацией (i)-(iii) выше;
и кодирующие белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
Предпочтительные варианты нуклеиновых кислот настоящего изобретения также включают нуклеиновую кислоту по любому из (а)-(c) ниже:
(а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, или ее фрагмент;
(b) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, или ее фрагмент;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4, или ее фрагмент.
(а) Нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:1, или ее фрагмент; (b) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислотную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:2, или ее фрагмент; и (c) нуклеиновая кислота, которая содержит нуклеотидную последовательность, приведенную в SEQ ID NO:4, или ее фрагмент, описаны выше. Фрагменты приведенных выше последовательностей представляют собой области, содержащиеся в приведенных выше нуклеотидных последовательностях, включая ORF, CDS, биологически активные области, области, используемые в качестве описанных ниже праймеров, и области, способные служить в качестве зондов, и могут быть природными или полученными искусственно.
Нуклеиновые кислоты настоящего изобретения также включают:
(1) (а) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2;
(b) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 80% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1, и кодирующую белок;
(d) нуклеиновую кислоту, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2;
(e) нуклеиновую кислоту, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2; и
(2) нуклеиновую кислоту по пункту (1), которой является одна из (а)-(e):
(а) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2;
(b) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, имеющую 90% или большую идентичность с нуклеотидной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:1;
(d) нуклеиновой кислоты, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 90% или больше с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2;
(e) нуклеиновой кислоты, которая гибридизуется в условиях 2×SSC при 50°C с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2.
Белки ацетил-CoA-карбоксилазы настоящего изобретения
Белки настоящего изобретения включают белок, состоящий из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, и белки, функционально эквивалентные этому белку, и могут быть природными или полученными искусственно. Белок, состоящий из приведенной в SEQ ID NO:2 аминокислотной последовательности, описан выше. «Функционально эквивалентные белки» относятся к белкам, обладающим «указанной выше активностью настоящего изобретения», определение которой дано выше в разделе «Нуклеиновые кислоты, кодирующие ацетил-CoA-карбоксилазу настоящего изобретения».
В настоящем изобретении белки, функционально эквивалентные белку, состоящему из аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, включают белок описанный в (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения; или
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, идентичной на 80% или более аминокислотной последовательности, состоящей из SEQ ID NO:2, и обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения.
В настоящем описании аминокислотная последовательность с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2 или аминокислотная последовательность, идентичная на 80% или более аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2, описаны в разделе «Нуклеиновые кислоты, кодирующие ацетил-CoA-карбоксилазу настоящего изобретения». Термин «белок, обладающий указанной выше активностью настоящего изобретения», также включает вариант белка, кодируемый нуклеиновой кислотой, содержащей нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:1, или вариант белка, содержащий различные типы модификаций, такие как замена, делеция или добавление одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности, приведенной в SEQ ID NO:2, или модифицированный белок, имеющий модифицированную боковую цепь аминокислоты, или белок, слитый с другим белком и обладающий АСС-активностью и/или активностью, компенсирующей недостаток АСС в дрожжах, и/или активностью, регулирующей соотношение состава жирных кислот настоящего изобретения.
Белки настоящего изобретения могут быть получены искусственно с помощью методик химического синтеза, таких как Fmoc-метод (флуоренилметилоксикарбонильный метод) и tBoc-метод (трет-бутилоксикарбонильный метод). Их также можно синтезировать химически с использованием пептидного синтезатора, поставляемого компаниями Advanced ChemTech, Perkin Elmer, Pharmacia, Protein Technology Instrument, Synthecell-Vega, PerSeptive, Shimadzu Corporation и т.п.
Белки настоящего изобретения также включают:
(1) (а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением одной или нескольких аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 80% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью, состоящей из SEQ ID NO:2;
(2) белок по (а) или (b) ниже:
(а) белок, состоящий из аминокислотной последовательности с делецией, заменой или добавлением 1-200 аминокислот в аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) белок, состоящий из аминокислотной последовательности, имеющей 90% идентичность или большую с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO:2.
Клонирование нуклеиновых кислот настоящего изобретения
Нуклеиновые кислоты для АСС настоящего изобретения можно клонировать, например, скринируя кДНК-библиотеку с использованием соответствующего зонда. Их также можно клонировать ПЦР-амплификацией с соответствующими праймерами с последующим лигированием в подходящий вектор. Клон можно дополнительно субклонировать в другой вектор.
Например, можно использовать коммерчески доступные плазмидные векторы, такие как pBlue-Script™ SK (+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp (TM: Gibco-BRL), p-Direct (Clontech) и pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Для амплификации с помощью ПЦР в качестве праймеров можно использовать любые области нуклеотидных последовательностей, приведенных в SEQ ID NO:1, и т.п. выше, например, такие как:
прямой праймер: 5'-GCCAACTGGCGTGGATTCTC-3' (SEQ ID NO:6) и
обратный праймер: 5'-GTCCTCGTTGATAGTAGGGTC-3' (SEQ ID NO:7).
ПЦР проводят, добавляя указанные выше праймеры и термостабильную ДНК-полимеразу (или аналогичный фермент) к кДНК, полученной из клеток M. alpina. Хотя специалисты в данной области смогут легко осуществить данную методику, следуя, например, «Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.» (Cold Spring Harbor Press (2001)), условия проведения ПЦР в настоящем изобретении могут включать следующее:
температуру денатурации: 90-95°C;
температуру отжига: 40-60°C;
температуру элонгации: 60-75°C;
число циклов: 10 или больше.
Полученный продукт ПЦР можно очистить с использованием известных способов. Например, в таких способах используются наборы, такие как GENECLEAN (Funakoshi Co., Ltd.), QIAquick PCR для очистки (QIAGEN), ExoSAP-IT (GE Healthcare Bio-Sciences); или DEAE-целлюлозные фильтры, или диализные мешки и т.д. При использовании агарозного геля ПЦР продукты разделяют электрофорезом в агарозном геле, и фрагменты нуклеиновых кислот вырезают из агарозного геля с последующей очисткой с помощью GENECLEAN (Funakoshi Co., Ltd.), экстракционных наборов QIAquick Gel (QIAGEN), способом «заморозки-оттаивания» и т.д.
Нуклеотидные последовательности клонированных нуклеиновых кислот можно определить с использованием нуклеотидного секвенатора.
Конструирование векторов для экспрессии АСС настоящего изобретения и получение трансформированных клеток
Настоящее изобретение также относится к рекомбинантным векторам, содержащим нуклеиновую кислоту, кодирующую АСС настоящего изобретения. Настоящее изобретение дополнительно относится к клеткам, трансформированным рекомбинантными векторами.
Такие рекомбинантные векторы и трансформированные клетки могут быть получены следующим образом. А именно, плазмиду, несущую нуклеиновую кислоту, кодирующую АСС настоящего изобретения, расщепляют рестрикционными эндонуклеазами. Используемые рестрикционные эндонуклеазы, например, включают, но не ограничиваются ими, EcoRI, KpnI, BamHI и SalI и т.д. Концы плазмиды после рестрикции можно «затупить» обработкой ДНК-полимеразой фага Т4. Расщепленный нуклеотидный фрагмент очищают электрофорезом в агарозном геле. Этот фрагмент можно встроить в экспрессионный вектор известным способом, таким образом, получая вектор для экспрессии АСС. Этот экспрессионный вектор трансформируют в хозяина для создания трансформированной клетки, которую используют для экспрессии целевого белка.
В настоящем изобретении экспрессионный вектор и хозяин конкретно не ограничены, при условии возможности экспрессии целевого белка; и хозяева, например, включают грибы, бактерии, растения и животных, или их клетки. Грибы включают филаментные грибы, такие как продуцирующие липиды грибы M. alpina, дрожжи, такие как Saccharomyces cerevisiae и т.д. Бактерии включают Escherichia coli, Bacillus subtilis и т.д. Кроме того, растения включают продуцирующие масло растения, такие как рапс, соя, хлопчатник, сафлор и лен.
Продуцирующие липиды грибы, которые можно использовать, включают, например, штаммы, описанные в MYCOTAXON, Vol. XLIV, NO. 2, pp. 257-265 (1992), в частности, микроорганизмы, относящиеся к роду Mortierella, включая микроорганизмы, относящиеся к подроду Mortierella, такие как Mortierella elongata (M. elongata) IFO8570, Mortierella exigua (M. exigua) IFO8571, Mortierella hygrophila (M. hygrophila) IFO5941, Mortierella alpina IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS 219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68, или микроорганизмы, относящиеся к подроду Micromucor, такие как Mortierella isabellina (M. isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, Mortierella nana (M. nana) IFO8190, Mortierella ramanniana (M. ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, Mortierella vinacea (M. vinacea) CBS236.82. Из них предпочтительным видом является M. alpina.
При использовании грибов в качестве хозяина предпочтительно, чтобы структура вектора позволяла самостоятельную репликацию нуклеиновой кислоты настоящего изобретения в хозяине или ее встраивание в хромосому гриба. Также предпочтительно, чтобы вектор содержал промотор и терминатор. При использовании M. alpina в качестве хозяина экспрессионным вектором может быть, например, pD4, pDuraSC, pDura5 и т.п. Можно использовать любой промотор, который экспрессируется в хозяине, включая промоторы генов M. alpina, такие как промотор гена гистона Н4.1, промотор гена GAPDH (глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы) и промотор гена TEF (фактора элонгации трансляции).
Методики трансформации рекомбинантным вектором филаментных грибов, таких как M. alpina, включают электропорацию, использование сферопластов, доставку генетического материала с помощью частиц и прямые микроинъекции ДНК в ядро. При использовании ауксотрофного штамма-хозяина трансформированные штаммы можно получить путем селекции штаммов, растущих на селективной среде, в которой отсутствуют необходимые для штамма питательные вещества. При использовании для трансформации маркерного гена лекарственной резистентности с помощью культивирования в селективной среде, содержащей лекарственное соединение, можно получить клеточные колонии, демонстрирующие устойчивость к лекарственным соединениям.
При использовании в качестве хозяина дрожжей экспрессионным вектором может быть, например, pYE22m или аналогичный вектор. Также можно использовать коммерчески доступные векторы для экспрессии дрожжей, такие как pYES (Invitrogen) и pESC (STRATAGENE). Дрожжи, подходящие для использования в качестве хозяев в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, штамм S. cerevisiae EH13-15 (trp1, MATα) и т.д. Используемые промоторы включают, например, промоторы генов дрожжей или родственных организмов, такие как промотор GAPDH, промотор GAL1 и промотор GAL10.
Методики трансформации рекомбинантного вектора в дрожжи включают, например, литий-ацетатный способ, электропорацию, использование сферопластов, декстран-опосредованную трансфекцию, осаждение фосфатом кальция, полибрин-опосредованную трансфекцию, слияние протопластов, заключение (одного или нескольких) полинуклеотидов в липосомы и прямую микроинъекцию ДНК в ядра, и т.д.
При использовании в качестве хозяев бактерий, таких как E. coli, экспрессионным вектором может быть, например, pGEX, pUC18 или аналогичный вектор, доступный от компании Pharmacia. Промоторы, которые можно использовать, включают промоторы генов E. coli, фагов и т.п., такие как, например, trp-промотор, lac-промотор, PL-промотор и PR-промотор. Методики трансформации рекомбинантного вектора в бактерии включают, например, электропорацию и кальций-хлоридный способ.
Способы получения композиций жирных кислот настоящего изобретения
Настоящее изобретение относится к способам получения композиции жирных кислот из трансформированной клетки, описанной выше. А именно, к способам получения композиции жирных кислот из продукта культивирования, полученного культивированием указанной выше трансформированной клетки. Более конкретно, ее можно получить по методике, описанной ниже. Однако способы настоящего изобретения не ограничены нижеследующими методиками, и их также можно осуществлять с использованием других стандартных общеизвестных методик.
Для культивирования организма, экспрессирующего АСС, можно использовать любую культуральную среду, при условии, что она имеет соответствующий рН и осмотическое давление, а также содержит питательные вещества, необходимые для роста каждого хозяина, микроэлементы и биологические материалы, такие как сыворотка или антибиотики. Например, среды, которые можно использовать для дрожжевых клеток, трансформированных для экспрессии АСС, включают, но не ограничиваются ими, среду SC-Trp, среду YPD, среду YPD5 и т.п. В качестве композиции конкретной среды приведен состав среды SC-Trp, которая содержит в расчете на объем 1 литр: 6,7 г дрожжевой азотной основы без аминокислот (DIFCO), 20 г глюкозы и 1,3 г сухого порошка аминокислот (смеси 1,25 г сульфата аденина, 0,6 г аргинина, 3 г аспарагиновой кислоты, 3 г глутаминовой кислоты, 0,6 г гистидина, 1,8 г лейцина, 0,9 г лизина, 0,6 г метионина, 1,5 г фенилаланина, 11,25 г серина, 0,9 г тирозина, 4,5 г валина, 6 г треонина и 0,6 г урацила).
Можно использовать любые культуральные условия, подходящие для роста хозяина и поддерживающие стабильность получаемого фермента, и, в частности, можно подбирать различные условия, включая анаэробность, время инкубации, температуру, влажность, статичную или качаемую культуру, и т.д. Культивирование можно проводить в одинаковых условиях (одностадийная культура) или можно проводить так называемое двухстадийное или трехстадийное культивирование с использованием двух или нескольких различных типов культуральных условий, но в случае крупномасштабных культур предпочтительно использовать двухстадийную культуру вследствие ее высокой эффективности.
В качестве конкретного способа получения композиции жирных кислот настоящего изобретения ниже приведено и проиллюстрировано использование дрожжей в качестве хозяина в двухстадийной культуре. А именно, в качестве предварительной культуры колонии, полученные, как описано выше, инокулируют в указанную выше среду SC-Trp или аналогичную среду, и предварительно культивируют в течение 2 дней при встряхивании при 30°C. Затем, в качестве основной культуры 500 мкл предварительной культуры добавляют в 10 мл среды YPD5 (2%-й дрожжевой экстракт, 1%-й полипептон, 5%-я глюкоза) и культивируют при встряхивании при 30°C в течение 2 дней.
Композиция жирных кислот настоящего изобретения
Настоящее изобретение также относится к композиции жирных кислот, которая представляет собой совокупность одной или нескольких жирных кислот в клетке, экспрессирующей АСС настоящего изобретения. Предпочтительно, изобретение относится к композиции жирных кислот, полученной культивированием трансформированной клетки, экспрессирующей АСС настоящего изобретения. Жирными кислотами могут быть свободные жирные кислоты или триглицериды, фосфолипиды и т.д.
Жирными кислотами, содержащимися в композиции жирных кислот настоящего изобретения, являются линейные или разветвленные монокарбоновые кислоты длинноцепочечных углеводов, включая, например, но, не ограничиваясь ими, миристиновую кислоту (тетрадекановую кислоту) (14:0), миристолеиновую кислоту (тетрадеценовую кислоту) (14:1), пальмитиновую кислоту (гексадекановую кислоту) (16:0), пальмитолеиновую кислоту (9-гексадеценовую кислоту) (16:1), стеариновую кислоту (октадекановую кислоту) (18:0), олеиновую кислоту (цис-9-октадеценовую кислоту) (18:1 (9)), вакценовую кислоту (11-октадеценовую кислоту (18:1 (11)), линолевую кислоту (цис,цис-9,12-октадекадиеновую кислоту) (18:2 (9,12)), α-линоленовую кислоту (9,12,15-октадекатриеновую кислоту) (18:3 (9,12,15)), γ-линоленовую кислоту (6,9,12-октадекатриеновую кислоту) (18:3 (6,9,12)), стеаридоновую кислоту (6,9,12,15-октадекатетраеновую кислоту) (18:4 (6,9,12,15)), арахиновую кислоту (эйкозановую кислоту) (20:0), (8,11-эйкозадиеновую кислоту) (20:2 (8,11)), кислоту Мида (5,8,11-эйкозатриеновую кислоту) (20:3 (5,8,11)), дигомо-γ-линоленовую кислоту (8,11,14-эйкозатриеновую кислоту) (20:3 (8,11,14)), арахидоновую кислоту (5,8,11,14-эйкозатетраеновую кислоту) (20:4 (5,8,11,14)), эйкозатетраеновую кислоту (8,11,14,17-эйкозатетраеновую кислоту) (20:4 (8,11,14,17)), эйкозапентаеновую кислоту (5,8,11,14,17-эйкозапентаеновую кислоту) (20:5 (5,8,11,14,17)), бегеновую кислоту (докозановую кислоту) (22:0), (7,10,13,16-докозатетраеновую кислоту) (22:4 (7,10,13,16)), (7,10,13,16,19-докозапентаеновую кислоту) (22:5 (7,10,13,16,19)), (4,7,10,13,16-докозапентаеновую кислоту) (22:5 (4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-докозагексаеновую кислоту) (22:6 (4,7,10,13,16,19)), лигноцериновую кислоту (тетрадокозановую кислоту) (24:0), нервоновую кислоту (цис-15-тетракозеновую кислоту) (24:1), церотиновую кислоту (гексадокозановую кислоту) (26:0) и т.д. Приведенные выше химические названия являются общепринятыми названиями, которые приведены в биохимической номенклатуре IUPAC, при этом после каждого названия приведено систематическое название, и в круглых скобках указано число атомов углерода, а также число и положения двойных связей.
Композиция жирных кислот настоящего изобретения может состоять из любого числа и любого типа жирных кислот, при условии, что они содержат комбинацию одной или нескольких из перечисленных выше жирных кислот.
Лиофилизированные клетки, полученные с помощью способов получения композиций жирных кислот настоящего изобретения, описанных выше, перемешивают со смесью хлороформа и метанола в соответствующем соотношении, и затем нагревают в течение соответствующего времени. Кроме того, клетки отделяют от растворителя несколько раз центрифугированием. Затем липиды сушат подходящим способом и затем растворяют в растворителе, таком как хлороформ. Аликвоту полученного образца собирают, и жирные кислоты в клетках преобразуют в метиловые эфиры с использованием метанольной HCl, затем экстрагируют гексаном и выпаривают гексан, и осадок анализирую газовой хроматографией. Например, при экспрессии АСС настоящего изобретения в дрожжах можно получить композицию жирных кислот, которая отличается (в отношении соотношения состава жирных кислот) более высоким содержанием пальмитолеиновой кислоты и/или докозановой кислоты или более низким содержанием пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и/или гексадокозановой кислоты относительно их содержания в культурах хозяев, которые не были трансформированы рекомбинантным вектором настоящего изобретения.
АСС настоящего изобретения иногда приводит к соотношению состава жирных кислот, которое отличается от соотношений составов жирных кислот, полученных с известными АСС, демонстрируя, что влияние АСС настоящего изобретения на липидный метаболизм в клетках-хозяевах отличается от влияния известных АСС.
Продукты питания или другие продукты, содержащие композиции жирных кислот настоящего изобретения
Настоящее изобретение также относится к продуктам питания, содержащим указанные выше композиции жирных кислот. Композиции жирных кислот настоящего изобретения можно стандартно использовать для получения продуктов питания и промышленных сырьевых материалов, содержащих жиры и масла (сырьевые материалы для косметической промышленности, фармацевтической промышленности (например, местных лекарственных средств для кожи), мыл и т.д.) или для других целей. Косметические средства (композиции) или фармацевтические средства (композиции) могут представлять собой любую форму, включая, но, не ограничиваясь ими, раствор, пасту, гель, твердое вещество, порошок и т.д. Продукты питания могут также представлять собой фармацевтический состав, такой как капсула, или процессированное питание, такое как натуральная жидкая диета, безшлаковая диета, элементная диета, питательные напитки или формула для питания через зонд, содержащие композицию жирных кислот настоящего изобретения в комбинации с белками, сахарами, жирами, микроэлементами, витаминами, эмульгаторами, вкусоароматическими добавками и т.д.
Другие примеры продуктов питания настоящего изобретения включают, но не ограничиваются ими, пищевые добавки, продукты здорового питания, продукты функционального питания, продукты питания для детей, модифицированное молоко для детей, модифицированное молоко для недоношенных детей, продукты питания для пожилых и т.д. Используемый в настоящем описании термин «продукт питания» собирательно относится к пищевым продуктам в твердой, текучей, жидкой форме или к пищевым продуктам в виде смеси указанных форм.
Пищевые добавки относятся к продуктам питания, усиленным определенными питательными ингредиентами. Продукты здорового питания относятся к продуктам питания, которые считаются «здоровыми» или полезными для здоровья, и включают пищевые добавки, натуральные продукты питания, диетические продукты питания и т.д. Продукты функционального питания относятся к продуктам питания для введения питательных ингредиентов, имеющих физиологические регуляторные функции, и их можно также называть продуктами для специального оздоровительного питания. Продукты питания для детей относятся к продуктам питания, предназначенным для детей примерно до 6-летного возраста. Продукты питания для пожилых относятся к продуктам питания, обработанным для более легкого пищеварения и всасывания по сравнению с необработанными продуктами питания. Модифицированное молоко для детей относится к модифицированному молоку, предназначенному для детей до одного года. Модифицированное молоко для недоношенных детей относится к модифицированному молоку, предназначенному для недоношенных детей примерно до 6-месячного возраста.
Эти продукты питания включают натуральные продукты, такие как мясо, рыбу, орехи (обработанные жирами и маслами); продукты питания, приготовленные на жирах и маслах, такие как китайские продукты питания, китайская лапша, супы; продукты, в которых жиры и масла используются для жарки, такие как темпура (жареные во фритюре рыба и овощи), жареные во фритюре продукты питания, панированные в сухарях, жареный соевый творог, китайский жареный рис, пончики, каринто (японское печенье из жареного теста); продукты на жировой и масляной основе или продукты питания, приготовляемые с жирами и маслами, такие как сливочное масло, маргарин, майонез, салатная заправка, шоколад, лапша быстрого приготовления, карамель, сухое печенье, печенье, торты, мороженное; и продукты питания, на которые распыляют, или которые покрывают жирами и маслами в конце приготовления, такие как рисовые крекеры, галеты, сладкий хлеб с бобовой пастой. Однако продукты питания настоящего изобретения не ограничены продуктами, содержащими жиры и масла, но также включают процессированные сельскохозяйственные продукты, такие как хлеб, макароны, готовый к употреблению рис, сладости (леденцы, жевательная резинка, жевательный мармелад, таблетки, японские сладости), соевый творог и процессированные продукты из них; ферментированные продукты питания, такие как саке (японское рисовое вино), медицинский ликер, мирин (сладкое рисовое вино), уксус, соевый соус и мисо (паста из соевых бобов); животные продукты питания, такие как йогурт, ветчина, бекон и сосиски; процессированные морепродукты, такие как камабоко (блюдо из сурими), агетен (жареное во фритюре сурими) и ханпен (воздушное сурими); и фруктовые напитки, безалкогольные напитки, спортивные напитки, алкогольные напитки, чай и т.п.
Способ оценки или отбора штаммов с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей АСС, или белка АСС настоящего изобретения
Настоящее изобретение также относится к способам оценки или отбора продуцирующих липиды штаммов с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей АСС, или белка АСС настоящего изобретения. Способы более подробно описаны ниже.
(1) Способы оценки
Одним из вариантов осуществления настоящего изобретения является способ оценки продуцирующего липиды штамма с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей АСС, или белка АСС настоящего изобретения. Способ оценки настоящего изобретения может включать оценку продуцирующего липиды тестируемого штамма на указанную выше активность настоящего изобретения с использованием праймера или зонда, подобранных на основе нуклеотидной последовательности настоящего изобретения. Общие методики для такого способа оценки известны и описаны, например, в WO01/040514 или JP HEI 8-205900 A. Краткое описание способа оценки приведено ниже.
Сначала получают геном тестируемого штамма. Можно использовать любой способ выделения, такой как способ Херефорда или калий-ацетатный способ (см., например, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)).
Праймер или зонд подбирают на основе нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, предпочтительно, SEQ ID NO:1. С помощью известных методик праймер или зонд можно подобрать из любой области нуклеотидной последовательности настоящего изобретения. Число нуклеотидов в полинуклеотиде, используемом в качестве праймера, обычно составляет 10 или больше, предпочтительно, от 15 до 25. Обычно число нуклеотидов, подходящих для расположенной между праймерами области, как правило, составляет от 300 до 2000 нуклеотидов.
Полученный выше праймер или зонд используют для оценки того, содержит ли геном указанного выше тестируемого штамма последовательность, специфичную для нуклеотидной последовательности настоящего изобретения. Последовательность, специфичную для нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, можно детектировать с помощью известных методик. Например, для амплификации нуклеиновой кислоты тестируемого штамма с помощью ПЦР или аналогичного метода в качестве одного праймера используют полинуклеотид, содержащий часть или всю последовательность, специфичную для нуклеотидной последовательности настоящего изобретения, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную приведенной выше нуклеотидной последовательности, и в качестве другого праймера используют полинуклеотид, содержащий часть или всю последовательность выше или ниже от этой последовательности, или полинуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, комплементарную приведенной выше нуклеотидной последовательности, определяя, таким образом, присутствие или отсутствие продукта амплификации, молекулярную массу продукта амплификации и т.д.
Условия проведения ПЦР, подходящие для способа настоящего изобретения, конкретно не ограничены, но включают, например:
температуру денатурации: 90-95°C;
температуру отжига: 40-60°C;
температуру элонгации: 60-75°C;
число циклов: 10 или больше.
Полученный в результате продукт реакции, то есть амплифицированный продукт, можно разделить электрофорезом в агарозном геле или аналогичным способом для определения молекулярной массы амплифицированного продукта. Таким образом, указанную выше активность настоящего изобретения тестируемого штамма можно предсказать или установить по соответствию молекулярной массы амплифицированного продута массе молекулы нуклеиновой кислоты, соответствующей области, специфичной для нуклеотидной последовательности настоящего изобретения. Более того, указанную выше активность настоящего изобретения можно более точно предсказать или оценить с помощью анализа нуклеотидной последовательности амплифицированного продукта способом, описанным выше, или аналогичным способом. Способ оценки указанной выше активности настоящего изобретения описан выше.
Альтернативно, способ оценки настоящего изобретения может включать культивирование тестируемого штамма и определение уровня экспрессии АСС, кодируемой нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, такой как SEQ ID NO:1, в результате чего тестируемый штамм оценивается на указанную выше активность настоящего изобретения. Уровень экспрессии АСС можно определить, культивируя тестируемый штамм в соответствующих условиях и количественно оценивая мРНК АСС или белок. Количественную оценку мРНК или белка можно провести с помощью известных методик. Количественную оценку мРНК можно провести, например, с помощью нозерн-гибридизации или количественной ОТ-ПЦР, в то время как количественную оценку белка можно выполнить, например, с помощью Вестерн-блоттинга (Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
(2) Способы отбора
Другим вариантом осуществления настоящего изобретения является способ отбора продуцирующего липиды штамма с использованием нуклеиновой кислоты, кодирующей АСС, или белка АСС настоящего изобретения. Способ отбора настоящего изобретения может включать культивирование тестируемых штаммов и определение уровня экспрессии АСС, кодируемой нуклеотидной последовательностью настоящего изобретения, такой как SEQ ID NO:1, для отбора штамма, имеющего желаемый уровень экспрессии, в результате чего можно отобрать штамм, обладающий желаемой активностью. Альтернативно, способ может включать предварительное определение типового штамма, отдельное культивирование типового штамма и тестируемых штаммов, определение указанного выше уровня экспрессии в каждом штамме и сравнение уровня экспрессии между типовым штаммом и каждым тестируемым штаммом, в результате чего можно отобрать желаемый штамм. Более конкретно, штамм с желаемой активностью можно отобрать, культивируя типовой штамм и тестируемые штаммы в соответствующих условиях, определяя уровень экспрессии в каждом штамме и отбирая тестируемый штамм, например, имеющий более высокий или более низкий уровень экспрессии относительно типового штамма. Желаемую активность можно оценить, определяя уровень экспрессии АСС, как описано выше.
Альтернативно, способ отбора настоящего изобретения может включать культивирование тестируемых штаммов и отбор штамма, имеющего более высокую или более низкую указанную выше активность настоящего изобретения, в результате чего можно отобрать штамм, обладающий желаемой активностью. Желаемую активность можно оценить, определяя уровень экспрессии АСС, как описано выше.
Примеры тестируемых штаммов или типовых штаммов, которые можно использовать, включают, например, но не ограничиваются ими, штамм, трансформированный указанным выше вектором настоящего изобретения, штамм с подавленной экспрессией указанной выше нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, штамм с введенными мутациями, штамм с природными мутациями и т.д. Следует отметить, что АСС-активность настоящего изобретения и/или активность, компенсирующую недостаток АСС в дрожжах настоящего изобретения, можно оценить, например, способом, описанным в разделе «Нуклеиновые кислоты, кодирующие ацетил-CoA-карбоксилазу настоящего изобретения». Методики введения мутаций включают, но не ограничиваются ими, физические способы, такие как УФ или радиоактивное излучение, и химические способы, такие как обработка химическими соединениями EMS (этилметансульфонат), N-метил-N-нитрозогуанидином или аналогичными соединениями (см., например, Yasuji Oshima ed., Biochemistry Experiments vol. 39, Experimental Protocols for Yeast Molecular Genetics, pp. 67-75, Japan Scientific Societies Press).
Штаммы, используемые в качестве типовых и тестируемых штаммов настоящего изобретения, включают, но не ограничиваются ими, продуцирующие липиды грибы или дрожжи, перечисленные выше. Более конкретно, типовые и тестируемые штаммы могут представлять собой комбинацию любых штаммов, принадлежащих к различным родам или видам, и одновременно можно использовать один или несколько тестируемых штаммов.
Настоящее изобретение дополнительно проиллюстрировано следующими примерами. Однако следует понимать, что настоящее изобретение не ограничено приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
[Пример 1]
(1) Конструирование кДНК-библиотеки и EST-анализ
Штамм M. alpina 1S-4 инокулировали в 100 мл среды (1,8% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта, рН 6,0) и инкубировали при встряхивании в течение 4 дней при 28°C. Клетки собирали для выделения тотальной РНК с использованием гидрохлорида гуанидина/CsCl. Поли(А)+мРНК выделяли из тотальной РНК с использованием набора для очистки мРНК Oligotex-dT30 <Super> mRNA. Ее использовали для конструирования кДНК-библиотеки, используя набор для клонирования ZAP-cDNA GigapackIII Gold (STRATAGENE). Проводили однократный анализ нуклеотидной последовательности с 5'-конца кДНК (примерно 2000 клонов).
(2) Поиск гомологов АСС
Отыскивали последовательности, полученные с помощью приведенного выше EST-анализа, по аминокислотным последовательностям, помещенным в базу данных GENEBANK, используя программу поиска гомологии BLASTX для выявления гомологов ацетил-CoA-карбоксилазы. В результате была найдена последовательность, имеющая наиболее высокий процент идентичности с гомологом ацетил-CoA-карбоксилазы из Schizosaccharomyces pombe (номер доступа P78820), а именно, последовательность, соответствующая нуклеотидам 5833-6026 в SEQ ID NO:1.
[Пример 2]
(1) Клонирование МаАСС
кДНК-библиотеку скринировали для поиска последовательности, соответствующей нуклеотидам 5833-6026 в SEQ ID NO:1, обнаруженной в примере 1,, поскольку эта последовательность, по-видимому, кодирует фрагмент гомолога ацетил-CoA-карбоксилазы из M. alpina (MaACC). Для получения зонда с помощью ПЦР сначала конструировали праймеры 931-F и 931-R.
931-F: 5'-GCCAACTGGCGTGGATTCTC-3' (SEQ ID NO:6)
931-R: 5'-GTCCTCGTTGATAGTAGGGTC-3' (SEQ ID NO:7)
ПЦР проводили, используя кДНК-библиотеку (2,6×106 БОЕ/мкл) в качестве матрицы с ExTaq (Takara Bio Inc.) и праймерами 931-F и 931-R. Условия проведения ПЦР включали 2 мин. при 94°C с последующими 30 циклами по 1 мин. при 94°C, 1 мин. при 55°C и 3 мин. при 72°C.
Амплифицированные фрагменты ТА-клонировали (клонированы в ТА-вектор) с использованием набора для клонирования TOPO-TA (INVITROGEN CORPORATION). Определяли нуклеотидные последовательности некоторых клонов, и клон, содержащий нуклеотиды 5835-6014 в SEQ ID NO:4, обозначали как pCR-MaACC-P1. Затем проводили ПЦР с использованием этой плазмиды в качестве матрицы вместе с указанными выше праймерами. В реакции использовали ExTaq (Takara Bio Inc.), но амплифицируемую ДНК метили диоксигенином (DIG), используя смесь для ПЦР-мечения (Roche Diagnostics), вместо включенной в набор для ПЦР смеси dNTP, таким образом, получая зонд для скрининга кДНК-библиотеки. Полученный зонд использовали для скрининга кДНК-библиотеки.
Условия проведения гибридизации были следующими.
Гибридизационный буфер: 5×SSC, 1% SDS, 50 мМ Tris-HCl (pH 7,5), 50% формамид;
Температура гибридизации: 42°C (в течение ночи);
Условия проведения отмывки: 3 раза по 20 минут в растворе 0,2×SSC, 0,1% SDS (65°C).
Детекцию осуществляли, используя набор для детекции нуклеиновой кислоты DIG (Roche Diagnostics). Плазмиды вырезали отщеплением in vivo из фаговых клонов, полученных в результате скрининга. Была определена нуклеотидная последовательность плазмиды pBMaACC-p38, содержащая фрагмент, соответствующий нуклеотидам 5833-6026 в SEQ ID NO:1, и имеющая максимально длинную вставку среди этих плазмид. Плазмида pBMaACC-P38 содержала нуклеотиды 1892-6865 в SEQ ID NO:4. Этот клон, по-видимому, не содержал всю последовательность МаАСС, принимая во внимание сравнение с известными гомологами ацетил-CoA-карбоксилазы, присутствие или отсутствие старт-кодона и т.д.
Для получения полноразмерной последовательности МаАСС проводили три раунда 5'-RACE с использованием набора 5'-Full RACE Core Set (Takara Bio Inc.), следуя протоколу изготовителя, указанному ниже. Тотальная РНК была такой же, как использовали для конструирования кДНК-библиотеки.
Для проведения 5'-RACE (первый раунд) конструировали следующие праймеры на основе нуклеотидной последовательности вставки из pBMaACC-P38:
праймер ACC-RT-1: pTGGTGCCGGGTTGCT (SEQ ID NO:8)
праймер ACC-S1-1: GCAAACTTGTTCGCTACCTTG (SEQ ID NO:9)
праймер ACC-A1-1: TCGTTCTCCTTCTCCAACAA (SEQ ID NO:10)
праймер ACC-S2-1: CAGGCCTATGCTGAGATTGAG (SEQ ID NO:11)
праймер ACC-A2-1: TGGACCTCTTCCAACGAGTAA (SEQ ID NO:12).
В 5'-RACE (первый раунд) фрагменты кДНК, амплифицированные с праймером ACC-S2-1 и праймером ACC-A2-1, клонировали в ТА-вектор, и клон с максимальной длиной вставки из полученных клонов, содержащий частичную последовательность MaACC, был обозначен как pCRMaACC-P2-5. Этот клон содержал нуклеотиды 1183-2011 в SEQ ID NO:4.
Для проведения дополнительной 5'-RACE (второй раунд) на основе этой последовательности конструировали следующие праймеры:
5'-RACE (второй раунд)
праймер ACC-RT-2: pCAGGGCGTTCAGCAGTG (SEQ ID NO:13)
праймер ACC-S1-2: CGAGTACTTGATCCGCCTTT (SEQ ID NO:14)
праймер ACC-A1-2: GGAAATCACCACGAATGGAG (SEQ ID NO:15)
праймер ACC-S2-2: GGAGTTCGAGGAAAACACCA (SEQ ID NO:16)
праймер ACC-A2-2: TGACCACGATCCTGTCCATA (SEQ ID NO:17).
В 5'-RACE (второй раунд) фрагменты кДНК, амплифицированные с праймером ACC-S2-2 и праймером ACC-A2-2, клонировали в ТА-вектор, и клон, содержащий частичную последовательность MaACC, с максимальной длиной вставки из полученных клонов обозначали как pCRMaACC-P7-15. Этот клон содержал нуклеотиды 738-1522 в SEQ ID NO:4.
Для проведения дополнительной 5'-RACE (третий раунд) на основе этой последовательности конструировали следующие праймеры:
5'-RACE (третий раунд)
праймер ACC-RT-3: pTCGGGCTTGGCAATG (SEQ ID NO:18)
праймер ACC-S1-3: ATCTGGAGGTCCAGCTTTTG (SEQ ID NO:19)
праймер ACC-A1-3: GCGTTACCAGCCAACTTCAT (SEQ ID NO:20)
праймер ACC-S2-3: GCGTCGCCATCAGAAGATTA (SEQ ID NO:21)
праймер ACC-A2-3: AGGCCTGAGCGAACTTTTCT (SEQ ID NO:22).
В 5'-RACE (третий раунд) фрагменты кДНК, амплифицированные с праймером ACC-S2-3 и праймером ACC-A2-3, клонировали в ТА-вектор, и клон, содержащий частичную последовательность MaACC, с максимальной длиной вставки из полученных клонов, обозначали как pCRMaACC-P9-2. Этот клон содержал нуклеотиды 1-792 в SEQ ID NO:4 и, по-видимому, содержал старт-кодон MaACC, исходя из сравнения с известными гомологами ацетил-CoA-карбоксилазы или аналогичными белками. Полученные таким образом последовательности лигировали, с получением последовательности SEQ ID NO:4, представляющей последовательность кДНК, содержащую полную кодирующую последовательность MaACC.
Затем содержащую SEQ ID NO:4 плазмиду конструировали, как описано ниже. Сначала лигировали фрагмент ДНК примерно 8 т.п.о., полученный расщеплением плазмиды pBMaACC-P38 рестрикционными эндонуклеазами NotI и BamHI, и фрагмент ДНК примерно 0,8 т.п.о., полученный расщеплением плазмиды pCRMaACC-P2-5 рестрикционными эндонуклеазами NotI (полилинкер вектора pCR2.1, расположенный в 5'-области от МаАСС) и BamHI, с производством плазмиды pBMaACC-P4. С другой стороны, синтезировали кДНК с помощью системы для ОТ-ПЦР SuperScript First-Strand (Invitrogen) с использованием такой же тотальной РНК, которую использовали для конструирования кДНК-библиотеки с праймерами со случайной последовательностью.
Ее использовали в качестве матрицы для проведения дополнительной ПЦР с использованием ExTaq (Takara Bio) с праймером ACC-NotI: GCGGCGGCCGCTCCCACTGACTCAAGCGG (SEQ ID NO:23) и праймером ACC-A1-2, и полученные ДНК-фрагменты клонировали в ТА-вектор. Фрагмент ДНК примерно 1,5 т.п.о., полученный расщеплением клона, содержащего корректный фрагмент нуклеотидов 1-1578 в SEQ ID NO:4, рестрикционными эндонуклеазами NotI и XbaI, лигировали с фрагментом ДНК примерно 8,4 т.п.о., полученным расщеплением плазмиды pBMaACC-P4 рестрикционными эндонуклеазами NotI и XbaI, с получением плазмиды pB-MaACC.
(2) Анализ последовательности
Последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из M. alpina (MaACC), полученную как описано выше, подвергали анализу ORF (открытой рамки считывания). В результате было предсказано, что кодирующая область АСС настоящего изобретения соответствует нуклеотидам 45-6734 в SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO:3), и область ORF соответствует нуклеотидам 45-6731 в SEQ ID NO:4 (SEQ ID NO:1). Последовательность кДНК (SEQ ID NO:4) ACC из M. alpina (также называемая в данном описании «МаАСС») и ее предполагаемая аминокислотная последовательность (SEQ ID NO:2) показаны на фиг.1.
Кроме того, SEQ ID NO:4 подвергали гомологическому анализу с использованием BLASTX по аминокислотным последовательностям, зарегистрированным в базе данных GenBank. В результате было показано, что МаАСС имеет гомологию с гомологами АСС из эукариотических микроорганизмов, в частности, среди известных аминокислотных последовательностей максимальную идентичность МаАСС имеет с предполагаемым белком RO3G_04977 из Rhizopus oryzae. Идентичность по нуклеотидной последовательности между CDS данного белка и кодирующей областью MaACC и идентичность его аминокислотной последовательности и предполагаемой аминокислотной последовательностью МаАСС, определенные с помощью clustalW, составляли 65,5% и 66,3%, соответственно. Процент идентичности с предполагаемыми аминокислотными последовательностями гомологов АСС из других грибов составлял: 58,8% с гомологом из Neurospora crassa (номер доступа EAA33781), 58,3% с гомологом из Aspergillus fumigatus (номер доступа EAL93163) и 55,1% с цитоплазматической ACC Acc1p и 44,7% с митохондриальной ACC Hfa1p из дрожжей S. cerevisiae.
С другой стороны, фрагмент гомолога АСС из штамма M. alpina CBS528.72 был уже зарегистрирован в базе данных Genbank (нуклеотидная последовательность: номер доступа AJ586915 (непатентный документ 6) (SEQ ID NO:24); аминокислотная последовательность: номер доступа CAE52914 (SEQ ID NO:25)). Полученную новую полноразмерную кДНК-последовательность из M. alpina 1S-4 и ее предполагаемую аминокислотную последовательность сравнивали с этими последовательностями. Сравнение нуклеотидных последовательностей показано на фиг.2, и сравнение аминокислотных последовательностей показано на фиг.3. CDS-область нуклеотидной последовательности с номером доступа AJ586915 соответствует нуклеотидам 342-1439 в SEQ ID NO:4 и показала 91,3% идентичность до тех пор, пока это касается указанной области. Аминокислотная последовательность с номером доступа CAE52914 соответствует аминокислотам 100-465 в SEQ ID NO:2 и показала 97,8% идентичность до тех пор, пока это касается указанной области.
[Пример 3]
Конструирование экспрессионного вектора
Вектор для экспрессии в дрожжах, pYE22m, расщепляли рестрикционной эндонуклеазой EcoRI и выступающие концы достраивали с образованием «тупых» концов, используя набор для затупления (Takara Bio). В этот фрагмент встраивали NotI-линкер (p-GCGGCCGC: SEQ ID NO:26) с конструированием вектора pYE22mN. Лигировали фрагмент, полученный расщеплением вектора pYE22mN рестрикционными эндонуклеазами NotI и SalI, и фрагмент примерно 6,9 т.п.о., полученный расщеплением плазмиды pB-MaACC рестрикционными эндонуклеазми NotI и XhoI, с использованием набора для высокого лигирования (TOYOBO), получая плазмиду pYE-MaACC. Затем расщепляли плазмиду pYE-MaACC рестрикционной эндонуклеазой HindIII, и выступающие концы достраивали с образованием «тупых» концов, используя набор для затупления (Takara Bio), и встраивали по сайту SmaI в плазмиду pUC-URA3 с получением плазмиды pUC-URA3-MaACC. Полученную плазмиду расщепляли рестрикционной эндонуклеазой HindIII и трансформировали в дрожжевой штамм Δura3, таким образом, чтобы экспрессионная кассета АСС из M. alpina была встроена ниже URA3 на дрожжевой хромосоме.
[Пример 4]
Получение штаммов дрожжей, трансформированных кассетой для экспрессии АСС из штамма M. alpina 1S-4, и анализ случайной выборки спор
Нокаутированный штамм дрожжей YSC1021-673427 (Δacc1:KanMX/ACC1, his3Δ1/his3Δ1, leu2Δ0/leu2Δ0, ura3Δ0/ura3Δ0, LYS2/lys2Δ0, MET15/met15Δ0, Open Biosystems), который является гетерозиготным диплоидным штаммом, у которого отсутствует ген цитоплазматической АСС, трансформировали с ДНК-фрагментом, полученным расщеплением рестрикционной эндонуклеазой HindIII плазмиды pUC-URA3-MaACC, сконструированной в примере 3. Трансформированные штаммы отбирали, исходя из роста на чашках с агаром SD-Ura. Штаммы, случайно отобранные таким образом, обозначали как штамм MaACC-HD-#1 и штамм MaACC-HD-#2 (Δacc1: KanMX/ACC1, his3Δ1/his3Δ1, leu2Δ0/leu2Δ0, MaACC-URA3/ura3Δ0, LYS2/lys2Δ0, MET15/met15Δ0).
Для индукции споруляции штаммы MaACC-HD-#1 и MaACC-HD-#2 высевали на чашки с агаром YPD и инкубировали при 30°C в течение 2 дней. Растущие клетки высевали на чашки с агаром для споруляции (1% ацетата калия, 0,1% дрожжевого экстракта, 0,05% глюкозы, 2% агара) и инкубировали при 25°C в течение 4 дней. Одну полную микробиологическую петлю инокулировали в 1 мл раствора зимолазы (1,2 М сорбит, 50 мМ калий-фосфатного буфера (рН 7,5), 14 мМ 2-меркаптоэтанола, 0,2 мг/мл зимолазы 100Т (Seikagaku Corporation)) и инкубировали при встряхивании при 30°C в течение 24 часов. Затем клетки собирали центрифугированием и удаляли супернатант. Клетки энергично перемешивали с 1 мл стерильной воды, затем собирали центрифугированием и удаляли супернатант. Эту операцию дополнительно повторяли дважды.
Полученные клетки соответственно разводили стерильной водой и высевали на чашки с агаром YPD для образования одиночных колоний. Для ста случайно выбранных штаммов из полученных колоний (из всего 200 штаммов) делали реплики на чашках с агаром YPD, YPD+G418 (200 мг/л), SD-Ura, SD-Met и SD-Lys и оценивали рост на каждой чашке. Результаты показаны в таблице 1.
Таблица 1
Рост трансформированных штаммов гетерозиготного диплоидного штамма, у которого отсутствует ген дрожжевой цитоплазматической АСС
Ген АСС1 из S. cerevisiae и MaACC могут быть расщеплены на четыре генотипа:
(1) Δacc1: KanMX, MaACC-URA3;
(2) ACC1, ura3Δ0;
(3) ACC1, MaACC-URA3; и
(4) Δacc1: KanMX, ura3Δ0.
Фенотипы штаммов, имеющих такие генотипы, соответствуют номерам (I-IV), показанным в первой колонке в таблице 1, но некоторые штаммы, растущие на всех тестируемых чашках с агаром, являются диплоидными.
Из восьми штаммов выделяли геномную ДНК, используя набор Dr. GenTLE (для дрожжей) (Takara Bio), и подвергали ПЦР с использованием ExTaq (Takara Bio) с комбинациями праймеров ScACC1-19/ScACC1+658, праймеров ScACC1-19/KanB и праймеров ACC1-scf5/ACC1-scr5. В результате, в трех из восьми штаммов наблюдалась амплификация фрагмента ДНК соответствующего размера с комбинацией праймеров, указывая на то, что они являются диплоидными. Последовательности приведенных выше праймеров приведены ниже:
ScACC1-19: CCCGAAACAGCGCAGAAAATTAG (SEQ ID NO:27)
ScACC1+658: CCAGACCGGTTTTCTCGTCCACGTG (SEQ ID NO:28)
KanB: CTGCAGCGAGGAGCCGTAAT (SEQ ID NO:29)
ACC1-scf5: CGCATTGGTCTTGCTAGTGA (SEQ ID NO:30)
ACC1-scr5: AAGTGCGACACTCCGTTCTT (SEQ ID NO:31).
Таким образом, 74 штамма с фенотипом I в таблице 1 включают примерно 60 гаплоидных штаммов, то есть штаммы с указанными выше генотипами (1):(2):(3):(4), по-видимому, появляются в соотношении расщепления примерно 1:1:1:0.
Следует отметить, что штаммы Δacc1 известны как являющиеся летальными в S. cerevisiae. Не было получено ни одного штамма с генотипом (4), поскольку они были Δacc1 и летальными. Однако штаммы с генотипом (1) были получены, несмотря на то, что они были Δacc1, демонстрируя, что МаАСС может компенсировать Δacc1. Другими словами, было показано, что МаАСС обладает АСС-активностью в цитоплазме.
[Пример 5]
Саузерн-анализ
Случайным образом выбирали два штамма из каждой из групп I-a (штаммы, гаплоидные по результатам ПЦР), II-a и III-a в таблице 1, полученные в примере 4. Геномную ДНК выделяли, как описано выше. Ее расщепляли рестрикционными эндонуклеазами BamHI или HindIII и разделяли электрофорезом в 0,8%-ом агарозном геле, и переносили и фиксировали ДНК на Hybond N+. Используемыми зондами являлись: (1) фрагмент ДНК от -500-го до -157-го нуклеотида выше гена АСС1 из S. cerevisiae, (2) фрагмент ДНК от 101-го до 658-го нуклеотида в гене АСС1 из S. cerevisiae, и (3) фрагмент ДНК МаАСС (SEQ ID NO:4). Для мечения и детектирования зондов использовали AlkPhos Direct (GE Healthcare). Саузерн-анализ проводили с использованием зонда (1) или зонда (2) для ДНК, расщепленной рестрикционной эндонуклеазой BamHI, и с использованием зонда (3) для ДНК, расщепленной рестрикционной эндонуклеазой HindIII. В результате, в группе I-a, штамм, гаплоидный по результатам ПЦР, зонд (1) детектировал сигнал на уровне 3,2 т.п.о., зонд (2) не давал сигнала, и зонд (3) детектировал сигнал на уровне 8,2 т.п.о. С другой стороны, в группе II-a зонд (1) и зонд (2) детектировал сигнал на уровне 7,6 т.п.о., и зонд (3) не давал сигнала, при этом в группе III-a зонд (1) и зонд (2) детектировали сигнал 7,6 т.п.о, и зонд (3) детектировал сигнал 8,2 т.п.о.
Приведенные результаты показали, то эти штаммы содержат следующие гены цитоплазматической АСС: штамм группы I-a содержит только MaACC из штамма M. alpina 1S-4, штамм группы II-a содержит только ACC1 из S. cerevisiae, а штамм группы III-a содержит как MaACC, так и ACC1.
[Пример 6]
Анализ дрожжей, экспрессирующих МаАСС
Для четырех случайных образом выбранных штаммов из каждой из групп I-a (штаммы, гаплоидные по результатам ПЦР), II-a и III-a в таблице 1, полученных в примере 4, инокулировали по одной полной микробиологической петле в 10 мл жидкой среды YPD5+Ura (2% дрожжевого экстракта, 1% полипептона, 5% глюкозы, 0,002% урацила) и инкубировали при встряхивании при 30°C в течение 24 часов или 72 часов. В конце инкубации измеряли оптическую плотность культур при 600 нм для оценки роста клеток (таблица 2).
Таблица 2
Рост клеток (OD 600 нм ) |
|||
I-a | II-a | III-a | |
24 часа | 7,08±0,72 | 6,12±0,35 | 7,4±0,54 |
72 часа | 8,97±2,26 | 7,55±1,21 | 9,88±2,4 |
Среднее значение±SD |
Клетки собирали центрифугированием и лиофилизировали, затем жирные кислоты в клетках переводили в метиловые эфиры с использованием метанольной HCl, затем экстрагировали гексаном, гексан выпаривали, и осадок анализировали с помощью газовой хроматографии для определения композиций жирных кислот при различных временах инкубации (таблицы 3 и 4).
Таблица 3
Соотношение состава жирных кислот штаммов дрожжей (после 24-часовой инкубации) |
|||
I-a | II-a | III-a | |
16:0 | 13,22±0,59 | 21,83±0,49 | 20,54±0,65 |
16:1 | 50,06±1,12 | 39,62±0,50 | 42,62±1,09 |
18:0 | 1,98±0,17 | 5,87±0,51 | 4,91±0,50 |
18:1 | 23,24±0,81 | 26,21±1,31 | 24,60±1,68 |
22:0 | 1,48±0,33 | 0,23±0,08 | 0,83±0,18 |
26:0 | 0,00±0,00 | 1,16±0,09 | 0,93±0,11 |
другие | 10,02±0,35 | 5,08±0,91 | 5,58±0,55 |
Среднее значение±SD |
Таблица 4
Соотношение состава жирных кислот штаммов дрожжей (после 72-часовой инкубации) |
|||
I-a | II-a | III | |
16:0 | 8,10±1,73 | 16,55±3,69 | 13,15±3,91 |
16:1 | 50,52±0,54 | 40,51±0,16 | 42,61±1,73 |
18:0 | 1,79±0,20 | 6,31±0,84 | 6,23±0,32 |
18:1 | 22,43±4,27 | 29,23±1,76 | 31,28±5,75 |
22:0 | 1,12±0,38 | 0,50±0,42 | 0,98±0,51 |
26:0 | 0,48±0,13 | 1,76±0,18 | 1,30±0,58 |
другие | 15,55±6,16 | 5,14±0,54 | 4,45±1,13 |
Среднее значение±SD |
В результате, штамм группы I-a, содержащий только МаАСС из M. alpina, рос быстрее штамма группы II-a, содержащего только ген АСС из S. cerevisiae. Штамм группы III-a, содержащий оба гена АСС, рос еще быстрее штамма группы I-a.
Более того, штаммы с разными генотипами имели разное соотношение состава жирных кислот, то есть, у штамма группы I-a, содержащего только МаАСС из M. alpina, наблюдалось заметное снижение содержания пальмитиновой кислоты, стеариновой кислоты и гексадокозановой кислоты среди насыщенных жирных кислот, а также снижение содержания олеиновой кислоты среди мононенасыщенных жирных кислот по сравнению со штаммом группы II-a, содержащим только ген АСС из S. cerevisiae. С другой стороны, у этого штамма наблюдалось повышение содержание тетрадокозановой кислоты среди насыщенных жирных кислот и содержание пальмитолеиновой кислоты среди мононенасыщенных жирных кислот. У штамма группы III-a, содержащего как MaACC из M. alpina, так и ACC1 из S. cerevisiae, наблюдалось промежуточное соотношение состава жирных кислот между соотношениями, характерными для группы I-a и II-a.
[Пример 7]
Установление геномной последовательности гена АСС
Штаммом M. alpina 1S-4 инокулировали 100 мл жидкой среды (1% глюкозы, 0,5% дрожжевого экстракта, рН 6,0) и инкубировали при встряхивании и 28°C в течение 4 дней. Клетки собирали фильтрованием, и выделяли геномную ДНК с использованием набора DNeasy Plant (Quiagen).
Для определения последовательности геномной ДНК АСС из штамма M. alpina 1S-4 использовали следующие праймеры:
ACC-G1: atgactaccaacgtacagtccttcattg (SEQ ID NO:32)
ACC-G2: ttaaacggtcatcgtggcgaacttggc (SEQ ID NO:33).
Геномную ДНК из штамма M. alpina 1S-4 использовали в качестве матрицы для проведения 30 циклов ПЦР (98°C-10 сек. и 68°C-15 мин.) с использованием LATaq (Takara Bio). Полученные фрагменты ДНК примерно 8 т.п.о. клонировали в ТА-вектор. Последовательность геномной ДНК (SEQ ID NO:5) АСС из штамма M. alpina 1S-4 определяли нуклеотидным секвенированием вставок в многочисленных клонах.
Сравнение последовательности геномной ДНК гена АСС из штамма M. alpina 1S-4 с последовательностью кДНК выявило, что ген содержит пять интронных и экзонных областей, соответствующих нуклеотидам 1-27, 315-665, 1271-2828, 2917-3463, 3590-6239 и 6339-7889 в SEQ ID NO:5.
[Пример 8]
Повышенная экспрессия АСС в Mortierella alpina
(1) Конструирование экспрессионного вектора
Проводили ПЦР, используя плазмиду pB-MaACC (см. пример 2) в качестве матрицы, вместе со следующими праймерами ACCExF-SpeI и ACCExR-SpeI, что давало продукт ПЦР примерно 6,7 т.п.о.
праймер ACCExF-SpeI: 5'-ATACTAGTATGACTACCAACGTACAGTCC-3' (SEQ ID NO:36)
праймер ACCExR-SpeI: 5'-GGACTAGTCTTAAACGGTCATCGTGGCG-3' (SEQ ID NO:37).
Его расщепляли рестрикционной эндонуклеазой SpeI и лигировали с фрагментом, полученным расщеплением плазмиды pSDY рестрикционной эндонуклеазой SpeI с получением плазмиды pSDY-ACC (фиг.5).
(2) Трансформация Mortierella alpina
Ауксотрофный по урацилу штамм Dura-3, который получали из M. alpina способом, согласно международной публикации № WO2005/019437 (озаглавленной «Способ разведения продуцирующих липиды грибов»), использовали в качестве хозяина и трансформировали методом доставки генетического материала с помощью частиц. Для отбора трансформированных штаммов использовали среду SC на агаре (0,5% дрожжевой азотной основы без аминокислот и сульфата аммония (DIFCO), 0,17% сульфата аммония, 2% глюкозы, 0,002% аденина, 0,003% тирозина, 0,0001% метионина, 0,0002% аргинина, 0,0002% гистидина, 0,0004% лизина, 0,0004% триптофана, 0,0005% треонина, 0,0006% изолейцина, 0,0006% лейцина, 0,0006% фенилаланина и 2% агара).
(3) Отбор трансформированных штаммов
Примерно 50 трансформированных штаммов выделяли, инокулировали в 15 мл жидкой среды GY (2% глюкозы, 1% дрожжевого экстракта, рН 6,0) и инкубировали при встряхивании при 28°C в течение 8 дней. Клетки собирали и сушили при 120°C в течение 2 часов, жирные кислоты в клетках преобразовывали в метиловые эфиры с использованием метанольной HCl и проводили анализ жирных кислот. Для дальнейших экспериментов отбирали четыре штамма, A4, H9, H11 и H20, имеющие высокий уровень продукции жирных кислот и высокое содержание арахидоновой кислоты,
(4) Подтверждение трансформации МаАСС-экспрессионной кассеты
Четыре трансформированных штамма, отобранных, как описано выше, инкубировали в жидкой среде GY и выделяли геномную ДНК. Для того чтобы оценить была ли или нет экспрессионная кассета МаАСС трансформирована в трансформированные штаммы, проводили ПЦР с использованием геномной ДНК в качестве матрицы вместе с праймерами ACC-F7 и trpCt-R, указанными ниже. При использовании в указанной реакции pSDY-ACC в качестве матрицы амплифицировался ПЦР-продукт примерно 1,6 т.п.о. В случае каждого трансформированного штамма обнаруживали ПЦР-продукт этого размера, что указывало на то, что МаАСС-экспрессионная кассета была трансформирована в указанные штаммы. Однако ПЦР-продукт не мог быть детектирован в штамме-хозяине Δura-3 в таких же условиях.
ACC-F7: 5'-GCTTGGTCGCGATGTCTACACCTCG-3' (SEQ ID NO:38)
trpCt-R: 5'-ACGTATCTTATCGAGATCCTGAACACCA-3' (SEQ ID NO:39)
(5) Оценка трансформированных штаммов
Для четырех трансформированных штаммов оценивали изменение роста и продукции жирных кислот во времени. А именно, каждый штамм инокулировали в 15 мл жидкой среды GY и инкубировали при встряхивании при 28°C. На 2-й, 4-й, 6-й, 8-й и 10-й день все клетки собирали и оценивали сухую массу клеток и уровень продукции жирных кислот (фиг.6 и 7). В результате, все трансформированные штаммы и штамм-хозяина Δura-3 имели максимальный уровень продукции жирных кислот на 8-й день.
Таким образом, проводили сравнение композиций жирных кислот, сухой массы клеток, общего уровня продукции жирных кислот и продукции арахидоновой кислоты на 8-й день (фиг.8, таблица 5). В результате, штамм-хозяина Δura-3 и трансформированные штаммы имели примерно одинаковую сухую массу клеток, но количество жирных кислот, продуцируемых на объем, увеличилось в 1,1-1,2 раза, и количество арахидоновой кислоты, продуцируемой на объем, увеличилось в 1,2-1,6 раза.
Таблица 5
Сравнение роста штаммов и их продуктивности в отношении жирных кислот и арахидоновой кислоты |
|||||
Штамм-хозяина | A4 | H9 | H11 | H20 | |
Сухая масса клеток (г) | 0,129 (1,0) | 0,125 (1,0) | 0,125 (1,0) | 0,125 (1,0) | 0,126 (1,0) |
Общее содержание жирных кислот на объем (мг/л среды) | 134,5 (1,0) | 170,1 (1,3) | 166,5 (1,2) | 154,8 (1,2) | 155,3 (1,2) |
Общее содержание жирных кислот на клетку (мг/г сухой массы клеток) | 1156,5 (1,0) | 1420,9 (1,2) | 1383,7 (1,2) | 1293,7 (1,1) | 1308,1 (1,1) |
Содержание арахидоновой кислоты на объем (мг/л среды) | 24,2 (1,0) | 30,9 (1,3) | 37,9 (1,6) | 38,9 (1,6) | 38,0 (1,6) |
Содержание арахидоновой кислоты на клетку (мг/г сухой массы клеток | 208,4 (1,0) | 258,6 (1,2) | 315,2 (1,5) | 325,2 (1,6) | 319,9 (1,5) |
Величины в круглых скобках представляют собой соотношение со значениями, полученными для штамма-хозяина. |
Таким образом, повышение экспрессии АСС в Mortierella alpine увеличивало уровень продукции жирных кислот, в частности, увеличивало уровень продукции арахидоновой кислоты относительно других жирных кислот.
Перечень последовательностей:
SEQ ID NO:6: праймер
SEQ ID NO:7: праймер
SEQ ID NO:8: праймер
SEQ ID NO:9: праймер
SEQ ID NO:10: праймер
SEQ ID NO:11: праймер
SEQ ID NO:12: праймер
SEQ ID NO:13: праймер
SEQ ID NO:14: праймер
SEQ ID NO:15: праймер
SEQ ID NO:16: праймер
SEQ ID NO:17: праймер
SEQ ID NO:18: праймер
SEQ ID NO:19: праймер
SEQ ID NO:20: праймер
SEQ ID NO:21: праймер
SEQ ID NO:22: праймер
SEQ ID NO:23: праймер
SEQ ID NO:26: праймер
SEQ ID NO:27: праймер
SEQ ID NO:28: праймер
SEQ ID NO:29: праймер
SEQ ID NO:30: праймер
SEQ ID NO:31: праймер
SEQ ID NO:32: праймер
SEQ ID NO:33: праймер
SEQ ID NO:36: праймер
SEQ ID NO:37: праймер
SEQ ID NO:38: праймер
SEQ ID NO:39: праймер
Claims (11)
1. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1; и
(d) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1; и
(d) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
2. Молекула нуклеиновой кислоты по п.1, состоящая из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий ацетил-СоА-карбоксилазной активностью, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1; и
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
(a) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1; и
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
3. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий ацетил-СоА- карбоксилазной активностью, где нуклеотидная последовательность содержит нуклеотидную последовательность SEQ ID NO:4.
4. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1; и
(d) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1; и
(d) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
5. Молекула нуклеиновой кислоты по п.4, состоящая из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий активностью, компенсирующей недостаток ацетил-СоА-карбоксилазной активности в дрожжах, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1; и
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
(a) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1; и
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в условиях 2xSSC при 50°С с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
6. Белок, обладающий ацетил-СоА-карбоксилазной активностью, где белок состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
7. Рекомбинантный вектор, содержащий нуклеиновую кислоту по любому из пп.1-5, для получения композиции жирных кислот, содержащей повышенный уровень арахидоновой кислоты.
8. Клетка, которая трансформирована рекомбинантным вектором по п.7, для получения композиции жирных кислот, содержащей повышенный уровень арахидоновой кислоты.
9. Способ получения композиции жирных кислот, включающий культивирование трансформированных клеток по п.8 и сбор композиции жирных кислот из культур трансформированных клеток по п.8.
10. Молекула нуклеиновой кислоты, состоящая из нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина, где нуклеотидная последовательность выбрана из группы, состоящей из:
(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1; и
(d) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
(a) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, кодирующую белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2;
(b) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности SEQ ID NO:1;
(c) нуклеотидной последовательности, которая содержит нуклеотидную последовательность, состоящую из SEQ ID NO:1; и
(d) нуклеотидной последовательности, которая гибридизуется в жестких условиях с нуклеиновой кислотой, состоящей из нуклеотидной последовательности, комплементарной нуклеотидной последовательности, кодирующей белок, состоящий из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
11. Белок, обладающий активностью, повышающей содержание арахидоновой кислоты, характерное для хозяина, где белок состоит из аминокислотной последовательности SEQ ID NO:2.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2009066147 | 2009-03-18 | ||
JP2009-066147 | 2009-03-18 | ||
PCT/JP2010/054582 WO2010107070A1 (ja) | 2009-03-18 | 2010-03-17 | 新規なアセチルCoAカルボキシラーゼ |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2011142010A RU2011142010A (ru) | 2013-04-27 |
RU2551779C2 true RU2551779C2 (ru) | 2015-05-27 |
Family
ID=42739729
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2011142010/10A RU2551779C2 (ru) | 2009-03-18 | 2010-03-17 | Новая ацетил-coa-карбоксилаза |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US9051590B2 (ru) |
EP (1) | EP2410051B1 (ru) |
JP (1) | JP5255695B2 (ru) |
KR (1) | KR101646302B1 (ru) |
CN (1) | CN102395676A (ru) |
AU (1) | AU2010225738B2 (ru) |
BR (1) | BRPI1013611A8 (ru) |
CA (1) | CA2753981C (ru) |
DK (1) | DK2410051T3 (ru) |
RU (1) | RU2551779C2 (ru) |
WO (1) | WO2010107070A1 (ru) |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2038377C1 (ru) * | 1990-01-17 | 1995-06-27 | Сосьете Де Продюи Нестле С.А. | Способ получения полиненасыщенных жирных кислот |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6582908B2 (en) * | 1990-12-06 | 2003-06-24 | Affymetrix, Inc. | Oligonucleotides |
JP4149007B2 (ja) | 1995-02-01 | 2008-09-10 | 麒麟麦酒株式会社 | 酵母の凝集性判定用dna分子および凝集性判定方法 |
WO2001040514A1 (fr) | 1999-11-30 | 2001-06-07 | Asahi Breweries, Ltd | Procede d'estimation des proprietes de floculation de la levure basse de brasserie |
DE602004030807D1 (de) * | 2003-08-22 | 2011-02-10 | Suntory Holdings Ltd | Verfahren zur züchtung eines lipidproduzierenden pilzes |
US7588931B2 (en) | 2004-11-04 | 2009-09-15 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | High arachidonic acid producing strains of Yarrowia lipolytica |
DE102005038036A1 (de) * | 2005-08-09 | 2007-02-15 | Basf Plant Science Gmbh | Verfahren zur Herstellung von Arachidonsäure und/oder Eicosapentaensäure in transgenen Nutzpflanzen |
CN101578366B (zh) * | 2007-06-18 | 2012-05-30 | 三得利控股株式会社 | 甘油-3-磷酸酰基转移酶(gpat)同源物及其应用 |
-
2010
- 2010-03-17 BR BRPI1013611A patent/BRPI1013611A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2010-03-17 RU RU2011142010/10A patent/RU2551779C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-03-17 KR KR1020117020561A patent/KR101646302B1/ko active IP Right Grant
- 2010-03-17 DK DK10753561.9T patent/DK2410051T3/en active
- 2010-03-17 JP JP2011504871A patent/JP5255695B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-17 US US13/254,512 patent/US9051590B2/en active Active
- 2010-03-17 CN CN2010800128819A patent/CN102395676A/zh active Pending
- 2010-03-17 AU AU2010225738A patent/AU2010225738B2/en not_active Ceased
- 2010-03-17 WO PCT/JP2010/054582 patent/WO2010107070A1/ja active Application Filing
- 2010-03-17 EP EP10753561.9A patent/EP2410051B1/en not_active Not-in-force
- 2010-03-17 CA CA2753981A patent/CA2753981C/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2038377C1 (ru) * | 1990-01-17 | 1995-06-27 | Сосьете Де Продюи Нестле С.А. | Способ получения полиненасыщенных жирных кислот |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
DATABASE: UniProtKB/TrEMBL, Q70BT2 (Q70BT2_MORAP), 05.07.2004. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
BRPI1013611A8 (pt) | 2015-12-15 |
KR101646302B1 (ko) | 2016-08-05 |
CA2753981A1 (en) | 2010-09-23 |
DK2410051T3 (en) | 2015-03-23 |
CN102395676A (zh) | 2012-03-28 |
JPWO2010107070A1 (ja) | 2012-09-20 |
AU2010225738B2 (en) | 2015-01-29 |
EP2410051A1 (en) | 2012-01-25 |
US9051590B2 (en) | 2015-06-09 |
EP2410051A4 (en) | 2013-01-02 |
AU2010225738A1 (en) | 2011-09-22 |
KR20110128286A (ko) | 2011-11-29 |
WO2010107070A1 (ja) | 2010-09-23 |
RU2011142010A (ru) | 2013-04-27 |
CA2753981C (en) | 2017-10-24 |
JP5255695B2 (ja) | 2013-08-07 |
BRPI1013611A2 (pt) | 2015-08-25 |
US20120264960A1 (en) | 2012-10-18 |
EP2410051B1 (en) | 2014-12-31 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101496803B1 (ko) | 신규 리소포스파티드산 아실기 전이 효소 유전자 | |
EP2182071B1 (en) | A method for preparing a fatty acid composition | |
RU2534559C2 (ru) | Новая лизофосфолипид-ацилтрансфераза | |
KR101496805B1 (ko) | 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소(gpat) 호몰로그와 그 이용 | |
RU2534560C2 (ru) | Новые гены атф:цитратлиазы | |
JP5576986B2 (ja) | ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子 | |
EP2172548B1 (en) | Phosphatidic acid phosphatase homologs and use thereof | |
RU2551779C2 (ru) | Новая ацетил-coa-карбоксилаза | |
EP2532744B1 (en) | Glycerol-3-phosphate acyltransferase homologue and use thereof |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210318 |