JP5576986B2 - ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子 - Google Patents
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Description
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(b)配列番号1からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(c)配列番号1からなる塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(d)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(e)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(f)配列番号4からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
(g)配列番号4からなる塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1〜110個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(b)配列番号1からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(c)配列番号1からなる塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(d)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(e)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(f)配列番号4からなる塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
(g)配列番号4からなる塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
(a)配列番号1で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列又はその部分配列を含む核酸
(c)配列番号4で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
(d)配列番号5で示される塩基配列又はその部分配列を含む核酸
(a)配列番号2において1又は複数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
(a)配列番号2において1〜110個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
本発明のホスファチジン酸ホスファターゼ(PAP)には、MaPAP2.2及びその変異体が含まれる。MaPAP2.2をコードする核酸のcDNA、CDS、ORF及びアミノ酸配列の対応関係を以下の表1に整理して記載した。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
(i) 配列番号2に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1〜110個、1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個))のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号2に示すアミノ酸配列のうち1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1〜110個、1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個))のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号2に示すアミノ酸配列において1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1〜110個、1〜100個、1〜75個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個個))の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせたアミノ酸配列、
からなるタンパク質であって、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
A群:ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、2−アミノブタン酸、メチオニン、O−メチルセリン、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
B群:アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、2−アミノアジピン酸及び2−アミノスベリン酸
C群:アスパラギン及びグルタミン
D群:リジン、アルギニン、オルニチン、2,4−ジアミノブタン酸及び2,3−ジアミノプロピオン酸
E群:プロリン、3−ヒドロキシプロリン及び4−ヒドロキシプロリン
F群:セリン、スレオニン及びホモセリン
G群:フェニルアラニン及びチロシン
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号1からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号1に示される塩基配列に対して少なくとも70%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなり、かつ、PAP活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対して相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
配列番号4からなる塩基配列は、MaPAP2.2をコードするゲノムDNA配列である。
本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号4からなる塩基配列に対して少なくとも70%以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。好ましくは、配列番号4に示される塩基配列に対して少なくとも75%以上、さらに好ましくは80%以上(例えば、85%以上、より一層好ましくは、90%以上、さらには95%、98%又は99%以上)の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列があげられる。2つの塩基配列の同一性%は、上述したように決定することができる。
(i) 配列番号1に示す塩基配列のうち1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1〜330個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個))の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号1に示す塩基配列のうち1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1〜330個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個))の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号1に示す塩基配列において1個又は複数個(好ましくは1個又は数個(例えば、1〜330個、1〜300個、1〜250個、1〜200個、1〜150個、1〜100個、1〜50個、1〜30個、1〜25個、1〜20個、1〜15個、さらに好ましくは10、9、8、7、6、5、4、3、2、又は1個))の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)〜(iii)を組み合わせた塩基配列、
であって、かつ、PAP活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
(a)配列番号1で示される塩基配列
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
(c)配列番号4で示される塩基配列
(d)配列番号5で示される塩基配列
(1) 以下の(a)〜(g)のいずれかに記載の核酸。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(b)配列番号1からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
(c)配列番号1からなる塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(d)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(e)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
(f)配列番号4からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
(g)配列番号4からなる塩基配列と同一性が70%以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1〜130個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(b)配列番号1からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズする核酸
(c)配列番号1からなる塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
(d)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(e)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズする核酸
(f)配列番号4からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と2×SSC、50℃の条件下でハイブリダイズする核酸
(g)配列番号4からなる塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
本発明のタンパク質は、配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びその変異体であって前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『ホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおり、PAP活性を有するタンパク質を意味する。
(a)配列番号2において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、PAP活性を有するタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が70%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、PAP活性を有するタンパク質
(1)(a)配列番号2において1若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が80%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
(2) 以下の(a)又は(b)のいずれかに記載のタンパク質。
(a)配列番号2において1〜110個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
PAPの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてcDNAライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてPCR反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
上流側用プライマーとして、プライマーPAP2.2-1f:5’−TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT−3’(配列番号6)、
下流側用プライマーとして、プライマーPAP2.2-4r:5’−GACAATGCCGAGGATCGAGCC−3’(配列番号7)、
等を、各々用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したcDNAに、上記プライマー及びDNAポリメラーゼ等を作用させてPCR反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のPCR反応の条件としては、例えば以下の条件があげられる。
変性温度:90〜95℃
アニーリング温度:40〜60℃
伸長温度:60〜75℃
サイクル数:10回以上
本発明はまた、PAPをコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。脂肪酸組成物は、1又はそれ以上の脂肪酸の組み合わせを含む組成物である。ここで、脂肪酸は遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリドやリン脂質等の脂肪酸を含む脂質として存在していてもよい。本発明の脂肪酸組成物は、具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
本発明はまた、MaPAP2.2又はその変異体が発現している細胞における1又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、MaPAP2.2又はその変異体が発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリド、リン脂質等の脂肪酸を含む脂質の形で存在していてもよい。
また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料(化粧料、医薬(例えば、皮膚外用薬)、石鹸等の原料)の製造等の用途に使用することができる。化粧料(組成物)又は医薬(組成物)の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
本発明はまた、本発明のPAPをコードする核酸又はPAPタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
本発明の一態様として、本発明のPAPをコードする核酸又はPAPタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。上記評価方法としては、まず、本発明のPAPをコードする核酸の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株のPAP活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
変性温度:90〜95℃
アニーリング温度:40〜60℃
伸長温度:60〜75℃、
サイクル数:10回以上
などの条件である。得られた反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株のPAP活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらにPAP活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、PAP活性の評価方法は、上記のとおりである。
本発明の他の態様として、本発明のPAPをコードする核酸又はPAPタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号1等の本発明の塩基配列がコードするPAPの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、PAPの発現量及びPAPが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
M. alpina 1S-4株を100mlのGY2:1培地(2%グルコース、1%酵母エキス、pH6.0)に植菌し、28℃で2日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy (QIAGEN) を用いてゲノムDNAを調製した。
M. alpina 1S-4株を100mlの培地(1.8%グルコース、1%酵母エキス、pH6.0)に植菌し、3日間28℃で前培養した。10L培養槽(Able Co.、東京)に5Lの培地(1.8%グルコース、1%大豆粉、0.1%オリーブ油、0.01%アデカノール、0.3%KH2PO4、0.1%Na2SO4、0.05%CaCl2・2H2O、0.05%MgCl2・6H2O、pH6.0)を入れ、前培養物を全量植菌し、300rpm、1vvm、26℃の条件で8日間通気攪拌培養した。培養1、2、及び3日目に各々2%、2%、及び1.5%相当のグルコースを添加した。培養1、2、3、6、及び8日目の各ステージに菌体を回収し、塩酸グアニジン/CsCl法でトータルRNAを調製した。Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit(Takara Bio Inc.)を用いて、トータルRNAからpoly(A)+RNAの精製を行った。各ステージのcDNAライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)を用いて作製した。
酵母のScDPP1(YDR284C:アクセッション番号 AAS56070)とScLPP1(YDR503C:アクセッション番号 AAT93210)のホモログをゲノムデータベースより検討した。その結果、2つのスーパーコンティグがヒットした。1つは、MaPAP1に係るゲノム配列を含むスーパーコンティグであり、他方は、配列番号4を含むスーパーコンティグであった。配列番号4に係る遺伝子をMaPAP2.2と命名した。
(1)クローニング
MaPAP2.2のcDNAをクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
プライマーPAP2.2-1f:TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT(配列番号6)
プライマーPAP2.2-4r:GACAATGCCGAGGATCGAGCC(配列番号7)
バッファー:5xSSC、1%SDS、50mM Tris−HCl(pH7.5)、50%ホルムアミド;
温度:42℃(一晩);
洗浄条件:0.2x SSC、0.1%SDS溶液中(65℃)で、20分間×3回。
MaPAP2.2遺伝子の塩基配列及びこれのコードする推定アミノ酸配列について、BLAST及びclustalWによる解析で、既知の核酸の塩基配列及びアミノ酸配列に対する相同性検索を行った。BLASTXによるGENBANKに登録されているアミノ酸配列に対する相同性検索でヒットしたものの中で、もっともE-Valueの低かった配列は、オオキツネタケ(Laccaria bicolor)由来の推定タンパク質(アクセッション番号:XP 001878243)で、アミノ酸配列の同一性は36.7%であった。MaPAP2.2のアミノ酸配列と、オオキツネタケ由来の推定タンパク質および酵母由来のScDPP1(YDR284C:アクセッション番号 AAS56070))のアミノ酸配列のアラインメントを図2に示した。
(1)酵母発現ベクターの構築
MaPAP2.2を酵母で発現させるために、以下のとおり酵母発現用ベクターを構築した。まず、プライマーEco-PAP2-2-FとKpn-PAP2-2-Rを作成し、pB-MaPAP2.2を鋳型として、ExTaq(タカラバイオ)にてPCR反応を行った。
Eco-PAP2-2-F:GAATTCATGTTCTCGTCCATGCGCTTCAAG(配列番号8)
Kpn-PAP2-2-R:TGGTACCTCATGGTCCCAAGTATACATCGTTCC(配列番号9)
プラスミドpYE22m、pYE-MaPAP2.2、pYE-MaPAP1(WO2009/008466)をそれぞれ用いて酢酸リチウム法により、酵母S. cerevisiae EH13-15株(trp1,MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)を形質転換した。形質転換株は、SC-Trp(1lあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids(DIFCO)6.7g、グルコース20g、アミノ酸パウダー(アデニン硫酸塩1.25g、アルギニン0.6g、アスパラギン酸3g、グルタミン酸3g、ヒスチジン0.6g、ロイシン1.8g、リジン0.9g、メチオニン0.6g、フェニルアラニン1.5g、セリン11.25g、チロシン0.9g、バリン4.5g、スレオニン6g、ウラシル0.6gを混合したもの)1.3g)寒天培地(2%アガー)上で生育するものとして選抜した。
それぞれのベクターでの形質転換株を、以下の条件で培養した。すなわち、前培養として、SD-Trp 10mlに酵母を植菌し、30℃で1日、振とう培養を行った。本培養として、前培養液1mlをSD-Trp 100mlに添加し、30℃で1日、振とう培養した。
遠心分離にて集菌後、水洗し、−80℃にて一時保存した。菌体に5mlのバッファーA(50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.3Mスクロース、10mM DTT、1mM PMSF)を添加し、よく懸濁した。その後、フレンチプレスにて16kPaで3回処理することにより、菌体を破砕した。菌体破砕液を1,500×g、4℃にて10分間、遠心分離し、得られた上清を粗酵素液とした。
方法
PAP活性は、以下の通り測定した。反応液として、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50μg リノール酸(18:2)−PAまたはオレイン酸(18:1)−PAまたはマルガリン酸(17:0)−PA(基質となるホスファチジン酸)、0.5mM MgCl2または0.5mM EDTA、10mM DTT、100μl粗酵素液、を含む全量500μlの反応液を調製し、28℃で30分間反応させた。クロロホルム:メタノール(1:2)を添加して反応を停止させた。コントロールとして、粗酵素液のかわりにMaPAP2.2遺伝子を含まないプラスミドpYE22mで形質転換した酵母(コントロール株)の菌体破砕液の上清を添加した反応液を用いた。Bligh & Dyer法により脂質を抽出し、遠心濃縮機で乾固させた。クロロホルムに溶解し、TLC(シリカゲル60プレート、ヘキサン:ジエチルエーテル:酢酸=70:30:1)により脂質を分画した。プリムリン溶液を噴霧後、UV照射下で脂質を可視化し、リン脂質画分とジグリセリド(DG)画分を掻きとり、含まれる全脂肪酸をメチルエステルに誘導し、ガスクロマトグラフィーにて分析した。
結果を図4〜7に示した。
配列番号7:プライマーPAP2.2-4r
配列番号8:プライマーEco-PAP2-2-F
配列番号9:プライマーKpn-PAP2-2-R
Claims (10)
- 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の核酸。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1〜30個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(b)配列番号1からなる塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(c)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(d)配列番号4からなる塩基配列と同一性が90%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸 - 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の核酸。
(a)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(b)配列番号1からなる塩基配列と同一性が95%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(c)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が95%以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質、をコードする塩基配列を含む核酸
(d)配列番号4からなる塩基配列と同一性が95%以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸 - 以下の(a)〜(d)のいずれかに記載の核酸。
(a)配列番号1で示される塩基配列を含む核酸
(b)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
(c)配列番号4で示される塩基配列を含む核酸
(d)配列番号5で示される塩基配列を含む核酸 - ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数17のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数18のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、請求項1又は2に記載の核酸。
- 以下の(a)又は(b)のいずれかに記載のタンパク質。
(a)配列番号2において1〜30個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が90%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質 - 以下の(a)又は(b)のいずれかに記載のタンパク質。
(a)配列番号2において1〜15個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
(b)配列番号2からなるアミノ酸配列と同一性が95%以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質 - ホスファチジン酸ホスファターゼ活性が、炭素数17のアシル基を含有するホスファチジン酸よりも炭素数18のアシル基を含有するホスファチジン酸に対する基質特異性が高いことを特徴とする、請求項5又は6に記載のタンパク質。
- 配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
- 請求項9に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
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