WO2011081135A1 - ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to a novel phosphatidic acid phosphatase gene and use thereof.
  • Fatty acids containing two or more unsaturated bonds are collectively referred to as polyunsaturated (PUFA), and arachidonic acid, dihomo gamma linolenic acid, eicosapentaenoic acid, docosahexaenoic acid, and the like are known. Some of these highly unsaturated fatty acids cannot be synthesized in the animal body, and such highly unsaturated fatty acids need to be taken from food as essential fatty acids. Polyunsaturated fatty acids are widely distributed. For example, arachidonic acid is separated from lipids extracted from the adrenal glands and livers of animals.
  • microorganisms belonging to the genus Mortierella are known as microorganisms that produce highly unsaturated fatty acid-containing lipids such as arachidonic acid.
  • polyunsaturated fatty acids constitute storage lipids such as triacylglycerol (also referred to as triglyceride, TG) and accumulate in microbial cells or plant seeds.
  • triacylglycerol also referred to as triglyceride, TG
  • Triacylglycerol a storage lipid, is produced in vivo as follows. An acyl group is transferred to glycerol-3-phosphate by glycerol-3-phosphate acyltransferase to produce lysophosphatidic acid, and an acyl group is transferred to lysophosphatidic acid by lysophosphatidic acid acyltransferase to phosphatidic acid Phosphatidic acid is dephosphorylated by phosphatidic acid phosphatase to give diacylglycerol, and acyl group is transferred to diacylglycerol by diacylglycerol acyltransferase to give triacylglycerol.
  • phosphatidic acid phosphatidic acid, hereinafter sometimes referred to as “PA” and sometimes 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate
  • PA phosphatidic acid
  • 1,2-diacyl-sn-glycerol-3-phosphate is triacyl. It is a precursor of glycerol and a biosynthetic precursor of diacyl glycerophospholipid.
  • CDP diacylglycerol CDP-DG
  • CTP cytidine 5'-3 phosphate
  • Phosphatidic acid phosphatase EC 3.1.3.4, phosphatidic acid phosphatase, hereinafter “ It may be described as “PAP”. This PAP is known to exist in all organisms from bacteria to vertebrates.
  • Non-Patent Documents 1, 2, and 7 In yeast (Saccharomyces cerevisiae), two types of PAP are known (Non-Patent Documents 1, 2, and 7). One is Mg 2+ dependent PAP (PAP1) and the other is Mg 2+ independent PAP (PAP2).
  • the PAH1 gene is known as a gene encoding PAP1 (Non-patent Documents 3-5). Since the pah1 ⁇ mutant has PAP1 activity, there are other genes responsible for PAP1 activity. It is considered. In the pah1 ⁇ mutant, it is known that the nuclear membrane and ER membrane are abnormally expanded, and the expression of genes that are key to phospholipid biosynthesis is abnormally increased (Non-patent Document 6).
  • DGPP diacylglycerol pyrophosphate
  • lysophosphatidic acid lysophosphatidic acid
  • sphingoid-based phosphate isoprenoid phosphate
  • dephosphorylate dephosphorylate
  • Mortierella alpina which is a lipid-producing bacterium
  • the MaPAP1 gene which is an Mg 2+ -independent PAP2 homolog, is known (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide proteins and nucleic acids that can be produced or expressed in host cells to produce fats and oils having a target fatty acid composition or to increase the content of the target fatty acid. is there.
  • the present inventor has intensively studied to solve the above problems.
  • PAP1 Mg 2+ -dependent phosphatidic acid phosphatase
  • the gene is introduced into a host cell having a high growth ability such as yeast, the protein encoded by the cloned cDNA has phosphatidic acid phosphatase activity, and the introduction of the cDNA results in triacylglycerol as a storage lipid in yeast It has been found that the production volume is improved. Thereby, the gene relating to the novel phosphatidic acid phosphatase (PAP) was successfully cloned, and the present invention was completed. That is, the present invention is as follows.
  • nucleic acid according to any one of the following (a) to (g).
  • A a nucleotide sequence consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 and encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • B a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 and hybridizing under stringent conditions and encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • C Nucleic acid containing a base sequence
  • c A nucleic acid comprising a base sequence that is 70% or more identical to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 and that encodes a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • d an amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO
  • nucleic acid according to (1) which is any of the following (a) to (g): (A) a nucleotide sequence consisting of an amino acid sequence in which 1 to 130 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 and encoding a protein having phosphatidic acid phosphatase activity (B) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 and hybridizing under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • Nucleic acid comprising a base sequence encoding protein (c) Base sequence encoding a protein consisting of a base sequence consisting of 90% or more of the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 and having phosphatidic acid phosphatase activity A nucleic acid (d) containing the same amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 A nucleic acid comprising a nucleotide sequence encoding a protein having a phosphatidic acid phosphatase activity, comprising an amino acid sequence having a sex of 90% or more (e) a base encoding a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 A nucleic acid comprising a base sequence that hybridizes with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the sequence under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • nucleic acid SEQ ID NO: 5 or A base sequence having an exon which hybridizes with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence comprising SEQ ID NO: 10 under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C. and which encodes a protein having phosphatidic acid phosphatase activity
  • Nucleic acid Nucleic acid (g) nucleotide sequence comprising SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 Nucleic acid comprising a nucleotide sequence having exon identity is 90% or more of the nucleotide sequences, and, which encodes a protein having phosphatidic acid phosphatase activity and
  • nucleic acid according to any one of the following (a) to (d).
  • A a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 or a partial sequence thereof
  • b a base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 or a partial sequence thereof
  • Nucleic acid containing c) Nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 9 or a partial sequence thereof
  • d Nucleic acid containing the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 or a partial sequence thereof
  • nucleic acid consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7, and from phosphatidic acid (PA) in a PAH1-deficient strain of yeast
  • a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein having an activity of improving the diacylglycerol (DG) and / or triglyceride (TG) generating activity of (b) a base complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6
  • a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein that hybridizes with a nucleic acid comprising a sequence under stringent conditions and encodes a protein having an activity to improve DG and / or TG production activity from PA in a PAH1-deficient strain of yeast
  • nucleic acid according to (4) which is any of the following (a) to (g): (A) consisting of an amino acid sequence in which 1 to 130 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or 7 and from phosphatidic acid (PA) in a PAH1-deficient strain of yeast
  • a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein having an activity of improving the diacylglycerol (DG) and / or triglyceride (TG) generating activity of (b) a base complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6
  • a nucleotide sequence that encodes a protein that hybridizes with a nucleic acid comprising a sequence under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • nucleic acid to be contained (c) Base sequence having 90% or more identity with the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or And a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein having an activity of improving DG and / or TG generation activity from PA in a PAH1-deficient strain of yeast (d) an amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7
  • a nucleic acid (e) sequence comprising a base sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence having an identity of 90% or more and having an activity of improving DG and / or TG production activity from PA in a PAH1-deficient strain of yeast Hybridizes with a nucleic acid consisting of a base sequence complementary to the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in No.
  • nucleotide encoding a protein having an activity to improve DG and / or TG production activity from PA in a strain (F) a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 and hybridizing under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C., and in a PAH1-deficient strain of yeast
  • a nucleic acid comprising a base sequence having an exon that encodes a protein having an activity of improving DG and / or TG generation activity from PA (g) 90% or more in identity with the base sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10
  • DG diacylglycerol
  • PA phosphatidic acid
  • TG triglyceride
  • a protein comprising an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and yeast Protein having an activity to improve DG and / or TG production activity from PA in PAH1-deficient strain
  • DG diacylglycerol
  • PA phosphatidic acid
  • TG triglyceride
  • yeast a protein comprising an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and yeast A protein having an activity of improving the activity of improving DG and / or TG production from PA in a PAH1-deficient strain of
  • a protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7.
  • a method for producing a fatty acid composition comprising collecting a fatty acid or a lipid from a culture obtained by culturing the transformant according to (12).
  • the PAP of the present invention can improve the ability to produce fatty acids and stored lipids in cells into which it has been introduced. For this reason, it is preferable as what improves the productivity of highly unsaturated fatty acid in microorganisms and plants.
  • the PAP of the present invention can produce a fatty acid composition having a different composition in the host as compared with a fatty acid composition produced by a host into which PAP has not been introduced.
  • a lipid having desired characteristics and effects can be provided, which is useful as a product applicable to foods, cosmetics, pharmaceuticals, soaps and the like.
  • FIG. 1-1 is a diagram comparing the genome sequence (SEQ ID NO: 5) and ORF (SEQ ID NO: 1) of MaPAH1.1 derived from M. alpina 1S-4 strain.
  • FIG. 1-2 is a continuation of FIG. 1-1.
  • FIG. 1-3 is a continuation of FIG. 1-2.
  • 1-4 is a continuation of FIG. 1-3.
  • FIG. 2-1 is a diagram comparing the genome sequence (SEQ ID NO: 10) and ORF (SEQ ID NO: 6) of MaPAH1.2 derived from M. alpina 1S-4 strain.
  • FIG. 2-2 is a continuation of FIG. 2-1.
  • FIG. 2-3 is a continuation of FIG. 2-2.
  • FIG. 2-4 is a continuation of FIG. 2-3.
  • FIG. 1-1 is a diagram comparing the genome sequence (SEQ ID NO: 5) and ORF (SEQ ID NO: 1) of MaPAH1.1 derived from M. alpina 1S-4 strain.
  • FIG. 1-2 is a continuation
  • FIG. 3-1 is a diagram showing MaPAH1.1 cDNA (SEQ ID NO: 4) derived from M. alpina 1S-4 strain and a deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) derived therefrom.
  • FIG. 3-2 is a continuation of FIG. 3-1.
  • FIG. 3-3 is a continuation of FIG. 3-2.
  • FIG. 4-1 is a diagram showing MaPAH1.2 cDNA (SEQ ID NO: 9) derived from M. alpina 1S-4 strain and a deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) derived therefrom.
  • FIG. 4B is a continuation of FIG. 4-1.
  • 5-1 shows the deduced amino acid sequence of MaPAH1.1 (SEQ ID NO: 2) and the deduced amino acid sequence of MaPAH1.2 (SEQ ID NO: 7) from the M. alpina 1S-4 strain, and the phosphatidic acid phosphatase of the PAP1 family. It is the figure which compared the amino acid sequence (sequence number 20) of ScPAH1 protein (sequence number 19) derived from a certain yeast Saccharomyces cerevisiae and mouse-derived Lipin. In the PAP1 family of phosphatidic acid phosphatases, the N-terminal part is well conserved, and it is said to be a lipin N-terminal conserved region (pfam04571).
  • FIG. 5-2 is a continuation of FIG. 5-1.
  • FIG. 5-1 is a continuation of FIG. 5-1.
  • FIG. 6-1 is a diagram comparing the CDS sequence (SEQ ID NO: 3) of MaPAH1.1 and the CDS sequence (SEQ ID NO: 8) of MaPAH1.2 derived from M. alpina 1S-4 strain.
  • FIG. 6B is a continuation of FIG.
  • FIG. 6C is a continuation of FIG.
  • Fig. 7 is a diagram comparing the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 2) of MaPAH1.1 derived from M. alpina 1S-4 strain and the deduced amino acid sequence (SEQ ID NO: 7) of MaPAH1.2.
  • the present invention relates to a novel phosphatidic acid phosphatase gene derived from the genus Mortierella, characterized in that phosphatidic acid is dephosphorylated to produce diacylglycerol.
  • the phosphatidic acid phosphatase of the present invention is an enzyme that catalyzes a reaction of dephosphorylating phosphatidic acid to produce diacylglycerol.
  • the substrate of the PAP of the present invention is usually phosphatidic acid, but is not limited thereto.
  • Nucleic acids encoding phosphatidic acid phosphatases of the invention include MaPAH1.1 and MaPAH1.2.
  • the correspondence relationship between cDNA, CDS, ORF and deduced amino acid sequence encoding MaPAH1.1 and MaPAH1.2 is summarized in Table 1 below.
  • SEQ ID NO: 2 which is the amino acid sequence of MaPAH1.1
  • SEQ ID NO: 1 which is the sequence indicating the ORF region of MaPAH1.1
  • the sequence which indicates the region of the CDS Examples include SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 which is the base sequence of the cDNA.
  • SEQ ID NO: 3 corresponds to the 1st-3985th base sequence of SEQ ID NO: 4
  • SEQ ID NO: 1 is the 1st-3882th base sequence of SEQ ID NO: 4
  • the 1st-3882th base sequence of SEQ ID NO: 3 Corresponds to the base sequence.
  • SEQ ID NO: 5 is exemplified as a genomic base sequence encoding MaPAH1.1 of the present invention.
  • the genome sequence of SEQ ID NO: 5 consists of 11 exons and 10 introns, and the exon regions are the first to 182nd, 370 to 584th, 690 to 1435th, 1536 to 1856th of SEQ ID NO: 5, 1946 to 2192nd, 2292 to 2403th, 2490 to 2763th, 2847 to 3077th, 3166 to 3555th, 3648 to 3862th, 3981 to 5034th.
  • SEQ ID NO: 7 which is the amino acid sequence of MaPAH1.2
  • SEQ ID NO: 6 which is the sequence indicating the ORF region of MaPAH1.2
  • SEQ ID NO: 9 which is the base sequence of the cDNA.
  • SEQ ID NO: 8 corresponds to the 72-3791st nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • SEQ ID NO: 6 corresponds to the 72-3788th nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9
  • SEQ ID NO: 10 can be mentioned as a genomic base sequence encoding MaPAH1.2 of the present invention.
  • the genome sequence of SEQ ID NO: 10 consists of 8 exons and 7 introns, and the exon regions are 1st to 454th, 674 to 1006th, 1145 to 1390th, 1479 to 1583th of SEQ ID NO: 10, 1662 to 1804th, 1905 to 2143th, 2243 to 3409th, 3520 to 4552th.
  • the nucleic acid of the present invention includes not only single-stranded and double-stranded DNA but also its RNA complement, which may be naturally derived or artificially produced.
  • DNA include genomic DNA, cDNA corresponding to the genomic DNA, chemically synthesized DNA, DNA amplified by PCR, a combination thereof, and a hybrid of DNA and RNA. It is not limited.
  • Preferred embodiments of the nucleic acid of the present invention encode (a) a nucleic acid comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6, and (b) a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7.
  • Examples include a nucleic acid including a base sequence, (c) a nucleic acid including a base sequence represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 9, or (d) a nucleic acid including a base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10.
  • a base sequence encoding a protein having homology with a protein having a known PAP activity can be searched from the base sequence data of an organism having PAP activity or genomic DNA.
  • the organism having PAP activity is preferably a lipid-producing bacterium, and examples of the lipid-producing bacterium include, but are not limited to, M. ⁇ alpina.
  • a cDNA library is first prepared.
  • a method for preparing a cDNA library "Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)) can be referred to.
  • a commercially available cDNA library preparation kit may also be used. Examples of a method for preparing a cDNA library suitable for the present invention include the following methods. That is, an appropriate strain of M. alpina, which is a lipid-producing bacterium, is inoculated into an appropriate medium and pre-cultured for an appropriate period.
  • Examples of culture conditions suitable for this pre-culture include, for example, 1.8% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0 as a medium composition, a culture period of 3 to 4 days, and a culture temperature of 28 ° C. There are conditions. Thereafter, the preculture is subjected to main culture under appropriate conditions.
  • a medium composition suitable for the main culture for example, 1.8% glucose, 1% soybean flour, 0.1% olive oil, 0.01% adecanol, 0.3% KH 2 PO 4 , 0.1% Na 2 SO 4 , 0.05% CaCl 2 ⁇ 2H 2 O, 0.05% MgCl 2 ⁇ 6H 2 O, pH 6.0.
  • Examples of culture conditions suitable for the main culture include conditions of aeration and agitation culture at 300 rpm, 1 vvm, and 26 ° C. for 8 days. An appropriate amount of glucose may be added during the culture period. Timely cultures are collected during the main culture, and the cells are collected therefrom to prepare total RNA. For preparation of total RNA, a known method such as guanidine hydrochloride / CsCl method can be used. Poly (A) + RNA can be purified from the obtained total RNA using a commercially available kit. Furthermore, a cDNA library can be prepared using a commercially available kit.
  • the base sequence of an arbitrary clone of the prepared cDNA library can be determined using a primer designed to determine the base sequence of the insert portion on the vector to obtain an EST.
  • a primer designed to determine the base sequence of the insert portion on the vector can be determined using a primer designed to determine the base sequence of the insert portion on the vector to obtain an EST.
  • a cDNA library is prepared using the ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)
  • directional cloning can be performed.
  • genomic DNA When analyzing genomic DNA, cells of an organism having PAP activity are cultured, and genomic DNA is prepared from the cells. The base sequence of the obtained genomic DNA is determined, and the determined base sequence is assembled. A sequence encoding an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of a protein having a known PAP activity is searched from the finally obtained supercontig sequence. Primers are prepared from the hit supercontig sequences as coding for such amino acid sequences, PCR is performed using the cDNA library described above as a template, and the resulting DNA fragment is incorporated into a plasmid and cloned. Using the cloned plasmid as a template, a probe is prepared by performing PCR using the above-mentioned primers. A cDNA library is screened using the prepared probe.
  • the present invention also includes the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 1 or 6 (sometimes referred to as “the nucleotide sequence of the present invention”) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 (“A nucleic acid having a function equivalent to that of a nucleic acid containing a base sequence encoding a protein consisting of a protein consisting of “the amino acid sequence of the present invention”. “Having an equivalent function” means that the protein encoded by the base sequence of the present invention and the protein comprising the amino acid sequence of the present invention have phosphatidic acid phosphatase (PAP) activity.
  • PAP phosphatidic acid phosphatase
  • “having an equivalent function” means that when a protein encoded by the nucleotide sequence of the present invention or a protein comprising the amino acid sequence of the present invention is expressed in a PAH1-deficient strain of yeast, the phosphatidine in the defective strain.
  • the activity to improve the activity of producing diacylglycerol (DG) and / or triglyceride (TG) from acid (PA) is also included.
  • Activity to enhance the production activity of the DG and / or TG from PA in PAH1 deficient strain of PAP activity and yeast proteins of the present invention may be a Mg 2+ dependent, may be Mg 2+ -independent .
  • the activity of the protein of the invention is Mg 2+ dependent.
  • Such a nucleic acid having a function equivalent to that of the nucleic acid of the present invention includes a nucleic acid containing the base sequence described in any of the following (a) to (g).
  • the above activity of the present invention means “the activity of improving the PAP activity and / or the activity of generating DG and / or TG from PA in a PAH1-deficient strain of yeast”. "Means.
  • nucleic acid containing sequence The base sequence contained in the nucleic acid of the present invention consists of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and It includes a base sequence encoding the protein having the above activity of the present invention.
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 preferably one or several (for example, 1 to 400, 1 to 200, 1 to 130, 1 to 100) 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 2, or 1)) amino acid sequence deleted
  • amino acid sequence deleted preferably one or a plurality of amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 (preferably one or several (for example, 1 to 400, 1 to 200, 1 to 130, 1 to 100) 1 to 75, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 1 to 15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 Amino acid sequence wherein 2 or 1)) amino acid is substituted with another amino acid
  • amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 preferably one or several (for example, 1 to 400, 1 to 200, 1 to 130, 1 to 100) amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ
  • substitution is preferably a conservative substitution.
  • a conservative substitution is the replacement of a particular amino acid residue with a residue having similar physicochemical characteristics, but any substitution that does not substantially change the structural characteristics of the original sequence.
  • any substitution may be made so long as the substituted amino acid does not destroy the helix present in the original sequence or other types of secondary structures characterizing the original sequence.
  • non-natural amino acid residue may be included in the substituent, and the reversed type or the same region in which the non-substituted region is reversed in the peptidomimetic or amino acid sequence is reversed. Inverted types are also included.
  • amino acid residues are classified and exemplified for each substitutable residue, but the substitutable amino acid residues are not limited to those described below.
  • Group A leucine, isoleucine, norleucine, valine, norvaline, alanine, 2-aminobutanoic acid, methionine, O-methylserine, t-butylglycine, t-butylalanine and cyclohexylalanine
  • Group B aspartic acid, glutamic acid, isoaspartic acid, Isoglutamic acid, 2-aminoadipic acid and 2-aminosuberic acid group
  • C asparagine and glutamine group
  • D lysine, arginine, ornithine, 2,4-diaminobutanoic acid and 2,3-diaminopropionic acid group
  • E proline, 3 -Hydroxyproline and 4-hydroxyproline group
  • F serine, threonine and homos
  • one member of the above types can be exchanged with another type of member, in this case, in order to preserve the biological function of the protein of the present invention. It is preferable to consider the hydropathic index of amino acids (hydropathic amino acid index) (Kyte et al., J. Mol. Biol., 157: 105-131 (1982)).
  • amino acid substitution can be performed based on hydrophilicity.
  • the amino acid residue corresponding to the 80th amino acid in SEQ ID NO: 2 or 7 is preferably glycine.
  • the portion corresponding to the 819-823th amino acid of SEQ ID NO: 2 or the 737-741th amino acid of SEQ ID NO: 7 is preferably DXDX (T / V) (X is an arbitrary amino acid).
  • Stereoisomers of the above amino acids such as D-amino acids, unnatural amino acids such as ⁇ , ⁇ -disubstituted amino acids, N-alkyl amino acids, lactic acid, and other unconventional amino acids also constitute the protein of the present invention.
  • the protein notation used in the present specification is based on the standard usage and the notation commonly used in the art, the left direction is the amino terminal direction, and the right direction is the carboxy terminal direction.
  • the left end of a single-stranded polynucleotide sequence is the 5 'end, and the left direction of the double-stranded polynucleotide sequence is the 5' direction.
  • Those skilled in the art can design and prepare appropriate mutants of the proteins described herein using techniques known in the art. For example, in a protein molecule that can change its structure without damaging the biological activity of the protein of the present invention by targeting a region that is considered to be less important for the biological activity of the protein of the present invention. Appropriate regions can be identified. It is also possible to identify molecular residues and regions that are conserved among similar proteins. In addition, conservative amino acid substitutions are introduced into regions believed to be important for the biological activity or structure of the protein of the invention without compromising biological activity and without adversely affecting the polypeptide structure of the protein. You can also
  • N a lipin, N-terminal conserved region (pfam04571) in the Mg 2+ -dependent phosphatidic acid phosphatase (PAP1) family of enzymes.
  • PAP1 Mg 2+ -dependent phosphatidic acid phosphatase
  • the amino acid sequence of about 100 amino acids at the terminal portion is relatively well conserved.
  • DXDX (T / V) catalytic site motif which is a conserved motif of haloacid dehalogenase-like protein superfamily enzymes.
  • the DIDGT sequences (residues 819 to 823 of SEQ ID NO: 2 and residues 737 to 741 of SEQ ID NO: 7, respectively) indicated by double underlining in FIG. 5 correspond to the above motif.
  • the mutant of the present invention may be any mutant as long as the conserved motif is preserved and the activity of the present invention is not impaired. There is a report that PAP activity is lost when a mutation occurs in this conserved motif in PAP1 of yeast (J. Biol. Chem., 282 (51): 37026-37035, (2007)).
  • a person skilled in the art identifies residues of peptides that are important for the biological activity or structure of the protein of the invention and are similar to the peptides of the proteins, and compares the amino acid residues of the two peptides, A so-called structure-function study can be performed to predict which residues of a protein similar to the protein of the invention are amino acid residues corresponding to amino acid residues important for biological activity or structure. . Furthermore, by selecting a chemically similar amino acid substitution of the amino acid residue predicted in this way, a mutant that retains the biological activity of the protein of the present invention can also be selected. Those skilled in the art can also analyze the three-dimensional structure and amino acid sequence of the mutant of this protein.
  • amino acid residues predicted to be on the protein surface may be involved in important interactions with other molecules, but those skilled in the art will be able to do this based on the analysis results described above.
  • Mutants can be made that do not change the amino acid residues predicted to be on the surface of various proteins.
  • those skilled in the art can also produce mutants that substitute only one amino acid residue among the amino acid residues constituting the protein of the present invention. Such mutants can be screened by known assay methods and information on individual mutants can be collected.
  • a protein comprising an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted, or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 is “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed”. (Cold Spring Harbor Press (2001)), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons (1987-1997), Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92, Kunkel (1988) Method. Enzymol.85: 2763-6 etc. can be prepared according to the method such as site-directed mutagenesis etc. Mutations in which such mutations such as deletion, substitution or addition of amino acids have been made.
  • the body is prepared by, for example, a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio Inc.) and the like can be carried out using.
  • a mutation introduction kit using site-directed mutagenesis by a known method such as Kunkel method or Gapped duplex method, for example, QuikChange TM Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene), GeneTailor TM Site-Directed Mutagenesis System Invitrogen), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System (Mutan-K, Mutan-Super Express Km, etc .: Takara Bio Inc.) and the like can
  • a gene can be mutated as a method for introducing deletion, substitution or addition of one or more amino acids into a protein amino acid sequence while maintaining its activity. And a method of ligation after selective cleavage of a gene to remove, substitute or add selected nucleotides.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention preferably consists of an amino acid sequence in which 1 to 130 amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and PAP It is a base sequence encoding a protein having activity.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention preferably comprises an amino acid sequence in which 1 to 130 amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and A base sequence encoding a protein having the above activity is also included.
  • the number of amino acid mutations or modifications, or the site of mutation or modification in the protein of the present invention retains the activity of improving PAP activity or DG and / or TG production activity from PA in a PAH1-deficient strain of yeast. There is no limit.
  • the activity of improving the PAP activity of the present invention or the DG and / or TG production activity from PA in a PAH1-deficient strain of yeast can be measured using a known method.
  • a known method for example, reference can be made to the following document: J. Biol. Chem., 273, 143143-14338 (1998).
  • the “PAP activity” of the present invention may be measured as follows.
  • the transformed cells expressing the PAP of the present invention are crushed, the cell lysate is centrifuged, and the supernatant is recovered to obtain a crude enzyme solution.
  • the crude enzyme solution may be further purified for the PAP of the present invention.
  • the crude enzyme solution containing the PAP of the present invention or the purified PAP of the present invention is added to the reaction solution, 0.5 mM phosphatidic acid, 10 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), Reaction is carried out at 25-28 ° C. for an appropriate time, and the reaction is stopped by adding chloroform: methanol, followed by extraction of lipids, fractionation of the obtained lipids by thin layer chromatography or the like, and production of diacylglycerol The amount can be quantified.
  • the “activity for improving DG and / or TG production activity from PA in a PAH1-deficient strain of yeast” of the present invention may be measured, for example, as follows.
  • yeast Sacchariae
  • the ScPAH1 gene is disrupted to obtain a PAH1-deficient strain of yeast.
  • transformation is performed using a vector containing a nucleic acid encoding the PAP of the present invention.
  • the cells are collected by centrifuging the culture, washed with water, and lyophilized.
  • Chloroform methanol is added to the dried cells, the cells are destroyed with glass beads, and lipids are extracted with a solvent.
  • the extracted lipid is fractionated by thin layer chromatography or the like, and the amount of DG and / or TG produced is measured.
  • a PAH1-deficient strain of yeast transformed with a vector containing no nucleic acid encoding the PAP of the present invention is compared as a control.
  • the amount of DG and / or TG produced is improved when a yeast PAH1-deficient strain is transformed with a vector containing a nucleic acid encoding the PAP of the present invention, the PAP is expressed as “in a yeast PAH1-deficient strain. It is judged to have the activity of improving DG and / or TG production activity from PA.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6, and the present invention.
  • the above nucleotide sequence is prepared by preparing a probe using an appropriate fragment by a method known to those skilled in the art, and using this probe by a known hybridization method such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. And a genomic library.
  • hybridization conditions The strength of hybridization conditions is mainly determined by hybridization conditions, more preferably, hybridization conditions and washing conditions.
  • stringent conditions include moderately or highly stringent conditions.
  • moderately stringent conditions include, for example, hybridization conditions of 1 ⁇ SSC to 6 ⁇ SSC, 42 ° C. to 55 ° C., more preferably 1 ⁇ SSC to 3 ⁇ SSC, 45
  • the conditions are from 50 ° C. to 50 ° C., most preferably, 2 ⁇ SSC, 50 ° C.
  • the hybridization solution contains, for example, about 50% formamide, a temperature 5 to 15 ° C. lower than the above temperature is adopted.
  • Cleaning conditions include 0.5 ⁇ SSC to 6 ⁇ SSC, 40 ° C. to 60 ° C. During hybridization and washing, 0.05% to 0.2%, preferably about 0.1% SDS may generally be added.
  • Highly stringent conditions include hybridization and / or washing at higher temperatures and / or lower salt concentrations than moderately stringent conditions.
  • the hybridization conditions are 0.1 ⁇ SSC to 2 ⁇ SSC, 55 ° C. to 65 ° C., more preferably 0.1 ⁇ SSC to 1 ⁇ SSC, 60 ° C. to 65 ° C., most preferably , 0.2 ⁇ SSC, 63 ° C.
  • the washing conditions include 0.2 ⁇ SSC to 2 ⁇ SSC, 50 ° C. to 68 ° C., and more preferably 0.2 ⁇ SSC, 60 to 65 ° C.
  • hybridization conditions used in the present invention for example, prehybridization is performed in 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) and 50% formamide at 42 ° C., and then the probe is used. And overnight at 42 ° C. to allow hybridization, followed by washing in 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS at 65 ° C. for 20 minutes three times. It is not limited.
  • a commercially available hybridization kit that does not use a radioactive substance for the probe can be used. Specific examples include hybridization using a DIG nucleic acid detection kit (Roche Diagnostics), ECL direct labeling & detection system (Amersham).
  • the base sequence included in the present invention preferably hybridizes with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence comprising SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 under the conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C., and And a base sequence encoding a protein having PAP activity.
  • (C) a nucleic acid comprising a base sequence having 70% or more identity with the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 and comprising a base sequence encoding the protein having the above activity of the present invention.
  • the contained nucleotide sequence comprises a nucleotide sequence having at least 70% identity to the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6, and encodes a protein having the above activity of the present invention including.
  • it is at least 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more, further 95%, 98% or more with respect to the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6. % Or 99% or more) and a nucleotide sequence encoding a protein having the above activity of the present invention.
  • the percent identity between two base sequences can be determined by visual inspection or mathematical calculation, but is preferably determined by comparing the sequence information of two nucleic acids using a computer program.
  • sequence comparison computer program include the BLASTN program (Altschul et al. (Altschul et al.) Available from the website of the National Library of Medicine: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html. 1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10: Version 2.2.7, WU-BLAST 2.0 algorithm or the like. Standard default parameter settings for WU-BLAST 2.0 can be those described in the following Internet site: http://blast.wustl.edu.
  • the base sequence included in the sequence includes an amino acid sequence that is 70% or more identical to the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and includes a base sequence that encodes the protein having the activity of the present invention.
  • the protein encoded by the nucleic acid of the present invention may be a protein identical to the amino acid sequence of MaPAH1.1 or MaPAH1.2 as long as it has a function equivalent to that of the protein having the activity of the present invention.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention preferably encodes an amino acid sequence having 90% or more identity with the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and the protein having the above activity of the present invention.
  • the base sequence to be encoded More preferably, it is a base sequence that encodes an amino acid sequence having 95% or more identity with the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 and that encodes the protein having the activity of the present invention.
  • the percent identity between two amino acid sequences can be determined by visual inspection and mathematical calculation.
  • the percent identity can also be determined using a computer program.
  • Examples of such computer programs include BLAST, FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410 (1990)), ClustalW, and the like.
  • various conditions (parameters) for identity search using the BLAST program are described in Altschul et al. (Nucl. Acids. Res., 25, p. 3389-3402, 1997), and the National Center for Biotechnology Information (NCBI) ) And DNA Data Bank of Japan (DDBJ) website (BLAST Manual, Altschul et al.
  • a specific alignment scheme that juxtaposes multiple amino acid sequences can also show a match of a specific short region of the sequence, so even if there is no significant relationship between the full length sequences of the sequences used, In such a region, a region having a very high specific sequence identity can also be detected.
  • the BLAST algorithm can use the BLOSUM62 amino acid scoring matrix, but the following can be used as selection parameters: (A) Segments of query sequences with low composition complexity (Wootton and Federhen's SEG program (ComputersCompand Chemistry, 1993); Wootton and Federhen, 1996 "Analysis ofpositionalpositionbiased regions in sequence databases” Methods Enzymol., 266: 544-71 Including filters to mask segments that consist of short-period internal repeats (determined by the XNU program of Claverie and States (Computers and Chemistry, 1993)), and (B) the database Statistical significance threshold for reporting fit to sequence, or E Expected probability of fit found simply by chance, according to a statistical model of scores (Karlin and Altschul, 1990); if the statistical significance difference due to a fit is greater than the E-score threshold, this fit is not reported .
  • nucleic acid hybridizes under stringent conditions with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to a base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, and the above of the present invention
  • Nucleic acid containing a base sequence encoding a protein having activity The base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is a base sequence complementary to the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7.
  • a nucleotide sequence encoding the protein having the above activity of the present invention.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 and the hybridization conditions are as described above.
  • the nucleotide sequence contained in the nucleic acid of the present invention is a hybrid under stringent conditions with a nucleic acid comprising a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence encoding the protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7. Examples thereof include a base sequence encoding a protein that is soybean and has the above activity of the present invention.
  • nucleic acids containing the nucleotide sequences having The nucleotide sequences consisting of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 10 are genomic DNA sequences encoding MaPAH1.1 and MaPAH1.2 of the present invention, respectively.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention hybridizes with a nucleic acid comprising a base sequence complementary to the base sequence comprising SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 under stringent conditions, and the activity of the present invention
  • the above base sequence is prepared by preparing a probe using an appropriate fragment by a method known to those skilled in the art, and using this probe by a known hybridization method such as colony hybridization, plaque hybridization, Southern blotting, etc. It can be obtained from rally etc.
  • the hybridization conditions are as described above.
  • nucleic acid comprising a base sequence having an exon encoding a protein having the above activity of the present invention, the base sequence having 70% or more identity with the base sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or 10
  • the nucleotide sequence contained in the nucleic acid comprises a nucleotide sequence having at least 70% identity to the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10, and encodes the protein having the above activity of the present invention.
  • the percent identity between two base sequences can be determined as described above.
  • the genomic DNA sequence of SEQ ID NO: 5 consists of 11 exons and 10 introns, and the exon regions are the first to 182nd, 370 to 584th, 690 to 1435th, 1536 to 1536 of SEQ ID NO: 5.
  • 1856th, 1946th to 2192nd, 2292th to 2403th, 2490th to 2763th, 2847th to 3077th, 3166th to 3555th, 3648th to 3862th, 3981th to 5034th is there.
  • the genomic DNA sequence of SEQ ID NO: 10 consists of 8 exons and 7 introns, and the exon regions are 1st to 454th, 674 to 1006th, 1145 to 1390th, 1479th to 1479th of SEQ ID NO: 10. 1583, 1662 to 1804th, 1905 to 2143th, 2243 to 3409th, 3520 to 4552th.
  • the nucleotide sequence contained in the nucleic acid of the present invention is a genomic DNA sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10, and the nucleotide sequence of the intron region is relative to the sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence of the exon region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more) relative to the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10. %, More preferably 90% or more, further 95% or more, 98% or more, 99% or more), and an exon encoding a protein having the above activity of the present invention.
  • the base sequence which has is mentioned.
  • the base sequence contained in the nucleic acid of the present invention is the genomic DNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10
  • the base sequence of the exon region is the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10.
  • nucleotide sequence of the intron region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 (for example, 85% or more, more preferably 90% or more, further 95% or more, 98% or more, 99% or more), and the intron region can be removed by splicing,
  • region connects and has the said activity of this invention by these is mentioned.
  • nucleotide sequence contained in the nucleic acid of the present invention is the genomic DNA sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10
  • nucleotide sequence of the intron region is the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10.
  • the base sequence of the exon region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more (for example, 85% or more, even more preferably 90% or more, further 95% or more, 98% or more, 99% or more)
  • the base sequence of the exon region is at least 70% or more, preferably 75% or more, more preferably 80% or more with respect to the sequence shown in SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 (for example, 85% or more, more preferably 90% or more, further 95% or more, 98% or more, 99% or more) Seen, and intron regions by splicing are possible desorption, it exon region linked by encodes a protein having the above activity of the present invention, the base sequence.
  • the percent identity between two base sequences can be determined by the method described above.
  • nucleic acid of the present invention comprises a base sequence in which one or more bases are deleted, substituted or added in the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6, and has the above-described activity of the present invention.
  • Nucleic acids containing a base sequence encoding a protein are also included.
  • nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 preferably one or several (eg, 1-1000, 1-1000, 1-750, 1-500) 1 to 400, 1 to 300, 1 to 250, 1 to 200, 1 to 150, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20 , 1-15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1))
  • nucleotide sequences shown in SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 preferably one or several (eg, 1-1000, 1-1000, 1-750, 1-500) 1 to 400, 1 to 300, 1 to 250, 1 to 200, 1 to 150, 1 to 100, 1 to 50, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20 1 to 15, more preferably 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1)
  • a base sequence substituted with another base preferably one or more (preferably one or several (for example, 1-1,200, 1-
  • a preferred embodiment of the nucleic acid of the present invention includes a nucleic acid containing a fragment of the base sequence described in any of the following (a) to (d).
  • (c) represented by SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 9 Base sequence
  • A a base sequence represented by SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6,
  • b a base sequence encoding a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7,
  • c SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 9
  • the base sequence represented by is as described in Table 1.
  • the base sequence represented by SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 is also as described above. Fragments of the above sequence include ORFs, CDSs, biologically active regions, regions used as primers as described below, and regions that can be used as probes, and are naturally derived. Or may be artificially produced.
  • the nucleic acids of the present invention also include the following nucleic acids.
  • nucleic acid according to any one of the following (a) to (g).
  • A a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7
  • B SEQ ID NO: 1
  • c at least 70% identical to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6
  • D a nucleic acid containing a base sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence 70% or more identical to the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7
  • Complementary to the base sequence encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 Nucleic acid that hybridizes
  • nucleic acid according to (1) which is any of the following (a) to (g): (A) a nucleic acid comprising a base sequence encoding a protein consisting of an amino acid sequence in which 1 to 130 amino acids have been deleted, substituted or added in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 (b) SEQ ID NO: 1 Or a nucleic acid that hybridizes with a nucleic acid complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 6 with 2 ⁇ SSC at 50 ° C.
  • nucleic acid having a base sequence complementary to the base sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10 under conditions of 2 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • Nucleic acid (g) Nucleic acid comprising a nucleotide sequence consisting of a nucleotide sequence having 90% or more identity with the nucleotide sequence consisting of SEQ ID NO: 5 or SEQ ID NO: 10
  • the phosphatidic acid phosphatase protein of the present invention includes a protein comprising the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 and a protein having a function equivalent to that of the protein, It may be artificially produced.
  • the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or 7 is as described above.
  • the “protein having an equivalent function” means a protein having “the above activity of the present invention” as described in the section “Nucleic acid encoding the phosphatidic acid phosphatase of the present invention” above.
  • examples of the protein having the same function as the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 include the proteins described in either of the following (a) or (b).
  • an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7, or an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 Is as described above in the section “Nucleic acid encoding phosphatidic acid phosphatase of the present invention”.
  • the “protein having the activity of the present invention” is a variant of a protein encoded by a nucleic acid containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6, or the amino acid shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7.
  • Proteins in which one or more amino acids in the sequence are mutated by many types of modifications such as substitution, deletion or addition, modified proteins whose amino acid side chains are modified, or fusion proteins with other proteins
  • a protein having an activity of improving PAP activity and / or diacylglycerol (DG) and / or triglyceride (TG) generation activity from phosphatidic acid (PA) in a PAH1-deficient strain of yeast is also included.
  • the protein of the present invention may be artificially prepared.
  • chemical synthesis such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method), tBoc method (t-butyloxycarbonyl method), etc. It can also be manufactured by the law.
  • Chemical synthesis using peptide synthesizers such as Advanced Chemtech, PerkinElmer, Pharmacia, Protein Technology Instruments, Syntheselvega, Perceptive, Shimadzu, etc. You can also.
  • the protein of the present invention also includes the following proteins.
  • (1) (a) a protein consisting of an amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 (b) identical to the amino acid sequence consisting of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 A protein comprising an amino acid sequence having a sex of 80% or more (2) The protein according to any one of the following (a) and (b).
  • A a protein comprising an amino acid sequence in which 1 to 200 amino acids have been deleted, substituted or added in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 (b) identity with the amino acid sequence comprising SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 7 % Protein consisting of amino acid sequences
  • the PAP nucleic acid of the present invention can be cloned, for example, by screening from a cDNA library using an appropriate probe. Moreover, it can clone by amplifying by PCR reaction using a suitable primer, and ligating to a suitable vector. Furthermore, it can be subcloned into another vector.
  • plasmids such as pBlue-Script TM SK (+) (Stratagene), pGEM-T (Promega), pAmp (TM: Gibco-BRL), p-Direct (Clontech), pCR2.1-TOPO (Invitrogene) Vectors can be used.
  • pBlue-Script TM SK (+) (Stratagene)
  • pGEM-T Promega
  • pAmp TM: Gibco-BRL
  • p-Direct Clontech
  • pCR2.1-TOPO Invitrogene
  • any part of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 or the like can be used as a primer.
  • NotI-PAH1-1-F 5′-GCGGCCGCATGCAGTCCGTGGGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
  • MaPAH1-1-10R 5′-TTCTTGAGTAGCTGCTGTTGTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 16), Etc.
  • the above primer, DNA polymerase and the like are allowed to act on cDNA prepared from M. alpina cells to carry out a PCR reaction.
  • the above method can be easily carried out by those skilled in the art according to “Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.” (Cold Spring Harbor Press (2001)), etc. For example, the following conditions can be given. Denaturation temperature: 90-95 ° C Annealing temperature: 40-60 °C Elongation temperature: 60-75 ° C Number of cycles: 10 times or more
  • a known method can be used to purify the obtained PCR product.
  • a kit such as GENECLEAN, QIAquick) PCR purification Kits (QIAGEN), ExoSAP-IT (GE Healthcare Bioscience), a method using DEAE-cellulose filter paper, a method using a dialysis tube, and the like.
  • GENECLEAN, QIAquick PCR purification Kits
  • ExoSAP-IT GE Healthcare Bioscience
  • DEAE-cellulose filter paper a method using DEAE-cellulose filter paper
  • a method using a dialysis tube and the like.
  • the base sequence of the cloned nucleic acid can be determined using a base sequencer.
  • the present invention also provides a recombinant vector containing a nucleic acid encoding the PAP of the present invention.
  • the present invention further provides a transformant transformed with the above recombinant vector.
  • Such a recombinant vector and transformant can be obtained as follows. That is, a plasmid having a nucleic acid encoding the PAP of the present invention is digested with a restriction enzyme. Examples of restriction enzymes used include, but are not limited to, EcoRI, KpnI, BamHI, and SalI. The ends may be smoothed by treating with T4 polymerase. The digested DNA fragment is purified by agarose gel electrophoresis. A PAP expression vector can be obtained by incorporating this DNA fragment into an expression vector using a known method. This expression vector is introduced into a host to produce a transformant and used for expression of the target protein.
  • a restriction enzyme include, but are not limited to, EcoRI, KpnI, BamHI, and SalI.
  • the ends may be smoothed by treating with T4 polymerase.
  • the digested DNA fragment is purified by agarose gel electrophoresis.
  • a PAP expression vector can be obtained by incorporating this DNA fragment
  • the expression vector and the host are not particularly limited as long as the target protein can be expressed, and examples of the host include fungi, bacteria, plants, animals, or cells thereof.
  • fungi include filamentous fungi such as M. alpina, which are lipid-producing bacteria, and yeasts such as Saccharomyces cerevisiae.
  • bacteria include Escherichia coli and Bacillus subtilis.
  • plants include oil plants such as rapeseed, soybean, cotton, safflower and flax.
  • a strain described in MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265 (1992) can be used, and specifically, a Mortierella genus.
  • the nucleic acid of the present invention is preferably capable of autonomous replication in the host or has a structure that can be inserted into the chromosome of the fungus.
  • a structure including a promoter and a terminator is preferable.
  • examples of expression vectors include pD4, pDuraSC, pDura5 and the like.
  • the promoter any promoter that can be expressed in the host may be used. For example, histonH4.1 gene promoter, GAPDH (glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) gene promoter, TEF (Translation elongation factor) gene A promoter derived from M. alpina such as a promoter is used.
  • Examples of methods for introducing a recombinant vector into filamentous fungi such as M. alpina include electroporation, spheroplast, particle delivery, and direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • a transformed strain can be obtained by selecting a strain that grows on a selective medium lacking the nutrient.
  • a drug resistance marker gene is used for transformation, cell colonies exhibiting drug resistance can be obtained by culturing in a selective medium containing the drug.
  • yeast When yeast is used as a host, examples of expression vectors include pYE22m. Commercially available yeast expression vectors such as pYES (Invitrogen) and pESC (STRATAGENE) may also be used. Suitable hosts for the present invention include, but are not limited to, Saccharomyces cerevisiae EH13-15 (trp1, MAT ⁇ ). As the promoter, for example, promoters derived from yeast such as GAPDH promoter, gal1 promoter, gal10 promoter, etc. are used.
  • Examples of the method for introducing a recombinant vector into yeast include lithium acetate method, electroporation method, spheroplast method, dextran mediated transfection, calcium phosphate precipitation, polybrene mediated transfection, protoplast fusion, polynucleotide in liposome ( Singular or plural) encapsulation, and direct microinjection of DNA into the nucleus.
  • examples of the expression vector include Pharmacia pGEX and pUC18.
  • the promoter for example, a promoter derived from Escherichia coli, phage or the like, such as trp promoter, lac promoter, PL promoter, PR promoter or the like is used.
  • an electroporation method or a calcium chloride method can be used as a method for introducing a recombinant vector into bacteria.
  • the present invention provides a method of producing a fatty acid composition from the transformant. That is, it is a method for producing a fatty acid composition from a culture obtained by culturing the transformant.
  • a fatty acid composition is a composition comprising an aggregate of one or more fatty acids.
  • the fatty acid may be a free fatty acid or may exist as a lipid containing a fatty acid such as triglyceride or phospholipid.
  • the fatty acid composition of the present invention can be produced by the following method. However, the production method is not limited to this method, and can be carried out using other generally known methods.
  • a medium used for culturing organisms expressing PAP has a suitable pH and osmotic pressure, and contains a nutrient solution necessary for the growth of each host, trace components, and biological materials such as serum and antibiotics ( Any culture solution can be used as long as it is a medium.
  • a nutrient solution necessary for the growth of each host, trace components, and biological materials such as serum and antibiotics ( Any culture solution can be used as long as it is a medium.
  • yeast is transformed to express PAP
  • SC-Trp medium, YPD medium, YPD5 medium and the like can be used, but are not limited thereto.
  • SC-Trp medium is exemplified as a specific medium composition: Yeastgnitro base w / o amino acids (DIFCO) 6.7g, glucose 20g, amino acid powder (1.25g of adenine sulfate, 0.6g of arginine per liter) Aspartic acid 3 g, Glutamic acid 3 g, Histidine 0.6 g, Leucine 1.8 g, Lysine 0.9 g, Methionine 0.6 g, Phenylalanine 1.5 g, Serine 11.25 g, Tyrosine 0.9 g, Valine 4.5 g, Threonine 6 g , Mixed with 0.6 g of uracil) 1.3 g.
  • DIFCO Yeastgnitro base w / o amino acids
  • the culture conditions may be any conditions as long as they are suitable for the growth of the host and are suitable for keeping the produced enzyme stable. Specifically, anaerobic degree, culture time, temperature, humidity, static Individual conditions such as stationary culture or shaking culture can be adjusted.
  • the culture method may be culture under the same conditions (one-stage culture), or so-called two-stage culture or three-stage culture using two or more different culture conditions, but in the case of mass culture, the culture efficiency is good. Two-stage culture is preferred.
  • the method for producing a fatty acid composition of the present invention can be performed as follows.
  • a pre-culture colonies of the transformant are inoculated into the above SC-Trp medium or the like and subjected to shaking culture at 30 ° C. for 2 days.
  • 500 ⁇ l of a preculture solution is added to 10 ml of YPD5 (2% yeast extract, 1% polypeptone, 5% glucose) medium, and shake culture is performed at 30 ° C. for 2 days.
  • the present invention also provides a fatty acid composition that is an aggregate of one or more fatty acids in cells in which the PAP of the present invention is expressed.
  • a fatty acid composition obtained by culturing a transformant in which the PAP of the present invention is expressed.
  • the fatty acid may be a free fatty acid or may exist in the form of a lipid containing a fatty acid such as triglyceride or phospholipid.
  • the fatty acid contained in the fatty acid composition of the present invention refers to a long-chain carbohydrate chain or branched monocarboxylic acid, such as myristic acid (tetradecanoic acid) (14: 0), myristoleic acid (tetradecenoic acid).
  • the fatty acid composition of the present invention may be a composition comprising any number and any kind of fatty acids as long as it is a combination of one or more of the above fatty acids.
  • the foodstuff etc. which contain the fatty acid composition of this invention Moreover, this invention provides the foodstuff containing the said fatty acid composition.
  • the fatty acid composition of the present invention can be used for applications such as production of foods containing fats and oils, industrial raw materials (raw materials such as cosmetics, pharmaceuticals (for example, topical drugs for skin), soaps) according to conventional methods.
  • Examples of the dosage form of the cosmetic (composition) or medicine (composition) include, but are not limited to, any dosage form such as solution, paste, gel, solid, and powder.
  • a form of food such as a capsule, or a natural liquid food in which the fatty acid composition of the present invention is mixed with protein, saccharide, fat, trace element, vitamins, emulsifier, fragrance, etc., semi-digested Processing forms such as state nutrition foods, ingredient nutrition foods, drinks, enteral nutrients and the like can be mentioned.
  • examples of the food of the present invention include, but are not limited to, nutritional supplements, health foods, functional foods, infant foods, infant formulas, premature infant formulas, and elderly foods.
  • food refers to a generic term for solids, fluids, liquids, and mixtures thereof that can be consumed.
  • Nutritional supplements are foods that are enriched with specific nutritional ingredients.
  • the health food refers to food that is considered healthy or healthy, and includes nutritional supplements, natural foods, diet foods, and the like.
  • Functional food means food for supplementing nutritional components that fulfill the body's regulatory functions, and is synonymous with food for specified health use.
  • Infant food refers to food for children up to about 6 years old.
  • the food for the elderly refers to food that has been processed so that it can be easily digested and absorbed as compared to untreated food.
  • Infant formula refers to formula for feeding to children up to about 1 year old.
  • Premature infant formula refers to formula that is given to premature infants until about 6 months after birth.
  • These foods include natural foods such as meat, fish and nuts (treated with oils and fats); foods to which fats and oils are added when cooking Chinese food, ramen, soup, etc .; tempura, fries, fried chicken, fried rice, donuts, sugar sugar, etc. Foods that use fats and oils as a heat medium for cooking; fats and oils such as butter, margarine, mayonnaise, dressing, chocolate, instant ramen, caramel, biscuits, cookies, cakes, ice cream, etc. or processed foods with added fat during processing; The food etc. which sprayed or apply
  • lifted can be mention
  • the food of the present invention is not limited to foods containing fats and oils, such as bread, noodles, rice, confectionery (candy, chewing gum, gummi, tablet confectionery, Japanese confectionery), tofu and processed products thereof.
  • Agricultural foods such as sake, medicinal liquor, mirin, vinegar, soy sauce and miso; livestock foods such as yogurt, ham, bacon and sausage; Beverages, alcoholic beverages, tea, etc. are listed.
  • the present invention is also a method for evaluating or selecting a lipid-producing bacterium using the nucleic acid encoding PAP of the present invention or PAP protein.
  • I will provide a. Specifically, it is as follows.
  • Evaluation method As one embodiment of the present invention, a method for evaluating lipid-producing bacteria using the nucleic acid or PAP protein encoding the PAP of the present invention can be mentioned.
  • Examples of the evaluation method of the present invention include a method for evaluating the activity of the present invention of a lipid-producing strain as a test strain using a primer or probe designed based on the base sequence of the present invention.
  • a general method of such an evaluation method is known and described in, for example, International Patent Application Pamphlet WO01 / 040514, Japanese Patent Application Laid-Open No. 8-205900, and the like. Hereinafter, this evaluation method will be briefly described.
  • the genome of the test strain is prepared.
  • any known method such as Hereford method or potassium acetate method can be used (see, for example, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)).
  • a primer or probe is designed based on the base sequence of the present invention, preferably SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6. Any part of the base sequence of the present invention can be used as the primer or probe, and the design thereof can be performed using a known method.
  • the number of bases of the polynucleotide used as a primer is usually 10 bases or more, preferably 15 to 25 bases. In addition, the number of bases in the sandwiched portion is usually 300 to 2000 bases.
  • the primer or probe prepared above it is examined whether or not the base sequence of the present invention and a specific sequence are present in the genome of the test strain.
  • the base sequence of the present invention and the specific sequence can be detected using a known method.
  • a polynucleotide containing a part or all of a specific sequence in the base sequence of the present invention or a polynucleotide containing a base sequence complementary to the above base sequence is used as one primer, and this sequence is used as the other primer.
  • Amplification of nucleic acid of test strain by, for example, PCR method using polynucleotide containing part or all of upstream or downstream sequence, or polynucleotide containing base sequence complementary to the above base sequence Then, the presence or absence of the amplified product, the size of the molecular weight of the amplified product, and the like can be measured.
  • Reaction conditions of the PCR method suitable for the method of the present invention are not particularly limited, and examples thereof include the following conditions. Denaturation temperature: 90-95 ° C Annealing temperature: 40-60 °C Elongation temperature: 60-75 ° C Cycle number: Conditions such as 10 times or more.
  • the obtained reaction product can be separated by electrophoresis using an agarose gel or the like, and the molecular weight of the amplified product can be measured. Thereby, the activity of the present invention of the test strain is predicted or evaluated by confirming whether the molecular weight of the amplified product is a size including a nucleic acid molecule corresponding to a region specific to the base sequence of the present invention. Can do. Further, by analyzing the base sequence of the amplification product by the above method or the like, the activity of the present invention can be predicted or evaluated more accurately. The method for evaluating the activity of the present invention is as described above.
  • the test strain is cultured by measuring the expression level of PAP encoded by the base sequence of the present invention such as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6, etc.
  • the activity of the invention can also be evaluated.
  • the expression level of PAP can be measured by culturing the test strain under suitable conditions and quantifying the PAP mRNA or protein. Quantification of mRNA or protein can be performed using a known method. For example, mRNA quantification can be performed by Northern hybridization or quantitative RT-PCR, and protein quantification can be performed by, for example, Western blotting (Current Protocols in Molecular Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).
  • the test strain is cultured, the expression level of PAP encoded by the base sequence of the present invention such as SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 6 is measured, and the strain having the desired expression level is obtained.
  • a strain having a desired activity can be selected.
  • a reference strain is set, each of the reference strain and the test strain is cultured, the expression level of each strain is measured, the reference strain and the test strain are compared, and the desired strain is determined. You can also choose.
  • the reference strain and the test strain are cultured under appropriate conditions, the expression level of each strain is measured, and the test strain has a higher or lower expression than the reference strain.
  • a strain having a desired activity can be selected. Examples of the desired activity include a method of measuring the expression level of PAP and the composition of the fatty acid composition produced by PAP as described above.
  • a test strain having a desired activity can be selected by culturing a test strain and selecting a strain having a high or low activity of the present invention.
  • the desired activity include a method of measuring the expression level of PAP and the composition of the fatty acid composition produced by PAP as described above.
  • test strains or reference strains include strains into which the above-described vector of the present invention has been introduced, strains in which the expression of the nucleic acid of the present invention has been suppressed, strains that have been subjected to mutation treatment, naturally-mutated strains, etc. Although it can be used, it is not limited to these.
  • the above activity of the present invention can be measured, for example, by the method described in the item “Nucleic acid encoding phosphatidic acid phosphatase of the present invention” in the present specification.
  • mutation treatment examples include physical methods such as ultraviolet irradiation and radiation irradiation, and chemical methods using chemical treatment such as EMS (ethyl methanesulfonate) and N-methyl-N-nitrosoguanidine (for example, Oshima). Edited by Taiji, see Biochemical Experimental Method 39, Yeast Molecular Genetics Experimental Method, p.67-75, Academic Publishing Center, etc.).
  • EMS ethyl methanesulfonate
  • N-methyl-N-nitrosoguanidine for example, Oshima
  • examples of the strain used as the reference strain or test strain of the present invention include, but are not limited to, the above lipid-producing bacteria and yeasts.
  • the reference strain and the test strain may be used in combination with any strain belonging to different genera or species, and one or more strains may be used simultaneously as the test strain.
  • Example 1 Genomic analysis of M. alpina M. alpina 1S-4 strain was inoculated into 100 ml of GY2: 1 medium (2% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0) and shaken at 28 ° C. for 2 days. Cultured. The cells were collected by filtration, and genomic DNA was prepared using DNeasy (QIAGEN).
  • the base sequence of the genomic DNA was determined using Roche 454 GS GS FLX Standard. At that time, the base sequence of the fragment library was determined for 2 runs, and the base sequence of the mate pair library was determined for 3 runs. By assembling the obtained base sequences, 300 super tigs were obtained.
  • Example 2 Synthesis of cDNA and preparation of cDNA library M. alpina 1S-4 strain was inoculated into 100 ml of medium (1.8% glucose, 1% yeast extract, pH 6.0) at 28 ° C for 4 days. Cultured with shaking. The cells were collected by filtration, and total RNA was prepared by the guanidine hydrochloride / CsCl method.
  • cDNA was synthesized by reverse transcription reaction using random hexamers by SuperScript II RT (Invitrogen).
  • poly (A) + RNA was purified from total RNA using Oligotex-dT30 ⁇ Super> mRNA Purification Kit (Takara Bio).
  • a cDNA library was prepared using ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE).
  • Example 3 Search for PAH1 homologue derived from S. cerevisiae
  • the amino acid sequence of PAH1 (YMR165C) (sometimes referred to as ScPAH1 in this specification), which is one of the genes responsible for the PAP1 activity of Saccharomyces cerevisiae
  • the tblastn analysis was performed on the genomic base sequence of the 1S-4 strain. As a result, a super contig containing the sequences shown in SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 10 was hit.
  • the gene according to SEQ ID NO: 5 was named MaPAH1.1
  • the gene according to SEQ ID NO: 10 was named MaPAH1.2.
  • Example 4 Cloning of MaPAH1.1 and MaPAH1.2 (1) Preparation of probe In order to clone cDNAs of MaPAH1.1 gene and MaPAH1.2 gene, SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 10 and the previous BLAST The following primers were prepared from the analysis results.
  • MaPAH1-1-3F 5′-CGCCAATACATTGACGTTTTCAG-3 ′ (SEQ ID NO: 11)
  • MaPAH1-1-5R 5′-AGTTCCAGTCATTGAACTCGGGTGC-3 ′
  • MaPAH1-2-3F 5′-GAGCCCAGTTGACCTTTGAGGCATTC-3 ′
  • MaPAH1-2-5R 5′-CACTGAGAACGAGACCGTGTTGGCG-3 ′ (SEQ ID NO: 14)
  • PCR-MaPAH1.1-P is a plasmid having the nucleotide sequence 2352-3010 of SEQ ID NO: 4 obtained by the former primer combination and 1615-2201 of SEQ ID NO: 9 obtained by the latter primer combination.
  • the plasmid having the second base sequence was designated as pCR-MaPAH1.2-P.
  • probes were prepared by PCR using these plasmids as templates and the above primers.
  • ExTaq (Takara Bio) was used, but instead of the attached dNTP mix, a PCR labeling mix (Roche Diagnostics) was used to prepare a probe in which the amplified DNA was labeled with digoxigenin (DIG), MaPAH1.1 probe and MaPAH1.2 probe were used.
  • DIG digoxigenin
  • MaPAH1.1 probe MaPAH1.2 probe were used.
  • Each of these cDNA libraries was screened using these probes.
  • Hybridization conditions are as follows. Buffer: 5 ⁇ SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50% formamide; Temperature: 42 ° C. (overnight); Washing conditions: 0.2 ⁇ SSC, 0.1% SDS solution (65 ° C.), 20 minutes ⁇ 3 times;
  • Plasmids were excised from the phage clones obtained by screening by in vivo excitation to obtain each plasmid DNA.
  • the plasmid with the longest insert length contains the sequence from the 1307th sequence of SEQ ID NO: 4 and was named plasmid pB-MaPAH1.1p.
  • this plasmid pB-MaPAH1.1p was considered not to contain the region encoding the N-terminus of PAH1.1.
  • NotI-PAH1-1-F 5′-GCGGCCGCATGCAGTCCGTGGGAAG-3 ′ (SEQ ID NO: 15)
  • MaPAH1-1-10R 5′-TTCTTGAGTAGCTGCTGTTGTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 16)
  • the plasmid with the longest insert length contained the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 9.
  • this plasmid was considered to have a cDNA containing the full-length ORF of MaPAH1.2.
  • This plasmid was designated as pB-MaPAH1.2 cDNA.
  • the cDNA sequence (SEQ ID NO: 4) of the MaPAH1.1 gene includes CDS (SEQ ID NO: 3) consisting of the first to 3987th base sequences, ORF consisting of the first to 3984th base sequences (sequences) Number 1) was included.
  • the deduced amino acid sequence encoded by the MaPAH1.1 gene is shown in SEQ ID NO: 2.
  • the genomic sequence and ORF sequence of the MaPAH1.1 gene were compared (FIG. 1).
  • the genomic sequence of the MaPAH1.1 gene was considered to consist of 11 exons and 10 introns.
  • the cDNA sequence (SEQ ID NO: 9) of the MaPAH1.2 gene includes CDS (SEQ ID NO: 8) consisting of the base sequence of the 72nd-3791st and ORF consisting of the base sequence of the 72nd-3788th (SEQ ID NO: 6).
  • CDS SEQ ID NO: 8
  • ORF base sequence of the 72nd-3788th
  • the deduced amino acid sequence encoded by the MaPAH1.2 gene is shown in SEQ ID NO: 7.
  • the genomic sequence and ORF sequence of the MaPAH1.2 gene were compared (FIG. 2).
  • the genomic sequence of the MaPAH1.2 gene consisted of 8 exons and 7 introns.
  • the identity of the amino acid sequence of the ScPAH1 protein whose function has been analyzed and the amino acid sequences of MaPAH1.1 and MaPAH1.2 derived from M. alpina of the present invention are 22.7%, It was 22.5%.
  • the amino acid sequences of MaPAH1.1 and MaPAH1.2 derived from M. alpina of the present invention were compared with those of known ScPAH1 and mouse Lipin (FIG. 5).
  • the amino acid sequence of the N-terminal part is well conserved and is called lipin, N-terminal conserved region (pfam04571). Also in MaPAH1.1 and MaPAH1.2 derived from M.
  • the known enzyme and the N-terminal portion were relatively well preserved.
  • the DIDGT sequence indicated by a double underline in FIG. 5 is identical to the motif of the DXDX (T / V) catalytic site conserved in haloacid dehalogenase (HAD) -like protein superfamily enzymes. I did it.
  • Example 5 Expression of MaPAH1.1 and MaPAH1.2 in yeast Construction of expression vectors for MaPAH1.1 and MaPAH1.2: In order to express MaPAH1.1 in yeast, an expression vector was constructed as follows.
  • yeast expression vector pYE22m (Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995) was digested with the restriction enzyme EcoRI, followed by blunting with blunting Kit (Takara Bio). Subsequently, this was linked to Linker, pNotI, Phosphorylated (8mer) (Takara Bio) using ligation high (Toyobo), and the resulting vector was designated as vector pYE22mN.
  • the vector pYE22mN was digested with restriction enzymes NotI and KpnI, and the plasmid pB-MaPAH1.1 cDNA was digested with restriction enzymes NotI and KpnI to ligate the approximately 4.2 kbp DNA fragment to obtain plasmid pYE-MaPAH1.1. It was.
  • the vector pYE22mN was digested with restriction enzymes NotI and KpnI
  • the plasmid pB-MaPAH1.2cDNA was digested with restriction enzymes NotI and KpnI, and an approximately 3.8 kbp DNA fragment was ligated to obtain plasmid pYE-MaPAH1.2.
  • S. cerevisiae ⁇ Scpah1 URA3 strain: In order to clone the ScPAH1 gene derived from S. cerevisiae S288C strain, the following primers were prepared.
  • Primer KpnI-PAH1-F 5′-GGTACCATGCAGTACGTAGGCAGAGCTC-3 ′ (SEQ ID NO: 17)
  • Primer XhoI-PAH1-R 5′-CTCGAGTTAATCTTCGAATTCATCTTCG-3 ′ (SEQ ID NO: 18) S.
  • YPD yeast extract 2%, polypeptone 1%, glucose 2%) liquid medium
  • Gen Torkun for yeast
  • the obtained DNA fragment of about 2.5 kbp was cloned using TOPO TA cloning Kit, and a clone having the correct base sequence was designated as pCR-ScPAH1.
  • SC-Ura per liter, Yeast nitrogen base w / o amino acids (DIFCO) 6.7 g, glucose 20 g, amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine 0.6 g, aspartic acid 3 g) , Glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, leucine 1.8 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, phenylalanine 1.5 g, serine 11.25 g, tyrosine 0.9 g, valine 4.5 g, threonine 6 g, tryptophan 1.
  • DIFCO Yeast nitrogen base w / o amino acids
  • ⁇ Scpah1 URA3 strain as a host, transformed with plasmids pYE22m, pYE-MaPAH1.1, pYE-MaPAH1.2, respectively, SC-Ura, Trp (Yeast nitrogen base w / o amino acids per liter (DIFCO 6.7 g, glucose 20 g, amino acid powder (adenine sulfate 1.25 g, arginine 0.6 g, aspartic acid 3 g, glutamic acid 3 g, histidine 0.6 g, leucine 1.8 g, lysine 0.9 g, methionine 0.6 g, 1.5 g of phenylalanine, 11.25 g of serine, 0.9 g of tyrosine, 4.5 g of valine, 6 g of threonine) 1.3 g, agar medium (2% agar)) transformation of strain that can grow on agar medium As selected.
  • DIFCO 6.7
  • any two strains control strains transformed with plasmid pYE22m were C1, C2, and strains transformed with plasmid pYE-MaPAH1.1 were MaPAH1.1-1, MaPAH1. .1-2, strains transformed with plasmid pYE-MaPAH1.2 (MaPAH1.2-1, MaPAH1.2-2) were used for the following experiments.
  • Example 6 Measurement of Mg 2+ -dependent phosphatidic acid phosphatase activity (PAP1 activity)
  • PAP1 activity Mg 2+ -dependent phosphatidic acid phosphatase activity
  • buffer A 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.3 M sucrose, 10 mM mercaptoethanol, 0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
  • PMSF phenylmethylsulfonyl fluoride
  • PAP1 activity was measured as follows by modifying the method of Gil-Soo et al. (J. Biol. Chem., 282 (51), 37026-37035, (2007)). Since S. cerevisiae cannot synthesize linoleic acid, 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate (18: 2-PA) was used as a substrate for PAP.
  • the reaction solution was 500 ⁇ L, and the composition was 100 ⁇ L of crude enzyme solution, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 ⁇ g / ml 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate, Monosodium Salt (Avanti Polar Lipids, Inc.
  • the diacylglycerol (DG) fraction was scraped and the fatty acid was derived into a methyl ester by the hydrochloric acid methanol method. Subsequently, fatty acid methyl ester was extracted with hexane, and hexane was distilled off, followed by analysis by gas chromatography.
  • DG diacylglycerol
  • Table 2 shows the amount of linoleic acid transferred into the DG fraction per crude enzyme solution protein.
  • MaPAH1.1-1 and MaPAH1.1-2 that expressed MaPAH1.1 were approximately three times, and MaPAH1 that expressed MaPAH1.2. .2-1, MaPAH1.2-2 had approximately 1.2 times the activity of converting 18: 2-PA to dilinolein (18: 2-DG). This suggested that MaPAH1.1 and MaPAH1.2 have PAP activity.
  • the reaction was performed as follows. That is, the reaction solution was 500 ⁇ L, and the composition was 100 ⁇ L of crude enzyme solution, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 ⁇ g / ml 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate, Monosodium Salt (Avanti Polar Lipids, Inc.) 2 mM EDTA, 10 mM 2-mercaptoethanol, and other than that, the reaction was performed in the same manner as described above, and the analysis was performed. Table 3 shows the amount of linoleic acid transferred into the DG fraction per crude enzyme solution protein.
  • Triacylglycerol (also referred to herein as triglyceride, TG), which is a storage lipid, is obtained by further acylating diacylglycerol, which is a product of PAP protein.
  • TG Triacylglycerol
  • the above transformant using yeast lacking ScPAH1 as a host was inoculated into 10 ml of SD-Ura, Trp liquid medium, and statically cultured at 30 ° C. for 3 days.
  • the cells were collected by centrifuging the culture solution, washed with water, and lyophilized.
  • Chloroform methanol (2: 1) was added to the dried cells, and the cells were repeatedly crushed with glass beads, and lipids were extracted with a total amount of 8 ml of solvent. In the same manner as described above, after fractionation by TLC, the TG fraction was scraped and analyzed. The results are shown in Table 4.
  • the high expression strain of MaPAH1.1 was able to produce TG about 1.5 times that of the control, and the high expression strain of MaPAH1.2 was about 1.2 times.
  • Example 8 Substrate specificity of MaPAH1.1 and MaPAH1.2 ⁇ Scpah1: URA3 strain was used as a host, and transformed with plasmids pYE22m, pYE-MaPAH1.1, and pYE-MaPAH1.2, respectively. Four arbitrary strains for each transformant were subjected to the following experiment. A strain transformed with plasmid pYE22m was used as a control.
  • Each yeast transformant was inoculated into 10 ml of SC-Ura, Trp liquid medium, and cultured at 27.5 ° C. overnight.
  • the obtained culture broth was inoculated in a volume of 1/10 to 40 ml of SC-Ura and Trp liquid medium, and each was inoculated and cultured at 27.5 ° C. for 2 days.
  • a crude enzyme solution was prepared in the same manner as described in Example 6, and the protein concentration was measured.
  • PAP1 activity was determined by using 1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate (18: 2-PA) and 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphate (18: 1-PA) as PAP substrates. The measurement was performed in the same manner as described in Example 6 except that it was used.
  • Mortierella-derived MaPAH1.1 and MaPAH1.2 showed 1.9 times and 1.3 times the activity of the control, respectively.
  • MaPAH1.1 showed an activity 1.9 times that of the control
  • MaPAH1.2 showed an activity 1.1 times that of the control.
  • 18: 1 is a fatty acid originally possessed by yeast, it originally exists in the DG of the crude enzyme solution.
  • 18: 1 amount in DG in the crude enzyme solution when no substrate was added. Therefore, the difference between MaPAH1.1 and MaPAH1.2 shown in Table 6 and the control can be presumed to be the observation of the effect on 18: 1-PA added as a substrate.
  • MaPAH1.1 increases 1.9 times both 18: 1 and 18: 2 compared to the control.
  • MaPAH1.2 increased 18: 1 by 1.1 times compared to control and 18: 2 by 1.3 times compared with control. This means that MaPAH1.1 exerts its activity to the same extent against 18: 1-PA and 18: 2-PA, whereas MaPAH1.2 has an activity against 18: 2-PA of 18: 1 : Suggests higher activity than 1-PA.
  • MaPAH1.1 and MaPAH1.2 have PAP activity.
  • MaPAH1.2 had a higher activity on 18: 2-PA than 18: 1-PA, suggesting a higher activity on phosphatidic acid having a fatty acid moiety with a higher degree of unsaturation.
  • Sequence number 11 Primer Sequence number 12: Primer Sequence number 13: Primer Sequence number 14: Primer Sequence number 15: Primer Sequence number 16: Primer Sequence number 17: Primer Sequence number 18: Primer

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Abstract

　本発明は、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子を提供する。　本発明の上記課題は、本発明の配列番号１若しくは配列番号７、配列番号４若しくは配列番号９、又は、配列番号５若しくは配列番号１０の塩基配列、及び配列番号２若しくは配列番号６のアミノ酸配列の提供により解決する。

Description

ホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用
　本発明は、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子とその利用に関する。
　不飽和結合を２箇所以上含有する脂肪酸は、高度不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ：polyunsaturated）と総称され、アラキドン酸やジホモγリノレン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサヘキサエン酸などが知られている。この高度不飽和脂肪酸は、動物体内で合成できないものも含まれており、このような高度不飽和脂肪酸については、必須脂肪酸として食物から摂取する必要がある。高度不飽和脂肪酸は広く分布しており、例えば、アラキドン酸は動物の副腎腺や肝臓から抽出した脂質から分離される。しかしながら、動物臓器に含まれる高度不飽和脂肪酸は少量で、動物臓器から高度不飽和脂肪酸を抽出したり分離したりするだけでは、大量に供給するには十分ではなかった。そのため、種々の微生物を培養して高度不飽和脂肪酸を獲得する方法が開発されてきた。中でもモルティエレラ（Mortierella）属微生物は、アラキドン酸等の高度不飽和脂肪酸含有脂質を生産する微生物として知られている。
　また、高度不飽和脂肪酸を植物で生産させる試みもなされている。高度不飽和脂肪酸は、トリアシルグリセロール（トリグリセリド、ＴＧともいう）などの貯蔵脂質を構成し、微生物の菌体内もしくは植物種子中に蓄積されることが知られている。
　貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールは、生体内で以下のとおり生成される。グリセロール－３－リン酸にグリセロール－３－リン酸アシル基転移酵素によりアシル基が転移されてリゾホスファチジン酸が生じ、リゾホスファチジン酸にリゾホスファチジン酸アシル基転移酵素によりアシル基が転移されてホスファチジン酸が生じ、ホスファチジン酸がホスファチジン酸ホスファターゼにより脱リン酸化されてジアシルグリセロールが生じ、ジアシルグリセロールにジアシルグリセロールアシル基転移酵素によりアシル基が転移されてトリアシルグリセロールが生じる。
　上記系路の中で、ホスファチジン酸（phosphatidic acid、以下「ＰＡ」と記載する場合もある。また、１，２－ジアシル－ｓｎ－グリセロール－３－リン酸という場合もある。）は、トリアシルグリセロールの前駆体であるとともに、ジアシル型グリセロリン脂質の生合成前駆体である。酵母などではＰＡとシチジン５’－３リン酸（ＣＴＰ）からホスファチジン酸シチジルトランスフェラーゼ、によりＣＤＰジアシルグリセロール（ＣＤＰ－ＤＧ）が合成され、種々のリン脂質へと生合成される。
　上述したとおり、ＰＡを脱リン酸化してジアシルグリセロール（diacylglycerol、以下「ＤＧ」と記載する場合もある。）を生合成する反応は、ホスファチジン酸ホスファターゼ（E.C. 3.1.3.4、phosphatidic acid phosphatase、以下「ＰＡＰ」と記載する場合もある。）が触媒することが知られている。このＰＡＰは細菌から脊椎動物までのすべての生物で存在することが知られている。
　真菌類である酵母（Saccharomyces cerevisiae）では、２つのタイプのＰＡＰが知られている（非特許文献１、２、７）。一方はＭｇ２＋依存性のＰＡＰ（ＰＡＰ１）であり、他方はＭｇ２＋非依存性のＰＡＰ（ＰＡＰ２）である。ＰＡＰ１をコードする遺伝子としては、ＰＡＨ１遺伝子が知られているが（非特許文献３－５）、ｐａｈ１Δ変異株はＰＡＰ１活性を有していることから、ほかにもＰＡＰ１活性を担う遺伝子があると考えられている。ｐａｈ１Δ変異株では、核膜やＥＲの膜が異常に拡張し、さらにリン脂質の生合成のキーとなる遺伝子の発現が異常に高まることが知られている（非特許文献６）。
　一方、ＰＡＰ２をコードする遺伝子としては、ＤＰＰ１遺伝子とＬＰＰ１遺伝子が知られており、これらが酵母におけるＰＡＰ２活性をほぼ担っている。これらの遺伝子がコードする酵素は基質特異性が広く、ジアシルグリセロールピロホスフェート（ＤＧＰＰ）、リゾホスファチジン酸、スフィンゴイドベースホスフェートやイソプレノイドホスフェートなどにも作用し、脱リン酸化することが知られている。
　脂質生産菌であるモルティエレラ　アルピナ（Mortierella alpina）では、Ｍｇ２＋非依存性のＰＡＰ２ホモログであるＭａＰＡＰ１遺伝子が知られている（特許文献１）。
　そのほかの菌類において、ＰＡＰ１ファミリー酵素やＰＡＰ２ファミリー酵素をコードすると考えられる遺伝子ホモログの存在は知られているが、機能が知られているものはない。
国際公開公報第ＷＯ２００９／００８４６６号パンフレット
Biochem. Biophys. Acta, 1348, 45-55, 1997 Trends Biochem Sci., 31(12), 694-699, 2006 EMBO J., 24, 1931-1941, 2005, J. Biol. Chem., 281(14), 9210-9218, 2006 J. Biol. Chem., 281(45), 34537-34548, 2006 J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, 2007 J. Biol. Chem., 284(5), 2593-2597, 2009
　しかしながら、これまでに報告されているＰＡＰ遺伝子は、宿主細胞に導入して発現させた場合に当該宿主が産生する脂肪酸組成物の脂肪酸組成を変化させ得ることについては検討した例は非常に少ない。宿主細胞に導入する又は発現させることで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりできるような、新規な遺伝子を同定することが求められている。
 本発明の目的は、宿主細胞で発現又は導入することで、目的とする脂肪酸組成の油脂を製造させたり、目的とする脂肪酸の含有量を増加させたりできるようなタンパク質及び核酸を提供することである。
　本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った。まず、脂質生産菌Mortierella alpinaのゲノムを解析し、この中から既知のＭｇ２＋依存性ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ１）遺伝子と相同性のある配列を抽出した。さらに、ＰＡＰをコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）全長を取得するため、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングあるいはＰＣＲにより全長ｃＤＮＡをクローニングした。その遺伝子を酵母等の高増殖能を有する宿主細胞に導入して、クローニングしたｃＤＮＡによりコードされるタンパク質がホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有すること、そして当該ｃＤＮＡの導入により酵母において貯蔵脂質であるトリアシルグリセロールの生産量が向上することを見出した。それにより、新規なホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）に関する遺伝子のクローニングに成功し、本発明を完成するに至った。すなわち、本発明は以下の通りである。
　（１）　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　（２）　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　（３）　以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号１又は配列番号６で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（ｂ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（ｃ）配列番号４又は配列番号９で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
（ｄ）配列番号５又は配列番号１０で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
　（４）　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　（５）　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかである、（４）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　（６）　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
　（７）　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は配列番号７において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
　（８）　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質
　（９）　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は配列番号７において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を向上させる活性を有するタンパク質
　（１０）　配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
　（１１）　（１）～（５）のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
　（１２）　（１１）に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
　（１３）　（１２）に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸又は脂質を含む脂肪酸組成物。
　（１４）　（１２）に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸又は脂質を採取することを特徴とする、脂肪酸組成物の製造方法。
　（１５）　（１３）に記載の脂肪酸組成物を含む食品。
　本発明のＰＡＰは、それを導入した細胞における脂肪酸や貯蔵脂質の生産能の向上を図ることができる。このため、微生物や植物中での高度不飽和脂肪酸の生産性を向上させるものとして好ましい。
　また、本発明のＰＡＰは、ＰＡＰを導入していない宿主が産生する脂肪酸組成物と比較して、組成が異なる脂肪酸組成物を宿主中に産生可能であることが期待される。それにより、所望の特性や効果を有する脂質を提供できるため、食品、化粧料、医薬品、石鹸等に適用できるものとして有用である。
図１－１は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．１のゲノム配列（配列番号５）とＯＲＦ（配列番号１）を比較した図である。 図１－２は、図１－１の続きである。 図１－３は、図１－２の続きである。 図１－４は、図１－３の続きである。 図２－１は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．２のゲノム配列（配列番号１０）とＯＲＦ（配列番号６）を比較した図である。 図２－２は、図２－１の続きである。 図２－３は、図２－２の続きである。 図２－４は、図２－３の続きである。 図３－１は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．１のｃＤＮＡ（配列番号４）及びそれから導かれる推定アミノ酸配列（配列番号２）を示した図である。 図３－２は、図３－１の続きである。 図３－３は、図３－２の続きである。 図４－１は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．２のｃＤＮＡ（配列番号９）及びそれから導かれる推定アミノ酸配列（配列番号７）を示した図である。 図４－２は、図４－１の続きである。 図５－１は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．１の推定アミノ酸配列（配列番号２）及び同ＭａＰＡＨ１．２の推定アミノ酸配列（配列番号７）と、ＰＡＰ１ファミリーのホスファチジン酸ホスファターゼである酵母Saccharomyces cerevisiae由来のＳｃＰＡＨ１タンパク質（配列番号１９）及びマウス由来Lipinのアミノ酸配列（配列番号２０）を比較した図である。ＰＡＰ１ファミリーのホスファチジン酸ホスファターゼではＮ末端部分がよく保存されており、リピンＮ末端保存領域（pfam04571）といわれている。ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２においても、Ｎ末端の部分はよく保存されている。この中の＊印のグリシン残基（配列番号２の８０番目のアミノ酸、配列番号７の８０番目のアミノ酸に相当する）は、ＰＡＰ活性に必須であることが知られている。二重下線部（配列番号２の８１９－８２３番目のアミノ酸、配列番号７の７３７－７４１番目のアミノ酸に相当する）は、ハロ酸デハロゲナーゼ（ＨＡＤ）様ドメインの中にあるＤＸＤＸ（Ｔ／Ｖ）モチーフである。ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２においてもこのモチーフが保存されており、その前後の配列も保存されている。 図５－２は、図５－１の続きである。 図６－１は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．１のＣＤＳ配列（配列番号３）及び同ＭａＰＡＨ１．２のＣＤＳ配列（配列番号８）を比較した図である。 図６－２は、図６－１の続きである。 図６－３は、図６－２の続きである。 図７は、M. alpina 1S-4株由来のＭａＰＡＨ１．１の推定アミノ酸配列（配列番号２）及び同ＭａＰＡＨ１．２の推定アミノ酸配列（配列番号７）を比較した図である。
　本発明は、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成させることを特徴とする、Mortierella属由来の新規なホスファチジン酸ホスファターゼ遺伝子に関する。
　本発明のホスファチジン酸ホスファターゼは、ホスファチジン酸を脱リン酸化して、ジアシルグリセロールを生成する反応を触媒する酵素である。本発明のＰＡＰの基質は、通常、ホスファチジン酸であるが、これに限定されない。
　本発明のホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸
　本発明のホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）には、ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２が含まれる。ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２をコードするｃＤＮＡ、ＣＤＳ、ＯＲＦ及び推定アミノ酸配列の対応関係を以下の表１に整理して記載した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　本発明のＭａＰＡＨ１．１に関連する配列として、ＭａＰＡＨ１．１のアミノ酸配列である配列番号２、ＭａＰＡＨ１．１のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号１、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号３、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号４があげられる。このうち、配列番号３は配列番号４の第１－３９８５番目の塩基配列に相当し、配列番号１は配列番号４の第１－３９８２番目の塩基配列、及び配列番号３の１－３９８２番目の塩基配列に相当する。また、本発明のＭａＰＡＨ１．１をコードするゲノム塩基配列として、配列番号５が挙げられる。配列番号５のゲノム配列はエキソン１１個とイントロン１０個からなっており、エキソン領域は配列番号５の第１～１８２番目、第３７０～５８４番目、第６９０～１４３５番目、第１５３６～１８５６番目、第１９４６～２１９２番目、第２２９２～第２４０３番目、第２４９０～第２７６３番目、第２８４７～第３０７７番目、第３１６６～第３５５５番目、第３６４８～３８６２番目、第３９８１～第５０３４番目である。
　本発明のＭａＰＡＨ１．２に関連する配列として、ＭａＰＡＨ１．２のアミノ酸配列である配列番号７、ＭａＰＡＨ１．２のＯＲＦの領域を示す配列である配列番号６、そして、そのＣＤＳの領域を示す配列である配列番号８、及びそのｃＤＮＡの塩基配列である配列番号９があげられる。このうち、配列番号８は配列番号９の第７２－３７９１番目の塩基配列に相当し、配列番号６は配列番号９の第７２－３７８８番目の塩基配列、及び配列番号８の１－３７１７番目の塩基配列に相当する。また、本発明のＭａＰＡＨ１．２をコードするゲノム塩基配列として、配列番号１０が挙げられる。配列番号１０のゲノム配列はエキソン８個とイントロン７個からなっており、エキソン領域は配列番号１０の第１～４５４番目、第６７４～１００６番目、第１１４５～１３９０番目、第１４７９～１５８３番目、第１６６２～１８０４番目、第１９０５～第２１４３番目、第２２４３～第３４０９番目、第３５２０～４５５２番目である。
　本発明の核酸とは、一本鎖及び二本鎖のＤＮＡのほか、そのＲＮＡ相補体も含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。ＤＮＡには、例えば、ゲノムＤＮＡや、前記ゲノムＤＮＡに対応するｃＤＮＡ、化学的に合成されたＤＮＡ、ＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ、及びそれらの組み合わせや、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドがあげられるがこれらに限定されない。
　本発明の核酸の好ましい態様としては、（ａ）配列番号１若しくは配列番号６で示される塩基配列を含む核酸、（ｂ）配列番号２若しくは配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸、（ｃ）配列番号４若しくは配列番号９で示される塩基配列を含む核酸、又は（ｄ）配列番号５若しくは配列番号１０で示される塩基配列を含む核酸等があげられる。
　上記塩基配列を得るためには、ＰＡＰ活性を有する生物のＥＳＴやゲノムＤＮＡの塩基配列データから、既知のＰＡＰ活性を有するタンパク質と相同性のあるタンパク質をコードする塩基配列を探索することもできる。ＰＡＰ活性を有する生物としては、脂質生産菌が好ましく、脂質生産菌としてはM. alpinaがあげられるが、これに限定されない。
　ＥＳＴ解析を行う場合には、まず、ｃＤＮＡライブラリーを作製する。ｃＤＮＡライブラリーの作製方法については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))を参照することができる。また、市販のｃＤＮＡライブラリー作製キットを用いてもよい。本発明に適するｃＤＮＡライブラリーの作製方法としては、例えば以下のような方法があげられる。すなわち、脂質生産菌であるM. alpinaの適当な株を適当な培地に植菌し、適当な期間前培養する。この前培養に適する培養条件としては、例えば、培地組成としては、１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０があげられ、培養期間は３～４日間、培養温度は２８℃である条件があげられる。その後、前培養物を適当な条件にて本培養に供する。本培養に適する培地組成としては、例えば、１．８％グルコース、１％大豆粉、０．１％オリーブ油、０．０１％アデカノール、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、０．１％　Ｎａ２ＳＯ４、０．０５％　ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．０５％　ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．０があげられる。本培養に適する培養条件としては、例えば、３００ｒｐｍ、１ｖｖｍ、２６℃で８日間通気攪拌培養する条件があげられる。培養期間中に適当量のグルコースを添加してもよい。本培養中に適時培養物を採取し、そこから菌体を回収して、全ＲＮＡを調製する。全ＲＮＡの調製には、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法等の公知の方法を用いることができる。得られた全ＲＮＡから市販のキットを用いてpoly（Ａ）＋ＲＮＡを精製することができる。さらに、市販のキットを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製することができる。その後、作製したｃＤＮＡライブラリーの任意のクローンの塩基配列を、ベクター上にインサート部分の塩基配列を決定できるように設計されたプライマーを用いて決定し、ＥＳＴを得ることができる。例えば、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit (STRATAGENE)でｃＤＮＡライブラリーを作製した場合は、ディレクショナルクローニングを行うことができる。
　ゲノムＤＮＡを解析する場合は、ＰＡＰ活性を有する生物の細胞を培養し、当該細胞からゲノムＤＮＡを調製する。得られたゲノムＤＮＡの塩基配列を決定し、決定した塩基配列をアッセンブリする。最終的に得られたスーパーコンティグの配列から、既知のＰＡＰ活性を有するタンパク質のアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列をコードする配列を探索する。このようなアミノ酸配列をコードするものとしてヒットしたスーパーコンティグの配列からプライマーを作製し、上述したｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行い、得られたＤＮＡ断片をプラスミドに組み込み、クローン化する。クローン化されたプラスミドを鋳型として、上述のプライマーを用いてＰＣＲを行うことによりプローブを作製する。作製したプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。
　本発明のＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２の推定アミノ酸配列を、GenBankに登録されているアミノ酸配列に対してBLASTpプログラムで相同性検索を行った。これらのアミノ酸配列はいずれも、Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21 由来 Nuclear elongation and deformation protein 1 推定タンパク質（AAW42851）と最も高いスコアでヒットし、同一性はそれぞれ２５．９％及び２６．６％である。また、真菌類のＰＡＰ１ホモログの中で、機能解析されているS. cerevisiae由来のＰＡＨ１（本明細書において、酵母のＰＡＨ１、又はＳｃＰＡＨ１と表記することもある）タンパク質のアミノ酸配列と、本発明のＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２の推定アミノ酸配列の同一性は、それぞれ２２．７％及び２２．５％である。
　本発明はまた、上記配列番号１又は配列番号６で示される塩基配列（「本発明の塩基配列」と記載する場合もある）、並びに、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列（「本発明のアミノ酸配列」と記載する場合もある）からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸と同等の機能を有する核酸を含む。「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質及び本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質が、ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ）活性を有することを意味する。また、「同等の機能を有する」とは、本発明の塩基配列がコードするタンパク質、又は、本発明のアミノ酸配列からなるタンパク質を酵母のＰＡＨ１欠損株において発現させた場合に、該欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）の生成活性を向上させる活性も含まれる。本発明のタンパク質のＰＡＰ活性並びに酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧの生成活性を向上させる活性は、Ｍｇ２＋依存性であっても、Ｍｇ２＋非依存性であってもよい。好ましくは、本発明のタンパク質の前記活性はＭｇ２＋依存性である。
　このような本発明の核酸と同等の機能を有する核酸としては、以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の塩基配列を含む核酸があげられる。なお、以下にあげる塩基配列の記載において、「本発明の上記活性」とは、上記の「ＰＡＰ活性及び/又は酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧの生成活性を向上させる活性」を意味する。
　（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　具体的には、
(i) 配列番号２又は配列番号７に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～400個、1～200個、1～130個、1～100個、1～75個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が欠失したアミノ酸配列、
(ii) 配列番号２又は配列番号７に示すアミノ酸配列のうち１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～400個、1～200個、1～130個、1～100個、1～75個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））のアミノ酸が他のアミノ酸で置換したアミノ酸配列、
(iii) 配列番号２又は配列番号７に示すアミノ酸配列において１個又は複数個（好ましくは１個又は数個（例えば、1～400個、1～200個、1～130個、1～100個、1～75個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個個））の他のアミノ酸が付加されたアミノ酸配列、又は
(iv) 上記(i)～(iii)を組み合わせたアミノ酸配列からなるタンパク質であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
　上記のうち、置換は、好ましくは保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、もとの配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、もとの配列に存在するらせんを破壊したり、もとの配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。
　保存的置換は、一般的には、生物学的合成系や化学的ペプチド合成で導入されるが、好ましくは、化学的ペプチド合成による。この場合、置換基には、非天然アミノ酸残基が含まれていてもよく、ペプチド模倣体や、アミノ酸配列のうち、置換されていない領域が逆転している逆転型又は同領域が反転している反転型も含まれる。
　以下に、アミノ酸残基を置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、ノルロイシン、バリン、ノルバリン、アラニン、２－アミノブタン酸、メチオニン、Ｏ－メチルセリン、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン及びシクロヘキシルアラニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸、イソアスパラギン酸、イソグルタミン酸、２－アミノアジピン酸及び２－アミノスベリン酸
Ｃ群：アスパラギン及びグルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、オルニチン、２，４－ジアミノブタン酸及び２，３－ジアミノプロピオン酸
Ｅ群：プロリン、３－ヒドロキシプロリン及び４－ヒドロキシプロリン
Ｆ群：セリン、スレオニン及びホモセリン
Ｇ群：フェニルアラニン及びチロシン
　非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができるが、この場合は、本発明のタンパク質の生物学的機能を保持するために、アミノ酸のヒドロパシー指数（ヒドロパシーアミノ酸指数）を考慮することが好ましい（Kyteら, J. Mol. Biol., 157:105-131（1982））。
　また、非保存的置換の場合は、親水性に基づいてアミノ酸の置換を行うことができる。
　なお、保存的置換及び非保存的置換いずれにおいても、配列番号２又は配列番号７における８０番目のアミノ酸に相当するアミノ酸残基はグリシンであることが望ましい。また、配列番号２の８１９－８２３番目のアミノ酸又は配列番号７の７３７－７４１番目のアミノ酸に相当する部分は、ＤＸＤＸ（Ｔ／Ｖ）（Ｘは任意のアミノ酸）であることが望ましい。
　本明細書及び図面において、塩基やアミノ酸及びその略語は、IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature に従うか、又は、例えば、Immunology--A Synthesis（第２版, E.S. Golub及びD.R. Gren監修, Sinauer Associates，マサチューセッツ州サンダーランド(1991)）等に記載されているような、当業界で慣用されている略語に基づく。またアミノ酸に関し光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。
　Ｄ－アミノ酸等の上記のアミノ酸の立体異性体、α,α－二置換アミノ酸等の非天然アミノ酸、Ｎ－アルキルアミノ酸、乳酸、及びその他の非慣用的なアミノ酸もまた、本発明のタンパク質を構成する要素となりうる。
　なお、本明細書で用いるタンパク質の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている標記法に基づき、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。
　同様に、一般的には、特に言及しない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は５’端であり、二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向を５’方向とする。
　当業者であれば、当業界で公知の技術を用いて、本明細書に記載したタンパク質の適当な変異体を設計し、作製することができる。例えば、本発明のタンパク質の生物学的活性にさほど重要でないと考えられる領域をターゲティングすることにより、本発明のタンパク質の生物学的活性を損なうことなくその構造を変化させることができるタンパク質分子中の適切な領域を同定することができる。また、類似のタンパク質間で保存されている分子の残基及び領域を同定することもできる。さらに、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要と考えられる領域中に、生物学的活性を損なわず、かつ、タンパク質のポリペプチド構造に悪影響を与えずに、保存的アミノ酸置換を導入することもできる。
　特に、本発明のＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２のアミノ酸配列においては、Ｍｇ２＋依存型ホスファチジン酸ホスファターゼ（ＰＡＰ１）ファミリー酵素でリピンＮ末端保存領域（lipin, N-terminal conserved region; pfam04571）と呼ばれるＮ末端部分の１００アミノ酸程度のアミノ酸配列が比較的よく保存されている。また、本発明のＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２のアミノ酸配列においては、ハロ酸デハロゲナーゼ様タンパク質スーパーファミリー酵素の保存モチーフである「ＤＸＤＸ（Ｔ／Ｖ）触媒部位モチーフ」が存在する。図５において二重下線で示したＤＩＤＧＴ配列（それぞれ、配列番号２の第８１９～８２３残基、及び配列番号７の第７３７～７４１残基）が、上記のモチーフに相当する。本発明の変異体は、上記保存モチーフが保存され、かつ、本発明の上記活性が損なわれない限り、いかなる変異体であってもよい。なお、酵母のＰＡＰ１においてこの保存モチーフ部分に変異が生じるとＰＡＰ活性を消失するという報告が存在する（J. Biol. Chem., 282(51): 37026-37035, (2007)）。
　当業者であれば、本発明のタンパク質の生物学的活性又は構造に重要であり、同タンパク質のペプチドと類似するペプチドの残基を同定し、この２つのペプチドのアミノ酸残基を比較して、本発明のタンパク質と類似するタンパク質のどの残基が、生物学的活性又は構造に重要なアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基であるかを予測する、いわゆる、構造－機能研究を行うことができる。さらに、このように予測したアミノ酸残基の化学的に類似のアミノ酸置換を選択することにより、本発明のタンパク質の生物学的活性が保持されている変異体を選択することもできる。また、当業者であれば、本タンパク質の変異体の三次元構造及びアミノ酸配列を解析することもできる。さらに、得られた解析結果から、タンパク質の三次元構造に関する、アミノ酸残基のアラインメントを予測することもできる。タンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基は、他の分子との重要な相互作用に関与する可能性があるが、当業者であれば、上記したような解析結果に基づいて、このようなタンパク質表面上にあると予測されるアミノ酸残基を変化させないような変異体を作製することができる。さらに、当業者であれば、本発明のタンパク質を構成する各々のアミノ酸残基のうち、一つのアミノ酸残基のみを置換するような変異体を作製することもできる。このような変異体を公知のアッセイ方法によりスクリーニングし、個々の変異体の情報を収集することができる。それにより、ある特定のアミノ酸残基が置換された変異体の生物学的活性が、本発明のタンパク質の生物学的活性に比して低下する場合、そのような生物学的活性を呈さない場合、又は、本タンパク質の生物学的活性を阻害するような不適切な活性を生じるような場合を比較することにより、本発明のタンパク質を構成する個々のアミノ酸残基の有用性を評価することができる。また、当業者であれば、このような日常的な実験から収集した情報に基づいて、単独で、又は他の突然変異と組み合わせて、本発明のタンパク質の変異体としては望ましくないアミノ酸置換を容易に解析することができる。
　上記したように、配列番号２又は配列番号７で表されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)、Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-92、Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85: 2763-6等に記載の部位特異的変異誘発法等の方法に従って調製することができる。このようなアミノ酸の欠失、置換若しくは付加等の変異がなされた変異体の作製は、例えば、Kunkel法やGapped duplex法等の公知手法により、部位特異的突然変異誘発法を利用した変異導入用キット、例えばQuikChangeTM Site-Directed Mutagenesis Kit（ストラタジーン社製）、GeneTailorTM Site-Directed Mutagenesis System（インビトロジェン社製）、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System（Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：タカラバイオ社製）等を用いて行うことができる。
　なお、タンパク質のアミノ酸配列に、その活性を保持しつつ１若しくは複数個のアミノ酸の欠失、置換、若しくは付加を導入する方法としては、上記の部位特異的変異誘発の他にも、遺伝子を変異源で処理する方法、及び遺伝子を選択的に開裂して選択されたヌクレオチドを除去、置換若しくは付加した後に連結する方法があげられる。
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２又は配列番号７に示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
　また、本発明の核酸に含まれる塩基配列には、好ましくは、配列番号２又は配列番号７において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列も含まれる。
　本発明のタンパク質におけるアミノ酸の変異又は修飾の数、あるいは変異又は修飾の部位は、ＰＡＰ活性、又は、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／若しくはＴＧ生成活性を向上させる活性が保持される限り制限はない。
　本発明のＰＡＰ活性、又は酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性は、公知の方法を用いて測定することが可能である。例えば、以下の文献：J. Biol. Chem., 273, 14331-14338(1998)を参照することができる。
　例えば、本発明の「ＰＡＰ活性」は以下の通り測定してもよい。本発明のＰＡＰを発現させた形質転換細胞を破砕し、その細胞破砕液を遠心分離して上清を回収し、粗酵素液とする。粗酵素液をさらに本発明のＰＡＰについて精製してもよい。そして、本発明のＰＡＰを含む粗酵素液又は精製した本発明のＰＡＰを、反応液である、０．５ｍＭ　ホスファチジン酸、１０ｍＭ　２－メルカプトエタノール、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に添加し、２５～２８℃で適当な時間反応させ、クロロホルム：メタノールを添加して反応を停止させた後、脂質の抽出を行い、得られた脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したジアシルグリセロール量を定量することができる。
　また、本発明の「酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性」は、例えば以下のように測定してもよい。酵母（S. cerevisiae）において、ＳｃＰＡＨ１遺伝子を破壊し、酵母のＰＡＨ１欠損株を得る。酵母のＰＡＨ１欠損株を宿主として、本発明のＰＡＰをコードする核酸を含むベクターを用いて形質転換する。上記形質転換株を培養した後、培養液を遠心分離することにより菌体を回収し、水洗後、凍結乾燥する。乾燥菌体にクロロホルム：メタノールを加え、ガラスビーズで菌体を破壊し、溶媒で脂質を抽出する。抽出した脂質を薄層クロマトグラフィー等により分画し、生成したＤＧ及び／又はＴＧの量を測定する。本発明のＰＡＰをコードする核酸を含まないベクターで形質転換した酵母のＰＡＨ１欠損株を対照として比較する。生成したＤＧ及び／又はＴＧの量が、本発明のＰＡＰをコードする核酸を含むベクターを用いて酵母のＰＡＨ１欠損株を形質転換した場合に向上した場合、当該ＰＡＰは「酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性」を有すると判断する。
　（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いてコロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ｃＤＮＡライブラリー及びゲノムライブラリー等から得ることができる。
　ハイブリダイゼーション法の詳細な手順については、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001)；特にSection 6-7) 、『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons (1987-1997)；特にSection6.3-6.4)、『DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University (1995)；ハイブリダイゼーション条件については特にSection2.10) 等を参照することができる。
　ハイブリダイゼーション条件の強さは、主としてハイブリダイゼーション条件、より好ましくは、ハイブリダイゼーション条件及び洗浄条件によって決定される。本明細書における「ストリンジェントな条件」には、中程度又は高度にストリンジェントな条件が含まれる。
　具体的には、中程度にストリンジェントな条件としては、例えばハイブリダイゼーション条件として、１×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ、４２℃～５５℃の条件、より好ましくは、１×ＳＳＣ～３×ＳＳＣ、４５℃～５０℃の条件、最も好ましくは、２×ＳＳＣ、５０℃の条件があげられる。ハイブリダイゼーション溶液中に、例えば、約５０％のホルムアミドを含む場合には、上記温度よりも５ないし１５℃低い温度を採用する。洗浄条件としては、０．５×ＳＳＣ～６×ＳＳＣ、４０℃～６０℃があげられる。ハイブリダイゼーション及び洗浄時には、一般に、０．０５％～０．２％、好ましくは約０．１％ＳＤＳを加えてもよい。
　高度にストリンジェント（ハイストリンジェント）な条件としては、中程度にストリンジェントな条件よりも高い温度及び／又は低い塩濃度でのハイブリダイゼーション及び／又は洗浄を含む。例えば、ハイブリダイゼーション条件として、０．１×ＳＳＣ～２×ＳＳＣ、５５℃～６５℃の条件、より好ましくは、０．１×ＳＳＣ～１×ＳＳＣ、６０℃～６５℃の条件、最も好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６３℃の条件があげられる。洗浄条件として、０．２×ＳＳＣ～２×ＳＳＣ、５０℃～６８℃、より好ましくは、０．２×ＳＳＣ、６０～６５℃があげられる。
　特に本発明に用いられるハイブリダイゼーション条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）及び５０％ホルムアミド中４２℃の条件でプレハイブリダイゼーションを行った後、プローブを添加して一晩４２℃に保ってハイブリッド形成させ、その後、０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を３回行うという条件があげられるが、これらに限定されない。
　また、プローブに放射性物質を使用しない市販のハイブリダイゼーションキットを使用することもできる。具体的には、DIG核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社）、ECL direct labeling & detection system（Amersham社製）を使用したハイブリダイゼーション等があげられる。
　本発明に含まれる塩基配列としては、好ましくは、配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ＰＡＰ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
　（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号１又は配列番号６に示される塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　好ましくは、配列番号１又は配列番号６に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含む核酸であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
　２つの塩基配列の同一性％は、視覚的検査や数学的計算により決定することができるが、コンピュータープログラムを使用して２つの核酸の配列情報を比較することにより決定するのが好ましい。配列比較コンピュータープログラムとしては、例えば、米国国立医学ライブラリーのウェブサイト：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.htmlから利用できるBLASTNプログラム(Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)：バージョン2.2.7、又はWU-BLAST2.0アルゴリズム等があげられる。WU-BLAST2.0についての標準的なデフォルトパラメーターの設定は、以下のインターネットサイト：http://blast.wustl.eduに記載されているものを用いることができる。
　（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。本発明の核酸がコードするタンパク質は、本発明の上記活性を有するタンパク質と同等の機能を有する限り、ＭａＰＡＨ１．１又はＭａＰＡＨ１．２のアミノ酸配列と同一性のあるタンパク質でもよい。
　具体的には、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列と７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％、さらに好ましくは９０％（例えば、９５％、さらには、９８％）以上の同一性を有するアミノ酸配列等があげられる。
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、好ましくは、配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。さらに好ましくは、配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９５％以上のアミノ酸配列をコードし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列である。
　２つのアミノ酸配列の同一性パーセントは、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性パーセントを決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、BLAST、FASTA（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410（1990））、及びClustalW等があげられる。特に、BLASTプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（NCBI）やDNA Data Bank of Japan（DDBJ）のウェブサイトから公的に入手することができる（BLASTマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894;Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DINASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI(Infomax)等のプログラムを用いて決定することもできる。
　複数のアミノ酸配列を並列させる特定のアラインメントスキームは、配列のうち、特定の短い領域のマッチングをも示すことができるため、用いた配列の全長配列間に有意な関係がない場合であっても、そのような領域において、特定の配列同一性が非常に高い領域を検出することもできる。さらに、BLASTアルゴリズムは、BLOSUM62アミノ酸スコア付けマトリックスを用いることができるが、選択パラメーターとしては、以下のものを用いることができる：（Ａ）低い組成複雑性を有するクエリー配列のセグメント（Wootton及びFederhenのSEGプログラム（Computers and Chemistry, 1993）により決定される；Wootton及びFederhen, 1996「配列データベースにおける組成編重領域の解析（Analysis of compositionally biased regions in sequence databases）」Methods Enzymol., 266: 544-71も参照されたい）、又は、短周期性の内部リピートからなるセグメント（Claverie及びStates（Computers and Chemistry, 1993）のXNUプログラムにより決定される）をマスクするためのフィルターを含むこと、及び（Ｂ）データベース配列に対する適合を報告するための統計学的有意性の閾値、又はＥ－スコア（Karlin及びAltschul, 1990）の統計学的モデルにしたがって、単に偶然により見出される適合の期待確率；ある適合に起因する統計学的有意差がＥ－スコア閾値より大きい場合、この適合は報告されない。
　（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。
　配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及びハイブリダイズの条件は上記のとおりである。本発明の核酸に含まれる塩基配列としては、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列があげられる。
　（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　配列番号５及び配列番号１０からなる塩基配列は、それぞれ本発明のＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２をコードするゲノムＤＮＡ配列である。
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む。
　上記塩基配列は、当業者に公知の方法で適当な断片を用いてプローブを作製し、このプローブを用いて、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、サザンブロット等の公知のハイブリダイゼーション法により、ゲノムライブラリー等から得ることができる。ハイブリダイズの条件は、上記の通りである。
　（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
　本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対して少なくとも７０％以上の同一性を有する塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む。好ましくは、配列番号５又は配列番号１０に示される塩基配列に対して少なくとも７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは、９０％以上、さらには９５％、９８％又は９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列が挙げられる。２つの塩基配列の同一性％は、上述したように決定することができる。
　また、配列番号５のゲノムＤＮＡ配列はエキソン１１個とイントロン１０個からなっており、エキソン領域は配列番号５の第１～１８２番目、第３７０～５８４番目、第６９０～１４３５番目、第１５３６～１８５６番目、第１９４６～２１９２番目、第２２９２～第２４０３番目、第２４９０～第２７６３番目、第２８４７～第３０７７番目、第３１６６～第３５５５番目、第３６４８～３８６２番目、第３９８１～第５０３４番目である。そして、配列番号１０のゲノムＤＮＡ配列はエキソン８個とイントロン７個からなっており、エキソン領域は配列番号１０の第１～４５４番目、第６７４～１００６番目、第１１４５～１３９０番目、第１４７９～１５８３番目、第１６６２～１８０４番目、第１９０５～第２１４３番目、第２２４３～第３４０９番目、第３５２０～４５５２番目である。
　別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号５又は配列番号１０に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して１００％同一であり、そして、エキソン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列が挙げられる。
　また別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号５又は配列番号１０に示されるゲノムＤＮＡ配列において、エキソン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して１００％同一であり、そして、イントロン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それによりエキソン領域が連結して本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列、が挙げられる。
　さらに別の態様において、本発明の核酸に含まれる塩基配列は、配列番号５又は配列番号１０に示されるゲノムＤＮＡ配列において、イントロン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、そして、エキソン領域の塩基配列が配列番号５又は配列番号１０に示される配列に対して少なくとも７０％以上、好ましくは７５％以上、さらに好ましくは８０％以上（例えば、８５％以上、より一層好ましくは９０％以上、さらには９５％以上、９８％以上、９９％以上）の同一性を有する塩基配列を含み、かつ、スプライシングによりイントロン領域が脱離可能であり、それにより連結したエキソン領域が本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする、塩基配列が挙げられる。
　２つの塩基配列の同一性％は、上述した方法により決定することができる。
　また、本発明の核酸には、配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列において１若しくは複数個の塩基が欠失、置換若しくは付加された塩基配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸も含まれる。具体的には、
(i) 配列番号１又は配列番号６に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1～1200個、1～1000個、1～750個、1～500個、1～400個、1～300個、1～250個、1～200個、1～150個、1～100個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が欠失した塩基配列、
(ii) 配列番号１又は配列番号６に示す塩基配列のうち1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1～1200個、1～1000個、1～750個、1～500個、1～400個、1～300個、1～250個、1～200個、1～150個、1～100個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の塩基が他の塩基で置換された塩基配列、
(iii) 配列番号１又は配列番号６に示す塩基配列において1個又は複数個（好ましくは1個又は数個（例えば、1～1200個、1～1000個、1～750個、1～500個、1～400個、1～300個、1～250個、1～200個、1～150個、1～100個、1～50個、1～30個、1～25個、1～20個、1～15個、さらに好ましくは１０、９、８、７、６、５、４、３、２、又は１個））の他の塩基が付加された塩基配列、又は
(iv) 上記(i)～(iii)を組み合わせた塩基配列であって、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質をコードしている塩基配列を含む核酸を用いることもできる。
　本発明の核酸の好ましい態様としては、以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の塩基配列のフラグメントを含む核酸も含まれる。
（ａ）配列番号１又は配列番号６で示される塩基配列
（ｂ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列
（ｃ）配列番号４又は配列番号９で示される塩基配列
（ｄ）配列番号５又は配列番号１０で示される塩基配列
　（ａ）配列番号１又は配列番号６で示される塩基配列、（ｂ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列、（ｃ）配列番号４又は配列番号９で示される塩基配列については、表１に記載したとおりである。また、配列番号５又は配列番号１０で示される塩基配列についても上述の通りである。上記配列のフラグメントとは、上記塩基配列に含まれるＯＲＦ、ＣＤＳ、生物学的活性を有する領域、以下に記載するようなプライマーとして用いた領域、プローブとなりうる領域が含まれ、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。
　また、本発明の核酸には以下の核酸も含まれる。
（１）　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸、
（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（２）　以下の(ａ)～（ｇ）のいずれかである、（１）に記載の核酸。
（ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
（ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
（ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズする核酸
（ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなる塩基配列を含む核酸
　本発明のホスファチジン酸ホスファターゼタンパク質
　本発明のタンパク質は、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質及び前記タンパク質と同等の機能を有するタンパク質を含み、天然由来のものであっても、人工的に作製したものであってもよい。配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質については、上記のとおりである。「同等の機能を有するタンパク質」とは、上記『本発明のホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおり、「本発明の上記活性」を有するタンパク質を意味する。
　本発明において、配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質と同等の機能を有するタンパク質としては、以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質があげられる。
（ａ）配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、本発明の上記活性を有するタンパク質
　上記のうち、配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、配列番号２からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列については、上記、『本発明のホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸』の項で説明したとおりである。また、上記「本発明の上記活性を有するタンパク質」は、配列番号１若しくは配列番号６の塩基配列を含む核酸によってコードされるタンパク質の変異体、又は、配列番号２若しくは配列番号７に示されるアミノ酸配列において１個又は複数個のアミノ酸が置換、欠失若しくは付加等の多くの種類の修飾により変異したタンパク質、あるいはアミノ酸側鎖等が修飾されている修飾タンパク質、他のタンパク質との融合タンパク質であって、かつ、ＰＡＰ活性、並びに／又は、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／若しくはトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質も含まれる。
　また、本発明のタンパク質は、人工的に作製したものであってもよく、その場合は、Fmoc法（フルオレニルメチルオキシカルボニル法）、tBoc法（ｔ－ブチルオキシカルボニル法）等の化学合成法によっても製造することができる。また、アドバンスドケムテック社製、パーキンエルマー社製、ファルマシア社製、プロテインテクノロジーインストゥルメント社製、シンセセルーベガ社製、パーセプティブ社製、島津製作所社製等のペプチド合成機を利用して化学合成することもできる。
　また、本発明のタンパク質には、以下のタンパク質も含まれる。
（１）（ａ）配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が８０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
（２）　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
（ａ）配列番号２又は配列番号７において１～２００個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質
（ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質
　本発明の核酸のクローニング
　本発明のＰＡＰの核酸は、例えば、適切なプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーからスクリーニングすることにより、クローニングすることができる。また、適切なプライマーを用いてＰＣＲ反応により増幅し、適切なベクターに連結することによりクローニングすることができる。さらに、別のベクターにサブクローニングすることもできる。
　例えば、pBlue-Script TM SK(+) (Stratagene)、pGEM-T (Promega)、pAmp(TM: Gibco-BRL)、p-Direct (Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等の市販のプラスミドベクターを用いることができる。また、ＰＣＲ反応で増幅する場合、プライマーは、上記の配列番号４等に示される塩基配列のいずれの部分も用いることができるが、例えば、
上流側用プライマーとして、NotI-PAH1-1-F：５’－GCGGCCGCATGCAGTCCGTGGGAAG－３’（配列番号１５）、
下流側用プライマーとして、MaPAH1-1-10R：５’－TTCTTGAGTAGCTGCTGTTGTTCG－３’（配列番号１６）、
等を、各々用いることができる。そして、M. alpina 菌体から調製したｃＤＮＡに、上記プライマー及びＤＮＡポリメラーゼ等を作用させてＰＣＲ反応を行う。上記方法は、『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press (2001))等に従い、当業者であれば容易に行うことができるが、本発明のＰＣＲ反応の条件としては、例えば以下の条件があげられる。
変性温度：９０～９５℃
アニーリング温度：４０～６０℃
伸長温度：６０～７５℃
サイクル数：１０回以上
　得られたＰＣＲ産物の精製には公知の方法を用いることができる。例えば、GENECLEAN(フナコシ)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT（GEヘルスケアバイオサイエンス）等のキットを用いる方法、DEAE-セルロース濾紙を用いる方法、透析チューブを用いる方法等がある。アガロースゲルを用いる場合には、アガロースゲル電気泳動を行い、塩基配列断片をアガロースゲルより切り出して、GENECLEAN（フナコシ）、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、フリーズ＆スクイーズ法等により精製することができる。
　クローニングした核酸の塩基配列は、塩基配列シーケンサーを用いて決定することができる。
　ＰＡＰ発現用ベクター構築及び形質転換体の作製
　本発明はまた、本発明のＰＡＰをコードする核酸を含有する組換えベクターを提供する。本発明は、さらに、上記組換えベクターによって形質転換された形質転換体も提供する。
　このような組換えベクター及び形質転換体は以下のようにして得ることができる。すなわち、本発明のＰＡＰをコードする核酸を有するプラスミドを制限酵素を用いて消化する。用いる制限酵素としては、例えば、EcoRI、KpnI、BamHI及びSalI等があげられるが、これらに限定されない。なお、末端をＴ４ポリメラーゼ処理することにより平滑化してもよい。消化後のＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動により精製する。このＤＮＡ断片を、発現用ベクターに公知の方法を用いて組み込むことにより、ＰＡＰ発現用ベクターを得ることができる。この発現ベクターを宿主に導入して形質転換体を作製し、目的とするタンパク質の発現に供する。
　このとき、発現ベクター及び宿主は、目的とするタンパク質を発現できるものであれば特に限定されず、例えば、宿主として、真菌や細菌、植物、動物若しくはそれらの細胞等があげられる。真菌として、脂質生産菌であるM. alpina等の糸状菌、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)等の酵母等があげられる。また細菌として、大腸菌（Escherichia coli）やバチルス・ズブチリス(Bacillus subtilis)等があげられる。さらに植物としては、ナタネ、ダイズ、ワタ、ベニバナ、アマ等の油糧植物があげられる。
　脂質生産菌としては、例えば、MYCOTAXON,Vol.XLIV,NO.2,pp.257-265(1992)に記載されている菌株を使用することができ、具体的には、モルティエレラ（Mortierella）属に属する微生物、例えば、モルティエレラ・エロンガタ（Mortierella elongata）IFO8570、モルティエレラ・エキシグア（Mortierella exigua）IFO8571、モルティエレラ・ヒグロフィラ（Mortierella hygrophila）IFO5941、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS 219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等のモルティエレラ亜属（subgenus Mortierella）に属する微生物、又はモルティエレラ・イザベリナ（Mortierella isabellina）CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、モルティエレラ・ナナ（Mortierella nana）IFO8190、モルティエレラ・ラマニアナ（Mortierella ramanniana）IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、モルティエレラ・ヴィナセア（Mortierella vinacea）CBS236.82等のマイクロムコール亜属（subgenus Micromucor）に属する微生物等があげられる。とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Mortierella alpina）が好ましい。
　真菌類を宿主として用いる場合は、本発明の核酸が宿主中で自立複製可能であるか、若しくは当該菌の染色体上に挿入され得る構造であることが好ましい。それと同時に、プロモーター、ターミネーターを含む構成であることが好ましい。宿主としてM. alpinaを使用する場合、発現ベクターとして、例えば、pD4、pDuraSC、pDura5等があげられる。プロモーターとしては、宿主中で発現できるものであればいかなるプロモーターを用いてもよく、例えば、histonH4.1遺伝子プロモーター、GAPDH（グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ）遺伝子プロモーター、TEF（Translation elongation factor）遺伝子プロモーターといったM. alpinaに由来するプロモーターが用いられる。
　M. alpina等の糸状菌への組換えベクターの導入方法としては、例えば、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、パーティクルデリバリー法、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。栄養要求性のホスト株を用いる場合は、その栄養素を欠いた選択培地上で生育する株を選択することで、形質転換株を取得することができる。また、形質転換に薬剤耐性マーカー遺伝子を用いる場合には、その薬剤を含む選択培地にて培養を行い、薬剤耐性を示す細胞コロニーを得ることができる。
　酵母を宿主として用いる場合は、発現ベクターとして、例えば、pYE22m等があげられる。また、pYES（Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等の市販の酵母発現用ベクターを、用いてもよい。また本発明に適する宿主としては、Saccharomyces cerevisiae EH13-15株（trp1, MATα）等があげられるがこれらに限定されない。プロモーターとしては、例えば、GAPDHプロモーター、gal1プロモーター、gal10プロモーター等の酵母等に由来するプロモーターが用いられる。
　酵母への組換えベクターの導入方法としては、例えば、酢酸リチウム法、エレクトロポレーション法、スフェロプラスト法、デキストラン仲介トランスフェクション、リン酸カルシウム沈殿、ポリブレン仲介トランスフェクション、プロトプラスト融合、リポソーム中のポリヌクレオチド（単数又は複数）の被包、及び核内へのＤＮＡの直接マイクロインジェクション等があげられる。
　大腸菌等の細菌を宿主として用いる場合は、発現ベクターとしては、例えばファルマシア社のpGEX、pUC18等があげられる。プロモーターとしては、例えば、trpプロモーター、lac プロモーター、PLプロモーター、PRプロモーター等の大腸菌やファージ等に由来するプロモーターが用いられる。細菌への組換えベクターの導入方法としては、例えばエレクトロポレーション法や塩化カルシウム法を用いることができる。
　本発明の脂肪酸組成物の製造方法
　本発明は、上記形質転換体から、脂肪酸組成物を製造する方法を提供する。すなわち、上記形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸組成物を製造する方法である。脂肪酸組成物は、１又はそれ以上の脂肪酸の集合体を含む組成物である。ここで、脂肪酸は遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリドやリン脂質等の脂肪酸を含む脂質として存在していてもよい。本発明の脂肪酸組成物は、具体的には、以下の方法で製造することができる。しかし、本製造方法に関しては、当該方法に限られず、一般的な公知の他の方法を用いて行うこともできる。
　ＰＡＰを発現させた生物の培養に用いる培地は、適当なｐＨ及び浸透圧を有し、各宿主の増殖に必要な栄養素、微量成分、血清や抗生物質等の生物材料を含んでいる培養液（培地）であれば、いかなる培養液も用いうる。例えば、酵母を形質転換してＰＡＰを発現させた場合は、SC-Trp培地、YPD培地、YPD5培地等を用いることができるが、これらに限定されない。具体的な培地の組成としてSC-Trp培地を例示する：１ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids (DIFCO)６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、ウラシル０．６ｇを混合したもの）１．３ｇ。
　培養条件は、宿主の増殖に適し、かつ生成した酵素が安定に保たれるのに適当な条件であればいかなる条件でもよいが、具体的には、嫌気度、培養時間、温度、湿度、静置培養又は振盪培養等の個々の条件を調節することができる。培養方法は、同一条件での培養（１段階培養）でもよく、２以上の異なる培養条件を用いる、いわゆる２段階培養若しくは３段階培養でもよいが、大量培養をする場合には、培養効率がよい２段階培養等が好ましい。
　宿主として酵母を用いて２段階培養を行う場合、本発明の脂肪酸組成物の製造方法は以下のように行うことができる。前培養として、形質転換体のコロニーを、上記のSC-Trp培地等に植菌して、３０℃で２日間振盪培養を行う。その後、本培養として、YPD5（２％酵母エキス、１％ポリペプトン、５％グルコース）培地１０ｍｌに前培養液を５００μｌ添加し、３０℃で２日間振盪培養を行う。
　本発明の脂肪酸組成物
　本発明はまた、本発明のＰＡＰが発現している細胞における１又はそれ以上の脂肪酸の集合体である脂肪酸組成物を提供する。好ましくは、本発明のＰＡＰが発現している形質転換体を培養して得られる脂肪酸組成物である。脂肪酸は、遊離脂肪酸であってもよく、トリグリセリド、リン脂質等の脂肪酸を含む脂質の形で存在していてもよい。
　本発明の脂肪酸組成物に含まれる脂肪酸としては、長鎖炭水化物の鎖状あるいは分岐状のモノカルボン酸をいい、例えば、ミリスチン酸（テトラデカン酸）(14:0)、ミリストレイン酸（テトラデセン酸）（14：1）、パルミチン酸（ヘキサデカン酸）(16:0)、パルミトレイン酸（9－ヘキサデセン酸）(16:1)、ステアリン酸（オクタデカン酸）(18:0)、オレイン酸（cis－9－オクタデセン酸）(18:1(9))、バクセン酸（11－オクタデセン酸）(18:1(11))、リノール酸（cis, cis－9,12 オクタデカジエン酸）(18:2(9,12))、α－リノレン酸（9,12,15－オクタデカントリエン酸）(18:3(9,12,15))、γ－リノレン酸（6,9,12－オクタデカントリエン酸）(18:3(6,9,12))、ステアリドン酸(6,9,12,15-オクタデカンテトラエン酸)(18:4(6,9,12,15))、アラキジン酸（イコサン酸）(20:0)、（8,11－イコサジエン酸）(20:2(8,11))、ミード酸（5,8,11－イコサトリエン酸）(20:3(5,8,11))、ジホモγ-リノレン酸（8,11,14-イコサトリエン酸）(20:3(8,11,14))、アラキドン酸（5,8,11,14－イコサテトラエン酸）(20:4(5,8,11,14))、エイコサテトラエン酸（8,11,14,17-イコサテトラエン酸）（20:4(8,11,14,17)、エイコサペンタエン酸（5,8,11,14,17-イコサペンタエン酸）（20:5(5,8,11,14,17)）、ベヘン酸（ドコサン酸）(22:0)、（7,10,13,16-ドコサテトラエン酸）(22:4(7,10,13,16))、（7,10,13,16,19-ドコサペンタエン酸）(22:5(7,10,13,16,19))、（4,7,10,13,16-ドコサペンタエン酸）(22:5(4,7,10,13,16))、（4,7,10, 13,16,19-ドコサヘキサエン酸）(22:6(4,7,10, 13,16,19))、リグノセリン酸（テトラドコサン酸）(24:0)、ネルボン酸（cis－15－テトラドコサン酸）(24:１)、セロチン酸（ヘキサドコサン酸）(26:0)、等があげられるが、これらに限定されない。なお、上記物質名はIUPAC生化学命名法で定義された慣用名であり、組織名及び、炭素数と二重結合の位置を示す数値を、カッコ内に記載した。
　本発明の脂肪酸組成物は、上記の脂肪酸のうち、１またそれ以上の脂肪酸の組み合わせであれば、いかなる数のいかなる種類の脂肪酸からなる組成物でもよい。
　本発明の脂肪酸組成物を含む食品等
　また、本発明は、上記脂肪酸組成物を含む食品を提供する。本発明の脂肪酸組成物は、常法に従って、例えば、油脂を含む食品、工業原料（化粧料、医薬（例えば、皮膚外用薬）、石鹸等の原料）の製造等の用途に使用することができる。化粧料（組成物）又は医薬（組成物）の剤型としては、溶液状、ペースト状、ゲル状、固体状、粉末状等任意の剤型をあげることができるが、これらに限定されない。また、食品の形態としては、カプセル等の医薬製剤の形態、又はタンパク質、糖類、脂肪、微量元素、ビタミン類、乳化剤、香料等に本発明の脂肪酸組成物が配合された自然流動食、半消化態栄養食、及び成分栄養食、ドリンク剤、経腸栄養剤等の加工形態があげられる。
　さらに、本発明の食品の例としては、栄養補助食品、健康食品、機能性食品、幼児用食品、乳児用調製乳、未熟児用調製乳、老人用食品等があげられるが、これらに限定されない。本明細書においては、食品とは、固体、流動体、及び液体、並びにそれらの混合物であって、摂食可能なものの総称をいう。
　栄養補助食品とは、特定の栄養成分が強化されている食品をいう。健康食品とは、健康的な又は健康によいとされる食品をいい、栄養補助食品、自然食品、ダイエット食品等が含まれる。機能性食品とは、体の調節機能を果たす栄養成分を補給するための食品をいい、特定保健用食品と同義である。幼児用食品とは、約６歳までの子供に与えるための食品をいう。老人用食品とは、無処理の食品と比較して消化及び吸収が容易であるように処理された食品をいう。乳児用調製乳とは、約１歳までの子供に与えるための調製乳をいう。未熟児用調製乳とは、未熟児が生後約６ヶ月になるまで与えるための調製乳をいう。
　これらの食品としては、肉、魚、ナッツ等の天然食品（油脂で処理したもの）；中華料理、ラーメン、スープ等の調理時に油脂を加える食品；天ぷら、フライ、油揚げ、チャーハン、ドーナッツ、かりん糖等の熱媒体として油脂を用いた食品；バター、マーガリン、マヨネーズ、ドレッシング、チョコレート、即席ラーメン、キャラメル、ビスケット、クッキー、ケーキ、アイスクリーム等の油脂食品又は加工時に油脂を加えた加工食品；おかき、ハードビスケット、あんパン等の加工仕上げ時に油脂を噴霧又は塗布した食品等をあげることができる。しかしながら、本発明の食品は、油脂を含む食品に限定されるわけではなく、例えば、パン、麺類、ごはん、菓子類（キャンデー、チューインガム、グミ、錠菓、和菓子）、豆腐及びその加工品等の農産食品；清酒、薬用酒、みりん、食酢、醤油、みそ等の発酵食品；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ等の畜産食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶等があげられる。
　本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いた菌株の評価・選択方法
　本発明はまた、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価や選択を行う方法を提供する。具体的には以下のとおりである。
　（１）評価方法
　本発明の一態様として、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の評価を行う方法があげられる。本発明の上記評価方法としては、まず、本発明の塩基配列に基づいて設計したプライマー又はプローブを用いて、被検菌株である脂質産生菌株の本発明の上記活性について評価する方法があげられる。このような評価方法の一般的手法は公知であり、例えば、国際特許出願パンフレットWO01/040514号、特開平8-205900号公報などに記載されている。以下、この評価方法について簡単に説明する。
　まず、被検菌株のゲノムを調製する。調製方法は、Hereford法や酢酸カリウム法など、いかなる公知の方法をも用いることができる（例えば、Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130 (1990)参照）。
　本発明の塩基配列、好ましくは、配列番号１又は配列番号６に基づいてプライマー又はプローブを設計する。上記プライマー又はプローブは本発明の塩基配列のいずれの部分をも用いることができ、またその設計は公知の手法を用いて行うことができる。プライマーとして用いるポリヌクレオチドの塩基数は、通常、１０塩基以上であり、１５～２５塩基であることが好ましい。また、挟み込む部分の塩基数は、通常、３００～２０００塩基が適当である。
　上記で作製したプライマー又はプローブを用いて、上記被検菌株のゲノム中に本発明の塩基配列と特異的な配列が存在するか否かを調べる。本発明の塩基配列と特異的な配列の検出は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、本発明の塩基配列に特異的配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを一つのプライマーとして用い、もう一方のプライマーとしてこの配列よりも上流あるいは下流の配列の一部又は全部を含むポリヌクレオチド、又は上記塩基配列に対して相補的な塩基配列を含むポリヌクレオチドを用いて、例えば、ＰＣＲ法等によって被検菌株の核酸を増幅し、増幅物の有無、増幅物の分子量の大きさなどを測定することができる。
　本発明の方法に適するＰＣＲ法の反応条件は、特に限定されないが、例えば、以下の条件があげられる。
変性温度：９０～９５℃
アニーリング温度：４０～６０℃
伸長温度：６０～７５℃、
サイクル数：１０回以上
などの条件である。得られた反応生成物はアガロースゲルなどを用いた電気泳動法等により分離して、増幅産物の分子量を測定することができる。これにより、増幅産物の分子量が本発明の塩基配列と特異的な領域に相当する核酸分子を含む大きさか否かを確認することにより、被検菌株の本発明の上記活性を予測又は評価することができる。また、上記増幅産物の塩基配列を上記方法等で解析することによって、さらに本発明の上記活性をより正確に予測又は評価することができる。なお、本発明の上記活性の評価方法は、上記のとおりである。
　また、本発明の上記評価方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１又は配列番号６等の本発明の塩基配列がコードするＰＡＰの発現量を測定することによって、被検菌株の本発明の上記活性を評価することもできる。なお、ＰＡＰの発現量は、被検菌株を適当な条件で培養し、ＰＡＰのｍＲＮＡ又はタンパク質を定量することにより測定できる。ｍＲＮＡ又はタンパク質の定量は、公知の手法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、例えば、ノーザンハイブリダイゼーションや定量的ＲＴ－ＰＣＲによって、タンパク質の定量は、例えば、ウエスタンブロッティングによって行うことができる(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003)。
　（２）選択方法
　本発明の他の態様として、本発明のＰＡＰをコードする核酸又はＰＡＰタンパク質を用いて、脂質生産菌の選択を行う方法があげられる。本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養し、配列番号１又は配列番号６等の本発明の塩基配列がコードするＰＡＰの発現量を測定して、目的とする発現量の菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。また、基準となる菌株を設定し、この基準菌株と被検菌株を各々培養し、各菌株の前記発現量を測定し、基準菌株と被検菌株の発現量を比較して、所望の菌株を選択することもできる。具体的には、例えば、基準菌株及び被検菌株を適当な条件で培養し、各菌株の発現量を測定し、基準菌株よりも被検菌株の方が高発現、又は低発現である被検菌株を選択することにより、所望の活性を有する菌株を選択することができる。所望の活性には、上記のように、ＰＡＰの発現量及びＰＡＰが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
　また、本発明の上記選択方法としては、被検菌株を培養して、本発明の上記活性が高いか若しくは低い菌株を選択することにより、所望の活性を有する被検菌株を選択することもできる。所望の活性には、上記のように、ＰＡＰの発現量及びＰＡＰが産生する脂肪酸組成物の組成を測定する方法があげられる。
　被検菌株又は基準菌株としては、例えば、上記の本発明のベクターを導入した菌株、上記本発明の核酸の発現が抑制された菌株、突然変異処理が施された菌株、自然変異した菌株などを用いることができるがこれらに限定されない。なお、本発明の上記活性は、例えば本明細書中の「本発明のホスファチジン酸ホスファターゼをコードする核酸」の項目で記載した方法によって測定することが可能である。突然変異処理としては、例えば、紫外線照射や放射線照射などの物理的方法、ＥＭＳ（エチルメタンスルホネート）、Ｎ－メチル－Ｎ－ニトロソグアニジンなどの薬剤処理による化学的方法などがあげられる（例えば、大嶋泰治編著、生物化学実験法39　酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センターなど参照）が、これらに限定されない。
　なお、本発明の基準菌株、被検菌株として用いる菌株としては、上記の脂質生産菌又は酵母等があげられるが、これらに限定されない。具体的には、基準菌株、被検菌株は、異なる属や種に属するいかなる菌株を組み合わせて用いてもよく、被検菌株は１又はそれ以上の菌株を同時に用いてもよい。
　以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明は実施例に限定されるものではない。
　実施例１：　M.alpinaのゲノム解析
　M. alpina 1S-4株を１００ｍｌのＧＹ２：１培地（２％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、２８℃で２日間振とう培養した。濾過により菌体を集菌し、DNeasy（QIAGEN）を用いてゲノムＤＮＡを調製した。
　上記ゲノムＤＮＡの塩基配列を、Roche 454 GS FLX Standard を用いて決定した。その際、フラグメントライブラリーの塩基配列決定を２ラン分、メイトペアライブラリーの塩基配列決定を３ラン分行った。得られた塩基配列をアッセンブリすることにより、３００個のスーパーコンティグが得られた。
　実施例２：　ｃＤＮＡの合成とｃＤＮＡライブラリーの作製
　M. alpina 1S-4株を１００ｍｌの培地（１．８％グルコース、１％酵母エキス、ｐＨ６．０）に植菌し、４日間２８℃で振とう培養した。菌体を濾過により回収し、塩酸グアニジン／ＣｓＣｌ法でトータルＲＮＡを調製した。
　トータルＲＮＡから、SuperScript II RT（インビトロジェン）により、ランダムヘキサマーを用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを合成した。また、Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit（タカラバイオ）を用いて、トータルＲＮＡからｐｏｌｙ（Ａ）＋ ＲＮＡの精製を行った。ｃＤＮＡライブラリーを、ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit（STRATAGENE）を用いて作製した。
　実施例３：　S.cerevisiae由来ＰＡＨ１ホモログの探索
　Saccharomyces cerevisiae のＰＡＰ１活性を担う遺伝子の一つであるのＰＡＨ１　（ＹＭＲ１６５Ｃ）（本明細書ではＳｃＰＡＨ１と表記することもある）のアミノ酸配列をM.alpina 1S-4株のゲノム塩基配列に対し、ｔｂｌａｓｔｎ解析した。その結果、配列番号５と配列番号１０に示す配列を含むスーパーコンティグがヒットした。配列番号５に係る遺伝子をＭａＰＡＨ１．１、配列番号１０に係る遺伝子をＭａＰＡＨ１．２と命名した。
　実施例４：　ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２のクローニング
　（１）プローブの作製
　ＭａＰＡＨ１．１遺伝子とＭａＰＡＨ１．２遺伝子のｃＤＮＡをクローン化をするために、配列番号５及び配列番号１０並びに、先のＢＬＡＳＴ解析の結果より以下のプライマーを作製した。
MaPAH1-1-3F：５’－CGCCAATACATTGACGTTTTCAG－３’（配列番号１１）
MaPAH1-1-5R：５’－AGTTCCAGTCATTGAACTCGGGTGC－３’（配列番号１２）
MaPAH1-2-3F：５’－GAGCCCAGTTGACCTTTGAGGCATTC－３’（配列番号１３）
MaPAH1-2-5R：５’－CACTGAGAACGAGACCGTGTTGGCG－３’（配列番号１４）
　実施例２で作製したｃＤＮＡライブラリーを鋳型として、プライマーMaPAH1-1-3FとプライマーMaPAH1-1-5Rの組み合わせ、又はプライマーMaPAH1-2-3FとプライマーMaPAH1-2-5Rの組み合わせで、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いて、９４℃　２分につづいて（９４℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　２分）を３０サイクルのＰＣＲを行った。それぞれで得られた約０．６ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO-TA cloning Kit（インビトロジェン）を用いてクローン化し、得られたプラスミドのインサートの塩基配列を決定した。前者のプライマーの組み合わせで得られた配列番号４の２３５２番目－３０１０番目の塩基配列を有するプラスミドをpCR-MaPAH1.1-P、後者のプライマーの組み合わせで得られた配列番号９の１６１５番目－２２０１番目の塩基配列を有するプラスミドをpCR-MaPAH1.2-Pとした。
　次に、これらのプラスミドを各々鋳型として、上記プライマーを用いてＰＣＲによりプローブを作製した。反応には、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いたが、添付のｄＮＴＰミックスの代わりにＰＣＲラベリングミックス（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて、増幅されるＤＮＡをジゴキシゲニン（ＤＩＧ）ラベルしたプローブを作製し、ＭａＰＡＨ１．１プローブとＭａＰＡＨ１．２プローブとした。これらのプローブを用いて、ｃＤＮＡライブラリーをそれぞれスクリーニングした。
　ハイブリダイゼーションの条件は、次のとおりである。
バッファー：５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、５０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、５０％ホルムアミド；
温度：４２℃（一晩）；
洗浄条件：０．２ｘ　ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ溶液中（６５℃）で、２０分間×３回；
　検出は、ＤＩＧ核酸検出キット（ロシュ・ダイアグノス社）を用いて行った。スクリーニングによって得られたファージクローンから、in vivo エキシジョンにより、プラスミドを切り出し、各プラスミドＤＮＡを得た。ＭａＰＡＨ１．１プローブでスクリーニングして得られたプラスミドのうち、最もインサート長の長いものは、配列番号４の１３０７番目以降の配列を含んでおり、プラスミドpB-MaPAH1.1pと名づけた。ＳｃＰＡＨ１のアミノ酸配列との比較により、このプラスミドpB-MaPAH1.1pは、ＰＡＨ１．１のＮ末端をコードする領域を含んでいないと考えられた。ＢＬＡＳＴ解析によりＭａＰＡＨ１．１遺伝子を含むと考えられたゲノム配列（配列番号５）とＳｃＰＡＨ１のアミノ酸配列のＮ末配列を比較したところ、配列番号５の１－３番目のＡＴＧが、開始コドンである可能性が考えられた。また、プラスミドpB-MaPAH1.1pの各フレームをアミノ酸配列に翻訳してS.cerevisiae 由来のＳｃＰＡＨ１タンパク質のアミノ酸配列と比較したところ、配列番号４の３９８５－３９８７番目のＴＧＡが終止コドンであると考えられた。そこで、ｃＤＮＡの全長をクローン化するために、以下のプライマーを設計した。
NotI-PAH1-1-F：５’－GCGGCCGCATGCAGTCCGTGGGAAG－３’（配列番号１５）
MaPAH1-1-10R：５’－TTCTTGAGTAGCTGCTGTTGTTCG－３’（配列番号１６）
　まず、上記ｃＤＮＡを鋳型として、プライマーNotI-PAH1-1-FとプライマーMaPAH1-1-10Rの組み合わせで、ＥｘＴａｑ（タカラバイオ）を用いて、９４℃　２分につづいて（９４℃　３０秒、５５℃　３０秒、７２℃　２分）を３０サイクルのＰＣＲを行い、得られた約１．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO-TA cloning Kit（インビトロジェン）により、クローン化し、インサート部分の塩基配列を確認した。配列番号４の１－１５００番目の塩基配列を含むＤＮＡ断片がクローン化されたプラスミドをpCR-MaPAH1.1-Npとした。続いて、プラスミドpCR-MaPAH1.1-Npを制限酵素ＮｏｔＩとＸｈｏＩで消化して得られた約１．４ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドpB-MaPAH1.1pを制限酵素ＮｏｔＩとＢａｍＨＩで消化して得られた約３．７ｋｂｐのＤＮＡ断片と、プラスミドpB-MaPAH1.1pを制限酵素ＸｈｏＩとＢａｍＨＩで消化して得られた約２．１ｋｂのＤＮＡ断片をligation high（TOYOBO）を使って連結し、ＭａＰＡＨ１．１の全長ｃＤＮＡを含むと考えられるプラスミドpB-MaPAH1.1cDNAを得た。ＭａＰＡＨ１．１の全長ＯＲＦを含むｃＤＮＡ配列を配列番号４に示した。
 一方、ＭａＰＡＨ１．２プローブでスクリーニングして得られたプラスミドのうち、最もインサート長の長いものは、配列番号９の塩基配列を含んでいた。S. cerevisiae由来のＳｃＰＡＨ１の配列との比較により、このプラスミドは、ＭａＰＡＨ１．２の全長ＯＲＦを含むｃＤＮＡを有すると考えられた。このプラスミドをpB-MaPAH1.2cDNAとした。
　（２）配列解析
　ＭａＰＡＨ１．１遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号４）には、１番目－３９８７番目の塩基配列からなるＣＤＳ（配列番号３）、１番目－３９８４番目の塩基配列からなるＯＲＦ（配列番号１）が含まれていた。ＭａＰＡＨ１．１遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を配列番号２に示した。ＭａＰＡＨ１．１遺伝子のゲノム配列とＯＲＦ配列を比較した（図１）。ＭａＰＡＨ１．１遺伝子のゲノム配列は、エキソン１１個とイントロン１０個からなっていると考えられた。
　一方、ＭａＰＡＨ１．２遺伝子のｃＤＮＡ配列（配列番号９）には、７２番目－３７９１番目の塩基配列からなるＣＤＳ（配列番号８）、７２番目－３７８８番目の塩基配列からなるＯＲＦ（配列番号６）が含まれていた。ＭａＰＡＨ１．２遺伝子がコードする推定アミノ酸配列を配列番号７に示した。ＭａＰＡＨ１．２遺伝子のゲノム配列とＯＲＦ配列を比較した（図２）。ＭａＰＡＨ１．２遺伝子のゲノム配列は、エキソン８個とイントロン７個からなっていた。
　ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２のｃＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列をそれぞれ図３、図４に示した。
　ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２の推定アミノ酸配列を、GenBankに登録されているアミノ酸配列に対してＢＬＡＳＴｐプログラムで相同性検索を行ったところ、どちらも、Cryptococcus neoformans var. neoformans JEC21由来Nuclear elongation and deformation protein 1 推定タンパク質（AAW42851）と最も高いスコアでヒットしたが、同一性はそれぞれ２５．９％、２６．６％と低かった。
　真菌類のＰＡＰ１ホモログの中で、機能解析されているＳｃＰＡＨ１タンパク質のアミノ酸配列と、本発明のM.alpina由来のＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２のアミノ酸配列の同一性は、それぞれ２２．７％、２２．５％であった。本発明のM.alpina由来のＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２のアミノ酸配列を、既知のＳｃＰＡＨ１、及びマウス由来Ｌｉｐｉｎのアミノ酸配列を比較した（図５）。ＰＡＰ１ファミリー酵素では、Ｎ末端部分のアミノ酸配列がよく保存されており、lipin, N-terminal conserved region（pfam04571）と呼ばれている。本発明のM.alpina由来のＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２においても、既知の酵素とＮ末端部分は比較的よく保存されていた。さらに、図５に二重下線で示したＤＩＤＧＴ配列は、ハロ酸デハロゲナーゼ様タンパク質（haloacid dehalogenase(HAD)-like protein）スーパーファミリー酵素で保存されているＤＸＤＸ（Ｔ／Ｖ）触媒部位のモチーフと一致していた。
　ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２のＣＤＳ配列を比較したところ（図６）、同一性は５４．７％、推定アミノ酸配列を比較したところ（図７）、同一性は３５．６％であった。
　実施例５：　ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２の酵母での発現
　ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２の発現ベクターの構築：
　ＭａＰＡＨ１．１を酵母で発現させるために、以下のとおり発現ベクターを構築した。
　まず、酵母発現用ベクターｐＹＥ２２ｍ（Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995）を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化し、続いてBlunting Kit（タカラバイオ）により、末端を平滑化した。つづいて、これとLinker, pNotI, Phosphorylated（８ｍｅｒ）（タカラバイオ）を、ligation high（東洋紡）を使って連結し、得られたものをベクターｐＹＥ２２ｍＮとした。ベクターｐＹＥ２２ｍＮを制限酵素ＮｏｔＩとＫｐｎＩで消化し、プラスミドｐＢ－ＭａＰＡＨ１．１ｃＤＮＡを制限酵素ＮｏｔＩとＫｐｎＩで消化して得られた約４．２ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドpYE-MaPAH1.1を得た。一方、ベクターｐＹＥ２２ｍＮを制限酵素ＮｏｔＩとＫｐｎＩで消化し、プラスミドpB-MaPAH1.2cDNAを制限酵素ＮｏｔＩとＫｐｎＩで消化して得られた約３．８ｋｂｐのＤＮＡ断片を連結し、プラスミドpYE-MaPAH1.2を得た。
　S.cerevisiae　ΔＳｃｐａｈ１：ＵＲＡ３株の作成：
　S. cerevisiae S288C株由来ＳｃＰＡＨ１遺伝子をクローン化するために、以下のプライマーを作製した。
プライマーKpnI-PAH1-F：５’－GGTACCATGCAGTACGTAGGCAGAGCTC－３’（配列番号１７）
プライマーXhoI-PAH1-R：５’－CTCGAGTTAATCTTCGAATTCATCTTCG－３’（配列番号１８）
　S.cerevisiae S288C株を、ＹＰＤ（酵母エキス　２％、ポリペプトン　１％、グルコース　２％）液体培地、３０℃で一晩培養し、その菌体から、Ｇｅｎとるくん（酵母用）（タカラバイオ）を使って、ＤＮＡを抽出した。得られたＤＮＡを鋳型として、プライマーKpnI-PAH1-FとプライマーXhoI-PAH1-Rにより、ＥｘＴａｑを用いたＰＣＲ反応によりＳｃＰＡＨ１遺伝子を増幅した。得られた約２．５ｋｂｐのＤＮＡ断片をTOPO TA cloning Kitを用いてクローン化し、塩基配列の正しいクローンをｐＣＲ－ＳｃＰＡＨ１とした。ｐＣＲ－ＳｃＰＡＨ１を、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＥｃｏＲＶで消化して得られた約０．４ｋｂｐのＤＮＡ断片と、制限酵素ＥｃｏＲＶと制限酵素ＸｈｏＩで消化して得られた約２．１ｋｂｐのＤＮＡ断片を、制限酵素ＥｃｏＲＩと制限酵素ＸｈｏＩで消化したベクターpBluescriptIISK＋とライゲーションさせることにより、プラスミドpBScPAH1を得た。プラスミドpBScPAH1を制限酵素ＥｃｏＲＶと制限酵素ＨｉｎｃＩＩで消化したものと、プラスミドｐＵＲＡ３４（特開２００１－１２０２７６）を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、末端を平滑化して得られた約１．２ｋｂｐのＤＮＡ断片をライゲーションさせ、ＳｃＰＡＨ１遺伝子とＵＲＡ３遺伝子の向きが同じものをプラスミドｐＢΔｐａｈ１：ＵＲＡ３とした。次に、プラスミドｐＢΔｐａｈ１：ＵＲＡ３を制限酵素ＥｃｏＲＩで消化て得られたＤＮＡ断片で、S.cerevisiae YPH499株（ura3-52 lys2-801amber ade2-101ochre trp1-Δ63 his3-Δ200 leu2-Δ1 a）（STARATAGENE）をホストとして形質転換し、ＳＣ－Ｕｒａ（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids （DIFCO）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇ、トリプトファン１．２ｇを混合したもの）１．３ｇ、寒天培地（２％アガー））寒天培地上で生育するものを形質転換株として選抜した。ＰＣＲにてΔｐａｈ１：ＵＲＡ３コンストラクトが導入されＳｃＰＡＨ１遺伝子が破壊されたことを確認し、ΔＳｃｐａｈ１：ＵＲＡ３株とした。
　形質転換株の取得：
　ΔＳｃｐａｈ１：ＵＲＡ３株をホストとして、プラスミドｐＹＥ２２ｍ、pYE-MaPAH1.1、pYE-MaPAH1.2でぞれぞれ形質転換し、ＳＣ－Ｕｒａ、Ｔｒｐ（１Ｌあたり、Yeast nitrogen base w/o amino acids （DIFCO）６．７ｇ、グルコース２０ｇ、アミノ酸パウダー（アデニン硫酸塩１．２５ｇ、アルギニン０．６ｇ、アスパラギン酸３ｇ、グルタミン酸３ｇ、ヒスチジン０．６ｇ、ロイシン１．８ｇ、リジン０．９ｇ、メチオニン０．６ｇ、フェニルアラニン１．５ｇ、セリン１１．２５ｇ、チロシン０．９ｇ、バリン４．５ｇ、スレオニン６ｇを混合したもの）１．３ｇ、寒天培地（２％アガー））寒天培地上で生育できる株を形質転換をとして選抜した。それぞれのプラスミドで形質転換された株のうち、任意の２株ずつ（プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換したコントロール株をＣ１，Ｃ２、プラスミドpYE-MaPAH1.1で形質転換した株をMaPAH1.1-1，MaPAH1.1-2、プラスミドpYE-MaPAH1.2で形質転換した株をMaPAH1.2-1，MaPAH1.2-2）を、以下の実験に使用した。
　実施例６：　Ｍｇ ２＋ 依存性ホスファチジン酸ホスファターゼ活性（ＰＡＰ１活性）の測定
　それぞれの酵母の形質転換株をＳＣ－Ｕｒａ、Ｔｒｐ液体培地１００ｍｌに植菌し、３０℃にて１日間振とう培養した。得られた培養液より、以下のとおり粗酵素液を調製した。特に操作はすべて４℃又は氷中にて行った。まず培養液を遠心分離して菌体を回収し、水洗した。続いて、菌体にバッファーＡ（５０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、０．３Ｍスクロース、１０ｍＭ　メルカプトエタノール、０．５ｍＭ　phenylmethylsulfonyl fluoride（ＰＭＳＦ））を５ｍｌ添加し、菌体を懸濁した。フレンチプレス（Thermo Fisher Scientific社）により、ミニセル、１６ｋＰａで３回処理することにより、菌体を破砕した。菌体破砕液を１，５００ｘｇ、１０分遠心分離して上清を回収し粗酵素液とした。粗酵素液中に含まれるタンパク質濃度は、Protein Assay CBB Solution(5x)（ナカライテスク）により測定した。
 ＰＡＰ１活性はGil-Sooらの方法（J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, (2007)）を改変して、以下のとおり測定した。S.cerevisiaeは、リノール酸を合成できないことから、ＰＡＰの基質として1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate（１８：２－ＰＡ）を用いた。反応液は５００μＬとし、その組成は、粗酵素液１００μＬ、５０ｍＭ　Tris-HCl（ｐＨ７．５）、１００μｇ／ｍｌ　1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate, Monosodium Salt（Avanti Polar Lipids,Inc）、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　２－メルカプトエタノール、とした。反応液を２５℃で３０分間保持したあと、クロロホルム：メタノール（１：２）を加えて反応を停止し、Bligh-Dyer法にて、脂質を抽出した。シリカゲル６０　プレート（メルク）を用い、ヘキサン：ジエチルエーテル：酢酸＝７０：３０：１を展開溶媒とした薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）により、脂質を分画した。プリムリン溶液（０．０１５％プリムリン、８０％アセトン水溶液）を噴霧したあと、ＵＶ照射により、脂質を可視化した。ジアシルグリセロール（ＤＧ）画分を掻きとり、脂肪酸を塩酸メタノール法によりメチルエステルに誘導した。続いて、脂肪酸メチルエステルをヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去後、ガスクロマトグラフィーにより分析を行った。
 粗酵素液タンパク質あたりのＤＧ画分中に移行したリノール酸量を表２に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　表２に示したとおり、ｐＹＥ２２ｍで形質転換したＣ１、Ｃ２と比較すると、ＭａＰＡＨ１．１を発現させたMaPAH1.1-1、MaPAH1.1-2はおよそ３倍、ＭａＰＡＨ１．２を発現させたMaPAH1.2-1、MaPAH1.2-2はおよそ１．２倍の１８：２－ＰＡをジリノレイン（１８：２－ＤＧ）に変換する活性を有していた。このことから、ＭａＰＡＨ１．１とＭａＰＡＨ１．２はＰＡＰ活性を有することが示唆された。
　一方、上記ＰＡＰ活性がＭｇ２＋に依存するかどうかを調べるために、以下のとおり反応を行った。すなわち、反応液は５００μＬとし、その組成は、粗酵素液１００μＬ、５０ｍＭ　Tris-HCl（pH 7.5）、１００μｇ／ｍｌ　1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate, Monosodium Salt（Avanti Polar Lipids, Inc.）、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０ｍＭ　２－メルカプトエタノールとし、それ以外は、上記と同様に反応させ分析を行った。粗酵素液タンパク質あたりのＤＧ画分中に移行したリノール酸量を表３に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　表３で示したとおり、いずれの株のにおいても１８：２－ＰＡをジリノレイン（１８：２－ＤＧ）に変換する活性は同程度であった。
　これらのことから、ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２のＰＡＰ活性はＭｇ２＋に依存しており、これらはＰＡＰ１活性を有することが示唆された。
　実施例７：　トリアシルグリセロールの生産量
　貯蔵脂質であるトリアシルグリセロール（本明細書においてトリグリセリド、ＴＧとも表記する）は、ＰＡＰタンパク質の生成物であるジアシルグリセロールがさらにアシル化されたものである。本発明のＭａＰＡＨ１．１やＭａＰＡＨ１．２を高発現させた酵母の形質転換株のＴＧ生成量を調べた。
　ＳｃＰＡＨ１を欠損させた酵母を宿主とする上記の形質転換株をＳＤ－Ｕｒａ、Ｔｒｐ液体培地　１０ｍｌに植菌し、３０℃で３日間静置培養した。培養液　１ｍｌを、ＹＰＤＡ（酵母エキス　２％、ポリペプトン　１％、グルコース　２％、アデニン硫酸塩０．００８％）液体培地　１０ｍｌに植菌し、３０℃、１日間振とう培養した（ｎ＝３）。培養液を遠心分離することにより、菌体を回収し、水洗後、凍結乾燥した。乾燥菌体に、クロロホルム：メタノール（２：１）を加え、ガラスビーズで菌体を破砕することを繰り返し、全量８ｍｌの溶媒で、脂質を抽出した。上記と同様に、ＴＬＣにより分画したあとＴＧ画分を掻きとり、分析した。結果を表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表４のとおり、ＭａＰＡＨ１．１高発現株ではコントロールのおよそ１．５倍、ＭａＰＡＨ１．２高発現株ではおよそ１．２倍のＴＧを生産できた。
　実施例８：　ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２の基質特異性
　ΔＳｃｐａｈ１：ＵＲＡ３株をホストとして、プラスミドｐＹＥ２２ｍ、pYE-MaPAH1.1、及びpYE-MaPAH1.2で、それぞれ形質転換した。それぞれの形質転換株について任意の４株を、以下の実験に供した。なお、プラスミドｐＹＥ２２ｍで形質転換した株をコントロールとして用いた。
　それぞれの酵母の形質転換株をＳＣ－Ｕｒａ、Ｔｒｐ液体培地１０ｍｌに植菌し、２７．５℃、静置で終夜培養した。得られた培養液をＳＣ－Ｕｒａ、Ｔｒｐ液体培地４０ｍｌに１／１０量、各２本植菌し、２７．５℃、静置で２日間培養した。得られた培養液より、実施例６に記載の方法と同様に粗酵素液を調製し、そしてタンパク質濃度を測定した。
　ＰＡＰ１活性は、ＰＡＰの基質として1,2-Dilinoleoyl-sn-Glycero-3-phosphate（１８：２－ＰＡ）及び1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-phosphate（１８：１－ＰＡ）を使用したほかは、実施例６に記載の方法と同様に測定した。
　粗酵素液タンパク質あたりのジアシルグリセロール（ＤＧ）画分中に移行したリノール酸（１８：２）量及びオレイン酸（１８：１）量を、それぞれ表５及び表６に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　１８：２－ＰＡを基質とした場合、モルティエレラ由来のＭａＰＡＨ１．１、ＭａＰＡＨ１．２は、コントロールに比べ、それぞれ１．９倍、１．３倍の活性を示した。
　また、１８：１－ＰＡを基質とした場合、ＭａＰＡＨ１．１はコントロールの１．９倍の活性、ＭａＰＡＨ１．２はコントロールの１．１倍の活性を示した。ここで、１８：１は酵母がもともと持っている脂肪酸であるため、粗酵素液のＤＧ中にも元々存在する。しかし、基質を添加しない場合の粗酵素液中のＤＧ中の１８：１量には差がなかった。よって、表６に示されるＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２とコントロールとの差は、基質として添加した１８：１－ＰＡに対する作用を観察したものと推定できる。
　また、同じ酵素について基質ごとの活性を比較すると、ＭａＰＡＨ１．１は、１８：１及び１８：２を共にコントロールと比較して１．９倍増加させた。これに対し、ＭａＰＡＨ１．２は、１８：１をコントロールと比較して１．１倍、１８：２をコントロールと比較して１．３倍増加させた。このことは、ＭａＰＡＨ１．１は１８：１－ＰＡ及び１８：２－ＰＡに対して同程度にその活性を発揮するのに対し、ＭａＰＡＨ１．２は１８：２－ＰＡに対する活性の方が、１８：１－ＰＡに対する活性よりも高いことを示唆するものである。
　これらのことから、ＭａＰＡＨ１．１及びＭａＰＡＨ１．２は、ＰＡＰ活性を有することが示唆された。加えて、ＭａＰＡＨ１．２は、１８：１－ＰＡよりも１８：２－ＰＡに対する活性が高かったことから、より不飽和度の高い脂肪酸部分を有するホスファチジン酸に対する活性が高いことが示唆される。
　配列番号１１：プライマー
　配列番号１２：プライマー
　配列番号１３：プライマー
　配列番号１４：プライマー
　配列番号１５：プライマー
　配列番号１６：プライマー
　配列番号１７：プライマー
　配列番号１８：プライマー

Claims (15)

  1. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
  2. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかである、請求項１に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
  3. 　以下の（ａ）～（ｄ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号１又は配列番号６で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号４又は配列番号９で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号５又は配列番号１０で示される塩基配列若しくはその部分配列を含む核酸
  4. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかに記載の核酸。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が７０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
  5. 　以下の（ａ）～（ｇ）のいずれかである、請求項４に記載の核酸。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｂ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｃ）配列番号１又は配列番号６からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｄ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｅ）配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質をコードする塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードする塩基配列を含む核酸
    （ｆ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列に対し相補的な塩基配列からなる核酸と２×ＳＳＣ、５０℃の条件下でハイブリダイズし、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
    （ｇ）配列番号５又は配列番号１０からなる塩基配列と同一性が９０％以上の塩基配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質をコードするエキソンを有する塩基配列を含む核酸
  6. 　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
  7. 　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性を有するタンパク質
  8. 　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７において１若しくは複数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が７０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を有するタンパク質
  9. 　以下の（ａ）又は（ｂ）のいずれかに記載のタンパク質。
    （ａ）配列番号２又は配列番号７において１～１３０個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるホスファチジン酸（ＰＡ）からのジアシルグリセロール（ＤＧ）及び／又はトリグリセリド（ＴＧ）生成活性を向上させる活性を有するタンパク質
    （ｂ）配列番号２又は配列番号７からなるアミノ酸配列と同一性が９０％以上のアミノ酸配列からなるタンパク質であり、かつ、酵母のＰＡＨ１欠損株におけるＰＡからのＤＧ及び／又はＴＧ生成活性を向上させる活性を向上させる活性を有するタンパク質
  10. 　配列番号２又は配列番号７で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
  11. 　請求項１～５のいずれか１項に記載の核酸を含有する組換えベクター。
  12. 　請求項１１に記載の組換えベクターによって形質転換された形質転換体。
  13. 　請求項１２に記載の形質転換体を培養して得られる脂肪酸又は脂質を含む脂肪酸組成物。
  14. 　請求項１２に記載の形質転換体を培養して得られる培養物から脂肪酸又は脂質を採取することを特徴とする、脂肪酸組成物の製造方法。
  15. 　請求項１３に記載の脂肪酸組成物を含む食品。
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