KR101496771B1 - 포스파티드산 포스파타아제 유전자 - Google Patents

Abstract

본 발명의 과제는, 신규한 포스파티드산 포스파타아제 유전자를 제공하는 것이다. 상기 과제는, 서열 번호 1, 서열 번호 4, 또는 서열 번호 5의 염기 서열을 포함하는 핵산, 및 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 및 이들의 변이체의 제공에 의해 해결한다.

Description

포스파티드산 포스파타아제 유전자{PHOSPHATIDIC ACID PHOSPHATASE GENE}

본 출원은 신규한 포스파티드산 포스파타아제 유전자와 그 이용에 관한 것이다.

불포화 결합을 2개소 이상 함유하는 지방산은, 고도 불포화 지방산(PUFA : polyunsaturated fatty acid)이라고 총칭되며, 아라키돈산이나 디호모γ리놀렌산, 에이코사펜타엔산, 도코사헥사엔산 등이 알려져 있다. 이 고도 불포화 지방산은, 동물 체내에서 합성할 수 없는 것도 포함되어 있어, 이러한 고도 불포화 지방산에 관해서는, 필수 지방산으로서 음식물로부터 섭취할 필요가 있다. 고도 불포화 지방산은 넓게 분포되어 있고, 예컨대, 아라키돈산은 동물의 부신선이나 간으로부터 추출한 지질로부터 분리된다. 그러나, 동물 장기에 포함되는 고도 불포화 지방산은 소량으로, 동물 장기로부터 고도 불포화 지방산을 추출하거나 분리하거나 하는 것만으로는, 대량으로 공급하기에는 충분하지 않았다. 그 때문에, 여러가지 미생물을 배양하여 고도 불포화 지방산을 획득하는 방법이 개발되어 왔다. 그 중에서도 모르티에렐라(Mortierella)속 미생물은, 아라키돈산 등의 고도 불포화 지방산 함유 지질을 생산하는 미생물로서 알려져 있다.

또한, 고도 불포화 지방산을 식물에서 생산시키려는 시도도 이루어지고 있다. 고도 불포화 지방산은, 트리아실글리세롤(트리글리세리드, TG라고도 함) 등의 저장 지질을 구성하고, 미생물의 균체 내 혹은 식물 종자 중에 축적되는 것이 알려져 있다.

저장 지질인 트리아실글리세롤은, 생체 내에서 이하와 같이 생성된다. 글리세롤-3-인산에 글리세롤-3-인산 아실기 전이 효소에 의해 아실기가 전이되어 리소포스파티드산이 생기고, 리소포스파티드산에 리소포스파티드산 아실기 전이 효소에 의해 아실기가 전이되어 포스파티드산이 생기고, 포스파티드산이 포스파티드산 포스파타아제에 의해 탈인산화되어 디아실글리세롤이 생기고, 디아실글리세롤에 디아실글리세롤 아실기 전이 효소에 의해 아실기가 전이되어 트리아실글리세롤이 생긴다.

상기 계로(系路) 중에서, 포스파티드산(phosphatidic acid, 이하 「PA」라고 기재하는 경우도 있음. 또한, 1,2-디아실-sn-글리세롤-3-인산이라고 하는 경우도 있음)은, 트리아실글리세롤의 전구체임과 동시에, 디아실형 글리세로 인지질의 생합성 전구체이다. 효모 등에서는 PA와 시티딘 5'-3인산(CTP)으로부터 포스파티드산 시티딜트랜스퍼라아제에 의해 CDP 디아실글리세롤(CDP-DG)이 합성되고, 여러가지 인지질로 생합성된다.

상술한 바와 같이, PA를 탈인산화하여 디아실글리세롤(diacylglycerol, 이하 「DG」라고 기재하는 경우도 있음)을 생합성하는 반응은, 포스파티드산 포스파타아제(E.C. 3.1.3.4, phosphatidic acid phosphatase, 이하 「PAP」라고 기재하는 경우도 있음)가 촉매하는 것이 알려져 있다. 이 PAP는 세균부터 척추 동물까지의 모든 생물에서 존재하는 것이 알려져 있다.

진균류인 효모[사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)]에서는, 2가지 타입의 PAP가 알려져 있다(비특허문헌 1, 2, 7). 하나는 Mg^{2 +} 의존성의 PAP(PAP1)이고, 다른 하나는 Mg²⁺ 비의존성의 PAP(PAP2)이다. PAP1을 코드하는 유전자로는, PAH1 유전자가 알려져 있지만(비특허문헌 3∼5), pah1Δ 변이주는 PAP1 활성을 갖고 있는 점으로부터, 그 밖에도 PAP1 활성을 담당하는 유전자가 있는 것으로 생각되고 있다. pah1Δ 변이주에서는, 핵막이나 ER의 막이 비정상적으로 확장되고, 또한 인지질 생합성의 열쇠가 되는 유전자의 발현이 비정상적으로 높아지는 것이 알려져 있다(비특허문헌 6).

한편, PAP2를 코드하는 유전자로는, DPP1 유전자와 LPP1 유전자가 알려져 있고, 이들이 효모에서의 PAP2 활성을 거의 담당하고 있다. 이들 유전자가 코드하는 효소는 기질 특이성이 넓고, 디아실글리세롤 피로포스페이트(DGPP), 리소포스파티드산, 스핑고이드 베이스 포스페이트나 이소프레노이드포스페이트 등에도 작용하여, 탈인산화하는 것이 알려져 있다.

지질 생산균인 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)에서는, Mg²⁺ 의존성 PAP1 호몰로그로서, MaPAH1.1과 MaPAH1.2의 2종류가 알려져 있다(특허문헌 1). 또한, Mg^{2 +} 비의존성의 PAP2 호몰로그인 MaPAP1 유전자가 알려져 있다(특허문헌 2).

특허문헌 1 : 국제 공개 공보 제WO2011/081135호 팜플렛 특허문헌 2 : 국제 공개 공보 제WO2009/008466호 팜플렛

비특허문헌 1 : Biochem. Biophys. Acta, 1348, 45-55, 1997 비특허문헌 2 : Trends Biochem Sci., 31(12), 694-699, 2006 비특허문헌 3 : EMBO J., 24, 1931-1941, 2005, 비특허문헌 4 : J. Biol. Chem., 281(14), 9210-9218, 2006 비특허문헌 5 : J. Biol. Chem., 281(45), 34537-34548, 2006 비특허문헌 6 : J. Biol. Chem., 282(51), 37026-37035, 2007 비특허문헌 7 : J. Biol. Chem., 284(5), 2593-2597, 2009

현재까지 몇개의 PAP 유전자가 보고되어 있지만, 숙주 세포에 도입하여 발현시킨 경우에, 상기 숙주가 산생하는 지방산 조성물의 지방산 조성을 변화시킬 수 있는 것에 관해 검토된 예는 적다. 숙주 세포에 도입하거나 또는 발현시킴으로써, 목적으로 하는 지방산 조성의 유지를 제조시키거나, 목적으로 하는 지방산의 함유량을 증가시키거나 할 수 있는, 신규한 유전자를 도입할 것이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은, 신규한 포스파티드산 포스파타아제 유전자, 및 그것에 코드되는 단백질, 및 그들의 이용법을 제공하는 것에 있다.

본 발명자는, 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구를 했다. 우선, 지질 생산균 모르티에렐라 알피나의 게놈을 해석하여, 이 중에서 이미 알려진 Mg²⁺ 비의존성의 포스파티드산 포스파타아제(PAP2) 유전자와 상동성이 있는 서열을 추출했다. 또한, PAP를 코드하는 오픈 리딩 프레임(ORF) 전체 길이를 취득하기 위해, cDNA 라이브러리의 스크리닝 혹은 PCR에 의해 전체 길이 cDNA를 클로닝했다. 그 유전자를 효모 등의 고증식능을 갖는 숙주 세포에 도입하여, 클로닝한 cDNA에 의해 코드되는 단백질이 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 것을 확인했다. 이에 따라, 신규한 포스파티드산 포스파타아제(PAP)에 관한 유전자의 클로닝에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 즉, 일양태에 있어서, 본 발명은 이하와 같아도 좋다.

(1) 이하의 (a)∼(g) 중 어느 것에 기재된 핵산:

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(b) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(c) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(f) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산

(g) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산

(2) 이하의 (a)∼(g) 중 어느 것에 기재된 핵산:

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼110개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(b) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(c) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(f) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산

(g) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산

(3) 이하의 (a)∼(d) 중 어느 것에 기재된 핵산:

(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산

(c) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산

(d) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열 또는 그 부분 서열을 포함하는 핵산

(4) 포스파티드산 포스파타아제 활성이, 탄소수 17의 아실기를 함유하는 포스파티드산보다 탄소수 18의 아실기를 함유하는 포스파티드산에 대한 기질 특이성이 높은 것을 특징으로 하는, (1) 또는 (2)에 기재된 핵산.

(5) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재된 단백질:

(a) 서열 번호 2에 있어서 1개 또는 복수개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질

(6) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재된 단백질:

(a) 서열 번호 2에 있어서 1∼110개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질

(7) 포스파티드산 포스파타아제 활성이, 탄소수 17의 아실기를 함유하는 포스파티드산보다 탄소수 18의 아실기를 함유하는 포스파티드산에 대한 기질 특이성이 높은 것을 특징으로 하는, (5) 또는 (6)에 기재된 단백질.

(8) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(9) (1)∼(4) 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 함유하는 재조합 벡터.

(10) (9)에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.

본 발명은, 신규한 PAP 유전자, 및 그것에 코드되는 단백질, 및 그들의 이용법을 제공한다. 본 발명의 PAP는, PAP를 도입하지 않은 숙주가 산생하는 지방산 조성물과 비교하여, 조성이 상이한 지방산 조성물을 숙주 중에 산생 가능한 것이 기대된다. 이에 따라, 원하는 특성이나 효과를 갖는 지질을 제공할 수 있기 때문에, 식품, 화장료, 의약품, 비누 등에 적용할 수 있는 것으로서 유용하다.

도 1a는, MaPAP2.2의 게놈 서열 및 CDS의 염기 서열을 나타낸다.
도 1b는, 도 1a에 이어지는 것이다.
도 2는, MaPAP2.2의 아미노산 서열과, 큰 졸각 버섯 유래의 추정 단백질 및 효모 유래의 ScDPP1(YDR284C : 액세션 번호 AAS56070)의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다.
도 3은, MaPAP2.2의 아미노산 서열과, 모르티에렐라 알피나 유래의 Mg²⁺ 비의존성 PAP(PAP2)로서 이미 알려진 MaPAP1(WO2009/008466)의 아미노산 서열의 얼라인먼트이다. 2중 하선은, Mg²⁺ 비의존성의 포스파티드산 포스파타아제 2형(PAP2) 패밀리 효소의 3개의 보존 영역(N 말단측부터 순서대로, 도메인 1, 도메인 2, 및 도메인 3)을 나타낸다. *는, PAP 활성에 필수적인 아미노산을 나타낸다.
도 4는, MaPAP2.2의 18:2-PA를 18:2-DG로 변환하는 활성에 관해, Mg^{2 +} 의존성에 대해 검토한 결과를 나타내는 그래프이다(n=1). A는, Mg^{2 +}를 첨가한 경우의 결과를 나타낸다. B는, EDTA를 첨가한 경우(Mg^{2 +} 불포함)의 결과를 나타낸다. 종축은, DG 분획 중에 발견된 18:2의, 조(粗)효소액의 단백질당의 양(㎍/mg·단백질)을 나타낸다.
도 5는, Mg²⁺ 불포함의 반응액에서의, MaPAP2.2(A) 및 MaPAP1(B)의 18:2-PA를 18:2-DG로 변환하는 활성에 관해 검토한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 종축은, DG 분획 중에 발견된 18:2의, 조효소액의 단백질당의 양(㎍/mg·단백질)을 나타낸다.
도 6의 A는, MaPAP2.2를 포함하는 반응액 및 컨트롤에 있어서, 기질인 포스파티드산을 첨가하지 않는 경우의 18:1-DG의 양을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 도 6의 B는, MaPAP2.2를 포함하는 반응액 및 컨트롤에 있어서, 기질로서 18:1-PA를 첨가한 경우의, 반응 후의 18:1-DG의 양을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 종축은 모두, DG 분획 중에 발견된 18:1의, 조효소액의 단백질당의 양(㎍/mg·단백질)을 나타낸다.
도 7은, MaPAP2.2를 포함하는 반응액 및 컨트롤에 있어서, 기질로서 17:0-PA를 첨가한 경우의, 반응 후의 17:0-DG의 양을 검토한 결과를 나타내는 그래프이다(n=3). 종축은 모두, DG 분획 중에 발견된 17:0의, 조효소액의 단백질당의 양(㎍/mg·단백질)을 나타낸다.

본 발명은, 포스파티드산을 탈인산화하여, 디아실글리세롤을 생성시키는 것을 특징으로 하는, 모르티에렐라속 유래의 신규한 포스파티드산 포스파타아제 유전자, 그것에 코드되는 단백질, 및 그들의 이용법에 관한 것이다.

포스파티드산 포스파타아제는, 포스파티드산을 탈인산화하여, 디아실글리세롤을 생성하는 반응을 촉매하는 효소이다. 본 발명의 PAP의 기질은, 통상, 포스파티드산이지만, 이것에 한정되지 않는다.

포스파티드산 포스파타아제를 코드하는 핵산

본 발명의 포스파티드산 포스파타아제(PAP)에는, MaPAP2.2 및 그 변이체가 포함된다. MaPAP2.2를 코드하는 핵산의 cDNA, CDS, ORF 및 아미노산 서열의 대응 관계를 이하의 표 1에 정리하여 기재했다.

	MaPAP2.2
	서열 번호	서열 번호 5의 해당 영역
cDNA	서열 번호 5	*****
CDS	서열 번호 3	제75∼1166번째
ORF	서열 번호 1	제75∼1163번째
아미노산 서열	서열 번호 2	*****

즉, MaPAP2.2에 관련되는 서열로는, MaPAP2.2의 아미노산 서열인 서열 번호 2, MaPAP2.2의 ORF의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 1, 그리고, 그 CDS의 영역을 나타내는 서열인 서열 번호 3, 및 그 cDNA의 염기 서열인 서열 번호 5를 들 수 있다. 이 중, 서열 번호 1은 서열 번호 5의 제75∼1163번째의 염기 서열에 상당하고, 서열 번호 3은 서열 번호 5의 제75∼1166번째의 염기 서열에 상당한다. 또한, MaPAP2.2를 코드하는 게놈 염기 서열로서, 서열 번호 4를 들 수 있다. 서열 번호 4의 게놈 서열은, 엑손 3개와 인트론 2개로 이루어져 있고, 엑손 영역은 서열 번호 4의 제1∼207번째, 제445∼582번째, 제889∼1632번째이다.

본 명세서에 있어서 핵산이란, 단일쇄 및 이중쇄의 DNA 외에, 그 RNA 상보체도 포함하고, 천연 유래의 것이어도 좋고, 인공적으로 제작한 것이어도 좋다. DNA에는, 예컨대, 게놈 DNA나, 상기 게놈 DNA에 대응하는 cDNA, 화학적으로 합성된 DNA, PCR에 의해 증폭된 DNA, 및 이들의 조합이나, DNA와 RNA의 하이브리드를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

본 발명의 핵산의 바람직한 양태로는, (a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열, (c) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열 등을 포함하는 핵산을 들 수 있다.

상기 염기 서열을 얻기 위해서는, PAP 활성을 갖는 생물의 EST나 게놈 DNA의 염기 서열 데이터로부터, 이미 알려진 PAP 활성을 갖는 단백질과 상동성이 있는 단백질을 코드하는 염기 서열을 탐색할 수도 있다. PAP 활성을 갖는 생물로는, 지질 생산균이 바람직하고, 지질 생산균으로는 M. 알피나(M. alpina)를 들 수 있지만, 이것에 한정되지 않는다.

EST 해석을 행하는 경우에는, 우선, cDNA 라이브러리를 제작한다. cDNA 라이브러리의 제작 방법에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001))를 참조할 수 있다. 또한, 시판되는 cDNA 라이브러리 제작 키트를 이용해도 좋다. 본 발명에 알맞은 cDNA 라이브러리의 제작 방법으로는, 예컨대 이하와 같은 방법을 들 수 있다. 즉, 지질 생산균인 M. 알피나의 적당한 주(株)를 적당한 배지에 식균하고, 적당한 기간 전배양한다. 이 전배양에 알맞은 배양 조건으로는, 예컨대, 배지 조성으로는, 1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0을 들 수 있고, 배양 기간은 3∼4일간, 배양 온도는 28℃인 조건을 들 수 있다. 그 후, 전배양물을 적당한 조건에서 본배양에 제공한다. 본배양에 알맞은 배지 조성으로는, 예컨대, 1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데칸올, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂·2H₂O, 0.05% MgCl₂·6H₂O, pH 6.0을 들 수 있다. 본배양에 알맞은 배양 조건으로는, 예컨대, 300 rpm, 1 vvm, 26℃에서 8일간 통기 교반 배양하는 조건을 들 수 있다. 배양 기간중에 적당량의 글루코오스를 첨가해도 좋다. 본배양 중에 적시에 배양물을 채취하고, 그곳으로부터 균체를 회수하여, 전RNA를 조제한다. 전RNA의 조제에는, 염산구아니딘/CsCl 법 등의 공지된 방법을 이용할 수 있다. 얻어진 전RNA로부터 시판되는 키트를 이용하여 poly(A) ⁺RNA를 정제할 수 있다. 또한, 시판되는 키트를 이용하여 cDNA 라이브러리를 제작할 수 있다. 그 후, 제작한 cDNA 라이브러리의 임의의 클론의 염기 서열을, 벡터 상에 인서트 부분의 염기 서열을 결정할 수 있도록 설계된 프라이머를 이용하여 결정하여, EST를 얻을 수 있다. 예컨대, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)로 cDNA 라이브러리를 제작한 경우에는, 디렉셔널 클로닝을 행할 수 있다.

게놈 DNA를 해석하는 경우에는, PAP 활성을 갖는 생물의 세포를 배양하고, 상기 세포로부터 게놈 DNA를 조제한다. 얻어진 게놈 DNA의 염기 서열을 결정하고, 결정한 염기 서열을 어셈블리한다. 최종적으로 얻어진 수퍼콘틱의 서열로부터, 이미 알려진 PAP 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열과 상동성이 높은 아미노산 서열을 코드하는 서열을 탐색한다. 이러한 아미노산 서열을 코드하는 것으로서 동정된 수퍼콘틱의 서열로부터 프라이머를 제작하고, 상술한 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여 PCR을 행하고, 얻어진 DNA 단편을 플라스미드에 삽입하여, 클론화한다. 클론화된 플라스미드를 주형으로 하고, 상술한 프라이머를 이용하여 PCR을 행함으로써 프로브를 제작한다. 제작한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝한다.

MaPAP2.2의 아미노산 서열을, GenBank에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대하여 BLASTp 프로그램으로 상동성 검색을 행했다. 이 아미노산 서열은, 큰 졸각 버섯의 추정 단백질(서열 번호 10, 액세션 번호 : XP_001878243)과 가장 높은 스코어로 동정되고, 동일성은 36.7%이다. 또한, 모르티에렐라 알피나 유래의 공지된 PAP2(Mg²⁺ 비의존성의 PAP)인 MaPAP1의 아미노산 서열과, MaPAP2.2의 아미노산 서열 사이의 동일성은 20.5%이다.

본 발명은 또한, 상기 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열, 또는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산을 포함한다. 「동등한 기능을 갖는」이란, 본 발명의 염기 서열이 코드하는 단백질 및 본 발명의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이 포스파티드산 포스파타아제(PAP) 활성을 갖는 것을 의미한다. 본 명세서에 있어서, PAP 활성이란, 포스파티드산을 탈인산화하여, 디아실글리세롤을 생성하는 반응을 촉매하는 활성이다. 또한, PAP 활성은, 탄소수 17의 아실기를 함유하는 포스파티드산보다 탄소수 18의 아실기를 함유하는 포스파티드산에 대한 기질 특이성이 높은 것이어도 좋지만, 이것에 한정되지 않는다. 또한, PAP 활성은, Mg²⁺ 비의존성이어도 좋지만, 이것에 한정되지 않는다.

서열 번호 1로 표시되는 염기 서열, 또는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산의 변이체로서 상기 핵산과 동등한 기능을 갖는 핵산으로는, 이하의 (a)∼(g) 중 어느 것에 기재된 염기 서열을 포함하는 핵산을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

구체적으로는,

(i) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 수개(예컨대, 1∼110개, 1∼100개, 1∼75개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개))의 아미노산이 결실된 아미노산 서열,

(ii) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 수개(예컨대, 1∼110개, 1∼100개, 1∼75개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개))의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 아미노산 서열,

(iii) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 수개(예컨대, 1∼110개, 1∼100개, 1∼75개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개))의 다른 아미노산이 부가된 아미노산 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii)을 조합한 아미노산 서열

로 이루어지는 단백질이며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

상기 중, 치환은, 바람직하게는 보존적 치환이다. 보존적 치환이란, 특정한 아미노산 잔기를 유사한 물리 화학적 특징을 갖는 잔기로 치환하는 것인데, 본래의 서열 구조에 관한 특징을 실질적으로 변화시키지 않는다면 어떠한 치환이어도 좋고, 예컨대, 치환 아미노산이, 본래의 서열에 존재하는 나선을 파괴하거나, 본래의 서열을 특징짓는 다른 종류의 2차 구조를 파괴하거나 하지 않는다면 어떠한 치환이어도 좋다.

보존적 치환은, 일반적으로는, 생물학적 합성계나 화학적 펩티드 합성에 의해 도입되는데, 바람직하게는 화학적 펩티드 합성에 의한다. 이 경우, 치환기에는, 비천연 아미노산 잔기가 포함되어 있어도 좋고, 펩티드 모방체나, 아미노산 서열 중, 치환되어 있지 않은 영역이 역전되어 있는 역전형 또는 동영역이 반전되어 있는 반전형도 포함된다.

이하에, 아미노산 잔기를 치환 가능한 잔기별로 분류하여 예시하지만, 치환 가능한 아미노산 잔기는 이하에 기재되어 있는 것에 한정되지 않는다.

A군 : 류신, 이소류신, 노르류신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌 및 시클로헥실알라닌

B군 : 아스파라긴산, 글루타민산, 이소아스파라긴산, 이소글루타민산, 2-아미노아디프산 및 2-아미노수베르산

C군 : 아스파라긴 및 글루타민

D군 : 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산 및 2,3-디아미노프로피온산

E군 : 프롤린, 3-히드록시프롤린 및 4-히드록시프롤린

F군 : 세린, 트레오닌 및 호모세린

G군 : 페닐알라닌 및 티로신

비보존적 치환의 경우에는, 상기 종류 중, 어느 하나의 멤버와 다른 종류의 멤버를 교환할 수 있는데, 이 경우에는, 본 발명의 단백질의 생물학적 기능을 유지하기 위해, 아미노산의 하이드로퍼시 지수(하이드로퍼시 아미노산 지수)를 고려하는 것이 바람직하다(Kyte 등, J. Mol. Biol., 157:105-131(1982)).

또한, 비보존적 치환의 경우에는, 친수성에 기초하여 아미노산의 치환을 행할 수 있다.

본 명세서 및 도면에 있어서, 염기나 아미노산 및 그 약어는, IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature에 따르거나, 또는, 예컨대, Immunology--A Synthesis(제2판, E.S. Golub 및 D.R. Gren 감수, Sinauer Associates, 매사추세츠주 선덜랜드(1991)) 등에 기재되어 있는 것과 같은, 당업계에서 관용되고 있는 약어에 기초한다. 또한 아미노산에 관해 광학 이성체가 있을 수 있는 경우에는, 특별히 명시하지 않으면 L체를 나타낸다.

D-아미노산 등의 상기한 아미노산의 입체 이성체, α,α-2치환 아미노산 등의 비천연 아미노산, N-알킬아미노산, 젖산, 및 그 밖의 비관용적인 아미노산도 또한, 본 발명의 단백질을 구성하는 요소가 될 수 있다.

또, 본 명세서에서 이용하는 단백질의 표기법은, 표준적 용법 및 당업계에서 관용되고 있는 표기법에 기초하고, 좌측 방향은 아미노 말단 방향이고, 그리고 우측 방향은 카르복시 말단 방향이다.

마찬가지로, 일반적으로는, 특별히 언급하지 않는 한, 단일쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌단은 5' 단이고, 이중쇄 폴리뉴클레오티드 서열의 좌측 방향을 5' 방향으로 한다.

당업자라면, 당업계에서 공지된 기술을 이용하여, 본 명세서에 기재한 단백질의 적당한 변이체를 설계하여, 제작할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 그다지 중요하지 않다고 생각되는 영역을 타게팅함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성을 손상시키지 않고 그 구조를 변화시킬 수 있는 단백질 분자 중의 적절한 영역을 동정할 수 있다. 또한, 유사한 단백질 사이에서 보존되어 있는 분자의 잔기 및 영역을 동정할 수도 있다. 또한, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하다고 생각되는 영역 중에, 생물학적 활성을 손상시키지 않으며, 또한, 단백질의 폴리펩티드 구조에 악영향을 미치지 않고, 보존적 아미노산 치환을 도입할 수도 있다.

특히, 도 3에 있어서 2중 하선으로 나타낸 바와 같이, MaPAP2.2의 아미노산 서열(서열 번호 2) 중의 제115∼123 잔기, 제172∼175 잔기, 및 제229∼233 잔기에, Mg²⁺ 비의존성의 포스파티드산 포스파타아제 2형(PAP2) 패밀리 효소의 3개의 보존 영역이 존재한다. 또한, PAP2 패밀리 효소의 3개의 보존 영역 중, 도메인 1의 아르기닌, 도메인 2 및 3의 히스티딘은, 활성에 필수적인 아미노산으로서 알려져 있고, MaPAP2.2에 있어서도 상기 아미노산이, 각각 서열 번호 2의 제122 잔기의 아르기닌, 제175 잔기의 히스티딘 및 제229 잔기의 히스티딘으로서 보존되어 있다. 상기 보존 영역은, PAP2 패밀리 효소에 필수적인 영역이고, 본 발명의 PAP에 있어서도 중요한 영역이다. 따라서, 본 발명의 변이체는, 상기 보존 영역이 보존되어 있는 한, 어떠한 변이체여도 좋다.

당업자라면, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성 또는 구조에 중요하고, 동단백질의 펩티드와 유사한 펩티드의 잔기를 동정하고, 이 2개의 펩티드의 아미노산 잔기를 비교하여, 본 발명의 단백질과 유사한 단백질의 어느 잔기가, 생물학적 활성 또는 구조에 중요한 아미노산 잔기에 대응하는 아미노산 잔기인지를 예측하는, 소위, 구조-기능 연구를 행할 수 있다. 또한, 이와 같이 예측한 아미노산 잔기의 화학적으로 유사한 아미노산 치환을 선택함으로써, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성이 유지되어 있는 변이체를 선택할 수도 있다. 또한, 당업자라면, 본 단백질의 변이체의 3차원 구조 및 아미노산 서열을 해석할 수도 있다. 또한, 얻어진 해석 결과로부터, 단백질의 3차원 구조에 관한, 아미노산 잔기의 얼라인먼트를 예측할 수도 있다. 단백질 표면 상에 있을 것으로 예측되는 아미노산 잔기는, 다른 분자와의 중요한 상호 작용에 관여할 가능성이 있지만, 당업자라면, 상기한 바와 같은 해석 결과에 기초하여, 이러한 단백질 표면 상에 있을 것으로 예측되는 아미노산 잔기를 변화시키지 않는 것과 같은 변이체를 제작할 수 있다. 또한, 당업자라면, 본 발명의 단백질을 구성하는 각각의 아미노산 잔기 중, 하나의 아미노산 잔기만을 치환하는 것과 같은 변이체를 제작할 수도 있다. 이러한 변이체를 공지된 아세이 방법에 의해 스크리닝하여, 개개의 변이체의 정보를 수집할 수 있다. 이에 따라, 어느 특정한 아미노산 잔기가 치환된 변이체의 생물학적 활성이, 본 발명의 단백질의 생물학적 활성에 비해 저하되는 경우, 그러한 생물학적 활성을 나타내지 않는 경우, 또는, 본 단백질의 생물학적 활성을 저해하는 것과 같은 부적절한 활성을 발생시키는 것과 같은 경우를 비교함으로써, 본 발명의 단백질을 구성하는 개개의 아미노산 잔기의 유용성을 평가할 수 있다. 또한, 당업자라면, 이러한 일상적인 실험으로부터 수집한 정보에 기초하여, 단독으로, 또는 다른 돌연 변이와 조합하여, 본 발명의 단백질의 변이체로서는 바람직하지 않은 아미노산 치환을 용이하게 해석할 수 있다.

상기한 바와 같이, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001)), 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997)), Kunkel(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92, Kunkel(1988) Method. Enzymol. 85:2763-6 등에 기재된 부위 특이적 변이 유발법 등의 방법에 따라 조제할 수 있다. 이러한 아미노산의 결실, 치환 혹은 부가 등의 변이가 이루어진 변이체의 제작은, 예컨대, Kunkel 법이나 Gapped duplex 법 등의 공지된 수법에 의해, 부위 특이적 돌연 변이 유발법을 이용한 변이 도입용 키트, 예컨대 QuikChange^TM Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제조), GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(인비트로젠사 제조), TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K, Mutan-Super Express Km 등 : 다카라 바이오사 제조) 등을 이용하여 행할 수 있다.

또, 단백질의 아미노산 서열에, 그 활성을 유지하면서 1개 혹은 복수개의 아미노산의 결실, 치환, 혹은 부가를 도입하는 방법으로는, 상기한 부위 특이적 변이 유발 외에도, 유전자를 변이원으로 처리하는 방법, 및 유전자를 선택적으로 개열 하여 선택된 뉴클레오티드를 제거, 치환 혹은 부가한 후에 연결하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 1∼30개, 1∼20개, 또는 1∼10개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

본 발명의 핵산이 코드하는 단백질에서의 아미노산의 변이 또는 수식의 수, 혹은 변이 또는 수식의 부위는, PAP 활성이 유지되는 한 제한은 없다.

PAP 활성은, 공지된 방법을 이용하여 측정하는 것이 가능하다. 예컨대, 이하의 문헌 : J. Biol. Chem., 273, 14331-14338(1998)을 참조할 수 있다.

예컨대, PAP 활성은 이하와 같이 측정해도 좋다. 본 발명의 PAP를 발현시킨 형질 전환 세포를 파쇄하고, 그 세포 파쇄액을 원심 분리하고 상청을 회수하여, 조효소액으로 한다. 조효소액을 또한 본 발명의 PAP에 관해 정제해도 좋다. 그리고, 본 발명의 PAP를 포함하는 조효소액 또는 정제한 본 발명의 PAP를, 100 ㎍/mL 포스파티드산, 및 50 mM Tris-HCl(pH 7.5)을 포함하는 반응액에 첨가하고, 25℃∼28℃에서 적당한 시간 반응시킨다. 클로로포름 : 메탄올을 첨가하여 반응을 정지시킨 후, 지질의 추출을 행하고, 얻어진 지질을 박층 크로마토그래피 등에 의해 분획하여, 생성된 디아실글리세롤량을 정량할 수 있다.

(b) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

상기 염기 서열은, 당업자에게 공지된 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, cDNA 라이브러리 및 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다.

하이브리다이제이션법의 상세한 순서에 관해서는, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001) ; 특히 Section 6-7) , 『Current Protocols in Molecular Biology』(John Wiley & Sons(1987-1997) ; 특히 Section 6.3-6.4), 『DNA Cloning 1 : Core Techniques, A Practical Approach 2nd ed.』(Oxford University(1995) ; 하이브리다이제이션 조건에 관해서는 특히 Section 2.10) 등을 참조할 수 있다.

하이브리다이제이션 조건의 강도는, 주로 하이브리다이제이션 조건, 보다 바람직하게는 하이브리다이제이션 조건 및 세정 조건에 의해 결정된다. 본 명세서에서의 「스트린젠트한 조건」에는, 중정도 또는 고도로 스트린젠트한 조건이 포함된다.

구체적으로는, 중정도로 스트린젠트한 조건으로는, 예컨대 하이브리다이제이션 조건으로서, 1×SSC∼6×SSC, 42℃∼55℃의 조건, 보다 바람직하게는 1×SSC∼3×SSC, 45℃∼50℃의 조건, 가장 바람직하게는 2×SSC, 50℃의 조건을 들 수 있다. 하이브리다이제이션 용액 중에, 예컨대, 약 50%의 포름아미드를 포함하는 경우에는, 상기 온도보다 5℃ 내지 15℃ 낮은 온도를 채용한다. 세정 조건으로는, 0.5×SSC∼6×SSC, 40℃∼60℃를 들 수 있다. 하이브리다이제이션 및 세정시에는, 일반적으로, 0.05%∼0.2%, 바람직하게는 약 0.1% SDS를 첨가해도 좋다.

고도로 스트린젠트(하이 스트린젠트)한 조건으로는, 중정도로 스트린젠트한 조건보다 높은 온도 및/또는 낮은 염 농도에서의 하이브리다이제이션 및/또는 세정을 포함한다. 예컨대, 하이브리다이제이션 조건으로서, 0.1×SSC∼2×SSC, 55℃∼65℃의 조건, 보다 바람직하게는 0.1×SSC∼1×SSC, 60℃∼65℃의 조건, 가장 바람직하게는 0.2×SSC, 63℃의 조건을 들 수 있다. 세정 조건으로서, 0.2×SSC∼2×SSC, 50℃∼68℃, 보다 바람직하게는 0.2×SSC, 60∼65℃를 들 수 있다.

특히 본 발명에 이용되는 하이브리다이제이션 조건으로는, 예컨대, 5×SSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 및 50% 포름아미드 중 42℃의 조건에서 프리하이브리다이제이션을 행한 후, 프로브를 첨가하고 하룻밤 42℃로 유지하여 하이브리드 형성시키고, 그 후, 0.2×SSC, 0.1% SDS 중, 65℃에서 20분간의 세정을 3회 행한다는 조건을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.

또한, 프로브에 방사성 물질을 사용하지 않는 시판되는 하이브리다이제이션 키트를 사용할 수도 있다. 구체적으로는, DIG 핵산 검출 키트(로슈·다이아그노스틱스사), ECL direct labeling & detection system(Amersham사 제조)을 사용한 하이브리다이제이션 등을 들 수 있다.

본 발명에 포함되는 염기 서열로는, 바람직하게는, 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

(c) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

바람직하게는, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 대하여 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95%, 98% 또는 99% 이상)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산이며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

2개의 염기 서열의 동일성 %는, 시각적 검사나 수학적 계산에 의해 결정할 수 있지만, 컴퓨터 프로그램을 사용하여 2개의 핵산의 서열 정보를 비교함으로써 결정하는 것이 바람직하다. 서열 비교 컴퓨터 프로그램으로는, 예컨대, 미국 국립 의학 라이브러리의 웹사이트 : http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html로부터 이용할 수 있는 BLASTN 프로그램(Altschul et al.(1990) J. Mol. Biol. 215 : 403-10) : 버전 2.2.7, 또는 WU-BLAST2.0 알고리즘 등을 들 수 있다. WU-BLAST2.0에 관한 표준적인 디폴트 파라미터의 설정은, 이하의 인터넷 사이트 : http://blast.wustl.edu에 기재되어 있는 것을 이용할 수 있다.

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

본 발명의 핵산이 코드하는 단백질은, PAP 활성을 갖는 한, MaPAP2.2의 아미노산 서열과 동일성이 있는 단백질이어도 좋다. 구체적으로는, 본 발명의 핵산이 코드하는 단백질의 아미노산 서열로서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 85%, 더욱 바람직하게는 90%(예컨대, 95%, 나아가서는 98%) 이상의 동일성을 갖는 아미노산 서열 등을 들 수 있다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다. 더욱 바람직하게는, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 95% 이상인 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열이다.

2개의 아미노산 서열의 동일성 %는, 시각적 검사 및 수학적 계산에 의해 결정할 수 있다. 또한, 컴퓨터 프로그램을 이용하여 동일성 %를 결정할 수도 있다. 그러한 컴퓨터 프로그램으로는, 예컨대, BLAST, FASTA(Altschul 등, J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)), 및 ClustalW 등을 들 수 있다. 특히, BLAST 프로그램에 의한 동일성 검색의 각종 조건(파라미터)은, Altschul 등(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)에 기재된 것으로, 미국 바이오 테크놀로지 정보 센터(NCBI)나 DNA Data Bank of Japan(DDBJ)의 웹사이트로부터 공적으로 입수할 수 있다(BLAST 매뉴얼, Altschul 등 NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894 ; Altschul 등). 또한, 유전 정보 처리 소프트웨어 GENETYX Ver.7(제네틱스), DINASIS Pro(히타치 소프트), Vector NTI(Infomax) 등의 프로그램을 이용하여 결정할 수도 있다.

복수의 아미노산 서열을 병렬시키는 특정한 얼라인먼트 스킴은, 서열 중, 특정한 짧은 영역의 매칭도 나타낼 수 있기 때문에, 이용한 서열의 전체 길이 서열 사이에 유의적인 관계가 없는 경우에도, 그러한 영역에서, 특정한 서열 동일성이 매우 높은 영역을 검출할 수도 있다. 또한, BLAST 알고리즘은, BLOSUM62 아미노산 스코어가 부여된 매트릭스를 이용할 수 있는데, 선택 파라미터로는, 이하의 것을 이용할 수 있다 : (A) 낮은 조성 복잡성을 갖는 퀴리 서열의 세그먼트[Wootton 및 Federhen의 SEG 프로그램(Computers and Chemistry, 1993)에 의해 결정된다 ; Wootton 및 Federhen, 1996 「서열 데이터베이스에서의 조성 편중 영역의 해석(Analysis of compositionally biased regions in sequence databases)」 Methods Enzymol., 266 : 544-71도 참조할 것], 또는, 단주기성의 내부 리피트로 이루어지는 세그먼트(Claverie 및 States(Computers and Chemistry, 1993)의 XNU 프로그램에 의해 결정됨)를 마스크하기 위한 필터를 포함하는 것, 및 (B) 데이터베이스 서열에 대한 적합을 보고하기 위한 통계학적 유의성의 임계치, 또는 E-스코어(Karlin 및 Altschul, 1990)의 통계학적 모델에 따라, 단순히 우연에 의해 발견되는 적합의 기대 확률 ; 어느 적합에서 기인하는 통계학적 유의차가 E-스코어 임계치보다 큰 경우, 이 적합은 보고되지 않는다.

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다.

서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 하이브리다이즈의 조건은 상기한 바와 같다.

(f) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산

서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열은, MaPAP2.2를 코드하는 게놈 DNA 서열이다.

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함한다.

상기 염기 서열은, 당업자에게 공지된 방법으로 적당한 단편을 이용하여 프로브를 제작하고, 이 프로브를 이용하여, 콜로니 하이브리다이제이션, 플라크 하이브리다이제이션, 서던 블롯 등의 공지된 하이브리다이제이션법에 의해, 게놈 라이브러리 등으로부터 얻을 수 있다. 하이브리다이즈의 조건은 상기한 바와 같다.

(g) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 포함하는 핵산

본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 적어도 70% 이상의 동일성을 갖는 염기 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함한다. 바람직하게는, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열에 대하여 적어도 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95%, 98% 또는 99% 이상)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 들 수 있다. 2개의 염기 서열의 동일성%은, 상술한 바와 같이 결정할 수 있다.

서열 번호 4의 게놈 DNA 서열은, 엑손 3개와 인트론 2개로 이루어져 있고, 엑손 영역은 서열 번호 4의 제1∼207번째, 제445∼582번째, 제889∼1632번째이다.

다른 양태에 있어서, 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4로 표시되는 게놈 DNA 서열에 있어서, 인트론 영역의 염기 서열이 서열 번호 4로 표시되는 서열에 대하여 100% 동일하고, 그리고, 엑손 영역의 염기 서열이 서열 번호 4로 표시되는 서열에 대하여 적어도 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열을 들 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4로 표시되는 게놈 DNA 서열에 있어서, 엑손 영역의 염기 서열이 서열 번호 4로 표시되는 서열에 대하여 100% 동일하고, 그리고, 인트론 영역의 염기 서열이 서열 번호 4로 표시되는 서열에 대하여 적어도 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하며, 또한, 스플라이싱에 의해 인트론 영역이 탈리 가능하고, 그것에 의해 엑손 영역이 연결되어 PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

또 다른 양태에 있어서, 본 발명의 핵산에 포함되는 염기 서열은, 서열 번호 4로 표시되는 게놈 DNA 서열에 있어서, 인트론 영역의 염기 서열이 서열 번호 4로 표시되는 서열에 대하여 적어도 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하고, 그리고, 엑손 영역의 염기 서열이 서열 번호 5 또는 서열 번호 10으로 표시되는 서열에 대하여 적어도 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상(예컨대, 85% 이상, 한층 더 바람직하게는 90% 이상, 나아가서는 95% 이상, 98% 이상, 99% 이상)의 동일성을 갖는 염기 서열을 포함하며, 또한, 스플라이싱에 의해 인트론 영역이 탈리 가능하고, 그것에 의해 연결한 엑손 영역이 PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 들 수 있다.

2개의 염기 서열의 동일성 %는, 상술한 방법에 의해 결정할 수 있다.

또한, 본 발명의 핵산에는, 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 염기 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산도 포함된다. 구체적으로는,

(i) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 수개(예컨대, 1∼330개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개))의 염기가 결실된 염기 서열,

(ii) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열 중 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 수개(예컨대, 1∼330개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개))의 염기가 다른 염기로 치환된 염기 서열,

(iii) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 있어서 1개 또는 복수개(바람직하게는 1개 또는 수개(예컨대, 1∼330개, 1∼300개, 1∼250개, 1∼200개, 1∼150개, 1∼100개, 1∼50개, 1∼30개, 1∼25개, 1∼20개, 1∼15개, 더욱 바람직하게는 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개))의 다른 염기가 부가된 염기 서열, 또는

(iv) 상기 (i)∼(iii)을 조합한 염기 서열

이며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질을 코드하고 있는 염기 서열을 포함하는 핵산을 이용할 수도 있다.

본 발명의 핵산의 다른 양태로는, 이하의 (a)∼(d) 중 어느 것에 기재된 염기 서열의 프래그먼트를 포함하는 핵산도 포함된다:

(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열

(b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열

(c) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열

(d) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열.

(a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열, (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열, (d) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열에 관해서는, 표 1에 기재한 바와 같다. 또한, 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열에 관해서도 상술한 바와 같다. 상기 서열의 프래그먼트란, 상기 염기 서열에 포함되는 ORF, CDS, 생물학적 활성을 갖는 영역, 이하에 기재하는 바와 같은 프라이머로서 이용한 영역, 프로브가 될 수 있는 영역이 포함되고, 천연 유래의 것이어도 좋고, 인공적으로 제작한 것이어도 좋다.

또한, 본 발명의 핵산에는 이하의 핵산도 포함된다.

(1) 이하의 (a)∼(g) 중 어느 것에 기재된 핵산.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(b) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산

(c) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산,

(f) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 스트린젠트한 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산

(g) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 70% 이상인 염기 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산.

(2) 이하의 (a)∼(g) 중 어느 것인, (1)에 기재된 핵산.

(a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1∼130개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(b) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산

(c) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지는 염기 서열을 포함하는 핵산

(d) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열을 포함하는 핵산

(e) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산

(f) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열로 이루어지는 핵산과 2×SSC, 50℃의 조건하에서 하이브리다이즈하는 핵산

(g) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열과 동일성이 90% 이상인 염기 서열로 이루어지는 염기 서열을 포함하는 핵산

포스파티드산 포스파타아제 단백질

본 발명의 단백질은, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 및 그 변이체로서 상기 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질을 포함하고, 천연 유래의 것이어도 좋고, 인공적으로 제작한 것이어도 좋다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질에 관해서는, 상기한 바와 같다. 「동등한 기능을 갖는 단백질」이란, 상기 『포스파티드산 포스파타아제를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같이, PAP 활성을 갖는 단백질을 의미한다.

본 발명에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질과 동등한 기능을 갖는 단백질로는, 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재된 단백질을 들 수 있다.

(a) 서열 번호 2에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질이며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질.

상기 중, 서열 번호 2에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열, 또는, 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 70% 이상인 아미노산 서열에 관해서는, 상기 『포스파티드산 포스파타아제를 코드하는 핵산』의 항에서 설명한 바와 같다. 또한, 상기 「PAP 활성을 갖는 단백질」은, 서열 번호 1의 염기 서열을 포함하는 핵산에 의해 코드되는 단백질의 변이체, 또는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 1개 또는 복수개의 아미노산이 치환, 결실 혹은 부가 등의 많은 종류의 수식에 의해 변이된 단백질, 혹은 아미노산 측쇄 등이 수식되어 있는 수식 단백질, 다른 단백질과의 융합 단백질이며, 또한, PAP 활성을 갖는 단백질도 포함된다.

또한, 본 발명의 단백질은, 인공적으로 제작한 것이어도 좋고, 그 경우에는, Fmoc 법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc 법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드 켐텍사 제조, 퍼킨 엘머사 제조, 파마시아사 제조, 프로테인 테크놀로지 인스트루먼트사 제조, 신세셀-베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 시마즈 제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.

또한, 본 발명의 단백질에는, 이하의 단백질도 포함된다:

(1) (a) 서열 번호 2에 있어서 1개 혹은 복수개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 80% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.

(2) 이하의 (a) 또는 (b) 중 어느 것에 기재된 단백질.

(a) 서열 번호 2에 있어서 1∼110개의 아미노산이 결실, 치환 혹은 부가된 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

(b) 서열 번호 2로 이루어지는 아미노산 서열과 동일성이 90% 이상인 아미노산 서열로 이루어지는 단백질

핵산의 클로닝

PAP의 핵산은, 예컨대, 적절한 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리로부터 스크리닝함으로써, 클로닝할 수 있다. 또한, 적절한 프라이머를 이용하여 PCR 반응에 의해 증폭하고, 적절한 벡터에 연결함으로써 클로닝할 수 있다. 또한, 별도의 벡터에 서브 클로닝할 수도 있다.

예컨대, pBlue-Script ^TMSK(+)(Stratagene), pGEM-T(Promega), pAmp(TM : Gibco-BRL), p-Direct(Clontech), pCR2.1-TOPO(Invitrogene) 등의 시판되는 플라스미드 벡터를 이용할 수 있다. 또한, PCR 반응으로 증폭하는 경우, 프라이머는, 상기한 서열 번호 5 등으로 표시되는 염기 서열의 어느 부분이나 이용할 수 있지만, 예컨대,

상류측용 프라이머로서, 프라이머 PAP2.2-1f : 5'-TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT-3'(서열 번호 6),

하류측용 프라이머로서, 프라이머 PAP2.2-4r : 5'-GACAATGCCGAGGATCGAGCC-3'(서열 번호 7)

등을 각각 이용할 수 있다. 그리고, M. 알피나 균체로부터 조제한 cDNA에, 상기 프라이머 및 DNA 폴리머라아제 등을 작용시켜 PCR 반응을 행한다. 상기 방법은, 『Molecular Cloning, A Laboratory Manual 3rd ed.』(Cold Spring Harbor Press(2001)) 등에 따라, 당업자라면 용이하게 행할 수 있는데, 본 발명의 PCR 반응의 조건으로는, 예컨대 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도 : 90℃∼95℃

어닐링 온도 : 40℃∼60℃

신장 온도 : 60℃∼75℃

사이클수 : 10회 이상

얻어진 PCR 산물의 정제에는 공지된 방법을 이용할 수 있다. 예컨대, GENECLEAN(푸나코시), QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN), ExoSAP-IT(GE 헬스케어 바이오 사이언스) 등의 키트를 이용하는 방법, DEAE-셀룰로오스 여과지를 이용하는 방법, 투석 튜브를 이용하는 방법 등이 있다. 아가로오스 겔을 이용하는 경우에는, 아가로오스 겔 전기 영동을 행하고, 염기 서열 단편을 아가로오스 겔로부터 잘라내고, GENECLEAN(푸나코시), QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN), 프리즈 & 스퀴즈법 등에 의해 정제할 수 있다.

클로닝한 핵산의 염기 서열은, 염기 서열 시퀀서를 이용하여 결정할 수 있다.

PAP 발현용 벡터 구축 및 형질 전환체의 제작

본 발명은 또한, PAP를 코드하는 핵산을 함유하는 재조합 벡터를 제공한다. 본 발명은, 또한, 상기 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체도 제공한다.

이러한 재조합 벡터 및 형질 전환체는 이하와 같이 하여 얻을 수 있다. 즉, MaPAP2.2 또는 그 변이체를 코드하는 핵산을 갖는 플라스미드를 제한 효소를 이용하여 소화한다. 이용하는 제한 효소로는, 예컨대, EcoRI, KpnI, BamHI 및 SalI 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 말단을 T4 폴리머라아제 처리함으로써 평활화해도 좋다. 소화 후의 DNA 단편을 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 정제한다. 이 DNA 단편을, 발현용 벡터에 공지된 방법을 이용하여 삽입함으로써, PAP 발현용 벡터를 얻을 수 있다. 이 발현 벡터를 숙주에 도입하여 형질 전환체를 제작하고, 목적으로 하는 단백질의 발현에 제공한다.

이 때, 발현 벡터 및 숙주는, 목적으로 하는 단백질을 발현할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예컨대, 숙주로서, 진균이나 세균, 식물, 동물 혹은 그들의 세포 등을 들 수 있다. 진균으로서, 지질 생산균인 M. 알피나 등의 사상균, 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) 등의 효모 등을 들 수 있다. 또한 세균으로서, 대장균(Escherichia coli)이나 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 등을 들 수 있다. 또한 식물로는, 평지씨, 대두, 목화, 홍화, 아마 등의 유량(油糧) 식물을 들 수 있다.

지질 생산균으로는, 예컨대, MYCOTAXON, Vol.XLIV, NO.2, pp.257-265(1992)에 기재되어 있는 균주를 사용할 수 있고, 구체적으로는, 모르티에렐라(Mortierella)속에 속하는 미생물, 예컨대, 모르티에렐라 엘론가타(Mortierella elongata) IFO8570, 모르티에렐라 엑시구아(Mortierella exigua) IFO8571, 모르티에렐라 히그로필라(Mortierella hygrophila) IFO5941, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina) IFO8568, ATCC16266, ATCC32221, ATCC42430, CBS219.35, CBS224.37, CBS250.53, CBS343.66, CBS527.72, CBS528.72, CBS529.72, CBS608.70, CBS754.68 등의 모르티에렐라 아속(subgenus Mortierella)에 속하는 미생물, 또는 모르티에렐라 이자벨리나(Mortierella isabellina) CBS194.28, IFO6336, IFO7824, IFO7873, IFO7874, IFO8286, IFO8308, IFO7884, 모르티에렐라 나나(Mortierella nana) IFO8190, 모르티에렐라 라마니아나(Mortierella ramanniana) IFO5426, IFO8186, CBS112.08, CBS212.72, IFO7825, IFO8184, IFO8185, IFO8287, 모르티에렐라 비나세아(Mortierella vinacea) CBS236.82 등의 마이크로무코르 아속(subgenus Micromucor)에 속하는 미생물 등을 들 수 있다. 특히, 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)가 바람직하다.

진균류를 숙주로서 이용하는 경우에는, 본 발명의 핵산이 숙주 중에서 자립 복제 가능하거나, 혹은 상기 균의 염색체 상에 삽입될 수 있는 구조인 것이 바람직하다. 그와 동시에, 프로모터, 터미네이터를 포함하는 구성인 것이 바람직하다. 숙주로서 M. 알피나를 사용하는 경우, 발현 벡터로서, 예컨대, pD4, pDuraSC, pDura5 등을 들 수 있다. 프로모터로는, 숙주 중에서 발현할 수 있는 것이면 어떠한 프로모터를 이용해도 좋고, 예컨대, histonH4.1 유전자 프로모터, GAPDH(글리세르알데히드3-인산데히드로게나아제) 유전자 프로모터, TEF(Translation elongation factor) 유전자 프로모터와 같은 M. 알피나에서 유래되는 프로모터가 이용된다.

M. 알피나 등의 사상균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 파티클 딜리버리법, 및 핵 내로의 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다. 영양 요구성의 호스트주를 이용하는 경우에는, 그 영양소를 결여시킨 선택 배지 상에서 생육하는 주를 선택함으로써, 형질 전환주를 취득할 수 있다. 또한, 형질 전환에 약제 내성 마커 유전자를 이용하는 경우에는, 그 약제를 포함하는 선택 배지에서 배양을 행하여, 약제 내성을 나타내는 세포 콜로니를 얻을 수 있다.

효모를 숙주로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로서, 예컨대, pYE22m 등을 들 수 있다. 또한, pYES(Invitrogen), pESC(STRATAGENE) 등의 시판되는 효모 발현용 벡터를 이용해도 좋다. 또한 본 발명에 알맞은 숙주로는, 사카로미세스 세레비시에 EH13-15주(trp1, MATα) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 프로모터로는, 예컨대, GAPDH 프로모터, gal1 프로모터, gal10 프로모터 등의 효모 등에서 유래되는 프로모터가 이용된다.

효모로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대, 초산리튬법, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 덱스트란 중개 트랜스펙션, 인산칼슘 침전, 폴리브렌 중개 트랜스펙션, 프로토플라스트 융합, 리포솜 중의 폴리뉴클레오티드(단수 또는 복수)의 피포(被包), 및 핵 내로의 DNA의 직접 마이크로인젝션 등을 들 수 있다.

대장균 등의 세균을 숙주로서 이용하는 경우에는, 발현 벡터로는, 예컨대 파마시아사의 pGEX, pUC18 등을 들 수 있다. 프로모터로는, 예컨대, trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에서 유래되는 프로모터가 이용된다. 세균으로의 재조합 벡터의 도입 방법으로는, 예컨대 일렉트로포레이션법이나 염화칼슘법을 이용할 수 있다.

지방산 조성물의 제조방법

본 발명은, 상기 형질 전환체로부터, 지방산 조성물을 제조하는 방법을 제공한다. 즉, 상기 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 배양물로부터 지방산 조성물을 제조하는 방법이다. 지방산 조성물은, 1 또는 그 이상의 지방산의 조합을 포함하는 조성물이다. 여기서, 지방산은 유리 지방산이어도 좋고, 트리글리세리드나 인지질 등의 지방산을 포함하는 지질로서 존재하고 있어도 좋다. 본 발명의 지방산 조성물은, 구체적으로는 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 그러나, 본 제조방법에 관해서는, 상기 방법에 한정되지 않고, 일반적인 공지된 다른 방법을 이용하여 행할 수도 있다.

PAP를 발현시킨 생물의 배양에 이용하는 배지는, 적당한 pH 및 침투압을 갖고, 각 숙주의 증식에 필요한 영양소, 미량 성분, 혈청이나 항생 물질 등의 생물 재료를 포함하고 있는 배양액(배지)이면, 어떠한 배양액도 이용할 수 있다. 예컨대, 효모를 형질 전환하여 PAP를 발현시킨 경우에는, SC-Trp 배지, YPD 배지, YPD5 배지 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적인 배지의 조성으로서 SC-Trp 배지를 예시한다 : 1 ℓ당, 아미노산 무함유 효모 질소 기지 (DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g.

배양 조건은, 숙주의 증식에 알맞으며, 또한 생성한 효소가 안정적으로 유지되는 데 적당한 조건이면 어떠한 조건이라도 좋지만, 구체적으로는, 혐기도, 배양 시간, 온도, 습도, 정치 배양 또는 진탕 배양 등의 개개의 조건을 조절할 수 있다. 배양 방법은, 동일 조건에서의 배양(1단계 배양)이어도 좋고, 2 이상이 상이한 배양 조건을 이용하는, 소위 2단계 배양 혹은 3단계 배양이어도 좋지만, 대량 배양을 하는 경우에는, 배양 효율이 좋은 2단계 배양 등이 바람직하다.

숙주로서 효모를 이용하여 2단계 배양을 행하는 경우, 본 발명의 지방산 조성물의 제조방법은 이하와 같이 행할 수 있다. 전배양으로서, 형질 전환체의 콜로니를, 상기한 SC-Trp 배지 등에 식균하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행한다. 그 후, 본배양으로서, YPD5(2% 효모 엑기스, 1% 폴리펩톤, 5% 글루코오스) 배지 10 ml에 전배양액을 500 μl 첨가하고, 30℃에서 2일간 진탕 배양을 행한다.

지방산 조성물

본 발명은 또한, MaPAP2.2 또는 그 변이체가 발현하고 있는 세포에서의 1 또는 그 이상의 지방산의 집합체인 지방산 조성물을 제공한다. 바람직하게는, MaPAP2.2 또는 그 변이체가 발현하고 있는 형질 전환체를 배양하여 얻어지는 지방산 조성물이다. 지방산은, 유리 지방산이어도 좋고, 트리글리세리드, 인지질 등의 지방산을 포함하는 지질의 형태로 존재하고 있어도 좋다.

본 발명의 지방산 조성물에 포함되는 지방산으로는, 장쇄 탄수화물의 사슬형 혹은 분기형의 모노카르복실산을 말하며, 예컨대, 미리스트산(테트라데칸산)(14:0), 미리스트올레산(테트라데센산)(14:1), 팔미트산(헥사데칸산)(16:0), 팔미트올레산(9-헥사데센산)(16:1), 마르가르산(헵타데칸산)(17:0), 스테아르산(옥타데칸산)(18:0), 올레산(cis-9-옥타데센산)(18:1(9)), 박센산(11-옥타데센산)(18:1(11)), 리놀산(cis, cis-9,12 옥타데카디엔산)(18:2(9,12)), α-리놀렌산(9,12,15-옥타데카트리엔산)(18:3(9,12,15)), γ-리놀렌산(6,9,12-옥타데카트리엔산)(18:3(6,9,12)), 스테아리돈산(6,9,12,15-옥타데카테트라엔산)(18:4(6,9,12,15)), 아라키드산(이코산산)(20:0), (8,11-이코사디엔산)(20:2(8,11)), 미드산(5,8,11-이코사트리엔산)(20:3(5,8,11)), 디호모γ-리놀렌산(8,11,14-이코사트리엔산)(20:3(8,11,14)), 아라키돈산(5,8,11,14-이코사테트라엔산)(20:4(5,8,11,14)), 에이코사테트라엔산(8,11,14,17-이코사테트라엔산)(20:4(8,11,14,17)), 에이코사펜타엔산(5,8,11,14,17-이코사펜타엔산)(20:5(5,8,11,14,17)), 베헨산(도코산산)(22:0), (7,10,13,16-도코사테트라엔산)(22:4(7,10,13,16)), (7,10,13,16,19-도코사펜타엔산)(22:5(7,10,13,16,19)), (4,7,10,13,16-도코사펜타엔산)(22:5(4,7,10,13,16)), (4,7,10,13,16,19-도코사헥사엔산)(22:6(4,7,10,13,16,19)), 리그노세르산(테트라코산산)(24:0), 네르본산(cis-15-테트라코센산)(24:1), 세로트산(헥사코산산)(26:0) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, 상기 물질명은 IUPAC 생화학 명명법으로 정의된 관용명이고, 조직명 및, 탄소수와 2중 결합의 위치를 나타내는 수치를, 괄호 안에 기재했다.

본 발명의 지방산 조성물은, 상기한 지방산 중, 1 또는 그 이상의 지방산의 조합이면, 어떠한 수의 어떠한 종류의 지방산으로 이루어지는 조성물이어도 좋다.

지방산 조성물을 포함하는 식품 등

또, 본 발명은, 상기 지방산 조성물을 포함하는 식품을 제공한다. 본 발명의 지방산 조성물은, 통상법에 따라, 예컨대, 유지를 포함하는 식품, 공업 원료(화장료, 의약(예컨대, 피부 외용약), 비누 등의 원료)의 제조 등의 용도에 사용할 수 있다. 화장료(조성물) 또는 의약(조성물)의 제형으로는, 용액형, 페이스트형, 겔형, 고체형, 분말형 등 임의의 제형을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 식품의 형태로는, 캡슐 등의 의약 제제의 형태, 또는 단백질, 당류, 지방, 미량 원소, 비타민류, 유화제, 향료 등에 본 발명의 지방산 조성물이 배합된 자연 유동식, 반소화형 영양식, 및 성분 영양식, 드링크제, 경장 영양제 등의 가공 형태를 들 수 있다.

또한, 식품의 예로는, 영양 보조 식품, 건강 식품, 기능성 식품, 유아용 식품, 유아용 조제유, 미숙아용 조제유, 노인용 식품 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서는, 식품이란, 고체, 유동체, 및 액체, 및 이들의 혼합물로서, 섭취 가능한 것의 총칭을 말한다.

영양 보조 식품이란, 특정한 영양 성분이 강화되어 있는 식품을 말한다. 건강 식품이란, 건강적인 또는 건강에 좋다고 여겨지는 식품을 말하며, 영양 보조 식품, 자연 식품, 다이어트 식품 등이 포함된다. 기능성 식품이란, 신체 조절 기능을 수행하는 영양 성분을 보급하기 위한 식품을 말하며, 특정 보건용 식품과 동일한 의미이다. 유아용 식품이란, 약 6세까지의 아이에게 제공하기 위한 식품을 말한다. 노인용 식품이란, 무처리 식품과 비교하여 소화 및 흡수가 용이하도록 처리된 식품을 말한다. 유아용 조제유란, 약 1세까지의 아이에게 제공하기 위한 조제유를 말한다. 미숙아용 조제유란, 미숙아가 생후 약 6개월이 될 때까지 제공하기 위한 조제유를 말한다.

이들 식품으로는, 고기, 생선, 너츠 등의 천연 식품(유지로 처리한 것) ; 중화 요리, 라면, 스프 등의 조리시에 유지를 첨가하는 식품 ; 튀김, 프라이, 유부, 차오판(중국식 볶음밥), 도너츠, 카린토(일본식 밀가루 과자) 등의 열 매체로서 유지를 이용한 식품 ; 버터, 마가린, 마요네즈, 드레싱, 초콜릿, 즉석 라면, 캐러멜, 비스킷, 쿠키, 케이크, 아이스크림 등의 유지 식품 또는 가공시에 유지를 첨가한 가공 식품 ; 쌀과자, 하드 비스킷, 팥빵 등의 가공 마무리시에 유지를 분무 또는 도포한 식품 등을 들 수 있다. 그러나, 본 발명의 식품은, 유지를 포함하는 식품에 한정되지 않고, 예컨대, 빵, 면류, 밥, 과자류(캔디, 츄잉검, 구미, 정제형 과자, 화과자), 두부 및 그 가공품 등의 농산 식품 ; 청주, 약용주, 미림, 식초, 간장, 된장 등의 발효 식품 ; 요구르트, 햄, 베이컨, 소시지 등의 축산 식품 ; 어묵, 튀김 어묵, 어육 완자 등의 수산 식품 ; 과즙 음료, 청량 음료, 스포츠 음료, 알콜 음료, 차 등을 들 수 있다.

PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용한 균주의 평가·선택 방법

본 발명은 또한, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가나 선택을 행하는 방법을 제공한다. 구체적으로는 이하와 같다.

(1) 평가 방법

본 발명의 일양태로서, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 평가를 행하는 방법을 들 수 있다. 상기 평가 방법으로는, 우선, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산의 염기 서열에 기초하여 설계한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 피검 균주인 지질 산생 균주의 PAP 활성에 관해 평가하는 방법을 들 수 있다. 이러한 평가 방법의 일반적 수법은 공지되어 있고, 예컨대, 국제 특허 출원 팜플렛 WO01/040514호, 일본 특허 공개 평8-205900호 공보 등에 기재되어 있다. 이하, 이 평가 방법에 관해 간단히 설명한다.

우선, 피검 균주의 게놈을 조제한다. 조제 방법은, Hereford 법이나 초산칼륨법 등, 어떠한 공지된 방법도 이용할 수 있다(예컨대, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, p130(1990) 참조).

본 발명의 PAP를 코드하는 핵산의 염기 서열, 바람직하게는, 서열 번호 1에 기초하여 프라이머 또는 프로브를 설계한다. 상기 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산의 염기 서열의 어느 부분이나 이용할 수 있고, 또한 그 설계는 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다. 프라이머로서 이용하는 폴리뉴클레오티드의 염기수는, 통상, 10 염기 이상이고, 15∼25 염기인 것이 바람직하다. 또한, 끼워넣는 부분의 염기수는, 통상, 300∼2000 염기가 적당하다.

상기에서 제작한 프라이머 또는 프로브를 이용하여, 상기 피검 균주의 게놈 중에 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산의 염기 서열과 특이적으로 대응하는 서열이 존재하는지의 여부를 조사한다. 특이적으로 대응하는 서열의 검출은, 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산의 염기 서열의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 염기 서열의 일부에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 하나의 프라이머로서 이용하고, 다른 하나의 프라이머로서 이 서열보다 상류 혹은 하류의 서열의 일부를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 상기 서열에 대하여 상보적인 염기 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 이용하여, 예컨대, PCR 법 등에 의해 피검 균주의 핵산을 증폭하고, 증폭물의 유무, 증폭물의 분자량의 크기 등을 측정할 수 있다.

본 발명의 방법에 알맞은 PCR 법의 반응 조건은, 특별히 한정되지 않지만, 예컨대, 이하의 조건을 들 수 있다.

변성 온도 : 90℃∼95℃

어닐링 온도 : 40℃∼60℃

신장 온도 : 60℃∼75℃,

사이클수 : 10회 이상

등의 조건이다. 얻어진 반응 생성물은 아가로오스 겔 등을 이용한 전기 영동법 등에 의해 분리하고, 증폭 산물의 분자량을 측정할 수 있다. 이에 따라, 증폭 산물의 분자량이 본 발명의 염기 서열과 특이적인 영역에 상당하는 핵산 분자를 포함하는 크기인지의 여부를 확인함으로써, 피검 균주의 PAP 활성을 예측 또는 평가할 수 있다. 또한, 상기 증폭 산물의 염기 서열을 상기 방법 등으로 해석함으로써, 더욱 PAP 활성을 보다 정확히 예측 또는 평가할 수 있다. 또, PAP 활성의 평가 방법은 상기한 바와 같다.

또한, 본 발명의 평가 방법은, 피검 균주를 배양하고, 서열 번호 1 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 PAP의 발현량을 측정함으로써, 피검 균주의 PAP 활성을 평가하는 것이어도 좋다. 또, PAP의 발현량은, 피검 균주를 적당한 조건에서 배양하고, PAP의 mRNA 또는 단백질을 정량함으로써 측정할 수 있다. mRNA 또는 단백질의 정량은, 공지된 수법을 이용하여 행할 수 있다. mRNA의 정량은, 예컨대, 노던 하이브리다이제이션이나 정량적 RT-PCR에 의해, 단백질의 정량은, 예컨대, 웨스턴 블로팅에 의해 행할 수 있다(Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1994-2003).

(2) 선택 방법

본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 PAP를 코드하는 핵산 또는 PAP 단백질을 이용하여, 지질 생산균의 선택을 행하는 방법을 들 수 있다. 본 발명의 상기 선택 방법으로는, 피검 균주를 배양하고, 서열 번호 1 등의 본 발명의 염기 서열이 코드하는 PAP의 발현량을 측정하고, 목적으로 하는 발현량의 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 또한, 기준이 되는 균주를 설정하여, 이 기준 균주와 피검 균주를 각각 배양하고, 각 균주의 상기 발현량을 측정하고, 기준 균주와 피검 균주의 발현량을 비교하여, 원하는 균주를 선택할 수도 있다. 구체적으로는, 예컨대, 기준 균주 및 피검 균주를 적당한 조건에서 배양하고, 각 균주의 발현량을 측정하고, 기준 균주보다 피검 균주 쪽이 고발현, 또는 저발현인 피검 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 균주를 선택할 수 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, PAP의 발현량 및 PAP가 산생하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

또한, 본 발명의 상기 선택 방법으로는, 피검 균주를 배양하고, 본 발명의 상기 활성이 높거나 혹은 낮은 균주를 선택함으로써, 원하는 활성을 갖는 피검 균주를 선택할 수도 있다. 원하는 활성에는, 상기한 바와 같이, PAP의 발현량 및 PAP가 산생하는 지방산 조성물의 조성을 측정하는 방법을 들 수 있다.

피검 균주 또는 기준 균주로는, 예컨대, 상기한 본 발명의 벡터를 도입한 균주, 상기 본 발명의 핵산의 발현이 억제된 균주, 돌연 변이 처리가 실시된 균주, 자연 변이한 균주 등을 이용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또, PAP 활성은, 예컨대 본 명세서 중의 「포스파티드산 포스파타아제를 코드하는 핵산」의 항목에서 기재한 방법에 의해 측정하는 것이 가능하다. 돌연 변이 처리로는, 예컨대, 자외선 조사나 방사선 조사 등의 물리적 방법, EMS(에틸메탄술포네이트), N-메틸-N-니트로소구아니딘 등의 약제 처리에 의한 화학적 방법 등을 들 수 있지만(예컨대, 오시마 야스지 편저, 생물 화학 실험법 39, 효모 분자 유전학 실험법, p.67-75, 학회 출판 센터 등 참조), 이들에 한정되지 않는다.

또, 본 발명의 기준 균주, 피검 균주로서 이용하는 균주로는, 상기한 지질 생산균 또는 효모 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 구체적으로는, 기준 균주, 피검 균주는, 상이한 속이나 종에 속하는 어떠한 균주를 조합하여 이용해도 좋고, 피검 균주는 1 또는 그 이상의 균주를 동시에 이용해도 좋다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 실시예에 한정되지 않는다.

실시예

실시예 1 : 모르티에렐라 알피나의 게놈 해석

M. 알피나 1S-4주를 100 ml의 GY2:1 배지(2% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하고, 28℃에서 2일간 진탕 배양했다. 여과에 의해 균체를 집균하고, DNeasy(QIAGEN)를 이용하여 게놈 DNA를 조제했다.

상기 게놈 DNA의 염기 서열을, Roche 454 GS FLX Standard를 이용하여 결정했다. 그 때, 프래그먼트 라이브러리의 염기 서열 결정을 2런분(runs), 메이트 페어 라이브러리의 염기 서열 결정을 3런분 행했다. 얻어진 염기 서열을 어셈블리함으로써, 300개의 수퍼콘틱이 얻어졌다.

실시예 2 : cDNA의 합성과 cDNA 라이브러리의 제작

M. 알피나 1S-4주를 100 ml의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 효모 엑기스, pH 6.0)에 식균하고, 3일간 28℃에서 전배양했다. 10 L 배양조(Able Co., 도쿄)에 5 L의 배지(1.8% 글루코오스, 1% 대두분, 0.1% 올리브유, 0.01% 아데칸올, 0.3% KH₂PO₄, 0.1% Na₂SO₄, 0.05% CaCl₂·2H₂O, 0.05% MgCl₂·6H₂O, pH 6.0)를 넣고, 전배양물을 전량 식균하고, 300 rpm, 1 vvm, 26℃의 조건에서 8일간 통기 교반 배양했다. 배양 1, 2, 및 3일째에 각각 2%, 2%, 및 1.5% 상당의 글루코오스를 첨가했다. 배양 1, 2, 3, 6, 및 8일째의 각 스테이지에 균체를 회수하고, 염산구아니딘/CsCl 법으로 토탈 RNA를 조제했다. Oligotex-dT30 <Super> mRNA Purification Kit(Takara Bio Inc.)를 이용하여, 토탈 RNA로부터 poly(A)⁺RNA의 정제를 행했다. 각 스테이지의 cDNA 라이브러리를, ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)를 이용하여 제작했다.

실시예 3 : 효모 유래 DPP1 호몰로그의 탐색

효모의 ScDPP1(YDR284C : 액세션 번호 AAS56070)과 ScLPP1(YDR503C : 액세션 번호 AAT93210)의 호몰로그를 게놈 데이터베이스로부터 검토했다. 그 결과, 2개의 수퍼콘틱이 동정됐다. 하나는, MaPAP1에 관련된 게놈 서열을 포함하는 수퍼콘틱이고, 다른 하나는, 서열 번호 4를 포함하는 수퍼콘틱이었다. 서열 번호 4에 관련된 유전자를 MaPAP2.2라고 명명했다.

실시예 4 : MaPAP2.2의 클로닝 및 서열 해석

(1) 클로닝

MaPAP2.2의 cDNA를 클론화하기 위해, 이하의 프라이머를 제작했다.

프라이머 PAP2.2-1f : TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT(서열 번호 6)

프라이머 PAP2.2-4r : GACAATGCCGAGGATCGAGCC(서열 번호 7)

상기한 바와 같이 제작한 라이브러리를 주형으로 하고, 프라이머 PAP2.2-1F와 프라이머 PAP2.2-4R의 조합으로 ExTaq(다카라 바이오)를 이용하여, 94℃ 2분, (94℃ 1분, 55℃ 1분, 72℃ 1분) 30 사이클의 PCR 반응을 행했다. 얻어진 약 0.4 kbp의 DNA 단편을, TOPO-TA 클로닝 키트(Invitrogen)를 사용하여 클론화하고, 인서트 부분의 염기 서열을 결정했다. 서열 번호 3의 534∼904번째의 염기 서열을 갖는 플라스미드를 pCR-MaPAP2.2-P로 했다.

다음으로, 이 플라스미드 pCR-MaPAP2.2-P를 주형으로 하고, 상기 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 프로브를 제작했다. 반응에는, ExTaq(다카라 바이오)를 이용했지만, 첨부의 dNTP 믹스 대신에 PCR 라벨링 믹스(로슈·다이아그노스틱스사)를 이용하여, 증폭되는 DNA를 디곡시게닌(DIG) 라벨한 프로브를 제작하여, MaPAP2.2 프로브로 했다. 이들 프로브를 이용하여, cDNA 라이브러리를 스크리닝했다.

하이브리다이제이션의 조건은 다음과 같다.

버퍼 : 5xSSC, 1% SDS, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50% 포름아미드 ;

온도 : 42℃(하룻밤) ;

세정 조건 : 0.2xSSC, 0.1% SDS 용액 중(65℃)에서, 20분간×3회.

검출은, DIG 핵산 검출 키트(로슈·다이아그노스틱스사)를 이용하여 행했다. 스크리닝에 의해 얻어진 파지 클론으로부터, 생체내(in vivo) 엑시전에 의해, 플라스미드를 잘라내고, 플라스미드 DNA를 얻었다. 가장 인서트 길이가 긴 것은, 서열 번호 5의 염기 서열을 포함하고 있고, 플라스미드 pB-MaPAP2.2라고 명명했다.

개시 코돈이나 종지 코돈의 존재, 다른 PAP2 호몰로그와의 비교로부터, 서열 번호 5의 75번째∼1166번째(서열 번호 3과 동일함)가, MaPAP2.2의 CDS인 것으로 생각되었다.

(2) 서열 해석

MaPAP2.2 유전자의 염기 서열 및 이것이 코드하는 추정 아미노산 서열에 관해, BLAST 및 clustalW에 의한 해석으로, 이미 알려진 핵산의 염기 서열 및 아미노산 서열에 대한 상동성 검색을 행했다. BLASTX에 의한 GENBANK에 등록되어 있는 아미노산 서열에 대한 상동성 검색에서 동정된 것 중에서, 가장 E-Value가 낮았던 서열은, 큰 졸각 버섯(Laccaria bicolor) 유래의 추정 단백질(액세션 번호 : XP_001878243)로, 아미노산 서열의 동일성은 36.7%였다. MaPAP2.2의 아미노산 서열과, 큰 졸각 버섯 유래의 추정 단백질 및 효모 유래의 ScDPP1(YDR284C : 액세션 번호 AAS56070))의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 도 2에 도시했다.

또한, 모르티에렐라 알피나 유래의 Mg²⁺ 비의존성 PAP(PAP2)로서 이미 알려진 MaPAP1(WO2009/008466)과, MaPAP2.2의 아미노산 서열의 동일성은 20.5%였다. MaPAP2.2와 MaPAP1의 아미노산 서열의 얼라인먼트를 도 3에 도시했다. PAP2 패밀리 효소에는 3개의 보존 영역이 있고, 활성에 필수적인 아미노산도 알려져 있다. 도 3에 도시한 바와 같이, MaPAP2.2에 있어서도 이들 보존 영역은 보존되어 있고(도 3 중, 2중 하선으로 나타낸 영역), 활성에 필수인 도메인 1의 아르기닌 잔기, 도메인 2와 도메인 3의 히스티딘 잔기(도 3 중, *로 나타낸 잔기)가 보존되어 있었다.

실시예 5 : MaPAP2.2의 기능 해석

(1) 효모 발현 벡터의 구축

MaPAP2.2를 효모에서 발현시키기 위해, 이하와 같이 효모 발현용 벡터를 구축했다. 우선, 프라이머 Eco-PAP2-2-F와 Kpn-PAP2-2-R을 작성하고, pB-MaPAP2.2를 주형으로 하여, ExTaq(다카라 바이오)로 PCR 반응을 행했다.

Eco-PAP2-2-F : GAATTCATGTTCTCGTCCATGCGCTTCAAG(서열 번호 8)

Kpn-PAP2-2-R : TGGTACCTCATGGTCCCAAGTATACATCGTTCC(서열 번호 9)

얻어진 1.1 kbp의 DNA 단편을 TOPO-TA cloning Kit(인비트로젠)를 이용하여 TA 클로닝하고, 염기 서열을 확인하여, MaPAP2.2의 CDS의 정확한 염기 서열(서열 번호 3)을 갖는 플라스미드를 pCR-MaPAP2.2로 했다. pCR-MaPAP2.2를 제한 효소 EcoRI과 KpnI로 소화하여 얻어진 약 1.1 kbp의 DNA 단편과, 효모 발현용 벡터 pYE22m(Biosci. Biotech. Biochem., 59, 1221-1228, 1995)을 제한 효소 EcoRI, KpnI로 소화하여 얻어진 약 8.3 kbp의 DNA 단편을, ligation high(TOYOBO)로 연결하여, 플라스미드 pYE-MaPAP2.2를 구축했다.

(2) 형질 전환 효모의 취득

플라스미드 pYE22m, pYE-MaPAP2.2, pYE-MaPAP1(WO2009/008466)을 각각 이용하여 초산리튬법에 의해, 효모 S. 세레비시에 EH13-15주(trp1, MATα)(Appl. Microbiol. Biotechnol., 30, 515-520, 1989)를 형질 전환했다. 형질 전환주는, SC-Trp(1 ℓ당, 아미노산 무함유 효모 질소 기지(DIFCO) 6.7 g, 글루코오스 20 g, 아미노산 파우더(아데닌황산염 1.25 g, 아르기닌 0.6 g, 아스파라긴산 3 g, 글루타민산 3 g, 히스티딘 0.6 g, 류신 1.8 g, 리신 0.9 g, 메티오닌 0.6 g, 페닐알라닌 1.5 g, 세린 11.25 g, 티로신 0.9 g, 발린 4.5 g, 트레오닌 6 g, 우라실 0.6 g을 혼합한 것) 1.3 g) 한천 배지(2% 아가) 상에서 생육하는 것으로서 선발했다.

(3) 효모의 배양

각각의 벡터에서의 형질 전환주를, 이하의 조건에서 배양했다. 즉, 전배양으로서, SD-Trp 10 ml에 효모를 식균하고, 30℃에서 1일, 진탕 배양을 행했다. 본배양으로서, 전배양액 1 ml를 SD-Trp 100 ml에 첨가하고, 30℃에서 1일, 진탕 배양했다.

(4) 조효소액의 조제

원심 분리로 집균 후, 수세하고, -80℃에서 일시 보존했다. 균체에 5 ml의 버퍼 A(50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 0.3 M 수크로오스, 10 mM DTT, 1 mM PMSF)를 첨가하여, 잘 현탁했다. 그 후, 프렌치 프레스로 16 kPa로 3회 처리함으로써, 균체를 파쇄했다. 균체 파쇄액을 1,500×g, 4℃에서 10분간, 원심 분리하여, 얻어진 상청을 조효소액으로 했다.

(5) PAP 활성 측정

방법

PAP 활성은 이하와 같이 측정했다. 반응액으로서, 50 mM Tris-HCl(pH 7.5), 50 ㎍ 리놀산(18:2)-PA 또는 올레산(18:1)-PA 또는 마르가르산(17:0)-PA(기질이 되는 포스파티드산), 0.5 mM MgCl₂ 또는 0.5 mM EDTA, 10 mM DTT, 100 μl 조효소액을 포함하는 전량 500 μl의 반응액을 조제하고, 28℃에서 30분간 반응시켰다. 클로로포름 : 메탄올(1 : 2)을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 컨트롤로서, 조효소액 대신에 MaPAP2.2 유전자를 포함하지 않는 플라스미드 pYE22m으로 형질 전환한 효모(컨트롤주)의 균체 파쇄액의 상청을 첨가한 반응액을 이용했다. Bligh & Dyer 법에 의해 지질을 추출하고, 원심 농축기로 건고시켰다. 클로로포름에 용해하고, TLC(실리카 겔 60 플레이트, 헥산 : 디에틸에테르 : 초산=70 : 30 : 1)에 의해 지질을 분획했다. 프리멀린 용액을 분무 후, UV 조사하에서 지질을 가시화하여, 인지질 분획과 디글리세리드(DG) 분획을 긁어내고, 포함되는 전지방산을 메틸에스테르에 유도하여, 가스 크로마토그래피로 분석했다.

상기한 반응에 있어서, 기질로서 첨가한 포스파티드산(PA)으로부터 변환된 디글리세리드(DG)의 양을 측정함으로써, PAP 활성을 측정할 수 있다.

결과

결과를 도 4∼7에 도시했다.

도 4에 도시한 바와 같이, MaPAP2.2의 조효소액을 첨가한 반응액에 있어서는, 컨트롤과 비교하여 18:2-DG의 양이 증가했다. 이것은, MaPAP2.2의 존재에 의해, 18:2-PA로부터 18:2-DG로의 변환이 높아진, 즉 MaPAP2.2는 PAP 활성을 갖는 것이 밝혀졌다. 또한, 도 4에 기재된 결과로부터, Mg²⁺의 유무에 관계 없이, 컨트롤과 MaPAP2.2의 고발현주(도 4에 있어서, MaPAP2.2라고 표기했음)의 18:2-PA로부터 18:2-DG로의 변환의 정도는 동등, 즉, MaPAP2.2는 Mg^{2 +}의 유무에 관계 없이 동등한 PAP 활성을 나타내는 것이 분명해졌다. 이것은, MaPAP2.2의 PAP 활성은 Mg²⁺에 의존하지 않는 것을 나타내는 것이다.

도 5는, MaPAP2.2의 조효소액, 또는 MaPAP1의 조효소액을 첨가한 Mg²⁺ 불포함의 반응액에서의 18:2-DG의 양을 검토한 결과를 나타내는 것이다. MaPAP2.2를 이용한 경우에는, 18:2-PA로부터 18:2-DG로의 변환이 유의적으로 높아진 반면, MaPAP1을 이용한 경우에는 컨트롤과 동일한 정도의 18:2-DG밖에 확인되지 않았다. 이것은, MaPAP2.2와 MaPAP1에서는 상이한 기질 특이성을 갖는 것을 나타내고 있다.

도 6은, MaPAP2.2의 조효소액을 포함하는 반응액 및 컨트롤에 있어서, 기질로서 18:1-PA를 첨가한 경우, 및 첨가하지 않은 경우의, 반응 후의 18:1-DG의 양을 검토한 결과를 나타내는 것이다. 18:1-PA는 효모에 있어서 본래 존재하는 포스파티드산이기 때문에, 18:1-PA를 첨가하지 않는 조건에서 조효소액 중의 18:1-PA의 양(백그라운드)을 측정하여, MaPAP2.2 발현주와 컨트롤주 사이에서 차가 없는 것을 확인했다(도 6의 A). 게다가, 18:1-PA를 첨가한 경우의 반응 후의 18:1-DG의 양을 측정한 바, 컨트롤의 조효소액을 이용한 경우에 비해, MaPAP2.2의 조효소액을 이용한 경우에, 보다 많은 18:1-PA가 생성되는 것이 확인되었다(도 6의 B). 이 결과는, MaPAP2.2가, 18:1-PA를 기질로 한 경우에도 PAP 활성을 갖는 것을 나타내고 있다.

도 7은, MaPAP2.2의 조효소액을 포함하는 반응액 및 컨트롤에 있어서, 기질로서 17:0-PA를 첨가한 경우의, 반응 후의 17:0-DG의 양을 검토한 결과를 나타내는 것이다. 도 7에 도시한 결과는, MaPAP2.2가, 17:0-PA를 기질로 한 경우에도 PAP 활성을 갖는 것을 나타내고 있다.

또한, 도 5 내지 도 7의 결과의 비교로부터, 18:2-PA를 18:2-DG로 변환하는 활성과, 18:1-PA를 18:1-DG로 변환하는 활성은 동일한 정도로 생각되었다. 한편, 17:0-PA를 17:0-DG로 변환하는 활성은, 18:2-PA를 18:2-DG로 변환하는 활성이나 18:1-PA를 18:1-DG로 변환하는 활성의 1/5 정도로 평가되었다. 이것은, MaPAP2.2의 포스파티드산 포스파타아제 활성이, 탄소수 17의 아실기를 함유하는 포스파티드산보다, 탄소수 18의 아실기를 함유하는 포스파티드산에 대한 기질 특이성이 높은 것을 나타내고 있다.

[서열표 프리 텍스트]

서열 번호 6 : 프라이머 PAP2.2-1f

서열 번호 7 : 프라이머 PAP2.2-4r

서열 번호 8 : 프라이머 Eco-PAP2-2-F

서열 번호 9 : 프라이머 Kpn-PAP2-2-R

SEQUENCE LISTING <110> SUNTORY HOLDINGS LIMITED <120> Phosphatidic acid phosphatase gene <130> FA0008-12090 <150> JP 2011-166490 <151> 2011-07-29 <160> 12 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1089 <212> DNA <213> Mortierella alpina <220> <221> CDS <222> (1)..(1089) <223> <400> 1 atg ttc tcg tcc atg cgc ttc aag gcc cgg aca agg tcc ttg ttt ctc 48 Met Phe Ser Ser Met Arg Phe Lys Ala Arg Thr Arg Ser Leu Phe Leu 1 5 10 15 tcc tat gtc aag gac tgg ggt ctg gtg att gtg atc ctg gcc gtc ttc 96 Ser Tyr Val Lys Asp Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Leu Ala Val Phe 20 25 30 tct tac gtc gac aca ctc gag cca ttc cat cgc cag ttc tct gtc caa 144 Ser Tyr Val Asp Thr Leu Glu Pro Phe His Arg Gln Phe Ser Val Gln 35 40 45 gac atg tcc att cag cat ccc tat gca aag aag gag acg gtt cct gta 192 Asp Met Ser Ile Gln His Pro Tyr Ala Lys Lys Glu Thr Val Pro Val 50 55 60 tgg atg gcg ctg gta ctt gct ttc att ctc ccc gct gtt gtt att ggg 240 Trp Met Ala Leu Val Leu Ala Phe Ile Leu Pro Ala Val Val Ile Gly 65 70 75 80 ctt att gcc ctc ctc aag aga aga tcc tac acg gat ttt cac aac gga 288 Leu Ile Ala Leu Leu Lys Arg Arg Ser Tyr Thr Asp Phe His Asn Gly 85 90 95 gta ctt ggc ctc ttt ctt act cag gcc ctc gtt ctt att gta act gac 336 Val Leu Gly Leu Phe Leu Thr Gln Ala Leu Val Leu Ile Val Thr Asp 100 105 110 agc atc aag att gct gtt ggc aga cct cgt cct gac ttt ctg gat cgc 384 Ser Ile Lys Ile Ala Val Gly Arg Pro Arg Pro Asp Phe Leu Asp Arg 115 120 125 tgc ctt gac ttg tac gat aac caa gca gcg ggc aca ccc cta gga cct 432 Cys Leu Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ala Ala Gly Thr Pro Leu Gly Pro 130 135 140 ctc tcg gat cca atc aac atg cta tca aac tcg acc att tgc acc agg 480 Leu Ser Asp Pro Ile Asn Met Leu Ser Asn Ser Thr Ile Cys Thr Arg 145 150 155 160 aca cac ttg ctg aga gat gga ttc aaa tcg ttc ccc tcg gga cat tcc 528 Thr His Leu Leu Arg Asp Gly Phe Lys Ser Phe Pro Ser Gly His Ser 165 170 175 tcc ttt tca ttc gga gga ctg ggc tac ttg tcc atg ttt ctt gca ggc 576 Ser Phe Ser Phe Gly Gly Leu Gly Tyr Leu Ser Met Phe Leu Ala Gly 180 185 190 aag ctg cat ctg ttt gac gag cgt gga cat atc tat aaa tcg gtc gta 624 Lys Leu His Leu Phe Asp Glu Arg Gly His Ile Tyr Lys Ser Val Val 195 200 205 gtt ctg gcg cct ttg atc gtc gct gct ttg atc gct acc tcg cgc gtg 672 Val Leu Ala Pro Leu Ile Val Ala Ala Leu Ile Ala Thr Ser Arg Val 210 215 220 gac gac tac agg cac cat tgg cag gat gtc acc gtc gga gcc ttc att 720 Asp Asp Tyr Arg His His Trp Gln Asp Val Thr Val Gly Ala Phe Ile 225 230 235 240 gga gcc aca ttt gcc atc ttt tcc tac cgt cag tac tac cct tcc ttg 768 Gly Ala Thr Phe Ala Ile Phe Ser Tyr Arg Gln Tyr Tyr Pro Ser Leu 245 250 255 gcg agt tct aaa tcc gac tgc ccc ttc gcg cct cgc att ggc aag gac 816 Ala Ser Ser Lys Ser Asp Cys Pro Phe Ala Pro Arg Ile Gly Lys Asp 260 265 270 gag cat ttg ccg gca gca ctg ttg cct cat cac cat atc cac cga cac 864 Glu His Leu Pro Ala Ala Leu Leu Pro His His His Ile His Arg His 275 280 285 gac aac gag gtg gtg gag gca gag gac gaa gtg cat cgg gaa tcg ttt 912 Asp Asn Glu Val Val Glu Ala Glu Asp Glu Val His Arg Glu Ser Phe 290 295 300 ctg agt aat gtc ggg ggc gcg ggt tcg aat cgg tct cac gag tct ttg 960 Leu Ser Asn Val Gly Gly Ala Gly Ser Asn Arg Ser His Glu Ser Leu 305 310 315 320 acg gga gga acg agt ctg cag gat ctg agt aac aat cat cat ggg gcc 1008 Thr Gly Gly Thr Ser Leu Gln Asp Leu Ser Asn Asn His His Gly Ala 325 330 335 aag ctc aac agc acg gcg ggc tat ggc ttt gat cag cag cgt aat gga 1056 Lys Leu Asn Ser Thr Ala Gly Tyr Gly Phe Asp Gln Gln Arg Asn Gly 340 345 350 ggt ggt caa cgg aac gat gta tac ttg gga cca 1089 Gly Gly Gln Arg Asn Asp Val Tyr Leu Gly Pro 355 360 <210> 2 <211> 363 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 2 Met Phe Ser Ser Met Arg Phe Lys Ala Arg Thr Arg Ser Leu Phe Leu 1 5 10 15 Ser Tyr Val Lys Asp Trp Gly Leu Val Ile Val Ile Leu Ala Val Phe 20 25 30 Ser Tyr Val Asp Thr Leu Glu Pro Phe His Arg Gln Phe Ser Val Gln 35 40 45 Asp Met Ser Ile Gln His Pro Tyr Ala Lys Lys Glu Thr Val Pro Val 50 55 60 Trp Met Ala Leu Val Leu Ala Phe Ile Leu Pro Ala Val Val Ile Gly 65 70 75 80 Leu Ile Ala Leu Leu Lys Arg Arg Ser Tyr Thr Asp Phe His Asn Gly 85 90 95 Val Leu Gly Leu Phe Leu Thr Gln Ala Leu Val Leu Ile Val Thr Asp 100 105 110 Ser Ile Lys Ile Ala Val Gly Arg Pro Arg Pro Asp Phe Leu Asp Arg 115 120 125 Cys Leu Asp Leu Tyr Asp Asn Gln Ala Ala Gly Thr Pro Leu Gly Pro 130 135 140 Leu Ser Asp Pro Ile Asn Met Leu Ser Asn Ser Thr Ile Cys Thr Arg 145 150 155 160 Thr His Leu Leu Arg Asp Gly Phe Lys Ser Phe Pro Ser Gly His Ser 165 170 175 Ser Phe Ser Phe Gly Gly Leu Gly Tyr Leu Ser Met Phe Leu Ala Gly 180 185 190 Lys Leu His Leu Phe Asp Glu Arg Gly His Ile Tyr Lys Ser Val Val 195 200 205 Val Leu Ala Pro Leu Ile Val Ala Ala Leu Ile Ala Thr Ser Arg Val 210 215 220 Asp Asp Tyr Arg His His Trp Gln Asp Val Thr Val Gly Ala Phe Ile 225 230 235 240 Gly Ala Thr Phe Ala Ile Phe Ser Tyr Arg Gln Tyr Tyr Pro Ser Leu 245 250 255 Ala Ser Ser Lys Ser Asp Cys Pro Phe Ala Pro Arg Ile Gly Lys Asp 260 265 270 Glu His Leu Pro Ala Ala Leu Leu Pro His His His Ile His Arg His 275 280 285 Asp Asn Glu Val Val Glu Ala Glu Asp Glu Val His Arg Glu Ser Phe 290 295 300 Leu Ser Asn Val Gly Gly Ala Gly Ser Asn Arg Ser His Glu Ser Leu 305 310 315 320 Thr Gly Gly Thr Ser Leu Gln Asp Leu Ser Asn Asn His His Gly Ala 325 330 335 Lys Leu Asn Ser Thr Ala Gly Tyr Gly Phe Asp Gln Gln Arg Asn Gly 340 345 350 Gly Gly Gln Arg Asn Asp Val Tyr Leu Gly Pro 355 360 <210> 3 <211> 1092 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 3 atgttctcgt ccatgcgctt caaggcccgg acaaggtcct tgtttctctc ctatgtcaag 60 gactggggtc tggtgattgt gatcctggcc gtcttctctt acgtcgacac actcgagcca 120 ttccatcgcc agttctctgt ccaagacatg tccattcagc atccctatgc aaagaaggag 180 acggttcctg tatggatggc gctggtactt gctttcattc tccccgctgt tgttattggg 240 cttattgccc tcctcaagag aagatcctac acggattttc acaacggagt acttggcctc 300 tttcttactc aggccctcgt tcttattgta actgacagca tcaagattgc tgttggcaga 360 cctcgtcctg actttctgga tcgctgcctt gacttgtacg ataaccaagc agcgggcaca 420 cccctaggac ctctctcgga tccaatcaac atgctatcaa actcgaccat ttgcaccagg 480 acacacttgc tgagagatgg attcaaatcg ttcccctcgg gacattcctc cttttcattc 540 ggaggactgg gctacttgtc catgtttctt gcaggcaagc tgcatctgtt tgacgagcgt 600 ggacatatct ataaatcggt cgtagttctg gcgcctttga tcgtcgctgc tttgatcgct 660 acctcgcgcg tggacgacta caggcaccat tggcaggatg tcaccgtcgg agccttcatt 720 ggagccacat ttgccatctt ttcctaccgt cagtactacc cttccttggc gagttctaaa 780 tccgactgcc ccttcgcgcc tcgcattggc aaggacgagc atttgccggc agcactgttg 840 cctcatcacc atatccaccg acacgacaac gaggtggtgg aggcagagga cgaagtgcat 900 cgggaatcgt ttctgagtaa tgtcgggggc gcgggttcga atcggtctca cgagtctttg 960 acgggaggaa cgagtctgca ggatctgagt aacaatcatc atggggccaa gctcaacagc 1020 acggcgggct atggctttga tcagcagcgt aatggaggtg gtcaacggaa cgatgtatac 1080 ttgggaccat ga 1092 <210> 4 <211> 1635 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 4 atgttctcgt ccatgcgctt caaggcccgg acaaggtcct tgtttctctc ctatgtcaag 60 gactggggtc tggtgattgt gatcctggcc gtcttctctt acgtcgacac actcgagcca 120 ttccatcgcc agttctctgt ccaagacatg tccattcagc atccctatgc aaagaaggag 180 acggttcctg tatggatggc gctggtaagt gtttccaatc attttttccc gttttgttga 240 ctcgcgattg ctcgtgtgct actgcttggt tttttttccc catcctcatg gtgtggagtt 300 tggtctccag ccgtaaccac aaagcgcagt ctgtcccacg ctgcacccct tgtagaggac 360 aatggccatg gagcatgaag aatgagatta ctcatgcctc tttttttcct tttttcttcg 420 tcgtgttctg tgttgattca ggtacttgct ttcattctcc ccgctgttgt tattgggctt 480 attgccctcc tcaagagaag atcctacacg gattttcaca acggagtact tggcctcttt 540 cttactcagg ccctcgttct tattgtaact gacagcatca aggtaagcta ccaactcccc 600 ccctctcatg gctttctcct ttcttttttt ttgtatgcga tctttggact caagtgcgtt 660 gaaaaaaaag ggggggtaga ataatatgca acgtgaacaa tctctggaca gtgtttattt 720 cggggacact catcctctgg taactgtttt cagccaaaga gttccttcta ctagaactat 780 gactctcgac ttgatacaag gcggctgttg tttgtgttgg gcgcagatcc tttagtgaca 840 atagaacaaa gcgtactcat acctgttgtt ttcccttggt cgtgatagat tgctgttggc 900 agacctcgtc ctgactttct ggatcgctgc cttgacttgt acgataacca agcagcgggc 960 acacccctag gacctctctc ggatccaatc aacatgctat caaactcgac catttgcacc 1020 aggacacact tgctgagaga tggattcaaa tcgttcccct cgggacattc ctccttttca 1080 ttcggaggac tgggctactt gtccatgttt cttgcaggca agctgcatct gtttgacgag 1140 cgtggacata tctataaatc ggtcgtagtt ctggcgcctt tgatcgtcgc tgctttgatc 1200 gctacctcgc gcgtggacga ctacaggcac cattggcagg atgtcaccgt cggagccttc 1260 attggagcca catttgccat cttttcctac cgtcagtact acccttcctt ggcgagttct 1320 aaatccgact gccccttcgc gcctcgcatt ggcaaggacg agcatttgcc ggcagcactg 1380 ttgcctcatc accatatcca ccgacacgac aacgaggtgg tggaggcaga ggacgaagtg 1440 catcgggaat cgtttctgag taatgtcggg ggcgcgggtt cgaatcggtc tcacgagtct 1500 ttgacgggag gaacgagtct gcaggatctg agtaacaatc atcatggggc caagctcaac 1560 agcacggcgg gctatggctt tgatcagcag cgtaatggag gtggtcaacg gaacgatgta 1620 tacttgggac catga 1635 <210> 5 <211> 1188 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 5 cacgaggctc gtcgctgcca ccttgtacac actcacgcac atatcctgat ctagctgcct 60 atctactcgg gatcatgttc tcgtccatgc gcttcaaggc ccggacaagg tccttgtttc 120 tctcctatgt caaggactgg ggtctggtga ttgtgatcct ggccgtcttc tcttacgtcg 180 acacactcga gccattccat cgccagttct ctgtccaaga catgtccatt cagcatccct 240 atgcaaagaa ggagacggtt cctgtatgga tggcgctggt acttgctttc attctccccg 300 ctgttgttat tgggcttatt gccctcctca agagaagatc ctacacggat tttcacaacg 360 gagtacttgg cctctttctt actcaggccc tcgttcttat tgtaactgac agcatcaaga 420 ttgctgttgg cagacctcgt cctgactttc tggatcgctg ccttgacttg tacgataacc 480 aagcagcggg cacaccccta ggacctctct cggatccaat caacatgcta tcaaactcga 540 ccatttgcac caggacacac ttgctgagag atggattcaa atcgttcccc tcgggacatt 600 cctccttttc attcggagga ctgggctact tgtccatgtt tcttgcaggc aagctgcatc 660 tgtttgacga gcgtggacat atctataaat cggtcgtagt tctggcgcct ttgatcgtcg 720 ctgctttgat cgctacctcg cgcgtggacg actacaggca ccattggcag gatgtcaccg 780 tcggagcctt cattggagcc acatttgcca tcttttccta ccgtcagtac tacccttcct 840 tggcgagttc taaatccgac tgccccttcg cgcctcgcat tggcaaggac gagcatttgc 900 cggcagcact gttgcctcat caccatatcc accgacacga caacgaggtg gtggaggcag 960 aggacgaagt gcatcgggaa tcgtttctga gtaatgtcgg gggcgcgggt tcgaatcggt 1020 ctcacgagtc tttgacggga ggaacgagtc tgcaggatct gagtaacaat catcatgggg 1080 ccaagctcaa cagcacggcg ggctatggct ttgatcagca gcgtaatgga ggtggtcaac 1140 ggaacgatgt atacttggga ccatgagcag atgaaacaaa ttgaaagg 1188 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer PAP2.2-1f <400> 6 ttccgtcagg acactcctcc agt 23 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer PAP2.2-4r <400> 7 gacaatgccg aggatcgagc c 21 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer Eco-PAP2-2-F <400> 8 gaattcatgt tctcgtccat gcgcttcaag 30 <210> 9 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> primer Kpn-PAP2-2-R <400> 9 tggtacctca tggtcccaag tatacatcgt tcc 33 <210> 10 <211> 366 <212> PRT <213> Laccaria bicolor <400> 10 Met Ala Phe Phe Gln Pro Ser His Ala Arg Thr Lys Val Pro Ala Met 1 5 10 15 Ser Pro Thr Arg Arg Arg Lys Leu Val Phe Ser Tyr Ala Pro Asp Trp 20 25 30 Tyr Ala Met Met Thr Ile Ala Leu Phe Phe Ser Leu Asp Lys Val Asn 35 40 45 Gly Tyr Arg Arg Val Phe Ser Leu Glu Asp Thr Ser Leu Arg His Pro 50 55 60 Tyr Ala Val His Glu Arg Val Pro Asn Ile Ala Leu Tyr Leu Ile Cys 65 70 75 80 Phe Val Ser Pro Leu Leu Ile Gln Pro Val Ile Asn Phe Phe Thr Val 85 90 95 Arg Ser Trp Trp Asp Phe His Asn Gly Ser Leu Gly Leu Val Leu Gly 100 105 110 Leu Ala Leu Thr Gly Ser Val Thr Gln Phe Val Lys Ile Thr Val Gly 115 120 125 Arg Pro Arg Pro Asp Val Ile Asp Arg Cys Gln Pro Pro Thr Gly Ser 130 135 140 Val Asp Pro Thr Phe Gly Leu Ser Asn Trp Thr Ile Cys Thr Gln Ala 145 150 155 160 Ser Glu Ala Ile Leu Arg Asp Gly Phe Arg Ser Phe Pro Ser Gly His 165 170 175 Ser Ser Met Ser Phe Ala Gly Leu Gly Phe Leu Ser Phe Tyr Leu Ala 180 185 190 Gly Lys Leu His Leu Phe Asp Ser Arg Gly His Thr Gly Lys Ala Trp 195 200 205 Leu Ala Leu Ser Pro Phe Ala Gly Ala Ser Leu Val Ala Ile Ser Arg 210 215 220 Thr Met Asp Tyr Arg His His Trp Gln Asp Val Leu Val Gly Ser Ile 225 230 235 240 Leu Gly Thr Val Leu Ala Tyr Phe Ser Tyr Arg Gln Tyr Tyr Pro Ser 245 250 255 Leu Glu Ser Asp Leu Ser His Arg Pro Tyr Ser Pro Arg Ile Lys His 260 265 270 Asp Glu Glu Asp Gly Leu Pro Ile His Val Arg Thr Gly Ser Glu Ser 275 280 285 His Ala Phe Ala His His Glu Ser Arg Thr Asn Pro Phe Leu Asn Thr 290 295 300 Gln Ala Arg Asp Pro Glu Arg Tyr Thr Ser Phe Asp His Thr Asp Ala 305 310 315 320 Glu Asp Phe Glu Leu Asp Gly Thr Val Pro Arg Pro Arg Ser Gly Ser 325 330 335 Leu Glu Glu Ile Trp Lys Asp Asp Glu Thr His Ser Arg Met Gly Ser 340 345 350 Pro Phe Val Asp Pro Phe Ala Thr Lys Thr Ser Thr Ala Leu 355 360 365 <210> 11 <211> 289 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 11 Met Asn Arg Val Ser Phe Ile Lys Thr Pro Phe Asn Ile Gly Ala Lys 1 5 10 15 Trp Arg Leu Glu Asp Val Phe Leu Leu Ile Ile Met Ile Leu Leu Asn 20 25 30 Tyr Pro Val Tyr Tyr Gln Gln Pro Phe Glu Arg Gln Phe Tyr Ile Asn 35 40 45 Asp Leu Thr Ile Ser His Pro Tyr Ala Thr Thr Glu Arg Val Asn Asn 50 55 60 Asn Met Leu Phe Val Tyr Ser Phe Val Val Pro Ser Leu Thr Ile Leu 65 70 75 80 Ile Ile Gly Ser Ile Leu Ala Asp Arg Arg His Leu Ile Phe Ile Leu 85 90 95 Tyr Thr Ser Leu Leu Gly Leu Ser Leu Ala Trp Phe Ser Thr Ser Phe 100 105 110 Phe Thr Asn Phe Ile Lys Asn Trp Ile Gly Arg Leu Arg Pro Asp Phe 115 120 125 Leu Asp Arg Cys Gln Pro Val Glu Gly Leu Pro Leu Asp Thr Leu Phe 130 135 140 Thr Ala Lys Asp Val Cys Thr Thr Lys Asn His Glu Arg Leu Leu Asp 145 150 155 160 Gly Phe Arg Thr Thr Pro Ser Gly His Ser Ser Glu Ser Phe Ala Gly 165 170 175 Leu Gly Tyr Leu Tyr Phe Trp Leu Cys Gly Gln Leu Leu Thr Glu Ser 180 185 190 Pro Leu Met Pro Leu Trp Arg Lys Met Val Ala Phe Leu Pro Leu Leu 195 200 205 Gly Ala Ala Leu Ile Ala Leu Ser Arg Thr Gln Asp Tyr Arg His His 210 215 220 Phe Val Asp Val Ile Leu Gly Ser Met Leu Gly Tyr Ile Met Ala His 225 230 235 240 Phe Phe Tyr Arg Arg Ile Phe Pro Pro Ile Asp Asp Pro Leu Pro Phe 245 250 255 Lys Pro Leu Met Asp Asp Ser Asp Val Thr Leu Glu Glu Ala Val Thr 260 265 270 His Gln Arg Ile Pro Asp Glu Glu Leu His Pro Leu Ser Asp Glu Gly 275 280 285 Met <210> 12 <211> 372 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 12 Met Gly Cys Phe Ala Arg Lys Thr His Thr Thr Pro His Pro Asp Thr 1 5 10 15 Asn Thr Thr Ala Val Asn Gly His His Asn Val Tyr Ser Met Gln Thr 20 25 30 Arg Pro Lys Phe Gly Gln Trp Leu Lys Cys Thr Trp Leu Asp Ile Leu 35 40 45 Thr Met Ala Val Met Gly Ala Leu Gly Leu Gly Val Tyr Met Leu Arg 50 55 60 Pro Val Pro Asn Arg Ser Phe Ala Val Thr Phe Ala Asp Gly Glu Ile 65 70 75 80 Val Tyr Pro Glu Phe Ala Tyr Pro Leu Arg Lys Glu Ile Val Pro Ile 85 90 95 Trp Leu Ala Ser Phe Leu Ala Val Val Val Pro Val Leu Gly Ile Leu 100 105 110 Leu Met Gln Ile Arg Val Arg Ser Phe Trp Asp Val Asn Asn Ala Ile 115 120 125 Val Gly Leu Leu Tyr Ser Leu Ile Thr Ala Ala Val Phe Gln Val Phe 130 135 140 Ile Lys Trp Leu Ile Gly Gly Leu Arg Pro His Phe Leu Glu Val Cys 145 150 155 160 Lys Pro Asp Thr Ser Leu Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Lys Gly 165 170 175 Phe Gln Gln Gln Tyr Phe Thr Arg Glu Ile Cys Thr Gly Asp Glu Lys 180 185 190 Glu Ile Asn Asp Ser Leu Glu Ser Phe Pro Ser Gly His Ser Thr Ala 195 200 205 Ala Phe Ala Gly Phe Val Phe Leu Tyr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Leu 210 215 220 Lys Val Phe Ser Asn Tyr His Pro Ala Met Trp Lys Leu Ile Val Ile 225 230 235 240 Tyr Thr Pro Ile Leu Gly Ala Val Leu Ile Gly Gly Ala Leu Thr Ile 245 250 255 Asp Glu Phe His Asn Trp Tyr Asp Val Val Ala Gly Ala Ile Ile Gly 260 265 270 Ser Val Met Ala Phe Ser Ser Tyr Arg Met Thr Tyr Ala Ala Ile Trp 275 280 285 Asp Trp Arg Tyr Asn His Ile Pro Leu Asn Arg Asn Ala Pro Phe Pro 290 295 300 Phe Leu Arg Asp Ser Gly Asp Leu Val Gly Ala Val Phe Thr Arg Lys 305 310 315 320 Ala Gly Trp Gly Asp Ala Ala Lys Val Pro Glu Arg Gly Asn Asp Trp 325 330 335 Asn His His Gly Gln Thr Pro Asn Ala Asn Gln Asp Gly Tyr Gln Ala 340 345 350 Ser Ser Ser Ile Pro Leu Arg Ser Val Gly Gly Gly Gln Ala Gln Pro 355 360 365 Glu Asn Ile Val 370

Claims (10)

1. 이하의 (a), (c) 및 (g) 중 어느 것에 기재된 핵산:
   (a) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열로 이루어지는 핵산
   (c) 서열 번호 1로 이루어지는 염기 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 염기 서열로 이루어지는 핵산
   (g) 서열 번호 4로 이루어지는 염기 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질을 코드하는 엑손을 갖는 염기 서열로 이루어지는 핵산.
2. 이하의 (a)∼(d) 중 어느 것에 기재된 핵산:
   (a) 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산
   (b) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질을 코드하는 염기 서열로 이루어지는 핵산
   (c) 서열 번호 4로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산
   (d) 서열 번호 5로 표시되는 염기 서열로 이루어지는 핵산.
3. 제1항에 있어서, 포스파티드산 포스파타아제 활성이, 탄소수 17의 아실기를 함유하는 포스파티드산보다 탄소수 18의 아실기를 함유하는 포스파티드산에 대한 기질 특이성이 높은 것을 특징으로 하는 핵산.
4. 이하의 (a)에 기재된 단백질:
   (a) 서열 번호 2의 아미노산 서열로 이루어지며, 또한, 포스파티드산 포스파타아제 활성을 갖는 단백질.
5. 제4항에 있어서, 포스파티드산 포스파타아제 활성이, 탄소수 17의 아실기를 함유하는 포스파티드산보다 탄소수 18의 아실기를 함유하는 포스파티드산에 대한 기질 특이성이 높은 것을 특징으로 하는 단백질.
6. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는 단백질.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 핵산을 함유하는 재조합 벡터.
8. 제7항에 기재된 재조합 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환체.
9. 삭제
10. 삭제

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