CN103703132A

CN103703132A - 磷脂酸磷酸酶基因

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Publication number: CN103703132A
Application number: CN201280036981.4A
Authority: CN
Inventors: 落合美佐
Original assignee: Suntory Holdings Ltd
Current assignee: Suntory Holdings Ltd
Priority date: 2011-07-29
Filing date: 2012-07-27
Publication date: 2014-04-02
Anticipated expiration: 2032-07-27
Also published as: JP5576986B2; EP2738254A1; CN103703132B; RU2625025C2; CA2841250A1; CA2841250C; US20140234941A1; RU2014107559A; DK2738254T3; WO2013018709A1; KR20140033525A; EP2738254A4; EP2738254B1; AU2012291107B2; KR101496771B1; AU2012291107A1; JPWO2013018709A1; US9447393B2; BR112014000936A2

Abstract

本发明提供磷脂酸磷酸酶基因。上述课题通过提供包含序列号1、序列号4或序列号5的碱基序列的核酸及包含序列号2的氨基酸序列的蛋白质以及这些的突变体来解决。

Description

磷脂酸磷酸酶基因

技术领域

本发明申请涉及新型磷脂酸磷酸酶基因及其利用。

背景技术

包含2个以上不饱和键的脂肪酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA：polyunsaturated fatty acid)，已知有花生四烯酸、二高γ亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。该多不饱和脂肪酸中包含在动物体内无法合成的多不饱和脂肪酸，对于此种多不饱和脂肪酸，作为必需脂肪酸需要从食物中摄取。多不饱和脂肪酸分布广泛，例如花生四烯酸可从由动物的肾上腺、肝脏中提取的脂质中分离。但是，动物脏器中所包含的多不饱和脂肪酸为少量，仅从动物脏器中提取或分离多不饱和脂肪酸，不足以进行大量供给。因此，不断在开发培养各种微生物以获得多不饱和脂肪酸的方法。其中，被孢霉属(Mortierella)微生物作为生产含有花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的脂质的微生物而广为人知。

此外，还进行了在植物中生产多不饱和脂肪酸的尝试。已知多不饱和脂肪酸构成三酰甘油(也称为甘油三酯、TG)等的贮藏脂质，在微生物的菌体内或植物种子中积累。

作为贮藏脂质的三酰甘油在生物体内如下生成。通过甘油—3—磷酸酰基转移酶向甘油—3—磷酸转移酰基而生成溶血磷脂酸，通过溶血磷脂酸酰基转移酶向溶血磷脂酸转移酰基而生成磷脂酸，磷脂酸通过磷脂酸磷酸酶脱磷酸化而生成二酰甘油，通过二酰甘油酰基转移酶向二酰甘油中转移酰基而生成三酰甘油。

在上述途径中，磷脂酸(phosphat idic acid，以下也有时记为“PA”。此外，也有时记为1，2-二酰基—sn—甘油—3—磷酸。)在为三酰甘油的前体的同时，还为二酰基型甘油磷脂的生物合成的前体。在酵母等中，由PA和胞嘧啶核苷5’—3磷酸(CTP)通过磷脂酸胞苷酰转移酶合成CDP二酰甘油(CDP-DG)，生物合成各种磷脂。

如上所述，已知将PA脱磷酸化而生物合成二酰甘油(diacylglycerol，以下有时也记为“DG”。)的反应由磷脂酸磷酸酶(E.C.3.1.3.4、phosphatidic acidphosphatase，以下也记为“PAP”。)催化。已知该PAP存在于从细菌到脊椎动物的所有的生物中。

已知在作为真菌类的酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevi siae))中，有2种类型的PAP(非专利文献1、2、7)。一个类型为Mg²⁺依赖性的PAP(PAP1)，另一类型为Mg²⁺非依赖性的PAP(PAP2)。作为编码PAP1的基因，已知有PAH1基因(非专利文献3～5)，由于pah1△突变株具有PAP1活性，所以，认为还有其他承担PAP1活性的基因。已知在pah1△突变株中，核膜、ER的膜异常扩张，进而成为磷脂生物合成的关键的基因表达异常增高(非专利文献6)。

另一方面，作为编码PAP2的基因，已知有DPP1基因和L PP1基因，这些基因基本承担了酵母的PAP2活性。已知这些基因所编码的酶的底物特异性广泛，作用于二酰甘油焦磷酸酯(DGPP)、溶血磷脂酸、sphingoid base phosphate、isoprenoid phosphate等而进行脱磷酸化。

在作为脂质生产菌的高山被孢霉(Mortierella alpina)中，作为Mg²⁺依赖性的PAP1同源物，已知有MaPAH1.1和MaPAH1.2的2种(专利文献1)。此外，还已知作为Mg²⁺非依赖性的PAP2同源物的MaPAP1基因(专利文献2)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1国际公开公报第WO2011/081135号公报

专利文献2国际公开公报第WO2009/008466号公报

非专利文献

非专利文献1Biochem.Biophys.Acta，1348，45-55，1997

非专利文献2Trends Biochem Sci.，31(12)，694-699，2006

非专利文献3EMBO J.，24，1931-1941，2005，

非专利文献4J.Biol.Chem.，281(14)，9210-9218，2006

非专利文献5J.Biol.Chem.，281(45)，34537-34548，2006

非专利文献6J.Biol.Chem.，282(51)，37026-37035，2007

非专利文献7J.Biol.Chem.，284(5)，2593-2597，2009

发明内容

至今为止已报道了一些PAP基因，但对导入宿主细胞使其表达时可使该宿主所产生的脂肪酸组合物的脂肪酸组成发生改变进行研究的例子非常少。期望导入如下新型基因，通过导入宿主细胞或使其表达，可制造目标脂肪酸组成的油脂或使目标脂肪酸含量增加。

本发明的目的在于提供新型磷脂酸磷酸酶基因及由其编码的蛋白质以及这些利用法。

本发明者为解决上述课题而进行了深入研究。首先，分析脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的基因组，从中提取与已知的Mg²⁺非依赖性的磷脂酸磷酸酶(PAP2)基因具有同源性的序列。进而为获得编码PAP的开放阅读框(ORF)的全长，通过cDNA文库的筛选或通过PCR克隆全长cDNA。将该基因导入酵母等具有高增殖能力的宿主细胞，确认出由经过克隆的eDNA编码的蛋白质具有磷脂酸磷酸酶活性。由此，成功地克隆了与新型磷脂酸磷酸酶(PAP)有关的基因，从而完成了本发明。即在其方式之一中，本发明可如下。

(1)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：

(a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(b)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(c)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；

(g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。

(2)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中任一项所述的核酸：

(a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中1～110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(b)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(c)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSt、50℃的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的碱基序列；

(f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列；

(g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质的外显子的碱基序列。

(3)一种核酸，其特征在于，为以下(a)～(d)中任一项所述的核酸：

(a)核酸，其包含序列号1表示的碱基序列或其部分序列；

(b)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列或其部分序列；

(c)核酸，其包含序列号4表示的碱基序列或其部分序列；

(d)核酸，其包含序列号5表示的碱基序列或其部分序列。

(4)根据(1)或(2)中所述的核酸，其特征在于，磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。

(5)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：

(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性；

(b)蛋白质，其为与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。

(6)一种蛋白质，其特征在于，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：

(a)蛋白质，其由序列号2中1～110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性；

(b)蛋白质，其为与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。

(7)根据(5)或(6)中所述的蛋白质，其特征在于，磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。

(8)一种蛋白质，其特征在于，由序列号2表示的氨基酸序列组成。

(9)一种重组载体，其特征在于，含有(1)～(4)中任一项所述的核酸。

(10)一种转化体，其特征在于，由(9)中所述的重组载体转化。

本发明提供新型PAP基因及由其编码的蛋白质以及这些的利用法。与未导入PAP的宿主所产生的脂肪酸组合物相比，可期待本发明的PAP可在宿主中产生组成不同的脂肪酸组合物。由此可提供具有所需特性、效果的脂质，所以，可作为适用于食品、化妆品、医药品、肥皂等的脂质而有用。

附图说明

图1-1表示MaPAP2.2的基因组序列及CDS的碱基序列。

图1-2为图1-1的延续。

图2为MaPAP2.2的氨基酸序列与来自双色蜡蘑的推定蛋白质及来自酵母的ScDPP1(YDR284C：注册号AAS56070))的氨基酸序列的比对。

图3为MaPAP2.2的氨基酸序列与作为来自高山被孢霉(Mortierellaalpina)的Mg²⁺非依赖性PAP(PAP2)而已知的MaPAP1(WO2009/008466)的氨基酸序列的比对。双下划线表示Mg²⁺非依赖性的磷脂酸磷酸酶2型(PAP2)家族酶的3个保守区(从N末端侧开始按顺序为结构域1、结构域2及结构域3)。*表示PAP活性中必须的氨基酸。

图4为表示涉及MaPAP2.2将18：2-PA转变为18：2-DG的活性，并对Mg² ⁺依赖性进行研究的结果图(n=1)。A表示添加Mg²⁺时的结果。B表示添加EDTA时(不含Mg²⁺)的结果。纵轴表示DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中18：2的量(μg/mg·蛋白质)。

图5为表示对不含Mg²⁺的反应液中的MaPAP2.2(A)及MaPAP1(B)将18：2-PA转变为18：2-DG的活性进行研究的结果图(n=3)。纵轴表示DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中18：2的量(μg/mg·蛋白质)。

图6A为表示在含有MaPAP2.2的反应液及对照中不添加作为底物的磷脂酸时，对18：1-DG量进行研究的结果图(n=3)。图6B为表示在含有MaPAP2.2的反应液及对照中添加作为底物的18：1-PA时，对反应后18：1-DG量进行研究的结果图(n=3)。纵轴均表示在DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中18：1的量(μg/mg·蛋白质)。

图7为表示在含有MaPAP2.2的反应液及对照中添加作为底物的17：O-PA时，对反应后17：0-DG量进行研究的结果图(n=3)。纵轴均表示DG组分中发现的粗酶液的单位蛋白质中17：0的量(μg/mg·蛋白质)。

具体实施方式

本发明涉及来自被孢霉属(Mortierella)的新型磷脂酸磷酸酶基因、由其编码的蛋白质、及这些的利用法，其特征在于，使磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油。

本发明的磷脂酸磷酸酶为催化使磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油的反应的酶。本发明的PAP的底物通常为磷脂酸，但不限于此。

编码磷脂酸磷酸酶的核酸

本发明的磷脂酸磷酸酶(PAP)中包含MaPAP2.2及其突变体。将编码MaPAP2.2核酸的cDNA、CDS、ORF及氨基酸序列的对应关系整理记入以下表1中。

表1

即作为与MaPAP2.2相关的序列，可列举作为MaPAP2.2的氨基酸序列的序列号2、作为表示MaPAP2.2的ORF区域的序列的序列号1、且还有作为表示其CDS区域的序列的序列号3及作为其cDNA的碱基序列的序列号5。其中，序列号1相当于序列号5的第75～1163位的碱基序列，序列号3相当于序列号5的第75～1166位的碱基序列。此外，作为编码MaPAP2.2的基因组碱基序列，可列举序列号4。序列号4的基因组序列由3个外显子和2个内含子组成，外显子区域为序列号4的第1～207位、第445～582位、第889～1632位。

本说明书中的核酸除单链及双链DNA以外，还包括其RNA互补体，可以来自天然，也可以由人工制作。DNA中例如可列举基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA以及其组合物、DNA和RNA的杂交体，但不限于此。

作为本发明的核酸的优选方式，可列举包含如下碱基序列的核酸，(a)序列号1表示的碱基序列，(b)编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列，(c)序列号5表示的碱基序列等。

为了获得上述碱基序列，也可从具有PAP活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中，搜索编码与已知具有PAP活性的蛋白质有同源性的蛋白质的碱基序列。作为具有PAP活性的生物，优选脂质生产菌，作为脂质生产菌，可列举高山被孢霉(M.alpina)，但并不限于此。

进行EST分析时，首先构建cDNA文库。对于cDNA文库的构建方法，可参考《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.》(Cold Spring HarborPress(2001))。且也可使用市售的cDNA文库构建试剂盒。作为适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可列举以下方法。即：将作为脂质生产菌的高山被孢霉(M.alpina)的适合菌株接种到适合的培养基中，预培养适当时间。作为适合该预培养的培养条件，例如作为培养基组成，可列举1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0，培养时间为3～4天，培养温度为28℃的条件。然后将预培养物在适当的条件下进行本培养。作为适合本培养的培养基组成，例如可列举1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H₂O、pH6.0。作为适合本培养的培养条件，例如可列举300rpm、1vvm、26℃下通气搅拌培养8天的条件。培养期间也可添加适量的葡萄糖。在本培养中适时采集培养物，从其中回收菌体，制备总RNA。制备总RNA时，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可使用市售的试剂盒从得到的总RNA中纯化poly(A)⁺RNA。而且还可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。然后将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列使用按照可确定载体上插入部分的碱基序列的方式而设计的引物来进行确定，可得到EST。例如用ZAP-cDNAGigapackIIIGold Cloning Kit(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。

分析基因组DNA时，培养具有PAP活性的生物的细胞，从该细胞中制备基因组DNA。确定所得到的基因组DNA的碱基序列，将确定的碱基序列进行拼接。从最终得到的超级重叠群(supercontig)的序列中，搜索编码与已知具有PAP活性的蛋白质的氨基酸序列有高同源性的氨基酸序列的序列。作为编码此种氨基酸序列的序列，从匹配的超级重叠群的序列中制备引物，以上述cDNA文库为模板进行PCR，将所得到的DNA片段整合到质粒中进行克隆。以经过克隆的质粒为模板，通过使用上述引物进行PCR来制备探针。使用制备的探针筛选cDNA文库。

将MaPAP2.2的氨基酸序列相对于在GenBank注册的氨基酸序列，使用BLASTp程序进行同源性搜索。该氨基酸序列与双色蜡蘑的推定蛋白质(序列号10、注册号：XP___001878243)以最高分匹配，同一性为36.7％。此外，作为来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的公知的PAP2(Mg²⁺非依赖性的PAP)的MaPAP1的氨基酸序列和MaPAP2.2的氨基酸序列之间的同一性为20.5％。

本发明还包括：与包含上述序列号1表示的碱基序列或编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能的核酸。“具有同等功能”是指，本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有磷脂酸磷酸酶(PAP)活性。本说明书中，PAP活性是指催化将磷脂酸脱磷酸化而生成二酰甘油的反应的活性。此外，PAP活性也可以为与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高，但不限于此。且PAP活性也可为Mg²⁺非依赖性，但不限于此。

包含序列号1表示的碱基序列或编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的核酸的突变体，作为与该核酸具有同等功能的核酸，可列举包含以下(a)～(g)中任一项所述的碱基序列的核酸。

(a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

具体地说，为如下碱基序列，其编码由以下氨基酸序列组成的蛋白质且具有PAP活性的蛋白质，氨基酸序列为：

(i)序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～110个、1～100个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸发生缺失的氨基酸序列，

(ii)序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～110个、1～100个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列，

(iii)在序列号2所示的氨基酸序列中附加1个或多个(优选为1个或数个(例如1～110个、1～100个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))其他氨基酸的氨基酸序列或

(iv)组合上述(i)～(iii)的氨基酸序列。

上述中，取代优选为保守性取代。保守性取代是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原来序列的结构相关的特征，可为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原来序列中存在的螺旋结构或不破坏赋予原来序列特征的其他种类的二级结构，可为任何取代。

保守性取代通常可用生物学体系合成、化学肽合成来导入，但优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可包含非天然的氨基酸残基，也可包含肽模仿物、氨基酸序列中未被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。

以下，将氨基酸残基按可取代的残基分类举例，但可取代的氨基酸残基不限于以下记载的残基：

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、邻甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己基丙氨酸；

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；

C组：天冬酰胺、谷氨酰胺；

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸及2，3-二氨基丙酸；

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸；

F组：丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸；

G组：苯丙氨酸及酪氨酸。

为非保守性取代时，上述种类中的某一种成分可与其他种类的成分互换，此时，为保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)(Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982))。

此外，为非保守性取代可根据亲水性进行氨基酸的取代。

本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩写，均根据IUPAC-IUB Commissionon Biochemical Nomenclature或例如Immunology--A Synthesis(第2版，E.S.Golub及D.R.Gren监修，Sinauer AsSociates，Sunderland，Massachusetts(1991))等中记载的本领域惯用的缩写。此外，氨基酸有光学异构体时，在无特别说明的情况下，均表示L体。

D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等的非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非惯用氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。

且本说明书中使用的蛋白质的标记法，根据标准用法及本领域中常用的标记法，左方向为氨基末端方向，且右方向为羧基末端方向。

同样，在通常情况下只要不特别提及，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方向为5’方向。

只要是本领域技术人员，使用本领域中公知的技术，即可设计、制备本说明书中记载的蛋白质的适当的突变体。例如，通过将认为对本发明蛋白质的生物学活性并不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而使其结构改变的蛋白质分子中适当的区域。且也可鉴定在类似的蛋白质间保守的分子的残基及区域。进而，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏生物学活性且不对蛋白质的多肽结构产生不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。

特别是如图3中双下划线所示，MaPAP2.2的氨基酸序列(序列号2)中的第115～123残基、第172～175残基、及第229～233残基上存在Mg²⁺非依赖性的磷脂酸磷酸酶2型(PAP2)家族酶的3个保守区。且PAP2家族酶的3个保守区中，结构域1的精氨酸、结构域2及3的组氨酸作为活性上必须的氨基酸而已知，MaPAP2.2中，该氨基酸也分别作为序列号2的第122残基的精氨酸、第175残基的组氨酸及第229残基的组氨酸而保守。上述保守区为PAP2家族酶中必须的区域，对于本发明的PAP也为重要的区域。因此，本发明的突变体，只要上述保守区保守，也可为任何突变体。

只要是本领域技术人员，均可鉴定对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽类似的肽残基，比较此2种肽的氨基酸残基，预测出与本发明蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基，即可进行所谓的结构-功能研究。而且，通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，可选择保持了本发明蛋白质的生物学活性的突变体。且如果是本领域技术人员，即也可对本蛋白质突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。进而从所得到的分析结果来看，也可预测与蛋白质的三维结构有关的氨基酸残基的比对。预测为蛋白质表面上存在的氨基酸残基具有参与和其它分子的重要的相互作用的可能性，因此，如果是本领域技术人员，即可基于上述分析结果，制备不使预测为在此种蛋白质表面上存在的氨基酸残基发生改变的突变体。而且，只要是本领域技术人员，均可制备构成本发明蛋白质的各个氨基酸残基中，只有一个氨基酸残基发生取代的突变体。通过公知的检测方法筛选此种突变体，即可收集各个突变体的信息。由此，通过对以下情况进行比较，即某种特定氨基酸残基发生取代的突变体的生物学活性与本发明蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现出此种生物学活性时或产生抑制本蛋白质生物学活性的不适当活性时，可评价构成本发明蛋白质的各种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，即可根据此种从日常实验中收集的信息，单独或与其他突变组合，从而容易地分析作为本发明蛋白质的突变体的不期望的氨基酸取代。

如上所述，由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，可通过《Molecular Cloning，ALaboratory Manual3rd ed.》(Cold Spring Harbor Press(2001))、《CurrentProtocol s in Molecular Biology》(John Wi ley＆Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl. Acad.Sci.USA82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6等中记载的定点诱变法等方法制备。发生了此种氨基酸的缺失、取代或附加等突变的突变体的制备，例如可通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知方法，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒例如QuikChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailor^TMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TAKARA BIO公司制)等进行。

且作为在蛋白质的氨基酸序列中，既保持了其活性同时又引入1个或多个氨基酸的缺失、取代或附加的方法，除上述定点诱变以外，还可列举为可利用用诱变剂处理基因的方法及使基因选择性断裂从而将所选择的核苷酸除去、取代或附加后再进行连接的方法。

本发明的核酸中所包含的碱基序列，优选为编码由序列号2表示的氨基酸序列中1～30个、1～20个或1～10个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸编码的蛋白质中的氨基酸的突变或修饰的数量、或突变或修饰的位点，只要保持PAP活性，则并无限制。

PAP活性可使用公知的方法测定。例如可参照以下的文献：J.Biol.Chem.，273，14331-14338(1998)。

例如PAP活性也可如下测定。破碎使本发明的PAP表达的转化细胞，离心分离其细胞破碎液并回收上清，制成粗酶液。也可将粗酶液进一步纯化为本发明的PAP。且可将包含本发明的PAP的粗酶液或纯化后的本发明的PAP添加在含有100μg/mL磷脂酸及50mM Tri s-HCl(pH7.5)的反应液中，25～28℃下反应适当时间。添加氯仿：甲醇使反应终止后进行脂质提取，将所得到的脂质通过薄层色谱法等进行分离，对生成的二酰甘油量进行定量。

(b)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段制备探针，使用此探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。

对于杂交法的详细步骤，可参照《Molecular Cloning，A LaboratoryManual3rd ed.》(Cold Spring Harbor Press(2001)；特别是Section6-7)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wi ley&Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4)、《DNA Cloning1：Core Techniques，APractical Approach2nd ed.》(Oxford University(1995)；杂交条件特别参照Section2.10)等。

杂交条件的强度主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明书中“严谨条件”包括中度或高度严谨条件。

具体来说，作为中度严谨条件，例如杂交条件，可列举1×SSC～6×SSC、42℃～55℃的条件，更优选为1×SSC～3×SSC、45℃～50℃的条件，最优选为2×SSC、50℃的条件。杂交溶液中例如包含约50％甲酰胺时，采用比上述温度低5至15℃的温度。作为洗涤条件，可列举0.5×SSC～6×SSC、40℃～60℃。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05％～O.2％SDS、优选为约0.1％SDS。

作为高度严谨(高严谨)的条件，包括在比中度严谨条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如杂交条件，可列举0.1×SSC～2×SSC、55℃～65℃的条件，更优选为0.1×SSC～1×SSC、60℃～65℃的条件，最优选为0.2×SSC、63℃的条件。作为洗涤条件，可列举0.2×SSC～2×SSC、50℃～68℃，更优选为0.2×SSC、60～65℃。

特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可列举：在5×SSC、1％SDS、50mMTris-HCl(pH7.5)及50％甲酰胺中在42℃的条件下进行预杂交后，添加探针，在42℃保温过夜形成杂交体，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行3次20分钟的洗涤的条件，但并不限于此条件。

此外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体地说，可列举为使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)、ECL directlabeling＆detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。

作为本发明中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，优选与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质。

(c)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列含有如下碱基序列，由与序列号1所示的碱基序列有至少70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有PAP活性的蛋白质。

可列举优选为包含与序列号1表示的碱基序列有至少75％以上、进一步优选为80％以上(例如为85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％、98％或99％以上)同一性的碱基序列的核酸，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

2个碱基序列的同一性％可通过视觉检查、数学计算来确定，但优选使用计算机程序、通过比较2组核酸的序列信息来确定。作为序列比较计算机程序，例如可利用美国国立医学图书馆网站：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/b12seq/bls.html的BLASTN程序(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)：2.2.7版或WU-BLAST2.0算法等。关于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站：http：//blast.wustl.edu中所记载的内容。

(d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸编码的蛋白质，只要具有PAP活性，也可以是与MaPAP2.2的氨基酸序列具有同一性的蛋白质。具体地说，作为本发明的核酸编码的蛋白质的氨基酸序列，可列举与序列号2表示的氨基酸序列有75％以上、优选为80％以上、更优选为85％、进一步优选为90％(例如95％、进一步为98％)以上同一性的氨基酸序列等。

本发明的核酸中所包含的碱基序列，优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列所组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

2段氨基酸序列的同一性％可通过视觉检查、数学计算来确定。此外，也可使用计算机程序来确定同一性％。作为此种计算机程序，例如可列举为BLAST、FASTA(Altschul等、J.Mol.Biol.，215：403-410(1990))、及ClustalW等。特别是通过BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)做了记载，可从美国生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等)。且可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DINASIS Pro(日立软件)、Vector NTI(Infomax)等的程序来确定。

使多个氨基酸序列并列的特定的比对图也可显示序列中特定的短的区域的匹配，所以，即使使用的序列的全长序列间无显著相关时，也可在此种区域中检测出特定的序列同一性非常高的区域。且BLAST算法可使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数可使用如下所示的内容：(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段(由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers andChemistry，1993)确定；也希望参照Wootton及Federhen，1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis of compositionally biased regions insequence databases)Methods Enzymol.266：544-71)或由短周期性的内部重复组成的片段(由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定))用于屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序列的一致性的统计学上的显著性阈值或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅由偶然发现的一致性的期望概率；源于某种一致性的统计学的显著差异比E-scote阈值大时，不报告此一致性。

(e)核酸，其包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列包含与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交的条件如上所述。

(f)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有PAP活性的蛋白质的外显子的碱基序列。

由序列号4组成的碱基序列为编码MaPAP2.2的基因组的DNA序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交，且具有编码具有PAP活性的蛋白质的外显子。

上述碱基序列可如下获得，用本领域技术人员公知的方法使用适当的片段制备探针，使用此探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，从基因组文库等中获得。杂交的条件如上所述。

(g)核酶，其包含与由序列号4组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成，且具有编码具有PAP活性的蛋白质的外显子的碱基序列。

本发明的核酸中所包含的碱基序列包含如下碱基序列，与由序列号.4组成的碱基序列有至少70％以上同一性的碱基序列所组成，且编码具有PAP活性的蛋白质。可列举如下碱基序列，包含优选与序列号4所示的碱基序列有至少75％以上、进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％、98％或99％以上)同一性的碱基序列，且具有编码具有PAP活性的蛋白质的外显子。2个碱基序列的同一性％可如上所述确定。

序列号4的基因组DNA序列由3个外显子和2个内含子组成，外显子区域为序列号4的第1～207位、第445～582位、第889～1632位。

在其他方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，包含在序列号4所示的基因组DNA序列中，内含子区域的碱基序列与序列号4表示的序列为100％同一，且外显子区域的碱基序列与序列号4表示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且具有编码具有PAP活性的蛋白质的外显子。

此外，在另一方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，包含在序列号4表示的基因组DNA序列中，外显子区域的碱基序列与序列号4表示的序列为100％同一，且内含子区域的碱基序列与序列号4表示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且可通过剪接脱离内含子区域，由此连接外显子区域并编码具有PAP活性的蛋白质。

进而在又一方式中，本发明的核酸中所包含的碱基序列可列举如下碱基序列，包含在序列号4表示的基因组DNA序列中，内含子区域的碱基序列与序列号4表示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且外显子区域的碱基序列与序列号5或序列号10表示的序列有至少70％以上，优选为75％以上，进一步优选为80％以上(例如85％以上，更优选为90％以上，进一步为95％以上、98％以上、99％以上)同一性的碱基序列，且可通过剪接脱离内含子区域，由此连接的外显子区域编码具有PAP活性的蛋白质。

2个碱基序列的同一生％可通过上述的方法确定。

而且本发明的核酸中还包含如下核酸，其包含由序列号1组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列所组成，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。具体地说，也可使用如下核酸，其包含

(i)序列号1所示的碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～330个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))碱基发生缺失的碱基序列，

(ii)序列号1所示的碱基序列中1个或多个(优选为1个或数个(例如1～330个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))碱基被其他碱基取代的碱基序列，

(iii)序列号1所示的碱基序列中附加了1个或多个(优选为1个或数个(例如1～330个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个，进一步优选为10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个))其他碱基的碱基序列，或

(iv)组合了上述(i)～(iii)的碱基序列，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。

作为本发明的核酸的其他方式，还为含有包含以下(a)～(d)中任一项所述的碱基序列的片段的核酸：

(a)序列号1表示的碱基序列

(b)编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列

(c)序列号4表示的碱基序列

(d)序列号5表示的碱基序列

有关(a)序列号1表示的碱基序列、(b)编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(d)序列号5表示的碱基序列，如表1中所记载。且有关序列号4表示的碱基序列也如上所述。上述序列的片段包含上述碱基序列中所包含的ORF、CDS、具有生物学活性的区域、作为如下记载的引物而使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制备。

此外，本发明的核酸中也含有以下核酸。

(a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列。

(b)核酸，其为与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸。

(c)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成的编码蛋白质的碱基序列。

(d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列。

(e)核酸，其为与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸。

(f)核酸，其为与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在严谨条件下杂交的核酸。

(g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列所组成的编码蛋白质的碱基序列。

(2)根据(1)中所述的核酸，其特征在于，为以下(a)～(g)中的任一项。

(a)核酸，其包含编码由序列号2表示的氨基酸序列中1～130个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列。

(b)核酸，其为与由序列号1组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交的核酸。

(c)核酸，其包含与由序列号1组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列所组成的碱基序列。

(d)核酸，其包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列。

(e)核酸，其为与编码由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交的核酸。

(f)核酸，其为与由序列号4组成的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交的核酸。

(g)核酸，其包含与由序列号4组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列所组成的碱基序列。

磷脂酸磷酸酶蛋白质

本发明的蛋白质为由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质及其突变体，包含与所述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可来自天然，也可人工制备。有关由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，指如上述《编码磷脂酸磷酸酶的核酸》一项中所说明的具有PAP活性的蛋白质。

在本发明中，作为与由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可列举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：

(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有PAP活性，

(b)蛋白质，其是由与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有PAP活性。

上述中，对于序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列或与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，如上述《编码磷脂酸磷酸酶的核酸》一项中的说明。且上述“具有PAP活性的蛋白质”包含如下蛋白质：其为由包含序列号1的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体或序列号2表示的氨基酸序列中通过1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等的多种修饰而产生突变的蛋白质或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且为具有PAP活性的蛋白质。

另外，本发明的蛋白质也可人工制备，此时也可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等化学合成法制造。也可利用Advanced ChemTech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。

且本发明的蛋白质中还包含以下蛋白质。

(1)(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成。

(b)蛋白质，其由与由序列号2组成的氨基酸序列有80％以上同一性的氨基酸序列所组成。

(2)蛋白质，为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质：

(a)蛋白质，其由序列号2中1～110个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成。

(b)蛋白质，其由与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列所组成。

核酸的克隆

PAP的核酸，例如可通过使用适合的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。且可使用适合的引物通过PCR反应扩增，通过与适合的载体连接来进行克隆。而且也可亚克隆到其他载体中。

例如也可使用pBlue-Script^TMSK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM：Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等市售的质粒载体。且通过PCR反应扩增时，引物可使用上述序列号5等所示的碱基序列的任何部分，例如可分别使用上游侧用引物，引物PAP2.2-1f：5’-TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT-3’(序列号6)、下游侧用引物，引物PAP2.2-4r：5’-GACAATGCCGAGGATCGAGCC-3’(序列号7)等。而后，在从高山被孢霉(M.alpina)菌体中制备的cDNA中，使上述引物及DNA聚合酶等作用而进行PCR反应。上述方法根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.》(Cold Spting Harbor Press(2001))等，只要是本领域技术人员均可容易地进行，作为本发明的PCR反应条件，例如可列举为以下条件：

变性温度：90～95℃

退火温度：40～60℃

延伸温度：60～75℃

循环数：10次以上

所得到的PCR产物的纯化可使用公知的方法。例如使用6ENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GE Healthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，可进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶切出，通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、Freeze&Squeeze法等纯化。

克隆后的核酸的碱基序列，可使用碱基序列测序仪来确定。

PAP表达用载体构建及转化体的制备

本发明还提供包含编码PAP的核酸的重组载体。本发明还进一步提供由上述重组载体转化的转化体。

此种重组载体及转化体可如下获得。即将具有编码MaPAP2.2或其突变体的核酸的质粒用限制性内切酶酶切。作为使用的限制性内切酶，例如可列举为EcoRI、KpnI、BamHI及SalI等，但不限于此。且也可通过T4聚合酶处理将末端平滑化。将酶切后的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将该DNA片段通过使用公知的方法整合到表达用载体中，可得到PAP表达用载体。将此表达载体导入宿主制备转化体，用于目的蛋白质的表达。

此时，表达载体及宿主只要可表达目的蛋白质，无特别限定，例如作为宿主，可列举真菌、细菌、植物、动物或它们的细胞等。作为真菌，可列举作为脂质生产菌的高山被孢霉(M.alpina)等的丝状菌、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)等的酵母等。且作为细菌，可列举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。且植物可列举菜籽、大豆、棉花、红花、亚麻等的油料作物。

作为脂质生产菌，例如可以使用在MYCOTAXON，Vol.XLIV， No.2，pp.257-265(1992)中记载的菌株，具体地说可以列举属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、喜湿被孢霉(Mortierella hygrophila)IFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCCl6266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBSl94.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、矮被孢霉(Mortierella nana)IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierellavinacea)CBS236.82等属于Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。特别优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。

以真菌类为宿主使用时，优选本发明的核酸在宿主中可自主复制或者是可插入该菌的染色体上的结构，与此同时，优选是包含启动子、终止子的组成。使用高山被孢霉(M.alpina)作为宿主时，作为表达载体，例如可列举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要可在宿主中表达，也可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1基因启动子、GAPDH(甘油醛3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF翻译延伸因子(Translation elongation factor)基因启动子的来自高山被孢霉(M.alpina)的启动子。

作为向高山被孢霉(M.alpina)等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可列举电穿孔法、原生质球法、粒子轰击法及向核内DNA直接显微注射法等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养素的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化株。此外，转化使用抗药性标记基因时，在包含其药剂的选择培养基上培养，可得到具有抗药性的细胞菌落。

以酵母为宿主使用时，作为表达载体，例如可列举pYE22m等。且也可使用pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。另外，作为适用于本发明的宿主可列举Saccharomyces cerevisiae EH13-15株(trp1，MATα)等，但不限于此。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gal1启动子、gal10启动子等来自酵母等的启动子。

向酵母内导入重组载体的方法，例如可列举醋酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或多数)的包裹及向核内直接显微注射DNA等。

以大肠杆菌等的细菌为宿主使用时，作为表达载体，例如可列举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。作为启动子，例如可使用trp启动子、1ac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。作为向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。

脂肪酸组合物的制造方法

本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即：培养上述转化体，从获得的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。脂肪酸组合物是包含1种或1种以上的脂肪酸组合的组合物。在此，脂肪酸可以是遊离脂肪酸，也可以作为包含甘油三酯、磷脂等脂肪酸的脂质而存在。本发明的脂肪酸组合物具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来说，并不限于该方法，可采用通常公知的其他方法进行。

用于培养使PAP表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，包含各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如转化酵母使PAP表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，以SC-Trp培养基为例：每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen basew/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g。

培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的适当的条件，可以为任意的条件，具体为可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等的各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(1段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即所谓2段培养或3段培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。

作为宿主使用酵母进行2段培养时，本发明的脂肪酸组合物的制造方法可如下进行。作为预培养，将转化体的菌落接种到上述的SC-Trp培养基等中，30℃下振荡培养2天。其后，作为本培养，在YPD5(2％酵母膏、1％多聚蛋白胨、5％葡萄糖)培养基10ml中添加预培养液500μl，30℃下振荡培养2天。

脂肪酸组合物

本发明还提供在MaPAP2.2或其突变体已表达的细胞中的1种或1种以上作为脂肪酸的集合体的脂肪酸组合物。优选为培养MaPAP2.2或其突变体已表达的转化体而得到的脂肪酸组合物。脂肪酸可以是遊离脂肪酸，也可以以包含甘油三酯、磷脂等脂肪酸的脂质的形态存在。

作为本发明脂肪酸组合物中包含的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可列举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14：0)、肉豆蔻油酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14：1)、棕榈酸(十六烷酸)(16：0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16：1)、珍珠酸(十七烷酸)(17：0)、硬脂酸(十八烷酸)(18：0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18：1(9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18：1(11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18：2(9，12))、α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18：3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18：3(6，9，12))、亚麻油酸(6，9，12，15-十八碳四烯酸酸)(18：4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20：0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20：2(8，11))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20：3(5，8，11))、二高γ-亚麻酸(8，11，14－二十碳三烯酸)(20：3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20：4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(8，11，14，17-二十碳四烯酸)(20：4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20：5(5，8，11，14，17))、山萮酸(二十二烷酸)(22：0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22：4(7，10，13，16))、(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22：5(7，10，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22：5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22：6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24：0)、神经酸(顺式-15-二十四碳单烯酸)(24：1)、蜡酸(二十六烷酸)(26：0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了组织名及表示碳原子数量和双键位置的数值。

本发明的脂肪酸组合物只要是为上述脂肪酸中1种或1种以上的脂肪酸的组合，也可为由任何数量任何种类的脂肪酸组成的组合物。

包含脂肪酸组合物的食品等

此外，本发明还提供包含上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物根据常用方法，例如可用于包含油脂的食品、工业原料(化妆品、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料)的制造等用途中。作为化妆品(组合物)或医药(组合物)的剂型，可列举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可列举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半消化状态营养食品以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。

进而，作为食品的例子，可以列举营养辅助食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方奶、早产儿用配方奶、老人用食品等，但不限于此。在本说明书中，食品是固体、流体、液体以及它们的混合物，是可摄取食用的物质的总称。

营养辅助食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指被认为是健康的或对健康有益的食品，包括营养辅助食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充发挥机体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用食品同义。幼儿用食品是指供给约6岁以下的儿童用的食品。老人用食品是指处理成比未处理食品易消化和吸收的食品。婴儿用配方奶是指供给约1岁以下的儿童用的配方奶。早产儿用配方奶是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方奶。

作为这些食品，可以列举肉、鱼、坚果等天然食品(用油脂处理过的食品)；中国菜、拉面、汤等在制作时加入油脂的食品；天妇罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、甜甜圈、花林糖等用油脂作为热介质的食品；黄油、人造黄油、蛋黄酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇凌等油脂食品或在加工时添加了油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等在加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于包含油脂的食品，例如还可以是面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产品；清酒、药酒、甜料酒、食醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。

使用编码PAP的核酸或PAP蛋白质的菌株的评价·选择方法

本发明还提供使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质进行脂质生产菌的评价和选择的方法。具体如下所示：

(1)评价方法

作为本发明的一个实施方式，可列举使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质，进行脂质生产菌评价的方法。作为上述评价方法，首先可列举使用编码本发明的PAP的核酸的碱基序列设计的引物或探针，对作为被测菌株的脂质生产菌株的PAP活性进行评价的方法。此种评价方法的通常方法为公知，例如在国际专利申请WO01/040514号公报、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。

首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等任何公知的方法[例如参照Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。

基于编码本发明的PAP的核酸的碱基序列、优选基于序列号1设计引物或探针。上述引物或探针可使用编码本发明的PAP的核酸的碱基序列的任意部分，且其设计可使用公知方法进行。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15～25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300～2000个碱基为宜。

使用上述制备的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在与编码本发明的PAP的核酸的碱基序列特异对应的序列。特异对应的序列的检测可采用公知方法进行。例如，将包含编码本发明的PAP的核酸的碱基序列的一部分的多核苷酸或包含与上述碱基序列的一部分互补的碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，作为另一个引物使用包含该序列的上游或下游序列的一部分的多核苷酸或包含上述序列的互补碱基序列的多核苷酸，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可测定扩增产物的有无、扩增产物分子量的大小等。

适合本发明方法的PCR法的反应条件无特别限定，例如可列举以下条件，

变性温度：90～95℃

退火温度：40～60℃

延伸温度：60～75℃、

循环数：10次以上

等的条件。将获得的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是包含相当于本发明碱基序列的特异性区域的核酸分子的大小，可预测或评价被测菌株的PAP活性。而且通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，还可进一步更正确地预测或评价PAP活性。另外，PAP活性的评价方法如上所述。

且作为本发明的评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号1等本发明的碱基序列编码的PAP的表达量，也可评价被测菌株的PAP活性。且PAP的表达量，可通过在适当条件下培养被测菌株，对PAP的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons1994-2003)。

(2)选择方法

作为本发明的其他方式，可列举使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质进行脂质生产菌选择的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号1等本发明的碱基序列编码的PAP的表达量，选择日的表达量的菌株，可选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可选择出所期望的菌株。具体地说，例如可在适当的条件下培养标准菌株及被测菌株，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比被测菌株为高表达或低表达的被测菌株，来选择具有期望活性的菌株。对于所期望的活性，如上所述，可列举测定PAP的表达量及PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。

且作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可选择出具有期望活性的被测菌株。对于所期望的活性，如上所述，可列举测定PAP的表达量及PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。

作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸表达受到抑制的菌株、进行诱变处理的菌株、自发突变的菌株等，但并不限于此。且PAP活性，例如可通过本说明书中的“编码磷脂酸磷酸酶的核酸”一项中记载的方法进行测定。作为诱变处理，例如可列举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等(日语原名：大嶋泰治編著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p.67-75、学会出版センタ一))，但不限于此。

此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可列举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体地说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。

以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例

实施例1：高山被孢霉(Mortierella alpina)的基因组分析

将M.alpina1S-4株接种到100ml的GY2：1培养基(2％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中，在28℃下振荡培养2天。通过过滤收集菌体，使用DNeasy(QIAGEN)制备基因组DNA。

使用Roche454GS FLX Standard来确定上述基因组DNA的碱基序列。此时，片段文库的碱基序列的确定进行2个run，末端配对文库的碱基序列的确定进行3个run。通过将得到的碱基序列拼接，得到300个超级重叠群。

实施例2：cDNA的合成和cDNA文库的制备

将M.alpina1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中，在28℃下预培养3天。在10L培养槽(Able Co.、東京)中加入5L培养基(1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H₂O、pH6.0)，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃条件下通气搅拌培养8天。培养第1、2及3天时，添加分别相当于2％、2％及1.5％的葡萄糖。在培养第1、2、3、6及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/CsCl法制备RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(Takara Bio Inc.)，从总RNA中进行poly(a)⁺RNA的纯化。使用ZAP-cDNAGigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)构建各阶段的cDNA文库。

实施例3：来自酵母的DPP1同源物的搜索

将酵母的ScDPP1(YDR284C：注册号AAS56070)和ScLPP1(YDR503C：注册号AAT93210)的同源物通过基因组数据库来进行研究。其结果，2个超级重叠群匹配。一个是包含MaPAP1所涉及的基因组序列的超级重叠群，另一个是包含序列号4的超级重叠群。序列号4所涉及的基因命名为MaPAP2.2。

实施例4：MaPAP2.2的克隆及序列分析

(1)克隆

为了克隆MaPAP2.2的cDNA，制备了如下引物。

引物PAP2.2-1f：TTCCGTCAGGACACTCCTCCAGT(序列号6)

引物PAP2.2-4r：GACAATGCCGAGGATCGAGCC(序列号7)

以如上所述制备的文库为模板，通过引物PAP2.2-1F和引物PAP2.2-4R的组合，使用ExTaq(TaKaRa Bio)，进行94℃2分钟、(94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟)30个循环的PCR反应。将所得到的约0.4kbp的DNA片段使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen)进行克隆，确定插入部分的碱基序列。将具有序列号3的第534～904位的碱基序列的质粒作为pCR-MaPAP2.2-P。

而后，以该质粒pCR-MaPAP2.2-P为模板，使用上述引物通过PCR制备探针。反应中使用ExTaq(TaKaRa Bio)，替换附带的dNTP混合物使用PCR标记混合物(Roche Diagnostics公司)，制备将经过扩增的DNA进行地高辛(DIG)标记的探针，作为MaPAP2.2探针。使用这些探针，筛选cDNA文库。

杂交条件如下。

缓冲液：5x SSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺；

温度：42℃(一夜)；

洗涤条件：0.2x SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)、20分钟×3次。

使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行检测。从筛选得到的噬菌体克隆中，通过使用体内切割技术切割质粒，得到质粒DNA。插入片段长度最长的质粒包含序列号5的碱基序列，命名为质粒pB-MaPAP2.2。

起始密码子、终止密码子的存在与其他PAP2同源物相比，序列号5的第75位～1166位(与序列号3相同)可认为是MaPAP2.2的CDS。

(2)序列分析

对于MaPAP2.2基因的碱基序列及其编码的推定氨基酸序列，通过BLAST及clustalW的分析，与已知的核酸碱基序列及氨基酸序列进行同源性搜索。在与通过BLASTX的在6ENBANK上注册的氨基酸序列进行同源性搜索时匹配的序列中，E-Value最低的序列为来自双色蜡蘑(Laccaria bicolor)的推定蛋白质(注册号：XP__001878243)，氨基酸序列的同一性为36.7％。MaPAP2.2的氨基酸序列与来自双色蜡蘑的推定蛋白质及来自酵母的ScDPP1(YDR284C：注册号AAS56070))的氨基酸序列的比对如图2所示。

此外，来自高山被孢霉(Mortierella alpina)的作为Mg²⁺非依赖性PAP(PAP2)而已知的MaPAP1(WO2009/008466)与MaPAP2.2的氨基酸序列的同一性为20.5％。MaPAP2.2与MaPAP1的氨基酸序列的比对如图3所示。PAP2家族酶中有3个保守区，也已知为活性上必需的氨基酸。如图3所示，MaPAP2.2中也保留有这些保守区(图3中，以双下划线表示的区域)，保留有活性上必需的结构域1的精氨酸残基、结构域2和结构域3的组氨酸残基(图3中，以*表示残基)。

实施例5：MaPAP2.2的功能分析

(1)酵母表达载体的构建

为了使MaPAP2.2在酵母中表达，如下构建酵母表达用载体。首先，制作引物Eco-PAP2-2-F和Kpn-PAP2-2-R，以pB-MaPAP2.2为模板，使用ExTaq(TaKaRaBio)进行PCR反应。

Eco-PAP2-2-F：GAATTCATGTTCTCGTCCATGCGCTTCAAG(序列号8)

Kpn-PAP2-2-R：TGGTACCTCATGGTCCCAAGTATACATCGTTCC(序列号9)

将所得到的1.1kbp的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(invitrogen)进行TA克隆，确认碱基序列，将具有MaPAP2.2的CDS的正确碱基序列(序列号3)的质粒作为pCR-MaPAP2.2。将用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切pCR-MaPAP2.2而得到的约1.1kbp的DNA片段与用限制性内切酶EcoRI、KpnI酶切酵母表达用载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)而得到的约8.3kbp的DNA片段使用ligation high(TOYOBO)连接，构建质粒pYE-MaPAP2.2。

(2)转化酵母的获得

分别使用质粒pYE22m、pYE-MaPAP2.2、pYE-MaPAP1(WO2009/008466)，通过醋酸锂法转化酵母S.cerevisiae EH13-15株(trpl，MAT a)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)。将在SC-Trp(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)6.7g、葡萄糖20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)1.3g)琼脂培养基(2％琼脂)中生长繁殖的菌株作为转化株进行筛选

(3)酵母的培养

将转化株在各个载体中用以下条件培养。即作为预培养，在10ml SD-Trp上接种酵母，30℃下振荡培养1天。作为本培养，将1ml预培养液添加在100mlSD-Trp中，30℃下振荡培养1天。

(4)粗酶液的制备

用离心分离回收菌体后、水洗，-80℃下暂时保存。在菌体中添加5ml的缓冲液A(50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.3M蔗糖、10mM DTT、1mM PMSF)，充分悬浮。其后，通过用弗式压碎器以16kPa进行3次处理，破碎菌体。将菌体破碎液以1，500xg、4℃下离心分离10分钟，将所得到的上清作为粗酶液。

(5)PAP活性测定

方法

PAP活性如下测定。作为反应液，制备含有50mM Tris-HCl(pH7.5)、50μg亚油酸(18：2)-PA或油酸(18：1)-PA或珍珠酸(17：0)-PA(成为底物的磷脂酸)、0.5mM MgCl₂或0.5mM EDTA、10mM DTT、100μl粗酶液的总量为500μl的反应液，28℃下反应30分钟。添加氯仿：甲醇(1：2)终止反应。作为对照，使用添加了替换粗酶液而用不含MaPAP2.2基因的质粒pYE22m转化的酵母(对照株)的菌体破碎液的上清的反应液。通过Bligh＆Dyer法提取脂质，用离心浓缩机干固。溶解于氯仿中，通过TLC(硅胶60板、己烷：乙醚：醋酸=70：30：1)分离脂质。将樱草灵溶液喷雾后，通过UV照射使脂质可视化。刮取磷脂质组分和甘油二脂(DG)组分，将所含有的总脂肪酸衍生为甲酯，进行气相色谱法分析。

在上述的反应中，通过测定从作为底物添加的磷脂酸(PA)转变的甘油二脂(DG)的量，可测定PAP活性。

结果

结果如图4～7所示。

如图4所示，在添加了MaPAP2.2的粗酶液的反应液中，与对照相比，18：2-DG量增加。此结论说明由于MaPAP2.2的存在，由18：2-PA向18：2-DG的转变提高了，即MaPAP2.2具有PAP活性。此外，由图4中记载的结果可表明，无论有无Mg²⁺，对照和MaPAP2.2的高表达株(图4中，标记为MaPAP2-2)中的从18：2-PA向18：2-DG的转变程度相同，即无论有无Mg²⁺，MaPAP2.2均显示出同等的PAP活性。此结论说明，MaPAP2.2的PAP活性不依赖于Mg²⁺。

图5显示出对在添加有MaPAP2.2的粗酶液或MaPAPl的粗酶液的不含Mg²⁺的反应液中的18：2-DG量进行研究的结果。使用MaPAP2.2时，从18：2-PA向18：2-DG的转变显著增高，而使用MaPAPl时仅确认出与对照为相同程度的18：2-DG。此结论说明，与MaPAP2.2和MaPAPl具有不同的底物特异性。

图6表示在含有MaPAP2.2的粗酶液的反应液及对照中，对作为底物添加18：1-PA时以及不添加18：1-PA时的反应后的18：1-DG量进行研究的结果。因18：1-PA为在酵母中原本存在的磷脂酸，所以，测定在不添加18：1-PA的条件下粗酶液中的18：1-PA量(本底值(Background))，确认出MaPAP2.2表达株与对照株之间无差异(图6A)。而且，在测定添加18：1-PA时的反应后的18：1-DG量时，与使用对照的粗酶液的情况相比，使用MaPAP2.2的粗酶液时生成更多的18：1-PA(图6B)。该结果说明，在以18：1-PA为底物时，MaPAP2.2也具有PAP活性。

图7表示在含有MaPAP2.2的粗酶液的反应液及对照中，对作为底物添加17：0-PA时的反应后的17：0-DG量进行研究的结果。图7所示的结果，该结果说明MaPAP2.2在以17：0-PA为底物时也具有PAP活性。

此外，从图5～图7的结果对比中，认为将18：2-PA转变为18：2-DG的活性与将18：1-PA转变为18：1-DG的活性为相同程度。另一方面，将17：0-PA转变为17：0-DG的活性可估算为将18：2-PA转变为18：2-DG的活性、将18：1-PA转变为18：1-DG的活性的1/5左右。此结论说明，MaPAP2.2的磷脂酸磷酸酶活性为，与含有碳原子数17的酰基的磷脂酸的底物特异性相比，与含有碳原子数18的酰基的磷脂酸的底物特异性高。

序列表自由内容

序列号6：引物PAP2.2-1f

序列号7：引物PAP2.2-4r

序列号8：引物Eco-PAP2-2-F

序列号9：引物Kpn-PAP2-2-R