CN101578372B - 具有新型脂肪酸组成的脂肪酸组合物 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供与以往脂肪酸组成不同的脂肪酸组合物。上述课题通过所述脂肪酸组合物解决，其中，脂肪酸组合物是培养通过含有包含本发明的序列号1的碱基序列或编码序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的核酸、或与其具有同等功能的突变体的重组载体转化的宿主而得到的脂肪酸组合物，其特征在于，在所述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)～v)：i)油酸含量，ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及iii)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率，iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率，v)n-6系脂肪酸含量中的至少1项以上均比培养用含有编码由序列号10组成的氨基酸序列的碱基序列的重组载体转化的宿主而得到的培养物高。

Description

具有新型脂肪酸组成的脂肪酸组合物

技术领域

本说明书基于2007年7月23日申请的日本专利申请第2007-190680号主张优先权。

本发明涉及脂肪酸组合物，其是培养通过含有包含本发明序列号1的碱基序列或编码序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的核酸、或与其具有同等功能的突变体的重组载体转化的宿主而得到的脂肪酸组合物，其特征在于，在所述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)～v)

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量中的至少1项以上均比培养未用所述重组载体转化的宿主而得到的培养物高。

背景技术

脂肪酸是构成磷脂、三酰基甘油等脂质的重要成分。已报道含有2个以上不饱和键的多不饱和脂肪酸(PUFA)：花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等具有种种生理活性(非专利文献1)。此多不饱和脂肪酸在各个领域的应用值得期待，为高效获得该脂肪酸，开发了培养各种微生物以获得多不饱和脂肪酸的方法，且还尝试了用植物生产多不饱和脂肪酸。在这种情况下，已知多不饱和脂肪酸，例如作为三酰基甘油等贮藏脂质的组成成分，在微生物的菌体内或植物种子中积累。

此三酰基甘油在生物体内以甘油3-磷酸为原始物质，从溶血磷脂酸开始经磷脂酸、二酰基甘油而生成。

如上所述，已知在溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid：以下在本说明书中，有时也记为“LPA”或“1-酰基甘油-3-磷酸”。)酰基化生成磷脂酸(phosphatidic acid：以下在本说明书中有时记为“PA”或”1，2-二酰基-sn-甘油3-磷酸”)的反应中，溶血磷脂酸酰基转移酶(以下有时记为“LPAAT”)会参与反应。

此LPAAT也作为1-酰基甘油3-磷酸酰基转移酶(E.C.2.3.1.51)而已知，到目前为止，已在一些生物中报道了该基因。作为来自大肠杆菌(Escherichiacoli)的LPAAT基因，plsC基因已被克隆(非专利文献2)，真菌中，来自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的SLC1基因已被克隆(非专利文献3)。且已从动物、植物中进行了克隆(专利文献1)。

作为脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)[以下有时也记为“高山被孢霉(M.alpina)”]的LPAAT基因，已报道了2种同源基因。(专利文献2及专利文献3)。

其中，专利文献2中记载了由来自高山被孢霉(M.alpina)、CDS的碱基数为1254个、用序列号16表示的碱基序列组成的基因LPAAT同源基因(LPAAT1)进行了克隆。且本文献中报道了，使此LPAAT1在酵母中与Δ6去饱和酶及Δ6链延长酶共表达，并在添加特定脂肪酸的培养基中培养时，与未表达LPAAT1的菌株相比，大量产生了比添加的脂肪酸链长更长的脂肪酸、不饱和度高的脂肪酸(专利文献2)。

专利文献1国际专利申请指南(pamphlet)WO2004/076617号

专利文献2美国专利申请公开第2006/174376号

专利文献3美国专利申请公开第2006/0094090号

非专利文献1Lipids，39，1147(2004)

非专利文献2Mol.Gen.Genet.，232，295-303，1992

非专利文献3J.B.C.，268，22156-22163，1993

非专利文献4Biochemical Society Transactions，28，707-709，2000

非专利文献5J.Bacteriology，180，1425-1430，1998

非专利文献6J.Bacteriology，173，2026-20341991

发明内容

但是，到目前为止已报道的LPAAT基因，即使导入宿主细胞使其表达，也由于其底物特异性，而使宿主产生的脂肪酸组合物受到局限。因此，希望鉴定出可产生与以往组成不同的脂肪酸组合物的基因。

本发明的目的在于，提供具有用于制造油脂、食品等时而有用的脂肪酸组成的脂肪酸组合物。

本发明者为解决上述课题进行了锐意研究。首先，分离来自脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的LPAAT1-long基因，导入酵母等具有高增殖力的宿主细胞以产生脂肪酸组合物，成功地生成了与公知的LPAAT不同的脂肪酸组合物，从而完成了本发明。及本发明如下所示。

(1)脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，培养通过含有如下核酸的重组载体转化的宿主，从所得到的培养物中提取脂肪酸组合物，该核酸包含以下(a)～(d)中任一项所述的LPAAT1-long碱基序列：

(a)由序列号1所组成的碱基序列；

(b)由序列号3所组成的碱基序列；

(c)由序列号4所组成的碱基序列；

(d)编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列；

该脂肪酸组合物的特征在于，以下i)～iv)的条件或以下v)的条件均比培养用含有编码由序列号10组成的氨基酸序列的LPAAT1-short碱基序列的重组载体转化的宿主而得到的培养物高，所述LPAAT1-short碱基序列选自由序列号8组成的碱基序列、由序列号9组成的碱基序列以及编码由序列号10组成的氨基酸序列的碱基序列：

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量。

(2)(1)中所述的制造方法，其中，n-6系脂肪酸选自亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸及花生四烯酸中的至少1种脂肪酸。

(3)包含以下(a)～(d)中任一项所述的碱基序列的核酸的用途，用于制造脂肪酸组合物：

(a)由序列号1组成的碱基序列；

(b)由序列号3组成的碱基序列；

(c)由序列号4组成的碱基序列；

(d)编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列；

并且，所述脂肪酸组合物的特征在于，以下i)～iv)的条件或以下v)的条件均比培养用含有LPAAT1-short碱基序列的重组载体转化的宿主而得到的培养物高，所述LPAAT1-short碱基序列选自由序列号8组成的碱基序列、由序列号9组成的碱基序列以及编码由序列号10组成的氨基酸序列的碱基序列：

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量。

本发明的LPAAT1-long与公知的LPAAT1的底物特异性不同，可在宿主中产生与公知LPAAT1表达宿主后所产生的脂肪酸组合物在组成上不同的脂肪酸组合物。由此可提供具有所期望特性、效果的脂质，所以，可有效适用于食品、化妆料、医药品、肥皂等。

本发明的LPAAT1-long表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率，比本发明的LPAAT1-long未表达的宿主细胞内的花生四烯酸含有率高，所以，可期待从该细胞的培养物中得到的脂肪酸组合物在营养学上具有更高的效果，因而优洗。

此外，因本发明的LPAAT可提高脂肪酸、储存脂质的生产能力，所以，可作为提高微生物、植物中多不饱和脂肪酸的生产能力的酶而优选。

附图说明

图1表示对本发明的LPAAT1-long及LPAAT1-short以及LPAAT1的CDS碱基序列的比较。

图2表示对本发明的LPAAT1-long及LPAAT1-short以及LPAAT1的CDS氨基酸序列的比较。

具体实施方式

本发明涉及新型脂肪酸组合物、该脂肪酸组合物的制造方法、含有该脂肪酸组合物的食品。

以下，详细说明本发明。

本发明是利用以产生上述新型脂肪酸组合物为特征的、来自被孢霉属(Mortierella)的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)基因，具体地说，利用发明者分离的序列号1所示的LPAAT1-long的核酸等。且溶血磷脂酸酰基转移酶是催化溶血磷脂酸酰化而生成磷脂酸的反应的酶。且本说明书中，“LPAAT1-long”“LPAAT1-short”，不仅代表菌株、代表基因、代表蛋白质，有时还代表将上述LPAAT1-long基因、LPAAT1-short基因插入表达载体，培养将该表达载体转化到适当宿主中的转化体而得到的菌体。

溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物

与本发明的LPAAT1-long相关的序列，可例举为表示LPAAT1-long的ORF区域的序列的序列号1、LPAAT1-long的氨基酸序列的序列号2、LPAAT1-long的cDNA碱基序列的序列号3、表示其CDS区域的序列的序列号4。其中，序列号1相当于序列号3的第115～1557位的碱基序列。

且除LPAAT1-long以外，本发明的发明者还分离了相当于LPAAT1-long的基因碱基序列全长的86.8％及氨基酸序列全长的86.7％的LPAAT1基因(以下有时也称为LPAAT1-short)。与LPAAT1-short有关的序列，可例举为表示LPAAT1-short的ORF区序列的序列号8、LPAAT1-short的氨基酸序列的序列号10、LPAAT1-short的cDNA碱基序列的序列号9。序列号9中，第36～1286位的碱基序列相当于序列号8所示的ORF。LPAAT1-long与LPAAT1-short的关系如以下表1所示。

表1

表1  LPAAT1同源物的关系

即本发明的LPAAT1-long的ORF碱基序列中，5’末端缺失的碱基序列相当于LPAAT1-short。详细地说，本发明的LPAAT1-long的ORF碱基序列(序列号1)的1443个碱基中，相当于全体的86.8％的第193～第1443位碱基区的碱基相当于LPAAT1-short的ORF碱基序列(序列号8)。也就是说，LPAAT1-long是与LPAAT1-short相比在5’区域长192个碱基的序列。且对于氨基酸序列，本发明的LPAAT1-long的氨基酸序列(序列号2)的481个残基中，相当于全体的86.7％的第65～481位区域的残基，相当于LPAAT1-short的氨基酸序列(序列号8)。也就是说，LPAAT1-long是与LPAAT1-short相比在N末端长64个氨基酸残基(序列号中的氨基酸残基1～64)的序列。

且作为来自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT，有上述专利文献2中公开的公知的LPAAT(以下为LPAAT1)。此LPAAT1的ORF碱基数为1251个碱基，与LPAAT1-short的ORF碱基数一致，ORF间碱基序列的同一性也高为89％，所以认为LPAAT1-short是与LPAAT1同种的等位基因。此LPAAT1-long、LPAAT1-short及LPAAT1的碱基序列的比对如图1所示，氨基酸序列的比对如图2所示(图1及图2)。

因此，发明者在探讨本发明的LPAAT1-long的活性时，作为比较例，将LPAAT1-short作为公知的LPAAT1的模型使用。具体地说，使LPAAT1-long及LPAAT1-short在酵母中表达，比较其脂肪酸组合物的脂肪酸组成。其结果，如以下详细说明，本发明的LPAAT1-long基因表达的宿主所产生的脂肪酸组合物的脂肪酸的组成，与LPAAT1-short表达的宿主所产生的脂肪酸组合物的脂肪酸的组成完全不同。也就是说，说明本发明的LPAAT1-long可产生与公知的LPAAT1所产生的脂肪酸组合物的脂肪酸组成完全不同的脂肪酸组合物。

具体地说，本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可为花生四烯酸含有率高。花生四烯酸是用化学式C₂₀H₃₂O₂表示、分子量为304.47的物质，是由含有4个双键的20个碳原子的碳链组成的羧酸(〔20:4(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。花生四烯酸作为动物细胞膜中重要的磷脂质(特别是磷脂酰乙醇胺·磷脂酰胆碱·磷脂酰肌醇)存在，大量存在于脑中。且花生四烯酸为通过花生四烯酸级联反应生成的前列腺素·血栓素·白三烯等一系列的类花生酸的起始物质，在细胞间的信号传递中作为第二信使也很重要。另一方面，花生四烯酸是动物以亚油酸为原料在体内合成的。但是，由于动物的种或年龄等不同、或者因此功能不充分而不能生产必需的量、或者完全没有生产功能，所以，必须从食物中摄取花生四烯酸，可以说花生四烯酸是必须脂肪酸。

本发明的脂肪酸组合物中的花生四烯酸含有率，例如可如下测定。即将本发明的LPAAT1-long的质粒，例如通过实施例8及9中所述的方法插入到pDuraSC、pDura5MCS等的载体中，转化到高山被孢霉(M.alpina)株，使得到的转化体表达，使用根据实施例10中所述的培养方法等得到的培养菌体，测定菌体内的脂肪酸组成、花生四烯酸含量等的方法。花生四烯酸含量等的分析方法，例如，是将所得到的培养菌体的脂肪酸通过盐酸甲醇法衍生为脂肪酸甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析的方法。由此表明，使本发明的LPAAT1-long转化到高山被孢霉(M.alpina)后，菌体内脂肪酸中的花生四烯酸含有率高。如此，因花生四烯酸含有率高的本发明的脂肪酸组合物可有助于高效摄取花生四烯酸，所以优选。

因此，本发明的LPAAT1-long具有与公知的LPAAT1完全不同的活性。之所以能得到此种新型活性，其根据之一可例举为本发明的LPAAT1-long与公知的LPAAT1的基因/蛋白质结构的不同。因此，具有与本发明的LPAAT1-long极为接近的碱基序列/氨基酸序列、且具有同样功能的突变体也包含于本发明的范围内。例如，包含以下内容：

i)与本发明的特定的LPAAT1-long碱基序列/氨基酸序列有90％左右(碱基数为144个左右，氨基酸残基数为48个左右；也包含这些碱基/残基发生缺失、取代或附加的突变体)同一性的范围内的碱基序列/氨基酸序列；及

ii)与本发明的LPAAT1-long的碱基序列/氨基酸序列在高严谨条件下杂交的碱基序列/氨基酸序列。

详细内容如以下“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”的项目中所记载。

编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)的核酸

本发明涉及具有新型脂肪酸组成的脂肪酸组合物、其制造方法等，该脂肪酸组合物为培养通过含有包含序列号1(LPAAT1-long)等的碱基序列的核酸的重组载体转化的宿主而得到。因此，首先对用于制造上述脂肪酸组合物的核酸加以说明。

如上所述，本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)中包含LPAAT1-long。与本发明的LPAAT1-long有关的序列在“溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物”的项目中已加以说明，可例举为表示LPAAT1-long的ORF区域序列的序列号1、表示LPAAT1-long的氨基酸序列的序列号2、表示LPAAT1-long的cDNA碱基序列的序列号3、表示其CDS区域的序列的序列号4。

本发明的核酸，除单链及双链的DNA外，还包含其RNA互补体，可来自天然，也可人工制备。DNA中，例如可例举为基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及这些的组合、DNA和RNA的杂交体，但不限于此。

本发明的核酸的优选方式，可例举为(a)序列号1所示的碱基序列，(b)，编码由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列等。

为获得上述碱基序列，也可从具有LPAAT活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中检索到编码与已知的具有LPAAT活性的蛋白质同一性高的蛋白质的碱基序列。具有LPAAT活性的生物，优选脂质生产菌，脂质生产菌可为高山被孢霉(M.alpina)，但不限于此。

进行EST分析时，首先构建cDNA文库。cDNA文库的构建方法，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.》[Cold Spring HarborPress (2001)]。且可使用市售的cDNA文库构建试剂盒。适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可例举为如下方法。即将脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)的适合的菌株接种于适合的培养基中，进行适当时间的预培养。适于此预培养的培养条件，例如、培养基组成可例举为1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0，培养时间为3天，培养温度为28℃的条件。而后，将预培养物用适合的条件进行本培养。适于本培养的培养基组成，例如可例举为1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H2O、pH6.0。适于本培养的培养条件，例如可例举为300rpm、1vvm、26℃下通气搅拌培养8天的条件。培养期间可添加适量的葡萄糖。本培养中适时采集培养物，从中回收菌体，制备总RNA。总RNA的制备中，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可从所得到的总RNA中使用市售的试剂盒纯化poly(A)⁺RNA。且还可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。而后，将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列，使用为可确定载体上插入部分的碱基序列而设计的引物来确定，可得到EST。例如，用ZAP-cDNA GigapackIII Gold CloningKit(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。

本发明还包括如下核酸，其与包含上述序列号1所示的碱基序列(有时记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2所示的氨基酸序列(有时记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能。“具有同等功能”，是指本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有LPAAT活性之意。此外，不仅具有此LPAAT活性，还包括具有如下活性的蛋白质(以下，有时也记为“具有可形成本发明的LPAAT脂肪酸组成活性的蛋白质”)，该活性为可形成在本发明的碱基序列编码的蛋白质、或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质表达的宿主的脂肪酸组成中，以下的

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量中的至少1项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比呈现高值的脂肪酸组成的活性。

具体地说，为包含编码具有如下活性的蛋白质的碱基序列的核酸，该活性为可形成以下数值的脂肪酸组成的活性：将上述本发明的碱基序列等插入表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)，用其以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15株(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)为宿主进行转化，将培养所得到的转化体后回收的菌体，用以下实施例6中所述的方法进行脂肪酸分析时，上述本发明的LPAAT的脂肪酸组成的数值具体为

i)油酸含量为47％以上；

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率为6.7以上，及/或

ii i)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率为10以上

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率为1.1以上。进一步优选，包含本发明的碱基序列等是编码具有LPAAT活性及可形成上述本发明的LPAAT脂肪酸组成的活性的蛋白质的碱基序列的核酸。

对于本发明的LPAAT1-long与LPAAT1-short，用实施例6中所述的方法进行脂肪酸分析时的结果，如以下表3所示，本发明的LPAAT1-long的油酸含量为54％左右，比为42％左右的LPAAT1-short高。此外，本发明的棕榈酸含量为7.6％左右，与对照等同，比为13.5％左右的LPAAT1-short低。且得到了如下结果，本发明的LPAAT1-long的油酸含量相对于棕榈酸含量的比率比LPAAT1-short高1.8倍～2.5倍，且本发明的LPAAT1-long的油酸含量相对于硬脂酸含量的比率比LPAAT1-short高1.5倍～1.8倍左右。

且在上述中，还包含具有如下活性的蛋白质(以下有时与上述同样记为“具有可形成本发明的LPAAT脂肪酸组成的活性的蛋白质”)，该活性为可形成在本发明的碱基序列编码的蛋白质、或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质表达的宿主的脂肪酸组成中，n-6系脂肪酸含量与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比呈现高值的脂肪酸组成的活性。n-6系脂肪酸，可例举为亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、7，10，13，16-二十二碳四烯酸及4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸，但不限于此。例如，为高山被孢霉(M.alpina)时，优选为亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸及花生四烯酸。

具体地说，为包含编码如下蛋白质的碱基序列的核酸，该蛋白质为：将上述本发明的碱基序列等插入表达载体pYE22m等，将其产物以为了能生产花生四烯酸而育种的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、被孢霉属(Mortierella)等可生产花生四烯酸的酵母、丝状菌等的真菌为宿主进行转化，将培养所得到的转化体然后再回收的菌体用以下实施例7～10中所述的方法进行脂肪酸分析时，上述本发明的LPAAT1-long的n-6系脂肪酸如以下表5所示为高含量的蛋白质。

使本发明的LPAAT1-long和LPAAT1-short在为了能生产花生四烯酸而育种的酵母中表达时，用实施例7中所述的方法进行脂肪酸分析的结果如以下表4所示。即本发明的LPAAT1-long的亚油酸含量比对照、LPAAT1-short高。且本发明的LPAAT1-long的γ-亚麻酸含量也比对照、LPAAT1-short高。并且本发明的LPAAT1-long的DGLA含量也比对照高，与LPAAT1-short为同等程度。而且，本发明的LPAAT1-long的花生四烯酸含量也比对照、LPAAT1-short高。

此外，使本发明的LPAAT1-long和LPAAT1-short在高山被孢霉(M.alpina)中表达时，用实施例8～10中所述的方法进行脂肪酸分析的结果如以下表5所示。即本发明的LPAAT1-long的花生四烯酸、DGLA的含量也比对照、LPAAT1-short高。

因此，本发明的LPAAT1-long如以下说明，可在宿主中产生与其他LPAAT表达的宿主所产生的脂肪酸组合物的组成完全不同的脂肪酸组合物，具有以往技术所不可预期的全新功能。

此种与本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举为包含以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列的核酸[以下，有时也记为“(具有同等功能)的本发明的突变体”]。且以下所例举的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”，是指上述的“LPAAT活性及/或可形成上述本发明的LPAAT的脂肪酸组成的活性”。

(a)碱基序列，其编码由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明的核酸中所包含的碱基序列，是包含编码由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

具体地说，如“溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物”的项目中所说明的，

(i)序列号2所示的氨基酸序列中，1个或多个[优选1个或多个(例如1～48个、1～32个、1～24个、1～20个、1～16个、1～12个、1～10个、1～8个、进一步优选1～4个)]氨基酸发生缺失的氨基酸序列，

(ii)序列号2所示的氨基酸序列中，1个或多个[优选1个或数个(例如1～48个、1～32个、1～24个、1～20个、1～16个、1～12个、1～10个、1～8个、进一步优选1～4个)]氨基酸用其他氨基酸取代后的氨基酸序列，

(iii)序列号2所示的氨基酸序列中，附加了1个或多个[优选1个或数个(例如1～48个、1～32个、1～24个、1～20个、1～16个、1～12个、1～10个、1～8个、进一步优选1～4个)]其他氨基酸后的氨基酸序列，或

(iv)编码由组合上述(i)～(iii)的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

上述中，取代优选为保守性取代。保守性取代，是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原本序列的结构有关的特征，可为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原本序列中存在的螺旋结构，或不破坏赋予原本序列特征的其他种类的二级结构，可为任何取代。

保守性取代，一般可用生物学体系合成、化学肽合成导入，但优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可包含非天然的氨基酸残基，也可包含肽模仿物、氨基酸序列中未被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。

以下，将氨基酸残基按可取代的残基分类举例，但可取代的氨基酸残基不限于以下记载的残基：

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、o-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸及环己基丙氨酸；

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸；

C组：天冬酰胺及谷氨酰胺；

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸及2，3-二氨基丙酸；

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸；

F组：丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸；

G组：苯丙氨酸及酪氨酸。

为非保守性取代时，上述种类中的某一种成分可与其他种类的成分互换，此时，为保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)[Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)]。

此外，为非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。

本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩写，可根据IUPAC-IUB Commissionon Biochemical Nomenclature、或例如Immunology--A Synthesis[第2版，E.S.Golub及D.R.Gren监修，Sinauer Associates，Sunderland，Massachusetts (1991)]等中记载的本领域惯用的缩写。此外，氨基酸有光学异构体时，在无特别说明的情况下，均表示L体。

D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等的非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非惯用氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。

且本说明书中使用的蛋白质的标记法，根据标准用法及本领域中常用的标记法，左方向为氨基末端方向，右方向为羧基末端方向。

同样，在一般情况下不特别提及时，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方向为5’方向。

只要是本领域技术人员，使用本领域中公知的技术，即可设计、制备本说明书中所述的蛋白质的适当的突变体。例如，通过将对本发明蛋白质的生物学活性并不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而使其结构改变的蛋白质分子中适当的区域。且也可鉴定在类似的蛋白质间保守的分子的残基及区域。并且，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏其生物学活性且不给予蛋白质的多肽结构以不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。特别是本发明中，在本发明的LPAAT氨基酸序列中的第208～213残基中存在保守基序“HXXXXD(HX₄D)”。本基序是甘油磷脂质酰基转移酶(Glycerolipid acyltransferase)中必须的基序(J.Bacteriology，180，1425-1430，1998)，对于本发明的LPAAT也是重要的基序。因此，本发明的突变体只要保留上述保守基序，且不损伤本发明的上述活性，可以是任何突变体。且在上述保守基序中，X可以是任何氨基酸残基。

只要是本领域技术人员，均可鉴定对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽类似的肽的残基，比较此2种肽的氨基酸残基，预测出与本发明蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基，即可进行所谓的结构-功能研究。并且，通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，可选择保持了本发明蛋白质的生物学活性的突变体。且如果是本领域技术人员，即可对本蛋白质突变体的三级结构及氨基酸序列进行分析。进而从所得到的分析结果来看，也可预测与蛋白质的三级结构有关的氨基酸残基的比对。预测为蛋白质表面上存在的氨基酸残基，具有参与和其它分子的重要的相互作用的可能性，因此，如果是本领域技术人员，即可基于上述分析结果，制备不使预测为在此种蛋白质表面上存在的氨基酸残基发生改变的突变体。进而如果是本领域技术人员，即可制备构成本发明蛋白质的各个氨基酸残基中，只有一个氨基酸残基发生取代的突变体。通过公知的检测方法筛选此种突变体，即可各个收集突变体的信息。由此，通过对某种特定的氨基酸残基发生取代的突变体的生物学活性与本发明蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现此种生物学活性时、或产生抑制本蛋白质生物学活性的不适当活性时进行比较，可评价构成本发明蛋白质的种种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，可根据此种从日常实验中收集的信息，单独或与其他突变组合，从而容易地分析作为本发明蛋白质的突变体的不期望的氨基酸取代。

如上所述，由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，可通过《Molecular Cloning，ALaboratory Manual3rd ed.》[Cold Spring Harbor Press(2001)]、《CurrentProtocols in Molecular Biology》[John Wiley&Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6]等中所述的定点诱变法制备。发生了此种氨基酸的缺失、取代或附加等突变的突变体的制备，例如可通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知手法，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒、例如QuikChange^TMSite-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailor^TMSite-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRaSite-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-Super Express Km等：TAKARA BIO公司制)等进行。

且作为在蛋白质的氨基酸序列中，既保持了其活性同时又引入1个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，可例举为除上述定点诱变以外，还可为用诱变剂处理基因的方法、及使基因选择性断裂将选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。

本发明进一步优选由序列号2中1～10个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明蛋白质中的氨基酸突变或修饰的数量、或突变或修饰的位点，只要保持LPAAT活性、或本发明的可形成LPAAT的脂肪酸组成的活性，无限制。

本发明的LPAAT活性、或本发明的可形成LPAAT的脂肪酸组成的活性，可使用公知的方法测定。例如，可参照以下的文献：J.B.C.，265，17215-17221，1990。

例如，本发明的“LPAAT活性”可如下测定。从使本发明的LPAAT表达的酵母中，通过J.Bacteriology，173，2026-2034(1991)中所述的方法等制备微粒体组分。而后可在反应液的0.44mM LPA、0.36mM酰基-CoA、0.5mM DTT、1mg/ml BSA、2mM MgCl₂、50mM Tris-HCl(pH7.5)中添加上述微粒体组分，使其在28℃下反应适当的时间，添加氯仿∶甲醇使反应停止后，进行脂质的提取，将所得到的脂质通过薄层色谱法等分离，从而对生成的PA量进行定量。

此外，本发明的“可形成LPAAT的脂肪酸组成的活性”例如可如下测定。在通过本发明的脂肪酸组合物的制造方法得到的冷冻干燥的菌体中，添加以适当比率调整的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当的时间。进一步通过离心分离分离菌体，回收溶剂，多次重复此操作。然后使用适当的方法使脂质干固后，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。适量分取此样品，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析。

(b)碱基序列，其与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明的核酸中所含有的碱基序列，如“溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物”的项目中所说明，包含与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。序列号1及有关本发明的上述活性如上所述。

上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法，使用适当的片段制备探针，使用此探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。

对于杂交法的详细步骤，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.》[Cold Spring Harbor Press(2001)；特别是Section6-7]、《CurrentProtocols in Molecular Biology》[John Wiley&Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4]、《DNA Cloning1：Core Techniques，A Practical Approach2nd ed.》[Oxford University(1995)；杂交条件特别参照Section2.10]等。

杂交条件的强度，主要取决于杂交条件、更优选杂交条件及洗涤条件。高严谨条件(高度严谨的条件)，例如，杂交条件可例举为0.1×SSC～2×SSC、55℃～65℃的条件，更优选0.1×SSC～1×SSC、60℃～65℃的条件，最优选0.2×SSC、63℃的条件。杂交溶液中，例如含有约50％甲酰胺时，采用比上述温度低5～15℃的温度。洗涤条件，可为0.2×SSC～2×SSC、50℃～68℃，更优选0.2×SSC、60～65℃。杂交及洗涤时，一般可加入0.05％～0.2％，优选约0.1％SDS。

本发明中所含有的碱基序列，优选为与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在1×SSC、60℃的条件下杂交，且编码具有LPAAT活性的蛋白质的碱基序列。

此外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体地说，可例举为使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)、ECL directlabeling & detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。

(c)碱基序列，其由与序列号1所组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明的核酸中所含有的碱基序列，如“溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物”的项目所说明，包含由与序列号1中所示的核酸序列有至少90％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明中为包含具有与序列号1所示的核酸序列有至少90％以上、优选93％以上、进一步优选95％(例如95％、更优选96％、进一步为97％、98％或99％)以上同一性的碱基序列的核酸，且可为编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

2个核酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来确定，但优选使用计算机程序、通过比较2组核酸的序列信息来确定。序列比较计算机程序，例如可利用美国国立医学图书馆的网站：

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl s.html的BLASTN程序(Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)：2.2.7版或WU-BLAST2.0算法等。关于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站：http://blast.wustl.edu中所记载的内容。

(d)碱基序列，其编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明的核酸中所含有的碱基序列，如“溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物”的项目中所说明，包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明具体地说，可例举编码与序列号2所示的氨基酸序列有至少90％以上、优选93％以上、进一步优选95％(例如95％、更优选96％、进一步为97％、98％或99％)以上同一性的氨基酸序列等，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中所含有的碱基序列，优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

2段氨基酸序列的同一性的百分率，可通过视觉检查、数学计算确定。此外，也可使用计算机程序来确定同一性百分率。此种计算机程序，例如可例举为BLAST、FASTA[Altschul等、J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)]、及ClustalW等。特别是通过BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，如Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)中所记载，可从美国生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD20894；Altschul等)。且可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DINASIS Pro(日立软件)、Vector NTI(Infomax)等的程序来确定。

使多个氨基酸序列并列的特定的比对图，也可显示序列中特定的短的区域的匹配，所以，即使使用的序列的全长序列间无显著相关时，也可在此种区域中检测出特定的序列同一性非常高的区域。且BLAST算法可使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数可使用如下所示的内容：(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段[由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers andChemistry，1993)确定；也希望参照Wootton及Federhen，1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis of compositionally biased regions insequence databases)Methods Enzymol.，266：544-71]、或由短周期性的内部重复组成的片段[由Claveri e及States(Computers and Chemi stry，1993)的XNU程序确定)]用于屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序列的一致性的统计学上的显著性阈值、或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然发现的一致性的期望概率；源于某种一致性的统计学的显著差异比E-score阈值大时，不报告此一致性。

(e)碱基序列，其与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。

本发明的核酸中所含有的碱基序列，如“溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAAT)1的同源物”的项目中所说明，包含与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交条件如上所述。本发明的核酸中所含有的碱基序列，可例举为与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。

本发明的核酸中还包含如下核酸，其包含由序列号1所组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。具体地说，也可使用包含如下碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸：

(i)序列号1所示的碱基序列中1个或多个[优选1个或多个(例如1～144个、1～96个、1～72个、1～48个、1～30个、1～24个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]碱基发生缺失的碱基序列，

(ii)序列号1所示的碱基序列中1个或多个[优选1个或多个(例如1～144个、1～96个、1～72个、1～48个、1～30个、1～24个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]碱基被其他碱基取代的碱基序列，

(iii)序列号1所示的碱基序列中附加1个或多个[优选1个或多个(例如1～144个、1～96个、1～72个、1～48个、1～30个、1～24个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]其他碱基的碱基序列，或

(iv)组合了上述(i)～(iii)的碱基序列。

本发明进一步优选由序列号1中1～数十个、更优选1～10个的碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列组成，且是编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸。

本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶蛋白质

本发明的LPAAT1-long，包含由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质及与上述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可来自天然，也可人工制备。对于由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，指如上述“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”的项目中说明的具有“本发明的上述活性”的蛋白质。

本发明中，与由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可为以下(a)～(e)中任一项所述的蛋白质且具有本发明的上述活性的蛋白质。即(a)蛋白质，其由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性；

(b)蛋白质，其由如下碱基序列编码，该碱基序列与由序列号1所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质；

(c)蛋白质，其由如下碱基序列编码，该碱基序列由与序列号1所组成的碱基序列有90％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质；

(d)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成、且具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性；及

(e)蛋白质，其由如下碱基序列编码，该碱基序列与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在高严谨条件下杂交，且编码具有溶血磷脂酸酰基转移酶活性的蛋白质。

上述中，对于序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列、或与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，如上述“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”的项目中的说明。且上述“具有本发明的上述活性的蛋白质”，还包括由包含序列号1的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、或序列号2所示的氨基酸序列中通过1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等的多种修饰而产生突变的蛋白质、或氨基酸侧链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且是具有LPAAT活性的蛋白质及/或具有可形成本发明的LPAAT脂肪酸组成活性的蛋白质。且与由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，更优选为与由序列号2所组成的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且是具有本发明的上述活性的蛋白质。

另外，本发明的LPAAT1-long也可人工制备，此时可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用AdvancedChem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。

LPAAT的核酸的克隆

本发明的具有LPAAT1-long的特定序列的核酸及其突变体，例如可通过使用适合的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。且可使用适合的引物通过PCR反应扩增，通过与适合的载体连接来进行克隆。并且也可亚克隆到其他载体中。以下，以使用LPAAT1-long的核酸为例进行说明。

例如也可使用pBlue-Script ^TMSK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM：Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.１-TOPO(Invitrogene)等市售的质粒载体。且用PCR反应扩增时，引物可使用上述序列号1所示的碱基序列的任何部分，例如对于序列号1，可使用

上游侧引物，引物955-1：GGACGTGTCAAGGAAAAGGA(序列号6)、

下游侧引物，引物955-2：TCCTTCAGATGAGCCTCCTG(序列号7)等。

且在从高山被孢霉(M.alpina)菌体中制备的cDNA中，使上述引物及耐热性DNA聚合酶等起作用而进行PCR反应。上述方法根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual3rd ed.》[Cold Spring Harbor Press(2001)]等，只要是本领域技术人员均可容易地进行，作为本发明的PCR反应条件，例如可例举为以下条件：

变性温度：90～95℃

退火温度：40～60℃

延伸温度：60～75℃

循环数：10次以上

所得到的PCR产物的纯化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick PCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GEHealthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，可进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶切出，通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick Gelextraction Kits(QIAGEN)、Freeze&Squeeze法等纯化。

克隆后的核酸的碱基序列，可使用碱基序列测序仪来确定。

LPAAT表达用载体构建及转化体的制备

含有编码本发明的LPAAT1-long的核酸及其突变体的重组载体及通过上述重组载体转化的转化体，可如下获得。以下以使用LPAAT1-long的核酸为例进行说明。即将具有编码本发明的LPAAT1-long的核酸的质粒用限制性内切酶酶切。使用的限制性内切酶，例如可例举为EcoRI、KpnI、BamHI及SalI等，但不限于此。且也可通过T4聚合酶处理将末端平滑化。将酶切后的碱基序列片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将此碱基序列片段通过使用公知的方法整合进表达用载体，可得到LPAAT1-long表达用载体。将此表达载体导入宿主制备转化体，用于目的蛋白质的表达。

此时，表达载体及宿主只要可表达目的蛋白质，无特别限定，例如宿主可例举真菌、细菌、植物、动物或它们的细胞等。真菌，可例举为脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)等的丝状菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母等。且细菌，可例举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。而植物可例举菜籽、大豆、棉花、红花、亚麻等的油料植物。

脂质生产菌例如可使用MYCOTAXON，Vol.XLIV，No.2，pp.257-265(1992)中记载的菌株，具体地说，可例举为属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如长孢被孢霉(Mortierella elongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierellaexigua)IFO8571、Mortierella hygrophila IFO5941、高山被孢霉(Mortierellaalpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物，或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、Mortiere lla nana IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等的属于Micromucor亚属(subgenus Micromucor)的微生物等。尤其优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。

以真菌类为宿主使用时，优选本发明的核酸在宿主中可自主复制、或者是可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选是含有启动子、终止子的组成。使用高山被孢霉(M.alpina)为宿主时，表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDura5等。启动子，只要可在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1基因启动子、GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)基因启动子、TEF翻译延伸因子(Translation elongation factor)基因启动子的来自高山被孢霉(M.alpina)的启动子。

向高山被孢霉(M.alpina)等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可例举为电穿孔法、原生质球法、基因枪轰击法及向核内DNA直接显微注射法等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养素的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化株。此外，转化使用抗药性标记基因时，在包含其药剂的选择培养基上培养，可得到具有抗药性的细胞菌落。

以酵母为宿主使用时，作为表达载体，例如可例举pYE22m等。且也可使用pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。另外，适用于本发明的宿主可例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15株(trp1，MATα)等，但不限于此。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gal1启动子、gal10启动子等来自酵母等的启动子。

向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举醋酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或多数)的包裹、及向核内直接显微注射DNA等。

以大肠杆菌等的细菌为宿主使用时，作为表达载体，例如可例举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。

本发明的脂肪酸组合物

本发明提供培养通过含有上述LPAAT1-long等的重组载体转化的宿主而得到的脂肪酸组合物。具体地说，本发明的脂肪酸组合物，是培养通过含有编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸(即，包含序列号1的碱基序列或编码序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的核酸、或与其具有同等功能的突变体)的重组载体转化的宿主而得到的脂肪酸组合物，其特征在于，在所述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)～v)

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

ii i)油酸含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量中的至少1项以上比培养未用本发明的重组载体转化的宿主而得到的培养物高。在此，“未用本发明的重组载体转化的宿主”，是指例如用未整合本说明书中的“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”的项目中所述的核酸的载体(空载体)转化的宿主。

本发明中所含有的脂肪酸，可以是游离脂肪酸，也可以是甘油三酯、磷脂质等。

本发明脂肪酸组合物中含有的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可例举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻烯酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1(9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18:1(11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、α-亚麻酸(9，12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亚麻油酸(Stearidonic acid)(6，9，12，15-十八碳四烯酸)(18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2(8，11))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，11))、二高γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20:4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(5，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(5，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山萮酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(4，7，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木质素酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四碳单烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值。

获得此种本发明的脂肪酸组合物，也就是说，本发明的LPAAT1-long表达的确认，可使用公知的一般的方法进行。例如，在酵母中使LPAAT1-long表达时，可确认脂肪酸组成的变化。即在通过上述本发明的脂肪酸组合物的制造方法获得的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当时间。进一步通过离心分离分离菌体，回收溶剂，重复数次此操作。然后使用适当的方法使脂质干固后，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。适量分取此样品，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析。

其结果，得到具有上述脂肪酸组成的脂肪酸组合物时，即可判断为得到了本发明的脂肪酸组合物。且本发明的LPAAT1-long如上所述，与公知LPAAT1的脂肪酸组合物的脂肪酸组成不同。即对本发明的LPAAT1-long与作为公知LPAAT1的模型使用的LPAAT1-short进行脂肪酸分析时，本发明的LPAAT1-long的油酸含量为54％左右，比为42％左右的LPAAT1-short高，本发明LPAAT1-long的油酸含量相对于棕榈酸含量的比率也比LPAAT1-short高1.8倍～2.5倍，本发明LPAAT1-long的硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率也比LPAAT1-short高1.8倍～2.3倍左右。此外，同样对于n-6系脂肪酸，LPAAT1-long与LPAAT1-short相比为高含量，具体地说，LPAAT1-long与LPAAT1-short相比，亚油酸含量、γ-亚麻酸含量及花生四烯酸含量均高。

由此可表明，本发明的LPAAT1-long与公知LPAAT的底物特异性不同。

且本发明还提供如下脂肪酸组合物，其为培养通过含有以下核酸或与其具有同等功能的突变体的重组载体转化的宿主，该核酸为上述“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”的项目中所述的、包含本发明序列号1的碱基序列、或编码序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的核酸，所得到的培养物与培养未用上述重组载体转化的宿主而得到的培养物相比，为长链的脂肪酸的含有比率、n-6系脂肪酸含量均高的脂肪酸组合物。长链，是指构成脂肪酸的碳数的长度长。例如，与碳数为16的棕榈酸、棕榈油酸相比，碳数为18的硬脂酸、油酸为长链。对于n-6系脂肪酸，如上述“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”中的说明。本发明的脂肪酸组合物，与培养未用含有编码LPAAT1-long的重组载体转化的宿主而得到的培养物相比，油酸含量、油酸含量相对于棕榈酸含量的比率均高，可以说是长链脂肪酸的含有比率高的脂肪酸组合物或n-6系脂肪酸含量高的脂肪酸组合物。而且，也可进一步通过制造本发明脂肪酸组合物的方法中选择的宿主，制造为长链的脂肪酸的含有比率高的脂肪酸组合物、n-6系脂肪酸含量高的脂肪酸组合物。此种宿主，可例举真菌、植物、动物或它们的细胞等。作为真菌，可例举为脂质生产菌的高山被孢霉(M.alpina)等的丝状菌、酿造酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母等。进而作为植物，可例举油菜子、大豆、棉花、红花、亚麻等油料植物。此时，与培养未用含有本发明核酸的重组载体转化的宿主而得到的培养物中的脂肪酸相比含有率高的长链脂肪酸，可例举油酸、亚油酸、γ-亚麻酸、DGLA、α-亚麻酸、十八碳四烯酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳五烯酸、二十二碳六烯酸，但不限于此。n-6系脂肪酸，可例举亚油酸、γ-亚麻酸、DGLA及花生四烯酸，但不限于此。因此种含有链长更长的脂肪酸的比率高的脂肪酸组合物，非常适合用于营养补充食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，所以优选。

本发明的脂肪酸组合物的制造方法

本发明还提供制造上述脂肪酸组合物的方法。本发明的制造方法以利用上述LPAAT1-long为特征。具体地说，涉及该脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，培养通过含有包含本发明的序列号1的碱基序列或编码序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质的碱基序列的核酸、或与其具有同等功能的突变体的重组载体转化的宿主，从所得到的培养物中提取脂肪酸组合物，该脂肪酸组合物的特征在于，以下i)～v)

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量。中的至少1项以上均比培养未用上述重组载体转化的宿主而得到的培养物高。●用于使LPAAT1-long表达的生物的培养的培养基，只要是具有适合的pH及渗透压，含有各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等的生物材料的培养液(培养基)，可使用任何培养液。例如，转化酵母使LPAAT1-long表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但不限于此。具体的培养基的组成，以SC-Trp培养基为例(每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g)。

培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于使生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的条件，具体地说，可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(1段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即2段培养或3段培养，但进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。

以下，作为本发明的脂肪酸组合物的具体制造方法，以使用酵母作为宿主进行2段培养为例进行说明。即：作为预培养，将上述获得的菌落例如接种到上述SC-Trp培养基等中，在30℃下振荡培养2天。而后，作为本培养，在YPD5(2％酵母膏、1％多聚蛋白胨、5％葡萄糖)培养基10ml内添加预培养液500μl，在30℃下振荡培养2天。

本发明的核酸的使用

本发明还进一步提供LPAAT1-long用于制造上述本发明的脂肪酸组合物的使用。

具体地说，提供用于制造本发明的脂肪酸组合物的、编码本发明的LPAAT的核酸的使用。

使用上述核酸时，不只用于制造本发明的脂肪酸组合物，还可制造以下“含有本发明脂肪酸组合物的食品”的项目中说明的、实现预定目的、含有该脂肪酸组合物的食品等，所以优选。

含有本发明的脂肪酸组合物的食品等

本发明还进一步提供含有上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物，根据通常方法，例如可用于含有油脂的食品、工业原料[化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料]的制造等用途中。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液状、糊状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可例举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半消化状态营养食品、以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。

进而，作为本发明的食品例，可例举营养补充食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体及液体以及这些的混合物且可摄取食用的食物的总称。

营养补充食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指用于保健的或对健康有益的食品，包括营养补充食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充可发挥身体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途的食品含义相同。幼儿用食品是指供给约6岁以下儿童的食品。老人用食品是指与未加处理的食品相比，处理成易消化及吸收的食品。婴儿用配方乳是指供给约1岁以下儿童的配方乳。早产儿用配方乳是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方乳。

作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)；中华料理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、沙拉酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。

使用本发明涉及的核酸或蛋白质的菌株的评价·选择方法

本发明还提供使用本发明涉及的核酸或蛋白质进行评价、选择脂质生产菌的方法。具体如下所示。

(1)评价方法

作为本发明的一个实施方式，可例举使用编码本发明的LPAAT1-long的核酸或LPAAT1-long蛋白质，进行脂质生产菌评价的方法。本发明的上述评价方法，首先可例举使用基于本发明的碱基序列设计的引物或探针，对被测菌株脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。此种评价方法的通常方法为公知，例如在国际专利申请指南WO01/040514号、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。

首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等任何公知的方法[例如参照Methods in Yeast Genetics，Cold Spring HarborLaboratory Press，p130(1990)]。

基于本发明的碱基序列、优选基于序列号1设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明碱基序列的任意部分，且其设计可使用公知方法进行。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15～25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300～2000碱基为宜。

使用上述制备的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明碱基序列的特异性序列。本发明碱基序列的特异性序列的检测可采用公知方法进行。例如，将含有本发明碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸、或含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可测定扩增产物的有无、扩增产物的分子量大小等。

适合本发明方法的PCR法的反应条件，无特别限定，例如可例举以下条件，

变性温度：90～95℃

退火温度：40～60℃

延伸温度：60～75℃

循环数：10次以上

等条件。将获得的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明碱基序列的特异性区域的核酸分子的大小，可预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。而且通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，还可进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。另外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。

作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号1等本发明的碱基序列编码的LPAAT1-long的表达量，可评价被测菌株的本发明的上述活性。且LPAAT1-long的表达量，可通过在适当条件下培养被测菌株，对LPAAT1-long的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量，可使用公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons 1994-2003)。此外，作为上述活性的评价方法，也可例举测定本发明LPAAT1-long产生的脂肪酸组合物的组成的方法。脂肪酸组合物的组成的测定方法如上所述。

(2)选择方法

作为本发明的其他实施方式，可例举使用编码本发明的LPAAT1-long的核酸或LPAAT1-long蛋白质进行脂质生产菌选择的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号1等本发明的碱基序列编码的LPAAT1-long的表达量，选择目的表达量的菌株，可选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可选择出所期望的菌株。具体地说，例如可在适当的条件下培养标准菌株和被测菌株，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比被测菌株为高表达、或低表达的被测菌株，来选择具有期望活性的菌株。对于所期望的活性，如上所述，可例举测定LPAAT1-long的表达量及LPAAT1-long产生的脂肪酸组合物的组成的方法。

且作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可选择出具有期望活性的被测菌株。对于所期望的活性，如上所述，可例举测定LPAAT1-long的表达量及LPAAT1-long产生的脂肪酸组合物的组成的方法。

作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸表达受到抑制的菌株、进行诱变处理的菌株、自发突变的菌株等，但并不限于此。且本发明的LPAAT1-long活性及可形成LPAAT1-long的脂肪酸组合物的活性，例如可通过本说明书中的“编码本发明的溶血磷脂酸酰基转移酶的核酸”、“本发明的脂肪酸组合物”项目中记载的方法进行测定。诱变处理，例如可例举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(日语原名：大嶋泰治编著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一)。但不限于此。

此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体地说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。

实施例

以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。

实施例1

(1)EST分析

将高山被孢霉(M.alpina)1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中，在28℃预培养3天。在10L培养槽(Able Co.，东京)中加入5L培养基[1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H₂O、pH6.0]，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。在培养的第1、2、及3天分别添加相当于2％、2％、及1.5％的葡萄糖。在培养的第1、2、3、6、及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/氯化铯法制备总RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)，从总RNA中纯化poly(a)⁺RNA。使用ZAP-cDNA GigapackIIIGold Cloning Kit(STRATAGENE)，构建各阶段的cDNA文库，进行cDNA的5’端一步法测序分析(8000克隆×5步)。将获得的序列进行聚类。其结果，获得约5000序列。

(2)LPAAT基因同源基因的检索

将通过EST分析获得的碱基序列，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列使用同源性检索程序BLASTX进行检索，提取出LPAAT基因的同源基因，发现了LPAAT同源基因的序列(序列号5)。序列号5与来自粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)的1-酰基-sn-甘油3-磷酸酰基转移酶样推定蛋白质(GB accessionNo.EAA28956)的同一性最高。

将上述得到的序列与专利文献2的说明书中所记载的高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT同源基因(LPAAT1)的序列进行比较时，发现序列号5为LPAAT1的同种等位基因的部分序列。

对于上述的序列，来源文库和其EST分析如表2所示，且表2中还表示了是来自培养第几天所得到的cDNA文库的克隆。

表2

实施例2

(1)LPAAT同源物的克隆

因序列号5中不存在被认为是编码LPAAT同源物的CDS，所以，为了克隆编码这些基因全长的cDNA，基于各自的序列，制备如下引物：

基于序列号5设计的引物：

引物955-1：GGACGTGTCAAGGAAAAGGA    (序列号6)

引物955-2：TCCTTCAGATGAGCCTCCTG    (序列号7)

使用这些引物，以包含构成序列号5的EST的cDNA文库为模板，使用ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR反应。将所得到的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN CORPORATION)进行TA-克隆，以确定插入部分的碱基序列。

其结果，证实包含序列号5的第20位～518位的DNA片段进行了克隆，将此质粒作为pCR-955-P。而后，以此质粒为模板，使用上述引物进行PCR反应。反应中虽然使用了ExTaq(TaKaRa Bio)，但用PCR标记用混合物(RocheDiagnostics公司)代替附带的dNTP混合物，将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记，制备用于筛选cDNA文库的探针。使用此探针，对通过EST分析得到的构成上述序列的EST的cDNA文库进行筛选。

杂交条件如下所示。

缓冲液：5×SSC、1％SDS、50mMTris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺；

温度：42℃(一夜)；

洗涤条件：在0.2×SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)，20分钟×3次；

检测，使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行。从经过筛选获得的噬菌体克隆中，通过体内切割，切出质粒，获得质粒DNA。

筛选含有序列号5的cDNA、所得到的插入片段最长的克隆的插入片段的碱基序列如序列号3所示。序列号3中，包含由第116位～第1557位的1443bp组成的编码区域，所以认为得到了编码LPAAT同源物全长的序列。由此基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列如序列号2所示。

筛选含有序列号5的cDNA，获得比上述序列号3短的插入片段的克隆。所得到的克隆的插入片段的碱基序列如序列号9所示。序列号9中，含有由第36位～第1286位的1251bp组成的ORF，并可知此序列与上述序列号1所示的碱基序列中，5’末端的第193～1443碱基的序列同一。也就是说，序列号9所示的碱基序列，与序列号1所示的碱基序列相比，是5’区短192个碱基的碱基序列。由此基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列如序列号10所示。

将含有序列号3的质粒作为pB-LPAAT1-long，含有序列号9的质粒作为pB-LPAAT1-short。且将序列号3所涉及的基因作为LPAAT1-long基因，将序列号9所涉及的基因作为LPAAT1-short基因。

(2)序列分析

将上述获得的来自高山被孢霉(M.alpina)的LPAAT同源物的cDNA序列，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列，使用BLASTX进行同源性分析。其结果，相对于各序列E-value最低，即同一性高的氨基酸序列如下所示。将各序列的ORF和同一性最高的序列相关的碱基序列的同一性、及氨基酸序列的同一性用clustalW求出，以下一同记载。

序列号3，仅比较相当于来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶样推定蛋白质(GB accessionNo.EAA60126)部分时，碱基序列为51％、氨基酸序列为32.1％。

序列号9，仅比较相当于来自构巢曲霉(Aspergillus nidulans)的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶样推定蛋白质(GB accessionNo.EAA60126)部分时，碱基序列为51％、氨基酸序列为32.1％。

此外，对于序列号3和序列号9，用各个来自高山被孢霉(M.alpina)的已知LPAAT同源基因的LPAAT1基因(专利文献2)及其编码的推定氨基酸序列进行比较。将上述文献中公开的序列和从高山被孢霉(M.alpina)1S-4株得到的序列在各自相当的区域比较时，确认出LPAAT1-long及LPAAT1-short均具有碱基序列为89％、氨基酸序列为91％的同一性。

实施例3

酵母表达载体的构建

为使LPAAT1-long、LPAAT1-short在酵母中表达，如下构建酵母表达用载体。

将质粒pB-LPAAT１-long用限制性内切酶EcoRI和KpnI酶切后所得到的约1.7kb的DNA片段插入酵母用表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)的EcoRI-KpnI位点，构建质粒pYE-MALPAA1-long。

为使LPAAT1-short在酵母中表达，如下构建酵母表达载体。即以质粒pB-LPAAT1-short为模板，使用以下的引物LPAAT1-6F(序列号11)和LPAAT1-R1(序列号12)，通过ExTaq(TAKARA BIO)进行PCR反应。

LPAAT1-6F：TCTGAGATGGATGAATCCACCACCACCAC    (序列号11)

LPAAT1-R1：GTCGACTCAACCAGACGATACTTGCTGCAGAG    (序列号12)

对于获得的DNA片段，使用TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN)，进行TA-克隆，确认插入部分的碱基序列，将具有正确的碱基序列的质粒作为pCR-LPAAT1-short。将该质粒用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切后获得的约1.3kb的DNA片段，插入酵母表达用载体pYE22m的EcoRI-SalI位点，构建质粒pYE-MALPAAT1-short。

实施例4

酵母的转化

使用质粒pYE22m、pYE-MALPAA1-long或pYE-MALPAAT1-short，通过醋酸锂法转化到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15株(trp1，MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)中。转化株选择在SC-Trp[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast ni trogen base w/o aminoacids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。

实施例5

酵母的培养

选择使用各个载体的转化株中的任意2株(c-1株、c-2株、LPAAT1-long-1株、LPAAT1-long-2株、LPAAT1-short-1株、LPAAT1-short-2株)，用以下条件培养。

即作为预培养，从平板上取1白金耳酵母接种到SC-Trp培养基10ml中，在30℃下振荡培养2天。本培养是在YPD5(酵母膏2％、多聚蛋白胨1％、葡萄糖5％)培养基10m1中添加预培养液500μl，30℃下振荡培养2天。

实施例6

酵母的脂肪酸分析

通过离心分离酵母培养液，回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，再通过离心分离回收菌体，进行冷冻干燥。在冷冻干燥菌体中添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，剧烈搅拌后，70℃下处理1小时。通过离心分离分离菌体，回收溶剂。在残留的菌体中再次添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，同样回收溶剂。在离心浓缩仪中使脂质干燥固化后，添加2ml氯仿溶解脂质。从该试样中分取200ul，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。

其结果如表3所示。

表3

表3  转化株的脂肪酸组成(宿主EH13-15)

	1	2	3	4	5(本发明)	6(本发明)
							样品名	pYE22m-1	pYE22m-2	LPAAT1(short)-1	LPAAT1(short)-2	LPAAT1(long)-1	LPAAT1(long)-2
16:0(棕榈酸)	8.60	6.58	12.17	14.76	7.66	7.49
							16:1(棕榈油酸)	39.52	42.40	34.69	34.44	33.00	32.54
18:0(硬脂酸)	5.28	4.62	4.73	5.10	3.73	3.69
							18:1(油酸)	44.07	43.74	45.88	42.40	54.04	53.91
其他脂肪酸	2.53	2.66	2.53	3.31	1.58	2.37
							合计	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00	100.00
16:1/16:0	4.59	6.45	2.85	2.33	4.31	4.34
							18:1/18:0	8.35	9.48	9.71	8.32	14.49	14.62
18:1+16:1/18:0+16:0	6.02	7.70	4.77	3.87	7.64	7.73
							18:0/16:0	0.61	0.70	0.39	0.35	0.49	0.49
18:1/16:1	1.12	1.03	1.32	1.23	1.64	1.66
							18:0+18:1/16:0+16:1	1.03	0.99	1.08	0.97	1.42	1.44
18:1/16:0	5.12	6.65	3.77	2.87	7.06	7.19

比较导入来自高山被孢霉(M.alpina)的2个LPAAT同源基因的酵母和对照酵母的脂肪酸组成。导入LPAAT1-short的酵母的脂肪酸组成，其棕榈酸的比例与对照株相比上升，而另一方面，棕榈油酸含量的比例降低。因此，棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率与对照株相比降低了。硬脂酸及油酸的含量与对照株为同等程度。

与此相对，导入了LPAAT1-long的酵母中，油酸的比例与对照株相比上升了10％以上，另一方面，棕榈油酸、硬脂酸的比例降低了。因此，油酸含量相对于棕榈酸含量的比率、以及油酸含量相对于硬脂酸含量的比率与比对照株相比升高了。且硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率与对照株相比也升高了。

以上结果表明，来自高山被孢霉(M.alpina)的2个LPAAT同源物，因其底物酰基的特异性不同，所以导入这些基因的酵母中各同源物的脂肪酸组成也完全不同。并且表明，通过将上述同源物适时分开使用，可对目的脂肪酸组成的生物进行育种。

实施例7

(1)花生四烯酸生产酵母的育种

为进行花生四烯酸生产酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的育种，构建以下质粒。

首先，以从高山被孢霉(M.alpina)1S-4株中制备的cDNA为模板，用Δ12-f和Δ12-r、Δ6-f和Δ6-r、GLELO-f和GLELO-r或Δ5-f和Δ5-r的引物的组合，使用ExTaq进行PCR，扩增高山被孢霉(M.alpina)1S-4株的Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因以及Δ5脂肪酸去饱和酶基因。

Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列号13)

Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列号14)

Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(序列号15)

Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列号16)

GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(序列号17)

GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号18)

Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(序列号19)

Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列号20)

将这些通过TOPO-TA-cloning Kit克隆。确认碱基序列，将含有序列号21～24的碱基序列的克隆分别作为质粒pCR-MAΔ12DS(含有序列号21的碱基序列)、pCR-MAΔ6DS(含有序列号22的碱基序列)、pCR-MAGLELO(含有序列号23的碱基序列)、pCR-MAΔ5DS(含有序列号24的碱基序列)。

而后，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MAΔ12DS且进行末端平滑化后用限制性内切酶XbaI酶切而获得的约1.2kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)且进行末端平滑化后用限制性内切酶SpeI酶切后的约6.6kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ6DS且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切而获得的约1.6kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SalI酶切质粒pESC-U-Δ12且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切后的约8kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-U-Δ12:Δ6。将其用限制性内切酶PvuII部分酶切获得的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位点，获得质粒pUC-URA-Δ12:Δ6。

此外，将用限制性内切酶XbaI和SacI酶切质粒pCR-MAGLELO后获得的约0.95kbp的DNA片段，与用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体pESC-LEU(STRATAGENE)后获得的约7.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLELO。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ5DS且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切而获得的约1.3kbp的DNA片段，与用限制性内切酶ApaI酶切质粒pESC-L-GLELO且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切后而获得的约8.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLELO:Δ5。将其用限制性内切酶PvuII酶切后获得的约3.2kb片段插入pUC-LEU2的SmaI位点，获得质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5。

将酿酒酵母(S.cerevisiae)YPH499株(STRATAGENE)用质粒pUC-URA-Δ12:Δ6和质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5进行共转化。转化株选择在SC-Leu，Ura[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o aminoacids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。将如此获得的菌株中的任意一株作为ARA3-1株。

(2)花生四烯酸生产酵母的转化株的获得与分析

将ARA3-1株用质粒pYE22m、pYE-MALPAAT1-long、pYE-MALPAAT1-short分别转化。转化株选择在SC-Trp、Leu、Ura[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。从导入各质粒的菌株中，分别选择任意4株。

将这些菌株在上述SC-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中30℃、培养1天，取其中1ml在SG-Trp、Leu、Ura[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeastnitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、半乳糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g]液体培养基10ml中15℃、培养7天，进行菌体的脂肪酸分析。菌体的脂肪酸组成如表4所示。

表4

表4  总脂肪酸中n-6系PUFA的比率(％)

如此，在为了可生产花生四烯酸而育种的酵母中使LPAAT1-long高表达时，与只导入载体的对照株相比，总脂肪酸中n-6系PUFA的比率升高。且与使LPAAT1-short高表达时相比，亚油酸、γ-亚麻酸、花生四烯酸的比率也升高了。

实施例8

高山被孢霉(M.alpina)表达用载体的构建

作为高山被孢霉(M.alpina)表达用载体，使用由GAPDH启动子使目的基因表达的pDuraSC。

为使LPAAT1-long和LPAAT1-short在高山被孢霉(M.alpina)中表达，如下构建载体。即将质粒pB-LPAAT1-long用限制性内切酶EcoRI和SalI酶切后所得到的DNA片段中约1.5kb的片段切出，插入载体pDuraSC的多克隆位点的EcoRI-XhoI位点，作为质粒pDuraSC-LPAAT1-long。且将质粒pCR-LPAAT1-short用EcoRI和SalI酶切后所得到的DNA片段中约1.3kb切出，插入载体pDuraSC的多克隆位点的EcoRI位点、XhoI位点，作为pDura5SC-LPAAT1-short。

实施例9

高山被孢霉(M.alpina)转化株的获得

使用这些质粒，从高山被孢霉(M.alpina)中，以根据专利文献(WO2005/019437“脂质生产菌的育种方法”)中记载的方法诱导的尿嘧啶缺陷型株Δura-3为宿主，用粒子轰击法进行转化。选择转化株时，使用SC琼脂培养基[无氨基酸和硫酸铵酵母氮源(Yeast Ni trogen Base w/o Amino Ac i ds andAmmonium Sulfate)(Difco)0.5％、硫酸铵0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％]。

实施例10

转化高山被孢霉(M.alpina)的评价

将获得的转化株，接种到GY培养基(葡萄糖2％、酵母膏1％)4ml中，28℃振荡培养3天或4天。通过过滤回收菌体，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过SuperScript First-Strand Synthes i s System for RT-PCR(Invitrogen)合成cDNA。为了确认导入的构建物中的各基因的表达、总的各基因的表达，用以下引物的组合进行RT-PCR。

用于导入构建物中的表达确认的引物

MaGAPDHpfw：CACACCACACATTCAACATC(序列号25)

LPAAT1-r：GCCTTCGTCCTTGGTACACCTTGAC(序列号26)

用于总的LPAAT1表达确认的引物

LPAAT1-2F：TCGGCTCGGTCCCAAGATGAAC(序列号27)

引物LPAAT1-2R：GCGTCTGTCATGTGCCCAGTCA(序列号28)

根据上述RT-PCR的结果，作为各基因在导入构建物中的表达及总表达高的菌株，从质粒pDuraSC-LPAAT1-long导入株中筛选出Gp-LPAAT1-long-5株，从质粒pDuraSC-LPAAT1-short导入株中筛选出Gp-LPAAT1-short-6株。

将这些菌株在GY培养基4ml中接种，28℃下125rpm振荡培养。培养第6天通过过滤回收全部菌体，冷冻干燥。取出一部分(约10～20mg左右)干燥菌体，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。菌体内的脂肪酸组成如表5所示。

表5

表5  总脂肪酸中DGLA和花生四烯酸的比率(％)

这样，在高山被孢霉(M.alpina)中使LPAAT1-long或LPAAT1-short高表达的转化株中，与野生株1S-4株相比，DGLA及花生四烯酸的比率高。且将使LPAAT1-long高表达的菌株和使LPAAT1-short高表达的菌株相比较时，前者的此趋势更为明显。

序列表FREETEXT

序列号6：引物

序列号7：引物

序列号11：引物

序列号12：引物

序列号13：引物

序列号14：引物

序列号15：引物

序列号16：引物

序列号17：引物

序列号18：引物

序列号19：引物

序列号20：引物

序列号25：引物

序列号26：引物

序列号27：引物

序列号28：引物

序列表SEQUENCE LISTING

<110>三得利株式会社(SUNTORY LIMITED.)

<120>具有新型脂肪酸组成的脂肪酸组合物

(Fatty Acid composition having novel fatty acid rate)

<130>071208

<150>JP2007-190680

<151>2007-07-23

<160>28

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1443

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1443)

<223>

<400>1

atg act gtc gca aag ctg gac cct gga acc acc agt cct atc tca ccc    48

Met Thr Val Ala Lys Leu Asp Pro Gly Thr Thr Ser Pro Ile Ser Pro

1               5                   10                  15

tcg gcc tcg gcc tcg ttt tcg ccc ccg acc acc cct ctc tcg cag aag    96

Ser Ala Ser Ala Ser Phe Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Ser Gln Lys

            20                  25                  30

aag ggt atc tac tcg gcg act acc act tct acc act acc acc acc act    144

Lys Gly Ile Tyr Ser Ala Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr

        35                  40                  45

acc acc acc aaa atc tcg agc tct agc aac tct tct agc gca acg ctc    192

Thr Thr Thr Lys Ile Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ala Thr Leu

    50                  55                  60

atg gat gaa tcc acc acc acc acc cac cac aca gag acc agc agc aag    240

Met Asp Glu Ser Thr Thr Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys

65                  70                  75                  80

acg tcc tcg cac ccc cgt cgg ctc ggt ccc aag atg aac ccc atc tac    288

Thr Ser Ser His Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr

                85                  90                  95

aag ggt ctg cga gcc ttt gtc tgg gcc ttg tac ttc aac cta gga gca    336

Lys Gly Leu Arg Ala Phe Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala

            100                 105                 110

tct ctc ata tcg ata acc caa gtc ctg tcg ttg cct ctg gcg ttg atc    384

Ser Leu Ile Ser Ile Thr Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile

        115                 120                 125

gct cca aaa gtt tac cag tgg cac atc act aaa acc cag ggt cac ttt    432

Ala Pro Lys Val Tyr Gln Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe

    130                 135                 140

ggg gct ttc ctg ctc aag atg aac cag cta ttt gcg ccc tca gat atc    480

Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile

145                 150                 155                 160

gtc ttg acg gga gat gaa agt gtc agg gga atc gtc aag gtg tac caa    528

Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln

                165                 170                 175

gga cga agg ctg aag gac act ggt gag gcg tac agc ggt cat gga gag    576

Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu

            180                 185                 190

gac att att ctg gat atg ccc gag agg atg gtt ttc atc gcg aac cac    624

Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His

        195                 200                 205

cag atc tat tct gac tgg atg tac ctc tgg tgc ttc tcc tat ttc gca    672

Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala

    210                 215                 220

gag agg cac agg gca ctg aag att att ctt cgg ggc gac ctg acc tgg    720

Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp

225                 230                 235                 240

atc cct gtc ttt ggc tgg ggt atg cgg ttc ttt gac ttt atc ttt ttg    768

Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu

                245                 250                 255

aaa cgt aat gac tgg gca cat gac aga cgc gcc att gag gag aac ctg    816

Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu

            260                 265                 270

gga cgt gtc aag gaa aag gat cca ctc tgg ctg gta gtc ttc cct gaa    864

Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu

        275                 280                 285

gga aca gtc gtc tcc aag gaa acg cgt ttg cga tct gtt gcc ttt tca    912

Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser

    290                 295                 300

aag aag gct ggt ctt tcg gat cac cgc cat gtg ttg ctt cca aga acc    960

Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr

305                 310                 315                 320

agc ggc ctc ttt gtt tgc atc aac aag ttg cgt gga tcc gtc gaa tac    1008

Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr

                325                 330                 335

tta tac gac gcg aca gtt ggc tac tcg aac gtt gaa tat gga gag att    1056

Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile

            340                 345                 350

cca cag gag ctt tac cct ttg cca ggg cta tat atc aac aag gcg cag    1104

Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln

        355                 360                 365

ccc aag gag atc aac atg cac ctg cgg cgg ttt gct atc aag gat atc    1152

Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile

    370                 375                 380

ccc acg tca gaa ccc gag ttt gtg gag tgg gtc cga gcg cgg tgg gta    1200

Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val

385                 390                 395                 400

gag aag gat gag ctg atg gag gag ttt tat acc aag ggc cga ttc cca    1248

Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro

                405                 410                 415

tcg cag ctg acg gct gag gac att ggc gag aag gag acc aac aag gca    1296

Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala

            420                 425                 430

gga ggc tca tct gaa gga cag agt gtc aga atc ccg ctc aaa tcg cga    1344

Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg

        435                 440                 445

ggc atg atg gac tac ctc atg cct tcg gcc att aac ctg gtt gcg ctg    1392

Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu

    450                 455                 460

cca gta ctg gct ttt gcg atg aga tat gct ctg cag caa gta tcg tct    1440

Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser

465                 470                 475                 480

ggt                                                                1443

Gly

<210>2

<211>481

<212>PRT

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>2

Met Thr Val Ala Lys Leu Asp Pro Gly Thr Thr Ser Pro Ile Ser Pro

1               5                   10                  15

Ser Ala Ser Ala Ser Phe Ser Pro Pro Thr Thr Pro Leu Ser Gln Lys

            20                  25                  30

Lys Gly Ile Tyr Ser Ala Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Thr Thr Thr

        35                  40                  45

Thr Thr Thr Lys Ile Ser Ser Ser Ser Asn Ser Ser Ser Ala Thr Leu

    50                  55                  60

Met Asp Glu Ser Thr Thr Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys

65                  70                  75                  80

Thr Ser Ser His Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr

                85                  90                  95

Lys Gly Leu Arg Ala Phe Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala

            100                 105                 110

Ser Leu Ile Ser Ile Thr Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile

        115                 120                 125

Ala Pro Lys Val Tyr Gln Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe

    130                 135                 140

Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile

145                 150                 155                 160

Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln

                165                 170                 175

Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu

            180                 185                 190

Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His

        195                 200                 205

Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala

    210                 215                 220

Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp

225                 230                 235                 240

Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu

                245                 250                 255

Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu

            260                 265                 270

Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu

        275                 280                 285

Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser

    290                 295                 300

Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr

305                 310                 315                 320

Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr

                325                 330                 335

Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile

            340                 345                 350

Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln

        355                 360                 365

Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile

    370                 375                 380

Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val

385                 390                 395                 400

Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro

                405                 410                 415

Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala

            420                 425                 430

Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg

        435                 440                 445

Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu

    450                 455                 460

Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser

465                 470                 475                 480

Gly

<210>3

<211>1627

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>3

gctcttccct ctcttcccgc tctactctca cttctcgctc gtcttcccca ccctctcacc   60

cattcgcaga gaacaagtgt gcctgctgca cccacacgga tatgactgtc gcaaagctgg  120

accctggaac caccagtcct atctcaccct cggcctcggc ctcgttttcg cccccgacca  180

cccctctctc gcagaagaag ggtatctact cggcgactac cacttctacc actaccacca  240

ccactaccac caccaaaatc tcgagctcta gcaactcttc tagcgcaacg ctcatggatg  300

aatccaccac caccacccac cacacagaga ccagcagcaa gacgtcctcg cacccccgtc  360

ggctcggtcc caagatgaac cccatctaca agggtctgcg agcctttgtc tgggccttgt  420

acttcaacct aggagcatct ctcatatcga taacccaagt cctgtcgttg cctctggcgt  480

tgatcgctcc aaaagtttac cagtggcaca tcactaaaac ccagggtcac tttggggctt  540

tcctgctcaa gatgaaccag ctatttgcgc cctcagatat cgtcttgacg ggagatgaaa  600

gtgtcagggg aatcgtcaag gtgtaccaag gacgaaggct gaaggacact ggtgaggcgt    660

acagcggtca tggagaggac attattctgg atatgcccga gaggatggtt ttcatcgcga    720

accaccagat ctattctgac tggatgtacc tctggtgctt ctcctatttc gcagagaggc    780

acagggcact gaagattatt cttcggggcg acctgacctg gatccctgtc tttggctggg    840

gtatgcggtt ctttgacttt atctttttga aacgtaatga ctgggcacat gacagacgcg    900

ccattgagga gaacctggga cgtgtcaagg aaaaggatcc actctggctg gtagtcttcc    960

ctgaaggaac agtcgtctcc aaggaaacgc gtttgcgatc tgttgccttt tcaaagaagg   1020

ctggtctttc ggatcaccgc catgtgttgc ttccaagaac cagcggcctc tttgtttgca   1080

tcaacaagtt gcgtggatcc gtcgaatact tatacgacgc gacagttggc tactcgaacg   1140

ttgaatatgg agagattcca caggagcttt accctttgcc agggctatat atcaacaagg   1200

cgcagcccaa ggagatcaac atgcacctgc ggcggtttgc tatcaaggat atccccacgt   1260

cagaacccga gtttgtggag tgggtccgag cgcggtgggt agagaaggat gagctgatgg   1320

aggagtttta taccaagggc cgattcccat cgcagctgac ggctgaggac attggcgaga   1380

aggagaccaa caaggcagga ggctcatctg aaggacagag tgtcagaatc ccgctcaaat   1440

cgcgaggcat gatggactac ctcatgcctt cggccattaa cctggttgcg ctgccagtac  1500

tggcttttgc gatgagatat gctctgcagc aagtatcgtc tggttgattt attttttgtt  1560

agacgctgcc gtagttgtaa atttgatgag tgctatttag agcaaacgaa agaagagact  1620

taaacgc                                                            1627

<210>4

<211>1446

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>4

atgactgtcg caaagctgga ccctggaacc accagtccta tctcaccctc ggcctcggcc     60

tcgttttcgc ccccgaccac ccctctctcg cagaagaagg gtatctactc ggcgactacc    120

acttctacca ctaccaccac cactaccacc accaaaatct cgagctctag caactcttct    180

agcgcaacgc tcatggatga atccaccacc accacccacc acacagagac cagcagcaag    240

acgtcctcgc acccccgtcg gctcggtccc aagatgaacc ccatctacaa gggtctgcga    300

gcctttgtct gggccttgta cttcaaccta ggagcatctc tcatatcgat aacccaagtc    360

ctgtcgttgc ctctggcgtt gatcgctcca aaagtttacc agtggcacat cactaaaacc    420

cagggtcact ttggggcttt cctgctcaag atgaaccagc tatttgcgcc ctcagatatc    480

gtcttgacgg gagatgaaag tgtcagggga atcgtcaagg tgtaccaagg acgaaggctg    540

aaggacactg gtgaggcgta cagcggtcat ggagaggaca ttattctgga tatgcccgag    600

aggatggttt tcatcgcgaa ccaccagatc tattctgact ggatgtacct ctggtgcttc    660

tcctatttcg cagagaggca cagggcactg aagattattc ttcggggcga cctgacctgg    720

atccctgtct ttggctgggg tatgcggttc tttgacttta tctttttgaa acgtaatgac    780

tgggcacatg acagacgcgc cattgaggag aacctgggac gtgtcaagga aaaggatcca    840

ctctggctgg tagtcttccc tgaaggaaca gtcgtctcca aggaaacgcg tttgcgatct    900

gttgcctttt caaagaaggc tggtctttcg gatcaccgcc atgtgttgct tccaagaacc    960

agcggcctct ttgtttgcat caacaagttg cgtggatccg tcgaatactt atacgacgcg   1020

acagttggct actcgaacgt tgaatatgga gagattccac aggagcttta ccctttgcca   1080

gggctatata tcaacaaggc gcagcccaag gagatcaaca tgcacctgcg gcggtttgct   1140

atcaaggata tccccacgtc agaacccgag tttgtggagt gggtccgagc gcggtgggta   1200

gagaaggatg agctgatgga ggagttttat accaagggcc gattcccatc gcagctgacg  1260

gctgaggaca ttggcgagaa ggagaccaac aaggcaggag gctcatctga aggacagagt  1320

gtcagaatcc cgctcaaatc gcgaggcatg atggactacc tcatgccttc ggccattaac  1380

ctggttgcgc tgccagtact ggcttttgcg atgagatatg ctctgcagca agtatcgtct  1440

ggttga                                                             1446

<210>5

<211>843

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<220>

<221>misc_feature

<222>(793)..(793)

<223>n表示任意碱基(n means any bases)

<400>5

gcgccattga ggagaacctg ggacgtgtca aggaaaagga tccactctgg ctggtagtct   60

tccctgaagg aacagtcgtc tccaaggaaa cgcgtttgcg atctgttgcc ttttcaaaga  120

aggctggtct ttcggatcac cgccatgtgt tgcttccaag aaccagcggc ctctttgttt  180

gcatcaacaa gttgcgtgga tccgtcgaat acttatacga cgcgacagtt ggctactcga    240

acgttgaata tggagagatt ccacaggagc tttacccttt gccagggcta tatatcaaca    300

aggcgcagcc caaggagatc aacatgcacc tgcggcggtt tgctatcaag gatatcccca    360

cgtcagaacc cgagtttgtg gagtgggtcc gagcgcggtg ggtagagaag gatgagctga    420

tggaggagtt ttataccaag ggccgattcc catcgcagct gacggctgag gacattggcg    480

agaaggagac caacaaggca ggaggctcat ctgaaggaca gagtgtcaga atcccgctca    540

aatcgcgagg catgatggac tacctcatgc cttcggccat taacctggtt gcgctgccag    600

tactggcttt tgcgatgaga tatgctctgc agcaagtatc gtctggttga tttatttttt    660

gttagacgct gccgtagttg taaatttgat gagtgctatt tagagcaaac gaaagaagag    720

acttaaacgc atggatgtgt gtaatttcat aacagaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    780

aacctgcagc ccngggggat ccactagttc tagagcgccg ccaccgcggt ggagctcagc    840

gtt                                                                  843

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>6

ggacgtgtca aggaaaagga                                               20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>7

tccttcagat gagcctcctg                                               20

<210>8

<211>1251

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>8

atggatgaat ccaccaccac cacccaccac acagagacca gcagcaagac gtcctcgcac   60

ccccgtcggc tcggtcccaa gatgaacccc atctacaagg gtctgcgagc ctttgtctgg  120

gccttgtact tcaacctagg agcatctctc atatcgataa cccaagtcct gtcgttgcct  180

ctggcgttga tcgctccaaa agtttaccag tggcacatca ctaaaaccca gggtcacttt    240

ggggctttcc tgctcaagat gaaccagcta tttgcgccct cagatatcgt cttgacggga    300

gatgaaagtg tcaggggaat cgtcaaggtg taccaaggac gaaggctgaa ggacactggt    360

gaggcgtaca gcggtcatgg agaggacatt attctggata tgcccgagag gatggttttc    420

atcgcgaacc accagatcta ttctgactgg atgtacctct ggtgcttctc ctatttcgca    480

gagaggcaca gggcactgaa gattattctt cggggcgacc tgacctggat ccctgtcttt    540

ggctggggta tgcggttctt tgactttatc tttttgaaac gtaatgactg ggcacatgac    600

agacgcgcca ttgaggagaa cctgggacgt gtcaaggaaa aggatccact ctggctggta    660

gtcttccctg aaggaacagt cgtctccaag gaaacgcgtt tgcgatctgt tgccttttca    720

aagaaggctg gtctttcgga tcaccgccat gtgttgcttc caagaaccag cggcctcttt    780

gtttgcatca acaagttgcg tggatccgtc gaatacttat acgacgcgac agttggctac    840

tcgaacgttg aatatggaga gattccacag gagctttacc ctttgccagg gctatatatc    900

aacaaggcgc agcccaagga gatcaacatg cacctgcggc ggtttgctat caaggatatc    960

cccacgtcag aacccgagtt tgtggagtgg gtccgagcgc ggtgggtaga gaaggatgag   1020

ctgatggagg agttttatac caagggccga ttcccatcgc agctgacggc tgaggacatt  1080

ggcgagaagg agaccaacaa ggcaggaggc tcatctgaag gacagagtgt cagaatcccg  1140

ctcaaatcgc gaggcatgat ggactacctc atgccttcgg ccattaacct ggttgcgctg  1200

ccagtactgg cttttgcgat gagatatgct ctgcagcaag tatcgtctgg t           1251

<210>9

<211>1369

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<220>

<221>CDS

<222>(36)..(1289)

<223>

<400>9

tctcgagctc tagcaactct tctagcgcaa cgctc atg gat gaa tcc acc acc      53

                                       Met Asp Glu Ser Thr Thr

                                       1               5

acc acc cac cac aca gag acc agc agc aag acg tcc tcg cac ccc cgt    101

Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys Thr Ser Ser His Pro Arg

            10                  15                  20

cgg ctc ggt ccc aag atg aac ccc atc tac aag ggt ctg cga gcc ttt    149

Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr Lys Gly Leu Arg Ala Phe

        25                  30                  35

gtc tgg gcc ttg tac ttc aac cta gga gca tct ctc ata tcg ata acc    197

Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala Ser Leu Ile Ser Ile Thr

    40                  45                  50

caa gtc ctg tcg ttg cct ctg gcg ttg atc gct cca aaa gtt tac cag    245

Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile Ala Pro Lys Val Tyr Gln

55                  60                  65                  70

tgg cac atc act aaa acc cag ggt cac ttt ggg gct ttc ctg ctc aag    293

Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe Gly Ala Phe Leu Leu Lys

                75                  80                  85

atg aac cag cta ttt gcg ccc tca gat atc gtc ttg acg gga gat gaa    341

Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile Val Leu Thr Gly Asp Glu

            90                  95                  100

agt gtc agg gga atc gtc aag gtg tac caa gga cga agg ctg aag gac    389

Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln Gly Arg Arg Leu Lys Asp

        105                 110                 115

act ggt gag gcg tac agc ggt cat gga gag gac att att ctg gat atg    437

Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu Asp Ile Ile Leu Asp Met

    120                 125                 130

ccc gag agg atg gtt ttc atc gcg aac cac cag atc tat tct gac tgg    485

Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His Gln Ile Tyr Ser Asp Trp

135                 140                 145                 150

atg tac ctc tgg tgc ttc tcc tat ttc gca gag agg cac agg gca ctg    533

Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala Glu Arg His Arg Ala Leu

                155                 160                 165

aag att att ctt cgg ggc gac ctg acc tgg atc cct gtc ttt ggc tgg    581

Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp Ile Pro Val Phe Gly Trp

            170                 175                 180

ggt atg cgg ttc ttt gac ttt atc ttt ttg aaa cgt aat gac tgg gca    629

Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu Lys Arg Asn Asp Trp Ala

        185                 190                 195

cat gac aga cgc gcc att gag gag aac ctg gga cgt gtc aag gaa aag    677

His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu Gly Arg Val Lys Glu Lys

    200                 205                 210

gat cca ctc tgg ctg gta gtc ttc cct gaa gga aca gtc gtc tcc aag    725

Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu Gly Thr Val Val Ser Lys

215                 220                 225                 230

gaa acg cgt ttg cga tct gtt gcc ttt tca aag aag gct ggt ctt tcg    773

Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser Lys Lys Ala Gly Leu Ser

                235                 240                 245

gat cac cgc cat gtg ttg ctt cca aga acc agc ggc ctc ttt gtt tgc    821

Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr Ser Gly Leu Phe Val Cys

            250                 255                 260

atc aac aag ttg cgt gga tcc gtc gaa tac tta tac gac gcg aca gtt    869

Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr Leu Tyr Asp Ala Thr Val

        265                 270                 275

ggc tac tcg aac gtt gaa tat gga gag att cca cag gag ctt tac cct    917

Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile Pro Gln Glu Leu Tyr Pro

    280                 285                 290

ttg cca ggg cta tat atc aac aag gcg cag ccc aag gag atc aac atg    965

Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln Pro Lys Glu Ile Asn Met

295                 300                 305                 310

cac ctg cgg cgg ttt gct atc aag gat atc ccc acg tca gaa ccc gag    1013

His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile Pro Thr Ser Glu Pro Glu

                315                 320                 325

ttt gtg gag tgg gtc cga gcg cgg tgg gta gag aag gat gag ctg atg    106l

Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val Glu Lys Asp Glu Leu Met

            330                 335                 340

gag gag ttt tat acc aag ggc cga ttc cca tcg cag ctg acg gct gag    1109

Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro Ser Gln Leu Thr Ala Glu

        345                 350                 355

gac att ggc gag aag gag acc aac aag gca gga ggc tca tct gaa gga    1157

Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala Gly Gly Ser Ser Glu Gly

    360                 365                 370

cag agt gtc aga atc ccg ctc aaa tcg cga ggc atg atg gac tac ctc    1205

Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg Gly Met Met Asp Tyr Leu

375                 380                 385                 390

atg cct tcg gcc att aac ctg gtt gcg ctg cca gta ctg gct ttt gcg    1253

Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu Pro Val Leu Ala Phe Ala

                395                 400                 405

atg aga tat gct ctg cag caa gta tcg tct ggt tga tttatttttt         1299

Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser Gly

            410                 415

gttagacgct gccgtagttg taaatttgat gagtgctatt tagagcaaac gaaagaagag  1359

acttaaacgc                                                         1369

<210>10

<211>417

<212>PRT

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>10

Met Asp Glu Ser Thr Thr Thr Thr His His Thr Glu Thr Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Thr Ser Ser His Pro Arg Arg Leu Gly Pro Lys Met Asn Pro Ile Tyr

            20                  25                  30

Lys Gly Leu Arg Ala Phe Val Trp Ala Leu Tyr Phe Asn Leu Gly Ala

        35                  40                  45

Ser Leu Ile Ser Ile Thr Gln Val Leu Ser Leu Pro Leu Ala Leu Ile

    50                  55                  60

Ala Pro Lys Val Tyr Gln Trp His Ile Thr Lys Thr Gln Gly His Phe

65                  70                  75                  80

Gly Ala Phe Leu Leu Lys Met Asn Gln Leu Phe Ala Pro Ser Asp Ile

                85                  90                  95

Val Leu Thr Gly Asp Glu Ser Val Arg Gly Ile Val Lys Val Tyr Gln

            100                 105                 110

Gly Arg Arg Leu Lys Asp Thr Gly Glu Ala Tyr Ser Gly His Gly Glu

        115                 120                 125

Asp Ile Ile Leu Asp Met Pro Glu Arg Met Val Phe Ile Ala Asn His

    130                 135                 140

Gln Ile Tyr Ser Asp Trp Met Tyr Leu Trp Cys Phe Ser Tyr Phe Ala

145                 150                 155                 160

Glu Arg His Arg Ala Leu Lys Ile Ile Leu Arg Gly Asp Leu Thr Trp

                165                 170                 175

Ile Pro Val Phe Gly Trp Gly Met Arg Phe Phe Asp Phe Ile Phe Leu

            180                 185                 190

Lys Arg Asn Asp Trp Ala His Asp Arg Arg Ala Ile Glu Glu Asn Leu

        195                 200                 205

Gly Arg Val Lys Glu Lys Asp Pro Leu Trp Leu Val Val Phe Pro Glu

    210                 215                 220

Gly Thr Val Val Ser Lys Glu Thr Arg Leu Arg Ser Val Ala Phe Ser

225                 230                 235                 240

Lys Lys Ala Gly Leu Ser Asp His Arg His Val Leu Leu Pro Arg Thr

                245                 250                 255

Ser Gly Leu Phe Val Cys Ile Asn Lys Leu Arg Gly Ser Val Glu Tyr

            260                 265                 270

Leu Tyr Asp Ala Thr Val Gly Tyr Ser Asn Val Glu Tyr Gly Glu Ile

        275                 280                 285

Pro Gln Glu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Leu Tyr Ile Asn Lys Ala Gln

    290                 295                 300

Pro Lys Glu Ile Asn Met His Leu Arg Arg Phe Ala Ile Lys Asp Ile

305                 310                 315                 320

Pro Thr Ser Glu Pro Glu Phe Val Glu Trp Val Arg Ala Arg Trp Val

                325                 330                 335

Glu Lys Asp Glu Leu Met Glu Glu Phe Tyr Thr Lys Gly Arg Phe Pro

            340                 345                 350

Ser Gln Leu Thr Ala Glu Asp Ile Gly Glu Lys Glu Thr Asn Lys Ala

        355                 360                 365

Gly Gly Ser Ser Glu Gly Gln Ser Val Arg Ile Pro Leu Lys Ser Arg

    370                 375                 380

Gly Met Met Asp Tyr Leu Met Pro Ser Ala Ile Asn Leu Val Ala Leu

385                 390                 395                 400

Pro Val Leu Ala Phe Ala Met Arg Tyr Ala Leu Gln Gln Val Ser Ser

                405                 410                 415

Gly

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>11

tctgagatgg atgaatccac caccaccac                                      29

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>12

gtcgactcaa ccagacgata cttgctgcag ag                                  32

<210>13

<211>28

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>13

tctagaatgg cacctcccaa cactattg                                       28

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>14

aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc                                     30

<210>15

<211>29

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>15

tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag                                      29

<210>16

<211>29

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>16

aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg                                      29

<210>17

<211>28

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>17

tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc                                       28

<210>18

<211>30

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>18

gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc                                     30

<210>19

<211>30

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>19

tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc                                     30

<210>20

<211>30

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>20

aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc                                     30

<210>21

<211>1203

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>21

atggcacctc ccaacactat tgatgccggt ttgacccagc gccatatcag cacctcggcc     60

gccccaacct ctgccaagcc cgccttcgag cgcaactacc agctccctga gttcaccatc    120

aaggagatcc gtgagtgcat ccctgcacac tgctttgagc gctccggtct ccgtggtctt    180

tgccacgttg ctattgatct gacctgggcc tcgctcttgt tcctggctgc gacccagatc    240

gacaagttcg agaacccttt gatccgctac ttggcctggc ctgcgtattg gatcatgcag    300

ggtattgttt gcaccggtat ctgggtattg gcacacgaat gtggtcatca gtccttctcg    360

acctccaaga cccttaacaa cactgtcggc tggatcttgc actcgatgct cttggtccct    420

taccactcct ggagaatctc gcactcgaag caccacaagg ccactggcca catgaccaag    480

gaccaggtct ttgttcccaa gacccgctct caggttggct tgccccccaa ggagaatgtt    540

gcagttgccg ttcaggagga ggatatgtcc gtgcacctgg atgaggaggc ccccattgtg    600

actttgttct ggatggtgat tcagttcctg ttcggatggc ctgcgtacct tattatgaac   660

gcctctggtc aagactatgg ccgctggacc tcgcacttcc acacctactc tcctatcttt   720

gagccccgca actttttcga cattatcatt tcggatctcg gtgtgttggc tgctcttggt   780

accttgatct acgcctccat gcagctctcg ctcttgaccg tgaccaagta ctacattgtc   840

ccctacttgt ttgtcaactt ctggttggtc ctgatcacct tcttgcagca caccgaccct   900

aagctgcccc attaccgtga gggtgcctgg aacttccagc gtggagccct ctgcaccgtt   960

gaccgctcgt tcggcaagtt cttggaccat atgttccacg gcattgtcca tacccatgta  1020

gcccatcact tgttctcgca gatgccgttc taccatgctg aggaagccac ccatcatctc  1080

aagaaactgc tgggagagta ctacgtctat gacccatcgc cgattgttgt tgcggtctgg  1140

aggtcgttcc gtgaatgccg attcgtggaa gaccatggag acgtggtctt tttcaagaag  1200

taa                                                                1203

<210>22

<211>1374

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>22

atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg agattttgaa tgccgaggcc     60

ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca ccctttctga tgatcattga caacaaggtg    120

tacgatgtcc gcgagtttgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt    180

ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact ttccaccccg aggctgcttg ggagactctt    240

gccaactttt acgttggtga tattgatgag agcgatcgtg ccatcaagaa tgatgacttt    300

gcggccgagg ttcgcaagct gcgcaccttg ttccagtccc ttggctacta cgactcgtcc    360

aaggcatact atgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggctt gtcgactttc    420

attgttgcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgctcttg    480

ggtctcttct ggcagcagtg cggatggttg gcgcacgact ttttgcacca ccaggtcttc    540

caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggtttc    600

tcgtcctcct ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ctgctcccaa cgtccacggc    660

gaggatcccg acattgacac tcaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc tctggagatg    720

ttctcggatg ttcctgacga ggagctgacc cgtatgtggt cgcgcttcat ggtcctcaac    780

cagacctggt tctacttccc cattctctcg tttgcccgtc tgtcctggtg cctccagtcc    840

attatgcttg ttctgcccaa cggtcaggcc cacaagccct ctggagcgcg tgtgcccatt   900

tcgttggtcg agcagctgtc tctggctatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc   960

ctgttcatta aggatcccgt caacatgatt gtgtactttt tggtgtcgca ggctgtttgc  1020

ggcaacttgt tggcgattgt gttctcgctc aaccacaacg gcatgcctgt gatctccaag  1080

gaggaagcgg tcgatatgga cttcttcacc aagcagatca tcacgggtcg tgatgttcac  1140

cctggtctgt ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact accagattga gcaccacttg  1200

ttcccttcga tgccccgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gactttgtgc  1260

aaaaagtacg gtgtccgata ccataccact ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt  1320

agccgtttga acgaggtctc caaggcggcc tccaagatgg gcaaggcaca gtaa        1374

<210>23

<211>1341

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>23

atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag    60

gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt    120

catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt    180

gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca    240

ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag    300

ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc    360

tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt    420

gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt    480

gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac    540

aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat    600

ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct    660

gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg    720

ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc    780

aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt    840

gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc    900

tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt   960

accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt  1020

gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca  1080

gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc  1140

acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac  1200

taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc  1260

gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt  1320

cttcgtccca aggaagagta a                                            1341

<210>24

<211>1341

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>24

atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag     60

gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt    120

catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt    180

gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca    240

ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag    300

ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc    360

tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt    420

gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt    480

gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac    540

aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat    600

ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct    660

gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg    720

ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc    780

aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt    840

gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc    900

tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt    960

accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt   1020

gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca  1080

gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc  1140

acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac  1200

taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc  1260

gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt  1320

cttcgtccca aggaagagta a                                            1341

<210>25

<211>20

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>25

cacaccacac attcaacatc                                                20

<210>26

<211>25

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>26

gccttcgtcc ttggtacacc ttgac                                          25

<210>27

<211>22

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>27

tcggctcggt cccaagatga ac                                             22

<210>28

<211>22

<212>DNA

<213>引物(primer)

<400>28

gcgtctgtca tgtgcccagt ca                                             22

Claims (3)

1.脂肪酸组合物的制造方法，其特征在于，培养通过含有如下核酸的重组载体转化的宿主，从所得到的培养物中提取脂肪酸组合物，该核酸包含以下(a)～(d)中任一项所述的LPAAT1-long碱基序列：

(a)由序列号1组成的碱基序列；

(b)由序列号3组成的碱基序列；

(c)由序列号4组成的碱基序列；

(d)编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列；

该脂肪酸组合物的特征在于，以下i)～iv)的条件或以下v)的条件均比培养用含有LPAAT1-short碱基序列的重组载体转化的宿主而得到的培养物高，所述LPAAT1-short碱基序列选自由序列号8组成的碱基序列、由序列号9组成的碱基序列以及编码由序列号10组成的氨基酸序列的碱基序列：

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量。

2.权利要求1中所述的制造方法，其中，n-6系脂肪酸选自亚油酸、γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸及花生四烯酸中的至少1种脂肪酸。

3.包含以下(a)～(d)中任一项所述的碱基序列的核酸的用途，用于制造脂肪酸组合物：

(a)由序列号1组成的碱基序列；

(b)由序列号3组成的碱基序列；

(c)由序列号4组成的碱基序列；

(d)编码序列号2所示的氨基酸序列的碱基序列；并且，所述脂肪酸组合物的特征在于，以下i)～iv)的条件或以下v)的条件均比培养用含有LPAAT1-short碱基序列的重组载体转化的宿主而得到的培养物高，所述LPAAT1-short碱基序列选自由序列号8组成的碱基序列、由序列号9组成的碱基序列以及编码由序列号10组成的氨基酸序列的碱基序列：

i)油酸含量

ii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率，以及

iii)油酸的含量相对于硬脂酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量及棕榈油酸的合计含量的比率

v)n-6系脂肪酸含量。

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