CN101595216B - 磷脂酸磷酸酶同源物及其利用 - Google Patents

Abstract

本发明提供新型磷脂酸磷酸酶基因。其为包含序列号1或4所示的碱基序列或其片段的核酸。

Description

磷脂酸磷酸酶同源物及其利用

技术领域

本说明书基于2007年7月11日申请的日本专利申请2007-181899主张优先权。 

本发明涉及新型磷脂酸磷酸酶基因。 

背景技术

脂肪酸是构成磷脂、三酰基甘油等脂质的重要成分。含有2个以上不饱和键的脂肪酸总称为多不饱和脂肪酸(PUFA)，已知有花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸等。此多不饱和脂肪酸包括在动物体内不能合成的多不饱和脂肪酸，这部分多不饱和脂肪酸作为必须脂肪酸需要从食物中摄取。多不饱和脂肪酸分布广泛，例如，花生四烯酸可从动物的肾上腺、肝脏中提取的脂质中分离。但是，动物脏器中含有的多不饱和脂肪酸为少量，仅从动物脏器中提取或分离多不饱和脂肪酸不足以大量供给。因此，开发出培养各种微生物以获得多不饱和脂肪酸的方法。其中，被孢霉属(Mortierella)微生物，作为生产含有花生四烯酸等多不饱和脂肪酸的脂质的微生物而为人所知。 

另外，还尝试了用植物生产多不饱和脂肪酸。已知多不饱和脂肪酸构成三酰基甘油等贮藏脂质，可在微生物的菌体内或植物种子中积累。 

贮藏脂质三酰基甘油在生物体内可如下生成。甘油-3-磷酸通过甘油-3-磷酸酰基转移酶转移酰基生成溶血磷脂酸，溶血磷脂酸通过溶血磷脂酸酰基转移酶转移酰基生成磷脂酸，磷脂酸通过磷脂酸磷酸酯酶脱磷酸化生成二酰基甘油，二酰基甘油通过二酰基甘油酰基转移酶转移酰基而生成三酰基甘油。 

上述途径中，磷脂酸(phosphatidic acid、以下有时记为“PA”。且有时也记为1，2-二酰基-sn-甘油-3-磷酸。)是三酰基甘油的前体，同时也是二酰基型甘油磷脂的生物合成前体。在酵母等中由PA和胞苷5’-3磷酸(CTP)通过磷脂酸胞苷转移酶合成CDP二酰基甘油(CDP-DG)，生物合成各种磷脂。 

如上所述，已知使PA脱磷酸化后生物合成二酰基甘油(diacylglycerol、以下有时记为 “DG”。)的反应，由磷脂酸磷酸酶(E.C.3.1.3.4、phosphatidic acid phosphatase、以下有时记为“PAP”。)催化。已知此PAP存在于细菌到脊椎动物的所有的生物中。此外，在菌类中，PAP是生物合成以PA为贮藏脂质的三酰基甘油的关键酶。 

已知为真菌类的酵母的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中，有2种类型的PAP(非专利文献1)。一个是Mg²⁺依赖性PAP(PAP1)，另一个是Mg²⁺非依赖性PAP(PAP2)。作为编码前者的基因已知有PAH1基因，但因pah1Δ突变株具有PAP1活性，所以认为还有其他具有PAP1活性的基因。另外，已知编码后者的基因有DPP1基因和LPP1基因，这些在酵母中几乎都具有PAP2活性。已知这些基因编码的酶的底物特异性广泛，与二酰基甘油焦磷酸盐(DGPP)、溶血磷脂酸、鞘氨基醇碱基磷酸酯(sphingoid base phosphate)、phosphate)等均起作用、脱磷酸化。 

在其他的菌类中也确认了这些同源物的存在，但还没有关于其功能的报道。 

已知脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)中，微粒体组分具有PAP活性(非专利文献2)。 

非专利文献1 Trends Biochem.Sci.，31(12)，694-699，2006 

非专利文献2 Biochemical Society Transactions，28，707-709，2000 

发明内容

但是，至今为止已报道的PAP基因，均未对导入宿主细胞中使其表达时使该宿主产生的脂肪酸组合物的脂肪酸组成发生变化这一点进行过研究。所以希望通过导入宿主细胞中或使其表达，鉴定出可制造目的脂肪酸组成的油脂或增加目的脂肪酸含量的新型基因。 

本发明的目的是提供：通过在宿主细胞内表达或导入，可制造具有目的脂肪酸组成的油脂、或增加目的脂肪酸含量的蛋白质及核酸。 

本发明者为了解决上述课题进行了精心研究，首先进行脂质生产菌高山被孢霉(Mortierella alpina)的EST分析，从中提取出与已知PAP基因同一性高的序列。进而为了获得编码PAP的开放阅读框(ORF)的全长，进行cDNA文库筛选或通过PCR克隆基因。将该基因导入酵母等具有高增殖力的宿主细胞内，以试验产生期望脂肪酸组合物的发明者，成功克隆出可生成与未导入该基因的宿主所产生的脂肪酸组合物相比不同的脂肪酸组合物的新型PAP相关的基因，从而完成了本发明。即本发明如下所述。 

(1)核酸，其包含以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列： 

(a)碱基序列，其编码由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质； 

(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质； 

(c)碱基序列，其由与序列号4所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质； 

(d)碱基序列，其编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质； 

(e)碱基序列，其与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质。 

(2)(1)中所述的核酸，其包含以下(a)～(c)中任一项的碱基序列： 

(a)碱基序列，其编码由序列号2所示的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质； 

(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质； 

(c)碱基序列，其编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有磷脂酸磷酸酶活性的蛋白质。 

(3)核酸，其包含以下(a)～(c)中任一项所述的碱基序列或其片段： 

(a)碱基序列，其如序列号4所示； 

(b)碱基序列，其编码由序列号2所示氨基酸序列组成的蛋白质； 

(c)碱基序列，其如序列号1所示。 

(4)核酸，其包含以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列： 

(a)碱基序列，其编码以下蛋白质， 

该蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码以下蛋白质， 

该蛋白质具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

(c)碱基序列，其由与序列号4所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成，且编码以下蛋白质， 

该蛋白质具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

(d)碱基序列，其编码以下蛋白质， 

该蛋白质由与序列号2所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述 蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率。 

(e)碱基序列，其与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码以下蛋白质， 

该蛋白质具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率。 

(5)(4)中所述的核酸，其包含以下(a)～(c)中任一项的碱基序列： 

(a)碱基序列，其编码以下蛋白质， 

该蛋白质由序列号2所示的氨基酸序列中1～10个的氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码以下蛋白质， 

该蛋白质具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

(c)碱基序列，其编码以下蛋白质， 

该蛋白质由与序列号2所组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在所述蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率。 

(6)蛋白质，其为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质： 

(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有磷脂酸磷酸酶活性； 

(b)蛋白质，其是由与序列号2所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有磷脂酸磷酸酶活性。 

(7)蛋白质，其为以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质： 

(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有可形成在由所述氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～ vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

(b)蛋白质，其由与序列号2所组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成，且具有可形成在由所述氨基酸序列组成的蛋白质已表达的宿主的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上与所述蛋白质未表达的宿主的脂肪酸组成相比为高比率的脂肪酸组成的活性： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率。 

(8)蛋白质，其由序列号2所示的氨基酸序列组成。 

(9)重组载体，其含有(1)～(5)中任一项所述的核酸。 

(10)转化体，其通过(9)中所述的重组载体转化。 

(11)脂肪酸组合物，其是培养(10)中所述的转化体而得到的脂肪酸组合物，其特征在于，上述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中至少1项以上均比培养未用(9)的重组载体转化的宿主而得到的培养物的所述比率高： 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率。 

(12)脂肪酸组合物的制造方法，所述脂肪酸组合物是(11)所述的脂肪酸组合物，其特征在于，从培养(10)中所述的转化体而得到的培养物中，提取所述的脂肪酸组合物。 

(13)食品，其含有(11)中所述的脂肪酸组合物。 

本发明的PAP可在宿主中产生与未导入PAP的宿主产生的脂肪酸组合物相比，组成不同的脂肪酸组合物。由此可提供具有所期望特性、效果的脂质，所以，可有效适用于食品、化妆料、医药品、肥皂等。 

此外，因本发明的PAP可提高脂肪酸、储存脂质的生产能力，所以，优选用作为提高微生物、植物中多不饱和脂肪酸的生产能力的酶。 

附图说明

图1表示本发明的MaPAP1的cDNA序列和推定氨基酸序列。 

图2表示MaPAP1p的推定氨基酸序列(序列号2)与PAP2家族蛋白质的氨基酸序列的比对。图中用双下线表示的3个部分表示PAP2家族酶的保守区域，*表示PAP活性必需氨基酸残基。 

具体实施方式

本发明涉及以将磷脂酸脱磷酸化而生成二酰基甘油为特征的、来自被孢霉属(Mortierella)的新型磷脂酸磷酸酶基因。 

本发明的磷脂酸磷酸酶(PAP)是催化磷脂酸脱磷酸化而生成二酰基甘油的反应的酶。本发明的PAP的底物通常是磷脂酸，但不限于此。 

编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸

本发明的磷脂酸磷酸酶(PAP)中包含MaPAP1。将编码MaPAP1的核酸的cDNA、CDS、ORF以及氨基酸序列的对应关系整理记载于以下表1内。 

表1 

也就是说，作为与本发明的PAP相关的序列，可例举MaPAP1的氨基酸序列的序列号2、表示MaPAP1的ORF区域序列的序列号4、表示其CDS区域序列的序列号3、以及其cDNA的碱基序列的序列号1。其中，序列号3相当于序列号1的第105～1223位碱基序列，序列号4相当于序列号1的第105～1220位碱基序列、以及序列号3的第1～1116位碱基序列。 

本发明的核酸，除单链及双链的DNA外，还包含其RNA互补体，可来自天然，也可人工制备。DNA中，例如可例举为基因组DNA、与上述基因组DNA对应的cDNA、化学合成的DNA、通过PCR扩增的DNA及这些的组合、DNA和RNA的杂交体，但不限于此。 

作为本发明的核酸的优选方式，可例举(a)序列号4所示的碱基序列、(b)编码由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号1所示的碱基序列等。 

序列号4所示的碱基序列及编码由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列以及序列号1所示的碱基序列，如表1中记载。 

为获得上述碱基序列，也可从具有PAP活性的生物的EST、基因组DNA的碱基序列数据中检索到编码与已知的具有PAP活性的蛋白质同一性高的蛋白质的碱基序列。具有PAP活性的生物，优选脂质生产菌，脂质生产菌可为高山被孢霉(M.alpina)，但不限于此。 

进行EST分析时，首先构建cDNA文库。cDNA文库的构建方法，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》[Cold Spring Harbor Press(2001)]。且可使用市售的cDNA文库构建试剂盒。适用于本发明的cDNA文库的构建方法，例如可例举为如下方法。即将脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)的适合的菌株接种于适合的培养基中，进行适当时间的预培养。适于此预培养的培养条件，例如、培养基组成为1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0，培养时间为3天，培养温度为28℃的条件。而后，将预培养物用适当的条件进行本培养。适于本培养的培养基组成，例如可例举为1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、 0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H₂O、pH6.0。适于本培养的培养条件，例如可例举为300rpm、1vvm、26℃下通气搅拌培养8天的条件。培养期间可添加适量的葡萄糖。本培养中适时采集培养物，从中回收菌体，制备总RNA。总RNA的制备中，可使用盐酸胍/CsCl法等公知的方法。可从所得到的总RNA中使用市售的试剂盒纯化poly(A) ⁺RNA。且还可使用市售的试剂盒构建cDNA文库。而后，将构建的cDNA文库的任意克隆的碱基序列，使用为可确定载体上插入部分的碱基序列而设计的引物来确定，可得到EST。例如，用ZAP-cDNA GigapackIII Gold Cloning Kit(STRATAGENE)构建cDNA文库时，可进行定向克隆。 

对本发明的MaPAP1的基因进行BLASTX分析，结果与编码E-value最低、即同一性最高的来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的二酰基甘油焦磷酸盐磷酸酶(DDP1)同源物(注册号：No.CAD70721)的碱基序列的同一性为57.4％，且与其氨基酸序列的同一性为59.3％。 

本发明还包括如下核酸，其与包含上述序列号4所示的碱基序列(有时记为“本发明的碱基序列”)、以及编码由序列号2所示的氨基酸序列(有时记为“本发明的氨基酸序列”)组成的蛋白质的碱基序列的核酸具有同等功能。“具有同等功能”，是指本发明的碱基序列编码的蛋白质及由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质具有PAP活性之意。此外，不仅具有上述PAP活性，还包括具有如下活性的蛋白质，该活性为可形成在本发明碱基序列编码的蛋白质、或由本发明的氨基酸序列组成的蛋白质表达的宿主的脂肪酸组成中，以下 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

中至少一项以上与未表达上述蛋白质的宿主的脂肪酸组成相比均为高比率的脂肪酸组成的活性(以下有时也为“具有可形成本发明的PAP的脂肪酸组成的活性的蛋白质”)。 

具体地说，为包含编码具有如下活性的蛋白质的碱基序列的核酸，该活性为可形成满足：将上述本发明的碱基序列等插入表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)后，使其以酵母中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15 株(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)为宿主转化，将培养所得到的转化体后回收的菌体用以下实施例6等中所述的方法进行脂肪酸分析时的上述本发明的PAP的脂肪酸组成，具体如以下 

i)油酸含量为46％以上，优选48％以上、50％以上、52％以上、54％以上； 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率为7.0以上，优选8.0以上、8.5以上； 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率为7.5以上，优选8.0以上、10.0以上、12.0以上、13.0以上； 

iv)硬脂酸及油酸的含量相对于棕榈酸含量的比率为8.0以上，优选10.0以上、12.0以上、14.0以上、14.5以上； 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率为1.1以上，优选1.2以上、1.3以上、1.4以上；以及 

vi)花生四烯酸的含有率为0.45以上，优选0.50以上、0.53以上、0.55以上，二高-γ-亚麻酸的含有率为0.34以上，优选0.40以上、0.42以上、0.45以上、及/或γ-亚麻酸的含有率为0.55以上，优选0.65以上、0.67以上、0.70以上、0.75以上(上述数值为在花生四烯酸产生酵母中使本发明的PAP基因表达时占总脂肪酸的比率。) 

中至少一个以上的数值的脂肪酸组成的活性。进一步优选，本发明的碱基序列等是包含编码具有PAP活性及可形成上述本发明的PAP脂肪酸组成的活性的蛋白质的碱基序列的核酸。 

本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可例举花生四烯酸含有率高。花生四烯酸是用化学式C₂₀H₃₂O₂表示、分子量为304.47的物质，是由含有4个双键的20个碳原子的碳链组成的羧酸(〔20:4(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。花生四烯酸作为动物细胞膜中重要的磷脂(特别是磷脂酰乙醇胺·磷脂酰胆碱·磷脂酰肌醇)存在，大量存在于脑中。且花生四烯酸为通过花生四烯酸级联反应生成的前列腺素·血栓素·白三烯等一系列的类二十烷酸的起始物质，在细胞间的信号传递中作为第二信使也很重要。另一方面，花生四烯酸是动物以亚油酸为原料在体内合成的。但是，由于动物的种或年龄等不同、或者因此功能不充分而不能生产必需的量、或者完全没有生产功能，所以，必须从食物中摄取花生四烯酸，可以说花生四烯酸是必须脂肪酸。 

本发明的脂肪酸组合物中的花生四烯酸含有率，例如可如下测定。即将本发明的PAP的质粒，例如通过实施例8中所述的方法插入到pDuraSC、pDura5MCS等的载体中，转化到高山 被孢霉(M.alpina)株，使得到的转化体表达，使用根据实施例8中所述的培养方法等得到的培养菌体，测定菌体内的脂肪酸含有率、单位培养基中的花生四烯酸含量等的方法。花生四烯酸含量等的分析方法，例如，是将所得到的培养菌体的脂肪酸通过盐酸甲醇法衍生为脂肪酸甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析的方法。由此表明，使本发明的PAP转化到高山被孢霉(M.alpina)后，菌体内的脂肪酸含有率、单位培养基中的花生四烯酸生产量均高。因此，因花生四烯酸含有率高的本发明的脂肪酸组合物可有助于高效摄取花生四烯酸，所以优选。 

此外，本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可例举二高-γ-亚麻酸含有率高。二高-γ-亚麻酸(DGLA)是用化学式C₂₀H₃₄O₂表示，分子量为306.48的物质，是由含有3个双键的20个碳原子的碳链组成的羧酸(〔20:3(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。DGLA通过γ-亚麻酸(18:3(n-6))延长而得到。DGLA的双键增加1个可生成花生四烯酸。 

并且，本发明的脂肪酸组合物的特征之一，可例举为γ-亚麻酸含有率高。γ-亚麻酸是用化学式C₁₈H₃₀O₂表示的、分子量为278.436的物质，是由含有3个双键的18个碳原子的碳链组成的羧酸(〔18:3(n-6)〕)，被分类为(n-6)系。人类以亚油酸(〔18:2(n-6)〕)为原料，可通过Δ6去饱和酶进行脱氢反应而产生γ-亚麻酸，但大部分从食物中摄取。 

此种与本发明的核酸具有同等功能的核酸，可例举为包含以下(a)～(e)中任一项所述的碱基序列的核酸。且以下所例举的碱基序列的记载中，“本发明的上述活性”，是指上述的“PAP活性及/或可形成上述本发明的PAP的脂肪酸组成的活性”。 

(a)碱基序列，其编码由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质。 

本发明的核酸中所包含的碱基序列，包含编码由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。 

具体地说，为编码以下氨基酸序列组成的、且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列： 

(i)序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个[优选1个或多个(例如1～110个、1～100个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]的氨基酸发生缺失的氨基酸序列， 

(ii)序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个[优选1个或多个(例如1～110个、1～100个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]的氨基酸由其他氨基酸取代的氨基酸序列， 

(iii)序列号2所示的氨基酸序列中附加1个或多个[优选1个或多个(例如1～110个、1～100个、1～75个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]其他氨基酸的氨基酸序列，或 

(iv)组合上述(i)～(iii)的氨基酸序列。 

上述中，取代优选为保守性取代。保守性取代，是指将特定的氨基酸残基用具有类似的物理化学特征的残基取代，但只要不实质性改变与原本序列的结构有关的特征，可为任何取代，例如，只要取代氨基酸不破坏原本序列中存在的螺旋结构，或不破坏赋予原本序列特征的其他种类的二级结构，可为任何取代。 

保守性取代，一般可用生物学体系合成、化学肽合成导入，但优选通过化学肽合成来进行。此时，取代基中可包含非天然的氨基酸残基，也可包含肽模仿物、氨基酸序列中未被取代的区域发生倒位的倒位型或同区域发生反转的反转型。 

以下，将氨基酸残基按可取代的残基分类举例，但可取代的氨基酸残基不限于以下记载的残基： 

A组：亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、O-甲基丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸及环己基丙氨酸； 

B组：天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、异谷氨酸、2-氨基己二酸及2-氨基辛二酸； 

C组：天冬酰胺及谷氨酰胺； 

D组：赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、2，4-二氨基丁酸及2，3-二氨基丙酸； 

E组：脯氨酸、3-羟基脯氨酸及4-羟基脯氨酸； 

F组：丝氨酸、苏氨酸及高丝氨酸； 

G组：苯丙氨酸及酪氨酸。 

为非保守性取代时，上述种类中的某一种成分可与其他种类的成分互换，此时，为保持本发明的蛋白质的生物学功能，优选参考氨基酸的亲水指数(亲水性氨基酸指数)[Kyte等，J.Mol.Biol.，157：105-131(1982)]。 

此外，为非保守性取代时，可根据亲水性进行氨基酸的取代。 

本说明书及附图中，碱基、氨基酸及其缩写，可根据IUPAC-IUB Commission onBiochemical Nomenclature、或例如Immunology--A Synthesis[第2版，E.S.Golub及D.R.Gren监修，Sinauer Associates，Sunderland，Massachusetts(1991)]等中记载的本领域惯用的缩写。此外，氨基酸有光学异构体时，在无特别说明的情况下，均表示L体。 

D-氨基酸等上述氨基酸的立体异构体、α，α-二取代氨基酸等的非天然氨基酸、N-烷基氨基酸、乳酸及其他非惯用氨基酸，也可作为构成本发明的蛋白质的要素。 

且本说明书中使用的蛋白质的标记法，根据标准用法及本领域中常用的标记法，左方向为氨基末端方向，右方向为羧基末端方向。 

同样，在一般情况下不特别提及时，单链多核苷酸序列的左端为5’端，双链多核苷酸序列的左方向为5’方向。 

只要是本领域技术人员，使用本领域中公知的技术，即可设计、制备本说明书中所述的蛋白质的适当的突变体。例如，通过将对本发明蛋白质的生物学活性并不太重要的区域作为靶区，可鉴定不损坏本发明的蛋白质的生物学活性而可使其结构改变的蛋白质分子中适当的区域。且也可鉴定在类似的蛋白质间保守的分子的残基及区域。并且，在认为对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要的区域中，在不损坏其生物学活性且不给予蛋白质的多肽结构以不良影响的情况下，也可导入保守性氨基酸取代。特别是本发明中，如图2中用双下线表示，本发明的MaPAP1的氨基酸序列(序列号2)中的第146～154残基、第202～205残基、及第260～264残基中，存在Mg²⁺非依赖性磷脂酸磷酸酶2型(PAP2)家族酶的3个保守区域。PAP2家族酶的3个保守区域中，结构域1的精氨酸、结构域2及3的组氨酸作为活性必需的氨基酸而已知，即使在本发明的MaPAP1中，该氨基酸也分别作为序列号2的第153残基的精氨酸、第205残基的组氨酸及第260残基的组氨酸而被保留。上述保守区域是PAP2家族酶所必须的区域，对本发明的PAP来说是重要的区域。因此，本发明的突变体只要保留上述保守区域，可为任何突变体。 

只要是本领域技术人员，均可鉴定对本发明蛋白质的生物学活性或结构重要、与该蛋白质的肽类似的肽的残基，比较此2种肽的氨基酸残基，预测出与本发明蛋白质类似的蛋白质的哪个残基是与对生物学活性或结构重要的氨基酸残基对应的氨基酸残基，即可进行所谓的结构-功能研究。并且，通过选择与上述预测的氨基酸残基的化学性质类似的氨基酸取代，可选择保持了本发明蛋白质的生物学活性的突变体。且如果是本领域技术人员，即可对本蛋白 质突变体的三维结构及氨基酸序列进行分析。进而从所得到的分析结果来看，也可预测与蛋白质的三维结构有关的氨基酸残基的比对。预测为蛋白质表面上存在的氨基酸残基，具有参与和其它分子的重要的相互作用的可能性，因此，如果是本领域技术人员，即可基于上述分析结果，制备不使预测为在此种蛋白质表面上存在的氨基酸残基发生改变的突变体。并且如果是本领域技术人员，即可制备构成本发明蛋白质的各个氨基酸残基中，只有一个氨基酸残基发生取代的突变体。通过公知的检测方法筛选此种突变体，即可收集各个突变体的信息。由此，通过对某种特定的氨基酸残基发生取代的突变体的生物学活性与本发明蛋白质的生物学活性相比降低时、不表现此种生物学活性时、或产生抑制本蛋白质生物学活性的不适当活性时进行比较，可评价构成本发明蛋白质的种种氨基酸残基的有用性。此外，只要是本领域技术人员，可根据此种从日常实验中收集的信息，单独或与其他突变组合，从而容易地分析作为本发明蛋白质的突变体的不期望的氨基酸取代。 

如上所述，由序列号2所示的氨基酸序列中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列组成的蛋白质，可通过《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》[Cold Spring Harbor Press(2001)]、《Current Protocols in Molecular Biology》[JohnWiley & Sons(1987-1997)、Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-92、Kunkel(1988)Method.Enzymol.85：2763-6]等中所述的定点诱变法等制备。发生了此种氨基酸的缺失、取代或附加等突变的突变体的制备，例如可通过Kunkel法、Gapped duplex法等公知手法，使用利用了定点诱变法的突变引入用试剂盒、例如QuikChange^TM Site-DirectedMutagenesis Kit(Stratagene公司制)、GeneTailor^TM Site-Directed Mutagenesis System(Invitrogen公司制)、TaKaRa Site-Directed Mutagenesis System(Mutan-K、Mutan-SuperExpress Km等：TAKARA BIO公司制)等进行。 

且作为在蛋白质的氨基酸序列中，既保持了其活性同时又引入1个或多个氨基酸的缺失、取代、或附加的方法，可例举为除上述定点诱变以外，还可为用诱变剂处理基因的方法、及使基因选择性断裂将选择的核苷酸除去、取代或附加后进行连接的方法。 

本发明的核酸中所包含的碱基序列，优选为编码由序列号2所示的氨基酸序列中1～10个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。 

此外，本发明的核酸中所包含的碱基序列中，也优选包含编码由序列号2中1～10个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基 序列。 

本发明蛋白质中的氨基酸突变或修饰的数量、或突变或修饰的位点，只要保持PAP活性、或本发明的可形成PAP的脂肪酸组成的活性，无限制。 

本发明的PAP活性、或本发明的可形成PAP的脂肪酸组成的活性，可使用公知的方法测定。例如，可参照以下的文献：J.Biol.Chem.，273，14331-14338(1998)。 

例如，本发明的“PAP活性”可如下测定。从使本发明的PAP表达的酵母中，通过J.Bacteriology，173，2026-2034(1991)中所述的方法等制备微粒体组分。而后可在反应液的0.5mM磷脂酸、10mM 2-巯基乙醇、50mM Tris-HCl(pH7.5)中添加上述微粒体组分，使其在28℃下反应适当的时间，添加氯仿∶甲醇使反应停止后，进行脂质的提取，将所得到的脂质通过薄层色谱法等分离，从而对生成的二酰基甘油量进行定量。 

此外，本发明的“可形成PAP的脂肪酸组成的活性”例如可如下测定。在通过本发明的脂肪酸组合物的制造方法得到的冷冻干燥的菌体中，添加以适当比率调整的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当的时间。进一步通过离心分离分离菌体，回收溶剂，多次重复此操作。然后使用适当的方法使脂质干固后，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。适量分取此样品，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析。 

(b)碱基序列，其与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。 

本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。序列号4及有关PAP活性如上所述。 

上述碱基序列，用本领域技术人员公知的方法，使用适当的片段制备探针，使用此探针通过菌落杂交法、噬菌斑杂交、Southern印迹法等公知的杂交法，可从cDNA文库及基因组文库等中获得。 

对于杂交法的详细步骤，可参照《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》[Cold Spring Harbor Press(2001)；特别是Section 6-7]、《Current Protocols in MolecularBiology》[John Wiley & Sons(1987-1997)；特别是Section6.3-6.4]、《DNA Cloning 1：CoreTechniques，A Practical Approach 2nd ed.》[Oxford University(1995)；杂交条件特别 参照Section2.10]等。 

杂交条件的强度，主要由杂交条件、更优选由杂交条件及洗涤条件决定。在本说明书中“严格条件”包括中度或高度严格条件。 

具体来说，作为中度严格条件，例如杂交条件，可例举1×SSC～6×SSC、42℃～55℃的条件，更优选1×SSC～3×SSC、45℃～50℃的条件，最优选2×SSC、50℃的条件。杂交溶液中例如含有约50％甲酰胺时，采用比上述温度低5至15℃的温度。作为洗涤条件，可例举0.5×SSC～6×SSC、40℃～60℃。在杂交及洗涤时，通常可加入0.05％～0.2％SDS、优选约0.1％SDS。 

作为高度严格(高严格)的条件，包括在比中度严格条件高的温度及/或低的盐浓度下的杂交及/或洗涤。例如杂交条件，可例举0.1×SSC～2×SSC、55℃～65℃的条件，更优选0.1×SSC～1×SSC、60℃～65℃的条件，最优选0.2×SSC、63℃的条件。作为洗涤条件，可例举0.2×SSC～2×SSC、50℃～68℃，更优选0.2×SSC、60～65℃。 

特别是作为本发明使用的杂交条件，例如可例举：在5×SSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)及50％甲酰胺中在42℃的条件下，进行预杂交后，添加探针，在42℃保温过夜形成杂交体，然后在0.2×SSC、0.1％SDS中在65℃下进行3次20分钟的洗涤的条件。但并不限于此条件。 

此外，也可使用探针中未使用放射性物质的市售的杂交试剂盒。具体地说，可例举为使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)、ECL direct labeling&detection system(Amersham公司制)进行的杂交等。 

作为本发明含有的碱基序列，优选与由序列号4所组成的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在2×SSC、50℃的条件下杂交，且编码具有PAP活性的蛋白质的碱基序列。 

(c)碱基序列，其由与序列号4所组成的碱基序列有70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。 

本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含由与序列号4中所示的核酸序列有至少70％以上同一性的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。 

本发明中优选包含具有与序列号4所示的核酸序列有至少75％以上、进一步优选80％(例如85％以上、更优选90％、进一步优选95％、98％或99％)同一性的碱基序列的核酸，且可为编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。 

2个核酸序列的同一性％，可通过视觉检查、数学计算来确定，但优选使用计算机程序、 通过比较2组核酸的序列信息来确定。序列比较计算机程序，例如可利用美国国立医学图书馆的网站：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bls.html的BLASTN程序(Altschulet al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10)：2.2.7版或WU-BLAST2.0算法等。关于WU-BLAST2.0的标准默认参数的设定，可使用以下网站：http://blast.wustl.edu中所记载的内容。 

(d)碱基序列，其编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。 

本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含编码与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。本发明的核酸编码的蛋白质，只要与具有本发明的上述活性的蛋白质有同等功能，也可以是与MaPAP1的氨基酸序列有同一性的蛋白质。 

具体地说，可例举与序列号2所示的氨基酸序列有75％以上、优选80％以上、更优选85％、进一步优选90％(例如95％、进一步为98％)以上的同一性的氨基酸序列等。 

本发明的核酸中所含有的碱基序列，优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有90％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。进一步优选为编码与由序列号2组成的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。 

2段氨基酸序列的同一性的百分率，可通过视觉检查、数学计算确定。此外，也可使用计算机程序来确定同一性百分率。此种计算机程序，例如可例举为BLAST、FASTA[Altschul等、J.Mol.Biol.，215：403-410(1990)]、及ClustalW等。特别是通过BLAST程序的同一性检索的各种条件(参数)，已由Altschul等(Nucl.Acids.Res.，25，p.3389-3402，1997)做了记载，可从美国生物技术信息中心(NCBI)、日本DNA数据库(DDBJ)的网站上公开获得(BLAST指南、Altschul等NCB/NLM/NIH Bethesda，MD 20894；Altschul等)。且可使用遗传信息处理软件GENETYX Ver.7(GENETYX)、DINASIS Pro(日立软件)、Vector NTI(Infomax)等的程序来确定。 

使多个氨基酸序列并列的特定的比对图，也可显示序列中特定的短的区域的匹配，所以，即使使用的序列的全长序列间无显著相关时，也可在此种区域中检测出特定的序列同一性非常高的区域。且BLAST算法可使用BLOSUM62氨基酸打分矩阵，作为选择参数可使用如下所示 的内容：(A)包括将具有低组成复杂性的查询序列的片段[由Wootton及Federhen的SEG程序(Computers and Chemistry，1993)确定；也希望参照Wootton及Federhen，1996《序列数据库中组成偏向性区域的分析》(Analysis of compositionally biased regions in sequencedatabases)Methods Enzymol.266：544-71]、或由短周期性的内部重复组成的片段[由Claverie及States(Computers and Chemistry，1993)的XNU程序确定)]用于屏蔽的过滤，及(B)根据用于报告对数据库序列的一致性的统计学上的显著性阈值、或根据E-score(Karlin及Altschul，1990)的统计学模型，仅偶然发现的一致性的期望概率；源于某种一致性的统计学的显著差异比E-score阈值大时，不报告此一致性。 

(e)碱基序列，其与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质。 

本发明的核酸中所含有的碱基序列，包含与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。 

由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质及杂交条件如上所述。本发明的核酸中所含有的碱基序列，可例举为与由编码序列号2所示的氨基酸序列所组成的蛋白质的碱基序列的互补碱基序列组成的核酸在严格条件下杂交，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。 

本发明的核酸中还包含如下核酸，其包含由序列号4所组成的碱基序列中1个或多个碱基发生缺失、取代或附加的碱基序列组成，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列。具体地说，也可使用包含如下碱基序列，且编码具有本发明的上述活性的蛋白质的碱基序列的核酸： 

(i)序列号4所示的碱基序列中1个或多个[优选1个或多个(例如1～330个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]的碱基发生缺失的碱基序列， 

(ii)序列号4所示的碱基序列中1个或多个[优选1个或多个(例如1～330个、1～300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]的碱基被其他碱基取代的碱基序列， 

(iii)序列号4所示的碱基序列中附加1个或多个[优选1个或多个(例如1～330个、1～ 300个、1～250个、1～200个、1～150个、1～100个、1～50个、1～30个、1～25个、1～20个、1～15个、1～10个、进一步优选1～5个)]其他碱基的碱基序列，或 

(iv)组合了上述(i)～(iii)的碱基序列。 

作为本发明的核酸的优选方式，也含有包含以下(a)～(c)中任一项所述的碱基序列的片段的核酸： 

(a)序列号4所示的碱基序列， 

(b)编码由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列， 

(c)序列号1所示的碱基序列。 

对于(a)序列号4所示的碱基序列、(b)编码由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的碱基序列、(c)序列号1所示的碱基序列，如表1中所记载。上述序列的片段，包含上述碱基序列中含有的ORF、CDS、具有生物学活性的区域、作为以下记载的引物使用的区域、可作为探针的区域，可来自天然，也可由人工制作。 

本发明的磷脂酸磷酸酶蛋白质

本发明的蛋白质，包含由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质及与所述蛋白质具有同等功能的蛋白质，可来自天然，也可人工制备。对于由序列号2所示的氨基酸序列组成的蛋白质，如上所述。“具有同等功能的蛋白质”，指如上述“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”的项目中说明的具有“本发明的上述活性”的蛋白质。 

在本发明中，作为与由序列号2表示的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质，可例举以下(a)或(b)中任一项所述的蛋白质： 

(a)蛋白质，其由序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加后的氨基酸序列组成，且具有本发明的上述活性， 

(b)蛋白质，其是由与序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列组成的蛋白质，且具有本发明的上述活性。 

上述中，对于序列号2中1个或多个氨基酸发生缺失、取代或附加的氨基酸序列、或与由序列号2组成的氨基酸序列有70％以上同一性的氨基酸序列，如上述“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”的项目中的说明。且上述“具有本发明的上述活性的蛋白质”，还包括由包含序列号4的碱基序列的核酸编码的蛋白质的突变体、或序列号2所示的氨基酸序列中通过1个或多个氨基酸发生取代、缺失或附加等的多种修饰而产生突变的蛋白质、或氨基酸侧 链等被修饰的修饰蛋白质、与其他蛋白质融合的蛋白质，且是具有PAP活性的蛋白质及/或具有可形成本发明的PAP脂肪酸组成活性的蛋白质。 

另外，本发明的蛋白质也可人工制备，此时可通过Fmoc法(9-芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基法)等的化学合成法制造。也可利用Advanced Chem Tech公司制、珀金埃尔默(Perkin Elmer)公司制、Pharmacia公司制、Protein Technology Instruments公司制、Synthecell-Vega公司制、PerSeptive公司制、岛津制作所制等的肽合成仪进行化学合成。 

PAP的核酸的克隆

本发明的PAP的核酸，例如可通过使用适合的探针从cDNA文库中筛选来进行克隆。且可使用适合的引物通过PCR反应扩增，通过与适合的载体连接来进行克隆。并且也可亚克隆到其他载体中。 

例如也可使用pBlue-Script^TM SK(+)(Stratagene)、pGEM-T(Promega)、pAmp(TM：Gibco-BRL)、p-Direct(Clontech)、pCR2.1-TOPO(Invitrogene)等市售的质粒载体。且用PCR反应扩增时，引物可使用上述序列号1所示的碱基序列的任何部分，例如对于序列号1，可使用 

上游侧引物D-1：5’-CATGGGTTGCTTCGCGCGCAAGACG-3’(序列号5)、 

下游侧引物D-2：5’-CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTC-3’(序列号6)等。 

且在从高山被孢霉(M.alpina)菌体中制备的cDNA中，使上述引物及DNA聚合酶等起作用而进行PCR反应。上述方法根据《Molecular Cloning，A Laboratory Manual 3rd ed.》[ColdSpring Harbor Press(2001)]等，只要是本领域技术人员均可容易地进行，作为本发明的PCR反应条件，例如可例举为以下条件： 

变性温度：90～95℃ 

退火温度：40～60℃ 

延伸温度：60～75℃ 

循环数：10次以上 

所得到的PCR产物的纯化可使用公知的方法。例如使用GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquickPCR purification Kits(QIAGEN)、ExoSAP-IT(GE Healthcare Bio-Sciences)等试剂盒的方法、使用DEAE-纤维素滤纸的方法、使用透析管的方法等。使用琼脂糖凝胶时，可进行琼脂糖凝胶电泳，将碱基序列片段从琼脂糖凝胶切出，通过GENECLEAN(Funakoshi)、QIAquick Gel extraction Kits(QIAGEN)、Freeze & Squeeze法等纯化。 

克隆后的核酸的碱基序列，可使用碱基序列测序仪来确定。 

PAP表达用载体构建及转化体的制备

本发明还提供含有编码本发明的PAP的核酸的重组载体。本发明还进一步提供由上述重组载体转化的转化体。 

此种重组载体及转化体可如下获得。即将具有编码本发明的PAP的核酸的质粒用限制性内切酶酶切。使用的限制性内切酶，例如可例举为EcoRI、KpnI、BamHI及SalI等，但不限于此。且也可通过T4聚合酶处理将末端平滑化。将酶切后的碱基序列片段通过琼脂糖凝胶电泳纯化。将此碱基序列片段通过使用公知的方法整合进表达用载体，可得到PAP表达用载体。将此表达载体导入宿主制备转化体，用于目的蛋白质的表达。 

此时，表达载体及宿主只要可表达目的蛋白质，无特别限定，例如宿主可例举真菌、细菌、植物、动物或它们的细胞等。真菌，可例举为脂质生产菌高山被孢霉(M.alpina)等的丝状菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的酵母等。且细菌，可例举大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。而植物可例举菜籽、大豆、棉花、红花、亚麻等的油料作物。 

脂质生产菌例如可使用MYCOTAXON，Vol.XLIV，No.2，pp.257-265(1992)中记载的菌株，具体地说，可例举为属于被孢霉属(Mortierella)的微生物，例如长孢被孢霉(Mortierellaelongata)IFO8570、微小被孢霉(Mortierella exigua)IFO8571、Mortierella hygrophilaIFO5941、高山被孢霉(Mortierella alpina)IFO8568、ATCC16266、ATCC32221、ATCC42430、CBS219.35、CBS224.37、CBS250.53、CBS343.66、CBS527.72、CBS528.72、CBS529.72、CBS608.70、CBS754.68等属于被孢霉亚属(subgenus Mortierella)的微生物，或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)CBS194.28、IFO6336、IFO7824、IFO7873、IFO7874、IFO8286、IFO8308、IFO7884、Mortierella nana IFO8190、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)IFO5426、IFO8186、CBS112.08、CBS212.72、IFO7825、IFO8184、IFO8185、IFO8287、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)CBS236.82等的属于Micromucor亚属(subgenusMicromucor)的微生物等。尤其优选高山被孢霉(Mortierella alpina)。 

以真菌类为宿主使用时，优选本发明的核酸在宿主中可自主复制、或者是可插入该菌的染色体上的结构。与此同时，优选是含有启动子、终止子的组成。使用高山被孢霉(M.alpina) 为宿主时，表达载体，例如可例举pD4、pDuraSC、pDura5等。作为启动子，只要可在宿主中表达，可使用任何启动子，例如可使用histonH4.1基因启动子、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)基因启动子、TEF翻译延伸因子(Translation elongation factor)基因启动子的来自高山被孢霉(M.alpina)的启动子。 

向高山被孢霉(M.alpina)等丝状菌内导入重组载体的方法，例如可例举为电穿孔法、原生质球法、基因枪轰击法及向核内DNA直接显微注射法等。使用营养缺陷型的宿主株时，通过选择在缺少其营养素的选择培养基上生长繁殖的菌株，可获得转化株。此外，转化使用抗药性标记基因时，在包含其药剂的选择培养基上培养，可得到具有抗药性的细胞菌落。 

以酵母为宿主使用时，作为表达载体，例如可例举pYE22m等。且也可使用pYES(Invitrogen)、pESC(STRATAGENE)等市售的酵母表达用载体。另外，适用于本发明的宿主可例举酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)EH13-15株(trp1，MATα)等，但不限于此。作为启动子，例如可使用GAPDH启动子、gal1启动子、gal10启动子等来自酵母等的启动子。 

向酵母内导入重组载体的方法，例如可例举醋酸锂法、电穿孔法、原生质球法、葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、脂质体中的多核苷酸(单数或多数)的包裹、及向核内直接显微注射DNA等。 

以大肠杆菌等的细菌为宿主使用时，作为表达载体，例如可例举Pharmacia公司的pGEX、pUC18等。启动子，例如可使用trp启动子、lac启动子、PL启动子、PR启动子等来自大肠杆菌、噬菌体等的启动子。向细菌内导入重组载体的方法，例如可使用电穿孔法、氯化钙法。 

本发明的脂肪酸组合物的制造方法

本发明提供从上述转化体中制造脂肪酸组合物的方法。即：培养上述转化体，从获得的培养物中制造脂肪酸组合物的方法。具体可用以下方法制造。但是，对于本制造方法来说，并不限于该方法，可采用通常公知的其他方法进行。 

用于培养使PAP表达的生物的培养基，只要是具有适当的pH及渗透压，含有各宿主增殖所必需的营养素、微量成分、血清、抗生素等生物材料的培养液(培养基)，可使用任意的培养液。例如转化酵母使PAP表达时，可使用SC-Trp培养基、YPD培养基、YPD5培养基等，但并不限于这些。作为具体的培养基的组成，以SC-Trp培养基为例：每1L中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、 赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g。 

培养条件，只要是适合宿主增殖、且适于生成的酶保持稳定的条件，可以为任意的条件，具体可调节厌氧度、培养时间、温度、湿度、静置培养或振荡培养等各种条件。培养方法，可以为同一条件下的培养(1段培养)，也可以为使用2个以上不同培养条件即2段培养或3段培养，进行大量培养时，优选培养效率良好的2段培养等。 

以下，作为本发明的脂肪酸组合物的具体制造方法，以使用酵母作为宿主进行2段培养为例进行说明。即：作为预培养，将上述获得的菌落例如接种到上述SC-Trp培养基等中，在30℃下振荡培养2天。然后，作为本培养，在YPD5(2％酵母膏、1％多聚蛋白胨、5％葡萄糖)培养基10ml内添加预培养液500μl，在30℃下振荡培养2天。 

本发明的脂肪酸组合物

本发明还提供在本发明的PAP已表达的细胞中的1种或1种以上脂肪酸的集合体脂肪酸组合物。脂肪酸可以是游离脂肪酸，也可以是甘油三酯、磷脂等。特别是，本发明的脂肪酸组合物的特征在于，在其脂肪酸组成中，以下 

i)油酸含量 

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iii)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率 

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率 

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及 

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量的比率 

中的至少一项以上均比培养未用本发明的重组载体转化的宿主而获得的培养物的上述比率高。在此，“未用本发明的重组载体转化的宿主”，是指例如用未整合本说明书中的“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”的项目中所述的核酸的载体(空载体)转化的宿主。 

本发明脂肪酸组合物中含有的脂肪酸，是指长链烃的链状或分支状的单羧酸，例如可例举肉豆蔻酸(myristic acid)(十四烷酸)(14:0)、肉豆蔻烯酸(myristoleic acid)(十四碳烯酸)(14:1)、棕榈酸(十六烷酸)(16:0)、棕榈油酸(9-十六碳烯酸)(16:1)、硬脂酸(十八烷酸)(18:0)、油酸(顺式-9-十八碳烯酸)(18:1(9))、异油酸(11-十八碳烯酸)(18:1(11))、亚油酸(顺式，顺式-9，12十八碳二烯酸)(18:2(9，12))、α-亚麻酸(9， 12，15-十八碳三烯酸)(18:3(9，12，15))、γ-亚麻酸(6，9，12-十八碳三烯酸)(18:3(6，9，12))、亚麻油酸(Stearidonic acid)(6，9，12，15-十八碳四烯酸)(18:4(6，9，12，15))、花生酸(二十烷酸)(20:0)、(8，11-二十碳二烯酸)(20:2(8，11))、Mead酸(5，8，11-二十碳三烯酸)(20:3(5，8，11))、二高γ-亚麻酸(8，11，14-二十碳三烯酸)(20:3(8，11，14))、花生四烯酸(5，8，11，14-二十碳四烯酸)(20:4(5，8，11，14))、二十碳四烯酸(8，11，14，17-二十碳四烯酸)(20:4(8，11，14，17)、二十碳五烯酸(5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)(20:5(5，8，11，14，17))、山萮酸(二十二烷酸)(22:0)、(7，10，13，16-二十二碳四烯酸)(22:4(7，10，13，16))、(7，10，13，16，19-二十二碳五烯酸)(22:5(7，10，13，16，19))、(4，7，10，13，16-二十二碳五烯酸)(22:5(4，7，10，13，16))、(4，7，10，13，16，19-二十二碳六烯酸)(22:6(4，7，10，13，16，19))、木蜡酸(二十四烷酸)(24:0)、神经酸(顺式-15-二十四碳单烯酸)(24:1)、蜡酸(二十六烷酸)(26:0)等，但并不限于这些。此外，上述物质名称是采用IUPAC生物化学命名法定义的通用名称，括号内记载了系统名称以及表示碳原子数量和双键位置的数值。 

本发明的脂肪酸组合物，只要是上述脂肪酸中的1种或1种以上的脂肪酸的组合，可以是由任意数量、任意种类的脂肪酸组成的组合物。 

获得此种本发明的脂肪酸组合物，也就是说，本发明的PAP表达的确认，可使用公知的一般的方法进行。例如，在酵母中使PAP表达时，可确认脂肪酸组成的变化。即在通过上述本发明的脂肪酸组合物的制造方法获得的冷冻干燥菌体中，添加以适当比率调整的氯仿∶甲醇并搅拌后，加热处理适当时间。进一步通过离心分离分离菌体，回收溶剂，重复数次此操作。然后使用适当的方法使脂质干固后，添加氯仿等溶剂使脂质溶解。适量分取此样品，通过盐酸甲醇法将菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷后，用气相色谱法进行分析。 

其结果，得到具有上述脂肪酸组成的脂肪酸组合物时，即可判断为得到了本发明的脂肪酸组合物。 

含有本发明的脂肪酸组合物的食品等

本发明还进一步提供含有上述脂肪酸组合物的食品。本发明的脂肪酸组合物，根据通常方法，例如可用于含有油脂的食品、工业原料[化妆料、医药(例如皮肤外用药)、肥皂等的原料]的制造等用途中。作为化妆料(组合物)或医药(组合物)的剂型，可例举溶液状、糊 状、凝胶状、固体状、粉末状等任意的剂型，但并不限于这些。此外，作为食品的形态，可例举胶囊等医药制剂的形态，或在蛋白质、糖类、脂肪、微量元素、维生素类、乳化剂、香料等中配合了本发明的脂肪酸组合物的自然流食、半消化状态营养食品、以及成分营养食品、保健饮料、经肠营养剂等加工形态。 

进而，作为本发明的食品例，可例举营养补充食品、保健食品、功能性食品、幼儿用食品、婴儿用配方乳、早产儿用配方乳、老人用食品等，但不限于这些。在本说明书中，食品是固体、流体及液体以及这些的混合物且可摄取食用的食物的总称。 

营养补充食品是指强化了特定营养成分的食品。保健食品是指用于保健的或对健康有益的食品，包括营养补充食品、天然食品、减肥食品等。功能性食品是指用来补充可发挥身体调节功能的营养成分的食品，与特定保健用途的食品含义相同。幼儿用食品是指供给约6岁以下儿童的食品。老人用食品是指与未加处理的食品相比，处理成易消化及吸收的食品。婴儿用配方乳是指供给约1岁以下儿童的配方乳。早产儿用配方乳是指供给早产儿出生后到约6个月为止所用的配方乳。 

作为这些食品，可例举肉、鱼、果仁等天然食品(用油脂处理过的食品)；中华料理、拉面、汤等制作时加入油脂的食品；天麸罗、油炸食品、油炸豆腐、炒饭、炸面圈、油炸糖点心等用油脂作热介质的食品；黄油、人造黄油、沙拉酱、调味汁、巧克力、方便面、奶糖、饼干、曲奇、蛋糕、冰淇淋等油脂食品或加工时加入油脂的加工食品；(烤)年糕片、硬饼干、豆沙面包等加工完成时用油脂喷雾或涂布的食品等。但是，本发明的食品并不限于含油脂的食品，例如可例举面包、面条类、米饭、点心类(糖果、口香糖、橡皮糖、压片糖、日式点心)、豆腐及其加工品等农产食品；清酒、药用酒、甜料酒、食用醋、酱油、黄酱等发酵食品；酸奶、火腿、培根、香肠等畜产食品；鱼糕、炸鱼糕、鱼肉山芋饼等水产食品；果汁饮料、清凉饮料、运动饮料、酒精饮料、茶等。 

使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质的菌株的评价·选择方法

本发明还提供使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质的脂质生产菌的评价、选择方法。具体如下所示： 

(1)评价方法 

作为本发明的一个实施方式，可例举使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质，进行脂质生产菌评价的方法。本发明的上述评价方法，首先可例举使用基于本发明的碱基序列设 计的引物或探针，对被测菌株脂质生产菌株的本发明的上述活性进行评价的方法。此种评价方法的通常方法为公知，例如在国际专利申请文本WO01/040514号、日本特开平8-205900号公报等中均有记载。以下对该评价方法进行简单说明。 

首先制备被测菌株的基因组。制备方法可使用Hereford法、醋酸钾法等任何公知的方法[例如参照Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory Press，p130(1990)]。 

基于本发明的碱基序列、优选基于序列号4设计引物或探针。上述引物或探针可使用本发明碱基序列的任意部分，且其设计可使用公知方法进行。作为引物使用的多核苷酸的碱基数，通常为10个碱基以上，优选为15～25个碱基。此外，夹在两引物间的碱基数通常以300～2000碱基为宜。 

使用上述制备的引物或探针，检测上述被测菌体的基因组中是否存在本发明碱基序列的特异性序列。本发明碱基序列的特异性序列的检测可采用公知方法进行。例如，将含有本发明碱基序列的特异性序列的一部分或全部的多核苷酸或者含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸作为一个引物使用，另一个引物使用含有该序列的上游或下游序列的一部分或全部的多核苷酸、或含有上述碱基序列的互补碱基序列的多核苷酸，例如通过PCR法等扩增被测菌株的核酸，可测定扩增产物的有无、扩增产物的分子量大小等。 

适合本发明方法的PCR法的反应条件，无特别限定，例如可例举以下条件， 

变性温度：90～95℃ 

退火温度：40～60℃ 

延伸温度：60～75℃ 

循环数：10次以上 

等条件。将获得的反应生成物通过使用琼脂糖凝胶等的电泳法等进行分离，可测定扩增产物的分子量。因此通过确认扩增产物的分子量是否是含有相当于本发明碱基序列的特异性区域的核酸分子的大小，可预测或评价被测菌株的本发明的上述活性。而且通过用上述方法等分析上述扩增产物的碱基序列，还可进一步更正确地预测或评价本发明的上述活性。另外，本发明的上述活性的评价方法如上所述。 

作为本发明的上述评价方法，通过培养被测菌株，测定序列号4等本发明的碱基序列编码的PAP的表达量，可评价被测菌株的本发明的上述活性。且PAP的表达量，可通过在适当条件下培养被测菌株，对PAP的mRNA或蛋白质定量来测定。mRNA或蛋白质的定量，可使用 公知的方法进行。mRNA的定量，例如可通过Northern杂交法、定量RT-PCR进行，蛋白质的定量例如可通过Western印迹法进行(Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons 1994-2003)。此外，作为上述活性的评价方法，也可例举测定本发明PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。脂肪酸组合物的组成的测定方法如上所述。 

(2)选择方法 

作为本发明的其他实施方式，可例举使用编码本发明的PAP的核酸或PAP蛋白质进行脂质生产菌选择的方法。作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，测定序列号4等本发明的碱基序列编码的PAP的表达量，选择目的表达量的菌株，可选择出具有期望活性的菌株。此外，设定作为标准的菌株，分别培养该标准菌株和被测菌株，测定各菌株的上述表达量，比较标准菌株和被测菌株的表达量，也可选择出所期望的菌株。具体地说，例如可在适当的条件下培养标准菌株和被测菌株，测定各菌株的表达量，通过选择与标准菌株相比被测菌株为高表达、或低表达的被测菌株，来选择具有期望活性的菌株。对于所期望的活性，如上所述，可例举测定PAP的表达量及PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。 

且作为本发明的上述选择方法，通过培养被测菌株，选择本发明的上述活性高或低的菌株，也可选择出具有期望活性的被测菌株。对于所期望的活性，如上所述，可例举测定PAP的表达量及PAP产生的脂肪酸组合物的组成的方法。 

作为被测菌株或标准菌株，例如可使用上述导入本发明的载体的菌株、上述本发明的核酸表达受到抑制的菌株、进行诱变处理的菌株、自发突变的菌株等，但并不限于此。且本发明的PAP活性及可形成PAP的脂肪酸组合物的活性，例如可通过本说明书中的“编码本发明的磷脂酸磷酸酶的核酸”、“本发明的脂肪酸组合物”项目中记载的方法进行测定。诱变处理，例如可例举紫外线照射、放射线照射等物理方法，EMS(甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学方法等(如参照大嶋泰治编著、生物化学实验法39酵母分子遗传学实验法、p67-75、学会出版中心等)(日语原名：「大嶋泰治編著、生物化学実験法39酵母分子遺伝学実験法、p67-75、学会出版センタ一」)。但不限于此。 

此外，作为本发明的标准菌株、被测菌株使用的菌株，可例举上述脂质生产菌或酵母等，但并不限于这些。具体地说，标准菌株、被测菌株，可将属于不同属、种的任意菌株组合使用，被测菌株也可同时使用1种或1种以上的菌株。 

实施例 

以下根据实施例更加具体地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。 

实施例1 

(1)EST分析

将高山被孢霉(M.alpina)1S-4株接种到100ml的培养基(1.8％葡萄糖、1％酵母膏、pH6.0)中，在28℃预培养3天。在10L培养槽(Able Co.，东京)中加入5L培养基[1.8％葡萄糖、1％大豆粉、0.1％橄榄油、0.01％Adecanol、0.3％KH₂PO₄、0.1％Na₂SO₄、0.05％CaCl₂·2H₂O、0.05％MgCl₂·6H₂O、pH6.0]，接种全部预培养物，在300rpm、1vvm、26℃的条件下通气搅拌培养8天。在培养的第1、2、及3天分别添加相当于2％、2％、及1.5％的葡萄糖。在培养的第1、2、3、6、及8天的各阶段回收菌体，用盐酸胍/氯化铯法制备总RNA。使用Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(TaKaRa Bio)，从总RNA中纯化poly(A)⁺RNA。使用ZAP-cDNA Synthesis Kit(STRATAGENE)，构建各阶段的cDNA文库，进行cDNA的5’端一步法测序分析(8000克隆×5步)。将获得的序列进行聚类。 

(2)PAP基因同源基因的检索

将通过EST分析获得的碱基序列，相对于在GENEBANK注册的氨基酸序列使用同源性检索程序BLASTX进行检索，提取出PAP基因的同源基因，其结果，从EST中，发现具有与来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的推定蛋白质即具有PAP活性的二酰基甘油焦磷酸盐磷酸酶(DPP)同源物有高同源性的序列的序列(序列号1)。此序列号1的EST分析的重叠群，由9个来自上述(1)的第8天的文库的序列构成。 

实施例2 

(1)PAP同源基因(MaPAP1)的克隆

为得到包含PAP同源基因全长ORF的cDNA片段，如下设计了引物： 

引物D-1：CATGGGTTGCTTCGCGCGCAAGACG(序列号5) 

引物D-2：CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTC(序列号6) 

以第8天的cDNA文库为模板，通过上述的各引物，使用ExTaq(TaKaRa Bio)进行PCR反应。将所得到的0.64kbp的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN)进行TA克隆，确定插入部分的碱基序列。 

其结果，证明包含序列号1的第113位～744位的碱基序列的DNA片段进行了克隆，将此质粒作为pCR-2051-P。而后，分别以质粒pCR-2051-P为模板，通过与上述相同的引物进 行PCR反应。反应中虽然使用了ExTaq(TaKaRa Bio)，但用PCR标记用混合物(RocheDiagnostics公司)代替附带的dNTP混合物，将扩增的DNA用地高辛(DIG)标记，制备用于筛选cDNA文库的探针。使用此探针，筛选第8天的cDNA文库。 

杂交条件如下所示。 

缓冲液：5×SSC、1％SDS、50mM Tris-HCl(pH7.5)、50％甲酰胺； 

温度：42℃(一夜)； 

洗涤条件：在0.2×SSC、0.1％SDS溶液中(65℃)，20分钟×3次； 

检测，使用DIG核酸检测试剂盒(Roche Diagnostics公司)进行。从经过筛选获得的噬菌体克隆中，通过体内切割，切出质粒，获得质粒DNA。 

如上所述，筛选cDNA的结果，插入片段的长度最长的克隆的碱基序列与序列号1一致。将此质粒作为pB-PAP1。序列号1中，包含由1119bp组成的CDS(序列号3)，所以认为得到了编码PAP同源物全长的序列(图1)。将此基因命名为MaPAP1基因。由此基因编码的蛋白质(MaPAP1p)的推定氨基酸序列如序列号2所示。 

(2)序列分析

对于MaPAP1基因的碱基序列及这些编码的推定氨基酸序列，通过BLAST及clustalW分析，相对于已知的核酸序列及氨基酸序列进行同源性检索。通过BLASTX相对于GENBANK中注册的氨基酸序列进行同源性检索，在击中(hit)的序列中，E-Value最低的序列来自粗糙链孢霉(Neurospora crassa)的DPP1同源物的推定蛋白质(accession No.CAD70721)。氨基酸序列的同一性为59.3％，与编码此蛋白质的核酸序列的同一性为57.4％。此外，也与来自菌类、植物、动物的Mg²⁺非依赖性磷脂酸磷酸酶2型(PAP2)家族蛋白质进行同源性检索有击中序列(hit)。PAP2家族酶是膜蛋白质，是6次跨膜型酶。这些PAP2家族的蛋白质的氨基酸序列、和本研究中所得到的MaPAP1基因编码的推定氨基酸序列的比对如图2所示。已知PAP2家族酶中有3个保守区域，是活性所必需的氨基酸。如图2所示，在MaPAP1p中也保留有这些保守区域(图2中用双下线表示的区域)，保留有活性所必需的结构域1的精氨酸残基、结构域2和结构域3的组氨酸残基(图2中用＊表示的残基)。 

实施例3 

酵母表达载体的构建

为使MaPAP1在酵母中表达，如下构建酵母表达用载体。首先，以pB-PAP1为模板，通过 引物D-1(序列号5)和引物D-3：CCACTAAACTATGTTCTCAGGC(序列号7)、用ExTaq(TaKaRaBio)进行PCR反应。将所得到的1.1kbp的DNA片段使用TOPO-TA cloning Kit(INVITROGEN)进行TA克隆，确认碱基序列，以具有MaPAP1的CDS的正确碱基序列(序列号3)的质粒作为pCR-PAP1。将质粒pCR-PAP1用限制性内切酶EcoRI部分酶切。通过琼脂糖凝胶电泳切出约1.1kbp的片段，用GFX DNA purification Kit(GE Healthcare)纯化，连接到酵母用表达载体pYE22m(Biosci.Biotech.Biochem.，59，1221-1228，1995)的EcoRI位点。确认插入的DNA片段方向，将使ORF从pYE22m的GAPDH启动子开始转录并插入的质粒分别作为pYE-MAPAP1。 

实施例4 

酵母的转化

分别使用质粒p YE22m、pYE-MAPAP1，通过醋酸锂法，转化酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)EH13-15株(trp1，MATα)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，30，515-520，1989)。转化株选择在SC-Trp[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、亮氨酸1.8g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、尿嘧啶0.6g的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。 

实施例5 

酵母的培养

选择使用各个载体的转化株中的任意2株(c-1株及c-2株以及MaPAP1-1株及MaPAP1-2株)，用以下条件培养。 

即作为预培养，从平板上取1白金耳酵母接种到SC-Trp培养基10ml中，在30℃下振荡培养2天。本培养是在YPD5(酵母膏2％、多聚蛋白胨1％、葡萄糖5％)培养基10ml中添加预培养液500μl，30℃下振荡培养2天。 

实施例6 

酵母的脂肪酸分析

通过离心分离酵母培养液，回收菌体。用10ml灭菌水洗涤，再通过离心分离回收菌体，进行冷冻干燥。在冷冻干燥菌体中添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，剧烈搅拌后，70℃下处理1小时。 通过离心分离分离菌体，回收溶剂。在残留的菌体中再次添加氯仿∶甲醇(2∶1)4ml，同样回收溶剂。用SpeedVac离心浓缩仪使脂质干固后，添加2ml氯仿溶解脂质。从该试样中分取200μl，通过盐酸甲醇法使菌体的脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。 

其结果如表2所示。 

表2转化株的脂肪酸组成(宿主EH13-15) 

比较导入MaPAP1的酵母(MaPAP1-1株、MaPAP1-2株)、和对照酵母(C-1株、C2株)的脂肪酸组成。在导入MaPAP1的酵母中，油酸的比例与对照株相比上升了20％以上。棕榈酸、棕榈油酸的比例与对照株相比均减少，而另一方面，棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率与对照株相比则有若干上升。且在导入MaPAP1的酵母中，油酸含量相对于棕榈酸含量的比率、以及硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率与对照株相比均上升。且导入MaPAP1的酵母中，碳原子数18的脂肪酸相对于碳原子数16的脂肪酸的比值上升，说明生成了链长更长的脂肪酸。 

即说明，通过使MaPAP1基因表达，可改变脂肪酸组成。 

实施例7 

花生四烯酸生产酵母中的表达分析

(1)花生四烯酸生产酵母的育种 

为进行花生四烯酸生产酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的育种，构建以下质粒。 

Δ6-f和Δ6-r、GLELO-f和GLELO-r或Δ5-f和Δ5-r的引物的组合，使用ExTaq进行PCR，扩增高山被孢霉(M.alpina)1S-4株的Δ12脂肪酸去饱和酶基因、Δ6脂肪酸去饱和酶基因、GLELO脂肪酸链延长酶基因以及Δ5脂肪酸去饱和酶基因。 

Δ12-f：TCTAGAatggcacctcccaacactattg(序列号8) 

Δ12-r：AAGCTTTTACTTCTTGAAAAAGACCACGTC(序列号9) 

Δ6-f：TCTAGAatggctgctgctcccagtgtgag(序列号10) 

Δ6-r：AAGCTTTTACTGTGCCTTGCCCATCTTGG(序列号11) 

GLELO-f：TCTAGAatggagtcgattgcgcaattcc(序列号12) 

GLELO-r：GAGCTCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(序列号13) 

Δ5-f：TCTAGAatgggtgcggacacaggaaaaacc(序列号14) 

Δ5-r：AAGCTTTTACTCTTCCTTGGGACGAAGACC(序列号15) 

将这些通过TOPO-TA-cloning Kit克隆。确认碱基序列，将含有序列号16～19的碱基序列的克隆分别作为质粒pCR-MAΔ12DS(含有序列号16的碱基序列)、pCR-MAΔ6DS(含有序列号17的碱基序列)、pCR-MAGLELO(含有序列号18的碱基序列)、pCR-MAΔ5DS(含有序列号19的碱基序列)。 

另外，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pURA34(日本特开2001-120276号公报)后获得的约1.2kb的DNA片段，插入用限制性内切酶EcoRI和SphI酶切载体pUC18后进行末端平滑化，通过自我连接作用获得的载体的HindIII位点，将载体的EcoRI位点侧为URA3的5’端的克隆作为pUC-URA3。并且，将用限制性内切酶SalI和XhoI酶切YEp13获得的约2.2kb的DNA片段插入载体pUC18的SalI位点，将载体的EcoRI侧为LUE2的5’端的克隆作为pUC-LEU2。 

而后，将用限制性内切酶HindIII酶切质粒pCR-MAΔ12DS且进行末端平滑化后用限制性内切酶XbaI酶切而获得的约1.2kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SacI酶切载体pESC-URA(STRATAGENE)且进行末端平滑化后用限制性内切酶SpeI酶切后的约6.6kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ6DS且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切而获得的约1.6kbp的DNA片段，与用限制性内切酶SalI酶切质粒pESC-U-Δ12且进行末端平滑化后再用限制性内切酶HindIII酶切的约8kbp的DNA片段连接，得到质粒pESC-U-Δ12:Δ6。将其用限制性内切酶PvuII部分酶切而获得 的约4.2kb的片段插入pUC-URA3的SmaI位点，获得质粒pUC-URA-Δ12:Δ6。 

此外，将用限制性内切酶XbaI和SacI酶切质粒pCR-MAGLELO后获得的约0.95kbp的DNA片段，与用限制性内切酶XbaI和SacI酶切载体pESC-LEU(STRATAGENE)而获得的约7.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLELO。将用限制性内切酶XbaI酶切质粒pCR-MAΔ5DS且进行末端平滑化后用限制性内切酶HindIII酶切而获得的约1.3kbp的DNA片段，与用限制性内切酶ApaI酶切质粒pESC-L-GLELO且进行末端平滑化后再用限制性内切酶HindIII酶切而获得的约8.7kbp的DNA片段连接，获得质粒pESC-L-GLELO:Δ5。将其用限制性内切酶PvuII酶切后获得的约3.2kb片段插入pUC-LEU2的SmaI位点，获得质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5。 

将酿酒酵母(S.cerevisiae)YPH499株(STRATAGENE)用质粒pUC-URA-Δ12:Δ6和质粒pUC-LEU-GLELO:Δ5进行共转化。转化株选择在SC-Leu、Ura[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g、色氨酸1.2g的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。将如此获得的菌株中的任意一株作为ARA3-1株。 

(2)花生四烯酸生产酵母转化株的获得和分析 

将ARA3-1株用质粒pYE22m、pYE-MAPAP1分别转化。转化株选择在SC-Trp、Leu、Ura[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、葡萄糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g]琼脂培养基(2％琼脂)上生长繁殖的菌株。从导入各质粒的菌株中，分别选择任意4株。 

将这些菌株在上述SC-Trp、Leu、Ura液体培养基10ml中30℃、培养1天，取其中1ml在SG-Trp、Leu、Ura[每1升中，无氨基酸酵母氮源(Yeast nitrogen base w/o amino acids)(DIFCO)为6.7g、半乳糖为20g、氨基酸粉(腺嘌呤硫酸盐1.25g、精氨酸0.6g、天冬氨酸3g、谷氨酸3g、组氨酸0.6g、赖氨酸0.9g、蛋氨酸0.6g、苯丙氨酸1.5g、丝氨酸11.25g、酪氨酸0.9g、缬氨酸4.5g、苏氨酸6g的混合物)为1.3g]液体培养基10ml中15℃、培养7天，进行菌体的脂肪酸分析。菌体的脂肪酸组成如表3所示，菌体内的油脂含有率如表4所示。 

表3 

表3菌体内脂肪酸含有率(％) 

表4 

表4γ亚麻酸、DGLA、ARA占总脂肪酸的比率(％) 

如此，使来自高山被孢霉(M.alpina)的PAP1基因在花生四烯酸生产酵母中高表达时，与对照株相比，菌体内脂肪酸含有率增高。且γ-亚麻酸、DGLA、花生四烯酸占总脂肪酸的比率也均有增高。 

实施例8 

高山被孢霉(M.alpina)表达用载体的构建

高山被孢霉(M.alpina)表达用载体，使用从GAPDH启动子开始使目的基因表达的pDuraSC和从组蛋白启动子开始使目的基因表达的pDuraMCS。 

为使PAP1在高山被孢霉(M.alpina)中表达，如下构建载体。即将质粒pCR-PAP1用限制性内切酶PstI酶切，然后用限制性内切酶XhoI部分分解。切出所得到的DNA片段中约1.1kb的片段，插入载体pDuraSC或载体pDura5MCS的多克隆位点的PstI位点、XhoI位点，作为各种质粒pDuraSC-PAP1、质粒pDura5MCS-PAP1。 

高山被孢霉(M.alpina)转化株的获得

使用这些质粒，从高山被孢霉(M.alpina)中，以根据专利文献(WO2005/019437“脂质生产菌的育种方法”)中记载的方法诱导的尿嘧啶缺陷型株Δura-3为宿主，用基因枪轰击法进行转化。选择转化株时，使用SC琼脂培养基[无氨基酸和硫酸铵酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate)(Difco)0.5％、硫酸铵 0.17％、葡萄糖2％、腺嘌呤0.002％、酪氨酸0.003％、蛋氨酸0.0001％、精氨酸0.0002％、组氨酸0.0002％、赖氨酸0.0004％、色氨酸0.0004％、苏氨酸0.0005％、异亮氨酸0.0006％、亮氨酸0.0006％、苯丙氨酸0.0006％、琼脂2％]。 

转化高山被孢霉(M.alpina)的评价

将获得的转化株，接种到GY培养基(葡萄糖2％、酵母膏1％)4ml中，28℃振荡培养3天或4天。通过过滤回收菌体，使用RNeasy plant kit(QIAGEN)提取RNA。通过SuperScriptFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)合成cDNA。为了确认导入的构建物中各基因的表达、总的各基因的表达，用以下引物的组合进行RT-PCR。 

○质粒pDuraSC-PAP1导入株 

用于导入构建物中的PAP1表达确认的引物 

MaGAPDHpfw：CACACCACACATTCAACATC  (序列号20) 

D2：CGAAGCCGGCAAAGGCGGCAGTCG  (序列号21) 

用于总PAP1表达确认的引物 

D1：CATGGGTTGCTTCGCGCGCAAGACG  (序列号22) 

D2： 

○质粒pDura5MCS-PAP1导入株 

用于导入构建物中的PAP1表达确认的引物 

PD4P：CGCATCCCGCAAACACACAC  (序列号23) 

D2： 

用于总的PAP1表达确认的引物 

D1： 

D2 

根据上述RT-PCR的结果，作为各基因在导入构建物中的表达及总表达高的菌株，从质粒pDuraSC-PAP1导入株中筛选出Gp-PAP1-49株，从质粒pDura5MCS-PAP1导入株中筛选出Hp-PAP1-2株。 

将这些菌株在GY培养基4ml中接种，28℃下125rpm振荡培养。培养第4天通过过滤回收全部菌体，冷冻干燥。取出一部分(约10～20mg左右)干燥菌体，通过盐酸甲醇法使菌体的 脂肪酸衍生为甲酯后，用己烷提取，蒸馏除去己烷，通过气相色谱法进行分析。菌体内的脂肪酸含有率、和单位培养基中的花生四烯酸生产量归纳于以下表5-7。 

表5 

表5菌体内脂肪酸含有率(％) 

表6 

表6花生四烯酸占总脂肪酸的比率(％) 

表7 

表7单位培养基中的花生四烯酸生产量(g/L) 

这样，通过使PAP1基因在高山被孢霉(M.alpina)中高表达，菌体内的脂肪酸含有率上升，花生四烯酸占总脂肪酸的比率也上升。并且，也可使单位培养基中的花生四烯酸生产量增加。 

序列表FREETEXT 

序列号5：引物 

序列号6：引物 

序列号7：引物 

序列号8：引物 

序列号9：引物 

序列号10：引物 

序列号11：引物 

序列号12：引物 

序列号13：引物 

序列号14：引物 

序列号15：引物 

序列号20：引物 

序列号21：引物 

序列号22：引物 

序列号23：引物 

序列表(SEQUENCE LISTING)

<110>三得利控股株式会社(Suntory Holdings Ltd.)

<120>磷脂酸磷酸酶同源物及其利用(PHOSPHATIDIC ACID PHOSPHATASE HOMOLOGS AND USE THEREOF)

<130>FA0038-08063

<150>JP 2007-181899

<151>2007-07-11

<160>23

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>1307

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<220>

<221>CDS

<222>(105)..(1223)

<223>

<400>1

gcattcactt tactgcttcc tggctattcc catctcctca cagttctttt cgctttactg    60

caatcgcaat cccacaccgc tcgggaactt tttcgcctgc aaac atg ggt tgc ttc    116

                                                 Met Gly Cys Phe

                                                 1

gcg cgc aag acg cac acc act cca cat cca gac act aat aca act gcc     164

Ala Arg Lys Thr His Thr Thr Pro His Pro Asp Thr Asn Thr Thr Ala

5                   10                  15                  20

gtg aat ggc cac cac aat gta tac tca atg cag acc cgg ccg aag ttt     212

Val Asn Gly His His Asn Val Tyr Ser Met Gln Thr Arg Pro Lys Phe

                25                  30                  35

gga cag tgg ctc aaa tgc aca tgg ctc gat att ctc acc atg gca gtg     260

Gly Gln Trp Leu Lys Cys Thr Trp Leu Asp Ile Leu Thr Met Ala Val

            40                  45                  50

atg ggt gct ctt ggc ctt gga gtc tac atg ttg cgt cct gtg ccg aat     308

Met Gly Ala Leu Gly Leu Gly Val Tyr Met Leu Arg Pro Val Pro Asn

        55                  60                  65

cga tct ttc gcc gtc acc ttc gcc gat ggc gag atc gtc tac cct gag     356

Arg Ser Phe Ala Val Thr Phe Ala Asp Gly Glu Ile Val Tyr Pro Glu

    70                  75                  80

ttt gct tac cct ttg cgc aaa gag att gtt ccc att tgg ctc gcc tcc     404

Phe Ala Tyr Pro Leu Arg Lys Glu Ile Val Pro Ile Trp Leu Ala Ser

85                  90                  95                  100

ttc ctg gcc gtc gtt gta ccc gtt ctg ggt atc ttg ctg atg caa att     452

Phe Leu Ala Val Val Val Pro Val Leu Gly Ile Leu Leu Met Gln Ile

                105                 110                 115

cgc gtc cgc tcc ttc tgg gat gtc aat aac gct atc gtg ggc tta ttg     500

Arg Val Arg Ser Phe Trp Asp Val Asn Asn Ala Ile Val Gly Leu Leu

            120                 125                 130

tac tcg ctc atc acc gcc gct gtc ttc cag gtc ttc atc aag tgg ctc     548

Tyr Ser Leu Ile Thr Ala Ala Val Phe Gln Val Phe Ile Lys Trp Leu

        135                 140                 145

atc gga ggt ctg cgt cct cat ttt ctc gaa gtc tgc aaa cct gat acc    596

Ile Gly Gly Leu Arg Pro His Phe Leu Glu Val Cys Lys Pro Asp Thr

    150                 155                 160

agt ttg gcc acc gac gcc gga tac aac agg aag gga ttc cag cag caa    644

Ser Leu Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Lys Gly Phe Gln Gln Gln

165                 170                 175                 180

tac ttc aca aga gag atc tgt acc gga gat gag aag gag atc aac gac    692

Tyr Phe Thr Arg Glu Ile Cys Thr Gly Asp Glu Lys Glu Ile Asn Asp

                185                 190                 195

agt ctc gag tcc ttc ccc agc gga cat tcg act gcc gcc ttt gcc ggc    740

Ser Leu Glu Ser Phe Pro Ser Gly His Ser Thr Ala Ala Phe Ala Gly

            200                 205                 210

ttc gkt ttt ctt tac cta tac ctg aat gca aag ctc aaa gtc ttc tcg    788

Phe Xaa Phe Leu Tyr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Leu Lys Val Phe Ser

        215                 220                 225

aac tac cac ccg gcc atg tgg aag ctc ata gtc att tac act cct atc    836

Asn Tyr His Pro Ala Met Trp Lys Leu Ile Val Ile Tyr Thr Pro Ile

    230                 235                 240

ctc gga gct gtc ctg atc ggc ggt gcc ctc acc atc gac gaa ttc cat    884

Leu Gly Ala Val Leu Ile Gly Gly Ala Leu Thr Ile Asp Glu Phe His

245                 250                 255                 260

aat tgg tac gat gtc gtg gcc gga gcc atc atc gga tcc gtc atg gcg    932

Asn Trp Tyr Asp Val Val Ala Gly Ala Ile Ile Gly Ser Val Met Ala

                265                 270                 275

ttt tca tct tac cgc atg acg tat gcg gcc att tgg gac tgg agg tac    980

Phe Ser Ser Tyr Arg Met Thr Tyr Ala Ala Ile Trp Asp Trp Arg Tyr

            280                 285                 290

aat cac atc ccg ttg aac cgc aat gcg ccg ttc ccc ttc ctc cgc gac    1028

Asn His Ile Pro Leu Asn Arg Asn Ala Pro Phe Pro Phe Leu Arg Asp

        295                 300                 305

agt ggc gat ttg gtg ggc gct gta ttt acg aga aag gcc ggt tgg gga    1076

Ser Gly Asp Leu Val Gly Ala Val Phe Thr Arg Lys Ala Gly Trp Gly

    310                 315                 320

gat gct gcg aaa gta ccc gaa cga gga aac gac tgg aat cac cat ggt    1124

Asp Ala Ala Lys Val Pro Glu Arg Gly Asn Asp Trp Asn His His Gly

325                 330                 335                 340

caa aca cct aat gcg aac caa gac gga tac caa gcc agt tca tca att    1172

Gln Thr Pro Asn Ala Asn Gln Asp Gly Tyr Gln Ala Ser Ser SerIle

                345                 350                 355

cca tta aga tcg gtc ggc ggg ggt caa gca cag cct gag aac ata gtt    1220

Pro Leu Arg Ser Val Gly Gly Gly Gln Ala Gln Pro Glu Asn Ile Val

            360                 365                 370

tag tggaacataa aatatgacac acagcttatc aaacaaaaaa ccgttaaatt         1273

tgcacacggg ccacaacata cgtcagaacc gtgt                              1307

<210>2

<211>372

<212>PRT

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<220>

<221>misc_feature

<222>(214)..(214)

<223>The’Xaa’at location 214 stands for Gly，or Val.

<400>2

Met Gly Cys Phe Ala Arg Lys Thr His Thr Thr Pro His Pro Asp Thr

1               5                   10                  15

Asn Thr Thr Ala Val Asn Gly His His Asn Val Tyr Ser Met Gln Thr

            20                  25                  30

Arg Pro Lys Phe Gly Gln Trp Leu Lys Cys Thr Trp Leu Asp Ile Leu

        35                  40                  45

Thr Met Ala Val Met Gly Ala Leu Gly Leu Gly Val Tyr Met Leu Arg

    50                  55                  60

Pro Val Pro Asn Arg Ser Phe Ala Val Thr Phe Ala Asp Gly Glu Ile

65                  70                  75                  80

Val Tyr Pro Glu Phe Ala Tyr Pro Leu Arg Lys Glu Ile Val Pro Ile

                85                  90                  95

Trp Leu Ala Ser Phe Leu Ala Val Val Val Pro Val Leu Gly Ile Leu

            100                 105                 110

Leu Met Gln Ile Arg Val Arg Ser Phe Trp Asp Val Asn Asn Ala Ile

        115                 120                 125

Val Gly Leu Leu Tyr Ser Leu Ile Thr Ala Ala Val Phe Gln Val Phe

    130                 135                 140

Ile Lys Trp Leu Ile Gly Gly Leu Arg Pro His Phe Leu Glu Val Cys

145                 150                 155                 160

Lys Pro Asp Thr Ser Leu Ala Thr Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Lys Gly

                165                 170                 175

Phe Gln Gln Gln Tyr Phe Thr Arg Glu Ile Cys Thr Gly Asp Glu Lys

            180                 185                 190

Glu Ile Asn Asp Ser Leu Glu Ser Phe Pro Ser Gly His Ser Thr Ala

        195                 200                 205

Ala Phe Ala Gly Phe Xaa Phe Leu Tyr Leu Tyr Leu Asn Ala Lys Leu

    210                 215                 220

Lys Val Phe Ser Asn Tyr His Pro Ala Met Trp Lys Leu Ile Val Ile

225                 230                 235                 240

Tyr Thr Pro Ile Leu Gly Ala Val Leu Ile Gly Gly Ala Leu Thr Ile

                245                 250                 255

Asp Glu Phe His Asn Trp Tyr Asp Val Val Ala Gly Ala Ile Ile Gly

            260                 265                 270

Ser Val Met Ala Phe Ser Ser Tyr Arg Met Thr Tyr Ala Ala Ile Trp

        275                 280                 285

Asp Trp Arg Tyr Asn His Ile Pro Leu Asn Arg Asn Ala Pro Phe Pro

    290                 295                 300

Phe Leu Arg Asp Ser Gly Asp Leu Val Gly Ala Val Phe Thr Arg Lys

305                 310                 315                 320

Ala Gly Trp Gly Asp Ala Ala Lys Val Pro Glu Arg Gly Asn Asp Trp

                325                 330                 335

Asn His His Gly Gln Thr Pro Asn Ala Asn Gln Asp Gly Tyr Gln Ala

            340                 345                 350

Ser Ser Ser Ile Pro Leu Arg Ser Val Gly Gly Gly Gln Ala Gln Pro

        355                 360                 365

Glu Asn Ile Val

    370

<210>3

<211>1119

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>3

atgggttgct tcgcgcgcaa gacgcacacc actccacatc cagacactaa tacaactgcc     60

gtgaatggcc accacaatgt atactcaatg cagacccggc cgaagtttgg acagtggctc    120

aaatgcacat ggctcgatat tctcaccatg gcagtgatgg gtgctcttgg ccttggagtc    180

tacatgttgc gtcctgtgcc gaatcgatct ttcgccgtca ccttcgccga tggcgagatc    240

gtctaccctg agtttgctta ccctttgcgc aaagagattg ttcccatttg gctcgcctcc    300

ttcctggccg tcgttgtacc cgttctgggt atcttgctga tgcaaattcg cgtccgctcc    360

ttctgggatg tcaataacgc tatcgtgggc ttattgtact cgctcatcac cgccgctgtc    420

ttccaggtct tcatcaagtg gctcatcgga ggtctgcgtc ctcattttct cgaagtctgc    480

aaacctgata ccagtttggc caccgacgcc ggatacaaca ggaagggatt ccagcagcaa    540

tacttcacaa gagagatctg taccggagat gagaaggaga tcaacgacag tctcgagtcc  600

ttccccagcg gacattcgac tgccgccttt gccggcttcg kttttcttta cctatacctg  660

aatgcaaagc tcaaagtctt ctcgaactac cacccggcca tgtggaagct catagtcatt  720

tacactccta tcctcggagc tgtcctgatc ggcggtgccc tcaccatcga cgaattccat  780

aattggtacg atgtcgtggc cggagccatc atcggatccg tcatggcgtt ttcatcttac  840

cgcatgacgt atgcggccat ttgggactgg aggtacaatc acatcccgtt gaaccgcaat  900

gcgccgttcc ccttcctccg cgacagtggc gatttggtgg gcgctgtatt tacgagaaag  960

gccggttggg gagatgctgc gaaagtaccc gaacgaggaa acgactggaa tcaccatggt 1020

caaacaccta atgcgaacca agacggatac caagccagtt catcaattcc attaagatcg 1080

gtcggcgggg gtcaagcaca gcctgagaac atagtttag                        1119

<210>4

<211>1116

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>4

atgggttgct tcgcgcgcaa gacgcacacc actccacatc cagacactaa tacaactgcc    60

gtgaatggcc accacaatgt atactcaatg cagacccggc cgaagtttgg acagtggctc   120

aaatgcacat ggctcgatat tctcaccatg gcagtgatgg gtgctcttgg ccttggagtc   180

tacatgttgc gtcctgtgcc gaatcgatct ttcgccgtca ccttcgccga tggcgagatc   240

gtctaccctg agtttgctta ccctttgcgc aaagagattg ttcccatttg gctcgcctcc   300

ttcctggccg tcgttgtacc cgttctgggt atcttgctga tgcaaattcg cgtccgctcc   360

ttctgggatg tcaataacgc tatcgtgggc ttattgtact cgctcatcac cgccgctgtc   420

ttccaggtct tcatcaagtg gctcatcgga ggtctgcgtc ctcattttct cgaagtctgc   480

aaacctgata ccagtttggc caccgacgcc ggatacaaca ggaagggatt ccagcagcaa   540

tacttcacaa gagagatctg taccggagat gagaaggaga tcaacgacag tctcgagtcc   600

ttccccagcg gacattcgac tgccgccttt gccggcttcg kttttcttta cctatacctg   660

aatgcaaagc tcaaagtctt ctcgaactac cacccggcca tgtggaagct catagtcatt   720

tacactccta tcctcggagc tgtcctgatc ggcggtgccc tcaccatcga cgaattccat   780

aattggtacg atgtcgtggc cggagccatc atcggatccg tcatggcgtt ttcatcttac   840

cgcatgacgt atgcggccat ttgggactgg aggtacaatc acatcccgtt gaaccgcaat   900

gcgccgttcc ccttcctccg cgacagtggc gatttggtgg gcgctgtatt tacgagaaag   960

gccggttggg gagatgctgc gaaagtaccc gaacgaggaa acgactggaa tcaccatggt  1020

caaacaccta atgcgaacca agacggatac caagccagtt catcaattcc attaagatcg  1080

gtcggcgggg gtcaagcaca gcctgagaac atagtt                            1116

<210>5

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)D-1

<400>5

catgggttgc ttcgcgcgca agacg                                      25

<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)D-2

<400>6

cgaagccggc aaaggcggca gtc                                        23

<210>7

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)D-3

<400>7

ccactaaact atgttctcag gc                                         22

<210>8

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)12-f

<400>8

tctagaatgg cacctcccaa cactattg                                   28

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)12-r

<400>9

aagcttttac ttcttgaaaa agaccacgtc                                 30

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)6-f

<400>10

tctagaatgg ctgctgctcc cagtgtgag                                      29

<210>11

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)6-r

<400>11

aagcttttac tgtgccttgc ccatcttgg                                      29

<210>12

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)GLELO-f

<400>12

tctagaatgg agtcgattgc gcaattcc                                       28

<210>13

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)GLELO-r

<400>13

gagctcttac tgcaacttcc ttgccttctc                                     30

<210>14

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)5-f

<400>14

tctagaatgg gtgcggacac aggaaaaacc                                     30

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)5-r

<400>15

aagcttttac tcttccttgg gacgaagacc                                      30

<210>16

<211>1203

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>16

atggcacctc ccaacactat tgatgccggt ttgacccagc gccatatcag cacctcggcc    60

gccccaacct ctgccaagcc cgccttcgag cgcaactacc agctccctga gttcaccatc    120

aaggagatcc gtgagtgcat ccctgcacac tgctttgagc gctccggtct ccgtggtctt    180

tgccacgttg ctattgatct gacctgggcc tcgctcttgt tcctggctgc gacccagatc    240

gacaagttcg agaacccttt gatccgctac ttggcctggc ctgcgtattg gatcatgcag    300

ggtattgttt gcaccggtat ctgggtattg gcacacgaat gtggtcatca gtccttctcg    360

acctccaaga cccttaacaa cactgtcggc tggatcttgc actcgatgct cttggtccct    420

taccactcct ggagaatctc gcactcgaag caccacaagg ccactggcca catgaccaag    480

gaccaggtct ttgttcccaa gacccgctct caggttggct tgccccccaa ggagaatgtt    540

gcagttgccg ttcaggagga ggatatgtcc gtgcacctgg atgaggaggc ccccattgtg    600

actttgttct ggatggtgat tcagttcctg ttcggatggc ctgcgtacct tattatgaac    660

gcctctggtc aagactatgg ccgctggacc tcgcacttcc acacctactc tcctatcttt    720

gagccccgca actttttcga cattatcatt tcggatctcg gtgtgttggc tgctcttggt    780

accttgatct acgcctccat gcagctctcg ctcttgaccg tgaccaagta ctacattgtc    840

ccctacttgt ttgtcaactt ctggttggtc ctgatcacct tcttgcagca caccgaccct    900

aagctgcccc attaccgtga gggtgcctgg aacttccagc gtggagccct ctgcaccgtt    960

gaccgctcgt tcggcaagtt cttggaccat atgttccacg gcattgtcca tacccatgta   1020

gcccatcact tgttctcgca gatgccgttc taccatgctg aggaagccac ccatcatctc   1080

aagaaactgc tgggagagta ctacgtctat gacccatcgc cgattgttgt tgcggtctgg   1140

aggtcgttcc gtgaatgccg attcgtggaa gaccatggag acgtggtctt tttcaagaag   1200

taa                                                                 1203

<210>17

<211>1374

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>17

atggctgctg ctcccagtgt gaggacgttt actcgggccg agattttgaa tgccgaggcc     60

ctgaatgagg gcaagaagga tgccgaggca ccctttctga tgatcattga caacaaggtg    120

tacgatgtcc gcgagtttgt ccctgatcat cccggtggaa gtgtgattct cacgcacgtt    180

ggcaaggacg gcactgacgt ctttgacact ttccaccccg aggctgcttg ggagactctt    240

gccaactttt acgttggtga tattgatgag agcgatcgtg ccatcaagaa tgatgacttt    300

gcggccgagg ttcgcaagct gcgcaccttg ttccagtccc ttggctacta cgactcgtcc    360

aaggcatact atgccttcaa ggtctcgttc aacctctgca tctggggctt gtcgactttc    420

attgttgcca agtggggcca gacctcgacc ctcgccaacg tgctctcggc tgcgctcttg    480

ggtctcttct ggcagcagtg cggatggttg gcgcacgact ttttgcacca ccaggtcttc   540

caggaccgtt tctggggtga tcttttcggc gccttcttgg gaggtgtctg ccagggtttc   600

tcgtcctcct ggtggaagga caagcacaac actcaccacg ctgctcccaa cgtccacggc   660

gaggatcccg acattgacac tcaccctctg ttgacctgga gtgagcatgc tctggagatg   720

ttctcggatg ttcctgacga ggagctgacc cgtatgtggt cgcgcttcat ggtcctcaac   780

cagacctggt tctacttccc cattctctcg tttgcccgtc tgtcctggtg cctccagtcc   840

attatgcttg ttctgcccaa cggtcaggcc cacaagccct ctggagcgcg tgtgcccatt   900

tcgttggtcg agcagctgtc tctggctatg cactggacct ggtacctcgc caccatgttc   960

ctgttcatta aggatcccgt caacatgatt gtgtactttt tggtgtcgca ggctgtttgc  1020

ggcaacttgt tggcgattgt gttctcgctc aaccacaacg gcatgcctgt gatctccaag  1080

gaggaagcgg tcgatatgga cttcttcacc aagcagatca tcacgggtcg tgatgttcac  1140

cctggtctgt ttgccaactg gttcacgggt ggattgaact accagattga gcaccacttg  1200

ttcccttcga tgccccgcca caacttttca aagatccagc ctgctgtcga gactttgtgc  1260

aaaaagtacg gtgtccgata ccataccact ggtatgatcg agggaactgc agaggtcttt  1320

agccgtttga acgaggtctc caaggcggcc tccaagatgg gcaaggcaca gtaa        1374

<210>18

<211>957

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>18

atggagtcga ttgcgcaatt cctcccctca aagatgccgc aagatctgtt tattgacctt     60

gcaagggcca tcggtgtcca ggccgcaccc tatgtcgacc ctctcgaggc agcgcttgtg    120

gcccaggccg agaagttctt ccccacggtc gttcatcaca cgcgcggctt tttggtcgcg    180

gtcgagtcac ccttggcccg tgagctgccc ttgatgaacc ccttccacgt gctgttgatc    240

gcgctcgctt acttggtcac ggtctttgtg ggcatgcaga tcatgaagaa ctttgaacgg    300

ttcgaggtca agacgttctc gctcttccac aacttttgtc tggtctcgat cagtgcctac    360

atgtgcggcg ggatcttgta cgaggcttac caggccaact atggactgtt tgagaacgcg    420

gccgatcata ccgtccaggg tcttcctatg gccaagatga tctggctctt ctacttctcc    480

aagatcatgg agtttgtcga caccatgatc atggtcctta agaagaacaa ccgccagatc    540

tcgttcttgc acgtctacca ccacagctcc atcttcacca tctggtggtt ggtcaccttt    600

gttgcaccca atggtgaagc ctacttctcg gctgcgttga actcgttcat ccacgtgatc    660

atgtacggct actacttcct gtccgccttg ggcttcaagc aggtgtcgtt catcaagttc    720

tacatcacgc gttcgcagat gacgcagttc tgcatgatgt cgatccagtc ctcctgggac    780

atgtatgcca tgaaggtgct tggccgcccc ggatacccct tcttcatcac cgccctgctt    840

tggttctaca tgtggaccat gctcggactc ttctacaact tctacagaaa gaacgccaag    900

ttggccaagc aggccaagat cgatgctgcc aaggagaagg caaggaagtt gcagtaa       957

<210>19

<211>1341

<212>DNA

<213>高山被孢霉(Mortierella alpina)

<400>19

atgggtgcgg acacaggaaa aaccttcacc tggcaagaac tcgcggcgca taacaccgag     60

gacagcctcc ttttggctat ccgtggcaat gtatacgatg tcacaaagtt cttgagccgt    120

catcctggtg gaacggatac tctcttgctc ggagctggcc gagatgtcac tccggttttt    180

gagatgtacc acgagtttgg agctgcagag gctatcatga agaagtacta tgttggcaca    240

ctggtctcaa atgagttgcc catcttccca gagccaacgg tgttccataa gaccatcaag    300

ggcagagttg aggcatactt taaggaccgg aacatggatt ccaagaacag accagagatc    360

tggggacgat atgctctcat ctttggatcc ttgatcgcct cttactacgc gcagctcttt    420

gtaccgttcg tggtcgaacg tacatggctc caggtggtgt ttgctatcat catgggattt    480

gcgtgcgcgc aagtcggatt gaaccctctt cacgatgcct cccacttttc agtgacccac    540

aaccccaccg tttggaagat tctcggagcc acgcacgact ttttcaacgg agcatcgtat    600

ctcgtgtgga tgtaccaaca tatgctcggc catcatccct ataccaacat tgctggagct    660

gatcccgatg tgtcgacctc tgagcccgat gttcgtcgta tcaagcccaa ccaaaagtgg    720

ttcgtcaacc acatcaacca gcacatgttt gttcctttcc tgtacggact gctggcgttc    780

aaggtgcgca tccaggacat caacatcttg tactttgtca agaccaatga cgccattcgt    840

gtcaacccca tctcgacttg gcacaccgtc atgttctggg gcggaaaggc cttctttgtc    900

tggtaccgct tgatcgttcc tatgcagtat ctgcccctga gcaaggtgtt gctcttgttt    960

accgtcgcag acatggtctc ttcttactgg ctggcgctga ccttccaggc gaaccacgtt   1020

gttgaggagg ttcagtggcc attgcctgat gagaatggaa tcatccaaaa ggattgggca   1080

gccatgcagg tcgagactac tcaggattac gcccacgatt cgcacctctg gaccagcatc   1140

acgggcagct tgaactacca agccgttcat catctgttcc cgaacgtttc ccagcatcac   1200

taccctgata tcctggctat catcaaggac acctgcagcg agtacaaggt gccatacctc   1260

gtcaaggata ccttttggca agcgtttgct tcacatttgg agcacttgcg tgtgcttggt   1320

cttcgtccca aggaagagta a                                             1341

<210>20

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)MaGAPDHpfw

<400>20

cacaccacac attcaacatc                          20

<210>21

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)D2

<400>21

cgaagccggc aaaggcggca gtcg                     24

<210>22

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)D1

<400>22

catgggttgc ttcgcgcgca agacg                    25

cgaagccggc aaaggcggca gtcg                     24

<210>23

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial)

<220>

<223>引物(primer)PD4P

<400>23

cgcatcccgc aaacacacac                          20

Claims (5)

1.核酸，由以下(a)～(c)中任一项所述的碱基序列组成：

(a)碱基序列，其如序列号4所示，且该序列号4的第640～642位为gtt；

(b)碱基序列，其编码由序列号2所示氨基酸序列组成的蛋白质，且该序列号2的第214位为缬氨酸；

(c)碱基序列，其如序列号1所示，且该序列号1的第744～746位为gtt。

2.蛋白质，其由序列号2所示的氨基酸序列组成，且该序列号2的第214位为缬氨酸。

3.重组载体，其含有权利要求1所述的核酸。

4.转化体，其通过权利要求3中所述的重组载体转化。

5.脂肪酸组合物的制造方法，包括从培养权利要求4中所述的转化体而得到的培养物中提取脂肪酸组合物，其特征在于，所述脂肪酸组合物的脂肪酸组成中，以下i)～vi)中的1项以上比培养未用权利要求3的重组载体转化的宿主而得到的培养物的所述比率高：

i)油酸含量

ii)棕榈油酸含量相对于棕榈酸含量的比率

ii i)油酸含量相对于棕榈酸含量的比率

iv)硬脂酸及油酸的合计含量相对于棕榈酸含量的比率

v)碳原子数18的脂肪酸含量相对于碳原子数16的脂肪酸含量的比率，以及

vi)花生四烯酸、二高-γ-亚麻酸及/或γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的比率。

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