KR101187081B1

KR101187081B1 - 지질생산균의 취득방법

Info

Publication number: KR101187081B1
Application number: KR1020067003636A
Authority: KR
Inventors: 미사 오치아이; 히로시 카와시마; 사카유 시미즈
Original assignee: 산토리 홀딩스 가부시키가이샤
Priority date: 2003-08-22
Filing date: 2004-08-20
Publication date: 2012-09-27
Also published as: AU2004267294A1; EP1666584B1; AU2004267294B2; BRPI0413830A; WO2005019437A1; DK1666584T3; ATE493489T1; CN1839199A; DE602004030807D1; CN100381558C; CA2536606A1; CA2536606C; MXPA06002074A; EP1666584A4; RU2006108790A; JP4537319B2; KR20070031827A; JPWO2005019437A1; EP1666584A1; RU2340665C2

Abstract

항생물질과 관계없이 모티에렐라속에 속하는 지질생산균의 육종을 유효하게 효율적으로 행할 수 있는 육종방법을 제공한다.

모티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질생산균의 영양요구성주, 예를 들어 우라실 요구성주를 숙주로 하여 형질전환공정을 행한다.

구체적으로는, 마커 유전자로서 이 영양요구성을 보완하는 유전자를 사용하여 이러한 마커 유전자를 숙주로 도입한다(유전자 도입단계). 그 후, 상기 숙주의 영양요구성의 회복을 마커로 하여 형질전환주를 선발한다(선발단계). 상기 지질생산균으로서는, 예를 들어 모티에렐라 알피나(M.alpina)를 들 수 있다.

Description

지질생산균의 취득방법 {METHOD OF OBTAINING LIPID-PRODUCING FUNGUS}

본 발명은, 지질생산균의 취득방법에 관한 것이며, 특히, 모티에렐라( Mortierella)속에 속하는 지질생산균에 있어서, 항생물질에 의한 선발을 사용하지 않고 형질전환에 의한 육종을 행하는 방법에 관한 것이다.

종래부터, 미생물의 대사에 의해 유용한 화합물을 생산시키는 기술(광의의 발효기술)이 개발되어 실용화되고 있다. 구체적으로는, 예를 들어, 대사에 의해 지질을 대량으로 생산하는 능력을 갖는 지질생산균을 들 수 있다. 대표적인 지질생산균으로서는、 모티에렐라 알피나(Mortierella alpina) 등의 모티에렐라속의 균류를 들 수 있다. 모티에렐라속의 균류는, 아라키돈산을 비롯하여 고도불포화지방산(PUFA)을 생산하는 것으로 알려져 있으며, 특히 공업적으로 유용한 균류이다(예를 들어, 일본 특공평7-34752(공고일:1995년 4월 19일, 공개공보:특개소63-44891, 공개일:1988년 2월 25일) 참조).

그러나, 상기 지질생산균 등의 미생물도 포함시키는 각종 유용생물에 있어서는, 육종, 즉 유용생물의 유전적 성질을 보다 바람직한 성질로 개량하는(품종개량하는)것이 행해지고 있다. 특히, 발효기술에서는, 미생물에 의한 화합물의 생산효율을 향상시키고, 이러한 화합물의 제조가격을 저감시키는 등의 관점에서, 육종은 대단히 중요한 것으로 부각되고 있다.

육종방법은, 기본적으로 유전적 이변을 포함하는 집단을 작출하는 공정(편의상, 집단작출공정이라고 한다)과, 이러한 집단으로부터 보다 바람직한 성질을 나타내는 품종을 선발하는 공정(편의상, 선발공정이라고 한다)으로 이루어져 있다. 집단작출공정 및 선발공정 모두 육종하려고 하는 유용생물의 종류에 따라 다양한 방법을 이용할 수 있지만, 상기 지질생산균 등의 미생물에서는, 집단작출공정에 있어서 주로 (1)변이처리에 의한 방법과 (2)형질전환에 의한 방법이 이용된다.

(1)변이처리에 의한 방법

변이처리에 의해 집단작출공정을 행하는 경우, 다양한 수법으로 미생물에 돌연변이를 발생시켜서 집단을 작출하는데, 돌연변이 그 자체는 무작위로 많은 종류가 발생하게 된다. 그렇기 때문에, 그 후의 선발공정에서 목적한 바의 형질을 나타내는 품종(주)을 취득할 수 있었다고 해도, 목적한 바의 형질에 관련된 유전자 이외의 다른 유전자에 예상외의 손상이 발생하고 있는 가능성을 부정할 수 없다. 예를 들어, 상기 지질생산균의 경우에는, 생산되는 지질의 종류에 변화가 발생해도, 증식이나 포자형성능 등이 악화되는 일이 있을 수 있다. 따라서, 변이처리에 의한 집단작출공정에서는, 반드시 생산성이 좋은 주를 얻을 수 있다고 말할 수 없다.

또한, 이러한 방법에서는, 상기와 같이, 얻어지는 집단을 형성하는 개체에는 무작위로 많은 종류의 돌연변이가 발생하게 된다. 그렇기 때문에, 그 후의 선발공정에 있어서 목적한 바의 성질을 나타내는 돌연변이체(주)를 얻기 위해서, 적절한 선발방법(스크리닝방법)이 없는 경우에는, 상기 집단을 형성하는 개체 전체에 대해서 돌연변이의 종류를 조사할 필요가 있어, 방대한 노력을 필요로 한다.

(2)형질전환에 의한 방법

한편, 형질전환에 의해 집단작출공정을 행하는 경우, 육종하려고 하는 유용생물을 숙주로 하여, 목적한 바의 성질을 획득하기 위해 필요한 DNA단편을 도입(형질전환)함으로써 형질전환체의 집단을 얻는다. 즉, 목적에 맞춘 특정 유전자만을 발현 제어한 집단을 작출하게 된다. 그렇기 때문에, 그 후의 선발공정에서는, 얻어진 형질전환체로부터 보다 바람직한 품종(주)만을 선발하면 되므로, 스크리닝이 용이해지고, 또한, 상기 다른 유전자에 예상외의 손상이 발생하는 것도 회피할 수 있다. 따라서, 육종을 위한 노력을 현저하게 저감시킬 수 있다.

이와 같이, 육종에 있어서의 집단작출공정에서는, 형질전환에 의한 방법이 바람직하게 사용되고 있다. 예를 들어 모티에렐라속의 균류가 속하는 사상균의 형질전환방법에 대해서는 다양한 기술이 보고되고 있다.

구체적으로는, (a)하기 문헌1~3 등에는, Aspergillus nidulans나 Neurospora crassa 등의 사상균을 파티클 딜리버리법에 의해 형질전환하는 기술이 개시되어 있다. 이들 기술에서는, 형질전환하는 숙주주로서 우라실 요구성주를 사용함과 동시에, 그것을 보완하는 유전자를 마커 유전자로서 사용하여 형질전환주를 선택하고 있다.

또, (b)상기 M.alpina의 형질전환방법으로서는, 하기 문헌4에 개시되어 있는 기술이 알려져 있다. 이 기술에서는, 포자를 프로토플래스트화하고, 일렉트로포레 이션법에 의해 유전자를 세포 내에 도입하고 있다. 또, 형질전환체의 스크리닝에는, 마커 유전자로서 대장균에서 유래하는 하이그로마이신B 내성유전자(hpt)를 사용하고 있다. 이에 의해, 하이그로마이신 함유 배지에서 생육할 수 있는 것을 형질전환체로서 선택할 수 있다.

문헌1 : Fungaro M. H. et al. Fems microbial Lett.,25,293-297,1995

문헌2 : Herzog R. W. et al. Appl. Microbial. Biotechnol.,45,333-337,1996

문헌3 : Armaleo, D. et al. Curr. Genet.,17,97-103,1990

문헌4 : Mackenzie D. A. et al. Appl. Environ. Microbial.,66,4655-4661,2000

그러나, 상술한 형질전환을 이용한 기술에서는, PUFA를 생산하는 지질생산균의 육종을 유효하게 효율적으로 행하는 것이 어렵다는 과제가 발생한다.

구체적으로는, 상기 (a)사상균을 파티클 딜리버리법에 의해 형질전환하는 기술을 사용하는 경우, 형질전환의 대상이 되는 상기 A. nidulans나 N. crassa 등의 사상균류는 지질생산성이 낮기 때문에, PUFA 등의 지질을 공업적으로 생산시키는 용도에는 적합하지 않다.

이에 반해, 상기 (b)문헌4에 개시되어 있는 기술에서는, 공업적으로도 이용가능한 지질생산균으로서 알려져 있는 M. alphina를 형질전환하는 기술이다. 그렇기 때문에, 상기 (a)의 기술에 비하면 공업적으로는 우수하다고 생각되어진다.

그러나, M. alphina로 대표되는 모티에렐라속의 균류는 모두 하이그로마이신 감수성이 아니다. 따라서, 이 기술을 사용하여 육종을 행하는 경우, 숙주가 되는 모티에렐라속의 균이 하이그로마이신 내성일 경우, 하이그로마이신 내성을 마커로서 사용할 수 없다.

PUFA의 대부분은 필수지방산이며, 생체 내에서 복잡한 생리기능에 관여하기 때문에, 최근 중요한 영양소로서 주목을 받고 있다. 그렇기 때문에, 보다 효율적으로 PUFA를 생산하는 발효기술이 요구되고 있는데, 이를 위해서는, 지질생산균으로서 신뢰성이 높은 모티에렐라속의 균류를 효율적으로 유효하게 육종하는 기술이 필요시 된다.

본 발명은, 상기 과제를 감안하여 이루어진 것이며, 그 목적은 항생물질에 관계없이 모티에렐라속에 속하는 지질생산균의 육종을 유효하게 효율적으로 행할 수 있는 육종방법을 제공하는 데 있다.

본 발명자들은 상기 과제를 감안하여 예의 검토한 결과, 지질생산균인 모티에렐라속의 균류의 영양요구성주를 취득하고, 그것을 보완하는 유전자를 마커 유전자로서 형질전환할 수 있는 시스템을 확립할 수 있으면, 모티에렐라속의 모든 균류의 주에 있어서 효율적이고 유효한 형질전환이 가능해짐과 동시에, 이 시스템을 이용하면, 셀프클로닝도 가능해져, 육종을 보다 효율적이고 유효하게 행할 수 있는 것을 발견하여 본 발명을 완성시키기에 이르렀다.

본 발명에 따른 지질생산균의 육종방법은, 모티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질생산균의 육종방법이며, 상기 지질생산균의 영양요구성주를 숙주로 하고, 마커 유전자로서 상기 영양요구성을 보완하는 유전자를 사용하여, 이러한 마커 유전자를 숙주에 도입하는 유전자 도입단계와, 상기 숙주의 영양요구성의 회복을 마커로 하여 형질전환주를 선발하는 선발단계를 갖는 형질전환공정을 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 육종방법에 있어서, 상기 지질생산균은, 모티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila) 또는 모티에렐라 클라미도스포라(Mortierella chlamydospora)인 것이 바람직하고, 상기 영양요구성주가 우라실 요구성주인 것이 바람직하고, 상기 마커 유전자로서, 오로티딘-5'-인산 디칼복실라제 유전자 또는 오로티딘산 파이로포스포릴라제 유전자가 이용되는 것이 바람직하다.

또한, 상기 육종방법에 있어서는, 상기 유전자 도입단계에서는, 일렉트로포레이션법 또는 파티클 딜리버리법을 사용할 수 있다.

또한, 상기 육종방법에 있어서는, 원종의 지질생산균으로부터 영양요구성주를 취득하는 영양요구성주 취득공정을 포함해도 좋다.

본 발명의 또 다른 목적, 특징 및 우수한 점은, 이하의 기재에 의해 충분히 이해될 것이다. 또한, 본 발명의 이익은, 첨부도면을 참조한 다음의 설명에 의해 명백해질 것이다.

본 발명의 일 실시예에 대해 설명하면 다음과 같으나, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는, 육종에 있어서의 유전적 변이를 포함하는 집단을 작출하는 공정(집단작출공정)으로서, 영양요구성을 마커로 한 형질전환공정을 실시한다. 구체적으로는, 지질생산균인 모티에렐라속의 균류의 영양요구성주를 취득하고, 이를 숙주로 하여 상기 영양요구성을 보완하는 유전자를 도입(형질전환)한다. 그 후, 상기 집단으로부터 상기 숙주의 영양요구성의 회복을 마커로 하여 형질전환주를 선발한다.

이하, 본 발명의 대상이 되는 모티에렐라속의 균류, 본 발명에 따른 육종방법 및 그 이용에 대해 각각 상세하게 설명한다.

(1)모티에렐라속의 균류

본 발명에 따른 육종방법의 대상이 되는 모티에렐라속의 균류로서는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 모티에렐라속으로 분류되는 각종 사상균을 들 수 있다. 모티에렐라속은, Mortierella와 Micromucor의 2아속으로 분류된다. Mortierella아속의 균은 모두 아라키돈산 등의 탄소수20의 지방산을 생산하나, Micromucor아속은 탄소수18 이하의 지방산만 생산한다. 본 발명의 대상이 되는 모티에렐라속의 균류는 상기 2아속 중 어느 것이어도 좋다.

모티에렐라속의 균류로서는, 구체적으로는, M.alpina, M.elongata, M.exigua, M.hygrophila, M.isabelina, M.turficola, M.gamsii, M.cogitans, M.capitata, M.vinacea, M.chlamydospora 등이 알려져 있는데, 물론 이에 한정되는 것은 아니다. 그 중에서도, 본 발명에서는, 지질생산균으로서 널리 이용되고 있는 M.alpina(모티에렐라 알피나)를 바람직하게 이용할 수 있다. M.alpina는 아라키돈 산(ARA)을 비롯한 PUFA를 균체 내에 축적하는 주가 알려져 있으며, PUFA의 생합성 연구용뿐 아니라, PUFA를 생산하는 공업용으로도 널리 이용되고 있다.

상기 M.alpina를 포함하는 모티에렐라속의 균류의 입수방법은 특별히 한정되는 것이 아니며, 재단법인 발효연구소나 ATCC(American Type Culture Collection) 등의 미생물 등 기탁기관으로부터 입수하면 된다. 또한, 특허출원되어 있는 주의 경우에는, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터로부터 입수할 수 있다. 또, 자연환경으로부터 모티에렐라속에 속하는 미지의 주를 공지된 스크리닝법에 의해 취득하여 사용해도 좋다.

(2)본 발명에 따른 지질생산균의 육종방법

본 발명에 따른 육종방법은, 상기 집단작출공정에 있어서 형질전환을 사용하는 형질전환공정을 포함하는 것이면 좋으나, 보다 바람직하게는, 영양요구성주 취득공정을 포함하고 있다. 물론 다른 공정을 포함하고 있어도 좋다. 이하, 각 공정에 대해서 상세하게 설명한다.

<영양요구성주 취득공정>

영양요구성주 취득공정은, 원종인 모티에렐라속의 균으로부터 영양요구성주(영양요구성 변이주)를 취득하는 공정이면 특별히 한정되지 않으며, 영양요구성주를 취득하기 위한 공지된 기술을 이용할 수 있다. 특히, 영양요구성에 관련된 유전자가 명백하면(예를 들어, 전게놈 해독에 의한 경우 등), 그 유전자를 손상시켜서 용이하게 영양요구성주를 취득할 수 있으므로 바람직하다.

영양요구성주의 구체적인 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어, 류신, 히스티딘, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 리신 등의 아미노산 요구성주 ; 우라실, 아데닌 등의 핵산염기 요구성주 ; 비타민 요구성주 ; 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어, 후술하는 실시예에서 설명한 바와 같이, 우라실 요구성주를 이용하고 있다. 우라실 요구성주의 경우, 특히, 모티에렐라속의 균에 있어서는 5-플루오로오로트산(5-FOA) 내성이라는 포지티브 실렉션을 마커로 하여 스크리닝을 시도할 수 있는 이점이 있다.

따라서, 영양요구성주 취득공정에서는, 특정 영양소를 결실된 합성 배지에 의해 성육할 수 없는 주를 취득하는 것만으로도 좋으나, 변이 유전자를 한정하는 스크리닝을 시도한 후에 주를 취득해도 좋다. 예를 들어, 우라실 요구성주의 취득에 있어서는, 상기 5-FOA를 사용하여 스크리닝을 시도하면, URA3 유전자 또는 URA5 유전자에 변이가 발생한 우라실 요구성주를 취득할 수 있다. 마찬가지로, 리신 요구성주의 취득에 있어서는, 아미노 아디핀산을 사용하여 스크리닝을 시도하면, LYS2유전자 또는 LYS5유전자에 변이가 발생한 리신 요구성주를 취득할 수 있다. 이와 같이, 변이유전자를 한정한 영양요구성주를 취득하면, 다음 단계의 형질전환공정에 사용하는 마커 유전자를 명확하게 특정할 수 있기 때문에 바람직하다.

<형질전환공정1/유전자 도입단계>

형질전환공정은, 상술한 바와 같이, 육종에 있어서의 집단작출공정에서 형질전환을 사용하는 공정이며, 유전자 도입단계와 선발단계의 두 단계를 적어도 거치는 공정이다. 물론, 필요에 따라서 이들 이외의 단계를 거쳐도 좋다.

본 발명에 있어서의 유전자 도입단계는, 모티에렐라속의 균류(지질생산균)의 영양요구성주를 숙주로 하고, 마커 유전자로서 상기 영양요구성을 보완하는 유전자를 사용하여, 상기 마커 유전자를 숙주에 도입하는 단계이면 특별히 한정되지 않는다.

상기 마커 유전자로서는, 영양요구성주의 변이(영양요구성 변이)를 보완하는 유전자이면 특별히 한정되지 않는다. 구체적으로는, 예를 들어 류신 요구성주의 경우에는 leu2 유전자, 히스티딘 요구성주의 경우에는 his3 유전자, 리신 요구성주의 경우에는 lys2 유전자, 트립토판 요구성주의 경우에는 trp1 유전자, 우라실 요구성주의 경우에는 ura3 유전자 또는 ura5 유전자, 아데닌 요구성주의 경우에는 ade2 유전자 등을 들 수 있다. 본 발명에서는, 예를 들어 후술하는 실시예에서 설명하는 바와 같이, 숙주를 우라실 요구성주로 하고, 마커 유전자로서 ura5 유전자를 사용하고 있다.

상기 각 마커 유전자의 취득방법도 특별히 한정되는 것이 아니며, 공지된 방법을 사용하여 효모 등의 이종의 (미)생물로부터 취득해도 좋고, 시판된 마커 유전자를 사용해도 좋다. 또한, 본 발명에서는, 셀프 클로닝이 가능하기 때문에 숙주인 모티에렐라속의 균으로부터 마커 유전자를 취득해도 좋다. 예를 들어, 후술하는 실시예에서는, 3종의 효모에 있어서의 ura5 유전자의 염기배열을 이용하여 숙주인 M.alpina로부터 ura5 유전자를 취득하고 있다.

상기 유전자 도입단계에서 사용되는 유전자 도입방법(형질전환방법)은 특별히 한정되는 것이 아니며, 일렉트로포레이션법, 파티클 딜리버리법 등의 종래의 공지된 방법을 적합하게 사용할 수 있다. 모티에렐라속의 균류에서는, 일렉트로포레 이션법을 사용하는 경우, 균체를 프로토플래스트화해 두는 것이 바람직하다. 또한, 상기 파티클 딜리버리법의 구체적인 일례로서는, 입자총법을 들 수 있으나, 물론 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 마커 유전자는, 발현가능한 상태가 되도록 모티에렐라속의 균체 내에 도입되면 되므로, 그 구체적인 구성은 한정되는 것이 아니다. 본 발명에서는, 적어도 프로모터를 연결하여 이루어지는 발현 카세트가 구축되고, 나아가, 이 발현 카세트에 염색체와 재조합하는 영역(재조합영역이라고 한다)이 연결된 유전자 구축물로서 구축되어 있으면 된다. 따라서, 상기 유전자 구축물은, 벡터 속에 삽입된 상태에서 상기 숙주에 도입되어도 좋고, 상기 유전자 구축물 그 자체로 도입되어도 좋다.

상기 유전자 구축물에 포함되는 마커 유전자의 발현 카세트는, 마커 유전자의 상류에 적어도 프로모터가 연결된 구성이면 좋으나, 나아가, 마커 유전자의 하류에 터이네이터가 연결된 구성인 것이 바람직하다. 또, 상기 유전자 구축물에는, 상기 마커 유전자의 발현 카세트 및 재조합 영역 이외에, 다양한 유전자를 발현시키는 발현 카세트를 도입가능하게 하기 위해서, 멀티클로닝사이트가 포함되어 있어도 좋다. 또한, 상기 유전자 구축물에는, 상기 마커 유전자의 발현 카세트(프로모터, 마커 유전자, 터미네이터)나 재조합영역, 또는 멀티클로닝사이트 이외의 DNA단편이 포함되어 있어도 좋고, 상기 유전자 구축물의 보다 구체적인 구성은 특별히 한정되는 것이 아니다.

상기 각 DNA단편의 구체적인 종류도 특별히 한정되는 것은 아니다. 예를 들 어, 프로모터의 경우, 마커 유전자를 유효하게 발현시킬 수 있는 프로모터이면 특별히 한정되지 않으며, 공지된 프로모터를 적합하게 사용할 수 있다. 후술하는 실시예에서는, hisH4.1 프로모터를 사용하고 있으나, 물론 이에 한정되는 것은 아니다. 마찬가지로, 터미네이터의 경우도, 전사종결부위로서의 기능을 가지고 있으면 특별히 한정되는 것이 아니며, 공지된 것이면 된다. 후술하는 실시예에서는, trpC터미네이터를 사용하고 있으나, 물론 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 재조합 영역의 경우, 모티에렐라속의 균체 내에 도입되는 마커 유전자를 염색체 내에 조합시켜서 존재시키는 DNA 세그먼트이면 특별히 한정되지 않는다. 후술하는 실시예에서는 18S리보솜 DNA(18Sr)을 사용하고 있다.

상기 유전자 구축물을 벡터에 조합시켜서 발현 벡터로 하는 경우도 특별히 한정되는 것이 아니며, 일반적인 재조합 발현 벡터로 되어 있으면 된다. 재조합 발현 벡터의 제작에는, 플라스미드, 파지, 코스미드 등을 사용할 수 있는데, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 제작방법도 공지된 방법을 사용하여 행하면 된다. 통상, 플라스미드를 바람직하게 사용할 수 있다.

<형질전환공정2/선발단계>

형질전환공정에 있어서의 선발단계는, 상기 숙주의 영양요구성의 회복을 마커로 하여 형질전환주를 선발하는 단계이면 특별히 한정되는 것이 아니며, 공지된 방법을 적합하게 사용할 수 있다. 즉, 마커가 되는 영양요구성에 기초하여, 합성배지로부터 특정 영양소를 제거하고, 상기 유전자 도입단계 후에 얻어진 형질전환체를 합성배지에서 배양하면 된다. 이에 의해, 용이하고 효율적으로 형질전환체를 스크리닝할 수 있다.

이와 같이, 본 발명에서는, 형질전환공정에 있어서 영양요구성을 마커로서 사용하고 있다. 영양요구성 마커는, 조작의 간편함, 낮은 백그라운드, 숙주로서의 모티에렐라속의 균에서 유래하는 유전자가 이용될 수 있는 등의 이점이 있다. 또, 항생물질 내성을 마커로 한 경우와 비교하면, 식품개발에 유리하다는 등의 이점도 있다.

구체적으로는, 예를 들어, 배경기술에서 언급한 상기 문헌4의 기술, 즉 하이그로마이신 내성을 마커로 하는 경우를 예로 들면, 선발된 형질전환체를 안정되게 성육시키기 위해서는, 배지에 하이그로마이신을 첨가해둘 필요가 있다. 그렇기 때문에, 이 형질전환체를 이용하여 생산되는 지질에 하이그로마이신이 혼입할 가능성이 있는데, 지질을 식품용도로 사용할 경우에는, 하이그로마이신의 혼입은 피해야 한다.

여기서, 예를 들어, 영양요구성이 우라실 요구성주인 경우를 예로 들면, 실생산에 있어서 우라실 결손배지를 사용하여 배양함으로써, ura5 유전자 등의 영양요구성을 보완하는 유전자가 도입된 균체를 선택하면서 지질을 생산하는 것이 가능해진다. 즉, 영양요구성을 마커로 하면, 하이그로마이신의 혼입을 피할 수 있고, 아울러 항상 셀렉션을 시도한 배양이 가능해지는 이점도 있다. 그렇기 때문에, 본 발명과 같이 영양요구성 마커를 사용하는 것은 보다 바람직하다.

<선발공정>

본 발명에 따른 지질생산균의 육종방법에서는, 상기 형질전환공정에 있어서, 영양요구성 마커로서 다양한 유전자를 도입함으로써, 다양한 성질을 나타내는 주의 집단을 얻는 것이 가능하다. 그렇기 때문에, 본 발명에서는, 상기 형질전환공정 후에 얻어진 집단으로부터 보다 바람직한 성질을 나타내는 품종을 선발하는 선발공정을 실시해도 좋다. 또한, 여기서 말하는 "선발공정"은, 상기 형질전환공정에 있어서의 "선발공정"과는 다르며, 영양요구성을 마커로 하여 형질전환주를 선택하는 것이 아니라, 얻어진 다수의 형질전환주로부터 보다 바람직한 성질을 나타내는 형질전환주를 선택하는 공정을 가리킨다.

선발공정의 구체적인 수법은 특별히 한정되지 않으며, 육종의 목적에 따라 바람직한 성질을 나타내는 형질전환주를 선택할 수 있는 조건을 설정하여, 공지된 수법에 기초하여 바람직한 형질전환주를 선택하면 된다.

(3)본 발명의 이용

본 발명에 따른 지질생산균의 육종방법은, 상기와 같이, 영양요구성을 마커로 하여, 유전적 변이를 포함하는 집단으로부터 보다 바람직한 성질을 나타내는 품종을 선발(스크리닝)하도록 되어 있다. 그렇기 때문에, 모티에렐라속에 속하는 지질생산균을 원종으로 하여, 신규 품종(신규 주)을 효율적으로 유효하게 생산하는 것이 가능해진다. 모티에렐라속의 균은 지질생산균으로서 잘 알려져 있으며, M.alpina와 같이 신뢰성이 높은 것도 포함되어 있으므로, 예를 들어, 지질생산성을 한층 높인 주를 용이하고 효율적으로 생산하는 것이 가능해진다.

또, 본 발명에 따른 육종방법에서는, 형질전환을 행하는 지질생산균의 유전자만을 사용하여 형질전환할 수 있으므로, 셀프클로닝이 가능해진다. 그렇기 때문 에, 본 발명에서는, 원종의 모티에렐라속의 균으로부터 적당한 DNA단편을 취득하여 이것을 영양요구성주에 도입하고, 특정 유전자의 발현조절(고발현, 발현시기의 조절, 발현억제 등)하는 것이 가능해져서, 지질생산량의 증가, 생산할 수 있는 지질의 종류의 개변, 조성의 개변 등이 가능한 형질전환체, 즉 신규 주를 얻을 수 있다. 물론, 본 발명에서는 셀프클로닝이 아니라, 다른 종에서 유래하는 DNA단편을 영양요구성주에 도입할 수 있는 것은 말할 필요도 없다.

본 발명에 따른 육종방법에서는, 예를 들어 셀프클로닝의 경우, 원종(숙주)의 모티에렐라속의 균으로부터 적당한 DNA단편을 취득하는 방법은 특별히 한정되지 않으며, 공지된 방법을 사용할 수 있다. 또, 여기서 말하는 적당한 DNA단편(예를들어, 도입하고 싶은 유전자 등)은, 숙주가 되는 모티에렐라속의 균에 있어서, 목적으로 하는 바보다 바람직한 성질을 실현할 수 있는 DNA단편, 또는 이러한 성질을 실현할 수 있는 가능성이 있는 DNA단편이면 특별히 한정되지 않는다.

이 DNA단편은, 상기 ura5 유전자와 마찬가지로, 적어도 프로모터와, 바람직하게는 터미네이터와도 연결함으로써 발현 카세트가 구축된 상태에서, 재조합 발현 벡터 속에 삽입되어 있으면 좋으나 이에 한정되지 않는다. 후술하는 실시예에서는, 상기 DNA단편으로서, GLELO유전자를 사용하고 있으나, 물론 본 발명은 이에 한정되지 않는다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예1]

본 실시예에서는, 본 발명에 따른 육종방법의 일례로서, 우라실 요구성주를 취득하고, 이를 형질전환하여 선발하는 구체예에 대해 설명한다.

(1)우라실 요구성주의 취득(영양요구성주의 취득공정)

M.alpina의 포자를 형성시키기 위해, Czapek-Dox배지(3%수크로오스, 0.2%N aNO₃, O.1%KH₂PO₄, 0.05%KCl, 0.05%MgSO₄?7H₂O, 0.001%FeSO₄?7H₂O, 2%한천, pH6.0으로 조정)에 본 균을 식균하여 28℃에서 약 2주간 배양했다. 이것을 Tween80 수용액(ldrop/100mlH₂0)으로 현탁시켜, 글라스 필터(이와키 가라스 주식회사 제품, 상품번호:3G1)로 균사를 제거하여 포자액을 조제했다. 변이처리는 1×10⁸~10⁹개의 포자에 대해, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)를 사용하여, jareonkitmongkol들의 방법(S. jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69, 939-944, 1992)에 따라서 행했다.

변이처리한 포자를 1.0mg/ml의 5-FOA와 0.05mg/ml의 우라실을 포함하는 GY 배지(2%글루코오스, 1%효모 엑기스, 2%한천, pH6.0로 조정)에 도포하고, 28℃에서 4일간 배양함으로써 5-FOA 내성 주를 6주 얻었다. 이들 주에 대해서 우라실 요구성의 평가를 행했다.

즉, SC배지(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco 회사제품)5.0g, (NH₄)₂SO₄1.7g, 글루코오스20g, 한천20g, 아데닌20mg, 티로신30mg, 메티오닌1.0mg, 아르기닌2.0mg, 히스티딘2.0mg, 리신4.Omg,트립토판4.0mg, 스레오닌5.0mg, 이소류신6.0mg, 류신6.Omg, 페닐알라닌6.0mg/리터) 및 우라실 첨가 SC배지(우라실50mg/리터)에 있어서의 생육 비교를 행했다.

그 결과, 6주의 5-FOA 내성 주 모두가 우라실을 포함하는 배지에서는 친주와 마찬가지로 생육할 수 있었으나, 우라실을 포함하지 않는 배지에서는 생육이 좋지 않았고, 그 중 2주는 전혀 생육할 수 없었다. 이들 주를 각각 △ura-1주, △ura-2주로 명명했다.

(2)효소활성의 측정

5-FOA 내성 그리고 우라실 요구성이라는 표현계를 나타내는 경우, 오로티딘-5'-인산 디칼복실라제(ura3 유전자에 코드화되는 효소로 ura3p라고 약칭한다) 또는 오로티딘산 파이로포스포릴라제(ura5 유전자에 코드화되는 효소로 ura5p라고 약칭한다) 활성이 결실되어 있는 것으로 생각되어진다. 그렇기에, 상기 △ura-1주 및 △ura-2주에 대해 이들의 효소활성을 측정했다.

각각의 주를 우라실 첨가 GY배지에서 28℃, 4일간 진탕 배양했다. 균체의 무세포추출액의 조제는, Wynn들의 방법(J.P.Wynn et al. Microbiology, 146, 2325-2331, 2000)을 개량하여 행했다.

즉, 0.05mg/ml의 우라실을 포함하는 GY액체배지에서 28℃, 4일간 배양한 균체를, 5mMβ-메르캅토에탄올을 포함하는 0.1M트리스버퍼(pH7.5)로 현탁시켰다. 그 후, 프렌치프레스를 사용하여 35MPa로 세포를 파쇄하여 원심분리했다. 얻어진 상청을 무세포추출액으로 했다. 또한, 100,000×g, 60min의 조건에서 초원심분리함으로써 오거넬라를 제거하여 가용성 획분을 얻었다.

얻어진 가용성 획분을 이용하여, ura3p활성을 Yoshimoto들의 방법(A. Yoshimoto et al. Methods in Enzymology Vol 51, 74-79, ACADEMIC PRESS 1978)에 따라서 측정했다. 동일하게 얻어진 가용성 획분을 사용하여, ura5p활성을 Umezu들의 방법(K. Umezu et al. J. Biochem., 70, 249-262, 1971)에 따라서 측정했다. 그 결과, 즉 피리미딘 생합성에 관련된 효소활성의 비교를 표1에 도시한다. 표1의 결과에서 명백한 바와 같이, 이들 2주는 모두 ura3p의 활성은 신주와 동일한 정도였으나, 그에 반해 ura5p활성은 전혀 검출되지 않았다.

또한,별도로 조제한 10⁸~10⁹개의 포자에 대해서 동일한 변이처리를 행한 결과, 5주의 5-FOA 내성 주가 얻어졌고, 그 중 3주는 우라실을 포함하지 않는 배지에서는 전혀 생육할 수 없었다.

[표1]

주	ura3p(mU/mg)	ura5p(mU/mg)
wild type	15.2	20.2
△ura-1	12.6	?
△ura-2	21.2	?

※?:검출되지 않음

(3)M.alpina의 게놈 DNA의 취득 및 cDNA 라이브러리의 제작

M.alpina와, 이것을 원종(wild type)으로서 유도한 우라실 요구주(상기 △ura-1주 및 △ura-2주)를 각각 GY액체배지에서 28℃, 5일간 배양하여 얻어진 균체로부터 Sakuradani들의 방법(E. Sakuradani et al. Eur. J. Biochem., 260, 208-216, 1999)에 따라서 게놈 DNA를 조제했다.

M.alpina의 포자를, 액체배지(2%글루코오스, 1%효모엑기스, pH6.0으로 조정)에 식균하고, 28℃에서 4일간 배양했다. 균체를 회수하고, 염산 구아니딘/CsCl법 으로 전체 RNA를 조제했다. Oligotex-dT30<Super>mRNA Purification Kit(From Total RNA)(상품명, 다카라바이오 회사제품)을 사용하여, 전체 RNA로부터 mRNA의 정제를 행하여, ZAP-cDNA Synhesis Kit(상품명, STRATAGENE 회사제품)을 사용하여 cDNA 라이브러리를 제작했다.

(4)M.alpina로부터의 ura5 cDNA의 취득

3종의 효모 Glomerella graminicola, Saccharomyces cerevisiae 및 Sordaria macrospora에 있어서의 ura5p의 아미노산 배열에 대해서, 그 상동성이 극히 높은 두개의 영역인 다음과 같은 아미노산 배열

영역1:FGPAYKGIP(배열번호1 참조)

영역2:KEAKDHGEG(배열번호2 참조)

에 기초하여, 다음 염기배열을 갖는 센스프라이머 및 안티센스프라이머를 합성했다. 또한, 하기의 프라이머에 있어서의 I는 이노신을 나타내고 있다. 또, 배열표에서는 이노신에 상당하는 부위는 n으로 나타내고 있다.

센스프라이머:5'-TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC-3'(배열번호3)

안티센스프라이머:5'-CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT-3'(배열번호4)

다음에, T Gradient 서모사이클러(상품명, Biometra 회사제품)에 의해 M.alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하여, 상기 2개의 프라이머로, Ex Taq polymerase (다카라바이오 회사제품)을 사용하여 PCR을 행했다. 이때의 PCR 조건은, 94℃에서 1min, 52℃에서 1min 및 72℃에서 2min을 1사이클로 하여 35사이클 후에 72℃에서 10min 신장시키는 조건으로 하였다.

그 결과, 약 130bp DNA단편이 얻어져, 이 DNA단편의 염기배열을 결정했다. 이 DNA단편은 기지의 ura5 유전자와 높은 상동성을 나타냈다. 이 DNA단편을 프로브로 하여, (3)에서 조제한 M.alpina의 cDNA 라이브러리를 플랙하이브리디제이션에 의해 스크리닝함으로써, M.alpina의 ura5 유전자의 cDNA를 포함하는 플라스미드pBMAURA5를 얻었다.

또한, ura5 유전자의 cDNA는, 배열번호5에 나타나는 염기배열을 가지고 있으며, 이 ura5 유전자에 코드화되어 있는 ura5p는 배열번호6으로 나타나는 아미노산 배열을 가지고 있다.

(5)ura5 게놈 DNA의 클로닝

상기 ura5 유전자의 cDNA배열(배열번호5)을 기초로, 다음에 나타내는 프라이머 CRON1 및CRON2

프라이머 CRONl:CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC(배열번호7)

프라이머 CRON2:GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC(배열번호8)

을 합성하여, M.alpina의 게놈 DNA를 주형으로 하여, PCR에 의해 ura5 게놈DNA를 클로닝했다. 이때의 PCR 조건은, 94℃에서 1min, 55℃에서 1min 및 72℃에서 2min을 1사이클로 하여 30사이클 후에 72℃에서 10min 신장시키는 조건으로 하였다. 그 결과, ura5 게놈 유전자 상에 인트론이 존재하지 않는 것이 명백해졌다.

(6)영양요구성주에 있어서의 변이부위의 특정

상기 프라이머 CRON1 및 CRON2를 사용하여, 우라실 요구성주인 △ura-1주 및 △ura-2주의 게놈 DNA를 각각 주형으로 하여 PCR을 행하여, 각각의 주의 ura5 게놈 유전자를 클로닝했다. 또한, 이때의 PCR 조건은, 94℃에서 1min, 55℃에서 1min 및 72℃에서 2min을 1사이클로 하여 30사이클 후에 72℃에서 10min 신장시키는 조건으로 하였다. 그 결과, △ura-1주에서는, 개시 코돈으로부터 세어서 93번째 염기에 1염기의 아데닌의 삽입이 있어, ORF 내에서 프레임 쉬프트를 발생시키고 있었다. 한편, △ura-2주에서는, 398번째 구아닌이 아데닌으로 치환되어 있으며, 모티프 배열 내의 133번째의 글리신이 아스파라긴산으로 치환되어 있었다. 이들 변이의 결과, 상기 2주는 ura5p 활성을 잃은 것이 시사되었다.

(7)재조합 발현 벡터:pDura5의 구축

플라스미드pD4(D.B.Archer에 의해 분양, 상기 문헌4 참조)를 제한효소 NcoI 및 BamHI로 소화하고, DNA Blunting Kit(상품명, 다카라바이오 회사제품)를 사용하여 말단을 평활화한 후, 하이그로마이신 B내성 유전자인 hpt^mod단편을 제외한 5.4kbp의 DNA단편을 GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(상품명, 아마샴바이오사이엔스 회사제품)을 사용하여 정제했다. (4)에서 얻어진 상기 pBMAURA5를 제한효소 EcoRI 및 Xhol로 소화하고, 말단을 평활화한 후, ura5 cDNA를 포함하는 약 0.65kbp의 단편을 정제했다. 이들 2개의 단편을 ligation high(상품명, 토요보 회사제품)를 사용하여 연결했다. ura5 유전자의 방향을 확인하고, ura5 유전자의 5'상류측에 hisH4.1 프로모터, 3'하류측에 trpC 터미네이터가 연결되어 있는 것을 선택하여, 플라스미드pDura5로 하였다.

(8)pDura5에 의한 형질전환(형질전환공정)

형질전환주의 선택배지에는 SC한천배지를 사용했다. 숙주가 되는 △ura-1주의 포자 10⁸개를 SC한천배지에 도포했다. 상기 pDura5는 파티클 딜리버리법에 의해 숙주에 도입(형질전환)했다. PDS-1000/He 파티클 딜리버리 시스템(상품명, BIO RAD 회사제품)에 의한 유전자 도입은, 헬륨압:7590kPa(1100psi), 챔버 내의 진공:28인치 Hg, 타겟과의 거리 3㎝, 텅스텐 입자경 1.1㎛의 조건에서 행했다. 유전자 도입후, 28℃에서 2~3일간 배양하면 4개의 콜로니가 생육하게 되어 이들을 형질전환주로서 취득했다. 또한, 편의상, 이들 형질전환주에 대해 #1~#4의 번호를 부여했다.

형질전환주#1~#4에 유전자기 도입되는지 여부를 PCR로 확인했다. 즉, 각각의 형질전환주에 의해 게놈 DNA를 조제하고, 이를 주형으로 하여 다음에 도시하는 프라이머 RDNA1 및 RDNA2

프라이머 RDNA1: ACAGGTACACTTGTTTAGAG(배열번호 9)

프라이머 RDNA2: CGCTGCGTTCTTCATCGATG(배열번호 10)

과, Ex Taq polymerase(다카라바이오 회사제품)를 사용하여 PCR을 행했다. 이때의 PCR 조건은, 94℃에서 1min, 54℃에서 1min 및 72℃에서 1min을 1사이클로 하여 35사이클 후에 72℃에서 10min 신장시키는 조건으로 하였다. 또한, 콘트롤로서, △ura-1주에 대해서도 동일하게 하여 PCR로 확인했다.

그 결과, 숙주로서의 △ura-1주에서는, DNA의 증폭이 보여지지 않았으나, 그 반면, 형질전환주#1~#4에서는 모두 1.5kbp의 DNA단편 증폭이 확인되었다. 이로 인 해, 상기 #1~#4의 18SrDNA영역에서 플라스미드 pDura5와 재조합이 발생하여 ura5 유전자가 도입되는 것이 확인되었다.

또한, 상기 형질전환주#1~#4를 SC액체배지 중에 28℃에서 4일간 진탕 배양하여, ura5p효소활성을 측정했다. 그 결과, 즉 ura5p효소활성의 비교를 표2에 도시했다. 표2의 결과로부터 명백한 바와 같이, 형질전환주#1~#4에서는 야생주와 동일한 정도 또는 수배의 활성을 회복하고 있으며, 도입한 ura5 유전자가 유효하게 기능하고 있는 것으로 나타났다.

[표2]

주	ura5p
wild type	59.0
형질전환주#1	556.0
형질전환주#2	45.6
형질전환주#3	55.2
형질전환주#4	295.0

또한, △ura-1주의 포자 약 10⁸개에 대해, 동일한 유전자 도입조작을 별도로 2회 행하여, 28℃에서 2~3일간 배양한 결과, 각각 3개 및 4개의 콜로니가 생육되어, 형질전환에 재현성이 있는 것으로 확인되었다.

[실시예2]

본 실시예에서는, 상기 실시예1에 있어서 구축된 우라실 요구성주를 이용한 육종방법을 사용하여, 신규 주인 GLELO 유전자 도입주를 창출하는 예에 대해서 설명한다.

(1)pDura5GLELO 벡터의 구축

γ-리놀렌산을 디호모γ-리놀렌산으로 하는 지방산 쇄장 효소를 코드화하는 GLELO 유전자는, J. M. Parker-Barnes et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 97(15), 8284-8289, 2000에 기재되어 있는 배열GB의 ID:AF206662의 염기배열에 기초하여, M.alpina의 cDNA를 주형으로 하여 PCR에 의해 증폭함으로써 취득했다. 이때, 다음에 나타내는 프라이머 MAGLEL01 및, MAGLEL02을 사용했다.

프라이머 MAGLEL01: CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC(배열번호 11)

프라이머 MAGLEL02: GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(배열번호 12)

증폭된 GLELO유전자를 제한요소 NcoI 및 BamHI로 소화하여 약 1kb의 단편을 얻었다. 또, pD4를 제한효소 NcoI 및 BamHI로 소화하여 약 7.7kb의 단편을 얻었다. 상기 각 단편을 ligation high(상품명, 토요보 회사제품)를 사용하여 연결하여, 플라스미드 pDGLELO를 얻었다.

한편, pDura5를 EcoRI로 부분 소화하고, 2군데 있는 EcoRI 사이트 중 1군데에서만 절단된 약 6.2kb의 DNA단편을 정제했다. 이 단편을 DNA Bluntiong Kit(상품명, 다카라바이오 회사제품)에 의해 말단을 평활화한 후, ligation high(상품명, 토요보 회사제품)에 의해 자기결합(self-ligation)시켜, 히스톤4.1 프로모터의 5'상류측이 되는 사이트만 남은 것을 선택하여 pDura5'로 하였다. 또, 상기 pDGLELO를 EcoRI로 소화하여 2.7kb의 단편을 얻고, 이를 상기 pDura5'의 EcoRI 사이트에 삽입했다. 그 중, GLELO 발현 카세트 및 ura5 발현 카세트가 동일한 방향으로 배열된 플라스미드를 선택하여, 이를 재조합 발현 벡터 pDura5GLELO로 하였다.

(2)pDura5GLELO에 의한 형질전환(형질전환공정)

실시예1의 (8)과 동일한 방법에 의해, △ura-1주를 형질전환하여, 형질전환 주 3주를 취득했다. 또한, 편의상 이들 형질전환주에 대해 #5~#7의 번호를 부여했다.

이들 형질전환주#5~#7에 pDura5GLELO가 도입되는지 여부를 실시예1의 (8)과 동일하게, 프라이머 RDNA1 및 RDNA2를 사용하여 PCR로 확인했다. 그 결과, 3주 모두 1.5kbp의 DNA단편의 증폭이 확인되었다. 이로 인해, 이들 3주의 18SrDNA 영역에서 pDura5GLELO와의 재조합이 발생하여 ura5 유전자가 도입되어 있는 것이 확인되었다.

(3)GLELO 유전자의 발현해석

실시예1에서 창출한 2종류의 ura5 유전자 도입주#1/#2와, 상기 (2)에서 취득한 GLELO 유전자 도입주#5~#7(지질분석을 행한 것과 동일한 배양조건의 균체)로부터, RNeasy plant mini kit(상품명, QIAGEN 회사제품)을 이용하여 전체 RNA를 추출했다. 1㎍의 전체 RNA를 SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(상품명、Invitrogen 회사제품)을 사용하여, 랜덤 헥사머를 프라이머로 하여 역전사반응을 행하여 cDNA를 합성했다. 합성된 cDNA 중 1㎕(1/20량)을 주형으로 하여, 다음에 나타내는 프라이머 MAGLEL05 및 MAGLEL06

프라이머 MAGLEL05: CTTTGTGGGCATGCAGATCA(배열번호 13)

프라이머 MAGLEL06: TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA(배열번호 14)

와, Ex Taq polymerase(다카라바이오 회사제품)을 사용하여 PCR을 행했다. 이때의 PCR 조건은, 94℃에서 1min, 55℃에서 1min 및 72℃에서 2min을 1사이클로 하여 20사이클 후에 72℃에서 10min 신장시키는 조건으로 하였다.

얻어진 PCR 산물을 전기영동하여, 약 300bp의 프래그먼트의 밴드에 대해, 그 형광농도를 비교했다. 그 결과, ura5 유전자 도입주에서는 2주 모두 밴드의 형광농도가 엷었으나, GLELO 유전자 도입주는 3주 모두 명확한 농도의 밴드를 확인할 수 있었다. 한편, PCR을 동일하게 30사이클에서 행한 경우에는, 어느 주에 있어서도 명확한 농도의 밴드를 검출할 수 있었다. 이로 인해, GLELO 유전자 도입주에서는, GLELO 유전자의 발현량이 증가하고 있는 것이 시사되었다.

(4)GLELO 유전자 도입주의 지질분석

실시예1에서 창출한 2종류의 ura5 유전자 도입주#1/#2와, 상기 (2)에서 취득한 GLELO 유전자 도입주#5~#7의 포자를 각각 액체배지(5%글루코오스, 1%효모엑기스, pH6.0으로 조정)에 식균하고, 28℃에서 7일간 진탕 배양했다. 배양 후, 균체를 여과에 의해 모아서 건조하여 칭량했다. 염산 메탄올법에 의해 균체 내의 지방산 잔기를 메틸에스테르에 유도한 후, 헥산으로 추출하여, 헥산을 유거하여 얻어진 지방산 메틸에스테르를 가스 크로마토그래피로 분석했다. 얻어진 결과, 즉 상기 각 유전자 도입주(형질전환체)를 성육시켰을 때의 건조균체 중량과, 각 주의 균체 내에 있어서의 지방산 조성과 총 지질생산량을 표3에 도시한다.

또한, 표에서 16:0은 팔미트산을 나타내고, 18:0은 스테아린산을 나타내고, 18:1이 올레산을 나타내고, 18:2가 리놀산을 나타내고, 18:3이 γ-리놀렌산을 나타내고, 20:3이 디호모-γ-리놀렌산을 나타내고, 20:4가 아라키돈산을 나타내고, 24:0이 리그노세린산을 나타낸다.

[표3]

균체	ura5 유전자 도입주		GLELO 유전자 도입주
균체	#1	#2	#5	#6	#7
건조균체 중량(mg/배지1mL)	14.8	11.7	18.1	18.6	16.8
지방산조성(%) 16:0 18:0 18:1 18:2 18:3 20:3 20:4 24:0 그 외	23.0 5.7 34.0 6.5 3.8 3.8 16.3 2.6 4.3	21.1 5.9 33.8 8.0 4.1 3.6 14.5 2.6 6.4	23.1 6.5 32.8 4.5 1.9 3.8 19.3 3.7 4.4	22.3 6.1 32.4 5.8 2.7 4.1 20.3 3.0 3.3	22.8 8.1 30.0 5.1 2.4 4.3 20.7 3.0 3.6
지질생산량 (mg/배지1mL) 총지질 20:3 20:4	5.07 0.20 0.82	3.48 0.13 0.50	7.32 0.28 1.41	7.94 0.33 1.61	6.33 0.27 1.31
지질함량(mg/ 건조균체1g) 총지질 20:3 20:4	342 13.2 55.6	297 10.6 42.9	406 15.5 78.1	427 17.9 86.7	377 16.1 78.0
20:3/18:3비	1.01	0.88	1.99	1.57	1.77
(20:3+20:4)/ 18:3비	5.3	4.4	12.0	9.2	10.3

표3의 결과로부터 명백한 바와 같이, GLELO 유전자를 도입함으로써, 건조균체 중량이 증가하고, 총 지방산 중에 차지하는 디호모-γ-리놀렌산 및 아라키돈산의 비율이 증가함과 동시에, γ-리놀렌산의 비율이 감소했다. 또, 총 지질생산량, 총 지질함량도 증가하여, 디호모-γ-리놀렌산 및 아라키돈산의 생산량 및 함량도 증가했다. 쇄장연장반응의 생성물인 디호모-γ-리놀렌산과 그 기질인 γ-리놀렌산과의 비(20:3/18:3 비) 또는 디호모-γ-리놀렌산의 대사물인 아라키돈산도 합계한 것과 γ-리놀렌산과의 비((20:3+20:4)/18:3 비)는, GLELO 유전자 도입주에 있어서 현저하게 큰 값을 나타냈다.

[실시예3]

본 실시예에서는, M.alpina 이외의 모티에렐라속의 균에 대해, 본 발명에 따른 육종방법을 적용한 구체예에 대해 설명한다.

(1)우라실 요구성주의 취득(영양요구성주의 취득공정)

M. hygrophila 및 M. chlamydospora의 포자를 형성시키기 위해서, Czapek-Dox배지(3%수크로오스, 0.2%NaNO₃, O.1%KH₂PO₄, 0.05%KCl, 0.05%MgSO₄?7H₂O, 0.001%FeSO₄?7H₂O, 2%한천, pH6.0으로 조정)에 이들 균을 각각 식균하고, 28℃에서 약 2주간 배양했다. 이것을 Tween80 수용액(ldrop/100mlH₂0)으로 현탁시켜, 글라스 필터(이와키 가라스 주식회사 제품, 상품번호:3G1)로 균사를 제거하여 포자액을 조제했다. 변이처리는 1×10⁸~10⁹개의 포자에 대해, N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG)를 사용하여, jareonkitmongkol들의 방법(S. jareonkitmongkol et al. JAOCS, 69, 939-944,1992)에 따라서 행했다.

변이처리한 포자를 1.0mg/ml의 5-FOA와 0.05mg/ml의 우라실을 포함하는 GY 배지(2%글루코오스, 1%효모 엑기스, 2%한천, pH6.0으로 조정)에 도포하고, 28℃에서 4일간 배양하여 생육할 수 있는 5-FOA 내성 주를 M.hygrophila로부터 2주, M.chlamydospora로부터 1주 얻었다. 이들 주에 대해서 우라실 요구성의 평가를 행했다.

즉, SC배지(Yeast Nitrogen Base w/o Amino Acids and Ammonium Sulfate(Difco 회사제품)5.0g, (NH₄)₂SO₄1.7g, 글루코오스20g, 한천20g, 아데닌 20mg, 티로신30mg, 메티오닌1.0mg, 아르기닌2.0mg, 히스티딘2.0mg, 리신4.Omg, 트립토판4.0mg, 스레오닌5.0mg, 이소류신6.0mg, 류신6.Omg, 페닐알라닌6.0mg/리터) 및 우라실 첨가 SC배지(우라실50mg/리터)에 있어서의 생육 비교를 행했다.

그 결과, 얻어진 5-FOA 내성 주 모두가 우라실을 포함하는 배지에서는 친주와 동일하게 생육할 수 있었으나, 우라실을 포함하지 않는 배지에서는 생육이 좋지 않았고, 그 중 M.hygrophila의 1주(MH-△ura-1로 명명), M.chlamydospora(MC-△ura-1로 명명)는 전혀 생육할 수 없었다.

(2)효소활성의 측정

상기 2주를 우라실 첨가 GY배지에서 28℃로 4일간 진탕 배양했다. 균체의 무세포추출액의 조제는, Wynn들의 방법(J.P.Wynn et al. Microbiology, 146, 2325-2331, 2000)을 개량하여 행했다.

즉, 0.05mg/ml의 우라실을 포함하는 GY액체배지에서 28℃로 4일간 배양한 균체를, 5mMβ-메르캅토에탄올을 포함하는 0.1M트리스버퍼(pH7.5)로 현탁시켰다. 그 후, 프렌치프레스를 사용하여 35MPa로 세포를 파쇄하여 원심분리했다. 얻어진 상청을 무세포추출액으로 했다. 또한, 100,000×g, 60min의 조건에서 초원심분리함으로써 오거넬라를 제거하여 가용성 획분을 얻었다.

얻어진 가용성 획분을 이용하여, 오로티딜산 파이로포스포릴라제(ura5p) 활성을 Umezu들의 방법(K. Umezu et al. J. Biochem., 70, 249-262, 1971)에 따라서 측정했다. 그 결과 모든 주에서 ura5p활성은 검출한계 이하였다.

(3)pDura5에 의한 형질전환(형질전환공정)

M.hygrophila MH-△ura-1 또는 M.chlamydospora MC-△ura-1을 Czapek-Dox배지에 식균하고, 28℃에서 약 2주간 배양하여 포자를 형성시켰다. 상기 (1)에 기재한 바와 같이 포자를 회수했다.

형질전환주의 선택배지에는 SC한천배지를 사용했다. pDura5는 파티클 딜리버리법에 의해 숙주에 도입(형질전환)했다. PDS-1000/He 파티클 딜리버리 시스템(상품명, BIO RAD 회사제품)에 의한 유전자 도입은, 헬륨압:7590kPa(1100psi), 챔버 내의 진공:28인치 Hg, 타겟과의 거리 3㎝, 텅스텐 입자경 1.1㎛의 조건에서 행했다. 유전자 도입 후, 28℃에서 2~3일간 배양하면 각각 십수개의 콜로니가 생육하게 되어 이들을 형질전환주로서 취득했다.

또한, 본 발명에서 이루어진 구체적인 실시형태 또는 실시예는, 어디까지나 본 발명의 기술내용을 명확히 하는 것에 불과하기에, 그와 같은 구체예에만 한정하여 협의로 해석되어서는 안되며, 본 발명의 정신과 다음에 기재하는 특허청구범위 내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있다.

본 발명에 따른 지질생산균의 육종방법은, 상기와 같이, 상기 지질생산균의 영양요구성주를 숙주로 하여, 마커 유전자로서 상기 영양요구성을 보완하는 유전자를 사용하여, 이러한 마커 유전자를 숙주로 도입(유전자 도입단계)하고, 상기 숙주의 영양요구성의 회복을 마커로 하여 형질전환주를 선발(선발단계)하는 형질전환공정을 포함하는 구성이다. 그렇기 때문에 모티에렐라속에 속하는 지질생산균을 원종으로 하여, 신규품종(신규 주)를 효율적이고 유효하게 생산할 수 있는 효과를 이 룬다. 또, 본 발명에서는 셀프클로닝이 가능하기 때문에, 원종의 모티에렐라속의 균으로부터 적당한 DNA단편을 취득하여 이것을 영양요구성주에 도입하고, 특정 유전자의 발현조절(고발현, 발현시기의 조절, 발현억제 등)할 수 있어, 지질생산량의 증가, 생산할 수 있는 지질의 종류의 개변, 조성의 개변 등이 가능한 형질전환체 즉 신규 주를 얻을 수 있는 효과를 이룬다.

모티에렐라속의 균은 지질생산균으로서 잘 알려져 있으며, M.alpina와 같이 신뢰성이 높은 것도 포함되어 있다. 그렇기 때문에, 본 발명을 사용하면, 예를 들어 지질생산성을 한층 높인 주를 용이하고 효과적으로 생산할 수 있는 효과를 이룬다.

따라서, 본 발명은 모티에렐라속의 균류를 이용하는 각종 발효기술에 관한 산업이나, 이러한 발효기술을 사용한 식품산업, 의약품산업 등에 이용할 수 있다.

<110> SUNTORY LIMITED <120> Breeding method of Lipid product mold <130> SU0410 <150> JP 2003-299345 <151> 2003-08-22 <160> 14 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Primer Sequence <400> 1 Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Ile Pro 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Motif for Primer Sequence <400> 2 Lys Glu Ala Lys Asp His Gly Glu Gly 1 5 <210> 3 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <220> <221> N_region <222> (9) <220> <221> N_region <222> (12) <400> 3 ttygghccng cntayaargg hatycc 26 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <220> <221> N_region <222> (18) <400> 4 ccctcdccrt grtcyttngc ytcytt 26 <210> 5 <211> 925 <212> DNA <213> Mortierella alpina <400> 5 acaaccttct cctcagcccc cagccgcatc ggtcccaccg ccgcaaccca tcagcacaca 60 atggccatca aggattacca gcgcgagttc attgagtttg ccatcaagaa cgaggtcttg 120 aagtttggag agttcaccct caagtccggc cgtatctccc cctacttcct gaacgcgggt 180 ctcttcaaca ctggcgcttc gctctccaag atcggaaagt tctacgccgc tgccgtcaac 240 gactcgggca ttgagcacga catcatcttt ggccccgctt acaagggtgt ccctcttgcc 300 tgcaccaccg tcattgcctt ggccgaggcc ccctacaaca aggacacgcc ttactgcttc 360 aaccgcaagg aaaagaagga ccatggcgag ggtggcacga ttgtcggatc ggcgttggag 420 ggcaaggtcc tggtcattga cgatgttatc accgccggta ccgccatccg cgagtctgtt 480 caaatcatcg aggactgcaa ggcccaattg gccggtgttt tggtggcggt ggatcgtcag 540 gagactggca agaacggcga catgtctgct atccaggagg tcgagaggga tttcggtgtc 600 cctgtcaagg ccattgtgac catgacccac atcatgcagt acatggagga gaagggtacc 660 tatggcgagc acttgactca gatgcgcacc taccgcgaga agtacggtgt ttaaggcaaa 720 tctaaatggg ataaggtccg gtataatgcg gcgagggaag gttctgttgg aaaatctcat 780 aatgcgggga gattgacatc ggggaacgat gtgctgctca tcagcagttt tcgtggactc 840 tcgggacagg ccttcctggg aatccagaca ataatcatta ataaatacca ataacaatca 900 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaa 925 <210> 6 <211> 217 <212> PRT <213> Mortierella alpina <400> 6 Met Ala Ile Lys Asp Tyr Gln Arg Glu Phe Ile Glu Phe Ala Ile Lys 1 5 10 15 Asn Glu Val Leu Lys Phe Gly Glu Phe Thr Leu Lys Ser Gly Arg Ile 20 25 30 Ser Pro Tyr Phe Leu Asn Ala Gly Leu Phe Asn Thr Gly Ala Ser Leu 35 40 45 Ser Lys Ile Gly Lys Phe Tyr Ala Ala Ala Val Asn Asp Ser Gly Ile 50 55 60 Glu His Asp Ile Ile Phe Gly Pro Ala Tyr Lys Gly Val Pro Leu Ala 65 70 75 80 Cys Thr Thr Val Ile Ala Leu Ala Glu Ala Pro Tyr Asn Lys Asp Thr 85 90 95 Pro Tyr Cys Phe Asn Arg Lys Glu Lys Lys Asp His Gly Glu Gly Gly 100 105 110 Thr Ile Val Gly Ser Ala Leu Glu Gly Lys Val Leu Val Ile Asp Asp 115 120 125 Val Ile Thr Ala Gly Thr Ala Ile Arg Glu Ser Val Gln Ile Ile Glu 130 135 140 Asp Cys Lys Ala Gln Leu Ala Gly Val Leu Val Ala Val Asp Arg Gln 145 150 155 160 Glu Thr Gly Lys Asn Gly Asp Met Ser Ala Ile Gln Glu Val Glu Arg 165 170 175 Asp Phe Gly Val Pro Val Lys Ala Ile Val Thr Met Thr His Ile Met 180 185 190 Gln Tyr Met Glu Glu Lys Gly Thr Tyr Gly Glu His Leu Thr Gln Met 195 200 205 Arg Thr Tyr Arg Glu Lys Tyr Gly Val 210 215 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 7 cttctcttca gcccccagcc gcatcggtcc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 8 gagtccacga aaactgctga tgagcagcac 30 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 9 acaggtacac ttgtttagag 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 10 cgctgcgttc ttcatcgatg 20 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 11 ccatggatgg agtcgattgc gccattcc 28 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 12 ggatccttac tgcaacttcc ttgccttctc 30 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 13 ctttgtgggc atgcagatca 20 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 14 tgaagatgga gctgtggtgg ta 22

Claims

모티에렐라(Mortierella)속에 속하는 지질생산균의 취득방법이며,

원종의 지질생산균으로부터 우라실 요구성주를 취득하는 우라실 요구성주 취득 단계와,

취득한 우라실 요구성주를 숙주로 하고, 마커 유전자로서 오로티딘산 파이로포스포릴라제 유전자를 사용하여, 이러한 마커 유전자를 숙주로 도입하여 우라실 요구성을 보완하는 유전자 도입단계와,

상기 숙주 세포를 우라실 결손배지에서 배양하고, 우라실 요구성이 회복한 형질전환주를 선발하는 선발 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 지질생산균의 취득방법으로,

상기 원종의 지질생산균이 모티에렐라 알피나(M.alpina), 모티에렐라 엘롱가타(M.elongata), 모티에렐라 엑시구아(M.exigua), 모티에렐라 하이그로필라(M.hygrophila), 모티에렐라 이사베리나(M.isabelina), 모티에렐라 투르피콜라(M.turficola), 모티에렐라 감시(M.gamsii), 모티에렐라 코기탄스(M.cogitans), 모티에렐라 카피타타(M.capitata), 모티에렐라 비나키아(M.vinacea) 및 모티에렐라 클라미도스포라(M.chlamydospora)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 1종인 상기 방법.
제1항에 있어서,

상기 지질생산균은, 모티에렐라 알피나(Mortierella alpina), 모티에렐라 하이그로필라(Mortierella hygrophila), 또는 모티에렐라 클라미도스포라(Mortierella chlamydospora)인 것을 특징으로 하는 방법.
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제1항에 있어서,

상기 유전자 도입단계에서는, 일렉트로포레이션법 또는 파티클 딜리버리법이 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
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