JPWO2005019437A1 - 脂質生産菌の育種方法 - Google Patents
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Abstract
Description
変異処理により集団作出工程を行う場合、様々な手法で微生物に突然変異を生じさせて集団を作出するが、突然変異そのものは無作為に多くの種類が生じることになる。そのため、その後の選抜工程にて、目的の形質を示す品種(株)を取得できたとしても、目的の形質に関わる遺伝子以外の他の遺伝子に予想外の損傷が生じている可能性が否めない。例えば、上記脂質生産菌の場合では、生産される脂質の種類に変化が生じても、増殖や胞子形成能などが悪くなること等があり得る。したがって、変異処理による集団作出工程では、必ずしも生産性のよい株を得ることができるとは限らない。
これに対して、形質転換により集団作出工程を行う場合、育種しようとする有用生物を宿主として、目的の性質を獲得するために必要なDNA断片を導入(形質転換)することにより形質転換体の集団を得る。すなわち、目的に合わせた特定の遺伝子のみを発現制御した集団を作出することになる。そのため、その後の選抜工程では、得られた形質転換体の中からより望ましい品種(株)のみを選抜すればよいことになるので、スクリーニングが容易になるだけでなく、上記他の遺伝子に予想外の損傷が生じることも回避できる。したがって、育種にかける労力を著しく低減することができる。
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[文献4]Mackenzie D.A.et al.Appl.Environ.Microbiol.,66,4655−4661,2000
しかしながら、上述した形質転換を利用した技術では、PUFAを生産する脂質生産菌の育種を有効かつ効率的に行うことが困難であるという課題を生じている。
本発明にかかる育種方法の対象となるモルティエレラ属の菌類としては、特に限定されるものではなく、モルティエレラ属に分類される各種糸状菌を挙げることができる。モルティエレラ属は、MortierellaとMicromucorとの2亜属に分けられる。Mortierella亜属の菌は全て、アラキドン酸等の炭素数20の脂肪酸を生産するが、Micromucor亜属は炭素数18以下の脂肪酸しか生産しない。本発明の対象となるモルティエレラ属の菌類は上記2亜属の何れであってもよい。
本発明にかかる育種方法は、上記集団作出工程において形質転換を用いる形質転換工程を含むものであればよいが、より好ましくは、栄養要求性株取得工程を含んでいる。もちろん他の工程を含んでいてもよい。以下、各工程について詳細に説明する。
栄養要求性株取得工程は、原種のモルティエレラ属の菌から栄養要求性株(栄養要求性変異株)を取得する工程であれば特に限定されるものではなく、栄養要求性株を取得するための公知の技術を用いることができる。特に、栄養要求性に関わる遺伝子が明らかであれば(例えば、全ゲノム解読による場合等)、その遺伝子を潰すことで容易に栄養要求性株を取得することが可能となるため、好ましい。
形質転換工程は、上述したように、育種における集団作出工程において形質転換を用いる工程であり、遺伝子導入段階と選抜段階との二段階を少なくとも経る工程である。もちろん、必要に応じてこれら以外の段階を経てもよい。
形質転換工程における選抜段階は、上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する段階であれば特に限定されるものではなく、公知の方法を好適に用いることができる。すなわち、マーカーとなる栄養要求性に基づいて、合成培地中から特定の栄養素を除き、上記遺伝子導入段階の後に得られた形質転換体を合成培地で培養すればよい。これによって、容易かつ効率的に形質転換体をスクリーニングすることができる。
本発明にかかる脂質生産菌の育種方法では、上記形質転換工程において、栄養要求性をマーカーとして、様々な遺伝子を導入することで、様々な性質を示す株の集団を得ることが可能である。それゆえ、本発明では、上記形質転換工程の後に、得られた集団からより望ましい性質を示す品種を選抜する選抜工程を実施してもよい。なお、ここで言う「選抜工程」は、上記形質転換工程における「選抜段階」とは異なり、栄養要求性をマーカーとして形質転換株を選択するのではなく、得られた複数の形質転換株から、より好ましい性質を示す形質転換株を選択する工程を指す。
本発明にかかる脂質生産菌の育種方法は、上記のように、栄養要求性をマーカーとして、遺伝的変異を含む集団からより望ましい性質を示す品種を選抜(スクリーニング)するようになっている。それゆえ、モルティエレラ属に属する脂質生産菌を原種として、新規品種(新規株)を効率的かつ有効に生産することが可能となる。モルティエレラ属の菌は脂質生産菌として良く知られており、M.alpinaのように信頼性の高いものも含まれているため、例えば、脂質生産性をより一層高めた株を容易かつ効率的に生産することが可能となる。
M.alpinaの胞子を形成させるために、Czapek−Dox培地(3%スクロース、0.2%NaNO3、0.1%KH2PO4、0.05%KCl、0.05%MgSO4・7H2O、0.001%FeSO4・7H2O、2%寒天、pH6.0に調整)に本菌を植菌し、28℃で約2週間培養した。これをTween80水溶液(1drop/100mlH2O)で懸濁し、ガラスフィルター(岩城硝子社製、商品番号:3G1)で菌糸を除去して胞子液を調製した。変異処理は1×108〜109個の胞子に対し、N−methyl−N’−nitro−N−nitrosoguanidine(MNNG)を用いて、Jareonkitmongkolらの方法(S.Jareonkitmongkol et al.JAOCS,69,939−944,1992)にしたがって行った。
5−FOA耐性かつウラシル要求性という表現系を示す場合、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ(ura3遺伝子にコードされる酵素でura3pと略す)またはオロチジル酸ピロホスホリラーゼ(ura5遺伝子にコードされる酵素でura5pと略す)活性が欠失していることが考えられる。そこで、上記Δura−1株およびΔura−2株についてこれらの酵素活性を測定した。
M.alpinaと、これを原種(wild type)として誘導したウラシル要求株(上記Δura−1株およびΔura−2株)をそれぞれGY液体培地で28℃、5日間培養し、得られた菌体からSakuradaniらの方法(E.Sakuradani et al.Eur.J.Biochem.,260,208−216,1999)にしたがって、ゲノムDNAを調製した。
3種の酵母Glomerella graminicola、Saccharomyces cerevisiae、およびSordaria macrosporaにおけるura5pのアミノ酸配列について、その相同性の極めて高い二つの領域である次のアミノ酸配列
領域1:FGPAYKGIP(配列番号1参照)
領域2:KEAKDHGEG(配列番号2参照)
に基づいて、次の塩基配列を有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを合成した。なお、下記のプライマーにおけるIはイノシンを示している。また、配列表では、イノシンに相当する部位はnで示している。
センスプライマー:5’−TTYGGHCCIGCITAYAARGGHATYCC−3’(配列番号3)
アンチセンスプライマー:5’−CCCTCDCCRTGRTCYTTIGCYTCYTT−3’(配列番号4)
次に、T Gradientサーモサイクラー(商品名、Biometra社製)によりM.alpinaのゲノムDNAを鋳型として、上記2つのプライマーで、Ex Taq polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCRを行った。このときのPCR条件は、94℃で1min、52℃で1min、および72℃で2minを1サイクルとして35サイクルの後に72℃で10min伸長させる条件とした。
上記ura5遺伝子のcDNA配列(配列番号5)を基に、次に示すプライマーCRON1およびCRON2
プライマーCRON1:CTTCTCTTCAGCCCCCAGCCGCATCGGTCC(配列番号7)
プライマーCRON2:GAGTCCACGAAAACTGCTGATGAGCAGCAC(配列番号8)
を合成し、M.alpinaのゲノムDNAを鋳型として、PCRによりura5ゲノムDNAをクローニングした。このときのPCR条件は、94℃で1min、55℃で1min、および72℃で2minを1サイクルとして30サイクルの後に72℃で10min伸長させる条件とした。その結果、ura5ゲノム遺伝子上にはイントロンは存在しないことが明らかになった。
上記プライマーCRON1およびCRON2を用い、ウラシル要求性株であるΔura−1株およびΔura−2株のゲノムDNAをそれぞれ鋳型としてPCRを行い、それぞれの株のura5ゲノム遺伝子をクローニングした。なお、このときのPCR条件は、94℃で1min、55℃で1min、および72℃で2minを1サイクルとして30サイクルの後に72℃で10min伸長させる条件とした。その結果、Δura−1株では,開始コドンから数えて93番目の塩基に1塩基のアデニンの挿入があり、ORF内でフレームシフトを起こしていた。一方、Δura−2株では、398番目のグアニンがアデニンに置換されており、モチーフ配列内の133番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されていた。これら変異の結果、上記2株はura5p活性を失ったことが示唆された。
プラスミドpD4(D.B.Archer氏より分譲、前記文献4参照)を制限酵素NcoIおよびBamHIで消化し、DNA Blunting Kit(商品名、タカラバイオ社製)を用いて末端を平滑化したのち、ハイグロマイシンB耐性遺伝子であるhptmod断片を除く5.4kbpのDNA断片をGPX PCR DNA and Gel Band Purification Kit(商品名、アマシャムバイオサイエンス社製)を用いて精製した。(4)で得られた上記pBMAURA5を制限酵素EcoRIおよびXhoIで消化し、末端を平滑化した後、ura5 cDNAを含む約0.65kbpの断片を精製した。これら2つの断片をligation high(商品名、東洋紡社製)を用いて連結した。ura5遺伝子の方向を確認し、ura5遺伝子の5’上流側にhisH4.1プロモーター、3’下流側にtrpCターミネーターが連結されているものを選択し、プラスミドpDura5とした。
形質転換株の選択培地にはSC寒天培地を用いた。宿主となるΔura−1株の胞子108個をSC寒天培地に塗布した。上記pDura5はパーティクルデリバリー法により宿主に導入(形質転換)した。PDS−1000/Heパーティクルデリバリーシステム(商品名、BIO RAD社製)による遺伝子導入は、ヘリウム圧:7590kPa(1100psi)、チャンバー内の真空:28インチHg、ターゲットとの距離3cm、タングステン粒子径1.1μmの条件で行った。遺伝子導入後、28℃で2〜3日間培養すると4個のコロニーが生育してきたので、これらを形質転換株として取得した。なお、便宜上、これらの形質転換株に対して#1〜#4の番号を付与した。
プライマーRDNA1:ACAGGTACACTTGTTTAGAG(配列番号9)
プライマーRDNA2:CGCTGCGTTCTTCATCGATG(配列番号10)
と、Ex Taq polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCRを行った。このときのPCR条件は、94℃で1min、54℃で1min、および72℃で1minを1サイクルとして35サイクルの後に、72℃で10min伸長させる条件とした。なお、コントロールとして、Δura−1株についても同様にしてPCRにて確認した。
γ−リノレン酸をジホモγ−リノレン酸とする脂肪酸鎖長酵素をコードするGLELO遺伝子は、J.M.Parker−Barnes et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,97(15),8284−8289,2000に記載されている配列GBのID:AF206662の塩基配列に基づいて、M.alpinaのcDNAを鋳型として、PCRにより増幅することにより取得した。このとき、次に示すプライマーMAGLELO1およびMAGLELO2を用いた。
プライマーMAGLELO1:CCATGGATGGAGTCGATTGCGCCATTCC(配列番号11)
プライマーMAGLELO2:GGATCCTTACTGCAACTTCCTTGCCTTCTC(配列番号12)
増幅したGLELO遺伝子を制限酵素NcoIおよびBamHIで消化し約1kbの断片を得た。また、pD4を制限酵素NcoIおよびBamHIで消化し約7.7kbの断片を得た。上記各断片をligation high(商品名、東洋紡社製)を用いて連結し、プラスミドpDGLELOを得た。
実施例1の(8)と同じ方法により、Δura−1株を形質転換し、形質転換株を3株取得した。なお、便宜上、これらの形質転換株に対して#5〜#7の番号を付与した。
実施例1で創出した2種類のura5遺伝子導入株#1・#2と、上記(2)で取得したGLELO遺伝子導入株#5〜#7(脂質分析を行ったものと同様の培養条件の菌体)から、RNeasy plant mini kit(商品名、QIAGEN社製)を用いて全RNAを抽出した。1μgの全RNAをSuperScript First−Strand Synthesis System for RT−PCR(商品名、Invitrogen社製)を用いて、ランダムヘキサマーをプライマーとして逆転写反応を行い、cDNAを合成した。合成されたcDNAのうち1μl(1/20量)を鋳型として、次に示すプライマーMAGLELO5およびMAGLELO6
プライマーMAGLELO5:CTTTGTGGGCATGCAGATCA(配列番号13)
プライマーMAGLELO6:TGAAGATGGAGCTGTGGTGGTA(配列番号14)
と、Ex Taq polymerase(タカラバイオ社製)を用いてPCRを行った。このときのPCR条件は、94℃で1min、55℃で1min、および72℃で2minを1サイクルとして20サイクルの後に、72℃で10min伸長させる条件とした。
実施例1で創出した2種類のura5遺伝子導入株#1・#2と、上記(2)で取得したGLELO遺伝子導入株#5〜#7の胞子を、それぞれ液体培地(5%グルコース、1%酵母エキス、pH6.0に調整)に植菌し、28℃で7日間振とう培養した。培養後、菌体を濾過により集めて乾燥し、秤量した。塩酸メタノール法により菌体内の脂肪酸残基をメチルエステルに誘導した後、ヘキサンで抽出し、ヘキサンを留去して得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィーで分析した。得られた結果、すなわち、上記各遺伝子導入株(形質転換体)を成育したときの乾燥菌体重量と、各株の菌体内における脂肪酸組成と総脂質生産量とを表3に示す。
M.hygrophilaおよびM.chlamydosporaの胞子を形成させるために、Czapek−Dox培地(3%スクロース、0.2%NaNO3、0.1%KH2PO4、0.05%KCl、0.05%MgSO4・7H2O、0.001%FeSO4・7H2O、2%寒天、pH6.0に調整)にこれらの菌をそれぞれ植菌し、28℃で約2週間培養した。これをTween80水溶液(1drop/100ml H2O)で懸濁し、ガラスフィルター(岩城硝子社製、商品番号:3G1)で菌糸を除去して胞子液を調製した。変異処理は1×108〜109個の胞子に対し、N−methyl−N’−nitro−N−nitrosoguanidine(MNNG)を用いてJareonkitmongkolらの方法(S.Jareonkitmongkol et al.JAOCS,69,939−944,1992)にしたがって行った。
上記の2株をウラシル添加GY培地で28℃、4日間振とう培養した。菌体の無細胞抽出液の調製は、Wynnらの方法(J.P.Wynn et al.Microbiology,146,2325−2331,2000)を改良して行った。
M.hygrophila MH−Δura−1またはM.chlamydospora MC−Δura−1をCzapek−Dox培地に植菌し、28℃で2週間培養して胞子を形成させた。上記(1)に記載のとおり胞子を回収した。
Claims (6)
- モルティエレラ(Mortierella)属に属する脂質生産菌の育種方法であって、
上記脂質生産菌の栄養要求性株を宿主とし、マーカー遺伝子として上記栄養要求性を相補する遺伝子を用いて、当該マーカー遺伝子を宿主に導入する遺伝子導入段階と、
上記宿主の栄養要求性の回復をマーカーとして形質転換株を選抜する選抜段階とを有する形質転換工程を含むことを特徴とする脂質生産菌の育種方法。 - 上記脂質生産菌は、モルティエレラ アルピナ(Mortierella alpina)、モルティエレラ ハイグロフィラ(Mortierella hygrophila)またはモルティエレラ クラミドスポラ(Mortierella chlamydospora)であることを特徴とする請求の範囲1に記載の脂質生産菌の育種方法。
- 上記栄養要求性株がウラシル要求性株であることを特徴とする請求の範囲1または2に記載の脂質生産菌の育種方法。
- 上記マーカー遺伝子として、オロチジン−5’−リン酸デカルボキシラーゼ遺伝子またはオロチジル酸ピロホスホリラーゼ遺伝子が用いられることを特徴とする請求の範囲3に記載の脂質生産菌の育種方法。
- 上記遺伝子導入段階では、エレクトロポレーション法、または、パーティクルデリバリー法が用いられることを特徴とする請求の範囲1ないし4の何れか1項に記載の脂質生産菌の育種方法。
- さらに、原種の脂質生産菌から栄養要求性株を取得する栄養要求性株取得工程を含むことを特徴とする請求の範囲1ないし5の何れか1項に記載の脂質生産菌の育種方法。
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