KR100222639B1

KR100222639B1 - 신규한 대장균 변이주 cj 181 및 그를 이용한 l-트립토판 제조방법

Info

Publication number: KR100222639B1
Application number: KR1019970035713A
Authority: KR
Inventors: 임상조; 김성준; 원종인; 김대철; 전영중; 이재흥
Original assignee: 손경식; 제일제당주식회사
Priority date: 1997-07-29
Filing date: 1997-07-29
Publication date: 1999-10-01
Also published as: KR19990012361A

Abstract

본 발명은 트립토판 생성균주인 대장균 CJ18에 루이신 유사체에 대한 내성을 부여하여 인공변이주 CJ181(KFCC 10975)을 생산하고, 이를 포도당이 함유된 배지에서 직접발효법으로 배양하여 배양액 내에 고농도의 L-트립토판을 축적시키는 방법을 통하여 L-트립토판을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 균주는 CJ18을 모주로 하고, 4-아자루이신에 대한 내성과 타이로신에 대한 영양요구성, L-아르기닌에 대한 감수성을 보유하고 있으며 배양액 내에 일정량의 루이신이 축적된 상태에서도 정상적으로 트립토판을 생산할 수 있고 소형 발효조에서도 CJ18의 경우와 비교하여 시간당 약 10%의 생산성 향상을 가져오는 특징이 있다.

Description

신규한 대장균 변이주 ＣＪ181 및 그를 이용한 Ｌ-트립토판 제조방법

본 발명은 트립토판 생성균주인 대장균에 루이신 유사체에 대한 내성을 부여함으로써 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 트립토판 생성균주인 대장균 CJ18에 루이신 유사체인 4-아자루이신(4-azaleucine)에 대한 내성을 부여한 인공변이주 CJ181 및 이를 포도당이 함유된 발효배지에서 직접발효법에 의해 L-트립토판을 생산하는 방법에 관한 것이다.

트립토판은 필수아미노산의 일종으로 사료첨가제, 의약 원료, 식품 소재 등으로 널리 이용되어 왔으며, 화학합성법, 효소반응법, 발효법 등을 이용하여 생산되고 있다. 그러나, 화학 합성법의 경우에는 고온, 고압의 조건이 필요하며 그 산물에 D형과 L형이 혼재하기 때문에 정제과정이 쉽지 않으며, 효소반응법의 경우 일본에는 예컨대, 마쓰이 도오아쓰의 특허(대한민국 특허공고 90-005773)가 공고된 바 있는데 이러한 효소반응법의 경우는 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 고가일 뿐만 아니라 효소의 안정성에 문제가 있었다. 따라서 현재는 미생물을 이용한 직접발효법에 의한 생산방법을 주로 사용하고 있다.

그런데, 종래의 미생물에 의한 트립토판의 생산은 대장균과 코리네박테리움등 여러 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절부위 변이 균주에서 이루어져 왔으며, 1980년대 들어서면서부터 유전자 재조합 기술이 급격히 발달하여 대사과정과 그 조절기작들이 자세히 규명됨에 따라 많은 연구자들이 유전자 조작 기법을 이용하여 우수한 재조합 균주들을 개발하는데 큰 성과를 거두었고 고도의 생산성 향상을 가져왔다(Matsui등, 1988). 직접발효법을 이용한 국내특허로는 트립토판 유사체에 내성을 갖거나 영양 요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우(공고번호 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우(공고번호 90-5772, 91-5627)가 각각 공지되어 있다. 한편, 이러한 트립토판 유사체 내성균주들은 주로 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 피드백 저해를 극복하는 것을 주된 목표로 하였고, 재조합 균주들 역시 트립토판 생합성 과정에서 효소들의 클로닝에 목표를 두었으며 모두 실제로 괄목할 만한 성과를 가져왔다. 그러나, 이러한 방법들은 트립토판 생합성에 이용되는 기질들에 대해서는 전혀 고려한 바가 없었다. 그러므로, 최근에는 수율을 보다 높이기 위하여 트립토판 생합성에 필요한 기질 생산에 관련되는 중앙 대사 경로상 효소들의 역가 향상과 고농도 아미노산 생산시 세포내의 생리학적 특성변화등에 대한 연구들이 수행되고 있다. 예컨대, DAHP synthase(aroG), tkt, pps등의 유전자를 세포내로 클로닝하여 방향족 아미노산의 최초 전구물질인 3-deoxyarabino heptulosonate 7-phosphate(DAHP)의 양을 획기적으로 증대시킨 것을 들 수 있다(Berry(1996), Trands in Biotechnology, 14:250-256).

대장균에는 배양온도나 pH, 배지의 영양상태등이 변할 때 이에 적응하기 위해 필요한 여러 유전자들의 발현을 하나로 조절하는 몇 개의 레귤론들이 있다. 그 레귤론중의 하나인 루이신-엘알피(Lucien-Lrp) 레귤론은 세포 밖의 루이신 농도에 따라 조절되는 70여개 정도의 유전자들로 구성되어 있는데 그 중에는 여러 아미노산의 생합성과 세포내 이동에 관련된 것이 많다(Newman 등(1992), Cell, 68:617-619).

최근의 연구들에 의하면 루이신-엘알피 레귤론은 대장균이 주변의 영양상태를 구분하고 이에 적응하기 위한 기작으로 이해되고 있다. 즉, 루이신-반응 조절 단백질인 Lrp(leucine-responsive regulatory protein)는 아미노산, 핵산 등의 생합성에 관련된 유전자들과 마찬가지로 세포주위의 영양상태가 불량할 때는 필요한 유전자들의 발현을 촉진하며, 주위의 영양물의 흡수 및 분해하는 데에 관련된 유전자들의 발현은 억제하는 특성을 갖고 있다. 이때 세포 밖의 루이신의 농도가 이에 대한 조절신호로 작용한다.

자연계에서 세포밖의 루이신 농도가 높은 경우는 세포 주위에서 단백질들이 대규모로 가수분해되는 경우 등을 볼 수 있으므로 고농도의 루이신은 세포 외부의 주위 환경이 좋은 영양상태에 있음을 의미한다. 따라서 대장균은 고농도의 루이신이 외부에 존재하는 경우에는 영양분의 흡수와 분해에 관련된 유전자들을 발현시키며 몇몇 아미노산 생합성 관련 유전자들의 발현을 억제하게 되는데 이중에는 트립토판 생합성에 기질로 이용되는 세린의 생합성에 관련된 유전자인 serA도 있다(Rex등(1992), J. Bacteriol, 173:5944-5953). 따라서, 트립토판 생산균주를 배양할 때 루이신이 배양액에 축적되면 세포는 주위의 환경이 좋은 영양상태에 있다고 판단하여 serA 유전자를 비롯한 여러 생합성 관련 유전자들의 발현을 억제함으로써 결과적으로 트립토판 생산을 저해할 가능성이 높다. 실제로 현재 사용하고 있는 트립토판 생산균주인 대장균 CJ18(KFCC 10902)은 발효시 100㎎/ℓ의 루이신을 배양액 내에 축적한다. 그러므로 상기 생산균주에 루이신 유사체 내성을 부여한 변이주 중에는 루이신에 의한 serA 등의 트립토판 생합성 관련 유전자들의 발현 억제를 피할 수 있는 우량 변이주가 존재할 가능성이 높다.

따라서, 본 발명은 상기와 같은 사실에 착안하여 트립토판 생산 균주인 대장균 CJ18에 루이신 유사체인 4-아자루이신(4-azaleucine)에 대한 내성을 부여하여 인공변이주를 개발하는데 그 목적이 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 변이주 CJ181을 이용하여 배양액 내에 일정량의 루이신이 축적된 상태에서도 정상적으로 트립토판을 생산하도록하는데 있다. 이밖에도 본 발명의 또다른 목적은 소형 발효조에서 약 10% 정도의 L-트립토판의 생산성을 향상시키는데 있다.

이하 본 발명의 구체적 구성과 작용을 상세히 설명한다.

본 발명의 4-아자루이신 내성 균주는 트립토판 생성 균주인 대장균 CJ18 (KFCC 10902)을 N-메틸-N′-니트로-N-니트로소구아니딘(이하 NTG로 칭함)으로 처리한 후 아자루이신이 20㎎/ℓ 포함된 평판최소배지에서 5일 동안 항온 배양하여 얻었다. 최소배지의 조성은 하기 표 1과 같고 영양요구성 아미노산은 100㎎/ℓ씩 첨가하여 사용하였다.

최소배지 조성

포도당 최소배지	LB 배지
성분	조성(g/ℓ)	성분	조성(g/ℓ)
포도당	2
NaHPO₄	6
KH₂PO₄	3
NaCl	0.5	박트로-트립톤	10
NH₄Cl	1	이스트 추출물	5
MgSO₄	0.5	NaCl	10
CaCl₂	0.01
타이로신	0.1
pH: 7.0	pH: 7.0

변이처리하여 얻은 균주들은 호기적 조건(플라스크의 진탕 배양 200-300rpm, 발효조의 경우 교반속도 400-1000rpm 및 통기량 0.5-1.5vvm) 및 배양온도 30-37℃, pH는 6.0-8.0에서 배양하여 L-트립토판을 배양액에 축적시켰다. 플라스크 배양의 경우에는 48-60시간 배양하여 L-트립토판을 배양액에 축적시켰다. 또한 발효조에서 배양하는 경우 수회 추가당을 공급하는 유가식 발효법으로 L-트립토판을 생산하였다. 발효배지 성분은 하기 표 2와 같다.

발효배지 조성

삼각 플라스크 발효배지	5L 발효조 발효 배지
성분	조성(g/ℓ)	성분	조성(g/ℓ)
포도당	60	포도당	200
이스트 추출물	2.5	이스트 추출물	2.3
KH₂PO₄	2	KH₂PO₄	3.6
MgSO₄·7H₂O	1	시트르산	0.4
(NH₄)₂SO₄	20	MgSO₄·7H₂O	1.1
구연산나트륨	5	(NH₄)₂SO₄	2
NaCl	1	타이로신	0.5
타이로신	0.1	푸마르산	0.3
CaCO₃	40

배양액의 균체 성장 정도는 562nm에서 흡광도로 측정하였으며, 당분석은 Bertrand법으로 수행하였다. 한편 L-트립토판 및 기타 아미노산의 정량은 HPLC로 분석하였다.

이하 본 발명의 구체적인 구성과 작용을 당업자가 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여 하기 실시예에 의거 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

실시예 1. 각종 아미노산 첨가에 따른 L-트립토판 축적량 검정

트립토판 생산능력이 있는 대장균 CJ18에서 각종 아미노산 첨가에 따른 L-트립토판 생산성의 변화를 관찰하기 위하여 각각의 아미노산을 발효배지에 2g/ℓ씩 첨가한 후, 플라스크에서 3일 동안 배양하였다. 발효 종료액에 축적된 L-트립토판의 양을 HPLC를 사용하여 분석한 결과는 표 3과 같다.

아미노산 첨가가 대장균 CJ18의 트립토판 생산에 미치는 영향

아미노산	트립토판 축적량(g/ℓ)	아미노산	트립토판 축적량(g/ℓ)
아스파라긴산	7.1	라이신 염산염	6.9
아스파라진	7.6	루이신	2.2
아르기닌	6.6	메치오닌	5.5
알라닌	5.7	페닐알라닌	3.6
시스테인	5.9	프로린	7.6
글루탐산	7.4	스테오닌	7.6
글루타민	7.4	타이로신	5.5
글리신	7.3	트립토판	8.4
히스티딘	7.1	세린	3.5
이소로이신	4.5	발린	6.6
		무첨가	7.1

상기 표 3에서 알 수 있듯이 루이신, 세린 및 페닐알라닌을 발효배지에 첨가할 경우 배양액내 트립토판 축적량이 현저히 감소하였다. 여기서 주목할 만한 특징은 페닐알라닌을 포함한 기타 아미노산을 첨가할 경우 최종 배양액내 포도당이 잔류하지 않는데 반하여, 루이신과 세린의 경우에는 각각 8.14g/ℓ의 포도당이 잔류하였다. 이것은 루이신과 세린의 경우 이들 아미노산이 대장균 CJ18에서 당소모속도를 지연시키는 요인이 될 수 있음을 시사하였다.

실시예 2. HPLC를 이용한 각종 아미노산 함량 분석

트립토판 생산균주인 대장균 CJ18 (KFCC 10902)을 5L 발효조에서 배양온도 32℃, 배양 pH 6.9-7.1, 통기량 0.5-1.0vvm으로 유지하면서 유가식으로 배양한 후 최종 배양액을 HPLC를 사용하여 각종 아미노산 함량을 분석하였다. 그 결과는 하기 표 4와 같다.

대장균 CJ18의 발효 배양액내 아미노산 함량

아미노산	농 도(g/ℓ)	아미노산	농 도(g/ℓ)
트립토판	24.15	루이신	0.13
아스파라긴산	0.47	페닐알라닌	0.09
글루탐산	4.59	라이신	0.06
알라닌	0.05	기타 아미노산	<0.05

상기 표 4에서 보는 바와 같이 대장균 CJ18은 발효시 130mg/ℓ의 루이신을 배양액에 축적시킴을 알 수 있었다.

실시예 3. 대장균 CJ18에서 트립토판에 대한 루이신의 영향 조사

트립토판 생산균주인 대장균 CJ18에서 트립토판에 대한 루이신의 영향을 알아보기 위하여 삼각플라스크 상에서 루이신을 각각 0.25, 0.5, 0.75, 1.0g/ℓ를 발효배지에 첨가하고 3일간 배양한 후 그 결과를 관찰하였다. 그 결과는 하기 표 5와 같다.

루이신 농도가 트립토판 발효에 미치는 영향

루이신 농도(g/ℓ)	OD₅₆₂	잔당(%)	Trp.(g/ℓ)
control	39		5.21
0.25	37	-	5.28
0.50	32	0.2	4.48
0.75	28	0.3	4.22
1.00	25	0.6	2.94

상기 표 5에서 보는 바와 같이 발효배지내의 루이신 농도가 0.50g/ℓ 이상이 되면 당소모속도가 저하되고 트립토판의 생산이 현저히 저해됨을 알 수 있었다.

실시예 4. 4-아자루이신에 대한 성장저해도 측정

루이신 유사체인 4-아자루이신에 대한 성장저해도를 측정하기 위해서 삼각플라스크상에서 타이로신(100mg/ℓ)이 함유된 최소배지에 대장균 CJ18을 접종하고, 하루동안 진탕배양하였다. 이 배양액을 삼각플라스크상에서 4-아자루이신이 0-0.16g/ℓ 함유된 최소배지에 OD₅₆₂값이 0.1이 되도록 각각 접종한 후 20시간 진탕 배양하고 최종배양액의 균체흡광도를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 6과 같다.

4-아자루이신 함량에 따른 균체 흡광도 변화

4-아자루이신(mg/ℓ)	균체흡광도(OD₅₆₂)	4-아자루이신(mg/ℓ)	균체흡광도(OD₅₆₂)
무첨가	0.72	20	0.23
1	0.70	40	0.21
5	0.68	80	0.19
10	0.64	160	0.18

상기 표 6에서 보는 바와 같이 최소배지내의 4-아자루이신 농도가 20mg/ℓ 이상이 되면 세포성장이 현저히 저해됨을 알 수 있었다.

실시예 5. 플라스크내에서 4-아자루이신 내성균주의 트립토판 생산 실험

트립토판 생산균주인 대장균 CJ18(KFCC 10902)을 LB배지(표 1)에서 하루 동안 배양한 후 멸균된 식염수로 2회 세척하고 0.1M 구연산염 완충용액(pH 5.5)으로 최종 OD가 1.0이 되도록 희석한 후 NTG 농도가 500㎍/㎖가 되도록 첨가하였다. 이 용액을 37℃ 항온조에서 30분간 반응시킨 후 0.1M 인산염 완충용액(pH 7.0)으로 3차례 세척하고 아자루이신이 20mg/ℓ 함유된 최소배지(표 1)에서 5일간 배양하여 120여개의 콜로니를 획득하였다. 획득한 4-아자루이신 내성균주를 플라스크내에서 트립토판 생산을 실험한 결과를 표 7에 요약하였다.

4-아자루이신 내성균주에 대한 플라스크내 발효결과

L-트립토판(g/ℓ)	4-아자루이신 내성균주	L-트립토판(g/ℓ)	4-아자루이신 내성균주
0	22주	5-6	2주
1-2	14주	6-7	3주
2-3	51주	7-8	2주
3-4	20주	8-9	1주
4-5	5주	7.0-7.3	대장균 CJ18

상기 표 7에서 보는 바와 같이 3균주 정도만이 모균주(대장균 CJ18)와 비슷하거나 높은 트립토판 생산성을 가지고 있었으며 대부분의 내성균주는 트립토판 생성속도가 모균주에 비하여 현저히 떨어져 있었다. 이러한 결과는 루이신-엘알피(Leucine-Lrp) 레귤론이 상당히 많은 수의 유전자들을 조절하고 있기 때문에 소망하는 부위 이외의 유전자들에 돌연변이가 생겼을 경우 충분히 예측 가능하다. 또한 내성균주중 가장 우수한 균주는 모균주에 비하여 약 5-10% 정도 트립토판 축적능력이 향상되었으며 발효종료액에 포도당이 잔류하지 않았다. 플라스크에서 트립토판 축적능력을 반복실험한 후, 최종적으로 개발한 대장균 CJ181을 1997. 7 . 8 일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(KFCC 10975).

한편, 대장균 CJ181은 4-아자루이신이 100mg/ℓ까지 함유된 최소배지에서도 성장저해 현상이 나타나지 않았다. 그 결과는 하기 표 8과 같다.

대장균 CJ181의 4-아자루이신에 대한 내성도

균주	4-아자루이신 함유량(mg/ℓ)
균주	0	10	25	50	100	200
대장균 CJ181	++++	++++	++++	++++	+++	+
대장균 CJ18	++++	+++	-	-	-	-
주; +: 성장함, -: 성장 못함

실시예 6. 대장균 CJ181과 모균주 CJ18의 발효시간 조사

대장균 CJ181(KFCC 10975)과 모균주인 CJ18(KFCC 10902)을 5L 발효조에서 배양온도 32℃, 배양 pH 6.9-7.1(암모니아수로 pH 조정), 통기량 0.5-1.0vvm 및 교반속도 500-1200rpm을 유지하면서 유가식으로 배양하였다. 이때 발효농도는 각각 CJ181이 27g/ℓ, 모균주인 CJ18이 25g/ℓ이었으며 대장균 CJ181의 경우 발효시간이 소폭 단축됨으로써 결과적으로 모균주인 CJ18 보다 시간당 약 10%정도의 생산성 향상이 있었다.

이상 설명한 바와 같이 본 발명은 대장균 CJ18에 루이신 유사체인 4-아자루이신(4-azaleucine)에 대해 내성을 부여하여 신규한 대장균 변이주 CJ181을 생산하고, 상기 변이주를 이용하여 배양액 내에 일정량의 루이신이 축적된 상태에서도 정상적으로 L-트립토판을 생산할 수 있는 효과가 있다. 또한, 모균주(CJ18)에 비하여 본 발명 변이주 CJ181은 약 5~10% 정도 트립토판 생산성을 향상시키며 발효종료후에 포도당을 잔류하지 않는 효과가 있어 아미노산 발효산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

L-트립토판을 생산하는 신규한 대장균 변이주 CJ181(KFCC 10975).
제 1항에 있어서, 상기 대장균 변이주는 트립토판 생성균주인 대장균 CJ18(KFCC 10902)를 모주로하고, 루이신 유사체에 대하여 내성이며 타이로신에 대한 영양요구성, L-아르기닌에 대한 감수성을 보유함을 특징으로 하는 변이주.
포도당을 탄소원으로 하는 직접발효법에 의하여 트립토판을 생산하는 방법에 있어서, 루이신 유사체에 내성을 부여한 L-트립토판을 생산하는 신규한 대장균 변이주 CJ181(KFCC 10975)를 사용함을 특징으로 하는 L-트립토판의 제조방법.
제 3항에 있어서, 루이신 유사체가 4-아자루이신임을 특징으로 하는 방법.