KR0145011B1 - L-아르기닌에 대해 감수성을 갖는 l-트립토판 생산균주 - Google Patents

Abstract

본 발명은 배양액에 L-아르기닌의 축적이 없이 L-트립토판을 고농도로 축적시킬 수 있는 대장균 CA15(KFCC 10861)에 관한 것으로, 상기한 균주는 트립토판 유사체인 5-플루오로 트립토판에 대해 내성을 지니며 타이로신에 대해 영양요구성을 갖는 L-트립토판 생산 균주 CF37(KFCC 10859)을 모균주로 하여, 이 모균주를 돌연변이 시켜 얻는다.

Description

L-아르기닌에 대해 감수성을 갖는 L-트립토판 생산균주

본 발명은 트립토판 유사체에 내성을 지니며 방향족 아미노산의 일종인 타이로신(L-tyrosine)에 대해 영양요구성을 갖는 대장균(Escherichia coli)을 모균주로하여 인공변이법에 의해 얻은 L-아르기닌(L-arginine)에 대해 감수성을 갖는 L-트립토판 생산균주에 관한 것이다. 또한, 이 L-아르기닌에 대해 감수성을 갖는 L-트립토판 생산균주를 포도당이 함유된 배지에 직접 발효법으로 배양함으로써 L-트립토판을 배양액에 축적시키는 방법에 관한 것이다.

트립토판은 필수 아미노산의 일종으로 식료품 및 사료첨가제 그리고 의약원료 등으로 그 사용범위가 넓은데 비하여 그 가격이 고가이기 때문에 현재는 주로 아미노산 주사제로 사용되고 있다. 그러나 트립토판은 라이신, 메치오닌과 더불어 사료첨가제로서의 효과가 매우 우수한 것으로 입증됨에 따라 그 수요가 급증하는 추세이다.

트립토판 생산 방법으로는 화학합성법, 효소합성법, 전구체발효법 및 직접 발효법으로 나눌수 있는데, 1980년도 후반까지 트립토판은 주로 화학합성법과 효소합성법으로 생산되었으나 최근에는 생명공학의 눈부신 발전으로 직접 발효법을 이용하여 생산하는 방법이 각광받고 있는 실정이다.

실제로 화학합성법의 경우에는 고온, 고압의 조건이 필요하며, 그 산물 또한 D형과 L형이 같이 섞여 있기 때문에 정제과정이 쉽지 않다. 한편, 효소합성법의 경우는 일본 미쓰이 도오아쓰의 특허(대한민국 특허공고 90-5773)가 공고된 바 있는데, 이는 세포로부터 추출된 효소수용액을 함유한 반응 혼합물 중에 인돌 및 세린을 반응시켜 L-트립토판을 형성하고 이 반응혼합물에 암모니아를 가하여 L-트립토판을 용해시킨 후 분리하는 방법이다. 그런데, 이러한 효소합성법의 경우에는 기질로 사용되는 인돌과 세린의 가격이 높을 뿐만 아니라 효소의 안정성이 문제가 된다.

한편, 미생물에 의한 직접발효법의 경우에도 그 수율이 낮은 것이 문제가 되어 왔는데, 최근에는 고역가 균주의 개발로 수율이 개선되었고, 낮은 원부재료비로 경제성이 크며, 또한 화학적 합성법에 의해서는 분리시켜 얻을 수 없는 광학적 특이체인 L체와 D체를 분리하여 얻을 수 있다는 잇점 때문에 많이 연구되어지고 있는 실정이다. 미생물을 이용하여 트립토판을 생산하는 방법에는 여러 다양한 미생물의 영양요구성 균주와 조절부위 변이 균주를 이용하는 방법이 있다. 그러나, 이전까지의 연구에서는 산업생산 현장에 적용시킬 만큼의 생산성을 얻을 수 없었다. 그런데 1970년대 이후로 유전자 조작 기법이 개발된 후 많은 연구자들이 균주개발에 노력하여 상당한 정도의 생산성 향상을 가져왔다(Matsui 등 (1988), Agri. Biol. Chem. 52:1863-1865).

국내에서 공고된 직접발효법을 이용한 특허는, 트립토판 유사체에 내성을 갖거나 영양요구성을 갖는 변이 균주를 이용한 경우(공고번호 87-1813, 90-8251, 92-7405)와 재조합 균주를 이용한 경우(공고번호 90-5772, 91-5627)로 나눌 수 있다.

변이균주를 이용하는 방법으로는 대장균 변이주(KCTC 8164P)를 이용한 L-트립토판의 제조방법이 특허공고(대한민국 특허공고 87-1813)된 바 있는데, 이 특허는 자외선 처리기법으로 변이주를 유도한 후 트립토판 유사체에 내성을 갖는 균주를 선별한 것을 특징으로 하는 것으로서, 최종 트립토판 생산농도가 13.6g/1이었다. 또한 L-트립토판 및 L-바린 유사체에 내성을 지니며, L-페닐알리닌 및 L-타이로신에 영양요구성을 갖는 대장균 변이주(KCTC 8373P)를 이용하여 직접 발효법으로 L-트립토판을 생산한 결과, 유가식 배양법으로 최대 15.6g/1의 트립토판을 생산하는 방법도 있다(대한민국 특허공고 90-8251).

본 발명의 목적은 배양액에 L-트립토판을 축적시켜 트립토판의 생산성을 현격하게 증가시키고자 하는 것이다. 이러한 본원발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 트립토판 유사체에 내성을 지니며 타이로신 영양요구성을 갖는 대장균으로부터 아르기닌에 감수성을 갖는 균주를 선별함으로써 트립토판 발현농도 및 생산성을 현격하게 증기시키는 새로운 균주를 제공하며, 또한 이러한 균주를 이용하여 배양액에 고농도의 L-트립토판을 축적시키는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 아르기닌에 대해 감수성을 갖는 L-트립토판 생산균주는 다음과 같은 방법으로 얻는다.

트립토판 유사체에 내성을 지니며 타이로신에 대하여 영양요구성을 가지는 트립토판 생산균주를 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘으로 처리한 후 포도당이 함유된 최소배지에서 배양한다. 배양된 세포를 아르기닌이 포함된 최소배지로 옮기고 암피실린(ampicillin) 처리를 하면, 아르기닌에 감수성이 없는 변이주들은 항생제 작용에 의하여 모두 용해됨으로써 아르기닌 감수성 균주만을 얻게 된다. 이렇게 얻어진 균주를 아르기닌이 포함된 최소 평판배지와 아르기닌이 제외된 최소 평판배지에 각각 tooth picking하여 2-3일 배양한 후 아르기닌이 제외된 최소 평판배지에서는 잘 자라면서 아르기닌이 포함된 최소 평판배지에서는 자라지 못하는 균주를 선별한다.

최소배지의 조성은 표 1과 같으며, 영양요구성 아미노산 100mg/1씩 첨가하여 사용하였다.

변이처리하여 얻은 균주들은 표 2와 같은 배지조성으로 호기적 상태(플라스크의 경우 진탕배양 200-300rpm; 발효조의 경우 교반속도 400-1000rpm으로하여 공기량 0.5-1.5vvm) 및 배양온도 30-37℃, pH는 6.0-8.0에서 배양하여, 배양액내 L-트립토판을 축적시켰다. 플라스크 배양의 경우에는 48-60시간 배양하여 L-트립토판을 배양액에 축적시켰다. 또한, 발효조에서 배양하는 경우 수회 추가당을 공급하는 유가식 발효법으로 L-트립토판을 생산하였으며, 균주의 L-트립토판 생산능력은 유가식 발효법으로 측정하였다.

배양액의 균체성장 정도는 562nm에서 흡광도(optical density)로 측정하였으며, 당 분석은 Bertrand법으로 시행하였다. 한편 L-트립토판 및 기타 아미노산의 정량은 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)로 분석하였다.

이하, 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로서, 이러한 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

트립토판 생산능력이 있는 대장균 CF37(KFCC 10859)을 5 L 발효조에서 배양온도 32℃, 배양 pH 6.9-7.1, 통기량 0.5-1.0 vvm으로 유지하면서 유가식으로 배양한 다음, 최종 배양액을 HPLC를 사용하여 각종 아미노산 조성을 분석하였으며, 각종 아미노산 첨가에 따른 L-트립토판 생산성의 변화를 관찰하기 위해 각각의 아미노산을 3g/1 첨가하여 플라스크에서 55 시간동안 발효시켜 그 영향을 검토하여 표3과 표4에 기재하였다.

*극미량 : 0.05g/1

표4의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이 라이신·로이신·프로린 등의 아미노산을 첨가시에는 L-트립토판의 생산이 촉진되는 반면에, 페닐알리닌·타이로신·시스테인·아르기닌 등의 첨가시에는 L-트립토판의 생산이 감소됨을 알 수 있었다. 여기서 페닐알라닌·타이로신 및 아르기닌의 첨가는 포도당을 정상적으로 대사시키면서 트립토판의 생산성을 낮추는 반면에, 시스테인은 포도당의 대사를 원만히 수행하지 못함에 따른 생산성 하락을 일으켰으며, 이러한 시스테인의 영향은 야생균주인 대장균 W3110에 대해서도 같은 현상을 보였다. 이 결과로부터 아르기닌에 감수성을 갖는 균주를 개발할 경우 L-트립토판 생산량이 증가할 것임을 알 수 있었다.

[실시예 2]

트립토판 생산능력이 있는 대장균 CF37(KCTC 10859)을 LB 배지에서 하룻밤동안 배양한 후 멸균된 식염수로 2회 세척해주고, 구연산 완충액(pH 5.5, 0.1M)으로 최종 O.D가 1.0이 되도록 희석한 후 NTG 농도가 500μg/m1가 되도록 최종 부피를 조정하였다. 이 용액을 37℃ 항온조에서 30분간 처리후 pH 7.0, 0.1M 인산 완충액으로 3차례 세척하고, 타이로신이 함유된 최소배지에서 하룻밤 동안 배양하였다. 이렇게 얻어진 배양액을 원심분리한 후, 멸균식염수로 세척하고 타이로신 및 아르기닌이 300mg/1 포함된 최소배지에서 3시간 동안 배양하였다. 이때, 암피실린을 20mg/1가 되도록 첨가하고 세포가 완전히 파괴되도록 2시간 배양하였다. 5000rpm에서 20분간 원심분리한 후 멸균식염수로 세척한 다음 최종 O.D 값이 0.3이 되도록 타이로신이 함유된 최소배지에 현탁하였다. 하룻밤 배양 후 멸균된 식염수로 1회 세척한 다음 위의 방법을 되풀이하여 암피실린 처리를 1회 더 반복하였다. 암피실린 처리 후 멸균된 식염수로 수회 세척하여 암피실린을 제거하고 식염수로 적당히 희석하여 타이로신이 함유된 최소배지에 도말한 후 32℃에서 수일간 배양하였다. 이렇게하여 얻어진 독립된 콜로니(colony)를 타이로신이 포함된 최소 평판배지와 타이로신 및 아르기닌이 300mg/1 함유된 최소 평판 배지에 연속해서 tooth picking 한 후 수일간 배양하였다. 그 후 타이로신이 함유된 최소 평판배지에서는 자라면서 타이로신 및 아르기닌이 포함된 최소 평판 배지에서는 자라지 못하는 균주를 선별하였다.

선별된 아르기닌 감수성 균주와 모균주에 대하여 트립토판 역가를 시험한 결과, 표 5에서 알 수 있는 바와 같이 선별된 아르기닌 감수성 균주의 역가가 기존의 모균주 역가에 비하여 현격하게 높았다.

*Tyr:타이로신 영양요구성 균주

Ft :5-플루오로 트립토판 내성 균주

Arg :아르기닌 감수성 균주

[실시예 3]

실시예 2에서 선별된 균주의 아르기닌에 대한 감수성을 확인하기 위하여, 아르기닌이 첨가되지 않은 최소배지와 아르기닌이 0-2g/1 첨가된 최소배지에 선별된 균주를 접종하여 배양한 후 세포성장도(OD)를 측정하였다. 250ml 삼각플라스크에서 24시간 동안 배양시켰을 때, 표 6에서 보듯이 W3110, CF37 균주는 아르기닌의 첨가여부에 관계없이 비슷한 성장을 보인 반면에, 아르기닌 감수성 균주들은 아르기닌이 첨가된 배지에서 배양시 세포성장도가 현격히 줄어들었음을 알 수 있었다.

*배양전 초기 OD값:0.3

이상의 실시예에서 발효배양액 중 L-트립토판 농도가 모균주인 CF37에 비해 향상되고, L-아르기닌에 대하여 감수성을 갖는 대장균 CA15를 최종선별하여 1995년 6월 21일자로 사단법인 한국종균협회에 기탁하였다(수탁번호 KFCC 10861).

[실시예 4]

첨가된 아르기닌의 농도에 따른 각 균주의 트립토판 생산성을 살펴보기 위하여 아르기닌 농도를 0, 0.5g/1, 1.0g/1, 2.0g/1로 달리한 플라스크 배지에 W3110, CF37, CA15를 각각 접종한 후 60시간 배양하였다. 표 7은 이때의 결과를 보여주는데, 아르기닌 감수성 균주의 경우 아르기닌 첨가량이 증가함에 따라 트립토판 생산량이 급속하게 감소함을 보였다.

[실시예 5]

선별된 아르기닌 감수성 균주CA15와 모균주인 CF37(KFCC 10859)를 30L 발효조에서 유가식으로 배양한 후, 최종 배양액 중의 트립토판 및 아르기닌 함량을 분석하여 그 결과를 표 8에 기재하였다. 발효조건은 배양온도 32℃, pH 7.0(암모니아수로 pH 조정), 통기량은 0.5-1.5vvm 그리고 교반속도는 400-700rpm이었다.

표 8로부터 알 수 있듯이 대장균 CA15는 배양액에 아르기닌을 축적시키지 않았다. 한편, 최종 배양액내 L-트립토판 농도는 20.4g/1로 모균주인 대장균 CF37에 비해 발효농도 40%, 시간당 생산성이 80% 증가함을 확인하였다.

상기에서 본 바와 같이 본 발명은 L-아르기닌에 대해 감수성을 갖는 L-트립토판 생산균주(CA15(KFCC 10861)를 포도당이 함유된 배지에 직접 발효법으로 배양함으로써 배양액에 L-트립토판을 고농도로 축적시킬 수 있는 유용한 수단임을 알 수 있다.

Claims (2)

1. L-아르기닌에 대해 감수성을 갖는 L-트립토판을 생산하는 대장균 CA15(KFCC 10861).
2. 제1항에 있어서, 모균주가 트립토판 유사체인 5-플루오로트립토판에 대해 내성을 지니며 L-트립토판에 의한 안스라닐산 합성효소의 생합성 및 효소활성 저해가 해제되고 타이로신에 대해 영양요구성을 갖는 대장균 CF37(KFCC 10859)인 것을 특징으로 하는 대장균 CA15(KFCC 10861).