CZ282396B6 - Způsob výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití - Google Patents

Způsob výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ282396B6
CZ282396B6 CZ95667A CZ66795A CZ282396B6 CZ 282396 B6 CZ282396 B6 CZ 282396B6 CZ 95667 A CZ95667 A CZ 95667A CZ 66795 A CZ66795 A CZ 66795A CZ 282396 B6 CZ282396 B6 CZ 282396B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
ala
tryptophan
leu
sera
ser
Prior art date
Application number
CZ95667A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ66795A3 (en
Inventor
Günter Dr. Wich
Walfred Dr. Leinfelder
Keith Dr. Backman
Original Assignee
Consortium für elektrochemische Industrie GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=6469024&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CZ282396(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Consortium für elektrochemische Industrie GmbH filed Critical Consortium für elektrochemische Industrie GmbH
Publication of CZ66795A3 publication Critical patent/CZ66795A3/cs
Publication of CZ282396B6 publication Critical patent/CZ282396B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/01—Preparation of mutants without inserting foreign genetic material therein; Screening processes therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/22—Tryptophan; Tyrosine; Phenylalanine; 3,4-Dihydroxyphenylalanine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/843—Corynebacterium
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/8215—Microorganisms
    • Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
    • Y10S435/848—Escherichia
    • Y10S435/849—Escherichia coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

Řešení se týká způsobu výroby mikroorganismů produkujících tryptofan, při kterém se mikroorganismy, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntesy tryptofanu, opatří serA-alelou, která má sníženou citlivost vůči inhibici serinem, přičemž mikroorganismy, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntesy tryptofanu, se podrobí mutagenesi a mutagenem zpracované populace organismů se podrobí selekci na klony se serA-geny, které kodují pro serin necitlivé fosfoglycerátdehydrogenasy, nebo ser-alely, které kodují pro serin necitlivé fosfoglycerátdehydrogenasy, se vyrobí technikami genového inženýrství, výhodně technikami místně směrované mutagenese a takovéto alely se vnesou do mikroorganismů, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntesy tryptofanu tak, že se integrovaně vyskytují buď na autonomně replikovatelném rekombinantním vektoru nebo v chromosomu kmene. Dále se týká použití takto vyrobených mikroorganismů pro fermentativní produkci tryptofanu.ŕ

Description

Způsob výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití pro výrobu tryptofanu.
Dosavadní stav techniky
Je známé, že látková přeměna tryptofanu ve všech dosud zkoušených mikroorganismech probíhá přes jednotnou biosyntézní cestu (Somerville, R. L., Hermann, K. M., 1983, Aminoacids, Biosynthesis and Genetic Regulation, Adelison-Wesley Publishing Company, USA: 301 - 322 15 a 351 -378; Aida a kol., 1986, Biotechnology of amino acid production, progress in industrial microbiology Vol. 24, Elsevier Science Publishers, Amsterdam: 188 -206). Látková přeměna tryptofanu, její spojení s látkovou přeměnou šeřinu, jakož i geny, kódované pro nej důležitější enzymy, jsou znázorněné na obr. 1.
Známé způsoby produkce tryptofanu spočívají v tom, že je mutovaný trpE-gen, který je kódován pro tryptofan-intenzivní antranilátsyntetázu, exprimován společně s jinými geny trp-operonu na vhodném autonomním replikovatelném vektoru. Větším množstvím kopií genu dochází ke zvýšené expresi trp-genu a v souladu s tím ke zvýšenému množství jednotlivých enzymů látkové přeměny tryptofanu. Důsledkem toho je nadprodukce tryptofanu.
Příklady takovýchto postupů jsou popsané pro řadu organismů, například pro Escherichia coli (EP 0 293 207, US 4 371 614), pro Bacillus (US 4 588 687) a pro Corynebakterium a Brevibakterium (EP 0 338 474). Při těchto způsobech dochází křadě problémů ve vedení procesu. Může docházet k nestabilitě a ke ztrátám vektoru, nebo k prodloužení růstu produkčního 30 kmene.
EP-A-0 401 735 (přihlašovatel: Kyowa Hakko Kogyo Co.) popisuje způsob produkce L-trýptofanu za pomoci kmenů Corynebakterium nebo Brevibakterium, které obsahují rekombinantní plazmidy. Tyto piazmidy nesou genetické informace pro syntézu enzymů DAHP-syntetázy, 35 antranilátsyntetázy, indol-3-glycerol-P-syntetázy, tryptofansyntetázy a fosfoglycerátdehydrogenázy. Používají se anranilsyntetázové alely, rezistentní vůči zpětnému ovlivňování (feedbackrezistentní).
Dále je známé zvyšování produkce tryptofanu v kmenech s deregulovanou látkovou přeměnou 40 tryptofanu vnesením více divokých typů genů serA nebo serA, B, C. Chemical Abstracts CA 111 ( 1989) 16 86 88q a CA 11 (1989) 16 86 89r popisují například použití kmenů Bacillus, které divoký· typ alely serA, popřípadě všechny typy divokých genů látkové přeměny šeřinu (serA, serB a serC) přeexprimují na plazmidy pro produkci tryptofanu.
Zvýšení výtěžku tryptofanu snížením odbourávání šeřinu v buňce je známé z EP-A-0 149 539 (přihlašovatel: Sauffer Chemical Company). Tato patentová přihláška popisuje K12-mutanty E. coli, ve kterých je serin, odbourávající enzym seríndeamináza (sda), rozrušován. Popisuje také použití takových kmenů pro produkci aminokyselin. Příklad VIII popisuje využití takovéhoto kmene pro nadprodukci tryptofanu z antranilátu. Výtěžky tryptofanu, zlepšené ve srovnání s kmenem s intaktní serindeminázou, se v této evropské patentové přihlášce vysvětlují tím, že v mikroorganismech, ve kterých je zásoba předstupňů tryptofanu velmi vysoká, je serin, popřípadě kapacita biosyntézy šeřinu parciálně limitující pro produkci tryptofanu.
Podstata vynálezu
Úkolem předloženého vynálezu je dát k dispozici mikroorganismy, které by ve vyšší míře produkovaly tryptofan, tedy vypracovat způsob, který by umožnil výrobu takovéhoto mikroorganismu.
Uvedený úkol byl vyřešen pomocí způsobu výroby mikroorganismů, produkujících tryptofan, jehož podstata spočívá v tom, že se mikroorganismy, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntézy tryptofanu, opatří serA-alelou, která má sníženou citlivost vůči inhibici serinem, přičemž mikroorganismy, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntézy tryptofanu, se podrobí mutagenezi a mutagenem zpracované populace organismů se podrobí selekci na klony se serA-geny, které kódují pro serin necitlivé fosfoglycerátdehydrogenázy, nebo ser-alely, které kódují pro serin necitlivé fosfoglycerátdehydrogenázy, se vyrobí technikami genového inženýrství, výhodně technikami místně směrované mutageneze, a takovéto alely se vnesou do mikroorganismů, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntézy tryptofanu, tak že se integrované vyskytují buď na autonomně replikovatelném rekombinantním vektoru, nebo v chromosomu kmene.
Tímto způsobem vyrobené mikroorganismy se vyznačují tím, že mají deregulovanou látkovou přeměnu tryptofanu a alespoň vůči zpětnému působení rezistentní (feedbackrezistent) serAalelou deregulovanou látkovou přeměnu šeřinu.
Ve smyslu předloženého vy nálezu se pod pojmem „vůči zpětnému působení rezistentní serAalely rozumí mutanty serA-genu, které pro fosfoglycerátdehydrogenázu kódují ve srovnání s odpovídajícím divokým typem fosfoglycerátdehydrogenázy odpovídajícího mikroorganismu se sníženou senzitivitou šeřinu.
Kombinací podle předloženého vynálezu alespoň jedné vůči zpětnému působení rezistentní serA-alely s mikroorganismem s deregulovanou látkovou přeměnou tryptofanu se zvýší neobvykle a neočekávaně o až 2,6 násobek výtěžku ve srovnání s výtěžky, kterých se může dosáhnout se stejným mikroorganismem bez vůči zpětnému působení rezistentní serA-alely při jinak stejných kultivačních podmínkách.
To, že kmeny podle předloženého vynálezu produkují ve zvýšené míře tryptofan, je neočekávané a překvapivé, neboť vůči zpětnému působení rezistentní serA-alely vykazují efekt pouze při vysoké intercelulámí hladině šeřinu (Tosa T., Pizer L. J., 1971, Joumal of Bacteriology Vol. 106:972 - 982; Winicov J., Pizer L. J., 1974, Joumal of Biological Chemistry Vol. 249: 1348 - 1355). Podle stavu techniky (například EP-A-0 149 539) mají mikroorganismy s deregulovanou látkovou přeměnou tryptofanu však nízkou hladinu šeřinu. Proto není možno očekávat při vnesení vůči zpětnému působení rezistentní serA-alely podle předloženého vynálezu do mikroorganismů s deregulovanou látkovou přeměnou tryptofanu zvýšení produkce tryptofanu.
Vzhledem k tomu, že u všech známých mikroorganismů probíhá přeměna tryptofanu mechanismem, znázorněným na obr. 1 a techniky, použité pro výrobu kmenů podle předloženého vynálezu jsou v principu známé a použitelné na všechny mikroorganismy, jsou kmeny podle předloženého vynálezu vyrobitelné z libovolných mikroorganismů.
Výborně vhodné jsou pro výrobu kmenů podle předloženého vynálezu bakterie. Obzvláště výborně vhodné jsou gramnegativní bakterie, především E. coli.
-2CZ 282396 B6
Kmeny se tedy podle předloženého vynálezu mohou získat tak, že se v libovolném tryptofanprototrofním výchozím kmenu zcela nebo částečně zruší látková přeměna tryptofanu a do tohoto kmene se zavede vůči zpětnému působení rezistentní serA-alela. Mohou se rovněž získat tak, že se u tryptofan-auxotrofních výchozích kmenů obnoví schopnost syntetizovat typrofan, přičemž 5 je rekonstruovaná látková přeměna tryptofanu deregulovaná, a do takovýchto kmenů se vnese vůči zpětnému působení rezistentní serA-alela.
Deregulace látkové přeměny tryptofanu v mikroorganismech se může provádět pomocí řady různých přístupů, které jsou známé ze stavu techniky.
Jedna možnost deregulace látkové přeměny tryptofanu spočívá v tom, že se změní enzym antranilátsyntetáza. Tento enzym katalyzuje u všech mikroorganizmů první krok tryptofanspecifické biosyntézní cesty. Tryptofan je ve své aktivitě potlačován a tím je regulován, v závislosti na množství tryptofanu, proud metabolitů tryptofanovou biosyntézní cestou. Enzym 15 je kódován pomocí genu trpE.
Modifikované trpE-geny, které kódují antranilátsyntetázy se sníženou selektivitou vůči tryptofanu ve srovnání s odpovídajícím divokým typem antranilátsyntetázy, označované v následujícím jako vůči zpětnému účinku rezistentní (feedbackrezistent) trpE-alely, se mohou 20 získat mutagenezi a následující selekcí tryptofan-prototrofního výchozího kmene. K tomu se odpovídající kmen podrobí mutaci indukujícímu zpracování (Miller J. H., 1972 Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113 - 185).
Zpracovávaný kmen se nanese na živné médium, které obsahuje alespoň jeden antagonist 25 tryptofanu v množství, které postačuje k tomu, aby byl růst kmene potlačen. Jako příklady vhodných antagonistů tryptofanu je možno uvést 4-methyltryptofan, 5-methyltryptofan, 6methyltryptofan, halogenové tryptofany, tryptazan, indol a kyselinu indolakrylovou.
Rezistentní klony se zkoušejí na tryptofan-senzitivitu své antranilátsyntetázy. Pro stanovení 30 tryptofansenzitivity antranilátsyntetázy se může použít každá metoda, která dovoluje změřit aktivitu tohoto enzymu za přítomnosti tryptofanu. Například se může nechat reagovat za enzymatické katalýzy chorismat ve vhodném pufrovacím systému se svým reakčním partnerem glutaminem (Bauerle R. a kol., 1987, Methods in Enzymology Vol. 142: 366 -386). Testovaná vsázka se kineticky alikvotně odebere a pomocí HPLC-analýzy se stanovuje množství 35 antranilátu jako reakčního produktu, vzniklého za jednotku času. Množství antranilátu, vytvořeného za časovou jednotku, je přímo mírou aktivity antranilátsynteázy. Test se provádí za přítomnosti a za nepřítomnosti tryptofanu, aby se stanovila senzitivita testované antran i látsyntetázy.
Je ale také možné připravit tryprofan-insenzitivní trpE-alely přímou genově technickou manipulací (Bauerle R. a kol., 1987, Methods in Enzymology Vol. 142: 366 - 386). Je popsána řada mutací v aminokyselinové sekvenci antranilátsyntetázy různých organismů, které vedou ke snížení senzitivity enzymu vůči tryptofanu (například pro Salmonellu: Caliguiri M.G., Bauerle R., 1991, J. of Biol. Chem. Vol. 266:8328 - 8335; pro Brevibacterium a Coryne45 bacterium: Matsui K. a kol.. 1987, J. bact. Vol. 169: 5330 - 5332).
Jsou známé metody, které umožňují zavést mutaci v DNA-fragmentu na specifickém místě. Takovéto metody jsou mimo jiné popsané v následujících publikacích:
Sakař G., Sommerauer S. S., 1990 Bio Techniques 8:404-407, Polymerase chain reaction abhángige site directed mutagenese;
Aushubel F. M. a kol., 1987, Curren Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Phage M13 abhángige Method;
-3CZ 282396 B6
Smith M., 1985, Ann. Rev. Genet. 19: 423 - 462, jiné metody.
DNA-fragment, který zahrnuje divoký typ trpE-genu, se pomocí již popsaných standardních 5 technik pro výrobu rekombinantní DNA rekombinuje na vektor. Použitím výše uvedených metod pro „site-directed“ mutagenezi se jeden nebo několik nukleotidů DNA-sekvence změní tak, že nyní genem kódovaná aminokyselinová sekvence odpovídá aminokyselinové sekvenci tryptofanin senzitivn i antran i lsyntetáze.
ío Pomocí popsaných technik se dá do libovolného trpE-genu zavést jedna nebo více mutací, které způsobují, že kódovaná antranilátsyntetáza má aminokyselinovou sekvenci, vedoucí k tryptofaninsenzitivitě.
Dodatečně jsou v kmenu podle předloženého vynálezu žádoucí, ale ne nezbytně nutné, 15 následující vlastnosti:
defektní tryptofanrepresorový protein, defektní attenuační kontrola exprese trp-operonu a defektní tryptofanáza. Tyto vlastnosti se dají v kmeni podle předloženého vynálezu nejjednodušeji získat volbou výchozího kmene, který může již získat jednu nebo více těchto 20 odpovídajících vlastností. Příprava nebo volba může probíhat kombinací v následujícím uvedených selekčních metod.
Tryptofanrepresorový protein je nadřazený regulátorový protein biosyntézy tryptofanu. Společně s tryptofanem jako aporepresorem reprimuje tento protein expresi trp-operon-genu. Protein je 25 kódován genem trpR. Tryptofanrepresorové mutanty se mohou selektovat například pod mutantami, které jsou rezistentní vůči antagonistům tryptofanu, jako je například 5-methyltryptofan. Příklady jsou popsané v J. Mol. 44, 1969, 185 - 193 nebo Genetics 52, 1965, 1303 1316.
Vedle kontroly pomocí trpR-kódovaného proteinu podléhá trp-operon dodatečně attenuační kontrole. Zodpovědný za tuto regulaci je DNA-region před prvním genem trp-operonu. Mutace nebo delece v této oblasti mohou vést k deregulaci. Takovéto mutanty mohou být selektovány pod mutanty, které jsou rezistentní vůči antagonistům tryptofanu, jako je například 5methyltryptofan. Za druhé mohou být dosaženy takovéto mutace, obzvláště, ale delece tak, že se způsobem „site-directed-mutageneze“ indukuje tato změna místně specificky v attenuační oblasti DNA.
Pomocí již popsaných technik místně specifické mutageneze je možné rekombinovat inaktivovanou attenuační oblast do chromozomu kmene podle předloženého vynálezu na místo 40 přírodní attenuační oblasti.
Enzym tryptofanáza (tnaA) katalyzuje odbourávání tryptofanu na indol, pyruvát a amoniak. Je žádoucí, aby tento enzym byl v tryptofan-produkčních kmenech inaktivní. Kmeny, ve kterých je tento enzym defektní. se mohou získat tak, že se organismy podrobí mutagennímu zpracování 45 a pod mutantami se rozumí takové, které již nejsou schopné využívat tryptofan jako zdroje uhlíku a dusíku. Detailní příklad popisuje J. Bact. 85, 1965, 680 - 685. Alternativně je rovněž možné pomocí výše uvedených technik zavést místně specifické delece do tnaA-genu, což vede potom k inaktivaci.
Řada dodatečných mutací výchozího kmene je vhodná k tomu, aby se dosáhlo dalšího zvýšení produkce tryptofanu. Je výhodné, když je vedle tryptofanové biosyntézní cesty dodatečně všeobecná biosyntézní cesta aromatických aminokyselin (cesta shikimi kyseliny) regulačně insenzitivní. Proto jsou kmeny, které mají regulačně insenzitivní syntetázu kyseliny dehydroarabinoheptulosonové a jejich tyrosinrepresorový protein (tyrR) je působením mutace
-4CZ 282396 B6 nebo delece inaktivován, vhodné jako výchozí kmeny pro přípravu kmenů podle předloženého vynálezu. Rovněž tak jsou výhodné kmeny, u nichž je porušena látková přeměna fenylalaninu a tyrosinu. Tím se zajistí výsledný přechod chorismatu na tryptofan. Takovéto kmeny mají například mutace nebo delece v genech pheA a/nebo tyrA.
Je známá řada kmenů, které jsou v jednom nebo více krocích biosyntézy tryptofanu deregulované a nadprodukují tryptofan. Jako příklady je možno uvést Bacillus subtilis FermBP-4 a FermP1483 (DE 3 123 001), Brevibacterium flavum ATCC21427 (US 3 849251), Corynebacterium glutamicum ATCC 21842 - 21851 (US 3 594 297 a US 3 849 251), io Micrococcus luteus ATCC 21102 (US 3 385 762), Escherichia coli ATCC 31743 (CA 1182409).
Tyto kmeny jsou rovněž vhodné jako výchozí kmeny pro přípravu kmenů podle předloženého vynálezu. Tím se ukazuje, že kmeny pro produkci tryptofanu podle předloženého vynálezu je možno získat z nejrůznějších skupin organismů.
Vedle kmenů s deregulovanou látkovou výměnou tryptofanu je pro výrobu kmenů podle předloženého vynálezu potřebný alespoň jeden gen, který kóduje fosfoglycerátdehydrogenázu se sníženou serin-senzitivitou ve srovnání s odpovídající fosfoglycerátdehydrogenázou divokého typu.
Fosfoglycerátdehydrogenáza (PGD) se kóduje pomocí genu serA. Sekvence divokého typu serAgenu je známá (Tobey K. L., Grant G. A., 1986, J. Bact. Vol. 261, č. 26: 1279- 1283). Nadexprese produktu divokého typu serA-genu přes plazmid-vektor je rovněž známá (Schuller a kol., 1989, J. Biol. Chem. Vol. 264: 2645 - 2648).
Výroba vůči zpětnému účinku rezistentních serA-alel pomocí klasického genetického postupu byla popsána Tosou T. a Pizerem L. T., 1971, J. Bact. Vol. 106, č. 3:972 -982. Selekce se přitom provádí přes rezistenci mutantů vůči serinovému analogu serinhydroxamátu. Mutace nejsou v tomto literárním odkaze blíže charakterizované; vliv mutace na látkovou přeměnu nebyl zkoumán.
Vůči zpětnému účinku rezistentní serA-alely jsou také například získatelné tak, že se mikroorganismus podrobí mutagenezi. Jako mutagen přichází v úvahu ultrafialové záření a obvyklé chemické mutageny, jako je například ethylmethansulfonát nebo N-methyl-N'-nitro-Nnitrosoguanidin. Dávkování a doba expozice zvoleného mutagenu se stanovuje pomocí dosavad35 nich postupů (Miller J. H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113 - 143).
Mutagenem zpracované populace organismů se podrobí selekci na klony se serA-geny, které se kódují pro serin-insenzitivní fosfoglycerátdehydrogenázy. Například se inkubuje mutagenem 40 zpracovaná populace na pevném růstovém médiu, které obsahuje v dostatečném množství serinhydroxamát. aby se potlačil růst nerezistentních bakterií.
Rezistentní klony se testují na serin-senzitivitu svojí fosfoglycerátdehydrogenázy. Příkladné provedení tohoto postupuje popsané Thosou a Pfizerem, 1971, J. Bact. 100, 3: 972 - 982.
Alely, které kódují serin-insenzitivní fosfoglycerátdehydrogenázu, se mohou také připravit pomocí technik ..genetic engineering“.
Region fosfoglycerátdehydrogenázy, který umožňuje serin-regulaci, leží v C-terminální oblasti 50 proteinu. Proto se tedy inzerce, substituce nebo delece jednotlivých nebo více aminokyselin zavádí výhodně v C-terminálních 25 % PGD-proteinu, obzvláště výhodně v 50 C-terminálních aminokyselinách PGD-proteinu. Toto vede ke snížené senzítivitě PGD vůči šeřinu.
-5CZ 282396 B6
Alely, které kódují takovéto PGD, se získají tak, že se změní 3'-oblast serA-genu, který kóduje uvedené C-terminální oblasti PGD. K tomu se nemutovaný serA-gen rekombinuje za využití technik pro výrobu rekombinantní DNA, které jsou pro odborníky známé, jako je restrikce, ligace a transformace (Maniatis T., Fritsch E. F. a Sambrook J., Molecular Cloning: 5 A Laboratory Manual 1982, Cold Spring Harbor Laboratory), na klonovací vektor.
Specifické změny ve 3'-oblasti strukturního genu se mohou například dosáhnout pomocí techniky „site-directed-Mutagenese“.
Příklady serin-insenzitivních fosfoglycerátdehydrogenáz, které jsou vhodné pro expresi v mikroorganismech s deregulovanou látkovou přeměnou tryptofanu, jsou uvedeny znázorněním svých C-terminálních aminokyselinových sekvencí v následující tabulce 1. Až na znázorněnou C-terminální oblast se proteinové sekvence enzymů neliší od sekvence divokého typu.
Aby se mohly genové produkty serA-alely vyzkoušet na PGD-aktivitu a serin-senzitivitu, využije se k tomu následující test:
PGD-aktivita byla stanovena důkazem obousměrné reakce enzymu podle metody Mc Kitricka
J. C. a Lewise J. P., 1980, J. Bact. 141; 235 - 245. Aktivita enzymu se přitom měřila bez šeřinu 20 as různými koncentracemi šeřinu. Uvedený test je vhodný pro stanovení serin-senzitivity každé fosfoglycerátdehydrogenázy. Může se ale použít každá další metoda měření PGD-aktivity.
Jako míra serin-senzitivity enzymu slouží hodnota K15 což je koncentrace šeřinu, která inhibuje aktivitu enzymu z 50 %. K, hodnoty a C-terminální sekvence aminokyselin více vůči zpětnému 25 působení rezistentních serA-alel, jakož i divoký typ serA-genu (serAWT), jsou uvedené v následující tabulce 1.
Tabulka 1
C-terminální sekvence aminokyselin mutovaných serA-alel ser AWT serA 5 serA 1508 serA 11 serA 1455
AEQG QAMK V AIPG NIA TIRA AQYL RLLY QTSA QMGY WID IEAD EDVA EKAL
AEQG V NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL
QAMK AI EG TIRA RLL_
AEQG ves?. ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY WID IEAD EDVA EKAL
QAMK AIPG TIRA RLLY
AEQG ves?. ΑΝΙΑ AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL
QAMK AIPG TIRA RLL_
AEQG V NIA AQYL QTSA QMGY VVID IEAD EDVA EKAL
QAMK AIPG TIR_
Ki/mM
0,02 SEQ ID NO: 1
0,2 SEQ ID NO: 2
3,8 SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
100 SEQ ID NO: 5
Pro výrobu kmenů podle předloženého vynálezu jsou výborně vhodné překvapivě serA-alely s hodnotami K( v rozmezí 100 a 50 mM šeřinu.
Pro expresi PGD-proteinů ve kmenu podle předloženého vynálezu se může použít každý rekombinantní vektor, který vede k expresi serin-insenzitivních serA-alel. Rekombinantní vektor, vhodný pro výrobu kmenů podle předloženého vynálezu, zahrnuje alespoň jeden serAgen, který kóduje PGD, který má vůči divokému typu sníženou senzitivitu vůči šeřinu, a jeden 40 podíl vektoru, který je ve kmeni hostitele autonomně replikovatelný.
-6CZ 282396 B6
Příklady vektorů, které jsou autonomně replikovatelné v Escherichia coli, jsou uvedené Pouwelem P. H., Engerem-Valkem a Brammarem W. J., 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam.
Takovéto vektory jsou mimo jiné:
Plazmidy vysokým počtem kopií, jako je například pBR322 nebo pUC 12;
plazmidy se středním počtem kopií, jako je například pACYC184, 177;
plazmidy s nízkým počtem kopií, jako je například pSC 101;
fágové vektory, jako je například M13, gama-vektory.
Srovnatelné vektory jsou popsány pro velký počet bakterií (například EP 0 401 735 pro Corynebakterium a Brevibakterium nebo CA 111 (1989) 168688q).
Obzvláště výhodné jsou vektory se středním až nízkým počtem kopií, především jsou výhodné vektory s pl5A-replikonem, jako je například pACYC184 (ATCC 37033) nebo pACYC177 (ATCC 37031).
V literatuře je dále popsán velký počet vektorů pro jiné bakterie (Pouwels a kol., 1985, Cloning Vectors, Elsevier Science Publishers, Amsterdam).
Vhodné rekombinantní vektory se mohou vyrobit pomocí standardních technik pro výrobu rekombinantních DNA. Tyto techniky jsou vyčerpávajícím způsobem uvedený například v publikaci Maniatis T., Fritsch E. F. a Sambrook J., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, USA nebo Ausubel F. M. a kol., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, USA.
Výroba rekombinantních vektorů je například možná tak, že se DNA dárcovského organismu, který má serA-alelu v chromozomu nebo na rekombinantním vektoru, který kóduje vůči šeřinu insenzitivní fosfogly cerátdehydrogenázu, fragmentuje pomocí restrikčních enzymů. Fragmentovaná DNA se liguje pomocí konvenčních metod, například použitím enzymu T4DNA-ligázy, na rovněž pomocí restrikčních enzymů linearizovanou molekulu vektoru. Ligační směs se využije k tomu, aby se hostitelské kmeny s deregulovanou látkovou přeměnou tryptofanu transformovaly pomocí známých způsobů, jako je kalciumchloridový šok nebo elektroporace. Vektory, které obsahují požadované serA- alely, se mohou v hostitelských kmenech získat například pomocí výše uvedených způsobů, jako je selekce na rezistenci vůči antibiotikům nebo komplementace serA-mutací.
V další formě provedení kmenů podle předloženého vynálezu jsou serA-alely integrovány jako jednotlivé kopie do chromozomu. Tohoto se může jednak dosáhnout tím, že se provede výše popsaná mutagenezní a selekční strategie přímo s tryptofan-deregulovaným výchozím kmenem. Za druhé je také možné serA-alely, které se nacházejí na rekombinantních vektorech, integrovat do chromozomu produkčního kmene. Řada metod k takovéto integraci je známá. Popisy takovýchto technik se nacházejí v následujících publikacích:
Integrace, zprostředkovaná fágem lambda: Balakrishnan a Backmann, 1988, Gene 67: 97 - 103; Simons R. W. a kol., 1987. Gene 53: 85 - 89;
Genreplacement, závislý na recD: Shervell a kol., 1987, J. Bact. 141: 235 - 245;
-Ί CZ 282396 B6
Další metody: Šilhavý a kol., 1988, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory.
Při fermentaci kmenů podle předloženého vynálezu se ukázalo zcela překvapivě, že kmeny, obsahující vůči zpětnému účinku rezistentní serA-alelu s hodnotou Kj pro serin v rozmezí 100 μΜ až 50 mM a s deregulovanou látkovou výměnou tryptofanu, a obsahující trpE-alelu s hodnotou K, pro tryptofan v rozmezí 0,1 mM až 20 mM, poskytují nejvyšší výtěžky tryptofanu.
Příklady provedení wnálezu
Následující příklady provedení slouží k dalšímu objasnění předloženého vynálezu.
Příklad 1
Screening na vůči zpětnému působení rezistentní alelu a integrace této alely do chromozomu
Pro hledání vůči zpětnému působení rezistentních trpE-alel se používá analog tryptofanu 5methyltryptofan. Jako mutagenní činidlo slouží N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NG). Použitý výchozí kmen je Escherichia coli K.12 YMC9 ATCC 33927. Pracovní postup při mutagenezi se řídí podle údajů Millera (Miller J. H. , 1972, Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Ν. Y.: 125 - 129).
Asi 2 x 109 buněk YMC9 z exponenciální růstové fáze v LB pěstované kultury se inkubuje ve 4 ml 0,1 M Na-citrátového pufru při pH 5,5 po dobu 30 minut při teplotě 37 °C s 50 pg/ml NG. Po dvojnásobném promytí 0.1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 se 0,1 ml buněk kultivuje přes noc při teplotě 37 °C za třepání LB. Potom se 0,1 ml buněk z různých zředění (10'3, W4, 10‘9 v 0,9 % NaCl) nanese na plotny s minimálním médiem se 100 pg/ml 5-methyltryptofanu. Vedle 5-methyltryptofanu obsahuje minimální médium 5 g/1 glukózy, 5 mg/1 vitaminu Bl, 3 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 12 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,3 g/1 heptahydrátu síranu hořečnatého, 0,1 g/1 chloridu sodného, 5 g/1 síranu amonného, 17,7 mg/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 2 mg/1 heptahydrátu síranu železnatého, 1 g/1 citrátu trojsodného a 15 g/1 agaru. Po 24 až 48 hodinách při teplotě 37 °C se 5-methyltryptofan-rezistentní klony oddělí na výše uvedené plotny.
Pro charakterizaci získaných mutantů se stanovuje K-hodnota trpE-genového produktu pro tryptofan (Bauerle R. a kol., 1987, Methods in Ezymology Vol. 142: 366 - 386). Mutanty by se mohly přitom rozdělit do dvou tříd. Mutanty třídy 1 mají vůči zpětnému působení rezistentní antranilátsyntetázy, mutanty třídy 2 mají enzymy se zvýšenou aktivitou antranilátsyntetázy při nezměněné hodnotě K,
Pro charakterizaci na molekulární rovině se relevantní oblasti DNA různých mutantů klonují asekvencují. K tomuto účelu se izoluje odpovídající chromozomální DNA a ve vsázce se rozštěpí pomocí restrikčních enzymů Nhel a Clal. Fragmenty jedné velikosti asi 5 kb se izolují a ligují se pomocí 4158 bp velikého Nhel/Clal-fragmentu pBR322. Ligační vsázka se transformuje do trpE-kmene E. coli KB 862 (DSM7196). Selektuje se na klony, které mohou růst na minimálním médiu bez tryptofanu. Komplementující plazmidy obsahují všechny 5 kb Nhel/Clalfragment. Vedle genů trpE a trpD obsahuje tento 5 kb Nhel/Clal-fragment také DNA-oblasti po směu od trpE (asi 0,8 kb) a po směru od trpD (asi 1 kb). V následující tabulce 2 jsou uvedeny rozdíly sekvence aminokyselin a K—hodnoty 4 mutantů třídy 1. V neznázoměných oblastech souhlasí sekvence mutantů se sekvencí divokého typu.
-8CZ 282396 B6
Tabulka 2 trpE WT trpE 0 trpE 5 trpE 6 trpE 8
Sekvence aminokyselin mutovaných trpE-alel
NPTA LEI IQ LCGD RPAT LLLE SADÍ DSKD DLKS
K,/mM
0, 01 SEQ ID NO: 6
0, 1 SEQ ID NO: 7
3, 0 SEQ ID NO: 8
>15 SEQ ID NO: 9
15 SEQ ID NO: 10
Sekvenční analýza mutantů třídy 2 ukazuje, že mutace existují buď v oblasti operátoru trppromotoru, nebo v oblasti DNA, která kóduje trp-řídicí peptid. Mutace, označené jako deltatrpLl, popřípadě deltatrpL2, mají 136 bp, popřípadě 110 hp velikou deleci v oblasti DNA, kódované pro řídicí peptid. Pro deltatrpLl mutaci zahrnuje delece oblast pozice nukleotidů 33 až do pozice 168, u deltatrpL2 mutace oblast od pozice nukleotidů 11 až do 120, v sekvenci, uložené v EMBL-databázi pod číslem AC VOO372.
Aby se dosáhlo silnější exprese vůči zpětnému působení rezistentních trpE-alel, kombinují se obě třídy mutace. Ktomu se použije mutace deltatrpLl třídy 2. Na obr. 2 je ukázána řada deltatrpLl mutací (třída 2) a mutace trpEO, trpE5, trpEó a trpE8 (třída 1).
Z plazmidu deltatrpL (obr. 2) se izoluje 1,6 kb Nrul-fragment, který nese deltatrpLl-mutaci a vymění se za odpovídající Nrul-fragment divokého typu plazmidů pEO, pE5-pE6, popřípadě pE8 (obr. 2). Získané plazmidy jsou pojmenovány jako pIEO, pIE5, pIE6, popřípadě pIE8 a použijí se pro chromozomální integraci homologních rekombinací. Ktomu se z uvedených plazmidů izolují odpovídající, asi 5 kb velké chromozomální Nhel (Clal-fragmenty, jak je uvedeno v příkladě 2 z low melting agarózy, a v lineární formě se transformují do recD—kmene PD106 [deltatrpLD102],
Jako transformační metoda se použije CaCli-metoda podle Cohena a kol., 1972, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:2110-2114. K en PDI06 je uložen podle Budapešťské smlouvy od 28. 07. 1992 v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod číslem 7195 (DSM 7195). Selektují se klony, které mohou růst na minimálním médiu bez tryptofanu a které jsou ampicilinsenzitivní, to znamená prosté plazmidu.
Pl-trasdukcí (Miller J. H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor, N. Y.: 201 - 205) se trpE-alely, které kódují různě vůči zpětnému působení rezistentní trpEenzymy a jsou odpovídajícím způsobem způsobem kombinované s deltatrpLl-mutaci, přecházejí zodpovídajících kmenů do KB862. Kmen KB862 je uložen podle Budapešťské smlouvy od 28. 07. 1992 v Německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod číslem 7196 (DSM 7196). Selektují se klony, které mohou růst na minimálním médiu bez tryptofanu. Získané kmeny byly označeny jako PD103 (trpEO), KB862 (trpE5), SV164 (trpE8) a SV163 (trpE6).
Příklad 2
Výroba serA-genů, které jsou kódovány pro serin-intenzivní fosfoglycerátdehydrogenázy
-9CZ 282396 B6
Divoký typ serA-genu z Escherichia coli kmene E. coli B (ATCC 23226) se klonuje na plazmidový vektor pUC18.
Aby se získala chromozomální DNA tohoto kmene, nechá se na něj přes noc působit při teplotě 37 °C Luria-Broth. Bakteriální buňky se získají centrifugací (4000 g). Lyže buněk a čištění DNA se provádí metodou, popsanou Ausubelou a kol., 1987, 2.4.1 -2.4.2, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates. Získané množství DNA se stanovuje spektrofotometricky při vlnové délce 260 nm. Výtěžek je okolo 600 mg/100 ml.
100 pg chromozomální DNA se štěpí pomocí restrikčního enzymu Sphl (Boehringer Mannheim GmbH) za podmínek, udaných výrobcem. Asi 3 pg směsi fragmentů se liguje pomocí 0,2 pg rovněž SphI-štěpeného autonomního replikovatelného plazmidového vektoru pUC18 (firmy Boehringer Mannheim GmbH) pomocí enzymu T4-ligáza (firmy Boehringer Mannheim GmbH) za podmínek, udávaných výrobcem. Ligační směs se použije k tomu, aby se serA-mutanty PC1523 (CGSC#: 5411;) (CGSC: E. coli Genetic Stock Center, Department od Biology 255 OML, Yale University, Postbox6666, New Haven, CT, USA) transformovaly. Jako transformační metoda se použije CaCl-metoda podle Cohena a kol., 1972, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114. Transformované bakterie se nanesou na plotny s minimálním médiem bez šeřinu. Klony, které bez šeřinu rostou, obsahují serA-gen z E. coli na 3,5 kb velikém Sphlfragmentu. Sekvence divokého typu serA-genu je uvedena na obr. 3 (SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14). Rekombinantní vektor se serA-genem je označen jako pGC3 (obr. 4).
SerA-alela serA5 se vyrobí tak, že se plazmid pGC3 rozštěpí pomocí restrikčních enzymů Sáli a KpnI (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podle údajů výrobce. Získané fragmenty se rozdělí podle agarozové gelové elektroforézy. Fragment Sall-KpnI o velikosti 2,0 kb, který obsahuje úplný serA-gen až na 8 C-terminální kodon, se na gelu přečistí. K tomu se provádí elektroforéza na „lovv-melting-agaróze“ (firmy Boehringer Mannheim GmbH) tak, aby se mohla DNA pomocí jednoduchého roztavení agarózy získat zpět. 0,2 pg tohoto fragmentu se liguje ekvimolámím množstvím pUC!8, štěpeného pomocí HindlII/SalI, a synteticky vyrobeného, dvoušroubovicového oligonukleotidu pomocí T4-ligázy (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podle údajů výrobce. Sekvence nukleotidů tohoto oligonukleotidu je následující:
5' 3'
C ATT CGC GCC CGT CTG CTG TAA TA
CTAGG TAA GCG CGG GCA GAC GAC ATT ATT CGA SEQ ID NO: 11 3' 5'
Tento oligonukle tid doplňuje 7 z 8 posledních C-terminálních kodonů serA-genů. Namísto osmého kodonu se zavádí stoptriplet TAA. Fosfoglycerátdehydrogenáza, kódovaná tímto serAgenem, je tím zkrácena o jednu C-terminální aminokyselinu. Aminokyselinová sekvence zmnožené PGD je ukázána v tabulce 1 (serA5). Rekombinantní plazmid se označuje jako pGH5 (obr. 5). Pomocí ligační vsázky se transformuje serA-mutanta PC 1523.
SerA-alela serA1508 se vyrobí následujícím způsobem. Plazmid pGC3 se štěpí pomocí SphI/SalI (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podle údajů výrovce. 3 kb-fragment, který nese úplný serA-gen. se čistí pomocí gelové elektroforézy a liguje se pomocí vektoru pUC18, štěpeného pomocí SphL SalI. Rezultující plazmid je označen jako pKB1321 (obr. 6).
Plazmid pKB13221 se inkubuje s restrikční endonukleázou HindlI (firmy Boehringer Mannheim) za podmínek, které dovolují pouze parciální štěpení ( 0,05 U enzymu pro 1 pg DNA pro 10 minut, obvyklé reakční podmínky podle údaje výrobce). Tím vznikne mimo jiné frakce fragmentů, které jsou štěpeny na pozici 1793 serA-genu HindlI. Na tomto místě se ligací zavede DNA-linker s Xbal-štépným místem. Sekvence DNA-linkeru je následující:
- 10CZ 282396 B6
5' 3'
TGC TCT AGA GCA
ACG AGA TCT CGT SEQ ID NO: 12
3' 5'
Inzerce vede k polyfosfátodehydrogenáze, která na tomto místě nese čtyři přídavné aminokyseliny. Jejich sekvence je znázorněna v tabulce 1. Plazmid s touto inzercí se označuje jako pKB 1508 (obr. 7). Je transformován do serA-mutanty PC1523.
SerA-alela serAll se vyrobí tak, že se štěpí plazmid pGH5 pomocí Sáli a KpnI (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podle údajů výrobce a 2,8 kb veliký fragment se ze směsi fragmentů oddělí pomocí gelové elektroforézy z „low-melting“-agarózy. Tento fragment obsahuje podíl vektoru z pUC18 a C-terminální oblast serA5. Plazmid pKB 1508 se rovněž štěpí pomocí Sall/Kpnl. 2,0 kb veliký fragment DNA se eluuje z „low-melting“-agarózového gelu. Tento fragment obsahuje serA-alelu serA1508 s inzertní mutací, avšak chybí 8 C-terminální kodony. Oba fragmenty se spolu ligují a tím se transformuje serA-mutanta PC1523. Výsledný rekombinantní plazmid se označuje jako pGHl 1 (obr. 8). Kódovaná fosfoglycerátdehydrogenáza spojuje inzertní mutaci serA1508 s deleční mutací serA5. Region s mutacemi v kódované sekvenci aminoky selin je znázorněn v tabulce 1.
Pro expresi mutovaných serA-alel v produkčních kmenech se tyto překlonují ve vektoru pACYC 184 (ATCC 37033). vektoru se středním počtem kopií. Ktomu se plazmid pGH5 a plazmid pGHll štěpí pomocí SalI/HinhlII a izolují se vždy asi 2 kb veliké fragmenty DNA, obsahující serA-alely serA5 a serAll, z „low-melting“-agarózového gelu. Fragmenty se v oddělených vsázkách zpracují pomocí Klenow-fragmentu DNA-polymerázyl zE. coli (firmy Boehringer Mannheim) podle předpisu výrobce, aby se 5'-převislé štěpené konce restrikčního enzymu převedly na hladké konce. Ktomu se 1 pg odpovídajícího fragmentu ve 20 μΙ reakční vsázky smísí s 5 U Klenow-enzymu, 0,5 mM dATP, dGTP, dTTP a dCTP a s výrobcem doporučeným pufrem a směs se inkubuje po dobu 15 minut při teplotě 30 °C.
Fragmenty DNA s hladkým koncem se ligují s vektorem pACYC184, štěpeným pomocí PvuII. Ligační vsázka se využije k tomu, aby se transformovaly serA-mutanty. Kompiementované plazmidy byly nazvány pGH5/II, popřípadě pGHll/II (obr. 9, obr. 10). Plazmid pKB1508 se štěpí pomocí Sall/SphI. Fragment velikosti 3,0 kb, který obsahuje serA-alelu serA15O8, se čistí pomocí gelové elektroforézy. Tento fragment se výše popsaným způsobem převede na fragment s hladkým koncem, liguje se pACYC184, štěpeným pomocí PvuII, a ligační vsázka se transformuje do E. coli PC 1523. Komplementující plazmid byl nazván pKB1508/II (obr. 11).
Plazmidy pGH5/II (serA5), pGHll/II (serAll) a pKB1508/II se využijí ktomu, aby se transformovaly kmeny PD103 (trpEO), KB862 (trpE5), SV164 (trpE8) a SV163 (trpE6).
Příklad 3
Konstrukce chromozomálně kódované, vůči zpětnému působení rezistentní serA5-alely za pomoci rekombinantního gama-profágu
Pro integraci do chromozomální lambda „attachment site“ (att lambda) se serA5-alela klonuje do plazmidu pRS551 (Simons a kol., 1987. Gene 53: 85 - 96). Ktomu se izoluje asi 2 kb veliký serA5-nesoucí HindlILSalI-fragment z plazmidu pGH5. 5'—převislé konce se zaplní pomocí Klenow-fragmentů DNA-polymerázy I (firmy Boehringer Mannheim GmbH) podle předpisu výrobce a za pomoci EcoRI-linkerů (Maniatis a kol., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Mannual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.: 396 - 397) se 2 kb
-11 CZ 282396 B6 fragment liguje do pomocí EcoRI štěpeného vektoru pRS551. Rekombinantní plazmid se označí jako pRS55.
Vyrobením plotnového lyzátu recA+kmenu, nesoucího pRS5 (například YMC9 ATCC 33927), pomoci lambdaRS45-fága se vyrobí in vivo homologní rekombinací heterogenní lambda-lyzát, který vedle lambdaRS45-fága obsahuje také rekombinantní serA5-nesoucí lambdaRS45deriváty (Simons a kol., 1987, Gene 53: 85 - 96).
Pro selekci na rekombinantní lambdaRS45-deriváty se použije serA-kmen PC 1523 (CGSC#:5421). K tomu se PC1523 infikuje heterogenním lambda-lyzátem (viz výše) a potom se zaočkuje na kanamycin, obsahující (25 mg/1) LB-plotny. Získané lyzogenní, kanamycinrezistentní klony se potom testují na svojí schopnost růstu na plotnách s minimálním médiem bez šeřinu. Zvolí se serin-prototrofní kmen a tento se použije pro výrobu homogenního serA5lambda-lyzátu (UV-indukcí. Simons a kol., 1987, Gene 53: 85 - 86).
Tímto homogenním serA5-lambda-lyzátem se infikuje tryptofan-produkční kmen SVÍ64. Získaný kmen SVÍ64 att-lambda: serA5 se fermentuje postupem, popsaným v příkladě 4. Odpovídající médium obsahuje namísto tetracyklinu jako selekční agens vždy 25 mg/1 kanamycinu.
Výtěžky tryptofanu se pohybují okolo 12,5 g/1, přičemž při použití stejného kmene bez serA5 se dosáhne výtěžku 3,5 g/1.
Příklad 4
Produkce tryptofanu Corynebakteriemi
Plazmid pGH5 se rozštěpí pomocí restrikčních enzymů Sáli a HindlII (firmy Boehringer Mannheim GmbH) a z ,,low-melting“-agarózového gelu se izoluje 2 kb veliký, serA5-gen nesoucí fragment DNA. Fragment DNA se stejně, jako je popsáno v příkladě 2, zpracuje působením Klenow-fragmentu DNA-polymerázy I z E. coli (firmy Boehringer Mannheim GmbH) pro dosažení hladkého konce. Vektor pWSTl se rozštěpí pomocí restrikčního enzymu Smál (firmy Boehringer) a liguje se fragmentem DNA s hladkým koncem. Vektor pWSTl je univerzální vektor pro E. coli/corynebacterium a může se replikovat jak v Corynebakteriích, tak v E. coli. Corynebakteriální replikou tohoto vektoru pochází z kmene Corynebacterium glutamicum ATCC 19 223. Výroba vektoru pWSTl je popsána v USA 4 965 197. Ligační vsázka se využije k tomu, aby se transformoval kmen E. coli PC 1523. Komplementující plazmid byl nazván pGH5/HI (obr. 12).
Plazmid pGH5/III se využije k tomu, aby se transformoval tryptofan-produkující kmen Corynebakterium glutamicum ATCC 21 851. Transformace se provádí přes elektroporaci pomocí techniky, vyčerpávajícím způsobem popsané H. Wolfem a kol., 1989, Appl. Microbiol. Biotechnol. 30: 283 - 289. Klony, které nesou rekombinantní plazmid pGH5/III, se selektují přes plazmid-kódovanou kanamvcinovou rezistenci na agarových plotnách s 25 mg/1 kanamycinu.
Plazmid pGC3 se rozštěpí pomocí restrikčních enzymů Sphl a Sall. 3 kb fragment DNA, který· nese divoký typ serA-alely, se přečistí a výše popsaným způsobem se liguje do vektoru pWSTl. Získaný vektor pGC3 (obr. 13) se využije k transformaci Corynebakterium glutamicum ATCC 21 851.
Analogicky se vyrobí kmen Corynebakterium glutamicum ATCC 21 581, který nese na plazmidu serA-alelu 1455.
- 12CZ 282396 B6
Při fermentaci se ukázalo, že kmen, který nese na plazmidu serA5-alelu, dosahuje nejvyšších výtěžků tryptofanu.
Příklad 5
Vliv různých plazmidem kódovaných serA-alel na produkci tryptofanu u různých trpE-kmenů
Různými, v tabulce 3 uvedenými, produkčními kmeny tryptofanu, se v 10 ml Erlenmeyerových baňkách zaočkuje 10 ml LB média (1 % tryptonu, 0,5 % kvasničného extraktu, 0,5 % chloridu sodného), které bylo smíšeno s 15 mg/1 tetracyklinu. Po 8 až 9 hodinové inkubaci za třepání při 150 otáčkách za minutu při teplotě 30 °C se odpovídající předkultury převedou do 100 ml SM1média. SMl-médium obsahuje 5 g/1 glukózy, 3 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 12 g/1 hydrogenfosforečnanu draselného, 0,1 g/1 síranu amonného, 0,3 g/1 heptahydrátu síranu hořečnatého, 15 mg/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 2 mg/1 heptahydrátu síranu železnatého, 1 g/1 dihydrátu citrátu trojsodného, 1 ml/1 roztoku stopových prvků (viz níže), 40 mg/1 Lfenylalaninu, 40 mg/1 L-tyrosinu, 5 mg/1 vitaminu B1 a 15 mg/1 teracyklinu. Roztok stopových prvků sestává z 0,15 g/1 dihydrátu molybdenanu sodného, 2,5 g/1 kyseliny borité, 0,7 g/1 hexahydrátu chloridu kobaltnatého, 0,25 g/l pentahydrátu síranu měďnatého, 1,6 g/1 tetrahydrátu chloridu manganatého a 0,3 g/1 heptahydrátu síranu zinečnatého.
Kultury se třepou v jednotlivých Erlenmeyerových baňkách při teplotě 30 °C po dobu 12 až 16 hodin při 150 otáčkách za minutu. Po této inkubaci je hodnota OD6oo v rozmezí 2 až 4. Další fermentace se provádí ve výzkumných fermentorech BIOSTATRM firmy Braun Melsungen. Používá se kultivační nádoba s celkovým objemem 2 litry.
Médium obsahuje 17,5 g/1 glukózy, 5 g/1 síranu amonného, 0,5 g/1 chloridu sodného, 0,3 g/1 heptahydrátu síranu hořečnatého, 15 mg/1 dihydrátu chloridu vápenatého, 75 mg/1 heptahydrátu síranu železnatého, 1 g/1 dihydrátu citrátu trojsodného, 1,5 g/1 dihydrogenfosforečnanu draselného, 1 ml roztoku stopových prvků (viz výše), 5 mg/1 vitaminu B1 (thiamin), 0,75 g/1 Lfenylalaninu, 0,75 g/1 L-tyrosinu, 2,5 g/1 kvasničného extraktu (Difco), 2,5 g/1 tryptonu (difco) a 20 mg/1 tetracyklinu.
Koncentrace glukózy se ve fermentoru udržuje dávkováním 700 g/1 (w/v) glukózového roztoku (autoklávovaného) na 17,5 g/l. Před zaočkováním se do fermentačního média přidá tetracyklin až na konečnou koncentraci 20 mg/1. Dále se udržuje hodnota pH přiváděním 25 % roztoku hydroxidu amonného na 6,7.
100 ml předkultury se pro zaočkování přečerpá do fermentační nádoby. Výchozí objem činí asi 1 litr. Kultury se nejprve míchají při 400 otáčkách za minutu a vzdušní se 1,5 wm stlačeného vzduchu, zbaveného zárodků pomocí sterilního filtru. Fermentace se provádí při teplotě 30 °C.
Hodnota pH se udržuje automatickým dávkováním 25 % hydroxidu amonného na 6.7. Sycení kyslíkem ve fermentačním médiu se v žádném okamžiku fermentace nenechá poklesnout pod 20 %. Sycení kyslíkem se při fermentaci udržuje pomocí rychlosti míchání.
Ve dvouhodinových až tříhodinových periodách se zjišťuje obsah glukózy v živém roztoku, optická hustota a výtěžek tryptofanu. Stanovení glukózy se provádí enzymaticky pomocí glukózového analyzátoru firmy Ysi. Koncentrace glukózy se nastavuje kontinuálním živením v rozmezí 5 až 20 g/1.
Obsah tryptofanu v médiu po fermentaci se stanovuje pomocí HPLC. Médium se rozděluje na Nucleosilu 100-7/C8 (250/4 mm; Macherey-Nagel). Sloupec se provozuje izokraticky s hodnotou toku 2 ml/min. Jako pohyblivá fáze se používá směs vody a acetonitrilu (83/17), do
- 13 CZ 282396 B6 které se přidává pro litr 0,1 ml kyseliny fosforečné (85 %). Detekuje se buď pomocí diodového arraydetektoru, nebo při pevné vlnové délce 215, popřípadě 275 nm.
Po 44 až 50 hodinách se fermentace ukončí. Produkovaná množství tryptofanu v g/1 z těchto fermentací po 48 hodinách jsou shrnuta v tabulce 3.
Tabulka 3
Výtěžky tryptofanu s různými kombinacemi serA/trpE
serAWT serA5 serA1508 ser AI l serA1455
trpEO 15,7 20,2 nestanov. Nestanov. 6,7
trpE5 12,5 18,9 15,0 10,0 7,5
trpE8 11,6 24,1 13,8 24,0 4,0
trpE6 7,5 18,0 nestanov. 11,5 3,9
Sekvenční protokol:
(1) Všeobecné informace:
(i) Přihlašovatel:
(A) Jméno: Consorcium fur elektrochemische
Industrie GmbH (B) Ulice: Zielstattstr. 20 (C) Místo: Mnichov (E) Stát: Německo (F) PSČ: 81379 (G) Telefon: 089-62792686 (H) Telefax: 089-62792795 (ii) Název vynálezu: Mikroorganismy pro produkci tryptofanu a způsob jejich výroby (iii) Počet sekvencí: 14 (iv) Počítačově čitelná forma:
(A) Nosič dat: Floppy disk (B) Computer: IBM PC kompatibilní (C) Pracovní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1.25 (EPA) (2) Informace k SEQ ID NO: 1:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 52 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý· (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein
- 14CZ 282396 B6 (iii) Hypoteticky: ano (v) Druh fragmentu: C-terminus (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: B (vii) Bezprostřední původ:
(B) Klon: pGC3 (xi) Popis sekvence: SEQIDNO: 1:
Ala Glu Gin Gly Val Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gin Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu Ala Asp Glu Asp
20 25 30
Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala Ile Pro Gly Thr
35 40 45
Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr
50
(2) Informace k SEQ ID NO: 2:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 51 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky': ano (v) druh fragmentu: C-terminus (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherihia coli (B) Kmen: B (vii) Bezprostřední původ:
(B) Klon: pGH5 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 2:
- 15 CZ 282396 B6
Ala Glu Gin Gly Val Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gin Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu Ala Asp Glu Asp
20 25 30
Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala Ile Pro Gly Thr
35 40 45
Ile Arg Ala Arg Leu Leu
(2) Informace k SEQ ID NO: 3:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 56 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano (v) druh fragmentu: C-terminus (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: B (vii) Bezprostřední původ:
(B) Klon: pKB 1508 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 3:
Ala Glu Gin Gly Val Cys Ser Arg Ala Asn Ile Ala Ala Gin Tyr
1 5 10 15
Leu Gin Thr Ser Ala Gin Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu
20 25 30
Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala
35 40 45
Ile Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu Leu Tyr
50 55
(2) Informace k SEQ ID NO: 4:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 55 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano
- 16CZ 282396 B6 (v) druh fragmentu: C-terminus (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: B (vii) Bezprostřední původ:
(B) Klon: pGHll o
(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 4:
Ala Glu Gin Glv Val Cys Ser Arg Ala Asn Ile Ala Ala Gin Tyr
15 1 5 10 15
Leu Gin Thr Ser Ala Gin Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu
20 25 30
Ala Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala
20 Ile 35 Pro Gly Thr Ile Arg Ala Arg Leu 50 40 Leu 55 45
(2) Informace k SEQ ID NO: 5:
25 (i) Charakteristika sekvence:
30 (ii) (A) Délka: 47 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární Druh molekuly: protein
(iii) Hypoteticky: ano
35 (V) druh fragmentu: C-terminus
(vi) Původ:
40 (vii) (A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: B Bezprostřední původ:
45 (xi) (B) Klon: pKB1455 Popis sekvence: SEQ ID NO: 5:
Ala Glu Gin Gly Val Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser
1 5 10 15
Ala Gin Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu Ala Asp Glu Asp
50 20 25 30
Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala Ile Pro Gly Thr
35 40 45
Ile Arg
- 17CZ 282396 B6 (2) Informace k SEQ ID NO: 6:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano (v) druh fragmentu: inertní (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: YMC9 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 6:
Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp Leu
20 25 30
Lys Ser
(2) Informace k SEQ ID NO: 7:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano (iii) Antisenze: ne (v) druh fragmentu: inertní (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: PD103 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 7:
- 18CZ 282396 B6
Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Glu S
20 25 30
Glu Ser
(2) Informace k SEQ ID NO: 8:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano (v) druh fragmentu: inertní (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: KB862 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 8:
Asn Ser Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp Leu
20 25 30
Lys Ser (2) Informace k SEQ ID NO: 9:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano (v) druh fragmentu: inertní (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: SVÍ63 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 9:
-19CZ 282396 B6
Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Glu Phe Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp Leu
20 25 30
Glu Ser (2) Informace k SEQ ID NO: 10:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 32 aminokyselin (B) Druh: aminokyseliny (C) Forma řetězce: jednotlivý (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: protein (iii) Hypoteticky: ano (v) druh fragmentu: inertní (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: SVÍ64 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:
Asn Ser Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala
1 5 10 15
Thr Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp Leu
20 25 30
Glu Ser
(2) Informac e k SEQ ID NO: 11:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 32 párů bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Forma řetězce: obojí (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisenze: ne (v i) Původ:
(A) Organismus: in vitro syntetizovaný fragment DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:
-20CZ 282396 B6
AGCTTATTAC AGCAGACGGG CGCGAATGGA TC (2) Informace k SEQ ID NO: 12:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 12 párů bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Forma řetězce: dvojitá (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisenze: ne (vi) Původ:
(A) Organismus: in vitro syntetizovaný fragment DNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:
TGCTCTAGAG CA (2) Informace k SEQ ID NO: 13:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 1233 párů bází (B) Druh: nukleová kyselina (C) Forma řetězce: dvojitá (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekuly: DNA (genomická) (iii) Hypoteticky: ne (iii) Antisenze: ne (vi) Původ:
(A) Organismus: Escherichia coli (B) Kmen: B (x) Informace o zveřejnění:
(A) Autoři: Tobey K. 1.
Grant G. A.
(B) Titul: The nucleotide sequence of the serA gene of Escherichia coli and the amino acid sequence of the encoded protein, d-3-phosphoglycerate.
(C) Časopis: J. Biol. Chem.
(D) Díl: 261 (E) Strana: 12179-12183 (G) Datum: 1986
-21 CZ 282396 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:
ATG 48 Met 1 GCA AAG GTA TCG CTG GAG AAA GAC AAG AAT AAG TTT CGT CGT
Ala Lys Val Ser 5 Leu Glu Lys Asp Lys 10 Ile Lys Phe Leu Leu 15
GTA GAA 96 GGC GTG CAC CAA AAG GCG CTG GAA AGC CTT CGT GCA GCT
Val Glu Gly Val His 20 Gin Lys Ala Leu Glu 25 Ser Leu Arg Ala Ala 30
GGT TAC ACC 144 AAC ATC GAA TTT CAC AAA GGC GCG CTG GST GAT GAA
Gly Tyr Thr Asn Ile 35 Glu Phe His Lys Gly 40 Ala Leu Asp Asp Glu 45
CAA TAA AAA GAA TCC 192 ATC CGC GAT GCC CAC TTC ATC GGC CTG CGA
Gin Leu Lys Glu Ser 50 Ile Arg Asp Ala His 55 Phe Ile Gly Leu Arg 60
TCC CGT ACC CAT CTG 240 ACT GAA GAC GTG ATC AAC GCC GCA GAA AAA
Ser Arg Thr His Leu 65 Thr Glu Asp Val Zle 70 Asn Ala Ala Glu Lys 75
CTG GTC GCT ATT GGC TGT 288 TTC TGT ATC C-GA ACA AAC CAG GTT GAT
Leu Val Ala Ile Gly 80 Cys Phe Cys Ile C-ly 3 5 Thr Asn Gin Val Asp 90
CTG GAT GCG GCG GCA AAG CGC 336 GGG ATC CCG GTA TTT AAC GCA CCG
Leu Asp Ala Ala Ala 95 Lys Arg Gly Ile Pro 100 V a 1 Phe Asn Ala Pro 105
TTC TCA AAT ACC- CGC TCT GTT GCG 384 GAG CTG GTG ATA GGC GAA CTG
Phe Ser Asn Thr Arg 110 Ser Val Ala Glu Leu 115 Val Ile Gly Glu Leu 120
CTG CTG CTA TTG CGC GGC GGT CCG GAA GCC 432 AAT GCT AAA GCG CAC
Leu Leu Leu Leu Arg 125 Gly Val Pro Glu Ala 130 Asn Ala Lys Ala His 135
CGT GGC GTG TGC- AAC AAA CTG GCG GCG GGT 480 TCT TTT GAA GCG CGC
Arg Gly Val Trp Asn 140 Lys Leu Ala Ala C-ly 145 Ser Phe Glu Ala Arg 150
GGC AAA AAG CTG GGT ATC ATC GGC TAC GGT CAT 528 AAT GGT ACG CAA
Gly Lys Lys Leu Gly 155 Ile Ile Gly Tyr Gly 160 His Ile Gly Thr Gin 165
TTG GGC ATT CTC- GCT GAA TCG CTG GGA ATG TAT GTT 576 TAC TTT TAT
Leu Gly Ile Leu Ala 170 Glu Ser Leu Gly Met 175 Tyr Val Tyr Phe Tyr 180
GAT ATT GAA AAT AAA CTG CCG CTG GGC AAC GCC ACT CAG 624 GTA CAG
Asp Ile Glu Asn Lys 185 Leu Pro Leu Gly Asn 190 Ala Thr Gin Val Gin 195
CAT CTT TCT GAC CTG CTG AAT ATG AGC GAT GTG GTG ; AGT CTG 672 ; cat
-22CZ 282396 B6
His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser Leu His
200 205 210
GTA CCA GAG AAT CCG TCC ACC AAA AAT ATG ATG GGC GCG AAA GAA
720
Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys Glu
215 220 225
ATT TCA CTA ATG AAG CCC GGC TCG CTG CTG ATT AAT GCT TCG CGC
Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
230 235 240
GGT ACT GTG GTG GAT ATT CCG GCG CTG TGT GAT GCG CTG GCG AGC
768
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser
245 250 255
AAA CAT CTG GCG GGG GCG GCA ATC GAC GTA TTC CCG ACG GAA CCG
816
Lys His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro
260 265 270
GCG ACC AAT AGO GAT CCA TTT ACC TCT CCG CTG TGT GAA TTC GAC
864
Asp Thr Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp
275 280 285
AAC GTC CTT CTG ACG CCA CAC ATT GGC GGT TCG ACT CAG GAA GCG
912
Asn Val Leu Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gin Glu Ala
290 295 300
CAG GAG AAT ATC GGC CTG GAA GTT GCG GGT AAA TTG ATC AAG TAT
960
Gin Glu Asn Ile Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr
305 310 315
TCT GAC AAT GGC TCA ACG CTC TCT GCG GTG AAC TTC CCG GAA GTC
1008
Ser Asp Asn Gly Ser 320 Thr Leu Ser Ala Val 325 Asn Phe Pro Glu Val 330
TCG CTG CCA CTG CAC GGT GGG 1056 CGT CGT CTG ATG CAC ATC CAC GAA
Ser Leu Pro Leu His 335 Gly Gly Arg Arg Leu 340 Met His Ile His Glu 345
AAC CGT CCG GGC GTG CTA ACT GCG CTG AAC AAA ATC TTC GCC GAG
1104
Asn Arg Pro Gly Val 350 Leu Thr Ala Leu Asn 355 Lys Ile Phe Ala Glu 360
CAG GGC GTC AAC ATC GCC GCG CAA TAT 1152 CTG CAA ACT TCC GCC CAG
Gin Gly Val Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser Ala Gin
365 370 375
ATG GGT TAT GTG GTT ATT GAT ATT GAA GCC GAC GAA GAC GTT GCC
1200
Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu Ala Asp Glu Asp Val Ala
380 385 390
GAA AAA GCG CTG CAG GCA ATG AAA GCT ATT CCG 1233 GGT ACC ATT CGC
Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arg
395 400 405
GCC CGT CTG CTG TAC TA
Ala Arg Leu Leu Tyr
410
-23 CZ 282396 B6 (2) Informace k SEQ ID NO: 14:
(i) Charakteristika sekvence:
(A) Délka: 410 aminokyselin (B) Druh: Aminokyselina (D) Topologie: Lineární (ii) Druh molekuly: Protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 14:
Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asp Lys Ile Lys Phe Leu Leu
1 5 10 15
Val Glu Gly Val His Gin Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arg Ala Ala
20 25 30
Gly Tyr Thr Asn Ile Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asp Glu
35 40 45
Gin Leu Lys Glu Ser Ile Arg Asp Ala His Phe Ile Gly Leu Arg
50 55 60
Ser Arg Thr His Leu Thr Glu Asp Val Ile Asn Ala Ala Glu Lys
65 70 75
Leu Val Ala Ile Gly Cys Phe Cys Ile Gly Thr Asn Gin Val Asp
80 85 90
Leu Asp Ala Ala Ala Lys Arg Gly Ile Pro Val Phe Asn Ala Pro
95 100 105
Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val Ala Glu Leu Val Ile Gly Glu Leu
110 115 120
Leu Leu Leu Leu Arg Gly Val Pro Glu Ala Asn Ala Lys Ala His
125 130 135
Arg Gly Val Trp Asn Lys Leu Ala Ala Gly Ser Phe Glu Ala Arg
140 145 150
Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly His Ile Gly Thr Gin
155 160 165
Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr Val Tyr Phe Tyr
170 175 180
Asp Ile Glu Asn Lys Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr Gin Val Gin
185 190 195
His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Val Val Ser Leu His
200 205 210
Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys Glu
215 220 225
Ile Ser Leu Met Lys Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg
230 235 240
Gly Thr Val Val Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser
245 250 255
Lys His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Val Phe Pro Thr Glu Pro
260 265 270
Ala Thr Asn Ser As o Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp
27 5 280 285
Asn Val Leu Leu Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gin Glu Ala
290 295 300
Gin Glu Asn Ile Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr
305 310 315
Ser Asp Asn Gly Ser Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu . Val
320 325 330
-24CZ 282396 B6
Ser Leu Pro Leu His 335 Gly Gly Arg Arg Leu 340 Met His Ile His Glu 345
Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu
350 355 360
Gin Gly Val Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser Ala Gin
365 370 375
Met Gly Tyr Val Val Ile Asp Ile Glu Ala Asp Glu Asp Val Ala
380 385 390
Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arg
395 400 405
Ala Arg Leu Leu Tyr
410

Claims (2)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Způsob výroby mikroorganismů, produkujících tryptofan, vyznačující se tím, že se mikroorganismy, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntézy tryptofanu, opatří serA-alelou, která má sníženou citlivost vůči inhibici serinem, přičemž mikroorganismy, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntézy tryptofanu, se podrobí mutagenezi a mutagenem zpracované populace organismů se podrobí selekci na klony se serA-geny, které kódují pro serin necitlivé fosforglvcerátdehydrogenázy, nebo ser-alely. které kódují pro serin necitlivé fosforglycerátdehydrogenázy, se vyrobí technikami genového inženýrství, výhodně technikami místně směrované mutageneze, a takovéto alely se vnesou do mikroorganismů, které jsou deregulovány v alespoň jednom kroku biosyntézy tryptofanu, tak že se integrované vyskytují buď na autonomně replikovatelném rekombinantním vektoru, nebo v chromozomu kmene.
  2. 2. Použití mikroorganismů, vyrobených způsobem nároku 1, pro fermentativní produkci tryptofanu.
CZ95667A 1992-09-28 1993-09-23 Způsob výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití CZ282396B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE4232468A DE4232468A1 (de) 1992-09-28 1992-09-28 Mikroorganismen für die Produktion von Tryptophan und Verfahren zu ihrer Herstellung
PCT/EP1993/002588 WO1994008031A1 (de) 1992-09-28 1993-09-23 Mikroorganismen für die produktion von tryptophan und verfahren zu ihrer herstellung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ66795A3 CZ66795A3 (en) 1997-03-12
CZ282396B6 true CZ282396B6 (cs) 1997-07-16

Family

ID=6469024

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ95667A CZ282396B6 (cs) 1992-09-28 1993-09-23 Způsob výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití

Country Status (18)

Country Link
US (1) US6180373B1 (cs)
EP (1) EP0662143B1 (cs)
JP (1) JP3032013B2 (cs)
KR (1) KR950703653A (cs)
CN (1) CN1065909C (cs)
AU (1) AU673374B2 (cs)
BR (1) BR9307125A (cs)
CA (1) CA2145630C (cs)
CZ (1) CZ282396B6 (cs)
DE (2) DE4232468A1 (cs)
ES (1) ES2089846T3 (cs)
FI (1) FI106727B (cs)
HU (1) HU218139B (cs)
RU (1) RU2111247C1 (cs)
SK (1) SK279854B6 (cs)
TW (1) TW241303B (cs)
UA (1) UA32566C2 (cs)
WO (1) WO1994008031A1 (cs)

Families Citing this family (103)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6329574B1 (en) 1990-01-22 2001-12-11 Dekalb Genetics Corporation High lysine fertile transgenic corn plants
CA2074355C (en) 1990-01-22 2008-10-28 Ronald C. Lundquist Method of producing fertile transgenic corn plants
US6118047A (en) 1993-08-25 2000-09-12 Dekalb Genetic Corporation Anthranilate synthase gene and method of use thereof for conferring tryptophan overproduction
US6326527B1 (en) 1993-08-25 2001-12-04 Dekalb Genetics Corporation Method for altering the nutritional content of plant seed
GB2304718B (en) * 1995-09-05 2000-01-19 Degussa The production of tryptophan by the bacterium escherichia coli
JP3997631B2 (ja) * 1998-01-12 2007-10-24 味の素株式会社 発酵法によるｌ−セリンの製造法
RU2206612C2 (ru) * 1999-11-03 2003-06-20 Закрытое акционерное общество Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" Способ получения шикимовой кислоты (варианты), штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент шикимовой кислоты (варианты)
JP2002209596A (ja) * 2001-01-19 2002-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
US7160711B2 (en) * 2001-08-06 2007-01-09 Degussa Ag Coryneform bacteria which produce chemical compounds I
EP1449918B1 (en) 2001-11-23 2010-06-09 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acid using escherichia
DE10231297A1 (de) * 2002-07-10 2004-02-05 Forschungszentrum Jülich GmbH Nukleotidsequenzen coryneformer Bakterien codierend für an der Biosynthese von L-Serin beteiligte Proteine sowie Verfahren zur Herstellung von L-Serin
RU2273666C2 (ru) * 2003-02-26 2006-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" Способ получения l-аминокислот методом ферментации смеси глюкозы и пентоз
RU2268300C2 (ru) 2003-04-07 2006-01-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНА pckA
DE10331291A1 (de) 2003-07-10 2005-02-17 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH Varianten der 3-Phosphoglyceratdehydrogenase mit reduzierter Hemmung durch L-Serin und dafür codierende Gene
RU2275425C2 (ru) * 2003-11-03 2006-04-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Бактерия, принадлежащая к роду escherichia, - продуцент l-цистеина и способ получения l-цистеина
RU2288268C2 (ru) * 2005-01-26 2006-11-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) 6-фосфоглюконолактоназа из escherichia coli, фрагмент днк, бактерия, принадлежащая к роду escherichia - продуцент l-аминокислоты и способ получения l-аминокислоты
US7300776B2 (en) * 2004-04-26 2007-11-27 Ajinomoto Co., Inc. L-amino acid-producing bacterium and a method for producing L-amino acid
RU2004137198A (ru) 2004-12-21 2006-06-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН yafA
DE102005013676A1 (de) 2005-03-24 2006-09-28 Degussa Ag Allele des zwf-Gens aus coryneformen Bakterien
JP2009118740A (ja) 2006-03-03 2009-06-04 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2351830B1 (en) 2006-03-23 2014-04-23 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing an L-amino acid using bacterium of the Enterobacteriaceae family with attenuated expression of a gene coding for small RNA
EP2007873B1 (en) 2006-04-18 2015-11-18 Ajinomoto Co., Inc. A METHOD FOR PRODUCING AN L-AMINO ACID USING A BACTERIUM OF THE ENTEROBACTERIACEAE FAMILY WITH ATTENUATED EXPRESSION OF THE sfmACDFH-fimZ CLUSTER OR THE fimZ GENE
JP2009165355A (ja) 2006-04-28 2009-07-30 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸を生産する微生物及びｌ−アミノ酸の製造法
RU2006129690A (ru) 2006-08-16 2008-02-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА ydiN, ГЕНА ydiB ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010017081A (ja) * 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010017082A (ja) 2006-10-10 2010-01-28 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2006143864A (ru) 2006-12-12 2008-06-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ cynT, cynS, cynX, ИЛИ cynR, ИЛИ ИХ КОМБИНАЦИИ
JP2010041920A (ja) 2006-12-19 2010-02-25 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN101627110B (zh) 2007-01-22 2014-08-13 味之素株式会社 生产l-氨基酸的微生物和l-氨基酸的生产方法
JP2010088301A (ja) 2007-02-01 2010-04-22 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
JP2010110216A (ja) 2007-02-20 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸または核酸の製造方法
JP2010110217A (ja) 2007-02-22 2010-05-20 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造法
DE102007051024A1 (de) 2007-03-05 2008-09-11 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP1975241A1 (de) 2007-03-29 2008-10-01 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
WO2008128076A1 (en) * 2007-04-13 2008-10-23 Monsanto Technology Llc Use of glyphosate to produce shikimic acid in microorganisms
RU2355759C1 (ru) * 2007-08-14 2009-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АРОМАТИЧЕСКОЙ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ГЕН ydiB, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СЛОЖНОГО ЭФИРА НИЗШИХ АЛКИЛОВ АЛЬФА-L-АСПАРТИЛ-L-ФЕНИЛАЛАНИНА
EP2192170B1 (en) 2007-09-04 2017-02-15 Ajinomoto Co., Inc. Amino acid-producing microorganism and method of producing amino acid
DE102007044134A1 (de) 2007-09-15 2009-03-19 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
RU2396336C2 (ru) 2007-09-27 2010-08-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ, ПРИНАДЛЕЖАЩЕЙ К РОДУ Escherichia
DE102007052270A1 (de) 2007-11-02 2009-05-07 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
EP2060636A1 (de) 2007-11-14 2009-05-20 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
JP2011067095A (ja) 2008-01-10 2011-04-07 Ajinomoto Co Inc 発酵法による目的物質の製造法
BRPI0906795A2 (pt) 2008-01-23 2015-08-18 Ajinomoto Kk Método para produzir um l-aminoácido
RU2008105793A (ru) 2008-02-19 2009-08-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ конструирования оперонов, содержащих трансляционно сопряженные гены, бактерия, содержащая такой оперон, способ продукции полезного метаболита и способ мониторинга экспрессии гена
WO2009104731A1 (ja) 2008-02-21 2009-08-27 味の素株式会社 Ｌ－システイン生産菌及びｌ－システインの製造法
DE102008002309A1 (de) 2008-06-09 2009-12-10 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008040352A1 (de) 2008-07-11 2010-01-14 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von L-Tryptophan unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
DE102008044768A1 (de) 2008-08-28 2010-03-04 Evonik Degussa Gmbh Verfahren zur Herstellung von organisch-chemischen Verbindungen unter Verwendung von verbesserten Stämmen der Familie Enterobacteriaceae
KR101627095B1 (ko) 2008-09-08 2016-06-03 아지노모토 가부시키가이샤 Ｌ-아미노산을 생산하는 미생물 및 ｌ-아미노산의 제조법
EP2382320B1 (en) 2009-01-23 2018-04-18 Ajinomoto Co., Inc. Process for producing l-amino acids employing bacteria of the enterobacteriacea family in a culture medium with controlled glycerol concentration
JP5359409B2 (ja) 2009-03-12 2013-12-04 味の素株式会社 Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
EP2460883A4 (en) 2009-07-29 2013-01-16 Ajinomoto Kk PROCESS FOR THE PREPARATION OF L-AMINO ACID
JP2012223092A (ja) 2009-08-28 2012-11-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
RU2009136544A (ru) 2009-10-05 2011-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) (RU) Способ получения l-цистеина с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae
JP2013013329A (ja) 2009-11-06 2013-01-24 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
EP2508594B1 (en) 2009-11-30 2017-08-16 Ajinomoto Co., Inc. L-cysteine-producing bacterium, and process for production of l-cysteine
RU2460793C2 (ru) 2010-01-15 2012-09-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Способ получения l-аминокислот с использованием бактерий семейства enterobacteriaceae
JP2013074795A (ja) 2010-02-08 2013-04-25 Ajinomoto Co Inc 変異型ｒｐｓＡ遺伝子及びＬ−アミノ酸の製造法
RU2471868C2 (ru) 2010-02-18 2013-01-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) Мутантная аденилатциклаза, днк, кодирующая ее, бактерия семейства enterobacteriaceae, содержащая указанную днк, и способ получения l-аминокислот
RU2482188C2 (ru) 2010-07-21 2013-05-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АРГИНИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИЙ РОДА Escherichia, В КОТОРОЙ ИНАКТИВИРОВАН ОПЕРОН astCADBE
RU2501858C2 (ru) 2010-07-21 2013-12-20 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт "Аджиномото-Генетика" (ЗАО АГРИ) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae
CN103119154B (zh) 2010-09-14 2015-11-25 味之素株式会社 含硫氨基酸生产菌以及含硫氨基酸的制造方法
CN101985638B (zh) * 2010-12-01 2013-04-17 厦门大学 前体流加发酵生产l-色氨酸的方法
JP2014036576A (ja) 2010-12-10 2014-02-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸の製造法
CN102140431B (zh) * 2010-12-21 2014-08-27 大成生化科技(松原)有限公司 L-色氨酸基因工程菌,其构建方法以及使用其发酵生产l-色氨酸的方法
JP2014087259A (ja) 2011-02-22 2014-05-15 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システイン生産菌及びｌ−システインの製造法
WO2012137689A1 (ja) 2011-04-01 2012-10-11 味の素株式会社 Ｌ－システインの製造法
JP2014131487A (ja) 2011-04-18 2014-07-17 Ajinomoto Co Inc Ｌ−システインの製造法
RU2011134436A (ru) 2011-08-18 2013-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") Способ получения l-аминокислоты с использованием бактерии семейства enterobacteriaceae, обладающей повышенной экспрессией генов каскада образования флагелл и клеточной подвижности
CN102433312A (zh) * 2011-11-30 2012-05-02 天津科技大学 一种d-3-磷酸甘油酸脱氢酶及其编码基因及构建方法
CN102453691B (zh) * 2011-12-02 2013-09-18 山东鲁抗生物制造有限公司 高产l-色氨酸的大肠杆菌工程菌
CA2860974C (en) * 2012-01-10 2019-03-05 Cj Cheiljedang Corporation A microorganism of the genus escherichia having enhanced l-tryptophan productivity and a method for producing l-tryptophan using the same
CN104220587A (zh) 2012-01-30 2014-12-17 麦兰特公司 从经基因改造的微生物生产黏康酸
EP2628792A1 (de) 2012-02-17 2013-08-21 Evonik Industries AG Zelle mit verringerter ppGppase-Aktivität
US20150037849A1 (en) 2012-02-29 2015-02-05 Danmarks Tekniske Universitet Microorganisms for the production of 5-hydroxytryptophan
US20150024440A1 (en) 2012-02-29 2015-01-22 Danmarks Tekniske Universitet Microorganisms for the production of melatonin
EP2762571A1 (de) 2013-01-30 2014-08-06 Evonik Industries AG Mikroorganismus und Verfahren zur fermentativen Herstellung von Aminosäuren
RU2013118637A (ru) 2013-04-23 2014-10-27 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, В КОТОРОЙ РАЗРЕГУЛИРОВАН ГЕН yjjK
CN105008532B (zh) 2013-05-13 2017-07-21 味之素株式会社 L‑氨基酸的制造方法
JP2016165225A (ja) 2013-07-09 2016-09-15 味の素株式会社 有用物質の製造方法
RU2013140115A (ru) 2013-08-30 2015-03-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ НАРУШЕНА ЭКСПРЕССИЯ КЛАСТЕРА ГЕНОВ znuACB
JP2016192903A (ja) 2013-09-17 2016-11-17 味の素株式会社 海藻由来バイオマスからのｌ−アミノ酸の製造方法
CN106459857B (zh) 2013-10-02 2019-04-19 味之素株式会社 氨控制装置及氨控制方法
RU2013144250A (ru) 2013-10-02 2015-04-10 Закрытое акционерное общество "Научно-исследовательский институт Аджиномото-Генетика" (ЗАО "АГРИ") СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА Enterobacteriaceae, В КОТОРОЙ ОСЛАБЛЕНА ЭКСПРЕССИЯ ГЕНА, КОДИРУЮЩЕГО ФОСФАТНЫЙ ТРАНСПОРТЕР
EP2886651B1 (en) 2013-10-21 2018-08-22 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acid
BR112016008830B1 (pt) 2013-10-23 2023-02-23 Ajinomoto Co., Inc Método para produzir uma substância alvo
RU2014105547A (ru) 2014-02-14 2015-08-20 Адзиномото Ко., Инк. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ L-АМИНОКИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БАКТЕРИИ СЕМЕЙСТВА ENTEROBACTERIACEAE, ИМЕЮЩЕЙ СВЕРХЭКСПРЕССИРУЕМЫЙ ГЕН yajL
RU2015120052A (ru) 2015-05-28 2016-12-20 Аджиномото Ко., Инк. Способ получения L-аминокислоты с использованием бактерии семейства Enterobacteriaceae, в которой ослаблена экспрессия гена gshA
WO2017136795A1 (en) * 2016-02-04 2017-08-10 Synlogic, Inc. Bacteria engineered to treat diseases associated with tryptophan metabolism
EP3420096A1 (en) 2016-02-25 2019-01-02 Ajinomoto Co., Inc. A method for producing l-amino acids using a bacterium of the family enterobacteriaceae overexpressing a gene encoding an iron exporter
KR20240005196A (ko) 2016-03-02 2024-01-11 피티티 글로벌 케미컬 퍼블릭 컴퍼니 리미티드 유전자 조작된 미생물로부터 개선된 뮤콘산 생산
JP7066977B2 (ja) 2017-04-03 2022-05-16 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造法
EP3385275B1 (de) 2017-04-07 2019-10-23 Evonik Degussa GmbH Verfahren zur herstellung von aromatischen l-aminosäuren unter verwendung von verbesserten stämmen der familie enterobacteriaceae
US10858676B2 (en) 2017-05-22 2020-12-08 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing objective substance
WO2019110101A1 (de) 2017-12-06 2019-06-13 Wacker Chemie Ag Mikroorganismen-stamm und verfahren zur fermentativen herstellung von methylanthranilat
US11053526B2 (en) 2018-08-09 2021-07-06 Evonik Operations Gmbh Process for preparing L amino acids using improved strains of the enterobacteriaceae family
JP7094494B2 (ja) * 2018-09-07 2022-07-04 味の素株式会社 キョウチクトウ科ニチニチソウ属の形質転換植物体
EP3861109A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing target substance by bacterial fermentation
WO2020171227A1 (en) 2019-02-22 2020-08-27 Ajinomoto Co., Inc. METHOD FOR PRODUCING L-AMINO ACIDS USING A BACTERIUM BELONGING TO THE FAMILY Enterobacteriaceae HAVING OVEREXPRESSED ydiJ GENE
JP7524909B2 (ja) 2019-04-05 2024-07-30 味の素株式会社 Ｌ－アミノ酸の製造方法
WO2021060438A1 (en) 2019-09-25 2021-04-01 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing l-amino acids by bacterial fermentation
CN111926002B (zh) * 2020-09-16 2021-01-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 TrpE的突变体及其在产L-色氨酸的基因工程菌中的应用
CN119012914A (zh) 2022-04-04 2024-11-22 味之素株式会社 防治寄生植物的方法

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3385762A (en) 1964-06-29 1968-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Process for the production of l-tryptophan by fermentation
FR2000641A1 (cs) 1968-01-24 1969-09-12 Kyowa Hakko Kogyo Kk
JPS5119037B2 (cs) 1972-11-16 1976-06-14
JPS575694A (en) 1980-06-10 1982-01-12 Showa Denko Kk Production of l-tryptophane
US4371614A (en) * 1980-08-22 1983-02-01 Ajinomoto Co., Inc. E.Coli bacteria carrying recombinant plasmids and their use in the fermentative production of L-tryptophan
JPS5780398A (en) 1980-11-05 1982-05-19 Sanraku Inc Plasmid produced by genetic manipulation, coliform bacillus having the same and preparation of tryptophan with said bacillus
SU990814A1 (ru) * 1981-08-12 1983-01-23 Всесоюзный Научно-Исследовательский Институт Генетики И Селекции Промышленных Микроорганизмов "Вниигенетика" Способ получени L-триптофана
JPS5889194A (ja) * 1981-11-24 1983-05-27 Ajinomoto Co Inc 微生物によるｌ−トリプトフアンの製造法
CA1226541A (en) 1984-01-13 1987-09-08 Stauffer Chemical Company Mutant strain deficient in l-serine deaminase activity
EP0232262A4 (en) * 1985-08-15 1989-09-19 Stauffer Chemical Co TRYPTOPHANE GENERATING MICROORGANISM.
EP0293207A3 (en) * 1987-05-29 1989-11-02 The Standard Oil Company Eschericia coli carrying recombinant plasmid for the production of tryptophan
US4965191A (en) 1988-02-12 1990-10-23 Eastman Kodak Company Lower alcohol sulfate wash solution, test kit and method for the determination of an immunological ligand
JP2656300B2 (ja) * 1988-04-18 1997-09-24 協和醗酵工業株式会社 Ｌ−トリプトファンの製造法
JP2967996B2 (ja) * 1989-06-06 1999-10-25 協和醗酵工業株式会社 Ｌ―トリプトファンの製造法
EP0488424B1 (en) 1990-11-30 1997-03-05 Ajinomoto Co., Inc. Recombinant DNA sequences encoding feedback inhibition released enzymes, plasmids comprising the recombinant DNA sequences, transformed microorganisms useful in the production of aromatic amino acids, and a process for preparing aromatic amino acids by fermentation
TW313589B (cs) * 1991-12-12 1997-08-21 Wacker Chemie Gmbh

Also Published As

Publication number Publication date
EP0662143B1 (de) 1996-06-19
CZ66795A3 (en) 1997-03-12
JP3032013B2 (ja) 2000-04-10
FI951439A0 (fi) 1995-03-27
DE4232468A1 (de) 1994-03-31
CA2145630A1 (en) 1994-04-14
AU4819093A (en) 1994-04-26
HU218139B (hu) 2000-06-28
US6180373B1 (en) 2001-01-30
CA2145630C (en) 2003-09-09
HUT72925A (en) 1996-06-28
FI106727B (fi) 2001-03-30
AU673374B2 (en) 1996-11-07
CN1085950A (zh) 1994-04-27
KR950703653A (ko) 1995-09-20
ES2089846T3 (es) 1996-10-01
SK34195A3 (en) 1996-05-08
HU9500884D0 (en) 1995-05-29
DE59303039D1 (de) 1996-07-25
FI951439L (fi) 1995-03-27
SK279854B6 (sk) 1999-04-13
WO1994008031A1 (de) 1994-04-14
JPH07507693A (ja) 1995-08-31
BR9307125A (pt) 1999-03-30
RU2111247C1 (ru) 1998-05-20
CN1065909C (zh) 2001-05-16
TW241303B (cs) 1995-02-21
UA32566C2 (uk) 2001-02-15
EP0662143A1 (de) 1995-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ282396B6 (cs) Způsob výroby mikroorganismů pro produkci tryptofanu a jejich použití
US4681852A (en) Novel microorganism and method
KR100275287B1 (ko) O-아세틸세린,l-시스테인및l-시스테인 유도생성물의 제조방법
CN1332021C (zh) 具有产生l－氨基酸能力的埃希氏菌属细菌以及生产l－氨基酸的方法
US5534421A (en) Production of isoleucine by escherichia coli having isoleucine auxotrophy and no negative feedback inhibition of isoleucine production
AU712821B2 (en) Production of tryptophan by the bacterium Escherichia coli
US7638312B2 (en) E.coli mutant containing mutant genes related with tryptophan biosynthesis and production method of tryptophan by using the same
US20030148474A1 (en) New mutant glutamine synthetase and method for producing amino acids
KR19990077974A (ko) Ｌ-글루타민산을생산하는박테리아및ｌ-글루타민산을생산하는방법
Gubler et al. Cloning of the pyruvate kinase gene (pyk) of Corynebacterium glutamicum and site-specific inactivation of pyk in a lysine-producing Corynebacterium lactofermentum strain
HUE032951T2 (en) Microorganism for production of L-amino acid and method for producing L-amino acid using microorganism
JP2001231584A (ja) 変異型ｉｌｖＨ遺伝子及びＬ−バリンの製造法
AU5777701A (en) Process for producing a target fermentation product
MXPA02001174A (es) Ingenieria metabolica de la produccion de aminoacidos.
CA2328598A1 (en) Microbial preparation of substances from aromatic metabolism/iii
EP1249494B1 (en) Process for the biological production of l-pipecolic acid
JP2001178481A (ja) コリネ型バクテリアを用いてｌ−リシンを発酵生産する方法
MXPA01013445A (es) Regulacion de la asimilacion de carbono.
RU2731289C2 (ru) Способ конструирования на основе бактерий рода Rhodococcus штамма-биокатализатора, обладающего нитрилазной активностью и повышенной операционной стабильностью, рекомбинантный штамм бактерий Rhodococcus rhodochrous, полученный таким способом, способ синтеза акриловой кислоты с использованием этого штамма в качестве биокатализатора
Fultz et al. Construction and characterization of Salmonella typhimurium strains that accumulate and excrete α-and β-isopropylmalate
KR0145011B1 (ko) L-아르기닌에 대해 감수성을 갖는 l-트립토판 생산균주
JPH11243976A (ja) 単細胞又は多細胞生物、トレオニンアルドラーゼ遺伝子、該遺伝子を含有する構造体、該遺伝子を含有するベクター、形質転換生物、リボフラビンの製法及び生物、遺伝子もしくはベクターの使用
Russ APPLIEI) Bl ()(3EISTRY ANI) MICR0B10100

Legal Events

Date Code Title Description
IF00 In force as of 2000-06-30 in czech republic
MK4A Patent expired

Effective date: 20130923