JP3032013B2 - トリプトファンを生産する微生物の菌株,その製造法およびトリプトファンの生産方法 - Google Patents
トリプトファンを生産する微生物の菌株,その製造法およびトリプトファンの生産方法Info
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Description
その製造法およびトリプトファンの生産方法に関する。
物において、簡単な生合成経路により進行されているこ
とは、公知である(Somerville,R.L.,Herrmann,K.M.,19
83,Aminoacids,Biosynthesis and Genetic Regulation,
Adelison−Wesley Publishing Company,USA:301〜322お
よび351〜378;Aida等,1986,Biotechnology of amino ac
id production,progress in industrial microbiology
第24巻,Elsevier Science Publishers,Amsterdam:188
〜206)。トリブトファン物質交換、そのセリン物質交
換との結合ならびに最も重要な酵素を暗号解読する遺伝
子は、図1に示されている。
ファンに感受性を有さないアントラニラートシンターゼ
をコードする突然変異されたtrpE遺伝子をtrpオペロン
の別の遺伝子と一緒に適当な複製可能の自律ベクター上
で発現させることに基づく。遺伝子のより高い複製数に
より、trp遺伝子の高められた発現および相応してトリ
プトファン物質交換の個々の酵素の高められた量が生じ
る。この結果、トリプトファンが過剰生産される。
れている:例えば、E.coliについては、欧州特許第0293
207号明細書、米国特許第4371614号明細書に記載されて
おり、バシラス(Bacillus)については、米国特許第45
88687号明細書に記載されており、コリネバクテリウム
(Corynebakterium)およびブレビバクテリウム(Brevi
bakterium)については、欧州特許第0338474号明細書に
記載されている。これらの方法の場合には、一連の問題
が処理の実施の点で発生する。不安定性およびベクター
の損失または生産菌株の遅延された成長が生じる。
Hakko Kogyo Co.)には、組換えプラスミドを含有する
コリネバクテリウム菌株またはブレビバクテリウム菌株
を用いてL−トリプトファンを生産する方法が記載され
ている。このプラスミドは、酵素DAHPシンターゼ、アン
トラニラートシンターゼ、インドール−3−グリセロー
ル−P−シンターゼ、トリプトファンシンターゼおよび
ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼの合成に対して遺
伝子情報を有する。耐フィードバック性アントラニラー
トシンターゼ−対立遺伝子が使用される。
トリプトファン物質交換と一緒に多数のserA、またはse
rA、B、C、野生型の遺伝子によって高めることは、公
知である。即ち、ケミカルアブストラクツCA 111(198
9)168688qおよびCA 111(1989)168689qには、トリプ
トファンの生産のためにserA−野生型−対立遺伝子もし
くはセリン物質交換の全ての野生型−遺伝子(serA、se
rBおよびserC)をプラスミド上で過剰発現させるバシル
ス菌株の使用が記載されている。
よって増大させることは、欧州特許出願公開第0149号明
細書(出願人:Stauffer Chemical Company)から公知で
ある。この欧州特許出願公開明細書には、E.coli−K12
−突然変異体が記載されており、この場合セリンを分解
する酵素セリンデアミナーゼ(sda)は、破壊されてい
る。また、この欧州特許出願公開明細書には、アミノ酸
の生産へのこのような菌株の使用が記載されている。実
施例VIIIには、アントラニラートからのトリプトファン
の過剰生産のためにこのような菌株を使用することが記
載されている。それと同時にこの欧州特許出願公開明細
書には、1つの菌株と完全なセリンデアミナーゼとの比
較で改善されたトリプトファンの収率により、トリプト
ファン前駆物質の貯蔵率が極めて高いような微生物の場
合には、セリンもしくはセリン生合成能力の割合がトリ
プトファンの生産に対して限定されていることが判明す
る。
微生物を提供し、かつこのような微生物の製造を可能に
する方法を提供することであった。
有しかつ少なくとも耐フィードバック性のserA−対立遺
伝子により脱調節されたセリン物質交換を有することを
特徴とする微生物の菌株によって解決される。
子は、serA遺伝子の突然変異体であり、この突然変異体
は、それぞれ微生物の相応する野生型のホスホグリセラ
ートデヒドロゲナーゼと比較して減少されたセリン選択
度を有するホスホグリセラートデヒドロゲナーゼをコー
ドする。
と脱調節されたトリプトファン物質交換を有する微生物
との本発明による組合せにより、トリプトファンの収率
は、意外なことに、とにかく同じ培養条件で耐フィード
バック性serA対立遺伝子なしに同じ微生物を用いて達成
することができる収率と比較して2.6倍だけ上昇され
た。
することは、予想できなかったことであり、かつ驚異的
なことである。それというのも、耐フィードバック牲se
rA対立遺伝子は、高い細胞内セリン濃度の場合にのみ効
果を示すからである(Tosa T,Pizer L.J.,1971,Journal
of Bacteriology 第106巻:972−982;Winicov J.,Pize
r L.J.,1974,Journal of Biological Chemistry 第249
巻:1348−1355)。しかし、公知技術(例えば、欧州特
許出願公開第0149539号明細書)の記載によれば、脱調
節されたトリプトファン物質交換を有する微生物は、低
いセリン濃度を有する。従って、本発明によれば、脱調
節されたトリプトファン物質交換を有する微生物中に耐
フィードバック牲serA対立遺伝子を導入することによっ
てトリプトファンの生産の増大を予想することはできな
い。
交換は図1に示した物質交換経路を経て進行し、本発明
による菌株の製造に使用すべき技術は公知でありかつ全
ての微生物に対して使用可能であるので、本発明による
菌株は、任意の微生物から製造可能である。
ある。特に好適なのは、グラム陰性細菌類、殊にE.coli
である。
をに出発菌株よりトリプトファン物質交換を全体的また
は部分的に破棄しかつこの菌株に耐フィードバック牲se
rA対立遺伝子を導入することによって得ることができ
る。
求性出発菌株の場合にトリプトファンを合成する能力を
再び回復させることにより得ることができ、この場合再
構築されたトリプトファン物質交換は、脱調節されてお
り、かつこのような菌株中に、耐フィードバック性のse
rA対立遺伝子がもたらされる。
知技術から公知である一連の種々の方法によって可能で
ある。
て、酵素アントラニラートシンターゼを変えることがで
きる。この酵素は、全ての微生物においてトリプトファ
ン特異的生合成経路の第1過程を触媒する。この酵素
は、活性の点でトリプトファンによって抑制され、した
がってトリプトファン量に依存してトリプトファン生合
成経路中の代謝産物流を調節する。この酵素は、遺伝子
trpEによりコードされる。相応する野生型アントラニラ
ートシンターゼと比較してトリプトファンに抗する減少
された感受性を有するアントラニラートシンターゼを暗
号解読する突然変異されたtrpE遺伝子(以下、耐フィー
ドバック性trpE対立遺伝子とも呼称される)は、トリプ
トファン原栄養出発菌株の突然変異誘発および引続く選
択によって得ることができる。そのために、該当する菌
株には、突然変異を誘発する処理を行なう(Miller J.
H.,1972,Experiments in Molecular Genetics,Cold Spr
ing Harbor Laboratory,USA:113−185)。
媒体は、少なくとも1つのトリプトファン拮抗体を、菌
株の成長を抑制するのに十分な量で含有する。適当なト
リプトファン拮抗体の例は、4−メチルトリプトファ
ン、5−メチルトリプトファン、6−メチルトリプトフ
ァン、ハロゲン化トリプトファン、トリプタザン、イン
ドール、インドールアクリル酸である。
プトファン感受性について試験される。アントラニラー
トシンターゼのトリプトファン感受性を測定するために
は、この酵素の活性をトリプトファンの存在下に測定す
ることができる全ての方法を利用することができる。例
えば、コリスミン酸塩は、適当な緩衝系中で反応成分グ
ルタミンと一緒に酵素触媒作用下に反応させることがで
きる(Bauerle R.等,1987,Methods in Enzymology 第1
42巻:366−386)。試験バッチ量から動的アリコートが
取り出され、反応生成物アントラニラートの1時間当た
りに生成された量は、HPLC分析によって測定された。こ
のアントラニラートの1時間当たりに生成された量は、
アントラニラートシンターゼの活性についての直接的な
尺度である。この試験は、試験されたアントラニラート
シンターゼの感受性を測定するためにトリプトファンの
存在下および不在下で実施される。
trpE対立遺伝子を直接的な遺伝子光学的操作によって発
生させることも可能である。(Bauerle R.等,1987,Meth
ods in Enzymology 第142巻:366−386)。これには、
種々の微生物のアントラニラートシンターゼのアミノ酸
配列中での数多くの突然変異が記載されており、この突
然変異によりトリプトファンに対する酵素の感受性は減
少される。(例えば、サルモネラ(Salmonella)につい
ては、Caliguiri MG.,Bauerle R.,1991,J.of Biol.Che
m.第266巻:8328−8335に記載されており;ブレビバクテ
リウム(Brevibakterium)、コリネバクテリウム(Cory
nebacterium)については、Matsui K.等,1987,J.Bact.
第169巻:5330−5332に記載されている)。
可能であるような方法は、公知である。このような方法
は、特に次の刊行物中に記載されている: サカル(Sakar G.)、ゾンメラウアー{Sommerauer S.
S.),1990,Bio Techniques 8:404−407には、ポリメラ
ーゼ鎖反応依存性の部位特異的突然変異誘発が記載され
ており; オースベル(Ausubel F.M.)等,1987,Current Protocol
s in Molecular Biology,Greene Publishing Associate
sには、M13ファージに依存する方法が記載されており; スミス(Smith M.),1985,Ann.Rev.Genet.19:423−462
には、別の方法が記載されている。
をベクター上に製造するための既に記載された標準法を
用いて組換えられる。部位特異的突然変異誘発のための
前記方法を使用することにより、DNS配列の1つまたは
それ以上のヌクレオチドは、今や遺伝子によって暗号解
読されたアミノ酸配列がトリプトファンに対して感受性
を有するアントラニラートシンターゼのアミノ酸配列に
相当するように変化される。記載された技術を用いて1
つの任意のtrpE遺伝子中に1つまたはそれ以上の突然変
異を導入することができ、この突然変異により、暗号解
読されたアントラニラートシンターゼはトリプトファン
に対する感受性を生じるアミノ酸配列を有することが惹
起される。
しも必要なものではない:欠陥トリプトファン抑制因子
−蛋白質、trp−オペロンの発現の欠陥アテニュエーシ
ョン調節、欠陥トリプトファナーゼ。この性質は、本発
明による菌株の場合に最も簡単には、既に相応する性質
の1つまたはそれ以上を有する出発菌株を選択すること
によって得ることができる。製造および選択は、次に記
載された選択方法の組合せによって行なうことができ
る。
生合成の上位の調節蛋白質である。この蛋白質は、主抑
制体としてのトリプトファンと一緒にtrp−オペロン−
遺伝子の発現を複製する(reprimieren)。蛋白質は、
遺伝子trpRによって暗号解読される。トリプトファン抑
制因子−突然変異体は、例えば5−メチルトリプトファ
ンのようなトリプトファン拮抗体に対して耐性を有する
突然変異体の下で選択することができる。例には、J.Mo
l.Biol.44,1969,185−193またはGenetics 52,1965,1303
−1316が記載されている。
−オペロンは、付加的にアテニュエーション調節に拠ら
ねばならない。trp−オペロンの第1の遺伝子の前方のD
NS領域は、調節にとって重要である。この領域内での突
然変異または欠失は、脱調節を生じうる。このような突
然変異体は、トリプトファン拮抗体、例えば5−メチル
トリプトファンに抗して耐性である突然変異体の下で選
択することができる。他面、このような突然変異、特に
欠失は、部位特異的突然変異誘発の方法によってこの変
化を部位特異的にDNSのアテニュエーション領域内で誘
発させることにより、得ることができる。部位特異的突
然変異誘発の既に記載された技術によって、失活された
アテニュエーション領域を天然のアテニュエーション領
域の位置で本発明による菌株の染色体中に組換えること
ができる。
ルバートおよびNH3ヘのトリプトファンの分解を触媒す
る。この酵素中で欠陥のある菌株は、微生物に突然変異
誘発処理を行ない、かつ突然変異体の中でトリプトファ
ンを炭素源および窒素源として利用する位置にもはやな
いものを捜すことにより得ることができる。1つの詳細
な例は、J.Bact.85,1965,680−685に記載されている。
また、同様に上記の技術を用いて部位特異的欠失を、失
活を生じるtnaA−遺伝子中に導入することも可能であ
る。
ン生産のさらなる増大を生じさせるのに適当である。即
ち、有利には、トリプトファン生合成経路とともに付加
的に芳香族アミノ酸の一般的な生合成経路(シキミ酸経
路)は調節に対して感受性を有する。従って、調節に対
して感受性を有するデヒドロアラビノヘプツロソン酸シ
ンターゼを有しかつ該シンターゼのチロシン抑制因子蛋
白質(tyrR)が突然変異または欠失によって失活されて
いる菌株は、本発明による菌株の製造のための出発菌株
として有利である。同様に、フェニルアラニンおよびチ
ロシン物質交換が妨害されている菌株は有利である。そ
れによって、トリプトファン中への前駆分子コリスミン
酸塩の専らの流れは保証される。このような菌株は、例
えば突然変異または欠失を遺伝子pheAおよび/またはty
rA中に有する。
酸経路で脱調節されておりかつトリプトファンを過剰生
産する一連の菌株は、公知である。例は、枯草菌(Baci
llus subtilis)のFermBP−4、FermP1483(ドイツ連邦
共和国特許第3123001号明細書)、ブレビバクテリウム
・フラブム(Brevibakterium flavum)のATCC 21427
(米国特許第3849251号明細書)、コリネバクテリウム
・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)のATCC
21842−21851(米国特許第3594279号明細書、米国特許
第3849251号明細書)、ミクロコッカス・ルテウス(Mic
rococcus luteus)のATCC 21102(米国特許第3385762号
明細書)、E.coliのATCC 31743(カナダ国特許第118240
9号明細書)である。これらの菌株は、同様に本発明に
よる菌株を製造するための出発菌株として適当である。
この出発菌株は、本発明によるトリプトファン生産菌株
を多種多様の微生物群で得ることができることを示す。
ともに、本発明による菌株を製造するために、相応する
野生型のホスホグリセラートデヒドロゲナーゼと比較し
て減少されたセリン選択度を有するホスホグリセラート
デヒドロゲナーゼを暗号解読する少なくとも1つの遺伝
子が必要とされる。
伝子serAによって暗号解読される。野生型のserA遺伝子
の配列は、公知である。(Tobey K.L.,Grant G.A.,198
6,J.Bac.Vol.261,No.26:1279−1283)。プラスミドベク
ターによる野生型のserA遺伝子生産物の過剰発現は、同
様に公知である(Schuller他,1989,J.Biol.Chem.Vol.26
4:2645−2648)。
対立遺伝子の製造は、トサ(Tosa T.)、ピザー(Pizer
L.T.)、1971,J.Bac.第106巻、No.3:972〜982頁に記載
されている。この場合、淘汰は、セリン類似体のセリン
ヒドロキサム酸塩に抗する突然変異体の耐性により行な
われた。前記の刊行物には、突然変異について詳細に特
徴付けられておらず;物質交換に対する突然変異の影響
についても試験されていなかった。
えば微生物を突然変異誘発させることによって得ること
もできる。突然変異誘発要因としてUV光および全ての化
学的突然変異誘発物質、例えばエチルメタンスルホネー
トまたはN−メチル−N′ニトロ−N−ニトロソグアニ
ジンがこれに該当する。選択された突然変異誘発物質の
用量および暴露時間は、従来法により定められる(Mill
er J.H.,1972,Experiments in Molecular Gentics,Cold
Spring Harbor Laboratory,USA:113−143)。
リンに対して感受性を有するホスホグリセラートデヒド
ロゲナーゼを暗号解読するserA−遺伝子を有するクロー
ンに対して淘汰される。例えば、突然変異誘発物質によ
り処理された微生物集団は、非耐性細菌類の成長を抑制
するために、セリンヒドロキサム酸塩を十分な量で含有
する固体の成長媒体上でインキュベートされる。耐性ク
ローンは、ホスホグリセラートデヒドロゲナーゼのセリ
ン選択度に対して試験される。この方法の例示的な実施
態様は、トサ(Tosa)およびプフィツァー(Pfizer)、
1971、J.Bact.100、3:972〜982頁に記載されている。
ヒドロゲナーゼを暗号解読する対立遺伝子は、同様に
“遺伝子工学”技術によって製造することができる。
範囲内にある。従って、個々または多数のアミノ酸の挿
入、置換または欠失が、有利にPGD蛋白質のC末端の25
%中、特に有利にPGD蛋白質の50C末端のアミノ酸中に導
入される。これにより、セリンに対して減少された選択
度が生じる。
載したC末端範囲を暗号解読するserA遺伝子の3′−範
囲を変化させることによって得られる。このために突然
変異されていないserA遺伝子は、組換えDNSを製造する
ための当業者に知られた技術、例えば制限、連結反応お
よび形質転換(Maniatis T.,Fritsch E.F.およびSambro
ok J.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 1982,C
old Spring Harbor Laboratory)を利用することによっ
てクローン化ベクター上に組み換えられる。構造遺伝子
の3′範囲内での特異的変化は、例えば部位特異的突然
変異誘発の技術により達成させることができる。
物の発現に適当である、セリンに対して感受性を有する
PGDの例は、C末端アミノ酸配列を示すことによって第
1表中に記載されている。酵素の蛋白質配列は、野生型
配列と表示された範囲まで区別されない。
ン感受性について試験するために、次の試験を使用し
た: PGD活性は、マックキトリック(Mc Kitrick,J.C.)お
よびルイス(Lewis J.P.)、1980年、J.Bact.141:235〜
245頁の方法により酵素の往復反応を検出することによ
って測定された。この場合、酵素の活性は、セリンなし
におよび種々の濃度のセリンを用いて測定される。記載
された試験は、全てのホスホグリセラートデヒドロゲナ
ーゼのセリン感受性を測定するために適当である。PGD
活性を測定するための全ての別の方法は、同様に使用す
ることができる。
ち酵素の活性を50%抑制するセリン濃度が使用される。
Ki値および多数のフィードバック耐性のserA対立遺伝子
のC末端アミノ酸配列ならびに野生型のserA遺伝子(se
rAWT)のC末端アミノ酸配列は、第1表中に記載されて
いる。
は、意外なことに、本発明による菌株の製造に好適であ
る。
めに、セリンに対して感受性を有するserA対立遺伝子の
発現を生じる全ての組換えベクターを使用することがで
きる。本発明による菌株の製造に適当な組換えベクター
は、野生型と比較して減少された感受性をセリンに対し
て有するPGDを暗号解読する少なくとも1つのserA遺伝
子およびレセプター菌株中で自律的に複製することがで
きるベクター含分を包含する。
例は、パウウェルズ(Pauwels P.H.)、エンガーボーク
(Enger−Valk B.e.)、ブランマー(Brammar W.J.)19
85、Cloning Vectors,Elsevier,Amsterdamに記載されて
いる。このようなベクターは、特に次のものである: −例えば、pBR322;pUC12のような高い模写数を有するプ
ラスミド、 −例えば、pACyC184,177のような中位の模写数を有する
プラスミド、 −例えば、pSC101のような低い模写数を有するプラスミ
ド、 −例えば、M13,λ−ベクターのようなファージベクタ
ー。
されている(例えば、コリネバクテリウムおよびブレビ
バクテリウムについては欧州特許第0401735号明細書ま
たはCA 111(1989)168688q)。
り;特に好ましいのは、p15Aレプリコン、例えばpACYC1
84(ATCC37033)またはpACYC177(ATCC37031)を有する
ベクターである。
記載されている。(パウウェルズ(Pauwels)他,1985,C
loning Vectors,Elsevier Science Publishers,Amsterd
am)。
の標準技術を用いて製造することができる。この技術
は、例えばマニアティス(Maniatis T.)、フリッチュ
(Fritsch E.F.)およびサムブルック(Sambrook
J.)、1982、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor Laboratory,USAまたはアウスベル
(Ausubel F.M.)他、1987,Current Protocols in Mole
cular Biology,Greene Pulishing Associates,USAに詳
細に記載されている。
ンに対して感受性を有するPGDを暗号解読する組換えベ
クター上にserA対立遺伝子を有するディスペンサー微生
物のDNAを制限酵素で断片化することによって可能であ
る。断片化DNSは、常法を用いて、例えば酵素T4−DNAリ
ガーゼを使用することによって、同様に制限酵素によっ
て系統化されたベクター分子中に結合される。連結反応
混合物は、レセプター菌株を脱調節されたトリプトファ
ン物質交換で公知方法、例えば塩化カルシウムショック
またはエレクトロポレーションにより形質転換させるた
めに利用される。望ましいserA対立遺伝子を含有するベ
クターは、レセプター菌株中で、例えば上記方法、例え
ば抗生物質耐性に対する淘汰またはserA突然変異の補完
によって得ることができる。
serA対立遺伝子は、単独模写として染色体中に組み込ま
れている。このことは、一方で上記の突然変異誘発方法
および淘汰方法を直接トリプトファン脱調節された出発
菌株を用いて実施することによって達成することができ
る。また、他面組込みベクター上に存在するserA対立遺
伝子を生産菌株の染色体中に組み込むこともできる。こ
のような組込みのための多数の方法が公知である。これ
らの技術についての記載は、次の刊行物中に見い出され
る: ファージλ仲介組込み:バラクリシュナン(Balakrishn
an)およびバックマン(Backmann)、Gene 67:97〜103
頁;サイモンズ(Simons R.W.)他、1987、Gene 53:85
〜89頁; recD依存性遺伝子置換:シャーベル(Shervell)他、19
87、J.Bact.141:235〜245頁; 他の方法:シルハビー(Silhavy)他、1989、Experimen
ts with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laborator
y。
ことに、セリン100μM〜50mMのKi値を有するフィード
バック耐性のserA対立遺伝子を含有しかつ(トリプトフ
ァン0.1mM〜20mMのKi値を有するtrpE対立遺伝子を含有
する)脱調節されたトリプトファンの物質交換を有する
菌株は、トリプトファンの最高の収率を提供することが
判明した。
および染色体中への前記対立遺伝子の組込み フィードバック耐性のtrpE対立遺伝子による試験のた
めに、トリプトファン類似体の5−メチルトリプトファ
ンを使用した。突然変異原性の作因として、N−メチル
−N′−ニトローN−ニトロソーグアニジン(NG)を使
用した。使用された出発菌株はE.coli K12 YMC9 ATCC33
927であった。突然変異誘発の際の優先方法は、ミラー
(Miller)の記載(Miller J.H.,1972,Experiments in
Molecular Genetics,Cold Spring Harbor Laboratory,C
old Spring Harbor,N.Y.:125−129)。LB中で成長した
培地の代表的な成長段階からのYMC9の細胞約2×1O9を
0.1モルのNaクエン酸塩緩衝液4ml,pH5.5、中で37℃で30
分間NG50μg/mlと一緒にインキュベートした。0.1モル
の燐酸塩緩衝液pH7.0を用いての2回の洗浄の後、細胞
0.1mlを一晩中37℃で振盪させながらLB中で培養した。
引続き、種々の希釈液(NaCl 0.9%中10-3、10-4、10-5)
からの細胞0.1mlを5−メチルトリプトファン100μg/ml
を有する最小媒体板上に塗布した。5−メチルトリプト
ファンとともに、この最小媒体は、グルコース5g/l、ビ
タミンB1 5mg/l、KH2PO43g/l、KH2PO412g/l、MgSO4×7H
2O0.3g/l、NaCl0.1g/l、(NH4)2SO45g/l、CaCl2×2H2O1
4.7mg/l、FeSO4×7H2O2mg/l,Na3クエン酸塩1g/lおよび
寒天15g/lを含有していた。37℃で24〜48時間後、5−
メチルトリプトファン耐性のクローンを接種しかつ上記
の板上に離散させた。
ファンに対するtrpE遺伝子生産物のKi値を測定した(Ba
uerle R.他,1987,Methods in Enzymology Vol.142:366
−386)。この場合、突然変異体は、2つのクラスに分
けることができた。クラス1の突然変異体は、フィード
バック耐性のアントラニラートシンターゼを有してい
た。クラス2の突然変異体は、不変のKi値で高められた
アントラニラートシンターゼ活性を有する酵素を有して
いた。
異体の重要なDNA範囲をクローン化しかつ配列決定し
た。この目的のために、それぞれの染色体DNAを単離
し、かつ制限酵素NheIおよびClaIを有する配合物中で分
割した。約5kbの大きさの断片を単離し、かつpBR322の4
158bpの大きさのNheI/ClaI断片と結合させた。結合配合
物をE.coli KB 862のtrpE菌株(DSM7196)中で形質転換
させた。最小媒体上でトリプトファンなしに成長するこ
とができるクローン上で淘汰した。補完するプラスミド
は、全て5kbのNheI/ClaI断片を含有していた。また、こ
の5kbのNheI/ClaI断片は、遺伝子trpEおよびtrpDととも
にtrpE(約0.8kb)の上流に向かっておよびtrpD(約1k
b)の下流に向かってDNA範囲を含有する。第2表には、
アミノ酸配列の差およびクラス1の4つの突然変異体の
Ki値が記載されている。野生型の配列を有する突然変異
体の配列は、図示されていない範囲内に一致している。
は、trpプロモーターのオペレーター範囲内にもtrpリー
ダーペプチドを暗号解読するDNA範囲内にも存在するこ
とが示された。ΔtrpL1もしくはΔtrpL2で標識された突
然変異は、136bpもしくは110bpの大きさの欠失をリーダ
ーペプチドを暗号解読するDNA範囲内で有する。ΔtrpL1
の突然変異の場合に、欠失は、位置168までに対してヌ
クレオチド位置33の範囲を包含し、trpL2の突然変異の
場合には、AC番号V00372でEMBLデータバンク内に記憶さ
れた配列中でヌクレオチド位置11〜120の範囲を包含す
る。
を達成するために、2つの突然変異体クラスが組み合わ
された。そのために、クラス2の突然変異ΔtrpL1が使
用された。図2は、ΔtrpL1突然変異(クラス2)の位
置および突然変異trpE0,trpE5、trpE6およびtrpE8(ク
ラス1)の位置を示す。
を有する1.6kbのNruI断片を単離し、かつプラスミドpE
0,pE5,pE6もしくはpE8の相応する野生型NruI断片(図
2)と交換した。得られたプラスミドをpIE0、、pIE5,p
IE6もしくはpIE8と呼称し、かつ同族体の組換えによる
染色体組込みのために使用した。そのために、記載した
プラスミドからそれぞれ約5kbの大きさの染色体NheI/Cl
aI断片を例2の記載と同様に低融点のアガロースから単
離し、かつ線形でrecD菌株PD106[ΔtrpLD102]中に形
質転換した。形質転換法として、コーエン(Cohen)
他、1972年、Proc.Nat1.Acad.Sci.USA69:2110〜2114頁
によるCaCl2方法を使用した。菌株PD106をブダペスト条
約により1992年7月28日付けでドイチェン・ザンムルン
グ・フュア・ミクロオルガニスメン(DSM)に番号7195
(DSM7195)で寄託した。最小嫌体上でトリプトファン
なしに成長することができかつアンピシリンに対して感
受性を有する、即ちプラスミド不含であるクローンにつ
いて淘汰した。P1形質導入(Miller J.H.,1972,Experim
ents in Molecular Genetics,Cold Spring Harbor,N.
Y.:201−205)により、異なるフィードハック耐性のtrp
E酵素を暗号解読しかつそれぞれΔtrpL1突然変異と組み
合わされているtrpE対立遺伝子をそれぞれの菌株からKB
862中に移行させた。菌株KB862をブダペスト条約により
1992年7月28日付けでドイチェン・ザンムルング・フュ
ア・ミクロオルガニスメン(DSM)に番号7196(DSM719
6)で寄託した。トリプトファン不含の最小媒体上で淘
汰を行なった。得られた菌株をPD103(trpE0)、KB862
(trpE5)、SV164(trpE8)およびSV163(trpE6)と呼
称した。
ドロゲナーゼを暗号解読するserA遺伝子の製造。
26)からプラスミドベクターpUC18上でクローン化し
た。
一晩中37℃でルリアブイヨン中で培養した。細菌類の細
胞を遠心分離(4000g)によって収穫した。細胞の溶解
およびDNSの精製は、アウスベル(Ausubel)他、1987
年、2.4.1−2.4.2、Current Protocols in Molecular B
iology、Greene Publishing Associatesに記載された記
録により行なわれた。得られたDNS量を分光測定法によ
り260nmの波長で測定した。収量は、600μg/l00mlであ
った。
im GmbH)を製造業者によって規定される条件下で切断
した。断片混合物約3μgを同様にSphI切断された自律
性の複製可能なプラスミドベクターpUC18 0.2μg(Boe
hringer Mannheim GmbH社)と、酵素T4リガーゼ(Boehr
inger Mannheim GmbH社)によって製造業者によって規
定される条件下で結合した。連結反応混合物をserA突然
変異体PC1523(CGSC No.5411;)(CGSC:E.coli Genetic
Stock Center,Department of Biology 255 OML,Yale U
niversity,Postbox 6666,New Haven,CT,USA)の形質転
換のために使用した。形質転換法として、コーエン(Co
hen)他、1972年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69:2110〜2
114頁によるCaCl2方法を使用した。形質転換された細菌
類を最小媒体上にセリンなしに塗布した。セリンなしに
成長するクロ一ンは、E.coliからのserA遺伝子を3.5kb
の大きさのSphI断片上で含有していた。野生型のserA遺
伝子の配列は、図3(SEQ ID NO:13;SEQ ID NO:14)に
記載されている。serA遺伝子を有する組換えベクターを
pGC3と呼称した(図4)。
有するプラスミドpGC3(Boehringer Mannheim GmbH社)
を製造業者の記載により切断することにより、製造し
た。得られた断片をアガロースゲル電気泳動法によって
分離した。完全なserA遺伝子を8C末端コドンまで含有す
る2.0kbの大きさのSalI−KpnI断片をゲルから精製し
た。そのために、“低融点”アガロース(Boehringer M
annheim GmbH社)上で電気泳動を実施し、したがってDN
Sをアガロースの簡単な溶融によって回収することがで
きた。この断片0.2μgを製造業者の記載によるT4リガ
ーゼ(Boehringer Mannheim GmbH社)によって等モル量
のHindIII/SalI切断されたpUC18および合成により得ら
れた二本鎖オリゴヌクレオチドと結合した。このオリゴ
ヌクレオチドのヌクレオチド配列は次の通りである: このオリゴヌクレオチドは、serA遺伝子の8個の最後
のC末端コドンの中の7個を補完する。8番目のコドン
の代わりに、ストップトリプレットTAAを導入する。従
って、このserA遺伝子によって暗号解読されるホスホグ
リセラートデヒドロゲナーゼは、1つのアミノ酸C末端
について短縮されている。突然変異されたPGDのアミノ
酸配列は、第1表(serA5)中に示されている。組換え
プラスミドをpGH5と呼称した(図5)。連結反応配合物
を用いて、serA突然変異体PC1523を形質転換した。
/SalIを有するプラスミドpGC3(Boehringer Mannheim G
mbH社)を製造業者の記載により切断した。完全なserA
遺伝子を有する3kbの断片をゲル電気泳動法により精製
し、SphI/SalI切断ベクターpUC18と結合した。生じるプ
ラスミドをpKB1321と呼称した(図6)。
r Mannheim GmbH社)と一緒に、部分的な切断のみを許
容する条件下でインキュベートする(DNS 1μg当たり
酵素0.05U、10分間、製造業者の記載による残りの反応
条件)。それによって、特にserA遺伝子HindIIの位置17
93で切断されている断片の分画が生じる。この位置で連
結反応によってXbaI切断個所を有するDNSリンカーを差
し込む。DNSリンカーの配列は、次の通りであった: この挿入は、この位置で4個の付加的なアミノ酸を有
するPGDに対して実施される。この配列は、第1表に示
されている。挿入を有するプラスミドをpKB1508と呼称
する(図7)。このプラスミドをserA突然変異体PC1523
中に形質転換した。
ラスミドpGH5(Boehringer Mannheim GmbH社)を製造業
者の記載により切断しかつ断片混合物の2.8kbの大きさ
の断片をゲル電気泳動法により“低融点”アガロースか
ら精製することにより製造した。この断片は、pUC18か
らのベクター含量およびserA5のC末端範囲を含有す
る。2.0kbの大きさのDNS断片を低融点アガロースゲルか
ら溶離した。この断片は、挿入突然変異を有するserA対
立遺伝子serA1508を含有しているが、しかし、8C末端コ
ドンを欠いている。2つの断片を互いに結合し、ひいて
はserA突然変異体PC1523を形質転換する。生じる組換え
プラスミドをpGH11(図8)と呼称する。暗号解読され
たホスホグリセラートデヒドロゲナーゼは、serA1508の
挿入突然変異をserA5の欠失突然変異と合一にする。暗
号解読されたアミノ酸配列中の突然変異を有する領域
は、第1表に示されている。
せるために、このserA対立遺伝子をベクターpACYC184
(ATCC37033)、中位の模写数を有するベクター中で再
クローン化した。そのために、プラスミドpGH5およびプ
ラスミドpGH11 SalI/HindIIIを切断し、serA対立遺伝子
serA5およびserA11を含有するそれぞれ約3kbの大きさの
DNS断片を“低融点”アガロースゲルから単離した。こ
の断片を、制限酵素の5′で突き出ている切断端部を滑
らかな端部中に移行させるために、E.coliからのDNSポ
リメラーゼIのクレノウ断片(Boehringer Mannheim Gm
bH社)を有する分離された配合物中で製造業者の規定に
より処理した。そのために、それぞれの断片1μgを反
応配合物20μl中でクレノウ酵素5U、0.5mMのdATP、dGT
P、dTTPおよびdCTPならびに製造業者によって推奨され
る緩衝液と混合し、かつ30℃で15分間インキュベートし
た。
pACYC 184と結合した。結合配合物を、serA突然変異体P
C1523を形質転換するために使用した。補完するプラス
ミドは、pGH5/IIもしくはpGH11/IIの名称を有していた
(図9、図10)。プラスミドpKB1508をSalI/SphIで切断
した。serA対立遺伝子serA1508を含有する3.0kbの断片
をゲル電気泳動法により精製した。この断片を上記の記
載と同様に滑らかな端部にし、PvuII切断pACYC184と結
合し、連結結合配合物をE.coli PC1523中で形質転換し
た。補完するプラスミドは、pKB1508/IIの名称を有して
いた(図11)。
よびpKB1508/IIを、菌株PD103(trpE0)、KB862(trpE
5)、SV164(trpE8)、SV163(trpE6)を形質転換する
ために、使用した。
たフィードバック耐性のserA5対立遺伝子の構築 染色体λ“付着部位”(att λ)への組込みのため
に、serA5対立遺伝子をプラスミドpRS551(Simons他,19
87,Gene 53:85−96)中にクローン化した。そのため
に、約2kbの大きさのserA5を有するHindIII/SalI断片を
プラスミドpGH5から単離した。5′で突き出ている端部
をDNAポリメラーゼIのクレノウ断片(Boehringer Mann
heim GmbH社)を用いて製造業者の規定により充填し、
かつEcoRIリンカー(Maniatis他,1982,Molecular Cloni
ng:A Laboratory Mannual,Cold Spring Harbor Laborat
ory,Cold Spring Harbor,N.Y.:396−397)の付着後、2k
bの断片をEcoRI切断ベクターpRS551中に結合した。組換
えプラスミドを淘汰し、かつpRS5と呼称した。
株(例えば、YMC9 ATCC33927)上で製造することによ
り、生体内で均一の組換えによって、λRS45ファージと
ともに組換えserA5担持λRS45誘導体を含有する類似体
のλ溶解物を製造した(Simons他,1987,Gene 53:85−9
6)。
株PC1523を使用した(CGSC No.5421)。そのために、PC
1523を異種λ溶解物(上記参照)と感染させ、引続きカ
ナマイシン含有(25mg/l)LB板上に塗布した。次に、得
られた溶原性のカナマイシン耐性クローンを、セリンな
しの最小媒体板上での成長能力について試験した。セリ
ン源栄養性クローンを淘汰し、均一なserA5−λ溶解物
(UV誘発、Simons他,1987,Gene 53:85−96)の製造に使
用した。
株SV164に感染させた。得られた菌株SV164 attλ::serA
5を例4の記載と同様に発酵させた。それぞれの媒体
は、テトラサイクリンの代わりに淘汰作因としてそれぞ
れカナマイシン25mg/lを含有していた。
いての3.5g/lと比較して12.5g/lであった。
Mannheim GmbH社)で切断し、かつ2kbの大きさのserA5
遺伝子担持DNS断片を“低融点”アガロースゲルから単
離した。DNS断片を、例2の記載と同様に、E.coliから
のDNSポリメラーゼI(Boehringer Mannheim GmbH社)
のクレノウ断片の作用によって滑らかな端部にした。ベ
クターpWST1を制限酵素SmaI(Boehringer社)で切断
し、かつ滑らかな端部のDNS断片と結合した。ベククーp
WST1は、E.coli/コリネバクテリウム−スイングベクタ
ー(Schaukelvektor)であり、かつE.coliの場合もコリ
ネバクテリウムの場合も複製することができる。このベ
クターのコリネバクテリウムのレプリコンは、菌株コリ
ネバクテリウム・グルタミクムATCC19223に由来する。
ベクターpWST1の製造は、米国特許第4965197号明細書に
記載されている。連結反応配合物は、E.coli菌株PC1523
を形質転換するために使用される。補完するプラスミド
は、pGH5/IIIの名称を有する(図12)。
リネバクテリウム・グルタミクムATCC21851を形質転換
するために、使用する。この形質転換は、ウォルフ(Wo
lf H.)、1989年、Appl.Microbiol.Biotechnol.30:283
〜289頁に詳細に記載された技術によるエレクトロポレ
ーションにより行なわれる。組換えプラスミドpGH5/III
を担持するクローンを、プラスミド暗号解読されたカナ
マイシン耐性によりカナマイシン25mg/lを有する寒天板
上で淘汰する。
る。serA−野生型対立遺伝子を担持する3kbのDNS断片を
精製し、かつ上記方法によりベクターpWST1中で結合す
る。得られたベクターpGC3/I(図13)を、コリネバクテ
リウム・グルタミクムATCC21851を形質転換するため
に、使用する。
るコリネバクテリウム・グルタミクムATCC21851菌株を
製造する。
担持する菌株が最も高いトリプトファン収率を達成する
ことが判明する。
ラスミド暗号解読されたserA対立遺伝子の影響 第3表に総括された種々のトリプトファン生産菌株を
用いて、100mlのエーレンマイヤーフラスコ中でテトラ
サイクリン15mg/lが添加された10mlのLB媒体(トリプト
ファン1%、酵母抽出液0.5%、NaCl0.5%)を接種し
た。30℃で150rpmで振盪しながらの8〜9時間のインキ
ュベーション後に、それぞれの前培養物を100mlのSM1媒
体中に移行させた。SM1媒体は、グルコース5g/l、KH2PO
412g/l、(NH4)2SO40.1g/l、MgSO4×7H2O 0.3g/l,CaCl
2×2H2O15mg/l、FeS04×7H202mg/l、Na3クエン酸塩×
2H201g/l、痕跡元素溶液1ml/l(下記参照)、L−フェ
ニルアラニン40mg/l、L−チロシン40mg/l、ビタミンB1
5mg/lおよびテトラサイクリン15mg/lを含有していた。
この痕跡溶液は、Na2MoO4×2H2O0.15g/l、H3BO32.5g/
l、CoCl2×6H2O0.7g/l、CuS04×5H2O0.25g/l、MnCl2
×4H2O1.6g/lおよびZnSO4×7H2O0.3g/lから構成され
ている。この培地を1lのエーレンマイヤーフラスコ中で
12〜16時間で30℃で150rpmで振盪させた。この培地のイ
ンキュベーション後、OD600は2〜4であった。更に、
発酵をブラウン−メルスンゲン社(Braun−Melsungen)
の研究発酵器BIOSTAATRM中で実施した。2リットルの
全容積を有する培養容器を使用した。
5g/l、MgSO4×7H2O 0.3g/l、CaCl2×2H2O15mg/l、FeSO4
×7H2O 75mg/l、Na3クエン酸塩×2H2O1g/l、KH2PO41.5g
/l、痕跡元素溶液1ml/l(上記参照)、ビタミンB1 5mg/
l(チアミン)、L−フェニルアラニン0.75g/l、L−チ
ロシン0.75g/l、酵母抽出液2.5g/l(ディフコ(Difc
o))、トリプトン2.5g/l(ディフコ(Difco))および
テトラサイクリン20mg/lを含有していた。
(w/v)(オートクレーブ処理した)をポンプ輸送する
ことによって17.5g/lに調節した。接種前に、発酵媒体
にテトラサイクリンを20mg/lの最終濃度まで添加した。
更に、pH値を25%のNH4OH溶液をポンプ輸送することに
よって6.7に調節した。
開始容量は、約1lであった。この培地をまず400rpmで攪
拌し、かつ滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気1.5v
vmで脱ガス化した。発酵を30℃の温度で実施した。
に維持した。発酵ブイヨン中での酸素飽和は、発酵の時
点で20%以下に減少しなかった。酸素飽和を発酵の際に
攪拌速度により制御した。
度およびトリプトファン収量を測定した。グルコース含
量の測定は、YSI社のグルコース分析装置を用いて酵素
により行なわれた。グルコース濃度を5〜20g/lの連続
的供給によって調節した。
した。媒体をヌクレオシル100−7/C8(250/4mm;Machere
y−Nagel)。カラムをアイソクラチック(isokratisc
h)に2ml/minの流速で運転した。フラックスとして、1
リットル当たりH3PO40.1ml(85%)を添加した水/アセ
トニトリル(83/17)を使用した。ダイオードアレイ検
出器を用いるかまたは215nmもしくは275nmの基準波長で
検出した。44〜50時間後、発酵を中断させた。48時間後
にこの発酵g/lで生産されたトリプトファン量は、第3
表に纒められている。
Claims (9)
- 【請求項1】トリプトファンを生産する微生物の菌株に
おいて、トリプトファン生合成が、trpE対立遺伝子によ
ってコードされるアントラニラートシンターゼを変異に
よりトリプトファンによりフィードバックを受けないよ
うに脱調節されており、かつセリンのKi値が0.1μM〜5
0μMのホスホグリセラートデヒドロゲナーゼをコード
するserA対立遺伝子が存在していることを特徴とする、
トリプトファンを生産する微生物の菌株。 - 【請求項2】trpE対立遺伝子によってコードされる酵素
が0.1mM〜20mMのセリンのKi値を有する、請求項1記載
の菌株。 - 【請求項3】serA対立遺伝子が染色体中に組み込まれて
いる、請求項1または2に記載の菌株。 - 【請求項4】微生物が細菌類である、請求項1から3ま
でのいずれか1項に記載の菌株。 - 【請求項5】細菌類が種大腸菌(E.coli)に属する、請
求項4記載の菌株。 - 【請求項6】細菌類が種コリネバクテリウムに属する、
請求項4記載の菌株。 - 【請求項7】請求項1記載の菌株を製造する方法におい
て、フィードバック耐性のserA対立遺伝子を、トリプト
ファン生合成が、trpE対立遺伝子によってコードされる
アントラニラートシンターゼを変異によりトリプトファ
ンによりフィードバックを受けないように脱調節されて
いる、トリプトファンを生産する微生物菌株中に導入す
ることを特徴とする、請求項1記載の菌株の製造法。 - 【請求項8】serA対立遺伝子を、トリプトファン生合成
が、trpE対立遺伝子によってコードされるアントラニラ
ートシンターゼを変異によりトリプトファンによりフィ
ードバックを受けないように脱調節されている、トリプ
トファンを生産する微生物の染色体中に導入する、請求
項7記載の方法。 - 【請求項9】トリプトファンを生産する方法において、
請求項1から6までのいずれか1項に記載の菌株を使用
することを特徴とする、トリプトファンの生産方法。
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