JPH07107984A

JPH07107984A - 染色体にマルチコピーのトリプトファンオペロンを含むバクテリアによるｌ−トリプトファンの製造

Info

Publication number: JPH07107984A
Application number: JP21136193A
Authority: JP
Inventors: Aachen Chan; チャン・アーチェン; Shiuran Tsuai; ツァイ・シウラン; Douengan Moo; モー・ドゥエンガン
Original assignee: Development Center for Biotechnology
Current assignee: Development Center for Biotechnology
Priority date: 1993-08-26
Filing date: 1993-08-26
Publication date: 1995-04-25

Abstract

(57)【要約】【目的】染色体にマルチコピーのトリプトファンオペ
ロンを含んだバクテリアと、それによるＬ−トリプトフ
ァンの生産に関するものである。【構成】高トリプトファン生産株の遺伝子からクロー
ン化された突然変異ｔｒｐオペロンを含むプラスミド、
宿主株と該プラスミドとの同種組換えにより得られた組
換えバクテリア、および該組換えバクテリアをＬ−トリ
プトファン生産培地で増殖させる過程を含む直接発酵に
よるＬ−トリプトファンの製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、染色体にマルチコピー
数のトリプトファンオペロンを含むバクテリア、および
染色体にマルチコピー数のトリプトファンオペロンを含
むバクテリアによるＬ−トリプトファンの製造に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】Ｌ−トリプトファンは重要なアミノ酸で
ある。幾つかの文献には、Ｌ−トリプトファンを添加し
た飼料によって家禽や豚の成長を促進できると報告され
ている[バターハム(Ｂatterham)およびワトソン(Ｗatso
n) １９８５]。そのため、Ｌ−トリプトファンを経済的
に製造する方法はアミノ酸産業において注目を集めてい
る。Ｌ−トリプトファンの微生物による製造方法がいく
つか報告されている。例えば、グルコース系の炭化水素
類からの直接発酵[キノ(Ｋino)ら、１９８８]、Ｌ−ト
リプトファンの前駆物質からのバイオ変換[海老原ら、
１９６９]、およびＬ−トリプトファンの前駆物質から
の酵素反応[中沢ら、１９７２]などがある。Ｌ−トリプ
トファンの生産について、多数の工業プロセスは各種の
組換え株を用いて、それぞれＬ−トリプトファンのシン
ターゼ[湯川ら、１９８７]およびトリプトファナーゼを
触媒としてインドール／セリンおよびインドール／ピル
ビン酸塩の変換を行なう。しかし、これらのプロセスに
は、その前駆物質が高価であることや、濃度の高い前駆
物質が微生物の成長と酵素活性を抑えることなどの欠点
がある。これらの問題を解決するために、新しいプロセ
スと安価な前駆物質の代用物が開発された[バン(Ｂang)
ら、１９８３；オイタ(oita)ら、１９９０]。

【０００３】経済上の角度から見れば、安価なグルコー
ス系炭化水素の直接発酵によりＬ−トリプトファンを生
産する方法は、低コストで大量生産できる選別肢であ
る。工業上、ブレビバクテリウム(Ｂrevi bacterium)
(松井ら、１９８８)、コリネバクテリウム(Ｃorynebact
erium)(萩野および中山、１９７５)、およびバシラス
(Ｂacillus)(椎野ら、１９７３)等の典型的なグルタミ
ン酸生産菌株を用いてＬ−トリプトファンを生産するこ
とが一般的である。しかし、Ｌ−トリプトファン合成の
遺伝的情報とその代謝経路が詳しく解明されているエシ
ェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)は、Ｌ−トリプト
ファン生産用微生物の有力候補として考えられる[アビ
ア(Ａbia)ら、１９８０；トリベ(Ｔribe)およびピッタ
ード(Ｐittard)１９７９]。

【０００４】エシェリキア・コリ(Ｅscherichia coli)
では、Ｌ−トリプトファンの生合成が複雑な機構によっ
て厳密に制御されている[スミス(Ｓmith)およびヤノフ
スキー(Ｙanofsky)１９６２]。そのうえ、ｔｒｐオペロ
ンの酵素のフィードバックおよび抑制阻害も詳しく研究
された。そこで、伝統的な突然変異により、特定の経路
にあるフィードバックおよび抑制制御を取り除くと、Ｌ
−トリプトファンが過剰生成される。一方、様々なプラ
スミドにおいて異なったコピー数のクローン化ｔｒｐオ
ペロンを含むエシェリキア・コリ菌株が報告されている
[アンダーソン(Ａnderson)およびクラウス(Ｋlaus)１９
８３；アイバ(Ａiba)ら、１９８２]。これらの結果
は、Ｌ−トリプトファンの生産とｔｒｐオペロンのコピ
ー数との関係を示す。しかし、ｔｒｐオペロンの発現頻
度が高すぎたら(過剰発現)、プラスミドが不安定にな
り、かえってＬ−トリプトファン生産が低下することに
なる。組換えプラスミドを安定化させるために、抗生物
質を選別プレッシャーとして加えることが一般的である
が、工業的スケールでは、抗生物質の使用はコストが高
くて実用化しにくい。

【０００５】本発明者らは、Ｌ−トリプトファン生産に
対するフィードバック耐性ｔｒｐオペロン遺伝子量の効
果を調べた。また、不安定なプラスミドを宿主株に導入
すると、同種組換えが起こり、プラスミドがマルチコピ
ーの状態として組み込まれることを発見した。そのう
え、本発明は、選別プレッシャーを与えない状態で、プ
ラスミドを安定に保持しながら効果的にＬ−トリプトフ
ァンを生産できる組換え株を開発した。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】したがって、本発明の
一つの目的としては、トリプトファンを大量生産できる
菌株の遺伝子からクローン化した突然変異ｔｒｐオペロ
ンを含むプラスミドを提供することである。

【０００７】本発明のもう一つの目的としては、染色体
にマルチコピーのトリプトファンオペロンを含む組換え
バクテリアを提供することである。

【０００８】本発明のまたもう一つの目的として、染色
体にマルチコピーのトリプトファンオペロンを持つ組換
えバクテリアを利用し、Ｌ−トリプトファンを生産する
方法を提供することである。

【０００９】本発明の上述の目的と他の目的、利点と特
徴は、以下の詳細な説明を参考にして、もっと完全に理
解されるべきである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、染色体にマル
チコピーのトリプトファンオペロン(ｔｒｐオペロン)を
含むバクテリア、および染色体にマルチコピーのトリプ
トファンオペロンを含むバクテリアによるＬ−トリプト
ファンの生産に関するものである。

【００１１】突然変異は、Ｌ−トリプトファン生合成の
フィードバック阻害効果を抑えることが知られており、
突然変異株の中でも、５−フッ素トリプトファン耐性
株、イー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５は１８時間内３ｇ／
リットルのＬ−トリプトファンを生産する能力を持つ。
このイー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５から得られたフィー
ドバック耐性ｔｒｐオペロンを、ｐＵＣ１９およびｐＨ
ＳＧ５７６に挿入してそれぞれｐＴＣ７０１およびｐＴ
Ｃ５７６を得た。ｐＨＳＧ５７６およびｐＴＣ７０１が
イー・コリに導入されたとき、遺伝子組込みが同種組
換えの方式で行なわれた。サザンハイブリッド形成(Ｓo
uthern hybridization)の技術により、本発明者らは、
挿入されたプラスミドがマルチコピーとして存在するこ
とを明らかにした。外来ｔｒｐオペロンを持つ組込み株
は、宿主株よりも高い活性のアントラニル酸シンターゼ
およびトリプロファンシンターゼを持ったことで、Ｄ−
グルコースから１３％変換収率で９.２ｇ／リットルの
Ｌ−トリプトファンを生成する能力を持つ。この組込み
株は、バッチ式発酵により、１７時間内に１６ｇ／リッ
トルのＬ−トリプトファンを生産でき、かつ細胞内の外
来ｔｒｐオペロンを安定させる選別プレッシャーとして
の抗生物質を不用とする。ｔｒｐオペロンを持つプラス
ミドの組込みおよび増幅過程は、プラスミドを安定さ
せ、Ｌ−トリプトファンの生産量を増加した。イー・コ
リＥＭＳ４−Ｃ２５は、通商産業省工業技術院生命工
学工業技術研究所に、ブダペスト条約の下、受託番号Ｆ
ＥＲＭＢＰ−４３７４にて、平成５年８月２日に寄託
してある。

【００１２】

【実施例】

材料および方法菌株およびプラスミドイー・コリＷ３１１０ｔｒｐＥは、アメリカン・タイ
プ・カルチャー・コレクション(Ａmerica Ｔype Ｃultu
re Ｃollection)から購入したものであり、フィードバ
ック耐性ｔｒｐオペロンを持ったイー・コリＥＭＳ４
−Ｃ２５は、イー・コリＫ１２をＮ−メチル−Ｎ'−ニ
トロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（Ｎ−methyl−Ｎ'−nit
ro−Ｎ−nitrosoguanidine）の処理により単離した５−
フッ素トリプトファン耐性株から選別されたものであ
る。プラスミドｐＴＣ７０１およびｐＴＣ５７６は、そ
れぞれ、突然変異したｔｒｐオペロンをハイコピー数ベ
クターｐＵＣ１９のＳｍａＩ部位に、またはローコピー
数ベクターｐＨＳＧ５７６のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部
位に挿入して得られたものである。

【００１３】プラスミドの構築染色体ＤＮＡは、マニアティス(Ｍaniatis)ら(１９８
３)の方法によって生成された。制限酵素とＴ４ＤＮＡ
リガーゼは業者[ベーリンガー・マンハイム・バイオケ
ミカルズ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals)、イ
ンディアナポリス、アメリカ合衆国]が提供した方法に
したがって使用した。プラスミドＤＮＡは、アルカリ分
解法で単離され、ＣsＣl−臭素エチジウム平衡遠心法に
よって精製された。制限されたＤＮＡ断片は、低ゲル化
温度アガロース[ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ
(Ｂethesda Ｒesearch Ｌaboratories)、ゲイザスバー
グ、アメリカ合衆国]から回収され、バイスランダー(Ｗ
eislander)ら(１９７９)の方法で精製された。イー・コ
リＥＭＳ４−Ｃ２５のゲノムライブラリーは、ベクタ
ーとしてのファージＥＭＢＬを使って生成した。ｔｒｐ
オペロンを含む８.７ｋｂＤＮＡ断片は、ＳｍａＩ処理
とプラークハイブリッド形成選別によって得られた。こ
のＤＮＡ断片をｐＵＣ１９ベクターのＳｍａＩ部位に挿
入してｐＴＣ７０１を得た。ｐＴＣ７０１をＥｃｏＲＩ
およびＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼで処理することに
より、８.７ｋｂＤＮＡ断片が選別された後、ｐＨＳＧ
５７６のＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩ切断部位に挿入し
てｐＴＣ５７６を得た(図１)。

【００１４】ＤＮＡハイブリッド形成サザンハイブリッド形成およびニック翻訳は、マニアテ
ィス(Ｍaniatis)ら(１９８２)の方法により、非放射性
ＤＮＡ標識および検出キット[ベーリンガー・マンハイ
ム・バイオケミカルズ]を使って手作業で行なわれた。
ＤＮＡ断片は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した後、ナイロ
ン膜にトランスブロットした。ＤＮＡは、トランス照明
デバイス(transillumination)を用いて３分間ＵＶ−ク
ロスリンクして固定した。制限されていないＤＮＡサン
プルは、ドットブロット装置を用いてナイロン膜に吸着
された[マニアティス(Ｍaniatis)ら１９８２]。ハイブ
リッド形成は、ジゴキシゲニン標識(digoxigenin labe
l)したｐＨＳＧ５７６またはｔｒｐオペロンをプローブ
として使用することにより行なわれた。プローブが抗体
−酵素共役物、抗ジゴキシゲニンおよびアルカリホスフ
ァターゼを含んだ溶液で培養された後、抗体−抗原共役
物の位置が酵素呈色反応により可視化される。呈色の強
度はＣＡＭＡＧＴＬＣスキャナーで評価される。

【００１５】プラスミドの表現型安定性細胞をルリア−バータニ(Ｌuria−Ｂertani)(ＬＢ)ブロ
スで２５世代培養した後、それを希釈してＬＢアガーに
移した。菌株はレプリカ平板法により、抗生物質を含む
ＬＢアガープレートに移してその耐薬性を調べた。クロ
ラムフェニコールおよびアンピシリンの使用量は、３０
ｕｇ／ｍｌおよび１００ｕｇ／ｍｌであった。

【００１６】Ｌ−トリプトファンの醗酵予め、細胞をＬＢブロスで培養し、中間−対数期(mid-l
ogarithmic phase)、０.１５ｍｌの培養液を０.１％Ｋ
Ｈ₂ＰＯ₄、０.２％Ｎa₂ＨＰＯ₄、１.０％(ＮＨ₄)₂ＳＯ
₄、０.０２％ＭgＳＯ₄、０.０５％クエン酸ナトリウ
ム、０.８％酵母エキス、７％グルコースおよび３％Ｃa
ＣＯ₃ １５ｍｌを含む１５ｍｌ培養液に移した。発酵
は、３７℃に２００ｒｐｍで振動しながら行った。

【００１７】発酵も５リットルの容器で行なわれる。こ
の場合には、５０ｍｌのＬＢ培地を入れた５００ｍｌフ
ラスコに０.２ｍｌの凍結した１７％グリセロールを有
するストック培養液を無菌的に加え、３７℃で、回転振
動器で撹拌しながら一夜培養した。培養液を、さらに、
３リットルの５％Ｄ−グルコースを添加した発酵培地を
入れた発酵槽に導入した。培地のpＨは、２５％のアモ
ニア液でｐＨ６.８に保持した。温度は、３７℃に制御
された。５０％(Ｗ／Ｖ)Ｄ−グルコースを含む培地を、
Ｄ−グルコースの濃度を１〜２％の間に保持するために
無菌的に発酵槽に導入した。エアレーションは、1 ｖｖ
ｍに保持され、溶存酸素はインペーラスピードコンドロ
ーラを用いて空気飽和濃度の２０％以上に制御された。
試料をそれぞれ異なった間隔で採って、そのグルコース
量、酢酸量、Ｌ−トリプトファン量および細胞密度を測
定した。細胞密度は、水で希釈した後に吸光光度計を使
い、６６０ｎｍの吸光で測定した。グルコースおよび酢
酸の濃度の測定は、ＩＢＭ炭化水素カラムＨＰＬＣ法
[ウォーター(Ｗater)社]を用いて、溶出液を８０％アセ
トニトリール／水系、流速を１.２ｍｌ／分にして室温
で行った。Ｌ−トリプトファンの濃度は、ＡＬＰＫＥＭ
自動分析器と、ＵＶ検出器を持ったＨＰＬＣで測定し
た。

【００１８】酵素活性測定アントラニル酸合成酵素(ＥＣ４.１.３.２７)とトリプ
トファン合成酵素(ＥＣ４.２.１.２０)の活性は、スミ
ス・ヤノフスキー(Ｓmith Ｙanofsky)(１９６２)の方法
にしたがって測定した。活性の単位は、３０℃で１分間
毎に１ｕｍｏｌの基質を消費する酵素量、または１ｕｍ
ｏｌの生成物を生産する酵素量で定義された。特定活性
は、１ｍｇのプロテインに含まれる酵素活性(ミリ単位)
で定義された。プロテイン濃度は、牛血清アルブミンを
スタンダードにしてロウリィ(Ｌowry）法(１９５１)で
定量された。

【００１９】組換え株によるＬ−トリプトファンの発酵クラシック突然変異により選別された５−フッ素トリプ
トファン耐性異変株(イー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５)
は、発酵培地で３ｇ／１リットル−トリプトファンを生
産した。この変異株はフィードバック阻害耐性酵素:ア
ントラニル酸シンターゼとトリプトファンシンターゼ
（図２）を含み、ｔｒｐオペロンの突然変異を示す。突
然変異したｔｒｐオペロンの遺伝子量効果がＬ−トリプ
トファンの生産を増加するかどうかを調べるために、ｔ
ｒｐオペロンを持ったプラスミドｐＴＣ７０１を構築し
た。ｔｒｐオペロンを含む８.７ｋｂＤＮＡ断片を、イ
ー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５のゲノムライブラリーから
得、それをｐＵＣ１９に挿入してプラスミドｐＴＣ７０
１を構築し、最小培地でｔｒｐオペロン欠乏株イー・コ
リＷ３１１０ｔｒｐＥを補足する。大部分の細胞は、
１００世代後にプラスミドを失ったものの、形質転換株
は、培地でＤ−グルコースから２％の変換収率で１.５
ｇ／リットルＬ−トリプトファンを生産できた。イー
・コリＥＭＳ４−Ｃ２５にプラスミドｐＴＣ７０１を
導入することにより、Ｌ−トリプトファンの生産は、４
ｇ／リットルまで上昇し、プラスミドの表現型安定度は
５０世代後に僅か２２％であった。この形質転換株を数
回再培養し、抗生物質を含んだＬＢアガープレートで精
製することにより、１００コロニーから表現型安定度が
９０％、Ｌ−トリプトファン生産が９.２ｇ／ｍｌに及
ぶ株が得られた。形質転換株はプラスミドの表現型安定
性が高く、宿主からプラスミドを分離できなかったの
で、プラスミドは宿主細胞の染色体に挿入されたと思わ
れた。

【００２０】アイバ(Ａiba)ら（１９８２）はローコピ
ー数ベクターｐＳＣ１０１は安定的に宿主に保持される
ことを報告している。そこで、ｐＳＣ１０１ｏｒｉを
含むｐＨＳＧ５７６ベクターは、ｔｒｐオペロンサブク
ローニングに使われた。プラスミドｐＴＣ５７６は、ｐ
ＨＳＧ５７６にｔｒｐオペロンを挿入したものである。
イー・コリＥＭＳ−Ｃ２５にプラスミドｐＴＣ５７６
を導入し、形質転換株を新鮮な培地で数回再培養した
後、ｐＴＣ７０１を含む株に匹敵できるＬ−トリプトフ
ァンおよびプラスミド表現型安定度を持つ株が選別され
た。結果を下記「表１」に示す。

【００２１】

【表１】

【００２２】サザンおよびドットハイブリッド形成同種組換えを確認するために、サザンおよびドットブロ
ットが行なわれた。ｔｒｐオペロン遺伝子の発現は、ア
ントラニル酸シンターゼおよびトリプトファンシンター
ゼの活性を指標にして調べられた。

【００２３】イー・コリにｐＴＣ５７６が組込まれたこ
とは、染色体ＤＮＡおよびｐＨＳＧ５７６をハイブリッ
ド形成させることによって確認された(図３)。酵素顕色
反応により、これらのブロットの中で、非形質転換細胞
以外のサンプルは、すべて強いハイブリッドを示してい
た。ｐＨＳＧ５７６はｌａｃＺ遺伝子を持つので、非形
質転換株も弱いハイブリッドを示していた。

【００２４】バクテリア染色体に組込まれたプラスミド
の増幅イー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５および組込まれた株のゲ
ノムＤＮＡをＥｃｏＲＩおよびＣｌａＩエンドヌクレア
ーゼで処理した後、電気泳動にかけ、ブロットしてｔｒ
ｐオペロン断片でプローブした。図４では、Ｃ２５／Ｅ
ｃｏＲＩと標識されたレーンに１つのバンドが見られ、
それは１ｎｇのイー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５株のゲノ
ムＤＮＡをＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼで処理してｔ
ｒｐオペロンでプローブするものである。一方、Ｄ１５
／ＥｃｏＲＩと標識されたレーンに３つのバンド(２３
ｋｂの所にほぼ重なる二つのバンドがある)が見られ、
それは１ｎｇの組込まれた株のゲノムＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉエンドヌクレアーゼで処理してｔｒｐオペロンでプロ
ーブしたものである。バンドの色の強度をスキャンし、
図５に示している同種組換えモデルを参照しながら、組
込まれた株の染色体にｔｒｐオペロンが３コピーあるこ
とが分かった。このモデルはまた、ＥＭＳ４−Ｃ２５／
ｐＴＣ５７６が組込まれた株の染色体にはｔｒｐオペロ
ンを３コピー持てば、エンドヌクレアーゼＣｌａＩによ
って４つのｔｒｐオペロンハイブリッドのバンドに分解
されることを示唆する(図５)。Ｄ１５／ＣｌａＩと標識
されたレーン(図４)にあるそれぞれ制限分解断片におい
て、組込まれた株には、ｔｒｐオペロン制限分解断片に
相当するところに増幅されたバンドが酵素反応の顕色と
して現れた。バンド顕色強度から、染色体にｔｒｐオペ
ロンが３つあることが分かった。

【００２５】ｐＴＣ７０１とｐＴＣ５７６の組込みと増
幅により、多クローン化ｔｒｐオペロン遺伝子が非常に
安定になり、Ｌ−トリプトファン生合成が抗生物質の添
加による選別プレシャーがなくても促進された（表
１）。下記「表２」に示すのは、Ｌ−トリプトファン生
産に対するｔｒｐオペロン量と遺伝子表現の影響であ
る。データにより、アントラニル酸シンターゼとトリプ
トファンシンターゼの活性とＬ−トリプトファンの生産
はｔｒｐオペロンのコピー数に比例することが示唆され
る。

【００２６】

【表２】

【００２７】Ｌ−トリプトファンの生産性５リットルの発酵槽でＬ−トリプトファンの生産性を調
べた。結果を下記「表３」に示す。２リットルの発酵培
地にシード培養液を接種(５％植え込む数）することに
よって導入して発酵を行なった。発酵条件は詳細な説明
に記述した。６０％(Ｗ／Ｖ)Ｄ−グルコースが含まれた
培地は、発酵過程の間に、ブロスのＤ−グルコースの濃
度を１−２％(Ｗ／Ｖ)の間に制御しながら入れられた。
２４時間の発酵をした後、ブロスを遠心し、上清のＬ−
トリプトファンをＨＰＬＣによって定量された。

【００２８】

【表３】

【００２９】形質転換する前にレシピエントよりクロー
ン化されたｔｒｐオペロン遺伝子に連結したプラスミド
ｐＵＣ１９とｐＨＳＧ５７６は、イー・コリの染色体に
組込まれたことが明らかにされた。ＤＮＡ制限分解のプ
ロフィル(図４、図５)により、挿入された後のプラスミ
ドと側面に置いたｔｒｐオペロン遺伝子は染色体の中に
タンデムアレー(tandem array)として増幅された。以上
の結果を説明する複製挿入モデルは、すでに報告されて
いる[バシラス・サチリス(Ｂacillus subtilis) (ハル
デンワング(Ｈaldenwang)ら１９８０)、ストレプトコ
ッカス・ニューモニエ(Ｓtreptococcus pnemoniae) (ポ
ッツィ(Ｐozzi)およびギルド(Ｇuild)１９８５)とサッ
カロミセス・セレビシエ(Ｓaccharmyces cerevisiae)
（ヒネン(Ｈinnen)ら１９７８)]。一般的には、遺伝子
量を増やそうとするとき、ｒｅｃＡ−欠乏イー・コリ株
は、組換えを抑えるために組換えＤＮＡレシピエントと
して使われる。しかし、組換え株には、プラスミドが不
安定になり、遺伝子生産の収量に対する遺伝子量効果が
低下することがしばしば起こる。本発明には、ｒｅｃＡ
−陽性株のゲノムにｔｒｐオペロンを含むプラスミドを
増幅、挿入し、Ｌ−トリプトファンの生合成を向上する
新たなアプローチを提供した。組込まれた株は、抗生物
質を添加しなくても、ｔｒｐオペロンを安定的に保持す
ることができ、その同時に相当の量のＬ−トリプトファ
ンを生産できるので、工業上に適用されるこの株を使っ
た発酵法の開発は今後の目標になるであろ。

【図面の簡単な説明】

【図１】 (ａ)および(ｂ)は、それぞれ、プラスミドｐ
ＴＣ５７６およびｐＴＣ７０１の構成を示す模式図。影
の部分は、挿入されたｔｒｐオペロンの８.７ｋｂＤＮ
Ａ断片を示す。

【図２】エシェリキア・コリ由来のアントラニル酸塩
シンターゼ(ＡＳ)とトリプトファンシンターゼ(ＴＳ)に
対するＬ−トリプトファンのフィードバック阻害効果を
示すグラフ。

【図３】組込まれたイー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５(レ
ーン１)とイー・コリＥＭＳ−Ｃ２５／ｐＴＣ７０１か
ら得られたゲノムＤＮＡのサザンブロットによるクロマ
トグラムの図面代用写真。この写真は、ｐＨＳＧ５７６
プローブのハイブリッド形成パターンを示す。レーン２
から６までは、０.５−１ｎｇの統合菌株のゲノムＤＮ
Ａをプローブとハイブリッド形成されたものを示す。レ
ーン７と８はそれぞれ、Ｈｉｎｄ IIIエンドヌクレアー
ゼによって制限されたｐＴＣ５７６とラムダＤＮＡであ
る。

【図４】イー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５／ｐＴＣ７０
組込み株のゲノムにあるｔｒｐオペロンの増幅を示すク
ロマトグラムの図面代用写真。この写真は、ｔｒｐオペ
ロンの８.７ｋｂ遺伝子断片プローブのハイブリッド形
成パターンを示す。Ｃ２５／ＥｃｏＲＩとＤ１５／Ｅｃ
ｏＲＩは、１ｎｇのイー・コリＥＭＳ４−Ｃ２５とそ
のＥｃｏＲＩエンドヌクレアーゼにより制限された組込
み株のゲノムＤＮＡである。Ｃ２５／Ｃ１ａＩとＤ１５
／Ｃ１ａＩはＣ１ａＩエンドヌクレアーゼによって制限
された株である。

【図５】同種組込みをして増幅されたｔｒｐオペロン
配列を持ったプラスミドを作成するためのフローチャー
ト。染色体にあるｔｒｐオペロンのコピー数は、Ｅｃｏ
ＲＩとＣ１ａＩエンドヌクレアーゼに作用され、ｔｒｐ
オペロンプローブでハイブリッド形成されたゲノム断片
を分析することによって判断される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｐ 13/22 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ツァイ・シウラン台湾タイペイ、シンチュン、チュン・シン・ストリート42番５フロアー (72)発明者モー・ドゥエンガン台湾タイペイ、チャン・シン・ストリート、レイン85、６番３フロアー

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】高トリプトファン生産株の遺伝子からク
ローン化された突然変異ｔｒｐオペロンを含むプラスミ
ド。
【請求項２】高トリプトファン生産株が突然変異イー
・コリ(Ｅ. coli)である請求項１記載のプラスミド。
【請求項３】高トリプトファン生産株がイー・コリ
ＥＭＳ４−Ｃ２５である請求項２記載のプラスミド。
【請求項４】突然変異ｔｒｐオペロンをハイコピー数
ベクターｐＵＣ１９に挿入して得られた請求項１記載の
プラスミド。
【請求項５】ｐＴＣ７０１である請求項１のプラスミ
ド。
【請求項６】突然変異ｔｒｐオペロンをローコピー数
ベクターｐＨＳＧ５７６に挿入して得られた請求項１記
載のプラスミド。
【請求項７】ｐＴＣ５７６である請求項１記載のプラ
スミド。
【請求項８】染色体にマルチコピーのトリプトファン
オペロンを含む組換えバクテリア。
【請求項９】宿主株と請求項１記載のプラスミドとの
同種組換えにより得られた請求項８記載の組換えバクテ
リア。
【請求項１０】宿主株と請求項５記載のプラスミドと
の同種組換えにより得られた請求項８の組換えバクテリ
ア。
【請求項１１】宿主株と請求項７記載のプラスミドと
の同種組換えにより得られた請求項８記載の組換えバク
テリア。
【請求項１２】宿主株が突然変異イー・コリである請
求項９、１０または１１記載の組換えバクテリア。
【請求項１３】宿主株がイー・コリＥＭＳ４−Ｃ２
５である請求項１２記載の組換えバクテリア。
【請求項１４】請求項８記載の組換えバクテリアをＬ
−トリプトファン生産培地で増殖させる過程を含む直接
発酵によるＬ−トリプトファンの製造方法。
【請求項１５】組換えバクテリアにある外来ｔｒｐオ
ペロンを保持するための選別抗生物質を添加しない請求
項１４の製造方法。