FI106727B

FI106727B - Transformoidut E. coli- tai Coryne-bakteerien kannat ja näiden valmistusmenetelmät

Info

Publication number: FI106727B
Application number: FI951439A
Authority: FI
Inventors: Guenter Wich; Walfred Leinfelder; Keith Backman
Original assignee: Consortium Elektrochem Ind
Priority date: 1992-09-28
Filing date: 1995-03-27
Publication date: 2001-03-30
Also published as: DE4232468A1; KR950703653A; WO1994008031A1; UA32566C2; ES2089846T3; HU218139B; RU2111247C1; CN1065909C; AU4819093A; CZ66795A3; SK34195A3; EP0662143B1; CZ282396B6; EP0662143A1; JPH07507693A; AU673374B2; TW241303B; US6180373B1; FI951439A0; BR9307125A

Description

106727

Transformoidut E. coli- tai Coryne-bakteerien kannat ja näiden valmistusmenetelmät - Transformerade E. coli- eller Cyrone-bakteriestammar och deras framställningsförfarande 5

Keksinnön kohteena ovat tryptofaanin tuottamiseen tarkoitetut transformoidut E. coli- tai Coryne-bakteerien kannat ja näiden valmistusmenetelmät.

10 Tryptofaaniaineenvaihdunnan tiedetään tapahtuvan kaikissa tähän mennessä tutkituissa mikro-organismeissa samaa biosyn-teesireittiä (Somerville, R. L., Herrmann, K. M., 1983, Aminoacids, Biosynthesis and Genetic Regulation, Adelison-Wesley Publishing Company, USA: 401-322 ja 351-378; Aida et 15 ai., 1986, Biotechnology of amino acid production, progress in industrial microbiology Vol. 24, Elsevier Science Publishers, Amsterdam: 188-206). Kuviossa 1 on esitetty tryptofaanin aineenvaihdunta, sen liittyminen seriinin aineenvaihduntaan sekä tärkeimpiä entsyymejä koodaavat geenit.

20

Tunnetut tryptofaanin tuottomenetelmät perustuvat siihen, että mutatoitu trpE-geeni, joka koodaa tryptofäänille epä-herkkää antranilaattisynteesiä, ekspressoidaan yhdessä trp-operonin muiden geenien kanssa sopivassa autonomisesti 25 replikoituvassa vektorissa. Geenin korkeammasta kopiointilu- vusta johtuen trp-geeni ekspressoituu enemmän ja vastaavasti tryptofaanin aineenvaihdunnan yksittäistä geeniä saadaan suurempi määrä. Tämä johtaa tryptofaanin ylituottoon.

30 Tällaisista menetelmistä on kuvattu esimerkkejä joukolle organismeja: esimerkiksi E. coli'lie: EP 0 293 207, US 4,371,614, Bacillukselle US 4,588,687, corynebakteerille ja brevibakteerille EP 0 338 474. Näissä menetelmissä esiintyy prosessin suorituksessa joukko ongelmia. Siinä voi 35 esiintyä epästabiilisuutta ja vektorin menettämistä tai tuottokannan hidasta kasvua.

106727 2

Patenttijulkaisussa ΕΡ-Α-0 401 735 (hakija: Kyowa Hakko Kogyo Co.) on kuvattu menetelmä tuottaa L-tryptofaania corynebakteeri- tai brevibakteeri-kantojen, jotka sisältävät rekombinanttiplasmideja, avulla. Näissä plasmideissa on 5 geneettiset informaatiot DAHP-syntetaasi-, antranilaattisyn-tetaasi, indoli-3-glyseroli-P-syntetaasi-, tryptofaanisynte-taasi- ja fosfoglyseriaattidehydrogenaasi-entsyymeille. Menetelmässä käytetään feedback-resistenttejä antranilaatti-syntetaasi-alleelej a.

10

Lisäksi tiedetään, että tryptofaanin tuottoa voidaan nostaa kannoissa, joissa on säätämätön tryptofaanin aineenvaihdunta, tuomalla mukaan useampia serA- tai serA, B, C, villi-tyyppisiä geenejä. Chemical Abstracts CA 111 (1989) 15 16 86 88q ja CA 111 (1989) 16 86 89r on siten kuvannut tryp tofaanin tuottamiseen sellaisten Bacillus-kantojen käyttämisen, jotka yliekspressoivat seriiniaineenvaihdunnan (serA, serB ja serC) serA-villityyppi-alleelin tai kaikki villi-tyyppigeenit plasmideissa. WO-A-87/01130:ssa on kuvattu 20 serA-, serB- ja serC-villityyppialleelien käyttö tryptofaanin tuottamiseen E. coli'ssa.

Patenttijulkaisusta EP-A-0 149 539 (hakija: Stauffer Chemical Company) tunnetaan tryptofaanisaannon parantaminen 25 estämällä seriinin hajottaminen soluissa. Tässä patenttihakemuksessa on kuvattu E. coli-K12-mutantteja, joissa on tuhottu seriiniä hajottava entsyymi seriinideaminaasi (sda). Patentissa on kuvattu myös tällaisten kantojen käyttö aminohappojen valmistamiseen. Esimerkissä VIII on kuvattu erään 30 tällaisen kannan hyötykäyttö tryptofaanin ylituottaraiseen antranilaatista. Kantaan, jolla on koskematon seriinideaminaasi, verrattuna parempi tryptofaanin saanto, selitetään eurooppalaisessa patenttihakemuksessa sillä, että niissä mikro-organismeissa, joissa tryptofaanin esivaiheiden varas-35 to on erittäin korkea, tryptofaanin tuoton nopeutta rajoittaa seriini tai kapasiteetti biosyntetisoida seriiniä.

106727 3

Keksinnön tavoitteena oli tuoda esiin mikro-organismeja, jotka tuottavat enemmän tryptofaania, ja menetelmät, jotka mahdollistavat tällaisten mikro-organismien valmistamisen.

5 Tähän tavoitteeseen päästään transformoiduilla E. coli- tai Coryne-bakteerien kannat kannoilla, joille on tunnusomaista, että niillä on säätelemätön tryptofäänin aineenvaihdunta ja feedback-resistentin serA-alleelin kautta säätelemätön seriiniaineenvaihdunta, jolloin serA-alleelin Kj_-arvo serii-10 nille on välillä 0,1 mM ja 50 mM.

Feedback-resistenteillä serA-alleeleilla ymmärretään keksinnön mielessä serA-geenin mutantteja, jotka koodaavat fosfo-glyseraattidehydrogenaasia, jolla on pienempi seriini-herk-15 kyys kuin kyseisen mikro-organismin vastaavalla villityyppi-fosfoglyseraattidehydrogenaasilla.

Keksinnön mukaisen yhdistelmän avulla, jossa on vähintään yksi feedback-resistentti serA-alleeli ja säätelemättömän 20 tryptofaasiaineenvaihdunnan omaava bakteeri, tryptofäänin saanto kasvoi yllättäen jopa 2,6-kertaiseksi verrattuna saantoon, joka voitiin saavuttaa bakteerilla, jolta puuttui feedback-resistentti serA-alleeli, muutoin samanlaisissa viljelyolosuhteissa.

25

Keksinnön mukaisten kantojen suurempi tryptofäänin tuotto on odottamatonta ja yllättävää, sillä feedback-resistentit serA-alleelit vaikuttavat vain korkeassa solunsisäisessä seriinikuvassa (Tosa T, Pizer L.J., 1971, Journal of Bacte-30 riology Voi. 106: 972-982; Winicov J.f Pizer L.J., 1974,

Journal of Biological Chemistry Voi. 249: 1348-1355). Tekniikan tason mukaisesti (esimerkiksi EP-A-0 149 539) mikro-organismeilla, joilla on säätelemätön tryptofäänin aineenvaihdunta, on kuitenkin alhainen seriinikuva. Sen vuoksi 35 tryptofäänin tuoton kasvua ei ole lainkaan odotettavissa tuomalla keksinnön mukaisesti feedback-resistentti serA-alleeli mikro-organismeihin, joissa on säätelemätön trypto- 4 106727 fäänin aineenvaihdunta.

Koska tryptofäänin aineenvaihdunta tapahtuu kaikissa tunnetuissa mikro-organismeissa kuviossa 1 esitettyä aineenvaih-5 duntareittiä ja keksinnön mukaisten kantojen valmistamiseen käytetyt tekniikat ovat periaatteessa tunnettuja ja käytettävissä kaikille mikro-organismeille, keksinnön mukaiset kannat voidaan valmistaa mielivaltaisista mikro-organismeista .

10

Keksinnön mukaisia kantoja voidaan saada siten, että trypto-faanin aineenvaihdunnan säätely lakkautetaan kokonaan tai osittain mielivaltaisessa tryptofaani-prototroofisessa lähtökannassa ja tähän kantaan tuodaan feedback-resistentti 15 serA-alleeli.

Keksinnön mukaisia kantoja voidaan saada myös siten, että tryptofaanin syntetisointikyky palautetaan tryptofaani-auksotrooppisissa lähtökannoissa, jolloin rekonstituoitu 20 tryptofaanin aineenvaihdunta on säätelemätöntä, ja tällaiseen kantaan tuodaan feedback-resistentti serA-alleeli.

Tryptofaanin aineenvaihdunnan säätelyn poistaminen mikro-organismeissa on mahdollista monilla erilaisilla menetelmil-25 lä, jotka ovat tunnettuja tekniikan tasosta.

Eräs mahdollisuus poistaa tryptofaanin aineenvaihdunnan säätely on muuttaa antranilaattisyntetaasi-entsyymiä. Tämä entsyymi katalysoi kaikissa mikro-organismeissa trypto-30 faanispesifisen biosynteesireitin ensimmäistä vaihetta.

Tryptofaani estää sen aktiivisuuden ja se säätelee siten tryptofaanin määrästä riippuen tryptofaani-biosynteesireitin kautta tapahtuvaa metaboliittivirtaa. trpE-geeni koodaa tätä entsyymiä.

Mutatoimalla ja sen jälkeen selektoimalla tryptofaani-proto-troofinen lähtökanta voidaan saada mutatoituja trpE-geenejä, 35 5 106727 jotka koodaavat antralinaattisyntetaaseja, joiden herkkyys tryptofaanin suhteen on pienempi kuin vastaavien villityyp-pisten antralinaattisyntetaasien. Näitä geenejä kutsutaan jäljempänä myös feedback-resistenteiksi trpE-alleeleiksi.

5 Tätä tarkoitusta varten tehdään kyseiselle kannalle mutaation indusoiva käsittely (Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113-185).

10 Käsiteltyä kantaa kasvatetaan ravintoalustassa, joka sisältää vähintään yhtä tryptofaaniantagonistia määrän, joka riittää estämään kannan kasvun. Esimerkkejä sopivista tryp-tofaaniantagonisteista ovat 4-metyylitryptofaani, 5-metyy-litryptofaani, 6-metyylitryptofaani, halogenoidut trypto-15 faanit, tryptatsaani, indoli, indoliakryylihappo.

Resistenteistä klooneista tutkitaan niiden antranilaattisyn- tetaasin herkkyys tryptofäänille. Antranilaattisyntetaasin tryptofaaniherkkyyden määrittämiseen voidaan käyttää jokais- 20 ta menetelmää, joka mahdollistaa tämän entsyymin aktiivisuu- den määrittämisen tryptofaanin läsnäollessa. Esimerkiksi .··.·. korismaatti voidaan saattaa reagoimaan sopivassa puskurisys-• · teemissä glutamiini-reaktiokomponenttiensa kanssa entsyymin “.katalysoimana (Bauerle R. et ai., 1987, Methods in 25’ ’ Enzymology Col. 142: 366-386). Testierästä otetaan kineetti- ···»#.· *· ♦· ♦· ·· ί·: : sesti nayte-eria ja HPLC-analyysin avulla määritetään ant-• · · ’ ranilaatti-reaktiotuotteen muodostunut määrä aikaa vasten. Aikaa vasten muodostunut antranilaattimäärä on suora mitta : antranilaattisyntetaasin aktiviisuudelle. Testi suoritetaan 3QT: tryptofaanin läsnäollessa ja ilman sitä, jotta voitaisiin määrittää testatun antranilaattisyntetaasin herkkyys.

« · · • · • ♦ • · · j ; ··· Lisaksi on mahdollista muodostaa tryptofaanille epaherkkia trpE-alleeleja suoraan geeniteknisesti manipuloimalla.

35*·.· (Bauerle R. et ai., 1987, Methods in Enzymology voi. 142: 366-386). Erilaisten organismien antranilaattisyntetaasin aminohapposekvenssissä on kuvattu lukuisia mutaatioita, 6 106727 jotka johtavat entsyymin pienempään herkkyyteen trypto-faanille. (Esimerkiksi Salmonella: Caliguiri MG., Bauerle R., 1991, J. of Biol. Chem. Voi. 266: 8328 - 8335; brevibak-teeri, corynebakteeri: Matsui K. et ai., 1987, J. Bact. Voi.

5 1 69: 5330· - 5332) .

Menetelmät, joilla on mahdollista aiheuttaa mutaatio DNA-fragmentisssa spesifisessä kohdassa, ovat tunnettuja. Tällaisia menetelmiä on kuvattu mm. seuraavissa julkaisuissa: 10 Sakar G., Sommerauer S. S., 1990, Bio Techniques 8: 404-407, kuvaavat polymeraasiketjureaktiosta riippuvaisia siten directed-mutatointeja;

Ausubel F. M. et ai., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, kuvaavat faagi 15 Ml3:sta riippuvaisia menetelmiä;

Smith M., 1985, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462, kuvaa muita menetelmiä.

DNA-fragmentti, joka sisältää villityyppisen trpE-geenin, 20 rekombinoidaan vektoriin jo kuvatuilla rekombinantti-DNA:n normaaleilla valmistustekniikoilla. Käyttämällä edellä • § · :·,·, mainittuja menetelmiä site-directed-mutatointiin muutetaan « · ! DNA-sekvenssin yhtä tai useampaa nukleotidiä niin, että nyt ", geenin koodaama aminohapposekvenssi vastaa tryptofaanille • < 4 « « 25’ epäherkän antranilaattisyntetaasin aminohapposekvenssejä.

« « * ί·ϊ ί Kuvatuilla tekniikoilla voidaan aiheuttaa mielivaltaisessa M* l.· * trpE-geenissä yksi tai useampi mutaatio, jotka saavat aikaan, että koodatulla antranilaattisyntetaasilla on trypto-: faani-epäherkkyyden aiheuttava aminohapposekvenssi.

3QT:

Keksinnön mukaisessa kannassa on lisäksi toivottavia seuraa- • % » *..* vat ominaisuudet, mutta eivät ehdottoman välttämättömiä: 1 · *;·* puutteellinen tryptofaanirepressori-proteiini, trp-operonin ekspression puutteellinen heikennyssäätely, puutteellinen 35»*·,· tryptofanaasi. Nämä ominaisuudet mahdollistavat keksinnön mukaisessa kannassa yksinkertaisimmin sellaisen lähtökannan valinnan, jossa jo on yksi tai useampi vastaavista ominai- 106727 7 suuksista. Valmistaminen tai valinta voi tapahtua seuraavas-sa mainittujen selektointimenetelmien yhdistelmällä.

Tryptofaanirepressori-proteiini on tryptofaanin biosynteesin 5 vallitseva säätelyproteiini. Tämä proteiini ohjaa yhdessä aporepressorina toimivan tryptofaanin kanssa trp-operoni-geenin ekspressiota. Tätä proteiinia koodaa trpR-geeni. Tryptofaanirepressori-mutantit voidaan selektoida esimerkiksi mutantteina, jotka ovat resistenttejä tryptofaanin anta-10 gonisteille, kuten esimerkiksi 5-metyylitryptofäänille.

Esimerkkejä on kuvattu julkaisussa J. Mol. Biol. 44, 1969, 185-193 tai Genetics 52, 1965, 1303-1316.

trpR-koodaaman proteiinin kontrollin lisäksi trp-operonin 15 alaisena on heikennyskontrolli. Säätelystä vastaa trp-operonin ensimmäisen geenin edellä oleva DNA-alue. Mutaatiot tai deleetiot tällä alueella voivat johtaa säätelyn menettämiseen. Tällaisia mutantteja voidaan selektoida mutantteina, jotka ovat resistenttejä tryptofaaniantagonisteille, kuten 20 5- metyylitryptofäänille. Tällaisia mutaatioita, erityisesti kuitenkin deleetioita, voidaan saada mm. siten, että DNA:n heikennysalueella indusoidaan tämä muutos paikkaspesifisesti site-directed-mutatointimenetelmällä. Jo kuvatun paikkaspesif isen mutatointitekniikan avulla on mahdollista rekombi-25 noida inaktivoitu heikennysalue keksinnön mukaisen kannan kromosomiin luonnonmukaisen heikennysalueen kohtaan.

Tryptofanaasi-entsyymi (tnaA) katalysoi tryptofaanin hajoamista indoliksi, pyruvaatiksi ja ammoniakiksi. Toivottavaa 30 on, että tämä entsyymi on inaktiivinen tryptofaanin tuotto-kannoissa. Kantoja, jotka ovat puutteellisia tämän entsyymin suhteen, voidaan saada siten, että organismit alistetaan mutatoivalle käsittelylle ja mutanteista etsitään sellaiset, jotka eivät enää kykene käyttämään tryptofaania hyödyksi 35 hiili- ja typpilähteinä. Yksityiskohtainen esimerkki on kuvattu julkaisussa J. Bact. 85, 1965, 680-685. Vaihtoehtoisesti on mahdollista aiheuttaa tnaA-geenissä edellä maini- 106727 8 tuilla tekniikoilla paikkaspesifinen deleetio, joka aiheuttaa inaktivoitumisen.

Tryptofäänin tuoton nostamiseen edelleen sopii joukko lähtö-5 kannan lisämutaatioita. Tryptofäänin biosynteesireitin lisäksi on suositeltavaa, että aromaattisten aminohappojen yleinen biosynteesireitti (sikimihapporeitti) on epäherkkä säätelylle. Keksinnön mukaisten kantojen valmistuksen lähtö-kantoina on siten suositeltavaa käyttää kantoja, joilla on 10 säätelylle epäherkkä dehydroarabinoheptulosonihapposyntetaa-si ja joiden tyrosiinirepressio-proteiini (tyrR) on inaktivoitu mutatoimalla tai deletoimalla. Samoin suositeltuja ovat kannat, joiden fenyylialaniini- ja tyrosiiniaineenvaih-dunta on tuhottu. Tällä tavoin mahdollistetaan korismaatti-15 esimolekyylin yksinomainen vuo tryptofääniksi. Tällaisilla kannoilla on esimerkiksi mutaatioita tai deleetioita geeneissä pheA ja/tai tyrA.

Tunnetaan joukko kantoja, jotka ovat säätelemättömiä trypto-20 faanin biosynteesin yksittäisissä tai useammissa vaiheissa tai sikimihapporeitissä ja jotka ylituottavat tryptofaania. Esimerkkejä ovat Bacillus subtilis FermBP-4, FermP1483 (DE 3123001), Brevibacterium flavum ATCC 21427 (US 3,849,251), Corynebacterium glutamicum, ATCC 21842-21851 (US 3,594,279, 25 US 3,849,251), Micrococcus luteus ATCC 21102 (US 3,385,762), E. coli ATCC 31743 (CA 1182409). Nämä kannat sopivat myös lähtökannoiksi keksinnön mukaisten kantojen valmistamiseen. Ne osoittavat, että keksinnön mukaisia tryptofäänin tuotta-jakantoja voidaan saada mitä erilaisimmista organismiryhmis-30 tä.

Kantojen, joissa on säätelemätön tryptofäänin aineenvaihdunta, lisäksi keksinnön mukaisten kantojen valmistamiseen tarvitaan vähintään yksi geeni, joka koodaa fosfoglyseraat-35 tidehydrogenaasia, jolla vastaavaan villityyppi-fosfoglyse-raattidehydrogenaasiin verrattuna on pienempi seriiniherk-kyys.

106727 9

Fosfoglyseraattidehydrogenaasia (PGD) koodaa serA-geeni. Villityyppi-serA-geenin sekvenssi tunnetaan. (Tobey K.L., Grant G.A., 1986, J. Bac. Vol. 261, No. 26: 1279-1283). Myös villityyppi-serA-geenituotteen yliekspressointi plasmidi-5 vektorin kautta on tunnettua (Schuller et ai., 1989, J.

Biol. Chem. Vol. 264: 2645-2648).

Feedback-resistenttien serA-alleelien valmistaminen klassisilla geenisillä menetelmillä on kuvattu julkaisussa: Tosa 10 T., Pizer L.T., 1971, J. Bac. Voi. 106, No. 3: 972-982.

Selektointi tapahtui tällöin käyttämällä hyväksi mutanttien resistenttiyttä seriinihydroksamaatti-seriinianalogia vastaan. Tässä kirjallisuuslähteessä ei mutatointia ole lähemmin karakterisoitu; mutaation vaikutusta aineenvaihduntaan 15 ei tutkittu.

Feedback-resistenttejä serA-alleeleja saadaan esimerkiksi myös siten, että mikro-organismi alistetaan mutatoinnille. Mutageeninä tulevat kysymykseen UV-valo ja kaikki kemialli-20 set mutageenit, kuten esimerkiksi etyylimetaanisulfonaatti tai N-metyyli-N1-nitro-N-nitrosoguanidiini. Valitun mutagee-nin annostelu ja altistusaika sille määritetään tavanomaisilla menetelmillä (Miller J.H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, USA: 113-25 143) .

Mutageenillä käsitellyt organismipopulaatiot selektoidaan serA-geenejä, jotka koodaavat seriinille epäherkkiä fosfo-glyseraattidehydrogenaaseja, sisältävien kloonien suhteen.

30 Mutageenilla käsiteltyä populaatiota inkuboidaan esimerkiksi kiinteällä kasvualustalla, joka sisältää niin paljon serii-nihydroksamaattia, että tämä estää ei-resistenttien baktee-reiden kasvun. Resistenteistä klooneista testataan niiden fosfoglyseraattidehydrogenaasin seriiniherkkyys. Tämän 35 menetelmän eräs esimerkkimäinen suoritusmuoto on kuvattu julkaisussa Tosa and Pfizer, 1971, J. Bact. 100, 3: 972-982.

10 106727

Seriinille epäherkkää fosfoglyseraattidehydrogenaasia koo-daavia alleeleja voidaan saada myös "geenitekniikoilla".

PGD:n alue, jolla seriinin säätely tapahtuu, on proteiinin 5 C-terminaalisella alueella. Yksittäisten tai useampien aminohappojen insertioita, substituutioita tai deleetioita tehdään sen vuoksi mieluummin PGD-proteiinin C-terminaali-sessa 25 %:ssa, erityisen mielellään PGD-proteiinin 50 C— terminaalisessa aminohapossa. Nämä pienentävät PGD:n herk-10 kyyttä seriiniä vastaan.

Tällaisia PGD-entsyymejä koodaavat alleelit saadaan siten, että muutetaan PGD:n mainittua C-terminaalista aluetta koodaavan serA-geenin 3'-aluetta. Tätä varten kloonausvekto-15 riin rekombinoidaan mutatoimaton serA-geeni käyttämällä ammattimiehen rekombinantti-DNA:n valmistamiseen tuntemia tekniikoita, kuten restriktiokäsittelemällä, ligatoimalla ja transformoimalla (Maniatis T., Fritsch E.F. ja Sambrook J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 1982, Cold Spring 20 Harbor Laboratory). Rakennegeenin 3'-alueeseen voidaan tehdä ,7, spesifisiä muutoksia esimerkiksi site-directed-mutatointi- t i t “* - tekniikan avulla.

i * t t t < * I *

Taulukossa 1 on annettu C-terminaalisen aminohapposekvenssin 25’ * antamisen kautta esimerkkejä seriinille epäherkistä PGD-1 · · ».i i entsyymeistä, jotka sopivat ekspressointiin tryptofaaniai-» ♦ ♦ V ’ neenvaihdunnaltaan säätelemättömissä mikro-organismeissa.

Esitettyyn alueeseen asti entsyymien proteiinisekvenssit } eivät eroa villityypin sekvenssistä.

3QT: * serA-alleelien geenituotteiden PGD-aktiivisuuden ja se- < · t :tml riiniherkkyyden tutkimiseen käytettiin seuraavia testejä: • * * · f · * 4 PGD-aktiivisuus määritettiin osoittamalla entsyymin reaktio

A

3$\· eteenpäin tai paluureaktio J.C. Mc Kitrick'in ja J.P.

4 ·

Lewis'in menetelmällä, 1980, J. Bact. 141: 235-245. Menetelmässä entsyymin aktiivisuus mitataan ilman seriiniä ja 11 106727 seriinin eri konsentraatioilla. Mainittu testi sopii kaikkien fosfoglyseraattidehydrogenaasien seriiniherkkyyden määrittämiseen. PGD-aktiivisuuden mittaamiseen voidaan myös käyttää kaikkia muitakin menetelmiä.

5

Entsyymin seriiniherkkyyttä mittaa K^-arvo, so. se seriinin konsentraatio, joka estää entsyymin aktiivisuutta 50 %. Taulukossa 1 on annettu useiden feedback-resistenttien serA-alleelien sekä villityyppi-serA-geenin (serAWT) K-j-arvot ja 10 C-terminaaliset aminohapposekvenssit.

» « i «ti • I f « I f «

< » I

» » • « f I i I « I » t tilli « t

t 1 III

r · · mi · »« « I I · • a » • i 4 « · f · · M · « «•f

I · I

Ψ 4 41 I I · 4 • · • ♦ • · • · «tf « 1 « I 1 9 «

It I 1 * ·· 12 106727 n TT in

O O O O O

2 2 2 2 2

D Q Q Q Q

H M H H H

a α σ σ σ ω ta ta w ta to to to to to 2

£ (M

\ O (N CO

•H -- » - O O

!*5 o o n in o i—i

>i I > I I

•J t-3 >4 O I

J iJ J O I

4-j K K K K I

ω < <d < <£ I

w k 2 a 2 a

Ö M H M H H

.*! O O O O O

<1> Λ Λ Λ Οι Οι U t-Ί Η 1—I Η Η Ο < < < < <, Β< « 2; « hi « 2 2 2 2 2 2 ο o' σ σ σ σ •ä j j j j §<<<<<; rt « Z Z Z 2 _p w ta m ta ϋ $ < < < < < “>>>>> jj ο a a o a ^ w ta ta ta a 2 o Q o O o 5 < < < < <

S W ta W w H

g M H M H M

S O Q Q Q O

... y M M M H M

**" q j? >> P* > • ^ > > > > > ·· · e-> : ' : g * * > >4 > * * .¾ o o o o o .: ^ θ' σ σ o' σ ·:··· h < < < < < η w to to to to

·· f* H E-1 E-1 H H

::: , α a o' α σ • · · · _j«

.·.'·. u ^ J O J .J

·.* · <D >< X X > > W O' O' O' O' O' < < < < < Ö , ::: ·η m h h h h

··· · 3 2 Z Z Z Z

.*:·. -p 1 1 < < 1

. . . -H

0 1 1 a « 1 ... -p · 1 to to 1 : · · ui 1 1 u u 1 • . -P > > > > > ... 3 : : ·· 200000 ··· <H O' O' O' O' O' • ta ω ta to ta .*.0 < < < < < : ·· --------- . . ·Ζ 0 in : ^ o m . . rH fP ID r-l P Z in tH t—t r-i rt < E-* < < < < U P P P p g ω a 0 0 to to to to to 106727 13

Keksinnön mukaisten kantojen valmistamiseen sopivat mieluummin ja yllättäen serA-alleelit, joiden K^arvo on välillä 100 μΜ ja 50 mM seriiniä.

5 PGD-proteiinien ekspressoimiseen keksinnön mukaisessa kannassa voidaan käyttää jokaista rekombinanttivektoria, joka ekspressoi seriinille epäherkät serA-alleelit. Keksinnön mukaisten kantojen valmistamiseen sopiva rekombinantti vektori sisältää vähintään yhden serA-geenin, joka koodaa 10 PGD-entsyymiä, jolla on villityyppiin verrattuna alempi herkkyys seriinille, ja vektoriosan, joka voi replikoitua autonomisesti vastaanottavassa kannassa.

Vektoreista, jotka voivat replikoitua autonomisesti E.

15 coli'ssa, esimerkkejä on annettu kirjassa: Pouwels P.H., Enger-Valk B.e., Brammar W.J. 1985, Cloning Vectors,

Elsevier, Amsterdam.

Tällaisia vektoreita ovat mm.: - Plasmidit, joilla on suuri kopioluku, kuten esimerkiksi 20 pBR322; pUC12, - Plasmidit, joilla on keskisuuri kopioluku, kuten esimer-kiksi pACYCI84,177, • · - Plasmidit, joilla on alhainen kopioluku, kuten esimerkiksi « pSC101, 25 . - Faagivektorit, kuten esimerkiksi M13, λ-vektorit.

• · · • · · * · · · ··* ·* * Vastaavia vektoreita on kuvattu hyvin monille bakteereille (esimerkiksi EP 0 401 735 corynebakteereille ja brevibaktee- • · :.· · reille tai abstraktissa CA 111 (1989) 168688q).

3ψ:

Hyvin sopivia ovat vektorit, joilla on keskimääräinen - • · alhainen kopioluku; erityisen hyvänä pidettyjä ovat vekto- *Γ rit, joissa on p15A-replikoni, kuten pACYC184 (ATCC37033) Γ’·· tai pACYCI77 (ATCC37031 ).

35%: • ·

Kirjallisuudessa on kuvattu suuri määrä vektoreita muille bakteereille. (Pouwels et ai., 1985, Cloning Vectors, 1 4 106727

Elsevier Science Publishers, Amsterdam).

Sopivia rekombinanttivektoreita voidaan valmistaa rekom-binantti-DNA:n normaaleilla valmistustekniikoilla. Näitä 5 tekniikoita on perusteellisesti esitetty esimerkiksi julkaisuissa: Maniatis T., Fritsch E.F. ja Sambrook J., 1982, Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, USA tai Ausubel F.M. et al, 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 10 USA.

Rekombinanttivektoreiden valmistaminen on esimerkiksi mahdollista siten, että lahjoittajaorganismin, joka sisältää kromosomissa tai rekombinanttivektorissa serA-alleelin, joka 15 koodaa seriinille epäherkkää PGD:a, DNA pilkotaan restrik-tioentsyymeillä. Pilkottu DNA ligatoidaan tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi käyttämällä T4-DNA-ligaasientsyy-miä, mahdollisesti restriktioentsyymeillä linearisoituun vektorimolekyyliin. Ligatointiseoksen avulla transformoidaan 20 vastaanottajakannat, joilla on säätelemätön tryptofaanin :T: aineenvaihdunta, tunnetuilla menetelmillä, kuten kalsiumklo-ridishokilla tai elektroporaation avulla. Haluttuja serA-alleeleja sisältävät vektorit voidaan saada vastaanottaja- kannoissa esimerkiksi edellä mainituilla menetelmillä, kuten 4 · 25 . selektoimalla antibiootti-resistenttiyden suhteen tai komp-lementoimalla serA-mutaatiot.

» : :

Keksinnön mukaisten kantojen eräässä toisessa suoritusmuo- • · · dossa ovat serA-alleelit integroituneet kromosomiin yksit-* * * ·· ·· ·· 30·’ ·’ täiskopioina. Tämä voidaan saada aikaan toisaalta siten, • ,, „ että edellä kuvatut mutatointi- ja selektointistrategiat • · kohdistetaan suoraan tryptofaanin suhteen säätelemättömään « t T lähtökantaan. Toisaalta on myös mahdollista integroida i ’·· rekombinanttivektoreissa olevat serA-alleelit tuottokannan 35·;* kromosomiin. Tällaista integrointia varten tunnetaan monia menetelmiä. Näitä tekniikoita on kuvattu seuraavissa julkaisuissa: 1 5 106727

Lambda-faagin välittämä integrointi: Balakrishnan ja Back-mann, 1988, Gene 67: 97-103; Simons R.W. et ai., 1987, Gene 53: 85-89; recD:sta riippuvainen geenin korvaaminen: Shervell et ai., 5 1987, j: Bact. 141: 235-245;

Muita menetelmiä: Silhavy et ai., 1988, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory.

Keksinnön mukaisia kantoja fermentoitaessa kävi täysin 10 yllättäen ilmi, että korkeimmat tryptofaanisaannot saatiin kannoilla, jotka sisälsivät feedback-resistentin serA-allee-lin, jonka K^arvo seriinille oli välillä 100 μΜ ja 50 mM ja jolla oli säätelemätön tryptofaanin aineenvaihdunta ja jotka sisälsivät trpE-alleelin, jonka K^-arvo tryptofaanille oli 15 välillä 0,1 mM ja 20 mM.

Seuraavat esimerkit selventävät lähemmin keksintöä:

Esimerkki 1: 20 :*·*: Feedback-resistenttien trpE—alleelien seulonta ja näiden :v; alleelien integrointi kromosomiin « · » · ·

Feedback-resistenttien trpE-alleelien etsimiseen käytettiin « · 2.5 . tryptofaani-analogina 5-metyylitryptofaania. Mutageenisena J · · aineena oli N-metyyli-N'-nitro-N-nitroso-guanidiini (NG).

*·’ * Käytetty lähtökanta oli E.coli K12 YMC9 ATCC33927. Mutatoin-ti suoritettiin Miller'in antamien tietojen mukaisesti • » : (Miller J. H., 1972, Experiments in Molecular Genetics. Cold • · · 3,(J ί Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. : 125- :·*.·. 129).

• · • · « · · I :

Noin 2 x 109 YMC9-solua, jotka oli otettu LB:ssa kasvatetun • · • *·· viljelmän eksponentiaalisesta kasvuvaiheesta, inkuboitiin 30 3,5-: minuuttia 37°C:ssa 4 ml:ssa 0,1 M natriumsitraatti-puskuria, pH 5,5, yhdessä 50 pg/ml NG:n kanssa. Sen jälkeen, kun oli pesty kaksi kertaa 0,1 M fosfaattipuskurilla, pH 7,0, 0,1 ml 106727 16 soluja inkuboitiin ravistelemalla yön yli 37°C:ssa LBrssa.

Sen jälkeen levitettiin 0,1 ml eri laimennuksista (10-3, 10~ 4, 10-5 0,9 % NaCl:ssa) saatuja soluja minimialustamaljoille, joissa oli 100 ug/ml 5-metyylitryptofaania. 5-Metyylitrypto-5 fäänin lisäksi minimialustan koostumus oli: 6 g/1 glukoosi, 5 mg/1 vitamiini B1 , 3 g/1 KH2P04, 12 g/1 K2HP04, 0,3 g/1 MgS04 x 7 H20, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NH4)2S04, 14,7 mg/l CaCl2 x 2H20, 2 mg/1 FeS04 x 7H20, 1 g/1 Na3-sitraatti ja 15 g/1 agar. 24 - 48 tunnin kuluttua 37°C:ssa siirrostettiin 5-10 metyylitryptofäänin resistentit kloonit ja hajotettiin edellä mainituille maljoille.

Saatujen mutanttien karakterisointia varten määritettiin trpE-geenituotteen I^-arvo tryptofaanille (Bauerle R. et 15 ai., 1987, Methods in Enzymology Voi. 142: 366-386). Mutan-tit jaettiin tällöin kahteen luokkaan. Luokan 1 mutanteilla oli feedback-resistenttejä antranilaattisyntetaaseja. Luokan 2 mutanteilla oli antranilaattisyntetaasi-aktiivisuudeltaan kohonneita entsyymejä, mutta muuttumaton Ki-arvo.

20

Molekyylitason karakterisointia varten kloonattiin eri ··.·. mutanttien kyseiset DNA-alueet ja sekvensoitiin. Tätä tar- J koitusta varten eristettiin kyseiset kromosomaaliset DNA:t < ", ja pilkottiin yhdessä erässä restriktioentsyymeillä Nhel ja « « 2.5 . Clal. Fragmentit, joiden koko oli noin 5 kb, eristettiin ja J J * ·;· : ligatoitiin pBR322:n 4158 bp suuren Nhel/Clal-fragmentin *·* * kanssa. Ligatointierä transformoitiin E.coli KB 862:n trpE- kannassa (DSM 7196). Selektoidut kloonit olivat klooneja, · jotka kykenivät kasvamaan minimialustalla ilman tryptofaa- aö:': nia. Komplementoivat plasmidit sisälsivät kaikki yhden 5 kb

Nhel/Clal-fragmentin. trpE- ja trpD-geenien lisäksi tämä 5 kb Nhel/Clal-fragmentti sisältää myös DNA-alueita » : ....

*;* trpE:sta myötävirtaan (noin 0,8 kb) ja vastavirtaan trpD f (noin 1 kb). Taulukossa 2 on listattu 4 luokan 1 mutantin 3*5.: aminohappoerot ja Ki-arvot. Alueiden osalta, jotka eivät ole esitetty, mutanttien sekvenssit täsmäävät villityypin sekvenssin kanssa.

17 106727 νο r- oo σι o (—t o o o b o 2 ,2 2 2 2 D Q O Q a

H H M H H

a o σ o σ

W W W W W

to to to to to f~t

2 o tH O

£--- \ o o r> in in •H r—f r—t 2 Λ 4-> Ή ω w c Φ > to a> a w aw to w

o Q

ft

ft Q

cd w

rC CO

a Q

ε S

< to w c φ w

•H W

1-1 t-3 • . φ *:· ^ < ? ft p« o ? #v ^ r5 * ♦ : -p fi

c J

( · y /1) •® S' *-< «-Μ

-H

• · · Π : 2 g *·» (ö £/ : ; ij ft to to • 3 2

S

* · · — - ------ ___ —. - _ * · · • » • · t **· ·* ...*(N E-t • 2 o in vo co o

• .. M W W W W W

' M ft ft ft a ft : 3 >4 £t £i V-i u

rH j-> JJ 4-> -P JJ

3 tti EH

106727 18

Luokan 2 mutanttien sekvenssianalyysi osoitti, että mutaatioita oli joko trp-promoottorin operaattori-alueella tai trp-leader-peptidiä koodaavalla DNA-alueella. AtrpL1:lla tai AtrpL2:lla merkityissä mutaatioissa on leader—peptidiä 5 koodaavalla DNA-alueella 136 bp tai 110 bp suuruinen delee-tio. AtrpLl-mutaatiolla deleetio käsittää alueen nukleoti-diasemasta 33 asemaan 168, ja AtrpL2-mutaatiolla alueen nukleotidiasemasta 11 asemaan 120 AC-numerolla V00372 EMBL-tietopankkiin tallennetussa sekvenssissä.

10

Jotta saataisiin voimakkaampi feedback-resistenttien trpE-alleelien ekspressoituminen, molemmat mutanttiluokat yhdistettiin. Tähän tarkoitukseen käytettiin luokan 2 AtrplLl-mutaatiota. Kuviossa 2 on esitetty kaaviollisesti AtrpLl-15 mutaation sijainti (luokka 2) ja trpEO-, trpE5-, trpE6- ja trpE8-mutaatioiden sijainnit (luokka 1).

Plasmidista pAtrpL (kuvio 2) eristettiin 1,6 kb Nrul-frag-mentti, jossa on AtrpLI-mutaatio, ja vaihdettiin pEO-, pE5-, 20 pE6- tai pE8-plasmidien vastaavaan villityyppi-NruI-frag- « I t : : menttiinn (kuvio 2). Saaduille plasmideille annettiin nimik- si pIEO, pIE5, pIE6 tai pIE8 ja näitä käytettiin kromosomaa-liseen integrointiin käyttämällä homologista rekombinaa- • i tiota. Tätä varten mainituista plasmideista eristettiin esimerkissä 2 kuvatulla tavalla low melting-agaroosista noin **!.] 5 kb suuruinen kromosomaalinen Nhel/Clal—fragmentti ja transformoitiin lineaarisessa muodossa recD-kantaan PD106 [AtrpLDl02]. Käytetty transformointimenetelmä oli Cohen'in ·"·: ! et ai. CaCl?-menetelmä, 1972, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: iä: 211 0-2114. Kanta PD106 tallennettiin Budapestin sopimuksen

mukaisesti 28.7.1992 numerolla 7195 (DSM 7195) DSM

♦ · j···. (Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen)—kokoelmaan. Selek-·* toidut kloonit olivat klooneja, jotka kykenivät kasvamaan : " minimialustalla ilman tryptofaania ja jotka olivat ampisil-ä5*; liini-herkkiä, so. plasmidittomia. trpE—alleelit, jotka koodaavat eri feedback-resistenttejä trpE-entsyymejä ja jotka kulloinkin ovat kombinoituja ytrpLI-mutaation kanssa, 106727 19 siirrettiin Pl-transduktion avulla (Miller J.H., 1972 Experiments in Molecular Genetics. Cold Spring Harbor, N.Y.: 201-205) kyseisistä kannoista KB862-kantaan. Kantaa KB862 tallennettiin 28.7.1992 Budapestin sopimuksen mukaisesti 5 numerolla 7196 (DSM 7196) DSM-kokoelmaan (Deutschen Sammlung fiir Mikroorganismen). Selektoinnin perusteena käytettiin kasvua tryptofaania sisältämättömällä minimialustalla. Saaduille kannoille annettiin nimiksi PD103 (trpEO).

KB862(trpE5), SV164 (trpE8) ja SV163 (trpE6).

10

Esimerkki 2:

Seriinille epäherkkiä fosfoglyseraattidehydrogenaaseja koodaavien serA-geenien valmistaminen 15 serA-villityyppi-geeni kloonattiin plasmidivektoriin pUC18 E. coli-kannasta E. coli B (ATCC 23226).

Tämän kannan kromosomaalisen DNA:n saamista varten sitä 20 kasvatettiin yön yli 37°C:ssa Luria-liemessä. Bakteerisolut : : : poistettiin sentrifugoimalla (4000 g). Solut lyysattiin ja DNA puhdistettiin julkaisussa: Ausubel et ai., 1987, • · • j. 2.4.1. - 2.4.2, Current Protocols in Molecular Biology, « « .,..: Greene Publishing Associates, kuvatulla protokollalla. Saatu 25·, DNA-määrä määritettiin spektrofotometrisesti aallonpituudel-• · ♦ la 260 nm. Saannot olivat 600 ug/100 ml.

t : : 1 pg kromosomaalista DNA:a pilkottiin SphI-restriktioent-: syymillä (Boehringer Mannheim GmbH) valmistajan antamissa ««· !iÖ * olosuhteissa. Valmistajan antamissa olosuhteissa ligitoitiin T4-ligaasi-entsyymillä (Boehringer Mannheim GmbH) noin 3 μg • · ,···. tätä fragmenttiseosta ja 0,2 μg myös Sphlrlla pilkottua • · ·* autonomisesti replikoituvaa pUC1 8-plasmidivektoria : ** (Boehringer Mannheim GmbH). Ligatointiseoksen avulla transsi formoitiin serA-mutantti PC1523 (CGSC#:5411;) (CGSC: E. coli Genetic Stock Center, Department of Biology 255 OML, Yale University, Postbox 6666, New Haven, CT, USA). Transformoin- 106727 20 timenetelmänä oli Cohen1 in et ai. CaCl-menetelmä, 1972,

Proc. Natl. Acad. Sei USA 69: 2110-2114. Transformoidut bakteerit maljattiin seriiniä sisältämättömälle minimialus-talle. Ilman seriiniä kasvaneet kloonit sisälsivät E. coli'n 5 serA-geenin 3,5 kb suuruisessa SphI-fragmentissa. Villityyp-pi-SerA-geenin sekvenssi on annettu kuviossa 3 (SEQ ID NO: 13; SEQ ID NO: 14). Rekombinanttivektorille, jossa oli serA-geeni, annettiin nimeksi pGC3 (kuvio 4).

10 serA-alleeli serA5 valmistettiin siten, että pGC3-plasmidi pilkottiin restriktioentsyymeillä SlI ja Kpnl (Boehringer Mannheim GmbH) valmistajan antamien tietojen mukaisesti. Saadut fragmentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesin avulla. Geelistä puhdistettiin 2,0 kb suuruinen Sall-Kpnl-15 fragmentti, joka sisältää täydellisen serA-geenin aina 8 C— terminaaliseen kodoniin asti. Tähän käytettiin elektroforeesia "low-melting"-agaroosilla (Boehringer Mannheim GmbH), jolloin DNA voitiin saada talteen vain yksinkertaisesti sulattamalla agaroosi. Valmistajan antamien tietojen mukai-20 sesti ligitoitiin T4-ligaasilla (Boehringer Mannheim GmbH) 0,2 pg tätä fragmenttia ja yhtä suuret moolimäärät Hindlll/ Sällillä pilkottua pUC18:a ja synteettisesti valmistettua, kaksisäikeistä oligonukleotidiä. Tämän oligonukleotidin ♦ 4 nukleotidisekvenssi on seuraava: •25 i.:; . 5' 3' • · ·

: C ATT CGC GCC CGT CTG CTG TAA TA

CTAGG TAA GCG CGG GCA GAC GAC ATT ATT CGA SEQ ID NO: 11 : 3' 5' • · · · • · ·

«.3Q

Tämä oligonukleotidi korvaa serA-geenin 8 viimeisestä C- .... terminaalisesta kodonista 7. Kahdeksannen kodonin asemesta * · mukaan laitetaan pysäytystripletti TAA. Tämän serA-geenin * · • · : ·· koodaama fosfoglyseraattidehydrogenaasi on siten C-terminaa-:.,3β lissa yhden aminohapon verran lyhyempi. Mutatoidun PGD:n aminohapposekvenssi on annettu taulukossa 1 (serA5). Rekom-binanttiplasmidille annettiin nimeksi pGH5 (kuvio 5). serA- 21 106727 mutantti PC1523 transformoitiin tällä ligatointierällä.

serA—alleeli serAl508 valmistettiin seuraavasti. pGC3-plas-midi pilkottiin valmistajan antamien tietojen mukaisesti 5 Sphl/Sall:lla (Boehringer Mannheim GmbH). Täydellisen serA-geenin sisältävä 3 kb-fragmentti puhdistettiin geelielektro-foreettisesti ja ligatoitiin Sphl/Sall:11a pilkotun pUC18-vektorin kanssa. Saadulle plasmidille annettiin nimeksi PKB1321 (kuvio 6).

10

Plasmidia pKBl321 inkuboitiin restriktioendonukleaasin Hindll (Boehringer Mannheim GmbH) kanssa olosuhteissa, jotka mahdollistavat osittaisen pilkkomisen (0,05 entsyymiyksikköä per 1 pg DNA 10 minuuttia, reaktion muut olosuhteet valmis-15 tajän antamien tietojen mukaisesti). Näin syntyy mm. frag menttien, jotka on pilkottu Hinduilla serA-geenin asemassa 1793, jae. Tähän kohtaan liitetään ligatoimalla DNA-linkke-ri, jossa on katkaisukohta Xbalille. DNA-linkkerin sekvenssi oli seuraava: 20 • i « 5' 3

Ϊ'Ί TGC TCT AGA GCA

·· ACG AGA TCT CGT SEQ ID N0: 12 « < ·«*·* 2 ^ 5 * 25 * • · i * * • ♦ · • · · · • ·· *·* * Insertoimalla saadaan PGD, joka sisältää tässä kohdassa 4 ylimääräistä aminohappoa. Niiden sekvenssi on annettu taulu- ♦ · »· ·· ·· j kossa 1 . Taman insertin sisältämälle plasmidille annettiin nimeksi pKB 1508 (kuvio 7). Se transformoitiin serA-mutant- tiin PC1523. ·' • ♦ ♦ • · ♦ · • ·· * : *;· serA—alleeli serA11 valmistettiin siten, että plasmidi pGH5 • · j '.. pilkottiin valmistajan antamien tietojen mukaisesti Sällillä :*3.$ ja Kpnlilla (Boehringer Mannheim GmbH) ja fragmenttiseoksen 2,8 kb suuruinen fragmentti puhdistettiin geelielektroforee-sin avulla "low-melting"-agaroosista. Tämä fragmentti sisäl- 106727 22 tää vektoriosan pUC18:sta ja C-terminaalisen alueen serA5:sta. Myös plasmidi pKB 1508 pilkottiin Sall/Kpnl:11a. 2,0 kb suuruinen DNA-fragmentti eluoitiin low-melting-aga-roosigeelistä. Tämä fragmentti sisältää serA-alleelin se-5 rAl508 yhdessä insertiomutaation kanssa, mutta siltä puuttuu kuitenkin 8 C-terminaalista kodonia. Molemmat fragmentit ligitoidaan keskenään ja tällä transformoidaan serA-mutantti PC1523. Saadulle rekombinanttiplasmidille annettiin nimeksi pGH11 (kuvio 8). Koodatussa fosfoglyseraattidehydrogenaasis-10 sa on yhdistetty serA1508:n insertiomutaatio serA5:n delee-tiomutaation kanssa. Taulukossa 1 on annettu mutaatioiden alue koodattuna aminohapposekvenssinä.

Mutatoitujen serA-alleelien ekspressoimiseksi tuottokannois-15 sa ne kloonattiin uudelleen pACYC 184-vektoriin (ATCC37033), jonka kopioluku on kohtalainen. Tätä varten eristettiin pGH5-plasmidi ja Sall/Hindlll:11a pilkottu plasmidi pGH11 ja kulloinkin noin 2 kb suuri, serA-alleeli serA5 ja serA11:n sisältävät DNA-fragmentit "low-melting"-agaroosigeeleistä.

20 Fragmentit käsiteltiin eri panoksissa E. coli'n DNA-polyme-' raasi I:n Klenow'in fragmentilla (Boehringer Mannheim GmbH) «t « • valmistajan ohjeiden mukaisesti, jotta restriktioentsyymien *!' 5'-ylipitkät leikkauspäät voitaisiin muuntaa tasapäiksi.

·:··; Tätä varten sekoitettiin 1 pg kutakin fragmenttia 20 μΐ J5". reaktiopanoksessa 5 U Klenow'in entsyymin, 0,5 mM dATP:n, * · · · dGTPrn, dTTP:n ja dCTP:n kanssa ja valmistajan suositteleman puskurin kanssa ja inkuboitiin 15 minuuttia 30°C:ssa.

♦ · • · » : Tasapäiset DNA-fragmentit ligitoitiin kulloinkin PvuII:lla 30’ pilkotun pACYC 184-vektorin kanssa. Ligatointierien avulla :*·*: transformoitiin serA-mutantti PC1523. Komplementoivat plas- i”*; midit saivat niemet pGH5/lI tai pGHil/lI (kuvio 9, kuvio ·· ♦ 10). Plasmidi pKB1508 pilkottiin Sall/Sphl:lla. serA-allee-\ Iin serAl508 sisältävä 3,0 kb fragmentti puhdistettiin *35* geelielektroforeesin avulla. Fragmentti, joka oli edellä kuvatulla tavalla tehty tasapäiseksi, ligitoitiin PvuIIrlla pilkotun pACYC184:n kanssa ja ligatointierä transformoitiin 106727 23 E. coli PC1523:ssa. Komplementoivat plasmidit saivat nimen pKB1508/11 (kuvio 11).

Plasmidien pGH5/lI (serA5), pGHl1/lI (serAll) ja pKB 1508/II 5 avulla transformoitiin kannat PD103 (trpEO), KB862 (trpE5), SV164 (trpE8), SV163 (trpE6).

Esimerkki 3: 10 Kromosomaalisesti koodatun, feedback—resistentin serA5— alleelin rakentaminen rekombinantti—λ—profaagin avulla

Lambdan kromosomaaliseen "kiinnityskohtaan" (att λ) varten serA5-alleeli kloonattiin plasmidiin pRS551 (Simons et ai., 15 1987, Gene 53: 85-96). Tätä varten eristettiin pGH5-plasmi- dista noin 2 kb suuruinen serA5:n sisältävä Hindlll/Sall-fragmentti. 5'-ylipitkät päät täytettiin valmistajan antamien tietojen mukaisesti DNA-polymeraasi I:n Klenow'in fragmentilla (Boehringer Mannheim GmbH). EcoRI-linkkereiden 20 (Maniatis et ai., 1982, Molecular Cloning: A Laboratory <*« : Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, IV N.Y.: 396-397) liittämisen jälkeen 2 kb fragmentti ligitoi-tiin EcoRI:lla pilkottuun pRS551-vektoriin. Valittiin yksi ·:·: rekombinanttiplasmidi ja tälle annettiin nimeksi pRS5.

··· ·

Valmistamalla pRS5:n sisältävän recA+—kannan (esim. YMC9 • ♦ · ATCC33927) maljalysaatti ARS45-faagien avulla tehtiin in • · vivo homologisen rekombinaation kautta heterogeeninen λ- • · · · .· ·· *”.* lysaatti, joka sisälsi ARS45-faagien Iisaksi myös serA5:n • · · 3[0* sisältäviä rekombinantti-lRS45-johdannaisia (Simons et ai., :*·*: 1987, Gene 53: 85-96).

• · ··· i : «..

./ Rekombinantti-XRS45-johdannaisten selektoimiseen käytettiin “ serA-kanta PC1523 (CGSC#:5421 ). Tätä varten PC1523 infektoi-• · · *·3£ tiin heterogeenisellä λ-lysaatilla (kts. edellä) ja sen jälkeen maljättiin kanamysiiniä sisältäville (25 mg/1) LB-maljoille. Saaduista lysogeenisistä, kanamysiini—resisten-

V

106727 24 teistä klooneista testattiin sen jälkeen niiden kyky kasvaa seriiniä sisältämättömillä minimialustamaljoilla. Valittiin yksi seriini-prototroofinen klooni ja tätä käytettiin homogeenisen serA5-l-lysaatin valmistamiseen (induktoimalla 5 UV:11a:'Simons et ai., 1987, Gene 53: 85-96).

Tryptofaanin tuottokanta SV164 infektoitiin tällä homogeenisella serA5-l-lysaatilla. Saatu kanta SV164 attl::serA5 fermentoitiin esimerkissä 4 kuvatulla tavalla. Kyseiset 10 alustat sisälsivät tetrasykliinin asemesta selektointiainee-na kulloinkin 25 mg/1 kanamysiiniä.

Tryptofaanisaannot olivat 12,5 g/1 verrattuna saman kannan, jossa ei ollut serA5:a, saantoon 3,5 g/1.

15

Esimerkki 4:

Tryptofaanin tuotto corynebakteereilla 20 pGH5-plasmidi pilkotaan restriktioentsyymeillä Sali ja V : Hindlll (Boehringer Mannheim GmbH) ja "low melting"-aga- i « ; roosigeelistä eristetään 2 kb suuruinen, serA5-geenin sisäl- tävä DNA-fragmentti. DNA-fragmentti tehdään esimerkissä 2 ·;" kuvatulla tavalla tasapäiseksi E. coli'sta saadun DNA-poly- i2§'; meraasi I:n Klenow'in fragmentin (Boehringer Mannheim GmbH) ··· · avulla. pWST1-vektori pilkotaan Smal-restriktioentsyymillä « tt (Boehringer) ja ligitoidaan tasapäisen DNA-fragmentin kans- j . sa. pWST1-vektori on E. coli/corynebakteeri-sukkulavektori * · * ,, „ ja se voi replikoitua seka E. coli ssa että corynebaktee- J » « 3*0’ reissä. Tämän vektorin corynebakteeri-replikoni on Γ·*: Corynebakterium glutamicum ATCC 19223-kannasta. pWST1-vekto- Γ**: rin valmistaminen on kuvattu US-A-4,965, 197:ssa. Ligatoin- • · · tierän avulla transformoidaan E. coli-kanta PC1523. Komple-*. ,* mentoiville plasmideille annetaan nimiksi pGH5/lII (kuvio ’'βύ 12).

Plasmidin pGH5/lII avulla transformoidaan tryptofaania 106727 25 tuottava Corynebacterium glutamicum ATCC21851. Transformaatio tapahtuu yksityiskohtaisesti julkaisussa: Wolf H. et ai., 1989, Appi. Microbiol. Biotechnol. 30: 283-289, kuvatun elektroforaatio-tekniikan avulla. Rekombinantti-plasmidin 5 pGH5/III sisältävät kloonit selektoidaan plasmidin koodaavan kanamysiiniresistenttiyden avulla agarmaljoilla, joissa on 25 mg/1 kanamysiiniä.

pGC3-plasmidi pilkotaan restriktioentsyymeillä Sphl ja Sali. 10 serA-villityyppi-alleelin sisältämä 3 kb DNA-fragmentti puhdistetaan ja ligitoidaan edellä kuvatulla tavalla pWSTl-vektoriin. Saadun vektorin pGC3/I (kuvio 13) avulla transformoidaan Corynebacterium glutanicum ATCC21851.

15 Analogisesti valmistetaan Corynebacterium glutamicum ATCC21581-kanta, joka sisältää plasmidissa serA-alleelin 1455 .

Kanta, joka sisältää plasmidissa serA5-alleelin, tuottaa 20 fermentoitaessa korkeimmat tryptofaani-saannot.

Esimerkki 5:

Erilaisten plasmidikoodattujen serA-alleelien vaikutus 25 erilaisten trpE-kantojen tryptofäänin tuottoon 100 ml Erlenmeyer-kolvit, jotka sisälsivät 100 ml LB-alustaa (1 % tryptoni, 0,5 % hiivauute, 0,5 % NaCl), jossa oli 15 mg/1 tetrasykliiniä, siirrostettiin erilaisilla, taulu-30 kossa 3 annetuilla tryptofäänin tuottokannoilla. Sen jälkeen, kun oli inkuboitu 8-9 tuntia ravistelemalla 150 k/min. 30°C:ssa, kyseiset esiviljelmät siirrettiin 100 ml:aan SMl-alustaa. SMl-alusta sisälsi: 5 g/1 glukoosi, 3 g/1 KH2P04, 12 g/1 K2HP04, 0,1 g/1 (NH4)2S04, 0,3 g/1 35 MgS04 x 7 H20, 15 mg/1 CaCl2 x 2 H20, 2 mg/1 FeS04 x 7 H20, 1 g/1 Na3 mg/1 L-fenyylialaniini, 40 mg/1 L-tyrosiini, 5 mg/1 vitamiini B1 ja 15 mg/1 tetrasykliini. Hivenalku- 106727 26 aineliuoksen koostumus oli: 0,15 g/1 Na2Mo04 x 2h20, 2.5 g/1 H3BO3, 0,7 g/1 CoCl2 x 6H20, 0,25 g/1 CuS04 x 5H20, 1.6 g/1 MnCL2 x 4 H20 ja 0,3 g/1 ZnS04 x 7H20. Viljelmiä ravisteltiin 1 litran Erlenmeyer-kolveissa 30°C:ssa 12-16 5 tuntia nopeudella 150 k/min. Tämän inkuboinnin jälkeen ODggg oli välillä 2 ja 4. Myöhemmät fermentaatiot suoritettiin Braun-Melsungen-yhtiön tutkimusfermenttoreissa BIO-STATRM. Käytetyn viljelyastian kokonaistilavuus oli 2 litraa.

10 Alustan koostumus oli: 17,5 g/1 glukoosi, 5 g/1 (NH4)2S04/ 0,5 g/1 NaCl, 0,3 g/l MgS04 x 7H20, 15 mg/1 CaCl2 x 2 H20, 75 mg/1 FeS04 x 7H20, 1 g/1 Na3-sitraatti x 2 H20, 1,5 g/1 KH2P04, 1 ml hivenaineliuos (kts. edellä), 5 mg/1 vitamiini B1 (tiamiini), 0,75 g/1 fenyylialaniini, 0,75 g/l L-tyrosii-15 ni, 2,5 g/1 hiivauute (Difco), 2,5 g/1 tryptoni (Difco) ja 20 mg/1 tetrasykliini.

Fermenttorin glukoosikonsentraatio säädettiin arvoon 17,5 g/1 pumppaamalla fermenttoriin 700 g/l (paino/tilavuus) 20 glukoosiliuosta (autoklavoitua). Ennen siirrostamista fer- «m ' mentaatioalustaan lisättiin tetrasykliiniä 20 mg/1 loppukon-Γ,\' sentraatioon. Sen jälkeen pH säädettiin arvoon 6,7 lisäämäl-«<· lä pumpun avulla 25-prosenttista NH4OH-liuosta.

t c I < « t r < p5>, Fermenttoriastiaan lisättiin pumppaamalla 100 ml esiviljel-mää siirrostamista varten. Lähtötilavuus oli noin 1 1.

,.i :

Viljelmiä sekoitettiin aluksi 400 k/min. ja ilmastettiin . , 1,5 vvm paineilmalla, joka oli steriloitu steriilisuodatti- ! men läpi. Fermentaatio suoritettiin 30°C lämpötilassa.

»M « 4 · *30· «*«*· pH pidettiin arvossa 6,7 korjaamalla automaattisesti 25-* · ,···, prosenttisella NH40H:lla. Fermenttoriliuoksen kyllästymisas-te hapella ei saanut laskea fermentaation millään ajankoh- • t • " dalla alle 20 %. Hapen kyllästymisastetta säädettiin fermen- • · !33* taatiossa sekoitusnopeuden avulla. Ravintoliuoksen glu- koosipitoisuus, optinen tiheys ja tryptofaanisaanto määritettiin 2—3 tunnin välein. Glukoosipitoisuus määritettiin 106727 27 entsymaattisesti YSI-yhtiön glukoosianalysaattorin avulla. Glukoosikonsentraatio säädettiin välille 5 ja 20 g/1 lisäämällä ravintoa jatkuvatoimisesti.

5 Alustan, tryptofaanipitoisuus fermentaation jälkeen määritettiin HPLC:n avulla. Alusta erotettiin Nucleosil 100-7/C8:lla (250/4 mm; Macherey-Nagel). Kolonnia ajettiin isokraatisesti 2 ml/min. virtausnopeudella. Ajoaineena oli vesi/asetonit-riili (83/17), johon oli lisätty litraa kohti 0,1 ml H3PO4 10 (85-prosenttista). Detektointi tapahtui joko Diodenarray- detektorilla tai kiinteällä 215 tai 275 nm aallonpituudella. Fermentaatio lopetettiin 44 - 50 tunnin kuluttua. Näissä fermentaatioissa tuotetut tryptofaanimäärät 48 tunnin jälkeen on koottu g/l-yksiköissä taulukkoon 3.

15

Taulukko 3:

Tryptofaanisaannot eri serA/trpE-yhdistelmillä 20 serAWT serA5 serA1508 serAll serA1455 « ( f I t t I ( ( , ί V trpEO ’ 15,7 20,2 n. b. n. b. 6,7 trpE5 12,5 18,9 15,0 20,0 7,5 'ϊ“ί tr?E8 11,6 24,1 13,8 24,0 4,0 f i‘i trpE6 7,5 18,0 n. b. 11,5 3,9 iM · * e· i ί ϊ n. b. ei määritetty • · r · · • «· · 30Tr 9 • 9 · 4 « · • · • · * : • · 1 4 9 1 4 · « ·« « ) · » • «· • ·

SEKVENSSIPROTOKOLLA

106727 28 (1) YLEISET TIEDOT: 5 ,(i) HAKIJA: (A) NIMI: Consortium fiir elektrochemische

Industrie GmbH

(B) KATU: Zielstattstr. 20 (C) ALUE: Munchen 10 (E) MAA: Saksa (F) POSTINUMERO: 81379 (G) PUHELIN: 089-62792686 (H) TELEFAX: 089-62792795 15 (ii) HAKEMUKSEN OTSIKKO: Mikro-organismit tryptofäänin tuottamista varten ja näiden valmistusmenetelmät (iii) SEKVENSSIEN MÄÄRÄ: 14 20 (iv) TALLENNUS TIETOKONEELLE: (A) TALLENNUSTAPA: lerppu i ; (B) TIETOKONE: IBM PC yhteensopiva

‘ : (C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS

t (D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, 25‘ Version #1.25 (EPÄ) I 1 J c c * · » ··· · V ** (2) TIEDOT SEQ ID NO 1:sta ;(i) sekvenssin ominaisuudet: ··· 3Q*·'· (A) PITUUS: 52 aminohappoa « (B) LAJI: aminohappo « » » (C) SÄlEMUOTO: yksi * · *·*»* (D) TOPOLOGIA: lineaarinen * · • 9 « · · * 35/·.· (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini $ · (iii) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ 106727 29 (v) FRAGMENTIN LAATU: C-pää (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Escherichia coli

5 (B) KANTA: B

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: pGC3 10 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 1:

Ala Glu Gin Gly Vai Asn Ile Ala Ala Gin Tvr Leu G1 n Sev ^1= 1 5 10 . ' 15~ “ “

Gin Met Gly Tyr Vai Vai Ile Aso Ile Glu Ala Asu Glu Asd Vai Ala 20 125 ‘ 301 1 ^ Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met lys Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arc Ala 35 40 45

Arg Leu Leu Tyr 50 20 (2) TIEDOT SEQ ID NO 2:sta • · · • < i • | ‘: (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: ·:· (A) PITUUS: 51 aminohappoa ·:··· (B) LAJI: aminohappo {25 (C) SÄlEMUOTO: yksi • · « · (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • ♦ · . . (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini i i · • · » • · · · • · · *•1310 (iii ) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ • · · ♦ · · • · • ♦ :1··; (v) FRAGMENTIN LAATU: C-pää • · · » • · \ 1' (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: '•’35 (A) ORGANISMI: Escherichia coli

(B) KANTA: B

106727 30 (vii) VÄLITÖN LÄHDE: (B) KLOONI: pGH5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 2: 5

Ala Giu Gin Glv Vai Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser Ala 1 ' 5 10 15

Gin Met Glv Tvr Vai Vai Ile Asn Ile Glu Ala Asm Gin Asd Vai Ala 2Ö * 25 * 30' 1 0 Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala Ile Pro Gly Thr Ile Arg Ala 35 40 45

Arg Leu Leu 50 (2) TIEDOT SEQ ID NO 3:sta 15 (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 56 aminohappoa (B) LAJI: aminohappo (C) SÄIEMUOTO: yksi 20 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « « < ·νί (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini (iii ) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ 2 5 C C i ‘II/ (v) FRAGMENTIN LAATU: C-pää • · · *·

« » I

(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: • · ··· · (A) ORGANISMI: Escherichia coli • · ·

\:3Ö (B) KANTA: B

• · · • · « • · .···. (vii) VÄLITÖN LÄHDE: • · (B) KLOONI: pKBl508 • · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 3: 106727 31

Ala Glu Gin Gly Vai Cys Ser Arg Ala Asn Ile Ala Ala Gin Tyr Lee 15 10 15

Gin T'nr Ser Ala,Gin Mer Gly Tvr Vai Vai lie Asn Ile Glu Ala Asn 5 20 '25 30

Glu Asd Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lvs Ala lie Pro Glv 35 40 ' 45

Thr lie' Arg Ala Axg Leu Leu Tyr 50 55 10 (2) TIEDOT SEQ ID NO 4:sta (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 55 aminohappoa (B) LAJI: aminohappo 15 (C) SÄIEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini 20 (iii) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ « « · * « · • « · • V (v) FRAGMENTIN LAATU: C-pää « i • i (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: ?5*; (A) ORGANISMI: Escherichia coli

(B) KANTA: B

(vii) VÄLITÖN LÄHDE: • · · (B) KLOONI: pGH11 • · · 3-0- • · · • · · · • · • ·· • · • · ··· • · • · « *4 5>5 '· (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 4: 106727 32

Ala Glu Gin Gly Val Cys Ser Arg Ala Asn lie Ala A.la Gin TV»" Leu 15 10 15

Gin Thr Ser Xla Gin Met Gly Tyr Val Val lie Asn lie Glu AJLa Asn 5 1 1 20 25 30

Glu Asp Val A.la Glu Lys Ala Leu Gin .Ala Met Lys Ala lie Pro Glv '35 40 ’ 45

Thr lie Arg Ala Arg Leu Leu 50 55 10 (2) TIEDOT SEQ ID NO 5:sta (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 47 aminohappoa 15 (B) LAJI: aminohappo (C) SÄIEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini 2ft.

«ci / ( iii ) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ ‘Γ (v) FRAGMENTIN LAATU: C-pää 251; (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Escherichia coli

(B) KANTA: B

• · I I I • · » 1··’ (vii) VÄLITÖN LÄHDE: • · · ' ' 310 (B) KLOONI: pKBl 455 • 1 · • · · • 1 • « • · · • 1 • « • · · « • 1 • ·» » » » 35: (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 5: 106727 33

Ala Glu Gin Gly Val Asn lie Ala Ala Gin Tyr Leu Gin Thr Ser Ala ; 15 10 15 5 Gin Met Gly Tyr Val Val lie A.sp lie Glu Ala Asn Glu Asp Val Ala 20 25 * 30*

Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala lie Pro Gly Thr lie Arg 35 40 45 10 (2) TIEDOT SEQ ID 6:sta (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 aminohappoa (B) LAJI: aminohappo 15 (C) SÄlEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini 20 (iii) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ « · · • · · i (v) FRAGMENTIN LAATU: sisäinen • · · *:*·: (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: :25: (A) ORGANISMI: Escherichia coli • · · · (B) KANTA: YMC9 : ... (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 6: * · ♦ ··· · • · · • * * • · · ao

Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cvs Gly Asd Aro Pro Ala ^hr : 1 5 10 · * " is I*· « ·

Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asp Leu Lys Ser ;·. 20 25 30 • · · • * « • · · 35' 106727 34 (2) TIEDOT SEQ ID 7:stä (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 aminohappoa 5 (B) LAJI: aminohappo (C) SÄIEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini 1 0

(iii) ANTISENSE: EI

(v) fragmentin LAATU: sisäinen 15 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Escherichia coli (B) KANTA: PD103 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 7: 20 V ' Asn Pro Thr Ala Levs ?he His Gin Leu Cvs Glv Asp Arg ti a 1 5 1Ö Ϊ5

Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Aso Asu Leu Glu Se-20 25 30 ?5': (2) TIEDOT SEQ ID 8:sta • « t r • ·· * · · « · * (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: . (A) PITUUS: 32 aminohappoa ***.* (B) LAJI: aminohappo « « · 3*Q (C) SÄIEMUOTO: yksi I **: (D) TOPOLOGIA: lineaarinen • · · • · • · * * · (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini • · • · * S*5*: (iii) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ (v) FRAGMENTIN LAATU: sisäinen 106727 35 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Escherichia coli (B) KANTA: KB862 5 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 8:

Asn Ser Thr AI e leu Phe His Gin Leu Cvs Giv Asp A-c =-o Ai- 1 5 lö “ *

Leu Leu Leu Glu Ser Ala Asp Ile Asp Ser Lys Asp Asd Leu Lys Ser 20 25 30 10 (2) TIEDOT SEQ ID 9:stä (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 aminohappoa 15 (B) LAJI: aminohappo (C) SÄlEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini 20 « i · ‘ (iii ) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ • f f « · t • r • « (v) FRAGMENTIN LAATU: sisäinen • « $5': (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: « « » * {*:*: (A) ORGANISMI: Escherichia coli (B) KANTA: SV163 • » • · ♦ < · · **!/ (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 9: * · * ^ « » · 30

Asn Pro Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Asp Arg Pro Ala Thr 1 5 10 15 • · I · • Leu Leu Leu Glu Phe Ala Asp Ile A.sp Ser Lys Asp A.sp Leu Glu Ser 20 25 30 • · 35(2) TIEDOT SEQ ID 10:stä (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 106727 36 (A) PITUUS: 32 aminohappoa (B) LAJI: aminohappo (C) SAIEMUOTO: yksi (D) TOPOLOGIA: lineaarinen 5 (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini (iii) HYPOTEETTINEN: KYLLÄ 10 (v) FRAGMENTIN LAATU: sisäinen (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Escherichia coli (B) KANTA: SV164 15 (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 10:

Asn Ser Thr Ala Leu Phe His Gin Leu Cys Gly Aso Arg Pro Ala Th1· i 5 10 15

Leu Lev; Len Glu Ser Ala Aso Ile A.so Ser Ly s A.sp A.so Leu Glu Ser 2q 20 ' 25~ ‘ 30 V : (2) TIEDOT SEQ ID 11:sta c (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 32 emäsparia 45/ (B) LAJI: nukleiinihappo \ I V ' ..

(C) SAIEMUOTO: molemmat (D) TOPOLOGIA: lineaarinen « 1 • t t

“j/ (ii) MOLEKYYLIN LAATU: DNA

* · 1 äo1 ·

iV: (iii) HYPOTEETTINEN: EI

« < 1 ♦ » · » · #

..1 (iii) ANTISENSE: EI

t « • A ·

P

* · 1 i5’: (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: in vitro-syntetisoitu DNA-frag-mentti (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 11: 106727 37 AGCTTATTAC AGCAGACGGG CGCGAATGGA TC 5 ' 32 (2) TIEDOT SEQ ID 12:sta (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: 10 (A) PITUUS: 12 emäsparia (B) LAJI: nukleiinihappo (C) SÄIEMUOTO: kaksois (D) TOPOLOGIA: lineaarinen

15 (ii) MOLEKYYLIN LAATU: DNA

(lii) HYPOTEETTINEN: EI

(iii) ANTISENSE: EI

»Il (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: ' [ (A) ORGANISMI: in vitro-syntetisoitu DNA-frag- t t t ” mentti f

Mflt * t Ϊ2Β* (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 12: • k * * « · • · TGCTCTAGAG CA 12 t · « « · ·»· · (2) TIEDOT SEQ ID 13:sta .30 * c · : (i) SEKVENSSIN OMINAISUUDET: (A) PITUUS: 1233 emäsparia ?*·.. (B) LAJI: nukleiinihappo .’.J (C) SÄIEMUOTO: kaksois » # 35 (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLIN LAATU: DNA (genominen) 106727 Jö

(iii) HYPOTEETTINEN: EI

(iii) ANTISENSE: EI

5 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Escherichia coli (B) KANTA: b (ix) TUNNUSMERKIT:

10 (A) NIMI/AVAIN: CDA

(B) ASEMA: 1..1233 (C) TIEDON LAATU: kokeellinen (D) MUUT TIEDOT: /kodonin alkukohta= 1 /EC-numero= 1 .1 .1.95 15 /tuote= "D-3-fosfoglyseraattidehydro- genaasi /todisteet= KOKEELLISIA /geeni= "serA" ... /standardinimi= "serA" 2V/ /viite= ([1]) • · · • « • 1 (x) TIEDOT JULKISTAMISESTA: (A) TEKIJÄT: Tobey, K.L.

• : .1 Grant, G.A.

·····«· 1 • · *·’ 2’5‘: (B) OTSIKKO: Escherichia coli'n serA-geenin ♦ 1 1 · : .1 nukleotidisekvenssi ja koodatun proteiinin, : .1. D-3-fosfoglyseraattidehydrogenaasin, amino- • · ♦ * · · · · *:**i happosekvenssi • · · • :1: 1. (C) JULKAISU: J. Biol. Chem.

··· · ·· « fBÖ.: (D) NIDE: 261 C!: (F) SIVUT: 12179-12183 :·! (G) PÄIVÄMÄÄRÄ: 1986 • · · · · # # · » · • · · · ··· · · 35 • « · • · • · • · · • · • · · • · · • · · (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 13: 106727 39 ATG GCA AAG GTA TCG CTG GAG AAA GAC AAG ATT AAG TTT CTG CTG GTA 48

Met Ala Lys Val Ser Leu Glu Lys Asd Lys lie Lvs Phe Leu Leu Val 1 ' ' 5 10 15 5

GAA GGC GTG CAC CAA AAG GCG CTG GAA AGC CTT CGT GCA GCT GGT TAC

c6

Glu Giy Val His Gin Lys Ala Leu Glu Ser Leu Arc Aua Ala Gly Tyr 20 25 30 in ACC AAC ATC GAA TTT CAC AAA GGC GCG CTG GAT GAT GAA CAA ttA aaa 144

Tnr Asn lie Glu Phe His Lys Gly Ala Leu Asp Asd Glu Gin Leu Lys 35 40 45 GAA TCC ATC CGC GAT GCC CAC TTC ATC GGC CTG CGA TCC CGT ACC CAT 192

Glu Ser lie Arg Asd AJ.a His Phe lie Glv Leu Arc Ser Arg Thr His 15 50 ‘55 ‘60

CTG ACT GAA GAC GTG ATC AAC GCC GCA GAA AAA CTG GTC GCT ATT GGC

240

Leu Thr Glu Asp Val lie Asn Ala Ala Glu Lvs Leu Val Ala lie Glv 65 * 70 75 80

TGT TTC TGT ATC GGA ACA AAC CAG GTT GAT CTG GAT GCG GCG GCA AAG

V ‘ 288

Cys Phe Cvs lie Glv Thr Asn Gin Val Asd Leu Asd Ala Ala Ala Lvs : *85 SÖ 95

", CGC GGG ATC CCG GTA TTT AAC GCA CCG TTC TCA AAT ACG CGC TCT GTT

536 . . Arg Gly lie Pro Val Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Arg Ser Val :.: i 100 105 no • · • · · « «

GCG GAG CTG GTG ATT GGC GAA CTG CTG CTG CTA TTG CGC GGC GTG CCG

: V 384 .1. Ala Glu Leu Val lie Gly Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arc Gly Val Pro ···· : 115 120 125 ♦ ··· · • · ··· • · « • · · • · · • · # Λ • ♦ * * »·* · ·« · : · : ::: • · ·· • · • · ··· ♦ · · ····· : · . . ...

•*·· · · ( » · · * • · «« ««· · · « ♦ *♦ · ♦ · ♦ : : • · · • · « · · » ♦· • · ##♦·· « · 106727 40 G AA GCC AAT GCT AAA GCG CAC CGT GGC GTG TGG AAC AAA CTG GCG GCG 432

Glu Ala Asn Ala Lvs Ala His Aro Gly Vai Tro Asn Lys Leu Ala Ala 130 135 ' 140 GGT ,TCT TTT GAA GCG CGC GGC AAA AAG CTG GGT ATC ATC GGC TAC GGT 480

Gly Ser Phe Glu Ala Aro Gly Lys Lys Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly 145 150 155 160 CAT ATT GGT ACG CAA TTG GGC ATT CTG GCT GAA TCG CTG GGA ATG TAT 528

His Ile Gly Thr Gin Leu Gly Ile Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr 165 170 175 GTT TAC TTT TAT GAT ATT GAA AAT AAA CTG CCG CTG GGC AAC GCC ACT 576

Vai Tyr Phe Tyr Asp Ile Glu Asn Lvs Leu Pro Leu Gly Asn Ala Thr 180 * 185 190

CAG GTA CAG CAT CTT TCT GAC CTG CTG AAT ATG AGC GAT GTG GTG AGT

624

Gin Vai Gin His Leu Ser Asp Leu Leu Asn Met Ser Asp Vai Vai Ser 195 200 205 CTG CAT GTA CCA GAG AAT CCG TCC ACC AAA AAT ATG ATG GGC GCG AAA 672

Leu His Vai Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lvs Asn Met Met Glv Ala Lvs 210 215 '220

t I I

GAA ATT TCA CTA ATG AAG CCC GGC TCG CTG CTG ATT AAT GCT TCG CGC : .· 720 •' · Glu Ile Ser Leu Met Lvs Pro Gly Ser Leu Leu Ile Asn Ala Ser Arg 225 230 235 240 (

. « GGT ACT GTG GTG GAT ATT CCG GCG CTG TGT GAT GCG CTG GCG AGC AAA

· 768 • · · Glv Thr Vai Vai Asp Ile Pro Ala Leu Cys Asp Ala Leu Ala Ser Lvs 245 250 255 « · · • ·

.:. CAT CTG GCG GGG GCG GCA ATC GAC GTA TTC CCG ACG GAA CCG GCG ACC

* ··· · ·-» 816 ·*· : His Leu Ala Gly Ala Ala Ile Asp Vai Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr # * :T: 260 ‘ 265 .270 • · · * * * ·

•*.1.· AAT AGC GAT CCA TTT ACC TCT CCG CTG TGT GAA TTC GAC AAC GTC CTT

v : 864

Asn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cys Glu Phe Asp Asn Vai Leu ·;· 275 280 285 • ♦*

· " CTG ACG CCA CAC ATT GGC GGT TCG ACT CAG GAA GCG CAG GAG AAT ATC

·*“: 912 *·· * · Leu Thr Pro Kis Ile Gly Gly Ser Thr Gin Glu Ala Gin Glu Asn Ile 290 295 300 • « • · · • · « · • · · • · • · · » ♦· ·· ·♦· • · 106727 41

GGC CTG GAA GTT GCG GGT AAA TTG ATC AAG TAT TCT GAC AAT GGC TCA

960

Glv Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu Ile Lys Tyr Ser Asu Asn Glv Ser 305 310 315 ‘ 320 ;

ACG CTC TCT GCG GTG AAC TTC CCG GAA GTC TCG CTG CCA CTG CAC GGT

5 1008

Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly 325 330 335

GGG CGT CGT CTG ATG CAC ATC CAC GAA AAC CGT CCG GGC GTG CTA ACT

1056

Gly Arq Arq Leu Het Lis Lie Lis G>Lu ksu Axq QLn Mai Leu. Tar.

340 345 ‘ 350 10

GCG CTG AAC AAA ATC TTC GCC GAG CAG GGC GTC AAC ATC GCC GCG CAA

1104 '

Ala Leu Asn Lys lie Phe Ala Glu Gin Gly Val Asn lie Ala Ala Gin 355 360 365

TAT CTG CAA ACT TCC GCC CAG ATG GGT TAT GTG GTT ATT GAT ATT GAA

1152 15 Tvr Leu Gin Thr Ser Ala Gin Met Gly Tyr Vai Vai Ile Aso He Glu 370 375 380 GCC GAC GAA GAC GTT GCC GAA AAA GCG CTG CAG GCA ATG AAA GCT AT'7’ 1200 ”-<= Asp Glu Asp Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lvs Ala He 385 390 395 ‘ 400 * » · • · «

2*0* CCG G«T ACC ATT CGC GCC CGT CTG CTG TAC TA

1233 ^ro G-y Thr He Arg Ala Arg Leu Leu Tyr 405 410 < • · i (2) TIEDOT SEQ ID NO 14:sta * · · · ; V (i)·SEKVENSSIN OMINAISUUDET: : (A) PITUUS: 410 aminohappoa · · « •ft 7/ (Β) LAJI: aminohappo • · · • ;*: *. (D) TOPOLOGIA: lineaarinen •·· · ·» * :7: :^ö (ii) MOLEKYYLIN LAATU: proteiini • · · ’· . (xi) SEKVENSSIN KUVAUS: SEQ ID NO 14:sta ··/ ’* 85 90 95

Arg Gly Ile Pro Vai Phe Asn Ala Pro Phe Ser Asn Thr Aro Se’- Vai 105 no • · ♦ : Ala Glu ^eu V£i Ii« Giy Glu Leu Leu Leu Leu Leu Arg Gly Vai Pre ll£ 120 125 • · « · · 106727 42

Glu Ala Asn Ala Lys Ala His Arg Gly Val Trp A.sn Lys Leu Ala Ala 130 135 ' 140

Gly Ser Phe Glu Ala A.ra Gly Lys Lys Leu Gly lie lie Gly Tvr Gly 145 150 155 ' 160

His lie Gly Thr 'Gin Leu Gly lie Leu Ala Glu Ser Leu Gly Met Tyr 165 170 175

Val Tyr Phe Tvr A.sd lie Glu Asn Lys Leu Pro Leu Glv Asn Ala Thr 180 ‘ 185 ' 190

Gin Val Gin His Leu Ser Asd Leu Leu Asn Met Ser Asu Val Val Ser 195 ‘ 200 205

Leu His Val Pro Glu Asn Pro Ser Thr Lys Asn Met Met Gly Ala Lys 210 215 220

Glu He Ser Leu Met Lvs Pro Gly Ser Leu Leu He Asn Ala Ser Arc 225 230 235 240

Gly Thr Val Val A so He Pro Ala Leu Cvs Asp Ala Leu Ala Ser Lys 245 250 255

His Leu Ala Glv Ala Ala He Asn Val Phe Pro Thr Glu Pro Ala Thr 260 ‘ 265 270 A.sn Ser Asp Pro Phe Thr Ser Pro Leu Cvs Glu Phe Asd Asn Val Leu 275 280 " 285 V ·' Lev Thr Pro His Ile Gly Gly Ser Thr Gin Glu Ala Gin Glu Asn He ;v< 290 295 300 c

Gly Leu Glu Val Ala Gly Lys Leu lie Lys Tyr Ser Asp Asn Gly Ser 305 310 315 320 < t t ; , Thr Leu Ser Ala Val Asn Phe Pro Glu Val Ser Leu Pro Leu His Gly I 325 330 335 • · · e * * • ♦ * « « V ; Gly Arg Arg Leu Met His He His Glu Asn Arg Pro Gly Val Leu Thr Γ* : 340 345 350 • ·

Ala Leu Asn Lys Ile Phe Ala Glu Gin Gly Val Asn He Ala Ala Gin • ; 355 360 365 ♦♦·*· ··· • · · · · • · · : * Tyr Leu Gin Thr Ser Ala Gin Met Gly Tvr Vai Val He Asd lie Glu : ·*: 370 375 ' 380 » · · * · * .··· ·.. : Ala A.sd Glu A.sd Val Ala Glu Lys Ala Leu Gin Ala Met Lys Ala He • 385 ‘ ' 390 395 400 • · • · · ····· · · · . Pro Glv Thr He Arg Ala Arg Leu Leu Tyr ' 405 410 * · · t » · • * * • · « « · « « · « ·« Φ · • ·

Claims

106727 43

1. Transformoidut E. coli- tai Coryne-bakteerien kannat, tunnettu siitä, että niillä on säätelemätön trypto- 5 fäänin aineenvaihdunta ja feedback-resistentin serA-alleelin kautta säätelemätön seriiniaineenvaihdunta, jolloin serA-alleelin Ki-arvo seriinille on välillä 0,1 mM ja 50 mM.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukaiset kannat, tunnettu 10 siitä, että trpE-alleelin Ki-arvo tryptofaanille on välillä 0,1 mM ja 20 mM.

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaiset kannat, tunnet-t u siitä, että serA-alleeli on integroitu kromosomiin. 15

4. Menetelmä valmistaa patenttivaatimuksen 1 mukaisia transformoituja kantoja, tunnettu siitä, että bakteerikantaan, jolla on säätelemätön tryptofäänin aineenvaihdunta, tuodaan feedback-resistentti serA-alleeli. 20

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että serA-alleeli on tuotu bakteeriin, jolla on säätelemätön tryptofäänin aineenvaihdunta, kromosomiin. « · · • · ’·1 ' 25

6. Yhden tai useamman patenttivaatimuksen 1-3 mukaisen • · · :V kannan käyttö tryptofäänin tuottamiseen. ♦ *♦· ···· *· · • ♦ • · · • · · ··· · • · · • · · • · · ····1 • ♦ ' ·«♦ • · « • · « * · · « « · • · • t f • · · • · · « · · * · 44 106727