KR100720300B1

KR100720300B1 - Ｌ-아미노산을 생산하는 신규한 유전자 및 생산 방법

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Publication number: KR100720300B1
Application number: KR1019990060483A
Authority: KR
Inventors: 리브쉬츠비탈리아르카드예비치; 자카타에바나탈리아파블로브나; 알레쉰블라디미르베니아미노비치; 벨라레바알라발렌티노브나; 토크흐마코바이리나리보브나
Original assignee: 아지노모토 가부시키가이샤
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-22
Publication date: 2007-05-22
Also published as: EP1013765B1; US9394346B2; RU2148642C1; US20160289716A1; SK184399A3; DK1013765T4; DE69937036T2; CA2291454A1; SK288294B6; EP1013765A1; BR9906283A; ES2293707T5; AU6543599A; ZA997819B; KR20000048340A; SK286619B6; DE69937036T3; JP2000189177A; ID24025A; DK1013765T3

Abstract

본 발명은 아미노산을 생산하는 능력을 가지며, 세균이 단백질 L-트레오닌 내성을 갖도록 하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 rhtC 유전자가 강화되고, 바람직하게는 세균이 단백질 L-호모세린 내성을 갖도록 하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 rhtB 유전자가 추가로 강화된 세균을 배양 배지에서 배양하여 아미노산을 생산하고 배지 중에 축적시키고, 배지로부터 상기 아미노산을 회수하는 방법에 관한 것이다.

L-트레오닌, L-호모세린, 측쇄형 아미노산, 아미노산 생산 방법, 에세리키아, 형질전환, 단백질, 뉴클레오티드, rhtB 유전자, rhtC 유전자

Description

Ｌ-아미노산을 생산하는 신규한 유전자 및 생산 방법 {Novel gene and method for producing L-amino acids}

도 1은 rhtB 및 rhtC 유전자의 클로닝 및 동정을 나타낸다.

도 2는 rhtB 유전자를 보유하는 플라스미드 pRhtB의 구조를 나타낸다.

도 3은 rhtC 유전자를 보유하는 플라스미드 pRhtC의 구조를 나타낸다.

도 4는 rhtB 유전자 및 rhtC 유전자를 보유하는 플라스미드 pRhtBC의 구조를 나타낸다.

본 발명은 생명공학에 관한 것이며, 보다 구체적으로 아미노산을 생산하는 방법, 특히 에세리키아 속에 속하는 세균을 사용하여 L-호모세린, L-트레오닌, L-발린 또는 L-류신을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명자들은 이. 콜라이 K-12와 관련하여, 최소 배지에서 고농도의 트레오닌 또는 호모세린에 대한 내성과 관계되는 thrR 돌연변이를 갖는 돌연변이체를 수득하였다[Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 21, 611-616(1985)]. 상기 돌연변이는 각각의 이. 콜라이 생산 균주에 의한 L-트레오닌[SU 특허 제974817호], 호모세린 및 글루타메이트 [Astaurova, O.B. et al., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561, 1991]의 생산을 개선시켰다.

추가로, 본 발명자들은 thrR 돌연변이가 이. 콜라이 염색체 18min에 존재하며, 이 돌연변이는 pexB 및 ompX 유전자 사이의 ORF1에서 발생함을 밝혀냈다. 상기 ORF에 의해 암호화되는 단백질을 발현하는 단위는 rhtA(rht: 호모세린 및 트레오닌 내성) 유전자로 명명하였다. rhtA 유전자는 SD 서열을 포함하는 5'-비암호화 영역, ORF1 및 종결 인자를 포함한다. 또한, 본 발명자들은 야생형 rhtA 유전자가 다수체 상태(multycopy state)로 클로닝되는 경우 트레오닌 및 호모세린에 대한 내성에 관여한다는 것과 thrR 돌연변이는 rhtA 유전자내에서 ATG 출발 코돈과 관련하여 -1 위치에서 G를 A로 치환시켜 유발된 것(상기 돌연변이는 "rhtA 23"으로 명명하였다)임을 밝혀냈다[ABSTRACTS of 17^th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997, abstract No. 457].

다수체 상태에서 트레오닌 및 호모세린 내성을 주는 두 개 이상의 상이한 유전자가 rhtA 유전자를 클로닝하는 동안 이. 콜라이에 존재함을 밝혀냈다. 이러한 유전자 중 하나는 rhtA 유전자이고, 다른 하나는 호모세린 내성을 주는 rhtB 유전자로 확인되었다[러시아 특허원 제98118425호].

본 발명의 목적은 아미노산, 특히 L-호모세린, L-트레오닌 및 측쇄 아미노산들을 보다 고수율로 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은, 다수체 벡터로 클로닝하는 경우, 이. 콜라이 염색체 상의 86min 영역이 이. 콜라이 세포에 L-호모세린 내성을 부여함을 밝혀냈다. 본 발명자들은 추가로, 상류 영역에 또 다른 유전자인 rhtC 유전자가 존재하며, 이는 트레오닌 내성에 관여한다는 사실과 이러한 유전자들이 증폭되는 경우, 이. 콜라이의 아미노산 생산성이 rhtA 유전자와 마찬가지로 개선될 수 있다는 것을 밝혀냈다. 이러한 발견에 기초하여, 본 발명이 완성되었다.

따라서, 본 발명은,

(1) 에세리키아 속에 속하는 세균(이때, 상기 세균의 L-트레오닌 내성은 세균 세포 중 하기 (A) 또는 (B)에서 정의된 바와 같은 단백질의 활성을 강화시킴으로써 강화된다):

(A) 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는

(B) 서열번호 4의 아미노산 서열 중 하나 또는 수 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 세균이 단백질 L-트레오닌 내성이 되도록 하는 활성을 갖는 단백질;

(2) 세균의 L-호모세린 내성이 세균 세포 중 하기 (C) 또는 (D)에서 정의된 바와 같은 단백질 활성을 강화시킴으로써 추가로 강화되는 (1)에 따르는 세균:

(C) 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 단백질, 또는

(D) 서열 2의 아미노산 서열 중 하나 또는 수 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 아미노산 서열을 포함하며, 세균이 단백질 L-호모세린 내성이 되도록 하는 활성을 갖는 단백질;

(3) (A) 또는 (B)에서 정의된 바와 같은 단백질의 활성이 (A) 또는 (B)에서 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA를 사용한 세균의 형질전환에 의해 강화되는 (1) 또는 (2)에 따르는 세균;

(4) (C) 또는 (D)에서 정의된 바와 같은 단백질의 활성이 (C) 또는 (D)에서 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA를 사용한 세균의 형질전환에 의해 강화되는 (2)에 따르는 세균;

(5) 아미노산을 생산하는 능력을 가진 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에서 정의한 바와 같은 세균을 배양 배지에서 배양하여, 아미노산을 생산하고 배지 중에 축적시키는 단계, 및 배지로부터 상기 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 아미노산을 생산하는 방법;

(6) 아미노산이 L-호모세린, L-트레오닌 및 측쇄형 아미노산으로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 (5)에 따르는 방법;

(7) 측쇄형 아미노산이 L-발린 또는 L-류신인 (6)에 따르는 방법;

(8) 하기 (A) 또는 (B)에서 정의된 단백질을 암호화하는 DNA:

(A) 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 단백질, 또는

(B) 서열번호 4의 아미노산 서열 중 하나 또는 수 개의 아미노산의 치환, 결실, 삽입, 부가 또는 전위를 포함하는 아미노산 서열을 가지며, 세균이 단백질 L-트레오닌 내성을 갖게 하는 활성을 갖는 단백질;

(9) 하기 (a) 또는(b)에서 정의된 DNA인 (8)의 DNA:

(a) 서열번호 3에서 뉴클레오티드 번호 187 내지 804의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA, 또는

(b) 서열번호 3에서 뉴클레오티드 번호 187 내지 804의 뉴클레오티드 서열 또는 상기 뉴클레오티드 서열로부터 제조된 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하며, 세균이 단백질 L-트레오닌 내성을 갖게 하는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA; 및

(10) 엄격한 조건이, 세척이 60℃에서, 및 1 x SSC 및 0.1% SDS에 상응하는 염 농도에서 수행되는 조건인 (9)의 DNA를 제공한다.

상기 (A) 또는 (B)에서 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA 단편은 "rhtC 유전자"로 인용될 수 있으며, rhtC 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 "RhtC 단백질"로 인용될 수 있고, 상기 (C) 또는 (D)에서 정의된 바와 같은 단백질을 암호화하는 DNA 단편은 "rhtB 유전자"로 인용될 수 있으며, rhtB 유전자에 의해 암호화되는 단백질은 "RhtB 단백질"로 인용될 수 있다. 세균의 L-트레오닌 내성에 참여하는 RhtC 단백질의 활성(즉, 세균이 RhtC 단백질 L-트레오닌-내성을 갖게 하는 활성)은 "Rt 활성"으로서 인용할 수 있으며, 세균의 L-호모세린 내성에 참여하는 RhtB 단백질의 활성(즉, 세균이 RhtB 단백질 L-호모세린-내성을 갖게 하는 활성)은 "Rh 활성"으로서 인용할 수 있다. rhtC 유전자 또는 rhtB 유전자에서 RhtC 단백질 또는 RhtB 단백질을 암호화하는 구조 유전자는 "rhtC 구조 유전자" 또는 "rhtB 구조 유전자"로서 인용할 수 있다. 용어 "Rt 활성 또는 Rh 활성을 강화하는"이란 세균에 트레오닌 또는 호모세린 내성을 주거나, 상기 단백질의 특이 활성을 증가시키는 RhtC 단백질 또는 RhtB 단백질의 분자 수를 증가시키거나, 상기 단백질의 발현 또는 활성 등에 대한 네가티브 조절을 탈감화시켜 내성을 강화하는 것을 의미한다. 용어 "단백질을 암호화하는 DNA"란 DNA가 이중쇄인 경우 쇄중 하나가 상기 단백질을 암호화하는 DNA를 의미한다. L-트레오닌 내성이란, 야생형 균주는 성장하지 못하는 농도, 즉 일반적으로 >30㎎/㎖의 농도로 L-트레오닌을 함유하는 최소 배지에서 세균이 성장하는 특성을 의미한다. L-호모세린 내성이란, 야생형 균주는 성장하지 못하는 농도, 즉 일반적으로 > 5㎎/㎖의 농도로 L-호모세린을 함유하는 최소 배지에서 세균이 성장하는 특성을 의미한다. 아미노산을 생산하는 능력이란 세균이 이의 야생형 균주보다 더 많은 양으로 아미노산을 생산하고 배지 중에 축적하는 특성을 의미한다.

본 발명에 따르면, 고농도의 트레오닌, 또는 트레오닌과 호모세린에 대한 내성이 에세리키아 속에 속하는 세균에게 부여될 수 있다. 에세리키아 속에 속하는 세균은 트레오닌, 또는 트레오닌과 호모세린에 대한 증강된 내성을 가지며, 아미노산, 특히, L-호모세린, L-트레오닌, 또는 L-발린과 L-류신 같은 측쇄형 아미노산을 배지중에 고수율로 축적하는 능력을 갖는다.

본 발명은 하기에서 상세히 설명될 것이다.

<1> 본 발명에 사용되는 DNA

본 발명에 사용되는 제1 DNA 단편(rhtC 유전자)은 Rt 활성을 갖는 단백질을 암호화하고 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 상기 DNA는 서열번호 3의 뉴클레오티드 번호 187 내지 804의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA에 의해 예증될 수 있다.

본 발명에 사용되는 제2 DNA 단편(rhtB 유전자)은 Rh 활성을 갖는 단백질을 암호화하고 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는다. 특히, 상기 DNA는 서열번호 1의 뉴클레오티드 번호 557 내지 1171의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 DNA에 의해 예증될 수 있다.

서열번호 1의 뉴클레오티드 서열을 갖는 rhtB 유전자는 GenBank 승인 번호 M87049의 서열에 상보적인 서열의 일부에 상응하며, 이. 콜라이 염색체 상의 86min에 위치하는 것으로 공지되어 있지만 그 기능이 미확인된 ORF(개방 판독 프레임)인 f138(M87049의 뉴클레오티드 번호 61959 내지 61543) 및 이의 5'- 및 3'-플랭킹 영역을 포함한다. 5'-플랭킹 영역에서 단지 160개의 뉴클레오티드를 갖는 f138은 호모세린 내성을 제공할 수 없다. 어떠한 종결 코돈도 M87049의 62160 내지 61959 사이(ORF f138의 상류)에 존재하지 않는다. 추가로, 상기 서열의 ATG 코돈 중 하나는 리보솜-결합 부위(M87049 중 62171 내지 62166) 뒤에 위치한다. 따라서, 암호화 영역은 201bp 더 길다. 보다 큰 ORF(M87049의 뉴클레오티드 번호 62160 내지 61546)를 rhtB 유전자로서 명명한다.

상기 rhtB 유전자는, 예를 들어, 이. 콜라이의 Mucts 용원성 균주를 mini-Mu d5005 파아지미드를 사용하는 방법[Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364(1986)]에 따라 K12 또는 W3110과 같은 이. 콜라이의 용원성 균주의 용해물을 사용하여 감염시키고, 파아지미드 DNA를 카나마이신(40㎍/㎖) 및 L-호모세린(10㎎/㎖)을 함유하는 최소 배지 상에서 성장하는 콜로니로부터 분리하여 수득할 수 있다. 하기 실시예에서 예증되는 바와 같이, rhtB 유전자는 이. 콜라이 염색체 상의 86min에서 맵핑되었다. 따라서, rhtB 유전자를 포함하는 DNA 단편은 이. 콜라이 염색체 상의 86min 부분의 인접 영역에 상응하는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드(들)을 사용하는 콜로니 하이브리드화 또는 PCR[폴리머라제 연쇄 반응, 문헌 참조: White, T.J. et al., Trends Genet. 5, 185 (1989)]에 의해 이. 콜라이의 염색체로부터 수득할 수 있다.

대안으로, 상기 올리고뉴클레오티드는 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열에 따라 디자인할 수 있다. PCR 프라이머로서 서열번호 1에서 뉴클레오티드 번호 557로부터 상류 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 번호 1171로부터 하류 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 전체 암호화 영역을 증폭시킬 수 있다.

상기 올리고뉴클레오티드의 합성은 시판중인 DNA 합성기(예를 들어, Applied Biosystems사 제조의 DNA Synthesizer 모델 380B)를 사용하여 포스포아미다이트 방법[문헌: Tetrahedron Letters, 22, 1859(1981)]과 같은 통상적인 방법으로 수행할 수 있다. 추가로, PCR은 공급원에 의해 지시된 방법에 따라 Taq DNA폴리머라제(공급원: Takara Shuzo Co., Ltd)를 사용하는 시판중인 PCR 장치(예를 들어, 제조원: Takara Shuzo Co., Ltd.의 DNA Thermal Cycler 모델 PJ2000)를 사용하여 수행할 수 있다.

rhtC 유전자는 실시 양태에서 하기 기술되는 바와 같이 rhtB가 클로닝될 때 우연히 rhtB 유전자를 포함하는 DNA 단편 중에서 수득되었다. rhtC 유전자는, 하기 기술되는 바와 같이 공지되어 있지만 기능이 미확인된 ORF인 O128(Genebank 승인 번호 M87049의 뉴클레오티드 번호 60860 내지 61480)의 보정된 서열에 상응한다. rhtC 유전자는 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열에 따라 디자인된 올리고뉴클레오티드를 사용한 PCR 또는 하이브리드화에 의해 수득될 수 있다. PCR 프라이머로서 서열번호 3의 뉴클레오티드 번호 187로부터 상류 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열 및 뉴클레오티드 번호 804로부터 하류 영역에 상응하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 사용하여, 전체 암호화 영역을 증폭시킬 수 있다.

본 발명에서, 본 발명의 RhtB 단백질을 암호화하는 DNA는, 이로부터 암호화되는 RhtB 단백질의 Rh 활성이 저하되지 않는 한, 하나 또는 복수의 위치에서 하나 또는 수 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 RhtB 단백질을 암호화할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 RhtC 단백질을 암호화하는 DNA는 이로부터 암호화되는 RhtC 단백질의 Rt 활성이 저하되지 않는 한, 하나 또는 복수의 위치에서 하나 또는 수 개의 아미노산의 결실, 치환, 삽입 또는 부가를 포함하는 RhtC 단백질을 암호화할 수 있다.

상기 기술된 바와 같은 RhtB 단백질 또는 RhtC 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열을 변형시킴으로써, 예를 들어, 부위-특이적인 돌연변이유발 방법으로 수득할 수 있으며, 이의 결과로서 특정 부위에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가된다. 상기 기술된 바와 같이 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해 수득될 수 있다. 상기 돌연변이 처리는 시험관내에서 RhtB 단백질 또는 RhtC 단백질을 암호화하는 DNA를, 예를 들면, 하이드록실아민으로 처리하는 방법, 및 미생물, 예를 들어, RhtB 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하는 에세리키아 속에 속하는 세균을 돌연변이 처리에 통상적으로 사용되는 자외선 조사, 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 및 아질산 같은 돌연변이 유발제로 처리하는 방법을 포함한다.

RhtB 단백질 또는 RhtC 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 상기와 같이 시험관내 돌연변이 처리된 DNA를 적당한 세포내에서 다수체로 발현시키고, 호모세린 또는 트레오닌 내성을 조사하고, 내성을 증가시키는 DNA를 선택함으로써 수득할 수 있다.

단백질의 아미노산 서열 및 이를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 종, 균주, 돌연변이체 또는 변이체에 따라 약간씩 상이할 수 있음은 일반적으로 공지되어 있다.

따라서, RhtC 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 187 내지 804의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는 이로부터 수득할 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하며, 돌연변이 처리한 에세리키아 속에 속하는 세균, 또는 에세리키아 속에 속하는 세균의 자연 돌연변이체 또는 변이체로부터 Rt 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다.

또한, RhtB 단백질과 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열의 뉴클레오티드 번호 557 내지 1171의 뉴클레오티드 서열을 갖는 DNA 또는 이로부터 수득할 수 있는 프로브와 엄격한 조건하에서 하이브리드화하며, 돌연변이 처리한 에세리키아 속에 속하는 세균, 또는 에세리키아 속에 속하는 세균의 자연 돌연변이체 또는 변이체로부터 Rh 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다.

본원에서 인용되는 용어 "엄격한 조건"은 소위 특이적인 하이브리드가 형성되며, 비-특이적인 하이브리드가 형성되지 않는 조건이다. 상기 조건을 임의 수치를 사용하여 명확하게 표현하는 것은 어렵다. 그러나, 예를 들어, 엄격한 조건은 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 서로 70% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 하이브리드화하며, 서로 70% 미만의 상동성을 갖는 DNA는 하이브리드화하지 않는 조건을 포함한다. 대안으로, 엄격한 조건은 DNA가 서던 하이브리드화에서 통상적인 세척 조건에 상응하는 염 농도, 즉, 60℃, 1 x SSC, 0.1% SDS, 바람직하게는, 0.1 x SSC, 0.1% SDS에서 서로 하이브리드화하는 조건으로 예증된다.

<2> 본 발명의 에세리키아 속에 속하는 세균

본 발명의 에세리키아 속에 속하는 세균은 Rt 활성이 강화된 에세리키아 속에 속하는 세균이다. 본 발명의 세균의 바람직한 양태는 Rh 활성이 추가로 강화된 세균이다. 에세리키아 속에 속하는 세균은 에세리키아 콜라이로 예증된다. Rt 활성은, 예를 들어, 세포 중 rhtC 구조 유전자의 복사체 수를 증폭시키거나, RhtC 단백질을 암호화하는 rhtC 구조 유전자를 포함하는 DNA 단편을 에세리키아 속에 속하는 세균내에서 효과적으로 기능하는 프로모터 서열과 결합시킨 재조합 DNA를 사용하여 에세리키아 속에 속하는 세균을 형질전환시킴으로써 강화시킬 수 있다. Rt 활성은 또한 염색체 상의 rhtC 유전자의 프로모터 서열을 에세리키아 속에 속하는 세균에서 효과적으로 기능하는 프로모터 서열로 치환시킴으로써 강화시킬 수 있다.

그밖에, Rh 활성은, 예를 들어, 세포 중 rhtB 구조 유전자의 복사체 수를 증폭시키거나, RhtB 단백질을 암호화하는 rhtB 구조 유전자를 포함하는 DNA 단편을 에세리키아 속에 속하는 세균내에서 효과적으로 기능하는 프로모터 서열과 결합시킨 재조합 DNA를 사용하여 에세리키아 속에 속하는 세균을 형질전환시킴으로써 강화시킬 수 있다. Rh 활성은 또한 염색체 상에서 rhtB 유전자의 프로모터 서열을 에세리키아 속에 속하는 세균에서 효과적으로 기능하는 프로모터 서열로 치환시킴으로써 강화시킬 수 있다.

세포 내에서 rhtC 구조 유전자 또는 rhtB 구조 유전자의 복사체 수를 증폭시키는 것은 rhtC 구조 유전자 또는 rhtB 구조 유전자를 보유하는 다수체 벡터를 에세리키아 속에 속하는 세균의 세포내로 도입시킴으로써 수행할 수 있다. 구체적으로, 복사체 수는 rhtC 구조 유전자 또는 rhtB 구조 유전자를 보유하는 플라스미드, 파아지 또는 트랜스포존[Berg, D.E. and Berg, C.M., Bio/Tecnol., 1, 417 (1983)]을 에세리키아 속에 속하는 세균의 세포내로 도입시킴으로써 증가시킬 수 있다.

다수체 벡터는 pBR322, pMW118, pUC19 등과 같은 플라스미드 벡터, 및 λ1059, λBF101, M13mp9 등과 같은 파아지 벡터로 예증된다. 트랜스포존은 Mu, Tn10, Tn5 등으로 예증된다.

DNA를 에세리키아 속에 속하는 세균에 도입하는 것은, 예를 들어, 문헌[D.A. M. Morrison, Methods in Enzymology, 68, 326(1979)]의 방법 또는 수용체 세균 세포가 염화칼슘으로 처리되어 DNA 투과성을 증가시키는 방법[Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159, (1970)] 등에 의해 수행될 수 있다.

Rt 활성, 또는 Rt 활성 및 Rh 활성이 상기된 바와 같은 에세리키아 속에 속하는 아미노산 생산 세균에서 강화되는 경우, 아미노산 생산량은 증가될 수 있다. Rt 활성이 있거나, Rt활성 및 Rh 활성이 있는 에세리키아 속에 속하는 세균이 강화되는 경우, 바람직한 아미노산을 생산하는 능력을 가진 균주가 사용된다. 또한, 아미노산을 생산하는 능력은 Rt 활성, 또는 Rh 활성 및 Rt 활성이 강화된 세균에 부여될 수 있다.

rhtC DNA 단편 증폭에 기초하여, 신규한 균주인 호모세린을 생산하는 이. 콜라이 MG442/pRhtC; 트레오닌을 생산하는 이. 콜라이 MG442/pVIC40,pRhtC; 호모세린, 발린 및 류신을 생산하는 이. 콜라이 NZ10/pRhtBC 및 이. 콜라이 NZ10/pRhtB, pRhtC가 수득되며, 이들은 어떠한 증폭된 rhtC DNA 단편도 함유하지 않은 세균들 보다 더 많은 양으로 아미노산을 축적한다.

상기 신규한 균주는 (부다페스트 조약에 근거한 국제기탁에 따라서) 국제기탁기관[All-Russian Collection for Industrial Microorganisms(VKPM)]에 기탁되었다. 이. 콜라이 균주 MG442/pRhtC는 수탁 번호 VKPM 제B-7700호로서 기탁되었고; 이. 콜라이 균주 MG442/pVIC40, pRhtC는 수탁 번호 VKPM 제B-7680호로서 기탁되었으며; 이. 콜라이 균주 NZ10/pRhtB, pRhtC는 수탁 번호 VKPM 제B-7681호로서 기탁되었고; 이. 콜라이 균주 NZ10/pRhtBC는 수탁 번호 VKPM 제B-7682호로서 기탁되었다.

이. 콜라이 균주 MG442/pRhtC(VKPM 제B-7700호)는 하기 배양 형태학적 특성 및 생화학적 특성을 나타낸다.

세포형태학

둥근 말단을 갖는 그람-음성의 약한 운동성의 간상 형태. 종축 크기: 1.5 내지 2㎛.

배양 특성

소고기-추출물 아가:

37℃에서 24시간 성장시키면, 직경 1.0 내지 3㎜의 희고 반투명한 둥근 콜로니가 형성되며, 부드러운 표면, 일정하고 약간 파상형의 가장자리를 가지며, 약간 볼록하고, 균일한 구조의 페이스트형(pastelike) 점도의 용이하게 유화될 수 있는 중심을 갖는다.

루리아 아가:

37℃에서 24시간 성장시키면, 직경 1.5 내지 2.5㎜의 희고 반투명한 콜로니가 형성되며, 부드러운 표면, 균일한 구조, 페이스트형 점도를 가지며 용이하게 유화될 수 있다.

최소 아가-도프된 M9 배지:

37℃에서 40 내지 48시간 성장시키면, 직경 0.5 내지 1.5㎜의 회백색의 반투명하며 약간 볼록한 콜로니가 형성되며, 광택이 나는 표면을 갖는다.

소고기-추출물 브로스에서의 성장:

37℃에서 24시간 성장시키면, 강하고 균일한 탁한 색을 나타내며 독특한 냄새를 갖는다.

생리학적 및 생화학적 특성

소고기-추출물 아가에서 천자 배양 접종(thrust inoculation) 상에서 성장:

접종된 전체 영역에서 양호한 성장을 나타낸다. 상기 미생물은 조건 혐기성으로 확인된다.

이는 젤라틴을 용해하지 못한다.

우유 응고와 함께 우유 상에서 양호한 성장을 나타낸다.

인돌을 생산하지 못한다.

온도 조건: 20 내지 42℃에서 소고기-추출물 브로스 상에서 성장, 최적 온도는 33 내지 37℃의 범위이다.

배양 배지의 pH 값: 6 내지 8의 pH 값을 갖는 액체 배지에서 성장, 최적 값은 7.2이다.

탄소원: 글루코스, 프럭토스, 락토스, 만노즈, 갈락토스, 크실로스, 글리세롤, 만니톨 상에서 산 및 가스를 생성하며 양호한 성장을 나타낸다.

질소원: 암모늄, 질산염의 형태로 뿐만 아니라 일부 유기 화합물의 형태로부터 질소를 동화한다.

암피실린에 대해 내성이다.

L-이소류신이 성장 인자로서 사용된다. 그러나, 상기 균주는 이소류신의 부재하에서도 천천히 성장할 수 있다.

플라스미드 함유: 상기 세포는 암피실린에 내성(100㎎/ℓ)을 주고 트레오닌에 대한 증가된 내성(50㎎/㎖)에 기여하는 rhtC 유전자를 함유하는 다수체 하이브리드 플라스미드 pRhtC를 함유한다.

이. 콜라이 균주 MG442/pVIC40, pRhtC(VKPM 제B-7680호)는 균주 VKPM 제B-7700호와 동일한 배양 형태학적 및 생화학적 특성을 가지나, 상기 균주는, pRhtC에 부가적으로, 스트렙토마이신에 대한 내성(100㎎/ℓ)을 주고 트레오닌 오페론의 유전자들을 함유하는 다수체 하이브리드 플라스미드 pVIC40을 함유한다.

이. 콜라이 균주 NZ10/pRhtB, pRhtC(VKPM 제B-7681호)는 균주 VKPM 제B-7700호와 동일한 배양 형태학적 및 생화학적 특성을 가지나, L-트레오닌(0.1 내지 5㎎/㎖)이 L-이소류신 대신에 성장 인자로서 사용된다. 또한, 상기 균주는 카나마이신에 대한 내성(50㎎/ℓ)을 주고 호모세린에 대한 내성(10㎎/㎖)을 주는 rhtB 유전자를 함유하는 다수체 하이브리드 플라스미드 pRhtB를 함유한다.

이. 콜라이 균주 NZ10/pRhtBC(VKPM 제B-7682호)는 균주 VKPM 제B-7681호와 동일한 배양 형태학적 및 생화학적 특성을 가지나, 상기 균주는 암피실린(100㎎/ℓ)에 대한 내성을 주고 L-호모세린(10㎎/㎖) 및 L-트레오닌(50㎎/㎖)에 대한 내성을 주는 rhtB 및 rhtC 유전자를 모두 함유하는 다수체 하이브리드 플라스미드 pRhtBC를 함유한다.

<3> 아미노산 생산 방법

아미노산은 상기 기술된 바와 같은 rhtC 유전자, 또는 rhtC 유전자 및 rhtB 유전자의 복사체 수를 증폭시킴으로써 Rt 활성, 또는 Rt 활성 및 Rh 활성이 강화되고, 아미노산을 생산하는 능력을 가진 세균을 배양 배지 중에서 배양하고, 아미노산을 생산하고 배지 중에 축적시키며, 상기 배지로부터 아미노산을 회수함으로써 효과적으로 생산될 수 있다. 아미노산은 바람직하게는 L-호모세린, L-트레오닌 및 측쇄형 아미노산으로 예증된다. 측쇄형 아미노산은 L-발린, L-류신 및 L-이소류신으로 예증될 수 있으며, 바람직하게는 L-발린 및 L-류신으로 예증된다.

본 발명의 방법에서, 에세리키아 속에 속하는 세균의 배양, 액체 배지로부터의 아미노산 회수 및 정제는 세균을 이용한 발효로 아미노산을 생산하는 통상적인 방법과 유사한 방식으로 수행할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는, 배지가 탄소원, 질소원 및 무기물을 포함하고, 경우에 따라, 사용되는 세균이 성장을 위해 요구하는 영양분을 적당량으로 포함하는 한, 합성 배지 또는 천연 배지일 수 있다. 탄소원은 글루코스 및 수크로스 같은 다양한 탄수화물, 및 다양한 유기산을 포함할 수 있다. 사용되는 세균의 동화 능력에 따라서, 에탄올 및 글리세롤을 포함하는 알콜이 사용될 수 있다. 질소원으로서, 암모니아, 암모늄 설페이트 같은 다양한 암모늄 염, 아민 같은 기타 질소 화합물, 및 펩톤, 콩 가수분해물 및 소화된 발효 미생물 같은 천연 질소원이 사용된다. 무기물로서, 인산1칼륨, 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산제일철, 황산망간, 탄산칼슘이 사용된다.

배양은 바람직하게는 진탕, 및 통기 및 교반 배양 같은 호기성 조건하의 배양이다. 배양 온도는 일반적으로 20 내지 40℃, 바람직하게는 30 내지 38℃이다. 배양의 pH는 일반적으로 5 내지 9, 바람직하게는 6.5 내지 7.2이다. 배양의 pH는 암모니아, 탄산칼슘, 다양한 산, 다양한 염기, 및 완충액으로 조정할 수 있다. 일반적으로, 1 내지 3일의 배양으로 배지 중 표적 아미노산을 축적시킨다.

아미노산 회수는 배양 후 원심분리 또는 막 여과에 의해 배지로부터 세포 같은 고체를 제거한 후, 이온 교환, 농축 및 결정성 분획화 방법 등으로 표적 아미노산을 회수하고 정제함으로써 수행할 수 있다.

본 발명은 실시예를 참조로 하여 보다 구체적으로 하기에서 설명될 것이다. 실시예에서, 아미노산은 기타 언급이 없는 한 L-배위이다.

실시예 1: rhtB 및 rhtC DNA 단편의 수득

단계 1. 호모세린 및 트레오닌 내성에 관여하는 유전자의 mini-Mu 파아지미드내로의 클로닝

호모세린 및 트레오닌 내성에 관여하는 유전자들을 mini-Mu d5005 파아지미드를 사용하여 생체내 클로닝시켰다[Groisman, E.A., et al., J. Bacteriol., 168, 357-364(1986)]. 균주 MG442의 MuCts62 용원균[Guayatiner et al., Genetika (in Russian), 14, 947-956 (1978)]을 공여체(donor)로 사용하였다. 신선하게 제조된 용해물을 균주 VKPM 제B-513호의 Mucts 용원성 유도체(Hfr K10 metB)를 감염시키는데 사용하였다. 세포를 메티오닌(50㎍/㎖), 카나마이신(40㎍/㎖) 및 호모세린(10㎍/㎖)을 함유하는 M9 글루코스 최소 배지 상에 플레이팅하였다. 48시간 후 생성되는 콜로니를 선발채집하여 분리하였다. 플라스미드 DNA를 분리하고 표준 기술을 사용하여 균주 VKPM 제B-513호를 형질전환시켰다. 형질전환체를 상기와 같이 카나마이신을 함유하는 L-브로스 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 플라스미드 DNA를 호모세린에 대해 내성인 것들로부터 분리하고, 삽입된 단편의 구조를 제한 맵핑하여 분석하였다. 상이한 염색체 영역에 속하는 두 개 유형의 삽입체가 공여체로부터 클로닝된 것으로 보였다. 따라서, 다수체로 호모세린에 대한 내성을 주는 2개 이상의 상이한 유전자들은 이. 콜라이에 존재한다. 상기 2개 유형의 삽입체 중 하나는 이미 공지된 rhtA 유전자이다[ABSTRACT of 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual Meeting of the American Society for Biochemistry and Molecular Biology, San Francisco, California August 24-29, 1997]. 2개 유형의 삽입체 중 다른 하나인, 0.8kb의 MluI-MluI 단편은 호모세린에 대한 내성만을 준다(도 1).

단계 2. rhtB 유전자 및 rhtC 유전자의 동정

상기 삽입체 단편을 생거의 디데옥시 쇄 종결 방법(dideoxy chain termination method of Sanger)으로 서열분석하였다. 양쪽 DNA쇄를 전체적으로 서열분석하고 모든 연결부는 중복해서 서열분석하였다. 상기 서열분석은 삽입체 단편이 이. 콜라이 염색체의 86min에 존재하는, 공지되어 있지만 기능이 미확인된 ORF(개방 판독 프레임)인 f138(GenBank 승인 번호 제M87049의 뉴클레오티드 번호 61543 내지 61959) 및 이의 상류 영역의 약 350bp(M87049의 서열에서 하류 영역)를 포함하고 있음을 나타내었다. 5'-플랭킹 영역에서 단지 160개의 뉴클레오티드만을 갖는 f138은 호모세린에 대한 내성을 줄 수 없었다. 어떠한 종결 코돈도 M87049의 62160 내지 61950번째 뉴클레오티드 사이의 ORF f138의 상류에 존재하지 않는다. 추가로, 리보솜 결합 부위로 예견된 서열에 뒤이은 하나의 ATG가 서열내에 존재한다. 보다 큰 ORF(뉴클레오티드 번호 62160 내지 61546)는 rhtB 유전자로 명명된다. 상기 유전자로부터 유도되는 RhtB 단백질은 소수성이 높고 가능한 막통과 단편들을 함유하는 영역을 갖는다.

하기 기술되는 바와 같이, 상기 유전자를 함유하는 플라스미드는 고농도의 호모세린에 대한 내성만을 세포에 부여하였다. 초기 SacII-SacII DNA 단편이 제2의 미확인된 ORF인 O128을 함유하고 있기 때문에, 상기 유전자를 서브 클로닝하여 호모세린 및 트레오닌에 대한 내성을 부여하는 능력을 시험하였다. O128(ClaI-Eco47III 단편)을 함유하는 플라스미드가 50㎎/㎖ 트레오닌에 대한 내성을 부여함이 입증되었다(도 1). 서브 클로닝된 단편을 서열분석한 결과 M87049의 61213 내지 61214번째 뉴클레오티드 사이의 위치에서 부가적인 뉴클레오티드 (G)를 함유한다는 것이 확인되었다. 서열에 대한 상기 뉴클레오티드 부가는 프레임 이동을 제거하여 상기 ORF를 60860번째 뉴클레오티드까지 5'-플랭킹 영역내로 확장시켰다. 이러한 신규한 유전자는 rhtC로 명명되었다. 두 유전자, rhtB 및 rhtC 모두는 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)의 리신 수송에 관여하는 수송 인자(transporter)와 상동성인 것으로 확인되었다.

실시예 2: 호모세린 생산에 대한 rhtB 및 rhtC 유전자 증폭의 효과

<1> L-호모세린 생산성 이. 콜라이 균주 NZ10/pAL4, pRhtB의 작제 및 호모세린 생산

rhtB 유전자를 플라스미드 pUK21[Vieira, J. and Messing, J., Gene, 100, 189-194 (1991)]에 삽입하여 pRhtB를 수득하였다(도 2).

이. 콜라이 균주 NZ10을, 아스파르토키나제-호모세린 데하이드로게나제 I을 암호화하는 thrA 유전자가 삽입된 pBR322 벡터인 플라스미드 pAL4로 형질전환시켜 균주 NZ10/pAL4를 수득하였다. 상기 균주 NZ10은 이. 콜라이 균주 C600(thrB, leuB)으로부터 수득된 leuB⁺-복귀 돌연변이체 thrB^-이다[Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452, 1954].

균주 NZ10/pAL4를 pUK21 또는 pRhtB로 형질전환시켜 균주 NZ10/pAL4, pUK21 및 NZ10/pAL4,pRhtB를 수득하였다.

이렇게 수득된 형질전환체를 각각 카나마이신 50㎎/ℓ 및 암피실린 100㎎/ℓ를 함유하는 영양 브로스 중에 37℃에서 18시간 동안 배양하고, 수득된 배양물 0.3㎖를 20 x 200㎜ 시험관 중 하기 조성을 갖고 카나마이신 50㎎/ℓ 및 암피실린 100㎎/ℓ를 함유하는 발효 배지 3㎖내로 접종한 후, 회전 진탕기로 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배양 후, 공지된 방법으로 배지 중 호모세린의 축적량 및 560㎚에서 배지의 흡광도를 측정하였다.

[발효 배지 조성(g/ℓ)]

글루코스	80
(NH₄)₂SO₄	22
K₂HPO₄	2
NaCl	0.8
MgSO₄·7H₂O	0.8
FeSO₄·7H₂O	0.02
MnSO₄·5H₂O	0.02
티아민 하이드로클로라이드	0.2
효모 추출물	1.0
CaCO₃	30
CaCO₃은 따로 멸균시킨다.

결과는 표 1에 나타낸다. 표 1에서 나타낸 바와 같이, 균주 NZ10/pAL4,pRhtB는 rhtB 유전자가 강화되지 않은 균주 NZ10/pAL4,pUK21보다 더 많은 양의 호모세린을 축적시켰다.

균주	OD₅₆₀	호모세린의 축적량(g/ℓ)
NZ10/pAL4, pUK21	14.3	3.3
NZ10/pAL4, pRhtB	15.6	6.4

<2> 호모세린-생산성 이. 콜라이 균주 MG442/pRhtC의 작제 및 호모세린 생산

rhtC 유전자를 pUC21 벡터[Vieira, J. and Messing, J., Gene, 100, 189-194 (1991)]내로 삽입하여 pRhtC를 수득하였다(도 3).

3g/ℓ 이상의 양으로 트레오닌을 생산할 수 있는 공지된 이. 콜라이 균주 MG442[Gusyatiner, et al., 1978, Genetika(in Russian), 14: 947-956]를 pUC21 또는 pRhtC로 도입하여 형질전환시켜 MG442/pUC21 및 MG442/pRhtC 균주를 수득하였다.

이렇게 수득된 형질전환체를 암피실린 100㎎/㎖를 함유하는 영양 브로스내에 37℃에서 18시간 동안 각각 배양하고, 수득된 배양액 0.3㎖를 20 x 200㎜ 시험관 중 암피실린 100㎎/㎖를 함유하는 상기된 발효 배지 3㎖에 접종한 후, 회전 진탕기로 37℃에서 48시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 공지된 방법으로 배지 중 호모세린의 축적량과 560㎚에서 배지의 흡광도를 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.

균주	OD₅₆₀	호모세린의 축적량(g/ℓ)
MG442/pUC21	9.7	<0.1
MG442/pRhtC	15.2	9.5

실시예 3: 트레오닌 생산에 대한 rhtB 및 rhtC 유전자 증폭의 효과

<1> 트레오닌-생산성 이. 콜라이 균주 MG442/pVIC40, pRhtB(VKPM 제B-7660호)의 작제 및 트레오닌 생산

통상적인 형질전환 방법으로 공지된 플라스미드 pVIC40[미국 특허 제5,175,107호 (1992)]을 도입시켜 균주 MG442를 형질전환시켰다. 형질전환체를 스트렙토마이신 0.1㎎/㎖를 함유하는 LB 아가 플레이트 상에서 선별하였다. 따라서, 신규한 균주 MG442/pVIC40을 수득하였다.

균주 MG442/pVIC40을 pUK21 또는 pRhtB로 형질전환시켜 균주 MG442/pVIC40, pUK21 및 MG442/pVIC40, pRhtB를 수득하였다.

이렇게 수득된 형질전환체를 카나마이신 50㎎/ℓ 및 스트렙토마이신 100㎎/ℓ를 함유하는 영양 브로스 중에 37℃에서 18시간 동안 각각 배양하고, 수득된 배지 0.3㎖를 20 x 200㎜ 시험관 중 카나마이신 50㎎/ℓ 및 스트렙토마이신 100㎎/ℓ를 함유하는 실시예 2에서 기술된 발효 배지 3㎖내로 접종한 후, 회전 진탕기로 37℃에서 68시간 동안 배양시켰다. 배양 후, 공지된 방법으로 배지 중 트레오닌의 축적량 및 560㎚에서 배지의 흡광도를 측정하였다.

결과를 표 3에 나타낸다. 표 3에서 나타낸 바와 같이, 균주 MG442/pVIC40, pRhtB는 rhtB 유전자가 강화되지 않은 균주 MG442/pVIC40, pUK21보다 더 많은 양의 트레오닌을 축적시켰다.

균주	OD₅₆₀	트레오닌의 축적량(g/ℓ)
MG442/pVIC40, pUK21	16.3	12.9
MG442/pVIC40, pRhtB	15.2	16.3

<2> 트레오닌-생산성 이. 콜라이 균주 MG442/pVIC40, pRhtC(VKPM 제B-7680호)의 작제 및 트레오닌 생산

균주 MG442/pVIC40을 pRhtC 및 pUC21로 형질전환시켰다. 따라서 형질전환체 MG442/pVIC40, pRhtC 및 MG442/pVIC40, pUC21을 수득하였다. 상기된 바와 동일한 방식으로, MG442/pVIC40, pUC21 및 MG442/pVIC40, pRhtC를 암피실린 100㎎/ℓ 및 스트렙토마이신 100㎎/ℓ를 함유하는 영양 브로스 중에 37℃에서 18시간 동안 각각 배양하고, 수득된 배양물 0.3㎖를 20 x 200㎜ 시험관 중 암피실린 100㎎/ℓ 및 스트렙토마이신 100㎎/ℓ를 함유하는 상기된 발효 배지 3㎖에 접종한 후, 회전 진탕기로 37℃에서 46시간 동안 배양하였다. 배양 후, 공지된 방법으로 배지 중 트레오닌의 축적량 및 560㎚에서 배지의 흡광도를 측정하였다.

결과를 표 4에 나타낸다. 표 4에서 나타낸 바와 같이, 균주 MG442/pVIC40, pRhtC는 rhtC 유전자가 강화되지 않은 균주 MG442/pVIC40, pUC21보다 더 많은 양으로 트레오닌을 축적시켰다.

균주	OD₅₆₀	트레오닌의 축적량(g/ℓ)
MG442/pVIC40, pUC21	17.4	4.9
MG442/pVIC40, pRhtC	15.1	10.2

실시예 4: 아미노산 생산에 대한 rhtB 유전자 및 rhtC 유전자의 협력 효과

rhtB 및 rhtC 유전자를 모두 함유하는 SacII-SacII DNA 단편을 pUC21에 삽입시켰다. 따라서, rhtB 유전자 및 rhtC 유전자를 보유하는 플라스미드 pRhtBC를 수득하였다(도 4).

이후, 균주 NZ10을 pUC21, pRhtB, pRhtC 또는 pRhtBC로 형질전환시키고, 형질전환체 NZ10/pUC21(VKPM 제B-7685호), NZ10/pRhtB(VKPM 제B-7683호), NZ10/pRhtC(VKPM 제B-7684호), NZ10/pRhtB, pRhtC(VKPM 제B-7681호) 및 NZ10/pRhtBC(VKPM 제B-7682호)를 따라서 수득하였다.

상기 수득된 형질전환체를 상기 기술된 바와 동일한 방식으로 배양하고 공지된 방법으로 배지 중 다양한 아미노산의 축적량 및 540㎚에서 배지의 흡광도를 측정하였다.

결과를 표 5에 나타내었다. 표 5로부터 호모세린, 발린 및 류신의 생산에서 pRhtB 및 pRhtC의 협력효과가 나타난다. 이러한 결과는, rhtB 및 rhtC 유전자 생성물이 세포내에서 상호작용할 수 있음을 나타낸다.

균주	OD₅₆₀	호모세린(g/ℓ)	발린(g/ℓ)	루이신(g/ℓ)
NZ10/pUC21	18.7	0.6	0.22	0.16
NZ10/pRhtB	19.6	2.3	0.21	0.14
NZ10/pRhtC	20.1	0.7	0.2	0.15
NZ10/pRhtBC	21.8	4.2	0.34	0.44
NZ10/pRhtB, pRhtC	19.2	4.4	0.35	0.45

실시예 5: 아미노산에 대한 내성에서 rhtB 유전자 및 rhtC 유전자의 효과

상기된 바와 같이, rhtB 및 rhtC 유전자를 보유하는 플라스미드는 상이한 균주에 의한 배양 브로스에서 특정 아미노산 축적에 대한 포지티브 효과를 갖는다. 축적된 아미노산의 패턴은 균주 유전자형에 의한다는 것을 입증하였다. rhtB 및 rhtC 유전자 생성물과 코리네박테리움 글루타미쿰의 리신 수송 인자 LysE와의 상동성[Vrljic, M., Sahm, H. and Eggeling, L. (1996) Mol. Microbiol. 22, 815-826.]은 이러한 단백질에 대한 유사체 기능을 나타낸다.

따라서, 공지된 균주 W3350(VKPM 제B-1557호)의 스트렙토마이신-내성(Str^R) 돌연변이체인 균주 N99의 특정 아미노산들 및 아미노산 유사체에 대한 민감성에서의 pRhtB 및 pRhtC 플라스미드의 효과를 시험하였다. 균주 N99/pUC21, N99pUK21, N99/pRhtB 및 N99/pRhtC의 밤새 브로스 배양한 배양물(10⁹cfu/㎖)을 M9 최소 배지에서 1:100으로 희석하여 동일 배지에서 5시간 동안 성장시켰다. 이후, 이렇게 수득된 대수 증식기(log phase) 배양물을 희석하고 약 10⁴개의 생세포를 배수 증가량의 아미노산 또는 유사체를 함유하는 M9 아가(2%)를 포함하는 잘-건조시킨 시험 플레이트에 적용시켰다. 따라서, 이러한 화합물의 최소 억제 농도(MIC)를 조사하였다.

결과를 표 6에 나타낸다. 표 6으로부터 다수체의 rhtB는 호모세린 이외에 α-아미노-β-하이드록시발레르산(AHVA) 및 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인(AEC), 및 4-아자-DL-류신에 대한 증가된 내성을 부여하며; 다수체의 rhtC는 트레오닌 이외에 발린, 히스티딘, 및 AHVA에 대한 증가된 내성을 부여함을 나타난다. 이러한 결과는 가정된 수송 인자들인, RhtB 및 RhtC 모두가 수 개의 기질(아미노산)에 특이성을 가지며, 증폭의 결과로서 비-특이적인 효과를 나타낼 수 있음을 나타낸다.

기질	MIC(㎍/㎖)
기질	N99/pUC21^*	N99/pRhtB	N99/pRhtC
L-호모세린	1000	20000	1000
L-트레오닌	30000	40000	80000
L-발린	0.5	0.5	2.0
L-히스티딘	5000	5000	40000
AHVA	100	2000	15000
AEC	5	20	5
4-아자-DL-류신	50	100	50
O-메틸-L-트레오닌	20	20	20
* : 동일한 데이터를 N99/pUK21을 사용해도 수득하였다

<110> Ajinomoto Co., Inc. <120> Novel gene and method for producing L-amino acids <130> OP851 <150> RU -98123511 <151> 1998-12-23 <160> 4 <170> KOPATIN 1.5 <210> 1 <211> 1231 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (557)..(1171) <400> 1 agaaataatg tggagatcgc accgcccatc gaatgtgcca gtatatagcg tttacgccac 60 ggaccgggct gaacctcctg ctgccagaat gccgccagat catcaacata atcattaaag 120 cgattaacat gcccgagatg cggatcggct aacaggcgac cggaacgtcc ctgcccgcga 180 tggtcgatga ttaagacatc aaaccccaaa tggaacaggt cataggccag ttccgcatat 240 tttacgtagc tctcaatacg ccccgggcag atgactacca cccggtcatg gtgctgtgcg 300 cgaaaacgga caaagcgcac cggaatgtca tccacaccag taaactctgc ttcatcacgc 360 tgacgccaga aatcagtcag cggtcccatg gtaaaagcag caaacgcgtt ttctcttgtt 420 tcccagtctt tttgctgctg aaacatcggg taatctgcct cttaaaccac gtaaaatcgt 480 tttttttagc gtgcctgaca caacgctgcg acagtagcgt attgtggcac aaaaatagac 540 acaccgggag ttcatc atg acc tta gaa tgg tgg ttt gcc tac ctg ctg 589 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu 1 5 10 aca tcg atc att tta acg ctg tcg cca ggc tct ggt gca atc aac act 637 Thr Ser Ile Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr 15 20 25 atg acc acc tcg ctc aac cac ggt tat ccg gcc ggt ggc gtc tat tgc 685 Met Thr Thr Ser Leu Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys 30 35 40 tgg gct tca gac cgg act ggc gat tca tat tgt gct ggt tgg cgt ggg 733 Trp Ala Ser Asp Arg Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly 45 50 55 gtt ggg acg cta ttt tcc cgc tca gtg att gcg ttt gaa gtg ttg aag 781 Val Gly Thr Leu Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys 60 65 70 75 tgg gca ggc gcg gct tac ttg att tgg ctg gga atc cag cag tgg cgc 829 Trp Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg 80 85 90 gcc gct ggt gca att gac ctt aaa tcg ctg gcc tct act caa tcg cgt 877 Ala Ala Gly Ala Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg 95 100 105 cga cat ttg ttc cag cgc gca gtt ttt gtg aat ctc acc aat ccc aaa 925 Arg His Leu Phe Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys 110 115 120 agt att gtg ttt ctg gcg gcg cta ttt ccg caa ttc atc atg ccg caa 973 Ser Ile Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln 125 130 135 cag ccg caa ctg atg cag tat atc gtg ctc ggc gtc acc act att gtg 1021 Gln Pro Gln Leu Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val 140 145 150 155 gtc gat att att gtg atg atc ggt tac gcc acc ctt gct caa cgg att 1069 Val Asp Ile Ile Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile 160 165 170 gct cta tgg att aaa gga cca aag cag atg aag gcg ctg aat aag att 1117 Ala Leu Trp Ile Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile 175 180 185 ttc ggc tcg ttg ttt atg ctg gtg gga gcg ctg tta gca tcg gcg agg 1165 Phe Gly Ser Leu Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg 190 195 200 cat gcg tgaaaaata atgtcggatg cggcgtaaac gccttatccg acttactctg 1220 His Ala 205 aagacgcgtc t 1231 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp Ala Ser Asp Arg 35 40 45 Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val Gly Thr Leu Phe 50 55 60 Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe Gln 100 105 110 Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe Leu 115 120 125 Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu Met 130 135 140 Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile Val 145 150 155 160 Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile Lys 165 170 175 Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu Phe 180 185 190 Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205 <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (187)..(804) <400> 3 atgccgatca ccgccagcga aatgctcagc gttaacggcg ttgggatgcg caagctggaa 60 cgctttggca aaccgtttat ggcgctgatt cgtgcgcatg ttgatggcga tgacgaagag 120 tagtcagcag cataaaaaag tgccagtatg aagactccgt aaacgtttcc cccgcgagtc 180 aaatgt atg ttg atg tta ttt ctc acc gtc gcc atg gtg cac att gtg 228 Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val 1 5 10 gcg ctt atg agc ccc ggt ccc gat ttc ttt ttt gtc tct cag acc gct 276 Ala Leu Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala 15 20 25 30 gtc agt cgt tcc cgt aaa gaa gcg atg atg ggc gtg ctg ggc att acc 324 Val Ser Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr 35 40 45 tgc ggc gta atg gtt tgg gct ggg att gcg ctg ctt ggc ctg cat ttg 372 Cys Gly Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu 50 55 60 att atc gaa aaa atg gcc tgg ctg cat acg ctg att atg gtg ggc ggt 420 Ile Ile Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly 65 70 75 ggc ctg tat ctc tgc tgg atg ggt tac cag atg cta cgt ggt gca ctg 468 Gly Leu Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu 80 85 90 aaa aaa gag gcg gtt tct gca cct gcg cca cag gtc gag ctg gcg aaa 516 Lys Lys Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys 95 100 105 110 agt ggg cgc agt ttc ctg aaa ggt tta ctg acc aat ctc gct aat ccg 564 Ser Gly Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro 115 120 125 aaa gcg att atc tac ttt ggc tcg gtg ttc tca ttg ttt gtc ggt gat 612 Lys Ala Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp 130 135 140 aac gtt ggc act acc gcg cgc tgg ggc att ttt gcg ctg atc att gtc 660 Asn Val Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val 145 150 155 gaa acg ctg gcg tgg ttt acc gtc gtt gcc agc ctg ttt gcc ctg ccg 708 Glu Thr Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro 160 165 170 caa atg cgc cgt ggt tat caa cgt ctg gcg aag tgg att gat ggt ttt 756 Gln Met Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe 175 180 185 190 gcc ggg gcg tta ttt gcc gga ttt ggc att cat ttg att att tcg cgg 804 Ala Gly Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg 195 200 205 tgatgc cagacgcgtc ttcagagtaa gtcggataag 840 <210> 4 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly 35 40 45 Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile 50 55 60 Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys 85 90 95 Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly 100 105 110 Arg Ser Phe Leu Lys Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala 115 120 125 Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val 130 135 140 Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr 145 150 155 160 Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met 165 170 175 Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly 180 185 190 Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg 195 200 205

Claims

서열 목록 중 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 암호화하는 유전자의 복사체 수를 증폭시키거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 서열을 에세리키아 속에 속하는 세균 내에서 효과적으로 기능하는 프로모터 서열로 대체시켜 상기 세균의 세포 내에서 서열번호 4의 아미노산 서열로 구성되는 단백질의 활성을 강화시킴으로써, L-트레오닌 내성이 강화된 에세리키아 속에 속하는 세균.
제1항에 있어서, 서열 목록 중 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질을 암호화하는 유전자의 복사체 수를 증폭시키거나 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 프로모터 서열을 에세리키아 속에 속하는 세균 내에서 효과적으로 기능하는 프로모터 서열로 대체시켜 상기 세균의 세포 내에서 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 단백질의 활성을 강화시킴으로써, L-호모세린 내성이 추가로 강화된 세균.
제1항에 있어서, 제1항에 정의된 단백질의 활성이 상기 단백질을 암호화하는 DNA로 세균을 형질전환시킴으로써 강화되는 세균.
제2항에 있어서, 제2항에 정의된 단백질의 활성이 상기 단백질을 암호화하는 DNA로 세균을 형질전환시킴으로써 강화되는 세균.
아미노산을 생산하는 능력을 가지며, 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에서 정의된 바와 같은 세균을 배양 배지에서 배양하여, 아미노산을 생산하고 배지 중에 축적시키는 단계, 및 배지로부터 아미노산을 회수하는 단계를 포함하는 아미노산의 생산 방법.
제5항에 있어서, 아미노산이 L-호모세린; L-트레오닌; 및 L-발린, L-류신 또는 L-이소류신인 측쇄형 아미노산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
제6항에 있어서, 측쇄형 아미노산이 L-발린 또는 L-류신인 방법.
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