JP2000189177A

JP2000189177A - 新規遺伝子及びアミノ酸の製造法

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Publication number: JP2000189177A
Application number: JP11356018A
Authority: JP
Inventors: Livshits Vitaly Arkadievich; ヴィタリー・アルカージエヴィッチ・リヴィシッツ; Pavlovna Zakataeva Nataliya; ナターリヤ・パーヴロヴナ・ザカタエヴァ; Venijaminovich Aryoshin Vladimir; ヴラジーミル・ヴェニヤミノヴィッチ・アリョーシン; Valentinovna Belaryova Ara; アーラ・ヴァレンチーノヴナ・ベラリョーヴァ; Libovna Tokmakova Ilina; イリーナ・リヴォヴナ・トクマコーヴァ
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1998-12-23
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2000-07-11
Also published as: CA2291454A1; US20050239177A1; AU6543599A; EP1013765B2; CN1260393A; ES2293707T5; EP1013765A1; DK1013765T4; KR100720300B1; SK286619B6; RU2148642C1; DE69937036T2; SK184399A3; ATE372383T1; DE69937036T3; CN1165613C; US20160289716A1; US9394346B2; BR9906283A; SK288294B6

Abstract

(57)【要約】【課題】アミノ酸、特にＬ−リジン、Ｌ−バリン及び
Ｌ−スレオニンをエシェリヒア属細菌で高収率で製造す
る方法を提供する。【解決手段】アミノ酸生産能を有し、かつ、スレオニ
ンに対する耐性を付与する活性を有するタンパク質をコ
ードする遺伝子（rhtC）が増強されたエシェリヒア属細
菌を培地で培養し、該培養物中にアミノ酸を生成蓄積せ
しめ、該培養物から前記アミノ酸を採取する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、バイオテクノロジ
ー、具体的には新規遺伝子及びアミノ酸の製造法に関
し、特に、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−リジ
ン又はＬ−ロイシンをエシェリヒア属細菌を用いて製造
する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、エシェリヒア・コリＫ−
１２株において、最小培地中で高濃度のスレオニン又は
ホモセリンに対する耐性に関与する変異thrR（以下、
「rhtA23」ともいう）を獲得した変異株を取得している
（Astaurova, O. B. et al., Appl. Biochem. and Mic
robiol., 21, 611-616 (1985)）。この変異は、Ｌ−ス
レオニン生産菌（SU Patent No. 974817）、ホモセリン
生産菌及びグルタミン酸生産菌（Astaurova, O.B. et a
l., Appl. Bioch. And Microbiol., 27, 556-561,199
1）のそれぞれのアミノ酸生産能を改善する。

【０００３】さらに本発明者は、rhtA遺伝子はエシェリ
ヒア・コリ染色体の１８分の位置にあり、これがpexB遺
伝子とompX遺伝子との間にあるＯＲＦ１と同一であるこ
とをつきとめた。そして、同ＯＲＦ１によってコードさ
れるタンパク質を発現する単位をrhtA（rht：ホモセリ
ンおよびスレオニン耐性）遺伝子と命名した。すなわ
ち、rhtA遺伝子とは、ＳＤ配列などの５’非コード領
域、ＯＲＦ１及びターミネーター等を含む。また、野生
型rhtA遺伝子をマルチコピーとしてクローン化した場合
には、スレオニン又はホモセリンに対する耐性に関与す
ること、及び、rhtA23変異はATG開始コドンの−１の位
置のG→A置換であることを見出している（ABSTRACTS of
17th Internatinal Congress of Biochemistry and Mo
lecular Biology in conjugatin with 1997 Annual Mee
ting of the American Society for Biochemistry and
Molecular Biology, San Francisco, California Augus
t 24-29, 1997, abstract No. 457）。

【０００４】尚、上記のrhtA遺伝子をクローニングする
際に、エシェリヒア・コリには、マルチコピーでスレオ
ニン又ホモセリンに対する耐性を付与する少なくとも２
つの異なる遺伝子が存在することを見出している。これ
らのうち一方は、rhtA遺伝子であり、他方の遺伝子は、
ホモセリン耐性を付与するrhtB遺伝子であることが明ら
かにされている（ロシア特許出願Ｎ９７１１７８７５
号）。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、スレオニン
に対する耐性に関与する新規な遺伝子を提供し、さらに
該遺伝子を用いてアミノ酸、特にＬ−ホモセリン、Ｌ−
スレオニン、又は分岐鎖アミノ酸を高収率で製造する方
法を提供することを課題とするものである。

【０００６】

【発明を解決するための手段】本発明者は、エシェリヒ
ア・コリ染色体の８６分の領域をマルチコピーベクター
でクローニングすると、エシェリヒア・コリ細胞にホモ
セリン耐性が付与されること、及び、その上流領域にス
レオニン耐性に関与する新規な遺伝子rhtCが存在するこ
とを見いだした。さらに、これらの遺伝子を増幅する
と、rhtAと同様に、エシェリヒア・コリのアミノ酸生産
能を向上させることができることを見い出し、本発明を
完成するに至った。すなわち本発明は、以下のとおりで
ある。

【０００７】（１）以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク
質の細胞中の活性が増強されたことにより、Ｌ−スレオ
ニン耐性が増強されたエシェリヒア属細菌。（Ａ）配列表配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（Ｂ）配列表配列番号４において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなるタンパク質であって、そのタンパク質を有
する細菌をＬ−スレオニン耐性にする活性を有するタン
パク質。（２）さらに、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質の
細胞中の活性が増強されたことにより、Ｌ−ホモセリン
耐性が増強された（１）の細菌。（Ｃ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（Ｄ）配列表配列番号２において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなるタンパク質であって、そのタンパク質を有
する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性を有するタン
パク質。（３）前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコードする
ＤＮＡで形質転換されたことにより同タンパク質の活性
が増強された（１）又は（２）記載の細菌。（４）前記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質をコードする
ＤＮＡで形質転換されたことにより同タンパク質の活性
が増強された（２）記載の細菌。

【０００８】（５）前記（１）〜（４）のいずれか一項
に記載の細菌であってアミノ酸生産能を有するものを培
地で培養し、該培養物中にアミノ酸を生成蓄積せしめ、
該培養物から前記アミノ酸を採取することを特徴とする
アミノ酸の製造法。（６）前記アミノ酸が、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−スレオニ
ン、又は分岐鎖アミノ酸から選ばれることを特徴とする
（５）の製造法。（７）前記分岐鎖アミノ酸が、Ｌ−バリン又はＬ−ロイ
シン又であることを特徴とする（６）の製造法。

【０００９】（８）下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパ
ク質をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、その
タンパク質を有する細菌をＬ−スレオニン耐性にする活
性を有するタンパク質。（９）下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡである（８）
のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜８０４からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜８０４からなる塩基配列とス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、そ
のタンパク質を有する細菌をＬ−スレオニン耐性にする
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。（１０）前記ストリンジェントな条件が、１×ＳＳＣ及
び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で洗浄が行
われる条件である（９）のＤＮＡ。

【００１０】尚、上記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質を
「RhtCタンパク質」、これをコードするＤＮＡを「rht
C」遺伝子、（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質を「RhtBタ
ンパク質」、これをコードするＤＮＡを「rhtB」遺伝子
ともいう。また、細菌のＬ−スレオニンに対する耐性に
関与するRhtCタンパク質の活性（すなわち、そのRhtCタ
ンパク質を有する細菌をＬ−スレオニン耐性にする活
性）を「Rt活性」、細菌のＬ−ホモセリンに対する耐性
に関与するRhtBタンパク質の活性（すなわち、そのRhtB
タンパク質を有する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活
性）を「Rh活性」ともいう。また、rhtB遺伝子又はrhtC
遺伝子中、RhtBタンパク質又はRhtCタンパク質をコード
する構造遺伝子を「rhtB構造遺伝子」又は「rhtC構造遺
伝子」ともいう。また、「Rh活性又はRt活性を増強す
る」とは、細胞内のRhtBタンパク質又はRhtCタンパク質
の分子数を増加させる、これらのタンパク質の比活性を
上昇させる、これらのタンパク質の発現や活性に対し、
負の効果を与える機構を解除する等の手段を通じて、Ｌ
−スレオニン又はＬ−ホモセリンに対する耐性を細胞に
付与すること、あるいは同耐性の程度を高めることを意
味する。「タンパク質をコードするＤＮＡ」とは、ＤＮ
Ａが二本鎖の場合にはそのいずれか一方の鎖がタンパク
質をコードすることを意味する。Ｌ−スレオニン耐性と
は、細菌が、その野生型細菌が生育できない濃度（通常
には＞３０ｍｇ／ｍｌ）のＬ−スレオニンを含む最小培
地で生育する性質を意味する。Ｌ−ホモセリン耐性と
は、細菌が、その野生型細菌が生育できない濃度（通常
には＞５ｍｇ／ｍｌ）のＬ−ホモセリンを含む最小培地
で生育する性質を意味する。アミノ酸生産能とは、細菌
が、その野生型細菌よりも多量にアミノ酸を培地中に生
成蓄積する性質を意味する。

【００１１】本発明により、エシェリヒア属細菌に高濃
度のＬ−スレオニン、又はＬ−スレオニン及びＬ−ホモ
セリンに対する耐性を付与することができる。Ｌ−スレ
オニン、又はＬ−スレオニン及びＬ−ホモセリンに対す
る耐性が上昇し、アミノ酸生産能を有するエシェリヒア
属細菌は、アミノ酸、特にＬ−ホモセリン、Ｌ−スレオ
ニン、又はＬ−バリンもしくはＬ−ロイシン等の分岐鎖
アミノ酸を高収率で培地中に蓄積する。

【００１２】

【発明の実施の形態】以下、本発明を詳細に説明する。

【００１３】＜１＞本発明に用いるＤＮＡ本発明に用いる第一のＤＮＡ（rhtC遺伝子）は、Rt活性
を有し、かつ、配列表配列番号４に示すアミノ酸配列を
有するタンパク質をコードする。本発明のＤＮＡとして
具体的には、配列表配列番号３において塩基番号１８７
〜８０４からなる塩基配列を有するＤＮＡが挙げられ
る。

【００１４】また、本発明に用いる第二のＤＮＡ（rhtB
遺伝子）は、Rh活性を有し、かつ、配列表配列番号２に
示すアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。本
発明のＤＮＡとして具体的には、配列表配列番号１にお
いて塩基番号５５７〜１１７１からなる塩基配列を有す
るＤＮＡが挙げられる。

【００１５】配列番号１に示す塩基配列を有するRhtB遺
伝子は、GenBank accession numberM87049の配列の相補
鎖の一部に相当し、エシェリヒア・コリ染色体の８６分
の位置に存在する公知かつ機能未知のＯＲＦ（オープン
リーディングフレーム）であるf138（M87049の塩基番号
61959〜61543）と、その５’及び３’隣接領域を含む。
f138は、５’隣接領域に１６０ヌクレオチドしか含ま
ず、ホモセリン耐性を付与しない。M87049の塩基番号62
160〜61959（ORF f138の上流）には終始コドンが存在し
ない。さらに、この配列のATGコドンの一つは、リボゾ
ーム結合部位（M87049中、62171-62166）が先行してい
る。したがって、コード領域は２０１ｂｐ長い。この大
きいORF（M87049の塩基番号62160〜61543）は、rhtB遺
伝子と命名された。

【００１６】rhtB遺伝子は、例えば、mini-Mu d5005フ
ァージミッドを用いる方法（Groisman, E. A., et al.,
J. Bicteriol., 168, 357-364 (1986)）により、エシ
ェリヒア・コリ、例えばK12株又はW3110株の溶原化株の
溶菌液を用いて、エシェリヒア・コリのMucts溶原化株
に感染させ、カナマイシン（40μg/ml）及びホモセリン
(10 mg/ml)を含む最小培地で生育するコロニーからプラ
スミドＤＮＡを単離することによって得られる。また、
rhtB遺伝子は、後記実施例に示すように、エシェリヒア
・コリ染色体の８６分の位置にマップされたことから、
エシェリヒア・コリ染色体の８６分の位置に近接する領
域に相当する配列を有するオリゴヌクレオチドを用いた
コロニーハイブリダイゼーション、又はＰＣＲ（ポリメ
ラーゼ・チェイン・リアクション：White,T.J. et al ;
Trends Genet. 5,185(1989)参照））によって得ること
ができる。また、ＰＣＲ又はハイブリダイゼーションに
用いるオリゴヌクレオチドは、配列番号１に示す塩基配
列から設計することもできる。ＰＣＲのプライマーとし
て、配列番号１において塩基番号５５７よりも上流の領
域、及び塩基番号１１７１よりも下流の領域にそれぞれ
対応する塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを用いる
と、コード領域全長を増幅することができる。

【００１７】オリゴヌクレオチドの合成は、例えば、Ap
plied Biosystems社製ＤＮＡ合成機model 380Bを使用
し、ホスホアミダイト法を用いて（Tetrahedron Letter
s(1981),22,1859参照）常法に従って合成できる。PCR反
応は、宝酒造（株）製DNAサーマルサイクラー PJ2000型
を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定
された方法に従って行うことができる。

【００１８】また、rhtC遺伝子は、後記実施例に示すよ
うに、rhtB遺伝子を得た際に、rhtB遺伝子を含むＤＮＡ
断片中に偶然得られた遺伝子である。rhtC遺伝子は、機
能未知のORF o128（GenBankのaccession number M87049
の塩基番号60860〜61480）に相当する。rhtC遺伝子は、
配列番号３に示す塩基配列から設計したオリゴヌクレオ
チドを用いたＰＣＲ又はハイブリダイゼーションによ
り、エシェリヒア・コリから取得することができる。Ｐ
ＣＲのプライマーとしては、配列番号３において塩基番
号１８７よりも上流の領域、及び塩基番号８０４よりも
下流の領域にそれぞれ対応する塩基配列を有するオリゴ
ヌクレオチドを用いると、コード領域全長を増幅するこ
とができる。

【００１９】本発明において、RhtBタンパク質をコード
するＤＮＡは、コードされるRhtBタンパク質のRh活性が
損なわれない限り、１若しくは複数の位置で１若しくは
数個のアミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加された
RhtBタンパク質をコードするものであってもよい。

【００２０】また、RhtCタンパク質をコードするＤＮＡ
は、コードされるRhtCタンパク質のRt活性が損なわれな
い限り、１若しくは複数の位置で１若しくは数個のアミ
ノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたRhtCタンパ
ク質をコードするものであってもよい。

【００２１】このようなRhtBタンパク質又はRhtCタンパ
ク質と実質的に同一のタンパク質をコードするＤＮＡ
は、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されるように塩
基配列を改変することによって得られる。また、上記の
ような改変されたＤＮＡは、従来知られている突然変異
処理によっても取得され得る。突然変異処理としては、
RhtBタンパク質をコードするＤＮＡ又はRhtCタンパク質
をコードするＤＮＡをヒドロキシルアミン等でインビト
ロ処理する方法、及びRhtBタンパク質をコードするＤＮ
Ａを保持するエシェリヒア属細菌を、紫外線照射または
N−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジン（NT
G）もしくは亜硝酸等の通常人工突然変異に用いられて
いる変異剤によって処理する方法が挙げられる。

【００２２】上記のようにしてインビトロ変異処理した
ＤＮＡを、適当な細胞でマルチコピーで発現させ、その
細胞のＬ−ホモセリン又はＬ−スレオニンに対する耐性
を調べ、耐性が上昇したものを選択することにより、Rh
tBタンパク質又はRhtCタンパク質と実質的に同一のタン
パク質をコードするＤＮＡが得られる。また、一般にタ
ンパク質のアミノ酸配列及びそれをコードする塩基配列
は、種間、株間、変異体、変種間でわずかに異なること
が知られているので、実質的に同一のタンパク質をコー
ドするＤＮＡは、エシェリヒア属のＬ−ホモセリン耐性
又はＬ−スレオニン耐性の種、株、変異体、変種から得
ることが可能である。

【００２３】具体的には、変異処理したエシェリヒア属
細菌、又はエシェリヒア属細菌の自然突然変異株若しく
は変種から、例えば配列表の配列番号１に記載の塩基配
列のうち、塩基番号５５７〜１１７１からなる塩基配列
を有するＤＮＡ又は同ＤＮＡから調製され得るプローブ
とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
つ、Rh活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを単
離することによっても、RhtBタンパク質と実質的に同一
のタンパク質をコードするＤＮＡが得られる。また、変
異処理したエシェリヒア属細菌、又はエシェリヒア属細
菌の自然突然変異株若しくは変種から、例えば配列表の
配列番号１に記載の塩基配列のうち、塩基番号１８７〜
８０４からなる塩基配列を有するＤＮＡとストリンジェ
ントな条件下でハイブリダイズし、かつ、Rt活性を有す
るタンパク質をコードするＤＮＡを単離することによっ
ても、RhtCタンパク質と実質的に同一のタンパク質をコ
ードするＤＮＡが得られる。ここでいう「ストリンジェ
ントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形
成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件を
いう。この条件を明確に数値化することは困難である
が、一例を示せば、相同性が高い核酸同士、例えば７０
％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズ
し、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズし
ない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーショ
ンの洗いの条件である６０℃、１×ＳＳＣ，０．１％Ｓ
ＤＳ、好ましくは、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに
相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が挙げられ
る。

【００２４】＜２＞本発明のエシェリヒア属細菌本発明のエシェリヒア属細菌は、Rt活性が増強されたエ
シェリヒア属細菌である。また、本発明のエシェリヒア
属細菌の好ましい態様は、さらにRh活性が増強されたエ
シェリヒア属細菌である。エシェリヒア属細菌として具
体的には、エシェリヒア・コリが挙げられる。Rt活性
は、例えば、rhtC構造遺伝子の細胞内のコピー数を増幅
すること、又は、RhtCタンパク質をコードするrhtC構造
遺伝子を含むＤＮＡ断片をエシェリヒア属細菌中で効率
よく機能するプロモーター配列に連結して得られる組換
えＤＮＡを用いてエシェリヒア属細菌を形質転換するこ
とによって、増強することができる。また、染色体ＤＮ
Ａ上のrhtC遺伝子のプロモーター配列を、エシェリヒア
属細菌中で効率よく機能する他のプロモーター配列に置
き換えることによっても、Rt活性を増強することができ
る。同様に、Rh活性は、例えば、rhtB構造遺伝子の細胞
内のコピー数を増幅すること、又は、RhtBタンパク質を
コードするrhtB構造遺伝子を含むＤＮＡ断片をエシェリ
ヒア属細菌中で効率よく機能するプロモーター配列に連
結して得られる組換えＤＮＡを用いてエシェリヒア属細
菌を形質転換することによって、増強することができ
る。また、染色体ＤＮＡ上のrhtB遺伝子のプロモーター
配列を、エシェリヒア属細菌中で効率よく機能する他の
プロモーター配列に置き換えることによっても、Rh活性
を増強することができる。

【００２５】rhtC構造遺伝子又はrhtB構造遺伝子の細胞
内のコピー数の増幅は、rhtC構造遺伝子又はrhtB構造遺
伝子を保持するマルチコピーベクターをエシェリヒア属
細菌の細胞に導入することによって行うことができる。
すなわち、これらの構造遺伝子を保持するプラスミド、
ファージ、トランスポゾン（Berg, D. E. and Berg,C.
M., Bio/Technol., 1, 417 (1983)）等をエシェリヒア
属細菌の細胞に導入することによって行うことができ
る。rhtC構造遺伝子及びrhtB構造遺伝子の両方を増幅す
る場合は、これらの遺伝子は単一のベクターに搭載され
ていても、異なる２種類のベクターに別々に搭載されて
いてもよい。

【００２６】マルチコピーベクターとしては、pBR322、
pMW118、pUC19等のプラスミドベクター、λ1059、λBF1
01、M13mp9等のファージベクターが挙げられる。また、
トランスポゾンとしては、Mu、Tn10、Tn5が挙げられ
る。

【００２７】エシェリヒア属細菌へのＤＮＡの導入は、
D.A.Morrisonの方法（Methods in Enzymology 68, 326
(1979)）あるいは受容菌細胞を塩化カルシウムで処理し
てＤＮＡの透過性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,
J.Mol.Biol.,53,159(1970)）等により行うことができ
る。

【００２８】アミノ酸生産性を有するエシェリヒア属細
菌において、上記のようにしてRt活性、又はRt活性及び
Rh活性を増強すると、そのアミノ酸の生産量を増大させ
ることができる。Rt活性、又はRt活性及びRh活性を増強
させるエシェリヒア属細菌としては、目的とするアミノ
酸を産生する能力を有する菌株を用いる。また、Rt活
性、又はRt活性及びRh活性を有するエシェリヒア属細菌
に、アミノ酸生産性を付与してもよい。

【００２９】rhtCＤＮＡ断片の増幅によって、エシェリ
ヒア・コリの新規菌株として、ホモセリン生産能を有す
るE. coli MG442/pRhtC、スレオニン生産能を有するE.
coliMG442/pVIC40,pRhtC、ホモセリン、バリン及びロイ
シン生産能を有するE. coliNZ10/pRhtBC、及びE. coli
NZ10/pRhtB, pRhtCが得られた。これらの菌株は、増幅
されたrhtC DNA断片を含まない菌株よりも多量に前記ア
ミノ酸を蓄積する。

【００３０】これらの新規菌株は、All-Russian Collec
tion for Industrial Microorganisms (VKPM)にブダペ
スト条約に基づき国際寄託されている。E. coli MG442/
pRhtCの受託番号は受託番号VKPM B-7700、E. coli MG44
2/pVIC40,pRhtCは受託番号はVKPM B-7680、E. coli NZ1
0/pRhtB, pRhtCの受託番号はVKPM B-7681、及びE. coli
NZ10/pRhtBCの受託番号はVKPM B-7682である。E. coli
MG442/pRhtC (VKPM B-7700)は、以下の培養形態及び生
物的特徴を示す。

【００３１】細胞形態：グラム陰性、弱い運動性の丸い
端部を有する桿菌。長径1.5〜2μm。培養における特徴：（ビーフエキス寒天培地）３７℃、２４時間での生育に
より、直径1.0〜３mmの円形、白色の半透明のコロニー
を形成する。コロニーは滑面で、規則的又はやや波状の
端部を有し、中央部はわずかに盛り上がり、均質構造、
パステライクの粘稠度を有し、容易に懸濁できる。

【００３２】（ルリア(Luria)寒天培地）３７℃、２４
時間の培養後、直径1.0〜2.5mmの白色の半透明のコロニ
ーを形成する。コロニーは滑面で、均質構造、パステラ
イクの粘稠度を有し、容易に懸濁できる。（M9最小寒天培地）３７℃、４０〜４８時間の培養後、
直径0.5〜1.5mmの灰白色、半透明、やや凸状、光沢面の
コロニーを形成する。（ビーフエキス液体培地）３７℃、２４時間の培養後、
特徴的な香気を持ち、一様に高度に濁る。

【００３３】生理学的及び生物学的性質：ビーフエキス
寒天培地での穿針培養で、植菌した部位全体で良好な生
育を示す。通性嫌気性。ゼラチンを液化しない。ミルクで良好に生育し、ミルクの凝集を伴う。インドールを生成しない。温度条件：ビーフエキス液体培地で20〜42℃で生育し、
至適温度は33〜37℃。培地のpH値：液体培地でpH６〜８で生育し、至適pHは7.
2。炭素源：グルコース、フルクトース、ラクトース、マン
ノース、ガラクトース、キシロース、グリセロール、マ
ンニトールで良好な生育を示し、酸及びガスを生成す
る。窒素源：アンモニア、硝酸塩の形態の窒素を、有機化合
物と同様に同化する。アンピシリン耐性Ｌ−イソロイシンを生育因子として利用するが、Ｌ−イ
ソロイシン非存在下でも生育可能。

【００３４】プラスミド：アンピシリン耐性(100 mg/l)
を付与し、スレオニン耐性(50 mg/ml)を担うrhtC遺伝子
を保持するマルチコピーのハイブリッドプラスミドpRht
Cを含む。

【００３５】E. coli MG442/pVIC40, pRhtC (VKPM B-76
80)は、pRhtCに加えて、ストレプトマイシン耐性(100 m
g/l)を付与し、スレオニンオペロンの遺伝子を保持する
マルチコピーのハイブリッドプラスミドpVIC40を含む以
外は、VKPM B-7700と同様の培養形態及び生物的特徴を
示す。

【００３６】E. coli NZ10/pRhtB, pRhtC (VKPM B-768
1)は、生育因子としてＬ−イソロイシンの代わりにＬ−
スレオニン(0.1〜5 mg/ml)を利用する以外は、VKPM B-7
700と同様の培養形態及び生物的特徴を示す。また、カ
ナマイシン耐性(50 mg/l)を付与し、ホモセリン耐性(10
mg/ml)を担うrhtB遺伝子を保持するマルチコピーのハ
イブリッドプラスミドpRhtBを含む。

【００３７】E. coli strain E. coli NZ10/pRhtBC, (V
KPM B-7682)は、アンピシリン耐性(100 mg/l)を付与
し、Ｌ−ホモセリン(10 mg/ml)及びＬ−スレオニン(50m
g/ml)耐性を付与するrhtB及びrhtCの両方を保持するマ
ルチコピーのハイブリッドプラスミドpRhtBCを含む以外
は、VKPM B-7681と同様の培養形態及び生物的特徴を示
す。

【００３８】＜３＞アミノ酸の製造法上記のようにして、rhtC遺伝子、又はrhtC遺伝子及びrh
tB遺伝子のコピー数が増幅されたことによりRt活性、又
はRt活性及びRh活性が増強されたエシェリヒア属細菌で
あってアミノ酸生産能を有するものを好適な培地で培養
し、該培養物中にアミノ酸を生産蓄積せしめ、該培養物
からアミノ酸を採取することにより、アミノ酸を効率よ
く製造することができる。好適なアミノ酸としては、Ｌ
−ホモセリン、Ｌ−スレオニン、及び分岐鎖アミノ酸が
挙げられる。分岐鎖アミノ酸としてはＬ−バリン、Ｌ−
ロイシン及びＬ−イソロイシン、特にＬ−バリン及びＬ
−ロイシンが挙げられる。

【００３９】本発明の製造法におけるエシェリヒア属細
菌の培養および培養液からのアミノ酸の採取、精製等
は、従来の微生物を用いた発酵法によるアミノ酸の製造
法と同様にして行えばよい。培養に使用する培地として
は、炭素源、窒素源、無機物を含有し、必要があれば使
用菌株が生育に要求する栄養源を適当量含有するもので
あれば、合成培地でも天然培地でもよい。炭素源として
は、グルコースやシュークロースをはじめとする各種炭
水化物、各種有機酸があげられる。また使用する微生物
の資化性によってはエタノールやグリセロール等のアル
コールを用いることが出来る。窒素源としては、アンモ
ニアや、硫酸アンモニウム等の各種のアンモニウム塩類
や、アミン類その他の窒素化合物や、ペプトン、大豆加
水分解物、発酵菌体分解物等の天然窒素源を用いること
が出来る。無機物としては、燐酸一カリウム、硫酸マグ
ネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガ
ン、炭酸カルシウム等が用いられる。

【００４０】培養は、振盪培養、通気撹拌培養等の好気
的条件下で行うことが好ましく、培養温度は２０〜４０
℃で、好ましくは３０〜３８℃の範囲で行う。培地のｐ
Ｈは通常５〜９の範囲であり、６．５〜７．２の範囲が
好ましい。培地のｐＨは、アンモニア、炭酸カルシウ
ム、各種酸、各種塩基、緩衝液などによって調整するこ
とができる。通常、１〜３日の培養によって、培養液中
に目的とするアミノ酸が蓄積する。

【００４１】培養終了後、培養液から菌体などの固形物
を遠心分離や膜分離法で除去し、イオン交換法、濃縮
法、晶析法等によって目的とするアミノ酸を採取、精製
することが出来る。

【００４２】

【実施例】以下に、本発明を実施例によりさらに具体的
に説明する。実施例においては、特記しない限り、アミ
ノ酸はＬ型である。

【００４３】

【実施例１】rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子断片の取得〔ステップ１〕：ホモセリン及びスレオニン耐性に関与
する遺伝子のmini-Muファージミッドへのクローニングホモセリン及びスレオニン耐性に関与する遺伝子を、mi
ni-Mu d5005ファージミッドのmini-Muファージミッドへ
のクローニング mini-Mu d5005ファージミッド（Groisman, E. A., et a
l., J. Bicteriol., 168, 357-364 (1986)）を用いて、
ホモセリン及びスレオニン耐性に関与する遺伝子をイン
ビボでクローニングした。MG442菌株のMuCts62溶原菌
（Guayatiner etal., Genetika (in Russian), 14, 947
-956 (1978)）を供与菌として用いた。新たに用意した
溶菌液を、VKPM B-513株（Hfr K10 metB）のMucts溶原
化誘導体に感染させるために用いた。メチオニン（５０
μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（４０μｇ／ｍｌ）および
ホモセリン（１０ｍｇ／ｍｌ）を含むＭ９グルコース最
小培地に細胞をプレートした。４８時間後に現れたコロ
ニーを採取し、単離を行った。プラスミドＤＮＡを分離
して、一般的方法によりVKPM B-513株を形質転換するた
めに用いた。形質転換体は、上記カナマイシンを含むＬ
−ブロース寒天プレートで選択した。プラスミドＤＮＡ
を、ホモセリンに耐性を有するこれらの形質転換体から
分離し、挿入断片の構造の制限酵素マッピングにより解
析した。異なる染色体領域に属する２つのタイプの挿入
断片が、供与菌からクローニングされたことが明らかと
なった。このように、エシェリヒア・コリには、マルチ
コピーでホモセリン耐性を付与する少なくとも２つの異
なる遺伝子が存在する。これらの挿入断片のうち一方
は、すでに報告されているrhtA遺伝子である（ABSTRACT
of17th International Congress of Biochemistry and
Molecular Biology in conjugation with 1997 Annual
Meeting af the American Society for Biochemistry
and Molecular Biology, San Francisco, California A
ugust 24-29, 1997）。他方の挿入断片のうち、ホモセ
リンに対する耐性を与える最短の断片は、０．８ｋｂで
あった（図１）。

【００４４】〔ステップ２〕：rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子の同定上記挿入断片の塩基配列を、サンガーのダイデオキシ・
チェイン・ターミネーション法によって決定した。配列
決定は両方のＤＮＡ鎖の全領域について行い、切断点は
すべてオーバーラップするようにして行った。その結
果、該挿入断片は、エシェリヒア・コリ染色体の８６分
の位置に存在する公知かつ機能未知のＯＲＦ（オープン
リーディングフレーム）であるf138（GenBank accessio
n number M87049の塩基番号61543〜61959）と、その上
流領域（M87049の配列では下流）約３５０ｂｐを含むこ
とが明らかとなった。尚、5'フランキング領域に１６０
ヌクレオチドしか有しないf138は、ホモセリンに対する
耐性を付与することができなかった。ＯＲＦ f138の上
流のヌクレオチド62160〜61950の間には、終止コドンが
存在しない。さらに、この配列には、リボゾーム結合部
位と予想される配列が先行する一個のATGコドンが存在
する。最大のＯＲＦ（M87049の塩基番号62160〜61546）
はrhtB遺伝子と命名された。この遺伝子から予想される
タンパク質RhtBは、高度に疎水性であり、トランスメメ
ンブレン・セグメントである可能性のある領域を有して
いる。

【００４５】後述するように、rhtB遺伝子を含むプラス
ミドは、細胞にホモセリンに対する耐性しか付与しなか
った。最初に単離したSacII-SacII ＤＮＡフラグメント
は二番目の未同定のORF、o128を含んでいたので、この
遺伝子をサブクローニングし、同遺伝子がホモセリン及
びスレオニンに対する耐性を付与できるかを調べた。o1
28（ClaI-Eco47III断片）を含むプラスミドは、50 mg/m
lのスレオニンに対する耐性を付与することが判明した
（図１）。サブクローン断片の配列を決定したところ、
M87049のヌクレオチド61213と61214の間の位置に付加的
なヌクレオチド（G）を含むことがわかった。この配列
へのヌクレオチドの付加は、フレームシフトを除去し、
５’側隣接領域をヌクレオチド60860までORFを延長させ
る。この新規な遺伝子はrhtCと命名された。rhtB、rhtC
の両遺伝子は、コリネバクテリウム・グルタミカムのリ
ジン排出に関与するトランスポーターと相同であること
が見い出された。

【００４６】

【実施例２】 rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子のホモセリン
生産に対する効果＜１＞エシェリヒア・コリＬ−ホモセリン生産菌 NZ10/
pAL4, pRhtBの構築及びホモセリンの製造

【００４７】rhtB遺伝子をプラスミドpUK21（Vieira,
J. and Messing, J., Gene, 100, 189-194 (1991)）に
挿入し、pRhtBを得た（図２）。エシェリヒア・コリNZ1
0株を、アスパルトキナーゼ−ホモセリンデヒドロゲナ
ーゼＩをコードするthrA遺伝子をpBR322ベクターに挿入
したプラスミドpAL4で形質転換し、NZ10/pAL4株を得
た。NZ10株は、エシェリヒア・コリC600株(thrB,leuB)
(Appleyard R.K., Genetics, 39, 440-452,1954)から得
られたthrB^-のleuB⁺復帰変異株（thrB）である。

【００４８】次に、前記NZ10/pAL4株をpUK21又はpRhtB
で形質転換し、NZ10/pAL4,pUK21株及びNZ10/pAL4,pRhtB
株を得た。上記のようにして得られた各形質転換株を、
５０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのアン
ピシリンを含むニュートリエントブロスを用いて３７℃
で１８時間培養し、培養液０．３ｍｌを、５０ｍｇ／ｌ
のカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを含
む下記の組成を有する発酵培地３ｍｌを含む２０×２０
０ｍｍ試験管に接種し、ロータリーシェーカーで３７
℃、４８時間培養した。培養後、培養液中のホモセリン
蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度を、公知の方法で
測定した。

【００４９】〔発酵培地（ｇ／Ｌ）〕グルコース８０（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄ ２２Ｋ₂ＨＰＯ₄ ２ＮａＣｌ０．８ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．８ＦｅＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ０．０２ＭｎＳＯ₄・５Ｈ₂Ｏ０．０２チアミン塩酸塩０．２イーストエキス１．０ＣａＣＯ₃ ３０ＣａＣＯ₃は別殺菌

【００５０】結果を表１に示す。表１に示されるよう
に、NZ10/pAL4,pRhtB株は、rhtB遺伝子を増強していな
いNZ10/pAL4株及びNZ10/pAL4,pUK21株よりも、ホモセリ
ンの蓄積量が多かった。

【００５１】

【表１】表１ ───────────────────────── 菌株ＯＤ₅₆₀ ホモセリン蓄積量（g/L） ───────────────────────── NZ10/pAL4,pUK21 14.3 3.3 NZ10/pAL4,pRhtB 15.6 6.4 ─────────────────────────

【００５２】＜２＞エシェリヒア・コリのホモセリン生
産菌 MG442/pRhtCの構築及びホモセリンの製造rhtC 遺伝子をプラスミドpUC21（Vieira, J. and Messin
g, J., Gene, 100, 189-194 (1991)）に挿入し、pRhtC
を得た（図３）。エシェリヒア・コリMG442菌株は既知
の菌株（Gusyatiner et al., Genetika(in Russian), 1
4, 947-956 (1978)）であり、３ｇ／Ｌ以上のＬ−スレ
オニンを生産することができる。この菌株を、既知のプ
ラスミドpUC21又はpRhtCを導入することにより形質転換
し、MG442/pUC21及びMG442/pRhtCを得た。

【００５３】得られた形質転換体は、１００ｍｇ／ｌの
アンピシリンを含むニュートリエントブロスを用いて３
７℃で１８時間培養し、培養液０．３ｍｌを、１００ｍ
ｇ／ｌのアンピシリンを含む前記発酵培地３ｍｌを含む
２０×２００ｍｍ試験管に接種し、ロータリーシェーカ
ーで３７℃、４８時間培養した。培養後、培養液中のホ
モセリン蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度を、公知
の方法で測定した。結果を表２に示す。

【００５４】

【表２】表２ ──────────────────────── 菌株 OD₅₆₀ ホモセリン（g/L） ──────────────────────── MG442/pUC21 9.7 <0.1 ──────────────────────── MG442/pRhtC 15.2 9.5 ────────────────────────

【００５５】

【実施例３】スレオニン生産に対するrhtB及びrhtC遺伝
子の効果＜１＞エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌 VG442/p
VIC40, pRhtB (VKPM B-7660)の構築及びスレオニン生産エシェリヒア・コリMG442株を、既知のプラスミドpVIC4
0（米国特許第5,175,107号 (1992)）を通常の形質転換
法により導入することによって形質転換した。形質転換
体は、０．１ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンを含むＬ
Ｂ−寒天プレートにより選択を行った。このようにして
新規菌株、MG442/pVIC40が得られた。

【００５６】MG442/pVIC40株を、pUK21又はpRhtBで形質
転換し、MG442/pVIC40,pUK21株及びMG442/pVIC40,pRhtB
株を得た。上記のようにして得られた各形質転換株を、
５０ｍｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのスト
レプトマイシンを含むニュートリエントブロスを用いて
３７℃で１８時間培養し、培養液０．３ｍｌを、５０ｍ
ｇ／ｌのカナマイシン及び１００ｍｇ／ｌのストレプト
マイシンを含む実施例３と同様の発酵培地３ｍｌを含む
２０×２００ｍｍ試験管に接種し、ロータリーシェーカ
ーで３７℃、６８時間培養した。培養後、培養液中のス
レオニン蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度を、公知
の方法で測定した。

【００５７】結果を表３に示す。表３に示されるよう
に、MG442/pVIC40,pRhtB株は、rhtB遺伝子を増強してい
ないMG442/pVIC40株及びMG442/pVIC40,pUK21株よりも、
スレオニンの蓄積量が多かった。

【００５８】

【表３】表３ ────────────────────────── 菌株ＯＤ₅₆₀ スレオニン蓄積量（g/L） ────────────────────────── MG442/pVIC40,pUK21 16.3 12.9 MG442/pVIC40,pRhtB 15.2 16.3 ──────────────────────────

【００５９】＜２＞エシェリヒア・コリのスレオニン生
産菌 VG442/pVIC40, pRhtC (VKPM B-7680)の構築及びス
レオニン生産 MG442/pVIC40株をpRhtC及びpUC21で形質転換し、MG442/
pVIC40,pRhtC株及びMG442/pVIC40,pUC21を得た。上記と
同様にして、MG442/pVIC40,pUC21及びMG442/pVIC40,pRh
tCを、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン及び１００ｍｇ／
ｌのストレプトマイシンを含むニュートリエントブロス
を用いて３７℃で１８時間培養し、培養液０．３ｍｌ
を、１００ｍｇ／ｌのアンピシリン及び１００ｍｇ／ｌ
のストレプトマイシンを含む前記と同様の発酵培地３ｍ
ｌを含む２０×２００ｍｍ試験管に接種し、ロータリー
シェーカーで３７℃、４６時間培養した。培養後、培養
液中のスレオニン蓄積量及び５６０ｎｍにおける吸光度
を、公知の方法で測定した。

【００６０】結果を表４に示す。表４に示されるよう
に、MG442/pVIC40,pRhtC株は、rhtC遺伝子を増強してい
ないMG442/pVIC40株及びMG442/pVIC40,pUC21株よりも、
ホモセリンの蓄積量が多かった。

【００６１】

【表４】表４ ───────────────────────────── 菌株 OD₅₆₀ スレオニン蓄積量（g/L） ───────────────────────────── MG442/pVIC40, pUC21 17.4 4.9 ───────────────────────────── MG442/pVIC40, pRhtC 15.1 10.2 ─────────────────────────────

【００６２】

【実施例４】 rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子のアミノ酸生
産に対する協奏的効果rhtB 遺伝子及びrhtC遺伝子の両方を含むSacII-SacII DN
A断片をpUC21に挿入した。得られたプラスミドpRhtBCは
rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子の両方を持つ（図４）。

【００６３】次に、NZ10株をpUC21、pRhtB、pRhtC又はp
RhtBCで形質転換し、NZ10/pUC21 (VKPM B-7685)、NZ10/
pRhtB (VKPM B-7683)、pNZ10/RhtC (VKPM B-7684)及びN
Z10/pRhtBC (VKPM B-7682)を得た。

【００６４】上記のようにして得られた各形質転換株
を、上記と同様にして培養し、各種アミノ酸の培地中の
蓄積量を測定した。結果を表５に示す。表５に示される
ように、ホモセリン、バリン及びロイシン生産に対する
pRhtB及びpRhtCの協奏効果が示された。これらの結果
は、rhtB及びrhtC遺伝子産物は、細胞中で相互作用する
ことを示している。

【００６５】

【表５】表５ ──────────────────────────────────── 菌株 OD₅₄₀ ホモセリン(g/L) ハ゛リン(g/L) ロイシン(g/L) ──────────────────────────────────── NZ10/pUC21 18.7 0.6 0.22 0.16 NZ10/pRhtB 19.6 2.3 0.21 0.14 NZ10/pRhtC 20.1 0.7 0.2 0.15 NZ10/pRhtBC 21.8 4.2 0.34 0.44 NZ10/pRhtB,pRhtC 19.2 4.4 0.35 0.45 ────────────────────────────────────

【００６６】

【実施例５】rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子のアミノ酸耐性
に対する影響上記のように、培地中のアミノ酸蓄積に対するrhtBまた
はrhtCを保持するプラスミドの効果を、異なる菌株を用
いて調べたところ、アミノ酸蓄積の様式は、菌株の遺伝
子型に依存した。

【００６７】rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子産物とコリネバ
クテリウム・グルタミカムのリジントランスポーターLy
sE（Vrljic, M., Sahm, H. and Eggeling, L. (1996) M
ol.Microbiol. 22, 815-826）との相同性から、これら
のタンパク質が類似した機能を有すること示唆された。
そこで、プラスミドpRhtB及びpRhtCについて、公知の
W3350株（VKPM B-1557）のストレプトマイシン耐性変異
株（str^R）であるN99株のアミノ酸又はアミノ酸アナロ
グに対する感受性に与える影響を調べた。一夜培養した
N99/pRhtB及びN99/pRhtCの培養液（10⁹cfu/ml）を、同
培地で５時間培養した。対数増殖期のこの培養物をＭ９
最少培地で1/100に希釈し、約10⁴個の生菌を、２倍づつ
増加させた量のアミノ酸又はアミノ酸アナログを含む、
よく乾かしたＭ９寒天（２％）培地にプレーティング
し、各化合物の最少阻止濃度を調べた。

【００６８】結果を表６に示す。表６に示されるよう
に、多コピーのrhtBはホモセリンに加えてα−アミノ−
β−ヒドロキシバレリン酸（AHVA）、Ｓ−（２−アミノ
エチル）Ｌ−システイン（AEC）、及び４−アザ−ＤＬ
−ロイシンに対する耐性を増加し、多コピーのrhtCはス
レオニンに加えてバリン、ヒスチジン及びAHVAに対する
耐性を増加した。この結果は、仮定的なトランスポータ
ーであるrhtB及びrhtCは、多くの基質（アミノ酸）に対
して特異的であるか、あるいは増幅の結果として非特異
的な効果を示す可能性がある。

【００６９】

【表６】表６ ─────────────────────────────── 最小阻止濃度（μg/ml）基質 ───────────────────── N99/pUC21^* N99/pRhtB N99/pRhtC ─────────────────────────────── L-ホモセリン 1000 20000 1000 L-スレオニン 30000 40000 80000 L-バリン 0.5 5 2.0 L-ヒスチジン 5000 5000 40000 ＡＨＶＡ 100 2000 15000 ＡＥＣ 5 20 5 ４−アザ−ロイシン 50 100 50 ｏ-メチル-L-スレオニン 20 20 20 ─────────────────────────────── *：N99/pUK21でも同様の結果が得られた。

【００７０】

【発明の効果】本発明により、エシェリヒア属細菌にス
レオニン、又はスレオニン及びホモセリンに対する耐性
を付与することができる。

【００７１】スレオニン、又はスレオニン及びホモセリ
ンに対する耐性が上昇し、アミノ酸生産能を有するエシ
ェリヒア属細菌は、アミノ酸、特にホモセリン、Ｌ−ス
レオニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシンを培地中に蓄積す
る。

【００７２】

【配列表】 SEQUENCE LISTINGS

【００７３】 <110> 味の素株式会社（Ajinomoto Co., Inc.） <120> 新規遺伝子及びアミノ酸の製造法 <130> P-6004F <141> 1999-12-15 <150> RU-98123511 <151> 1998-12-23 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.0

【００７４】 <210> 1 <211> 1231 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (557)..(1171) <400> 1 agaaataatg tggagatcgc accgcccatc gaatgtgcca gtatatagcg tttacgccac 60 ggaccgggct gaacctcctg ctgccagaat gccgccagat catcaacata atcattaaag 120 cgattaacat gcccgagatg cggatcggct aacaggcgac cggaacgtcc ctgcccgcga 180 tggtcgatga ttaagacatc aaaccccaaa tggaacaggt cataggccag ttccgcatat 240 tttacgtagc tctcaatacg ccccgggcag atgactacca cccggtcatg gtgctgtgcg 300 cgaaaacgga caaagcgcac cggaatgtca tccacaccag taaactctgc ttcatcacgc 360 tgacgccaga aatcagtcag cggtcccatg gtaaaagcag caaacgcgtt ttctcttgtt 420 tcccagtctt tttgctgctg aaacatcggg taatctgcct cttaaaccac gtaaaatcgt 480 tttttttagc gtgcctgaca caacgctgcg acagtagcgt attgtggcac aaaaatagac 540 acaccgggag ttcatc atg acc tta gaa tgg tgg ttt gcc tac ctg ctg aca 592 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr 1 5 10 tcg atc att tta acg ctg tcg cca ggc tct ggt gca atc aac act atg 640 Ser Ile Ile Leu Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met 15 20 25 acc acc tcg ctc aac cac ggt tat ccg gcc ggt ggc gtc tat tgc tgg 688 Thr Thr Ser Leu Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp 30 35 40 gct tca gac cgg act ggc gat tca tat tgt gct ggt tgg cgt ggg gtt 736 Ala Ser Asp Arg Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val 45 50 55 60 ggg acg cta ttt tcc cgc tca gtg att gcg ttt gaa gtg ttg aag tgg 784 Gly Thr Leu Phe Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp 65 70 75 gca ggc gcg gct tac ttg att tgg ctg gga atc cag cag tgg cgc gcc 832 Ala Gly Ala Ala Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala 80 85 90 gct ggt gca att gac ctt aaa tcg ctg gcc tct act caa tcg cgt cga 880 Ala Gly Ala Ile Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg 95 100 105 cat ttg ttc cag cgc gca gtt ttt gtg aat ctc acc aat ccc aaa agt 928 His Leu Phe Gln Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser 110 115 120 att gtg ttt ctg gcg gcg cta ttt ccg caa ttc atc atg ccg caa cag 976 Ile Val Phe Leu Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln 125 130 135 140 ccg caa ctg atg cag tat atc gtg ctc ggc gtc acc act att gtg gtc 1024 Pro Gln Leu Met Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val 145 150 155 gat att att gtg atg atc ggt tac gcc acc ctt gct caa cgg att gct 1072 Asp Ile Ile Val Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala 160 165 170 cta tgg att aaa gga cca aag cag atg aag gcg ctg aat aag att ttc 1120 Leu Trp Ile Lys Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe 175 180 185 ggc tcg ttg ttt atg ctg gtg gga gcg ctg tta gca tcg gcg agg cat 1168 Gly Ser Leu Phe Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His 190 195 200 gcg tgaaaaataa tgtcggatgc ggcgtaaacg ccttatccga cttactctga 1221 1200 Ala 205 agacgcgtct 1231

【００７５】 <210> 2 <211> 205 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 2 Met Thr Leu Glu Trp Trp Phe Ala Tyr Leu Leu Thr Ser Ile Ile Leu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Pro Gly Ser Gly Ala Ile Asn Thr Met Thr Thr Ser Leu 20 25 30 Asn His Gly Tyr Pro Ala Gly Gly Val Tyr Cys Trp Ala Ser Asp Arg 35 40 45 Thr Gly Asp Ser Tyr Cys Ala Gly Trp Arg Gly Val Gly Thr Leu Phe 50 55 60 Ser Arg Ser Val Ile Ala Phe Glu Val Leu Lys Trp Ala Gly Ala Ala 65 70 75 80 Tyr Leu Ile Trp Leu Gly Ile Gln Gln Trp Arg Ala Ala Gly Ala Ile 85 90 95 Asp Leu Lys Ser Leu Ala Ser Thr Gln Ser Arg Arg His Leu Phe Gln 100 105 110 Arg Ala Val Phe Val Asn Leu Thr Asn Pro Lys Ser Ile Val Phe Leu 115 120 125 Ala Ala Leu Phe Pro Gln Phe Ile Met Pro Gln Gln Pro Gln Leu Met 130 135 140 Gln Tyr Ile Val Leu Gly Val Thr Thr Ile Val Val Asp Ile Ile Val 145 150 155 160 Met Ile Gly Tyr Ala Thr Leu Ala Gln Arg Ile Ala Leu Trp Ile Lys 165 170 175 Gly Pro Lys Gln Met Lys Ala Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ser Leu Phe 180 185 190 Met Leu Val Gly Ala Leu Leu Ala Ser Ala Arg His Ala 195 200 205

【００７６】 <210> 3 <211> 840 <212> DNA <213> Escherichia coli <220> <221> CDS <222> (187)..(804) <400> 3 atgccgatca ccgccagcga aatgctcagc gttaacggcg ttgggatgcg caagctggaa 60 cgctttggca aaccgtttat ggcgctgatt cgtgcgcatg ttgatggcga tgacgaagag 120 tagtcagcag cataaaaaag tgccagtatg aagactccgt aaacgtttcc cccgcgagtc 180 aaatgt atg ttg atg tta ttt ctc acc gtc gcc atg gtg cac att gtg 228 Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val 1 5 10 gcg ctt atg agc ccc ggt ccc gat ttc ttt ttt gtc tct cag acc gct 276 Ala Leu Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala 15 20 25 30 gtc agt cgt tcc cgt aaa gaa gcg atg atg ggc gtg ctg ggc att acc 324 Val Ser Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr 35 40 45 tgc ggc gta atg gtt tgg gct ggg att gcg ctg ctt ggc ctg cat ttg 372 Cys Gly Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu 50 55 60 att atc gaa aaa atg gcc tgg ctg cat acg ctg att atg gtg ggc ggt 420 Ile Ile Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly 65 70 75 ggc ctg tat ctc tgc tgg atg ggt tac cag atg cta cgt ggt gca ctg 468 Gly Leu Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu 80 85 90 aaa aaa gag gcg gtt tct gca cct gcg cca cag gtc gag ctg gcg aaa 516 Lys Lys Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys 95 100 105 110 agt ggg cgc agt ttc ctg aaa gtt tta ctg acc aat ctc gct aat ccg 564 Ser Gly Arg Ser Phe Leu Lys Val Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro 115 120 125 aaa gcg att atc tac ttt ggc tcg gtg ttc tca ttg ttt gtc ggt gat 612 Lys Ala Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp 130 135 140 aac gtt ggc act acc gcg cgc tgg ggc att ttt gcg ctg atc att gtc 660 Asn Val Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val 145 150 155 gaa acg ctg gcg tgg ttt acc gtc gtt gcc agc ctg ttt gcc ctg ccg 708 Glu Thr Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro 160 165 170 caa atg cgc cgt ggt tat caa cgt ctg gcg aag tgg att gat ggt ttt 756 Gln Met Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe 175 180 185 190 gcc ggg gcg tta ttt gcc gga ttt ggc att cat ttg att att tcg cgg 804 Ala Gly Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg 195 200 205 tgatgccaga cgcgtcttca gagtaagtcg gataag 840

【００７７】 <210> 4 <211> 206 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Leu Met Leu Phe Leu Thr Val Ala Met Val His Ile Val Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Pro Gly Pro Asp Phe Phe Phe Val Ser Gln Thr Ala Val Ser 20 25 30 Arg Ser Arg Lys Glu Ala Met Met Gly Val Leu Gly Ile Thr Cys Gly 35 40 45 Val Met Val Trp Ala Gly Ile Ala Leu Leu Gly Leu His Leu Ile Ile 50 55 60 Glu Lys Met Ala Trp Leu His Thr Leu Ile Met Val Gly Gly Gly Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Cys Trp Met Gly Tyr Gln Met Leu Arg Gly Ala Leu Lys Lys 85 90 95 Glu Ala Val Ser Ala Pro Ala Pro Gln Val Glu Leu Ala Lys Ser Gly 100 105 110 Arg Ser Phe Leu Lys Val Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asn Pro Lys Ala 115 120 125 Ile Ile Tyr Phe Gly Ser Val Phe Ser Leu Phe Val Gly Asp Asn Val 130 135 140 Gly Thr Thr Ala Arg Trp Gly Ile Phe Ala Leu Ile Ile Val Glu Thr 145 150 155 160 Leu Ala Trp Phe Thr Val Val Ala Ser Leu Phe Ala Leu Pro Gln Met 165 170 175 Arg Arg Gly Tyr Gln Arg Leu Ala Lys Trp Ile Asp Gly Phe Ala Gly 180 185 190 Ala Leu Phe Ala Gly Phe Gly Ile His Leu Ile Ile Ser Arg 195 200 205

【図面の簡単な説明】

【図１】 rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子のクローニング及
び同定を示す図。

【図２】 rhtB遺伝子を含むプラスミドpRhtBの構造を
示す図。

【図３】 rhtC遺伝子を含むプラスミドpRhtCの構造を
示す図。

【図４】 rhtB遺伝子及びrhtC遺伝子を含むプラスミド
pRhtBCの構造を示す図。

【手続補正書】

【提出日】平成１２年４月１０日（２０００．４．１
０）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００２

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００２】

【従来の技術】本発明者らは、エシェリヒア・コリＫ−
１２株において、最小培地中で高濃度のスレオニン又は
ホモセリンに対する耐性に関与する変異thrRを獲得した
変異株を取得している（Astaurova, O. B. et al., App
l. Biochem. and Microbiol.,21, 611-616 (1985)）。
この変異は、Ｌ−スレオニン生産菌（SU Patent No. 97
4817）、ホモセリン生産菌及びグルタミン酸生産菌（As
taurova, O.B. et al.,Appl. Bioch. And Microbiol.,
27, 556-561, 1991）のそれぞれのアミノ酸生産能を改
善する。

【手続補正２】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】０００３

【補正方法】変更

【補正内容】

【０００３】さらに本発明者は、前記変異thrRは、エシ
ェリヒア・コリ染色体の１８分の位置にあり、これがpe
xB遺伝子とompX遺伝子との間にあるＯＲＦ１上にあるこ
とをつきとめた。そして、同ＯＲＦ１によってコードさ
れるタンパク質を発現する単位をrhtA（rht：ホモセリ
ンおよびスレオニン耐性）遺伝子と命名した。すなわ
ち、rhtA遺伝子とは、ＳＤ配列などの５’非コード領
域、ＯＲＦ１及びターミネーター等を含む。また、野生
型rhtA遺伝子をマルチコピーとしてクローン化した場合
には、スレオニン又はホモセリンに対する耐性に関与す
ること、及び、前記変異thrRは、rhtA遺伝子中のATG開
始コドンの−１の位置のG→A置換により生じたことを見
出している（この変異は「rhtA23」と命名された）（AB
STRACTS of 17th Internatinal Congress of Biochemis
try and Molecular Biology in conjugatin with 1997
Annual Meeting of the American Society for Biochem
istryand Molecular Biology, San Francisco, Califor
nia August 24-29, 1997, abstract No. 457）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｐ 13/08 ＤＣ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/06 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ヴィタリー・アルカージエヴィッチ・リヴィシッツロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者ナターリヤ・パーヴロヴナ・ザカタエヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者ヴラジーミル・ヴェニヤミノヴィッチ・アリョーシンロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者アーラ・ヴァレンチーノヴナ・ベラリョーヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内 (72)発明者イリーナ・リヴォヴナ・トクマコーヴァロシア連邦，モスクワ，113545，１，ドロズニィプロエズド，１ステートリサーチインスティテュートオブジェネティックスアンドセレクションオブインダストリアルマイクロオーガニズムズ（ジーオーエスエヌアイアイジェネティカ）内

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質の
細胞中の活性が増強されたことにより、Ｌ−スレオニン
耐性が増強されたエシェリヒア属細菌。（Ａ）配列表配列番号４に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（Ｂ）配列表配列番号４において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなるタンパク質であって、そのタンパク質を有
する細菌をＬ−スレオニン耐性にする活性を有するタン
パク質。
【請求項２】さらに、以下の（Ｃ）又は（Ｄ）のタン
パク質の細胞中の活性が増強されたことにより、Ｌ−ホ
モセリン耐性が増強された請求項１記載の細菌。（Ｃ）配列表配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタ
ンパク質。（Ｄ）配列表配列番号２において、１若しくは数個のア
ミノ酸が欠失、置換、挿入若しくは付加されたアミノ酸
配列からなるタンパク質であって、そのタンパク質を有
する細菌をＬ−ホモセリン耐性にする活性を有するタン
パク質。
【請求項３】前記（Ａ）又は（Ｂ）のタンパク質をコ
ードするＤＮＡで形質転換されたことにより同タンパク
質の活性が増強された請求項１又は２記載の細菌。
【請求項４】前記（Ｃ）又は（Ｄ）のタンパク質をコ
ードするＤＮＡで形質転換されたことにより同タンパク
質の活性が増強された請求項２記載の細菌。
【請求項５】請求項１〜４のいずれか一項に記載の細
菌であってアミノ酸生産能を有するものを培地で培養
し、該培養物中にアミノ酸を生成蓄積せしめ、該培養物
から前記アミノ酸を採取することを特徴とするアミノ酸
の製造法。
【請求項６】前記アミノ酸が、Ｌ−ホモセリン、Ｌ−
スレオニン、又は分岐鎖アミノ酸から選ばれることを特
徴とする請求項５記載の製造法。
【請求項７】前記分岐鎖アミノ酸が、Ｌ−バリン又は
Ｌ−ロイシンであることを特徴とする請求項６記載の製
造法。
【請求項８】下記（Ａ）又は（Ｂ）に示すタンパク質
をコードするＤＮＡ。（Ａ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列を有す
るタンパク質。（Ｂ）配列表の配列番号４に記載のアミノ酸配列におい
て、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付
加、又は逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、その
タンパク質を有する細菌をＬ−スレオニン耐性にする活
性を有するタンパク質。
【請求項９】下記（ａ）又は（ｂ）に示すＤＮＡであ
る請求項８記載のＤＮＡ。（ａ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜８０４からなる塩基配列を含
むＤＮＡ。（ｂ）配列表の配列番号３に記載の塩基配列のうち、少
なくとも塩基番号１８７〜８０４からなる塩基配列とス
トリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、そ
のタンパク質を有する細菌をＬ−スレオニン耐性にする
活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ。
【請求項１０】前記ストリンジェントな条件が、１×
ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度で６０℃で
洗浄が行われる条件である請求項９記載のＤＮＡ。