JP2005237379A - L−アミノ酸生産菌及びl−アミノ酸の製造法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 L−アミノ酸生産能を有し、かつ、ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変された微生物を作製し、得られた微生物を培地中で培養し、該培地中または菌体内にL−アミノ酸を生成蓄積させ、同培地中又は菌体内からL−アミノ酸を回収することにより、L−アミノ酸を製造する。
【選択図】 図2
Description
菌由来の野生型lysE遺伝子はこれらの細菌にとって致死的であるため、宿主微生物が生育できるような変異lysE遺伝子を導入する必要があった(例えば、特許文献15参照)。このように、lysE遺伝子は異種の微生物におけるL−リジン又はL−アルギニンの排出に関して万能に機能するものではなかった。従って、広く異種微生物において、適切なL−リジン又はL−アルギニン排出活性を発揮し、L−リジン又はL−アルギニンの製造に利用することのできるアミノ酸排出遺伝子の取得が求められていた。
(1)L−アミノ酸生産能を有し、かつ、ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変され
た微生物。
(2)ybjE遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりybjE遺伝子の発現が増強された、(1)の微生物。
(3)ybjE遺伝子が、配列番号2、9、10から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1に記載の微生物。
(4)前記ybjE遺伝子が、下記(a)又は(b)に記載のDNAである、(1)の微生物:
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号1に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(5)前記ybjE遺伝子が、下記(c)又は(d)に記載のDNAである、(1)の微生物:
(c)配列番号1の塩基番号49〜948の塩基配列を含むDNA、
(d)配列番号1の塩基番号49〜948の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードするDNA。
(6)ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変されることにより、L−アミノ酸の排出活性が向上したことを特徴とする、(1)〜(5)のいずれかの微生物。
(7)ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変されることにより、L−アミノ酸耐性またはL−アミノ酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、(1)〜(6)のいずれかの微生物。
(8)前記L−アミノ酸がL−リジン、L−アルギニン、L−オルニチン、L−ヒスチジン、L-イソロイシン、L-スレオニン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-システイン、L-グルタミン酸からなる群より選択される1種又は2種以上のL-アミノ酸である、(1)〜(7)の微生物。
(9)前記微生物が腸内細菌科に属する微生物であるである、(1)〜(8)のいずれかの微生物。
(10)前記微生物がエシェリヒア属細菌である(9)の微生物。
(11)前記微生物がコリネ型細菌である、(1)〜(8)のいずれかの微生物。
(12)前記微生物がメタノール資化性細菌である(1)〜(8)のいずれかの微生物。(13)前記微生物がメチロフィラス属又はメチロバチルス属に属する細菌である(12)の微生物。
(14)(1)〜(13)のいずれかの微生物を培地で培養して、L−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL−アミノ酸を回収することを特徴とするL−アミノ酸の製造法。
(15)(12)又は(13)の微生物を、メタノールを主要炭素源とする液体培地中で培養し、L−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL−アミノ酸を回収することを特徴とするL−アミノ酸の製造方法。
(16)前記L−アミノ酸がL−リジン、L−アルギニン、L−オルニチン、L−ヒスチジン、L-イソロイシン、L-スレオニン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-システイン、L-グルタミン酸からなる群より選択される1種又は2種以上の塩基性アミノ酸である、(14)又は(15)の製造方法。
L-フェニルアラニン、L-チロシン、L-トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、L-システイン、L-シスチン、L-メチオニンなどの含硫アミノ酸、L-グルタミン酸、L-アスパラギン酸、L-グルタミン、L-アスパラギンなどの酸性アミノ酸を発酵生産することが出来る。
本発明の微生物は、L−アミノ酸生産能を有する微生物であって、ybjE遺伝子の発現が増強するように改変された微生物である。ここで、L−アミノ酸生産能とは、本発明の微生物を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にL−アミノ酸を生成し、蓄積する能力をいう。なお、本発明の微生物は複数のL−アミノ酸の生産能を有するものであってもよい。L−アミノ酸の生産能を有する微生物としては、本来的にL−アミノ酸の生産能を有するものであってもよいが、下記のような微生物を、変異法や組換えDNA技術を利用して、L−アミノ酸の生産能を有するように改変したものであってもよい。なお、本発明の微生物は、後述のybjE遺伝子の発現が増強されることによってL−アミノ酸生産能が付与されたものであってもよい。
本発明の微生物は2種類以上のアミノ酸の生産能を有するものであってもよい。
以下に、L−アミノ酸生産能を付与する方法及び本発明で使用することのできるL−アミノ酸生産能が付与された微生物を例示する。ただし、L−アミノ酸生産能を有する限り、これらに制限されない。本発明の微生物の親株としては、エシェリヒア属細菌、パントエア属細菌を代表とする腸内細菌科に属する微生物や、コリネ型細菌等を用いることができる。また、メタノールからL−アミノ酸を生産できる、メチロフィラス属細菌、メチロバチルス属細菌などのメタノール資化性細菌を用いてもよい。その他の腸内細菌科に属する微生物としては、エンテロバクター(Enterobacter)属、、クレブシエラ(Klebsiella)属、セラチア(Serratia)属、エルビニア(Erwinia)属、サルモネラ(Salmonella)属、モルガネラ(Morganella)属などのγ−プロテオバクテリアに属する腸内細菌が挙げられ、またその他の微生物としては、アリサイクロバチルス(Alicyclobacillus)属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌、サッカロマイセス属やキャンディダ属等に属する酵母などが挙げられる。なお、上記親株は、本来内在的にybjE遺伝子を有しているものであってもよいし、本来はybjE遺伝子を有しないが、ybjE遺伝子を導入することにより、L-アミノ酸排出活性が向上するものであってもよい。
り分譲を受けることができる(住所 ATCC, Address: P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, 1,United States of America )。
BP−6615)、AJ13601株(FERM BP−7207)及びそれらの誘導体を用いることができる。これらの株は、分離された当時はエンテロバクター・アグロメランスと同定され、エンテロバクター・アグロメランスとして寄託されたが、上記のとおり、16S rRNAの塩基配列解析などにより、パントエア・アナナティスに再分類されている。
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム
コリネバクテリウム・アルカノリティカム
コリネバクテリウム・カルナエ
コリネバクテリウム・グルタミカム
コリネバクテリウム・リリウム
コリネバクテリウム・メラセコーラ
コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス(コリネバクテリウム・エフィシェンス)
コリネバクテリウム・ハーキュリス
ブレビバクテリウム・ディバリカタム
ブレビバクテリウム・フラバム
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
ブレビバクテリウム・ロゼウム
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス
ブレビバクテリウム・アルバム
ブレビバクテリウム・セリヌム
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC13870
コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC15806
コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC21511
コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991
コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13020, ATCC13032, ATCC13060
コリネバクテリウム・リリウム ATCC15990
コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC17965
コリネバクテリウム・エッフィシエンス AJ12340(FERM BP-1539)
コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC13868
ブレビバクテリウム・ディバリカタム ATCC14020
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC13826, ATCC14067, AJ12418(FERM BP-2205)
ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC14068
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC13869(コリネバクテリウム・グルタミカムATCC13869)
ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825
ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC14066
ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC19240
コリネバクテリウム・アンモニアゲネス ATCC6871、ATCC6872
ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111
ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112
ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC15354
業技術院生命工学工業技術研究所にFERM BP-2205の受託番号でブダペスト条約に基づいて寄託されている。
要求する変異株(米国特許第3708395号及び第3825472号明細書参照);DL−α−アミノ−ε−カプロラクタム、α−アミノ−ラウリルラクタム、アスパラギン酸−アナログ、スルファ剤、キノイド、N−ラウロイルロイシンに耐性を示すL−リジン生産変異株;オキザロ酢酸脱炭酸酵素(デカルボキシラーゼ)または呼吸系酵素阻害剤の耐性を示すL−リジン生産変異株(特開昭50-53588号公報、特開昭50-31093号公報、特開昭52-102498号公報、特開昭53-9394号公報、特開昭53-86089号公報、特開昭55-9783号公報、特開昭55-9759号公報、特開昭56-32995号公報、特開昭56-39778号公報、特公昭53-43591号公報、特公昭53-1833号公報);イノシトールまたは酢酸を要求するL−リジン生産変異株(特開昭55-9784号公報、特開昭56-8692号公報);フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感受性を示すL−リジン生産変異株(特開昭55-9783号公報、特開昭53-86090号公報);エチレングリコールに耐性を示し、L−リジンを生産するブレビバクテリウム属またはコリネバクテリウム属の生産変異株(米国特許第4411997号明細書)などが挙げられる。
例えば、以下のようにして、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及びアスパルトキナーゼ遺伝子の発現を増強することによってL−リジン生産能を付与することができる。すなわち、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、L−リジンの製造に用いる宿主微生物で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えDNAを作製し、これで宿主を形質転換する。形質転換により宿主細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及びアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
コピーで導入するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に多コピー存在する配列としては、レペッティブDNA、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び/又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及lysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及びAK活性が増幅される。
機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むDNAでコリネ型細菌を形質転換し、変異型遺伝子と染色体上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、染色体上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は既に確立しており、直鎖上DNAを用いる方法や温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645、米国特許第6303383号、又は特開平05-007491号公報)。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換により部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
開2000-197490号公報、特公平07-028749号公報などに記載された株を挙げることができる。
上述のL−アルギニン生合成に関与する酵素は、L−アルギニンにより抑制されていることが明らかになっており、L−アルギニン生合成系のアルギニンリプレッサーを欠損させることや、N−アセチルグルタミンシンターゼにフィードバック阻害に耐性な変異を導入することによっても効率よくL−アルギニン生産能を向上することが出来る(欧州公開公報1154020号明細書、欧州公開公報1170361号明細書等)。
L-ヒスチジン生産能を有する微生物としては、L-ヒスチジン生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現量を増強した微生物を用いてもよい。 L−ヒスチジン生合成系酵素としては、ATP フォスフォリボシルトランスフェラーゼ(hisG)、フォスフォリボシルAMP サイクロヒドロラーゼ(hisI)、フォスフォリボシル-ATP ピロフォスフォヒドラーゼphosphoribosyl-ATP pyrophosphohydrolase(hisIE)、フォスフォリボシルフォルミミノー5−アミノイニダゾールカルボキシアミドリボタイドイソメラーゼphosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide Isomerase(hisA)、アミドトランスフェラーゼamidotransferase (hisH)、ヒスチヂノールフォスフェートアミノトランスフェラーゼ(hisC)、ヒスチヂノールフォスファターゼ(hisB)、ヒスチヂノールデヒドロゲナーゼ(hisD)等が挙げられる。
変異を付与したコリネ型細菌や、アルスロバクター属細菌(特開平02-283290号公報)、ビタミン−P活性物質に耐性のコリネ型細菌AJ11589(FERM−P5644)(特開昭57-016696号公報)等が挙げられる。
L−オルニチン生合成系は、L−アルギニン生合成経路と共通であり、L−オルニチン生合成系遺伝子としては、N−アセチルグルタミン酸シンターゼ(argA)、N−アセチルグルタミルリン酸レダクターゼ(argC)、オルニチンアセチルトランスフェラーゼ(argJ)、N-アセチルグルタミン酸キナーゼ(argB)、アセチルオルニチントランスアミナーゼ(argD)、アセチルオルニチンデアセチラーゼ(argE)等が挙げられる。
Collection of Industrial Microorganisms (VKPM), GNII Genetika )に登録番号VKPM B-5318のもとに寄託されている。またこのVKPM B-5318株は、イソロイシン非要求性菌株であり、ラムダファージの温度感受性C1リプレッサー、PRプロモーターおよびCroタンパク質のN末端部分の下流に、本来持つ転写調節領域であるアテニュエーター領域を欠失したスレオニンオペロンすなわちスレオニン生合成関与遺伝子が位置し、スレオニン生合成関与遺伝子の発現がラムダファージのリプレッサーおよびプロモーターにより支配されるように構築された組換えプラスミドDNAを保持している。
L-スレオニン生産能を有する微生物としては、L−スレオニン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現が増強するように改変された微生物を用いることも出来る。例えば、L-スレオニン生合成系酵素としては、アスパルトキナーゼIII(lysC)、アスパラギ
ン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(asd)が挙げられる。これらの酵素名の後のカッコ内は、各酵素をコードする遺伝子名である。これらの酵素をコードする遺伝子は2種類以上導入してもよい。これらのL−スレオニン生合成系遺伝子は、スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌に導入してもよい。スレオニン分解が抑制されたエシェリヒア属細菌としては、例えば、スレオニンデヒドロゲナーゼ活性が欠損したTDH6株(特開2001-346578号公報)等が挙げられる。
L−ロイシンによるオペロンの発現調節を受けるので、生成するL−バリンによる発現抑制を解除するためにアテニュエーションを解除することが望ましい(特開平02-748418号公報)。L−バリン生産能を有する微生物としては、さらにアセト乳酸シンターゼ(III)をコードする遺伝子の発現が弱化したものであってもよい。アセト乳酸シンターゼIIIをコードする遺伝子としては例えばilvIH遺伝子が挙げられる。
L−バリン生産菌を付与する別の方法として、アミノ酸アナログなどへの耐性を付与する方法も挙げられる。例えば、L−イソロイシンおよびL−メチオニン要求性,ならびにD−リボ−ス,プリンリボヌクレオシドまたはピリミジンリボヌクレオシドに耐性を有し,かつL−バリン生産能を有する変異株(FERM P-1841、P5556、特開昭53-025034号公報) や、ポリケトイド類に耐性を有する変異株(FERM P-9325 特公平04-045314号公報) 等が挙げられる。
本発明の微生物は、上述したようなL−アミノ酸の生産能を有する微生物を、ybjE遺伝子の発現が増強するように改変することによって得ることができる。ただし、先にybjE遺伝子の発現が増強するように改変を行った後に、L−アミノ酸の生産能を付与してもよい。なお、ybjE遺伝子の発現増強は、後述するように、プロモーター改変を始めとする発現調節領域改変などによる内因性ybjE遺伝子の発現増強であってもよいし、ybjE遺伝子を含むプラスミドの導入などによる外因性ybjE遺伝子の発現増強であってもよい。さらに、これらを組み合わせてもよい。
エシェリヒア・コリのybjE遺伝子としては、配列番号2のアミノ酸番号17〜315のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする遺伝子、好ましくは、配列番号1の塩基番号49〜948の塩基配列を含む遺伝子を例示することもできる。なお、配列番号2のアミノ酸配列のアミノ酸番号1のValは、コドンはgtgであるものの、Metとして翻訳されている可能性があり、ybjE遺伝子にコードされるタンパク質は配列番号2に示すアミノ酸配列(1〜315)を有するタンパク質である可能性がある。その場合は、配列番号1に示す塩基配列(1〜948)を含むDNAを用いることが好ましい。なお、開始コドンがいずれであるにしても、配列番号1に示す塩基配列(49〜948)を含むDNAを用いることにより、本発明の製造法に用いることのできる微生物が得られることは実施例より明らかである。
ミノ酸配列をコードする遺伝子が挙げられる。(配列番号9アミノ酸配列は、Salmonella
typhimuriumLT2株のYbjEタンパク質との保存配列、配列番号10のアミノ酸配列はYersinia pestis CO92 YPO1361のYbjEタンパク質との保存配列を示す)従って、他の微生物由来のybjE遺伝子は、配列番号2のアミノ酸配列全体、または配列番号2のアミノ酸番号17〜315のアミノ酸配列に対して、80%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%、特に好ましくは98%以上の相同性を有し、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードするものを意味する。また、配列番号9、10に示すアミノ酸配列を有し、かつL−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードするものも含まれる。アミノ酸配列および塩基配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183,
63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
配列番号1に示す塩基配列が改変されたybjE遺伝子としては、配列番号1の第3番目の塩基であるg(グアニン)がa(アデニン)に置換された変異型ybjE遺伝子が挙げられる。また、以下のような従来知られている変異処理によっても取得され得る。変異処理としては、配列番号1に示す塩基配列または配列番号1の塩基番号49〜948の塩基配列を有する遺伝子をヒドロキシルアミン等でインビトロ処理する方法、および該遺伝子を保持する微生物、例えばエシェリヒア属細菌を、紫外線またはN-メチル-N'-ニトロ-N-ニトロソグアニジン(NTG)もしくはエチルメタンスルフォネート(EMS)等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。これらの遺伝子がL−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードしているか否かは、例えば、これらの遺伝子を適当な細胞で発現させ、培地中に排出されるL−アミノ酸の量を増大させているかを調べることにより、確かめることができる。またこれらの遺伝子が宿主に導入することによってL-アミノ酸耐性を付与するかどうかは、これらの遺伝子を宿主に導入し、導入菌株を高濃度のL-アミノ酸の存在する培地で培養することにより、対照株と比べて生育が向上しているかどうかを調べることにより、確かめることが出来る。
エシェリヒア・コリ細胞内において自律複製可能なベクターとしては、pUC19、pUC18、
pHSG299, pHSG399, pHSG398, pACYC184,(pHSG、pACYCは宝バイオ社より入手可), RSF1010, pBR322, pMW219(pMWはニッポンジーン社より入手可)等が挙げられる。
コリネ型細菌で自律複製できるプラスミドとして具体的には、以下のものが例示される。
pAM330 特開昭58-67699号公報参照
pHM1519 特開昭58-77895号公報参照
pSFK6 特開2000-262288号公報参照
pVK7 米国特許出願公開20030175912号明細書参照
また、これらのベクターからコリネ型細菌中でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使用することができる。
伝子のプロモーター領域に塩基置換等を導入し、より強力なものに改変することも可能である。プロモーターの強度の評価法および強力なプロモーターの例は、Goldsteinらの論文(Prokaryotic promoters in biotechnology. Biotechnol. Annu. Rev., 1995, 1, 105-128)等に記載されている。さらに、リボソーム結合部位(RBS)と開始コドンとの間のスペーサ、特に開始コドンのすぐ上流の配列における数個のヌクレオチドの置換がmRNAの翻訳効率に非常に影響を及ぼすことが知られており、これらを改変することも可能である。ybjEのプロモーター等の発現調節領域は、プロモーター検索ベクターやGENETYX等の遺伝子解析ソフトを用いて決定することも出来る。これらのプロモーター置換または改変によりybjE遺伝子の発現が強化される。発現調節配列の置換は、例えば温度感受性プラスミドを用いて行うことができる。コリネ型酸菌の温度感受性プラスミドとしては、p48K及びpSFKT2(以上、特開2000-262288号公報)、pHSC4(フランス特許公開1992年2667875号公報、特開平5-7491号公報)等が挙げられる。これらのプラスミドは、コリネ型細菌中で少なくとも25℃では自律複製することができるが、37℃では自律複製できない。なお、発現調節配列の改変は、ybjE遺伝子のコピー数を高めることと組み合わせてもよい。
Vol277.No.51 p49841-49849)。例えば、ybjE遺伝子を発現させた菌体より反転膜小胞を作成し、ATPあるいはその他駆動力となる基質を添加し、RIラベルしたL-アミノ酸の取り込み活性を測定することによって測定可能である。また生菌を使用して、ラベル化アミノ酸と非ラベル化アミノ酸の交換反応の速度を検出することによっても測定できる。
入株の生育を測定し、親株の生育と比較することによって確認することが出来る。具体的には、親株または本発明のプラスミドを導入した菌株をL-アミノ酸またはL-アミノ酸アナログを添加した液体培地で培養し、その培養液の580〜660nmの吸光度を計測し、親株とybjEを増幅した菌株の培養液の該吸光度を比較する方法を挙げることが出来る。培地中に添加されるL−アミノ酸またはL−アミノ酸アナログの濃度は、非改変株の生育が阻害される濃度であればよいが、0.3/L以上の濃度が好ましい。例えば、L−アミノ酸の添加濃度は、L-リジン塩酸塩は80g/L、L-アルギニン塩酸塩については90g/L、L-オルニチン塩酸塩については、45g/L、L-ヒスチジン塩酸塩については30g/L、L-イソロイシンについては、12g/L、L-スレオニンについては40g/L、L-グルタミン酸ナトリウムについては15g/L、L-フェニルアラニンについては8g/L、L-プロリンについては85g/L、L-システインについては、0.3g/Lの濃度が挙げられる。
本発明のL−アミノ酸の製造法は、本発明の微生物を培地で培養して、L−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL−アミノ酸を回収することを特徴とする製造法である。
音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、L−アミノ酸を回収することができる。
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。試薬は、特記しない限り和光純薬、又はナカライテスク社製のものを用いた。各実施例で用いる培地の組成は以下に示すとおりである。いずれの培地もpHはNaOHまたはHClで調整した。
バクト・トリプトン(ディフコ社製)10g/L
酵母エキス(ディフコ社製) 5g/L
塩化ナトリウム 10g/L
pH7.0
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
L培地
バクトアガー 15g/L
120℃、20分間蒸気滅菌を行った。
5xM9 salts* 200 ml
1M 硫酸マグネシウム 2 ml
20% グルコース 20 ml
1M 塩化カルシウム 0.1 ml
Up to 1L (pH 7.0)
*5xM9 salts
リン酸2ナトリウム 64 g
リン酸カリウム 15 g
塩化ナトリウム 2.5 g
塩化アンモニウム 5.0 g
Up to 1L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
適時L-リジンを添加した。
最小培地
バクトアガー 15g/L
115℃、10分間蒸気滅菌を行った。
グルコース 40g/L
硫酸アンモニウム 24g/L
リン酸2水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・7水塩 1.0g/L
硫酸鉄4・7水塩 0.01g/L
硫酸マンガン4・7水塩 0.01g/L
酵母エキス 2.0g/L
局方炭酸カルシウム 30g/L
水酸化カリウムでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
抗生物質として、クロラムフェニコール50 mg/Lを添加した。
グルコース 60 g/L(別殺菌)
硫酸マグネシウム・7水塩 1 g/L(別殺菌)
硫酸アンモニウム 25 g/L
リン酸2水素カリウム 2 g/L
酵母エキス(ディフコ社製)5 g/L
ビタミンB1 0.1 mg/L
pH 7.2
局方炭酸カルシウム25 g/L(別殺菌)
水酸化カリウムでpH7.2に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
抗生物質として、クロラムフェニコール50 mg/Lを添加した。
リン酸2水素カリウム 1.9g/L
リン酸2水素ナトリウム 1.56g/L
硫酸マグネシウム 0.2g/L
硫酸アンモニウム 5g/L
硫酸銅5水塩 5μg/L
硫酸マンガン4−5水塩 25μg/L
硫酸亜鉛4−7水塩 23μg/L
塩化カルシウム2−2水塩 72mg/L
塩化鉄2−6水塩 9.7mg/L
炭酸カルシウム(関東化学製)30g/L
メタノール 2%(vol/vol)
pH7.0
(メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加
した。)Journal of general microbiology(1989) 125, 135, 3153-3164 Silman N. J.,
Carver M. A. & Jones C. W.を参考として調製した。硫酸アンモニウムの代わりに、アセトアミド1.18gを用い、塩化カルシウムは、72mg/Lの濃度を添加した。
リン酸2水素カリウム 1.9g/L
リン酸2水素ナトリウム 1.56g/L
硫酸マグネシウム 0.2g/L
硫酸アンモニウム 5g/L
硫酸銅5水塩 5μg/L
硫酸マンガン4−5水塩 25μg/L
硫酸亜鉛4−7水塩 23μg/L
塩化カルシウム2−2水塩 72mg/L
塩化鉄2−6水塩 9.7mg/L
炭酸カルシウム(関東化学製)30g/L
メタノール 2%(vol/vol)
pH7.0
バクトアガー(ディフコ社製) 15g/L
(メタノール以外は121℃、15分間蒸気滅菌を行った。良くさめてからメタノールを添加した。)
ポリペプトン 10g/L
酵母エキス 10g/L
塩化ナトリウム 5g/L
シュークロース 5g/L
DL-メチオニン 0.1g/L
水酸化カリウムでpH7.2に調整、寒天培地の場合は20g/L添加した。
(オートクレーブで120℃30分滅菌した。)
グルコース 100g/L
硫酸アンモニウム 55g/L
大豆加水分解物 (全窒素量として) 1.05g/L
リン酸2水素カリウム 1.0g/L
硫酸マグネシウム・7水塩 1.0g/L
硫酸鉄4・7水塩 0.01g/L
硫酸マンガン4・7水塩 0.01g/L
硫酸マグネシウム 0.2g/L
GD113 0.05ml/L
局方炭酸カルシウム50g/L(別殺菌)
水酸化カリウムでpH7.5に調整し、115℃で10分オートクレーブ
但しグルコース及びMgSO4・7H2Oは別々に殺菌した。
L-リジン排出遺伝子の探索は以下のようにして行った。
MG1655(ATCC 47076)株においてのlysA(ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素遺伝子)を欠損させた株より染色体DNAを常法にて抽出し、制限酵素Sau3AIで部分分解後した2〜4kbpの断
片を、それぞれBamHIで消化したpTWV229(タカラバイオ社製)、pSTV28(タカラバイオ社製)、pMW118(ニッポンジーン社製)に導入し、プラスミドライブラリーを作製した。このプラスミドライブラリーをMG1655株に、エレクトロポレーションにより導入した。
プラスミドライブラリーを導入したMG1655株について、pTWV229導入株はアンピシリン耐性を指標に、pSTV28導入株はクロラムフェニコール耐性を指標に、pMW118導入株はアンピシリン耐性を指標にL 培地で選択し、合計約80000コロニーを形質転換体として取得した。この形質転換体をMG1655株がコロニーをほとんど形成できない、60g/Lのリジン塩酸塩を含む最小培地に塗布した。
塩基配列決定の結果、ほぼ全ての断片が、913181-914128に位置するybjE遺伝子を重複して含んでいることが明らかになった。
<2−1> ybjE増幅用プラスミドの構築及びエシェリヒア・コリへの導入
次にybjE遺伝子の単独でのリジン耐性に寄与する増幅効果を確認する為に、ybjEを単独で増幅するためのベクターを構築して、MG1655に導入し、効果を確認した。エシェリヒア・コリ(エシェリヒア・コリK-12株)の染色体の全塩基配列は既に明らかにされており(Science, 277, 1453-1474 (1997))、この文献に報告されているybjE遺伝子の塩基配列に基づいて、5'プライマーとしてGenBankのACCESSION No. AE000189の塩基番号4085〜4104の配列に相補的な配列である配列番号5の合成オリゴヌクレオチド、3'側プライマーとして同塩基配列の塩基番号2689〜2708の配列に相当する配列番号6に記載の合成オリゴヌクレオチドを用いて、エシェリヒア・コリ MG1655株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。
エシェリヒア・コリMG1655株の各種アミノ酸耐性に対するybjE遺伝子断片の増幅の効果、すなわちpSYBJE1、及びpSYBJE2プラスミドの、MG1655株のアミノ酸耐性に対する影響を調べた。MG1655/pSYBJE1株、MG1655/pSYBJE2株並びに対照株のMG1655/pSTV28株を、終濃度が50μg/mlとなるようにクロラムフェニコールを加えたL培地5mlに植菌し、往復振とう培養装置により約6時間程度培養した。濁度がOD600=1.0程度に菌体が増殖した培養液を遠心後、菌体をM9最小培地で2回洗浄し、最終濃度が濁度OD600=0.05になるように、終濃度50μg/mlのクロラムフェニコール及び80g/Lリジン塩酸塩を含有するM9最小培地にそれぞれ植菌し、70時間程度培養し、生育を調べた。
<3−1> ybjE遺伝子破壊株の構築
ybjE遺伝子の欠失は、DatsenkoとWannerによって最初に開発された「Red-driven integration」と呼ばれる方法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, vol. 97, No. 12, p6640-6645)によって行った。この方法によれば、目的とする遺伝子を合成オリゴヌクレオチドの5'側にデザインし、抗生物質耐性遺伝子を3'側にデザインした合成オリゴヌクレオチドを用いて得られたPCR産物を用いて、一段階で遺伝子破壊株を構築することが出来る。この方法に従って、ybjE遺伝子及び鋳型プラスミドに抗生物質耐性を付与する遺伝子のそれぞれに近接する領域に、それぞれ相補的なプライマーを設計し、ybjE遺伝子内部配列を得た。この内部配列は、プラスミドpACYC184(NBL Gene SciencesLtd. (英国)、 GenBank/EMBL アクセッション番号 X06403)を鋳型に、配列番号7及び8に示す合成オリゴヌクレオチドをプライマーに用いてPCRを行うことにより取得することも可能である。
ybjE遺伝子欠損株MG1655ΔybjE::Cmのアミノ酸耐性に対する影響を調べた。MG1655ΔybjE::Cm株、並びに比較対照のMG1655株を、L培地で往復振とう培養装置により約6時間程度培養した培養液(OD600≒1.0)を遠心後、菌体をM9最小培地で2回洗浄し、終濃度OD600=0.05になるようにM9最小培地及び80g/Lリジン塩酸塩を含有するM9最小培地に植菌し、70時間程度培養し、生育を調べた。
エシェリヒア・コリのL−リジン生産株として、AEC(S−(2−アミノエチル)−システイン)耐性株であるWC196株(AJ13069(FERM BP-5252);WO96/17930号国際公開パンフレット参照)を用いた。
べて、菌体内のリジン濃度が大幅に減少する事により、菌体内のリジン濃度に対する菌体外のL−リジン濃度が上昇し、ybjEはL−リジンの排出遺伝子であることが示唆された。
ybjE遺伝子増幅株のL−リジン蓄積、収率はともに対照株と比較して向上することが認められた。ここでは、L−リジンと同様、塩基性アミノ酸として知られるL−アルギニン生産への効果について検討した。エシェリヒア・コリのL−アルギニン生産菌として、N−アセチルグルタミン酸シンターゼのフィードバック阻害が解除された237株(VKPM B-7925;ロシア特許出願第2000117677号)を用いた。
実施例4と同様の方法を用い、237株のybjE遺伝子増幅株である237/pSYBJE1、及び、対照株として237/pSTV28を作製した。
以下に示す培地および培養方法ならびに分析方法にて、ybjE遺伝子増幅のL−アルギニン発酵への効果を検討した。前培養として、グリセロールストック100μlをL寒天培地に植菌し、50 mg/Lのクロラムフェニコールを含むLプレートに均一に塗布し、32度にて24時間培養した。上記寒天培地からプレートの1/8の面積をかき取り、アルギニン評価培地20mlに植菌し、32度にて90時間培養した。プラスミド導入菌株にはクロラムフェニコールを添加して行った。
<6−1> ybjE増幅用プラスミドpRSybjEの構築
メチロフィラス属微生物にybjE遺伝子を導入するために、公知のプラスミドpRS(特表平3-501682号公報参照)を用いて、ybjE発現用プラスミドpRSybjEを構築した。pRSは、RSF1010の誘導体である広宿主域ベクタープラスミドpAYC32(Chistorerdov, A.Y., Tsygankov, Y.D. Plasmid, 1986, 16, 161-167)に由来するpVIC40プラスミド(WO90/04636国際公開パンフレット、特表平3-501682号公報)から、同プラスミドが持つスレオニンオペロンをコードするDNA領域を削除して得られるベクター部分のみを持つプラスミドである。
・クロロホルム溶液を加えて混合し、反応を停止させた。反応液を遠心分離した後、上層を回収し、エタノール沈殿にてDNAを回収後、DNA blunting kitを用いて平滑末端処理した。
上記のようにして得られたpRSybjEを、エレクトロポレーション法(Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997))によりメチロフィラス・メチロトロファスAS1株(NCIMB10515)に導入した。なお、対照として、pRSをAS1株に導入した。pRSybjE及びpRSについて、それぞれストレプトマイシン耐性を指標として形質転換体を取得した。
メチロフィラス・メチロトロファスAS1株によるL−リジン生産において、ybjE遺伝子
の導入によりL-リジンの分泌が促進されることがわかったので、ybjE遺伝子を導入した株においてL−リジン生合成系酵素系の強化を行い、生産性の更なる向上を目指した。
L−リジン生合成系酵素遺伝子として、L−リジンによるフィードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子(以下dapA*と呼ぶ)を持つプラスミドを作製した。プラスミドの構築方法を図5に示す。
ybjEとdapA*の組み合わせ効果を評価するために、pRSdapAプラスミドにpRSybjE遺伝子を挿入したプラスミドを、図5に示した方法で構築した。実施例6で作製したpRSybjEを制限酵素SapIで消化し、DNA Blunting Kit(タカラバイオ社製)にて末端を平滑化した。また、dapA*を持つプラスミドpRSdapAを制限酵素EcoRIおよびSapIで消化し、0.8%アガロースゲルにより約1kbpのtacプロモーターおよびdapA*領域を含む断片を分離し、同断片をEASY TRAP Ver2(タカラバイオ社製)にて回収した。この断片を前記と同様に平滑化し、前記のpRSybjEの消化物とDNA Ligation Kit Ver2(タカラバイオ社製)にて連結した。
塗布し、37℃で一晩保温した。寒天培地上に出現したコロニーを20mg/Lのストレプトマイシンを含むLB液体培地に接種し、37℃で8時間振盪培養した。アルカリ−SDS法にて各培養液からプラスミドDNAを抽出し、制限酵素での消化および塩基配列の決定により構造を確認して、pRSybjEdapAプラスミドを得た。このプラスミドは、ybjEとdapA*の各遺伝子の転写の向きが同一になるように配置されている。
前記のようにして得られたpRSybjEdapA、pRSybjE、pRSdapA、又はpRSが導入されたAS1株を、20mg/Lのストレプトマイシンを含むSEIIプレートに塗り広げ、37℃にて1晩培養したのち、培地表面約0.3cm2の菌体をかきとって20mg/Lのストレプトマイシンを含む上述のSEII生産培地(20ml)に植菌し、37℃にて34時間振盪培養した。培養終了後、菌体を遠心分離により除去し、培養上清に含まれるL−リジン濃度をアミノ酸分析計(日本分光製、高速液体クロマトグラフィー)で定量した。結果を表4に示す。pRSybjEdapAを導入した株は、pRSdapAやpRSybjEを単独で導入した場合と比較して、培地中のL−リジン蓄積が向上しており、ybjE遺伝子とdapA*遺伝子増強効果が相乗的に表れたことがわかる。
次に、ybjE遺伝子増幅が、リジンアナログに対して与える影響について検討した。
上述のAS1/pRSybjEおよび対照としてpRSを持つメチロフィラス・メチロトロファスAS1株を20mg/Lのストレプトマイシンを含むSEII培地にて終夜培養した。この培養液を新しいSEII培地(20mg/Lのストレプトマイシンを含む)に10%植菌し、対数増殖期まで37℃にてしんとう培養を行った。この培養液をS−(2−アミノエチル)−システイン(AEC)をそれぞれ0,3,5g/Lの濃度で含むSEII培地(20mg/Lのストレプトマイシンを含む)に4%ずつ植菌し、37℃でしんとう培養しながら30分ごとに660nmのOD値を測定することで、それぞれの株のAECに対する耐性度を調べた。結果を図6に示す。測定にはアドバンテック社製のバイオフォトレコーダーTN-1506を使用し、専用試験管に5mlの培地をいれて使用した。
結果を図6に示す。
エシェリヒア・コリのL−スレオニン生産株としてエシェリヒア・コリB-5318株(欧州特許第0593792号明細書参照)を用いる。B-5318のybjE増幅株は例えば以下のような方法で構築することが出来る。
B-5318株を、実施例2で用いたybjE増幅用プラスミドpSYBJE1と、比較対照用プラスミドpSTV28(宝バイオ社製)で形質転換し、クロラムフェニコール耐性株を得る。所定のプラスミドが導入されていることを確認し、ybjE増幅用プラスミドpSYBJE1導入株、比較対照用プラスミドpSTV28導入株を構築することが出来る。ここで、ybjE増幅株をB-5318/ybjE,比較対照用プラスミド導入株をB-5318/pSTV28と命名する。
<10−1>ybjE増幅用プラスミドの作製
実施例2で構築したpSYBJE2を制限酵素EcoRI、及びPstIで処理し、得られた断片を同様の処理を施したベクターpVK7(米国特許出願公開 20030175912明細書)にライゲーションした。得られたybjE増幅用プラスミドをpVYBJE1と名づけた。
リジン生産能を有するコリネ型細菌として、Corynebacterium glutamicum ATCC13861株を用いた。常法に従って、Corynebacterium glutamicum ATCC13861株をpVK7、pVYBJE1で形質転換し、ATCC13861/pVK7株、及びATCC13861/pVYBJE1株を得た。また、これらの株を25 mg/Lのカナマイシンを含むM-CM2S培地にて終OD600≒0.6となるように31.5℃にて培養した後、培養液と等量の40%グリセロール溶液を加えて攪拌した後、適当量ずつ分注し-80℃に保存した。
これをグリセロールストックと呼ぶ。
ybjE遺伝子増幅用プラスミドと、比較対照用プラスミドpSTV28(タカラバイオ社製)を常法により、MG1655(ATCC 47076)に導入した。さらに、変異型ybjE遺伝子(ybjE*;配列番号1において第3番目のgがaに置換された配列を有する遺伝子)を含むプラスミドpSYJE1*2-1もMG1655株に導入した。
これらのプラスミドが導入された形質転換体をクロラムフェニコール耐性を指標として取得し、pSYBJE1が導入されたybjE導入株をMG1655/pSYJE1、pSYJE1*2-1が導入されたybjE導入株をMG1655/pSYJE1*2-1、pSTV28が導入された株をMG1655/pSTV28 と名づけた。
なお、変異型ybjE*増幅用プラスミドpSYJE1*2-1は以下のように構築した。まず、配列番号5と配列番号6の合成オリゴヌクレオチドをプライマー用いて、エシェリヒア・コリ
Lys生産菌NVC578の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。 得られたybjE遺伝子は、配列番号1において第3番目のgがaに置換された配列を有する変異型ybjE遺伝子(ybjE*)であった。精製したPCR産物を、SmaIで消化したベクターpSTV28(タカラバイオ社製)に連結してybjE*増幅用プラスミドを構築した。ybjE遺伝子がlacプロモーターに正方向に連結しているものをpSYJE1*2-1と名づけた。
尚、変異型ybjE*遺伝子は野生型ybjE遺伝子に上記変異を導入することによって得ることができる。変異導入方法としては、上記変異を有するオリゴヌクレオチドによるオーバーラップエクステンションPCR法を用いて、変異を含むybjE遺伝子を増幅する方法が挙げられる。(Urban, A., Neukirchen, S. and Jaeger, K. E., A rapid and efficient method for site-directed mutagenesis using one-step overlap extension PCR. Nucleic Acids Res, 25, 2227-8. (1997).)
上記で得たMG1655/pSYBJE1株、MG1655/pSYJE1*2-1株並びに対照株のMG1655/pSTV28株を、終濃度が50μg/mlとなるようにクロラムフェニコールを加えたL培地5mlに植菌し、往復振とう培養装置により約6時間程度培養した。濁度がOD600=1.0程度に菌体が増殖した培養液を遠心後、菌体をM9最小培地で2回洗浄し、最終濃度が濁度OD600=0.05になるように、終濃度50μg/mlのクロラムフェニコールを含むM9最小培地、及びアミノ酸(12g/Lイソロイシン、40g/Lスレオニン、15g/L グルタミン酸ナトリウム、30g/Lヒスチジン塩酸塩、45
g/Lオルニチン塩酸塩、90 g/Lアルギニン塩酸塩、8 g/Lフェニルアラニン、85g/Lプロリン、0.3g/Lシステイン)を含有するM9最小培地にそれぞれ植菌し、70時間程度培養し、生育を調べた。ここで、L-イソロイシンは脂肪族アミノ酸の代表として、L-スレオニンはヒロドキシモノアミノカルボン酸であるアミノ酸の代表として、L-プロリンは環式アミノ酸の代表として、L-フェニルアラニンは芳香族アミノ酸の代表として、L-システインは含硫アミノ酸の代表として、L-グルタミン酸は酸性アミノ酸として選択した。
、対照株に比較して、高濃度のL-アミノ酸存在下、特にL-アルギニン、L-オルニチン、L-イソロイシン、L-グルタミン酸、L-スレオニン、L-ヒスチジン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-システイン存在下での生育が向上することが明らかになった。また、変異型ybjE*遺伝子は野生型ybjE遺伝子よりもさらに効果的にMG1655株にアミノ酸耐性を付与することがわかった。
ybjE遺伝子として、配列番号1の塩基番号49〜948の900bp塩基配列からなる短いDNA断片の増幅がリジン耐性に寄与する効果を確認する為に以下の実験を行った。配列番号1の49〜948の塩基配列(以下、ybjE-900)、および配列番号1の塩基配列からなる948bpDNA断片(以下、ybjE-948)を増幅するためのベクターを構築して、エシェリヒア・コリMG1655に導入し、効果を確認した。ybjE-948増幅用の5'プライマーとして配列番号11の合成オリゴヌクレオチド(GenBankのAccession No. AE000189の塩基番号3799〜3818の配列に相補的な配列とその5'端にggcataを付与した配列、但し開始コドンに相当するgtgはatgに変更される)、3'側プライマーとして配列番号12の合成オリゴヌクレオチド(同塩基配列の塩基番号2873〜2891の配列に相当する配列とその5'端にggctcgagを付与した配列)、ybjE-900増幅用の5'プライマーとして配列番号13の合成オリゴヌクレオチド(GenBankのAccession No. AE000189の塩基番号3759〜3772の配列に相補的な配列とその5'端にggcatを付与した配列)、3'側プライマーとして配列番号12の合成オリゴヌクレオチドを用いて、MG1655株の染色体DNAを鋳型としてPCRを行った。
濁度がOD600=1.0程度に菌体が増殖した培養液を遠心後、菌体をM9最小培地で2回洗浄し、最終濃度が濁度OD600=0.01になるように、終濃度50μg/mlのクロラムフェニコール及び80g/Lのリジン塩酸塩を含有するM9最小培地に植菌し、20時間程度培養し、生育を調べた。
Claims (16)
- L−アミノ酸生産能を有し、かつ、ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変された微生物。
- ybjE遺伝子のコピー数を高めること、又は該遺伝子の発現調節配列を改変することによりybjE遺伝子の発現が増強された、請求項1に記載の微生物。
- ybjE遺伝子が、配列番号2、9、10から選択されるアミノ酸配列を有し、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードする遺伝子である、請求項1に記載の微生物。
- 前記ybjE遺伝子が、下記(a)又は(b)に記載のDNAである、請求項1に記載の微生物:
(a)配列番号1に示す塩基配列を含むDNA、
(b)配列番号1に示す塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - 前記ybjE遺伝子が、下記(c)又は(d)に記載のDNAである、請求項1に記載の微生物:
(c)配列番号1の塩基番号49〜948の塩基配列を含むDNA、
(d)配列番号1の塩基番号49〜948の塩基配列又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、L−アミノ酸排出活性を有するタンパク質をコードするDNA。 - ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変されることにより、L−アミノ酸の排出活性が向上したことを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の微生物。
- ybjE遺伝子の発現が増強されるように改変されることにより、L−アミノ酸耐性またはL−アミノ酸アナログ耐性が向上したことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記L−アミノ酸がL−リジン、L−アルギニン、L−オルニチン、L−ヒスチジン、L-イソロイシン、L-スレオニン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-システイン、L-グルタミン酸からなる群より選択される1種又は2種以上のL-アミノ酸である、請求項1〜7のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物が腸内細菌科に属する微生物であるである、請求項1〜8のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物がエシェリヒア属細菌である請求項9に記載の微生物。
- 前記微生物がコリネ型細菌である、請求項1〜8のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物がメタノール資化性細菌である請求項1〜8のいずれか一項に記載の微生物。
- 前記微生物がメチロフィラス属又はメチロバチルス属に属する細菌である請求項12に記載の微生物。
- 請求項1〜13のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養して、L−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL−アミノ酸を回収することを特徴とするL−アミノ酸の製造法。
- 請求項12又は13に記載の微生物を、メタノールを主要炭素源とする液体培地中で培養し、L−アミノ酸を該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりL−アミノ酸を回収することを特徴とするL−アミノ酸の製造方法。
- 前記L−アミノ酸がL−リジン、L−アルギニン、L−オルニチン、L−ヒスチジン、L-イソロイシン、L-スレオニン、L-プロリン、L-フェニルアラニン、L-システイン、L-グルタミン酸からなる群より選択される1種又は2種以上の塩基性アミノ酸である、請求項14又は15に記載の製造方法。
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