WO2011016301A1 - ビブリオ属細菌を用いたｌ－リジンの製造法 - Google Patents

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WO2011016301A1
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medium
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一平 井之上
寿 安枝
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味の素株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/08—Lysine; Diaminopimelic acid; Threonine; Valine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/01—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.1.1)
    • C12Y101/01055—Lactaldehyde reductase (NADPH) (1.1.1.55)

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing L-lysine using Vibrio bacteria.
  • L-Lysine is an industrially useful L-amino acid as an additive for animal feed, a component of health food, or an amino acid infusion.
  • L-lysine is a fermentation method using coryneform bacteria belonging to the genus Brevibacterium, Corynebacterium, etc., bacteria belonging to the genera Bacillus, Escherichia, Streptomyces, Methylobacillus, etc., or filamentous fungi belonging to Penicillium, etc. It is produced by.
  • Non-patent Document 1 a method for producing L-lysine, which reduces the degradation of L-lysine accumulated in the medium.
  • a method for reducing the ability of microorganisms to degrade L-lysine, in particular, the cadA gene or the ldcC gene in microorganisms belonging to the genus Escherichia Methods for reducing the expression level and enzyme activity have been known (Non-patent Document 1, Patent Document 4).
  • Vibrio bacteria Vibrio cholerae, Vibrio parahaemolyticus and Vibrio vuinificus were known to have cadA homologous genes (Non-patent Documents 2 to 4). However, it is not known whether the disruption of the cadA homolog gene causes weakening or loss of L-lysine degradation ability in these Vibrio bacteria. In addition, in Vibrio bacteria, the existence of an L-lysine degradation pathway other than the L-lysine degradation pathway involving the cadA homolog gene product is not known.
  • An object of the present invention is to provide a method for efficiently producing L-lysine using bacteria belonging to the genus Vibrio.
  • bacteria belonging to the genus Vibrio the present inventors have found a phenomenon that L-lysine accumulated in the medium decreases with the progress of culture, and one of the problems is to reduce this decrease in L-lysine. .
  • the present inventors have identified a gene encoding a factor involved in L-lysine degradation in Vibrio bacteria.
  • the inventors have found that by destroying the gene, degradation of accumulated L-lysine can be suppressed and L-lysine can be produced efficiently, and the present invention has been completed.
  • the present invention is as follows. (1) L-lysine obtained by culturing a Vibrio bacterium having L-lysine producing ability in a medium, causing L-lysine to be produced and accumulated in the medium or inside the cell, and collecting L-lysine from the medium or cell
  • the Vibrio bacterium is modified so that the activity of the protein encoded by the fucO gene is reduced.
  • the method wherein the activity of the protein is reduced by introducing a mutation into the coding region of the fucO gene and / or the expression control region of the gene.
  • A DNA comprising the base sequence of SEQ ID NO: 1
  • B a protein that hybridizes under stringent conditions with the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or a probe that can be prepared from the nucleotide sequence, and that improves L-lysine-producing ability when activity in bacteria is reduced DNA encoding
  • the bacterium has enhanced activity of one or more enzymes selected from the group consisting of dihydrodipicolinate synthase, aspartokinase, dihydrodipicolinate reductase, and diaminopimelate dehydrogenase, Method.
  • the medium is a medium containing glycerol as a carbon source.
  • the figure which shows suppression of L-lysine degradation by fucO gene deletion (a) Time-dependent change of OD660 of the culture solution diluted 51 times. (b) Change with time in glucose concentration in the medium. (c) Time course of L-lysine concentration in the medium. The average and standard deviation of 3 samples are shown. The figure which shows L-lysine production from glucose using V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2. (a) OD660 of culture solution diluted 51 times. (b) Glucose concentration in the medium, (c) L-lysine concentration in the medium. (d) Yield of L-lysine sugar consumed for 40 hours after the start of culture.
  • 0% NaCl to 8% NaCl indicate the average value and standard deviation when 0 to 8% (w / v) Na NaCl is added to the MS medium and cultured.
  • the figure which shows L-lysine production from glycerol using V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2.
  • 0% NaCl, 2% NaCl, and 4% NaCl are the mean and standard deviation when cultivated by adding 0 to 4% (w / v) NaCl to MS medium using glycerol as a carbon source.
  • the bacterium of the present invention is a Vibrio bacterium that has L-lysine production ability and has been modified so that the activity of the protein encoded by the fucO gene is reduced.
  • the ability to produce L-lysine is the ability to produce L-lysine in the medium or in the cells and accumulate it to the extent that it can be recovered in the medium or from the cells when the bacterium of the present invention is cultured in the medium.
  • the bacterium of the present invention is a Vibrio bacterium that can produce L-lysine by fermentation using sugar or the like as a carbon source (also called direct fermentation).
  • L-lysine includes free L-lysine and / or a salt thereof, such as sulfate, hydrochloride, carbonate and the like.
  • Vibrio bacteria having L-lysine production ability may be inherently L-lysine production ability. However, Vibrio bacteria as described below can be mutated using recombinant DNA technology. It may be modified so that it has an ability to produce L-lysine.
  • the Vibrio bacterium of the present invention may have the ability to produce other amino acids such as L-threonine and L-glutamic acid in addition to the ability to produce L-lysine.
  • Vibrio is a gram-negative facultative anaerobe belonging to the Vibrionanceae family of ⁇ -propiobacteria. It is a bacterium found in freshwater and seawater that moves with a single flagella. Vibrio bacteria used in the present invention are preferably non-pathogenic, and Vibrio bacteria whose pathogenicity is not known are biosafety level 1 (Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) published by the Office of Health and Safety (OHS)). ) 4th Edition) and the following Vibrio bacteria can be used.
  • biosafety level 1 Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) published by the Office of Health and Safety (OHS)
  • Vibrio spp. Some of which are classified as Vibrio spp. (Thompson, F. L. et al. (2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev. , 23, 403-431 and Macian, M. C. et al. (2000) Syst. Appl. Microbiol., 23, 373-375.). Therefore, such bacteria can also be used as Vibrio bacteria in the present invention.
  • Vibrio natriegens is preferably used.
  • Vibrio natriegens is a marine facultative anaerobic bacterium belonging to the Vibrionanceae family of ⁇ -propiobacteria and was isolated as a uronic acid oxidizing bacterium in 1958 (Payne, W. J. (1958) J. Bacteriology, 76, 301).
  • ATCC is classified as BiosafetyBiolevel 1 and DSMZ (the German National Resource for Biological Material) is also classified as Risk Group 1 (German classification), and pathogenicity is not known.
  • Vibrio natrigens As Vibrio natrigens, Vibrio natrigens ATCC14048 (NBRC15636 strain) can be used.
  • the above-mentioned bacteria belonging to the genus Vibrio for example, they can be purchased from the American Type Culture Collection (address P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America). That is, a registration number corresponding to each strain is given, and it is possible to receive a sale using this registration number (see http://www.atcc.org/). The registration number corresponding to each strain is described in the catalog of American Type Culture Collection.
  • Vibrio Natligence ATCC14048 strain is the number of NBRC15636 in the Biological Genetic Resource Department (NITE NBRC) (National Institute of Technology and Evaluation) (National Institute of Technology and Evaluation, 2-5-8, Kazusa-Kamazu, Kisarazu City, Chiba Prefecture 292-0818). It can be obtained from the same organization.
  • Vibrio bacteria are microorganisms that have been conventionally used for L-amino acid production (for example, Escherichia coli and so on) under high osmotic pressure conditions in which substances in the latter half of amino acid fermentation are highly accumulated or under high osmotic pressure conditions where the sugar concentration is high.
  • the bacterium can be preferably grown.
  • the high osmotic pressure is preferably, for example, a condition of 925 mOsm or more, preferably 1100 mOsm or more, more preferably 1500 mOsm or more.
  • the upper limit of the high osmotic pressure condition is not particularly limited as long as amino acid fermentation is possible, but is, for example, 2000 mOsm.
  • the expression “can be suitably grown under high osmotic pressure” means, for example, that the growth rate is maximum at 1100 mOsm in which the growth rate of an E. coli wild strain, for example, MG1655 strain (ATCC 47076) is reduced to 50% or less of the maximum. It means that it is kept higher than 50% of the hour, and preferably the growth rate is reduced only to about 90% of the maximum.
  • the enhancement of the activity of the L-lysine biosynthetic enzyme can be performed by increasing the copy number of a gene encoding the enzyme or by modifying an expression regulatory sequence such as a promoter.
  • imparting properties such as auxotrophy, L-amino acid analog resistance, and metabolic control mutation may be combined with enhancing the activity of lysine biosynthetic enzymes.
  • a method for imparting L-lysine producing ability will be exemplified.
  • L-lysine producing bacteria include L-homoserine, or mutant strains that require L-threonine and L-methionine (Japanese Patent Publication Nos. 48-28078 and 56-6499), mutants that require inositol or acetic acid.
  • Mutation treatment methods for obtaining mutants from Vibrio spp. include UV irradiation, mutations commonly used for mutation treatment such as N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine (NTG) or nitrous acid. The method of processing with an agent is mentioned. Vibrio bacteria having L-amino acid-producing ability can also be obtained by selecting natural mutants of Vibrio bacteria.
  • An L-amino acid analog resistant mutant can be obtained by, for example, inoculating a mutated Vibrio bacterium into an agar medium containing various concentrations of the L-amino acid analog and selecting a strain that forms a colony. it can.
  • the auxotrophic mutant strain forms a Vibrio bacterium colony on an agar medium containing a target nutrient substance (for example, L-amino acid) and replicates it on the agar medium containing no nutrient substance. It can be obtained by selecting a strain that cannot grow on an agar medium containing no substance.
  • a target nutrient substance for example, L-amino acid
  • Vibrio natrigens 28-15 strain (FERM BP-10946) can be mentioned (WO2008 / 093829). This strain was named AJ110593, and was established on October 24, 2006 by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1st, 1st East, 1-chome, Tsukuba City, Ibaraki Prefecture, 305-8566). Deposited as deposit number FERM P-21066, then transferred to international deposit and assigned deposit number of FERM BP-10946.
  • the ability to produce L-lysine can be imparted, for example, by enhancing dihydrodipicolinate synthase activity and / or aspartokinase activity.
  • a gene fragment encoding dihydrodipicolinate synthase and / or a gene fragment encoding aspartokinase is used in Vibrio bacteria.
  • a recombinant DNA may be prepared by ligating with a functioning vector, preferably a multicopy type vector, and this may be introduced into a host of Vibrio bacteria and transformed.
  • dihydrodipicolinate synthase may be abbreviated as DDPS, aspartokinase as AK, and aspartokinase III as AKIII.
  • any microorganism that can express DDPS activity and AK activity among microorganisms belonging to the genus Vibrio can be used as a microorganism that provides a gene encoding DDPS and a gene encoding AK.
  • the microorganism may be either a wild strain or a mutant derived therefrom.
  • E. coli (Escherichia coli) K-12 strain, Vibrio natrigens ATCC14048 (NBRC15636) strain and the like can be mentioned.
  • a gene encoding DDPS derived from bacteria belonging to the genus Escherichia (dapA, Richaud, F. et al. J.
  • Vibrio spp. Genes can be obtained by using the following GenBank database. Vibrio cholerae O1 biovar eltor str.N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852 Vibrio cholerae O1 biovar eltor str.N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031 Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032 Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020 Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021 Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795 Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796 Vibrio vulnificus YJ0
  • DDPS and AK used in the present invention are preferably those that are not subject to feedback inhibition by L-lysine.
  • Wild-type DDPS derived from Vibrio spp. Is known to be subject to feedback inhibition by L-lysine
  • wild-type AKIII derived from Vibrio spp. Is known to be suppressed and feedback inhibited by L-lysine. Therefore, it is preferable that dapA and lysC introduced into Vibrio bacteria encode DDPS and AKIII having a mutation that cancels feedback inhibition by L-lysine, respectively.
  • DDPS and AK do not necessarily need to be mutated.
  • DDPS derived from Corynebacterium is originally known not to be feedback-inhibited by L-lysine.
  • homologs may exist for genes encoding aspartokinase, and the gene source is not limited as long as it has aspartokinase activity.
  • the AK gene of Vibrio natrigens includes an AKO gene, a thrA gene, a metL gene, a lysC gene, and a putative-AK gene.
  • SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of the region containing Vibrio natrigens AKO gene.
  • SEQ ID NO: 11 shows the base sequence of the region containing Vibrio natrigens AKO gene.
  • GTGs of base numbers 526 to 528, GTGs of base numbers 544 to 546 or GTGs of base numbers 568 to 570 are start codons, and TGA of base numbers 1711-1713 is a stop codon.
  • the nucleotide sequence of nucleotide numbers 526-1710 of SEQ ID NO: 11 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 1-395 of SEQ ID NO: 12), the nucleotide sequence of nucleotide numbers 544-1710 (coded amino acid sequence) Can be used as the AKO gene.
  • the DNA having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 568-1710 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 15-395 of SEQ ID NO: 12) can be used as the AKO gene
  • SEQ ID NO: 13 shows the nucleotide sequence of the region containing the thrA gene of Vibrio natrigens. In SEQ ID NO: 13, it is presumed that ATG at base numbers 486-488, GTG at base numbers 591-593 or GTG at base numbers 633-635 is the start codon, and TAA at base numbers 2943-2945 is the stop codon.
  • nucleotide sequence of nucleotide numbers 486-2942 of SEQ ID NO: 13 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 1-819 of SEQ ID NO: 14)
  • nucleotide sequence of nucleotide numbers 591-2942 (encoded amino acid sequence) Is the amino acid number 35-819 of SEQ ID NO: 14, or a DNA having the base sequence of base numbers 633-2942 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 50-819 of SEQ ID NO: 14)
  • the thrA gene the nucleotide sequence of nucleotide numbers 486-2942 of SEQ ID NO: 13
  • the nucleotide sequence of nucleotide numbers 591-2942 (encoded amino acid sequence) Is the amino acid number 35-819 of SEQ ID NO: 14, or a DNA having the base sequence of base numbers 633-2942 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 50-819 of SEQ ID NO: 14)
  • SEQ ID NO: 15 shows the base sequence of the region containing the Vibrio natrigens metL gene.
  • ATG at base numbers 376-378, GTG at base numbers 487-489 or GTG at base numbers 490-492 is the start codon
  • TAA at base numbers 2782-2784 is the stop codon.
  • the nucleotide sequence of nucleotide numbers 376-2781 of SEQ ID NO: 15 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 1-802 of SEQ ID NO: 16), the nucleotide sequence of nucleotide numbers 487-2781 (coded amino acid sequence) Can be used as the metL gene.
  • the DNA having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 490-2781 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 39-802 of SEQ ID NO: 16) can be used as the metL gene.
  • SEQ ID NO: 17 shows the nucleotide sequence of the region containing the lysC gene of Vibrio natrigens.
  • GTG at base numbers 1060-1062 or ATG at base numbers 1117-1119 is the start codon
  • TAA at base numbers 2410-2412 is the stop codon.
  • the base sequence of nucleotide numbers 1060-2409 of SEQ ID NO: 17 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 1-450 of SEQ ID NO: 18) or the nucleotide number of 1117-2409 (the encoded amino acid sequence is the sequence) as an open reading frame DNA having amino acid numbers 20-450 of number 18 can be used as the lysC gene.
  • SEQ ID NO: 19 shows the nucleotide sequence of the region containing the putative-AK gene of Vibrio natrigens.
  • the ATG of base numbers 344-346, the ATG of base numbers 380-382 or the ATG of base numbers 470-472 is the start codon, and the TAA of base numbers 1766-1768 is the stop codon.
  • the base sequence of nucleotide number 344-1765 of SEQ ID NO: 19 (the encoded amino acid sequence is amino acid number 1-474 of SEQ ID NO: 20), the base sequence of base number 380-1765 (encoded amino acid sequence) Can be used as the putative-AK gene.
  • the DNA having the nucleotide sequence of nucleotide numbers 470-1765 (the encoded amino acid sequence is amino acid numbers 43-474 of SEQ ID NO: 20) can be used.
  • the AKO gene, thrA gene, metL gene, lysC gene, and putative-AK gene described above hybridize with a probe that can be prepared from a complementary strand or the same base sequence under stringent conditions, and aspartokinase activity It may be a DNA encoding a protein having
  • stringent conditions refers to conditions under which so-called specific hybrids are formed and non-specific hybrids are not formed. Although it is difficult to clearly quantify this condition, for example, highly homologous DNAs, for example, 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and still more preferably 97%. As described above, it is particularly preferable that DNAs having a homology of 99% or more hybridize with each other and DNAs with lower homology do not hybridize with each other, or the condition of washing at 60 ° C. under normal Southern hybridization.
  • ⁇ SSC 0.1% SDS, preferably 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS, more preferably 68 ° C., 0.1 ⁇ SSC, once at a salt concentration and temperature corresponding to 0.1% SDS, more preferably 2 to 3
  • the conditions for washing twice are mentioned.
  • the length of the probe is appropriately selected depending on the hybridization conditions, but is usually 100 bp to 1 Kbp.
  • “homology” may refer to “identity”.
  • the aspartokinase activity can be measured by the method described in Miyajima, Retal; The Journal of Biochemistry (1968), 63 (2), 139-148.
  • the AKO gene, thrA gene, metL gene, lysC gene, and putative-AK gene are not limited to wild-type genes. As long as they have aspartokinase activity, they are encoded in the open reading frame of each gene.
  • a variant or artificial variant that encodes a conservative variant having an amino acid sequence that includes substitution, deletion, insertion or addition of one or several amino acids at one or more positions It may be.
  • one or several differs depending on the position and type of the amino acid residue in the three-dimensional structure of the protein, but specifically 1 to 20, preferably 1 to 10, more preferably 1 to Mean 5.
  • the substitution, deletion, insertion, or addition of one or several amino acids is a conservative mutation that maintains the above function.
  • a conservative mutation is a polar amino acid between Phe, Trp, and Tyr when the substitution site is an aromatic amino acid, and between Leu, Ile, and Val when the substitution site is a hydrophobic amino acid.
  • the AKO gene, thrA gene, metL gene, lysC gene, and putative-AK gene are 80% or more, preferably 90% or more, based on the entire amino acid sequence encoded by the open reading frame of each gene.
  • a sequence encoding a protein having a homology of preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and having aspartokinase activity can also be used.
  • the algorithm BLAST Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993 5873 (1993)
  • FASTA Methodhods Enzymol., 183, 63 (1990)
  • Altschul are used. Can be determined. Based on this algorithm BLAST, programs called BLASTN and BLASTX have been developed (see http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
  • the plasmid used for gene cloning may be any plasmid that can be replicated in microorganisms such as Escherichia bacteria, and specific examples include pBR322, pTWV228, pMW119, and pUC19.
  • any vector that functions in Vibrio bacteria can be used as long as it is a plasmid that can autonomously replicate in Vibrio bacteria.
  • Any vector plasmid that has ori derived from pUC, pACYC184, or IncQ can be used as the vector plasmid.
  • a marker gene used for selection a Tn903-derived kanamycin resistance gene, a Tn9-derived chloramphenicol resistance gene, a streptomycin resistance gene, a tetracycline resistance gene, or the like can be used.
  • the vector is cleaved with a restriction enzyme that matches the ends of the DNA fragment containing dapA and lysC. Ligation is usually performed using a ligase such as T4 DNA ligase. dapA and lysC may be mounted on separate vectors or on the same vector.
  • DNA encoding a mutant dihydrodipicolinate synthase that is not subject to feedback inhibition by L-lysine examples include DNA encoding a protein having a sequence in which the histidine residue at position 118 is substituted with a tyrosine residue.
  • the threonine residue at position 352 is replaced with an isoleucine residue
  • the glycine residue at position 323 is replaced with an asparagine residue
  • 318 Examples include DNA encoding AKIII having a sequence in which the methionine at the position is replaced with isoleucine (see US Pat. Nos. 5,610,010 and 6,040,160 for these variants). Mutant DNA can be obtained by site-specific mutagenesis such as PCR.
  • plasmids RSFD80, pCAB1, and pCABD2 are known as plasmids containing mutant dapA encoding mutant mutant dihydrodipicolinate synthase and mutant lysC encoding mutant aspartokinase (USA) Patent No. 6040160).
  • Escherichia coli strain JM109 transformed with RSFD80 US Pat. No.
  • any method can be used as long as sufficient transformation efficiency can be obtained.
  • electroporation Canadian Journal of Microbiology, 43. 197 (1997)).
  • the enhancement of DDPS activity and / or AK activity can also be achieved by allowing multiple copies of dapA and / or lysC on the chromosomal DNA of Vibrio bacteria.
  • Introducing dapA and / or lysC in multiple copies onto the chromosomal DNA of Vibrio bacteria can be carried out by homologous recombination using a sequence present in multiple copies on the chromosomal DNA as a target.
  • a sequence present in multiple copies on chromosomal DNA repetitive DNA, inverted repeats present at the end of a transposable element, and the like can be used.
  • dapA and / or lysC can be mounted on a transposon and transferred to introduce multiple copies onto chromosomal DNA.
  • DDPS activity and / or AK activity is amplified.
  • Amplification of DDPS activity and / or AK activity can be achieved by replacing expression control sequences such as dapA and / or lysC promoters with strong ones in addition to the gene amplification described above (JP-A-1-215280). No. publication). For example, lac promoter, trp promoter, trc promoter, tac promoter, lambda phage PR promoter, PL promoter, or hybrid promoters thereof are known as strong promoters. By replacing these promoters, DDPS activity and / or AK activity is amplified by enhancing the expression of dapA and / or lysC. Substitution of expression regulatory sequences may be combined with increasing the copy number of dapA and / or lysC (Science.
  • DNA cleavage, ligation, and other methods such as chromosomal DNA preparation, PCR, plasmid DNA preparation, transformation, setting of oligonucleotides used as primers, etc. adopt ordinary methods well known to those skilled in the art. can do. These methods are described in Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual", Second Edition ", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989).
  • DDPS activity and / or AK activity the activity of other enzymes involved in L-lysine biosynthesis may be enhanced.
  • enzymes include dihydrodipicolinate reductase (dapB), diaminopimelate decarboxylase (lysA), diaminopimelate dehydrogenase (ddh) (above, WO 96/40934 pamphlet), phosphoenolpyruvate carboxylase (ppc ) (Japanese Patent Laid-Open No. 60-87788), Aspartate aminotransferase (aspC) (Japanese Patent Publication No.
  • Diaminopimelate epimerase (dapF) (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-135066), Aspartate semialdehyde dehydration Examples thereof include enzymes of the diaminopimelate pathway such as elementary enzyme (asd) (WO 00/61723 pamphlet), and enzymes of the aminoadipate pathway such as homoaconite hydratase (Japanese Patent Laid-Open No. 2000-157276).
  • the parentheses after the enzyme name are gene names (the same applies to the following description).
  • PCABD2 is derived from Escherichia coli having a mutant dapA gene encoding DDPS derived from Escherichia coli having a mutation in which feedback inhibition by L-lysine is released, and from Escherichia coli having a mutation in which feedback inhibition by L-lysine is released. It contains a mutant lysC gene encoding AKIII, a dapB gene encoding dihydrodipicolinate reductase derived from Escherichia coli, and a ddh gene encoding diaminopimelate dehydrogenase derived from Brevibacterium lactofermentum. WO95 / 16042, WO01 / 53459 pamphlet).
  • the Vibrio bacterium of the present invention may be a bacterium whose L-lysine producing ability is enhanced by enhancing L-lysine excretion activity.
  • L-lysine excretion activity can be increased by increasing the expression level of the ybjE gene or increasing the expression level of the lysE gene (Japanese Patent Laid-Open No. 2005-237379, WO 97/23697 pamphlet).
  • the bacterium of the present invention further functions negatively in the activity of an enzyme that catalyzes a reaction that branches from the biosynthetic pathway of L-lysine to produce a compound other than L-lysine, and in the synthesis or accumulation of L-lysine acid.
  • the enzyme activity may be reduced or deficient.
  • examples of such enzymes include homoserine dehydrogenase, malic enzyme, and the like, and strains in which the activity of the enzyme is reduced or deleted are disclosed in International Publication Nos. WO95 / 23864, WO96 / 17930, and WO2005. Can be constructed with reference to the / 010175 pamphlet.
  • a mutation that reduces or eliminates the activity of the enzyme in the cell is applied to the gene of the enzyme on the genome by a usual mutation treatment method or gene recombination technique. What is necessary is just to introduce.
  • Such mutations can be introduced, for example, by deleting a gene encoding an enzyme on the genome by genetic recombination or by modifying an expression regulatory sequence such as a promoter or Shine-Dalgarno (SD) sequence. Achieved.
  • a partial gene of the target gene is modified to produce a mutant gene that does not produce a normally functioning enzyme, transformed into a bacterium belonging to the genus Vibrio with the DNA containing the gene, and the mutant gene and genome
  • the target gene on the genome can be replaced with a mutant.
  • the gene replacement using such homologous recombination is a method called “Red-driven integration” (Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.
  • the method for reducing the enzyme activity described above can be applied to the following FucO protein activity reduction.
  • the bacterium of the present invention is a protein belonging to the genus Vibrio having the ability to produce L-lysine as described above (hereinafter referred to as “FucO”). It is obtained by modifying the activity so that the activity is reduced.
  • the bacterium of the present invention only needs to be modified so that the activity of the protein encoded by the fucO gene is reduced as compared to the wild strain or the unmodified strain. -It is more desirable that lysine accumulation ability is improved.
  • the fucO gene is a homologue of the E.coli fucO gene and can be obtained from a bacterium belonging to the genus Vibrio, and includes, for example, a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 is the base sequence of the fucO gene of V. natiregens 28-15 strain.
  • SEQ ID NO: 2 shows the amino acid sequence encoded by the same gene.
  • the fucO gene of the present invention is a gene having homology with the E.coli fucO gene.
  • the fucO gene of E. coli MG1655 strain is registered in GenBank as a gene encoding L-1,2-propanediol oxidoreductase (GenBank NC_000913.2, complementary strand of nucleotide numbers 2929887..2931038).
  • the fucO gene of the present invention includes the Vibrio parahaemolyticus eutG gene or a gene homologous thereto.
  • the eutG gene is registered in GenBank as iron-containing alcohol dehydrogenase (NC_004603.1, nucleotide number 1301840..1303159).
  • the amino acid homology between the E. coli fucO gene product and the E. coli eutG gene product is 77.3% (using Genetix ver.9.0.3 manufactured by Genetics Co., Ltd.).
  • the homologue of the Vibrio genus fucO gene is, for example, a gene having the base sequence of SEQ ID NO: 1, the fucO gene of E.coli, or a gene highly homologous to the eutG gene described in BLAST (http: //blast.genome. It can be obtained by searching with jp /).
  • the homology is not particularly limited as long as L-lysine accumulation is improved by reducing the activity of the gene expression product.
  • the homology is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably, relative to the entire amino acid sequence. It is 95% or more, more preferably 97% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • Examples of the protein encoded by the fucO gene include those having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, but may be conservative variants as long as the function of the protein is not changed.
  • the fucO gene may be DNA that hybridizes under stringent conditions with a base sequence consisting of SEQ ID NO: 1 or a probe that can be prepared from the base sequence as long as it encodes a FucO protein. “Stringent conditions” are the same as described above.
  • the activity of the protein encoded by the fucO gene has decreased means that a mutation is introduced into the coding region of the fucO gene by a drug or genetic engineering, and the function of the FucO protein encoded by the gene is weakened or lost, In addition, by introducing a mutation into the expression control region or the like of the fucO gene, the expression or translation of the fucO gene is reduced, thereby reducing the amount of FucO protein. Moreover, the activity of the FucO protein can be reduced by so-called gene disruption, that is, by deleting all or part of the fucO gene on the chromosome. The decrease in activity includes complete disappearance of activity.
  • the method for reducing the enzyme activity described for imparting L-lysine producing ability can be used.
  • Method for producing L-lysine comprises culturing the bacterium of the present invention in a medium, and producing and accumulating L-lysine in the medium or in the microbial cells. It is a method to collect.
  • a medium conventionally used in the fermentation production of L-amino acids using microorganisms can be used. That is, a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic components as required can be used.
  • a carbon source saccharides such as glucose, sucrose, lactose, galactose, fructose and starch hydrolysate, alcohols such as glycerol and sorbitol, organic acids such as fumaric acid, citric acid and succinic acid are used. be able to.
  • glycerol is preferably used as a carbon source.
  • glycerol is preferably used as a carbon source.
  • Glycerol may be used at any concentration suitable for producing L-lysine. When used as a single carbon source in the medium, it is preferably about 0.1 w / v% to 50 w / v%, more preferably about 0.5 w / v% to 40 w / v%, particularly preferably 1 w / v% to About 30 w / v% is contained in the medium.
  • Glycerol can also be used in combination with other carbon sources such as glucose, fructose, sucrose, molasses, starch hydrolysates.
  • glycerol and the other carbon source can be mixed in any ratio, but the ratio of glycerol in the carbon source is 10% by weight or more, more preferably 50% by weight or more, more preferably 70% by weight. % Or more is desirable.
  • Preferred as other carbon sources are glucose, fructose, sucrose, lactose, galactose, molasses, sugars such as sugar hydrolyzate obtained by hydrolysis of starch hydrolyzate or biomass, alcohols such as ethanol, fumaric acid, Organic acids such as citric acid and succinic acid. Among these, glucose is preferable.
  • the preferred initial concentration of glycerol at the start of the culture is as described above, but glycerol may be added depending on the consumption of glycerol during the culture.
  • the glycerol used may be pure glycerol or crude glycerol.
  • Crude glycerol refers to glycerol containing impurities produced industrially. Crude glycerol is produced industrially by contacting and hydrolyzing fats and oils with water under high temperature and high pressure, or by an esterification reaction for biodiesel fuel production.
  • Biodiesel fuel is fatty acid methyl ester that is produced by transesterification from oil and methanol, and crude glycerol is produced as a by-product of this reaction (Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416).
  • an alkali catalyst method is often used for transesterification, and an acid is added during neutralization, so that crude glycerol having a purity of about 70 to 95% by weight containing water and impurities is produced.
  • Crude glycerol produced in biodiesel fuel production contains, in addition to water, residual methanol and alkali salts such as NaOH as a catalyst and salts of acids such as K 2 SO 4 used for neutralization as impurities. .
  • alkali salts such as NaOH as a catalyst and salts of acids such as K 2 SO 4 used for neutralization as impurities.
  • salts and methanol reach several percent.
  • ions derived from alkali or acid used for neutralization thereof such as sodium, potassium, chloride ion and sulfate ion are 2 to 7%, preferably 3 to 6% based on the weight of crude glycerol. More preferably, the content is 4 to 5.8%.
  • Methanol may not be contained as an impurity, but it is preferably contained in 0.01% or less.
  • crude glycerol may contain trace amounts of metals, organic acids, phosphorus, fatty acids and the like.
  • the organic acid included include formic acid and acetic acid.
  • the organic acid may not be included as an impurity, but preferably 0.01% or less.
  • the trace metal contained in the crude glycerol is preferably a trace metal necessary for the growth of microorganisms, and examples thereof include magnesium, iron, calcium, manganese, copper, and zinc.
  • Magnesium, iron, and calcium are preferably contained in a total amount of 0.00001 to 0.1%, preferably 0.0005 to 0.1%, more preferably 0.004 to 0.05%, and still more preferably 0.007 to 0.01%, based on the weight of the crude glycerol.
  • Manganese, copper, and zinc are preferably contained in a total amount of 0.000005 to 0.01%, more preferably 0.000007 to 0.005%, and still more preferably 0.00001 to 0.001%.
  • the purity of glycerol in the crude glycerol may be 10% or more, preferably 50% or more, more preferably 70% or more, and particularly preferably 80% or more. As long as the content of impurities satisfies the above range, the purity of glycerol may be 90% or more.
  • the crude glycerol may be added to the medium so that the concentration of glycerol is the above concentration depending on the purity of glycerol. Further, both glycerol and crude glycerol may be added to the medium.
  • inorganic ammonium salts such as ammonium sulfate, ammonium chloride, and ammonium phosphate
  • organic nitrogen such as soybean hydrolysate, ammonia gas, aqueous ammonia, and the like
  • organic trace nutrient source it is desirable to contain an appropriate amount of required substances such as vitamin B 1 and L-homoserine or yeast extract.
  • potassium phosphate, magnesium sulfate, iron ions, manganese ions and the like are added as necessary.
  • the medium used in the present invention may be a natural medium or a synthetic medium as long as it contains a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and other organic trace components as required.
  • Cultivation is preferably carried out for 1 to 7 days under aerobic conditions, the culture temperature is preferably 24 ° C. to 37 ° C., and the pH during the culture is preferably 5 to 9.
  • an inorganic or organic acidic or alkaline substance, ammonia gas or the like can be used for pH adjustment.
  • the pH during the cultivation is controlled to 6.5 to 9.0, and the pH of the medium at the end of the cultivation is controlled to 7.2 to 9.0.
  • the basic amino acid may be recovered by a method (JP 2002-65287 A, US 2002-0025564A EP 1813677A).
  • the pH of the medium during the culture is 6.5 to 9.0, preferably 6.5 to 9.0.
  • the pH of the medium at the end of the culture is controlled to be 7.2 to 9.0, and further the pressure in the fermenter during the fermentation is controlled to be positive, or carbon dioxide or It is known to supply a mixed gas containing carbon dioxide gas to a culture medium (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-65287, US Patent Application Publication No. 20020025564, EP1813677A).
  • the recovery of L-lysine from the fermentation broth is usually performed by the ion exchange resin method (Nagai, H. et al., Separation Science and Technology, (39 (16), 3691-3710), precipitation method, membrane separation method (Japanese Patent Laid-Open No. 9-9 No. 164323, JP-A-9-173792), crystallization methods (WO2008 / 078448, WO2008 / 078646), and other known methods can be combined.
  • the microbial cells are crushed by ultrasonic waves and the microbial cells are removed by centrifugation, and the L-lysine is obtained from the supernatant obtained by ion exchange resin method or the like. Can be recovered.
  • the L-lysine recovered may contain bacterial cells, medium components, water, and bacterial metabolic byproducts in addition to L-lysine.
  • the purity of the collected L-lysine is 50% or more, preferably 85% or more, and particularly preferably 95% or more (JP1214636B, USP4315,431,933, 4,956,471, 7774,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005 / 0025878)).
  • L-lysine precipitates in the medium it can be recovered by centrifugation or filtration. Further, L-lysine precipitated in the medium may be isolated together after crystallization of L-lysine dissolved in the medium.
  • Example 1 Construction of V. natriegens with disrupted fucO gene The fucO gene on the chromosome of the lysine-producing bacterium V. natriegens 28-15 was disrupted.
  • PCR is performed using the pDNR-Dual Doner vector (Clontech, USA) having the sacB gene of Bacillus subtilis as a template DNA, and the synthetic DNAs having the sequences of SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 4 as primers, and the sacB gene is amplified.
  • the sacB gene encodes levanshuclease and is a gene used to efficiently select a strain from which the vector portion has been dropped from the chromosome (Schafer, A. et al. Gene 145 (1994) 69-73). That is, when levan sucrose is expressed, levan produced by assimilating sucrose works lethally and cannot grow. Therefore, if a strain having a vector carrying the levan sucrose enzyme remaining on the chromosome cannot be grown on a sucrose-containing plate, only the strain from which the vector has been dropped can be selected on the sucrose-containing plate.
  • pUT399 is a plasmid having an R6K origin of replication, a plasmid containing a mob region necessary for conjugation transfer, and a plasmid that cannot be replicated by a strain not having a pir gene (US Pat. No. 7090998).
  • PCR was performed using the chromosomal DNA of V.
  • telomere sequence was amplified.
  • PCR was performed again using the obtained mixture of the two types of PCR products as template DNA and using synthetic DNAs having the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 7 as primers.
  • the obtained PCR product and pUT_sacB were both digested with restriction enzymes SalI and SphI and ligated to obtain a vector pUT_sacB_fucOFR.
  • pUT_sacB_fucOFR is a plasmid for disrupting the fucO gene lacking a part of the coding region of fucO. Then, pUT_sacB_fucOFR was introduced into E. coli S17-1 ( ⁇ pir +, available from Biomedal: R. Simon., Et al., Bio / Technology 1; 784-791 (1983)), and S17-1 / pUT_sacB_fucOFR Obtained.
  • S17-1 / pUT_sacB_fucOFR is added to LB medium (10 g / L Bacto-tryptone, 5 g / L Bacto-yeast extract, 5 g / L NaCl, and 40 mg / L chloramphenicol, pH 7.0). Planted in 1.5 ml and cultured at 37 ° C for 18 hours. The obtained culture broth was collected by centrifugation (5000 rpm, 5 minutes) and suspended in 50 ⁇ l of fresh LB medium.
  • the bacterial solution contains LB-NaCl agar medium (10 g / L Bacto-tryptone, 5 g / L Bacto-yeast extract, 30 g / L NaCl, 0.4 g / L MgSO 4 and 20 g / L agar, pH 7.0). ) It was rolled up in a circular shape with a diameter of 2 cm and left at room temperature for 30 minutes to dry. At the same time, V. natriegens 28-15 is added to LB-NaCl medium (containing 10 g / L Bacto-tryptone, 5 g / L Bacto-yeast extract, 30 g / L NaCl, and 0.4 g / L MgSO 4 , pH 7.0).
  • TCBS agar medium (5 g / L yeast extract, 10 g / L peptone, 17 g / L white sugar, 10 g / L thio) Sodium sulfate (pentahydrate), 10 g / L sodium citrate (dihydrate), 3 g / L sodium cholate, 1 g / L ferric citrate, 10 g / L sodium chloride, 5 g / L Beef liver juice, 0.04 g / L bromothymol blue, 0.05 g / L thymol blue, 15 g / L agar and 10 mg / L ⁇ ⁇ chloramphenicol.
  • the fucO gene on the chromosome was destroyed along with the loss of pUT_sacB_fucOFR inserted on the chromosome. 28-15 (V. natriegens 28-15 ⁇ fucO) was obtained. Confirmation of the fucO gene disruption was performed by PCR using chromosomal DNA extracted from the obtained strain by a conventional method as template DNA and SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10 as primers.
  • Example 2 The L-lysine degradation activity of V. natriegens 28-15 ⁇ fucO was examined.
  • PCABD2 US Pat. No. 6,040,160
  • Electroporation was performed using Gene pluser Xcell (BioRad, USA) under pulse conditions of 9 kV / cm, 25 ⁇ F, 200 ⁇ .
  • V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2 and V. natriegens 28-15 / pCABD2 were cultured in LB-NaCl agar medium (containing 500 mg / L streptomycin) at 37 ° C for 10 hours.
  • the obtained microbial cells were scraped, planted in 20 ml of MS medium (containing 500 mg / L streptomycin) in a Sakaguchi flask (capacity 500 ml) so that OD660 was 0.1, and cultured at 37 ° C with shaking. Incubation was performed in three flasks each.
  • OD660 was measured using a spectrophotometer DU-800 (Beckman Coulter, USA) after diluting the culture solution 51-fold with 2% (w / v) NaCl aqueous solution.
  • Biotech Analyzer AS-300 was used for measurement of glucose concentration and L-lysine concentration in the culture solution.
  • the fucO gene may be involved in L-lysine degradation in V. natriegens. Therefore, the L-lysine degradation pathway of V. natriegens may be different from the pathway where cadaverine is produced from L-lysine.
  • V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2 was cultured on LB-NaCl agar medium (containing 500 mg / L streptomycin) at 37 ° C. for 8 hours.
  • the obtained bacterial cells are scraped and placed in a Sakaguchi flask (capacity 500 ml) in MS medium (containing 500 mg / L streptomycin. 0 to 8% (w / v) NaCl).
  • the seedlings were planted and cultured at 37 ° C with shaking.
  • OD660 was measured using a spectrophotometer DU-800 (Beckman coulter, USA) after diluting the culture solution 51 times with 2% (w / v) NaCl aqueous solution.
  • Biotech Analyzer AS-300 was used for measurement of glucose concentration and L-lysine concentration in the culture solution.
  • V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2 was cultured at 37 ° C. for 8 hours in LB-NaCl agar medium (containing 500 mg / L streptomycin). The obtained bacterial cells are scraped off and planted in 20 ml of MS medium (containing 500 mg / L streptomycin. 2% (w / v) or 4% (w / v) NaCl) so that OD660 is 0.1. And cultured at 37 ° C. with shaking.
  • glycerol As the carbon source, glycerol (Japan) was used. Three flasks of each were cultured. Then, 1 ml was sampled over time, and OD660 and glycerol concentration and L-lysine concentration in the medium were measured. OD660 was measured using a spectrophotometer DU-800 (Beckman coulter, USA) after diluting the culture solution 51 times with 2% (w / v) NaCl aqueous solution. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments, Japan) was used for the concentration of glycerol in the culture solution. Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co., Ltd., Japan) was used for the measurement of L-lysine concentration.
  • Example 5 The fucO gene was obtained in the same manner as in Example 1 except that V. natriegens 28-15 strain was used instead of V. natriegens wild strain ATCC14048 (NBRC15636, AJ13670). VLD01, a destroyed strain, was obtained.
  • Example 6 Using V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2, VLD01 / pCABD2, and V. natriegens ATCC14048 / pCABD2, L-lysine production was performed in MS4Y medium, which is MS medium with glycerol as a carbon source and Yeast Extract added excessively. went. First, each strain was cultured on LB-NaCl agar medium (containing 500 mg / L streptomycin) at 37 ° C. for 8 hours. The obtained cells were scraped, planted in 20 ml of MS4Y medium so that OD660 was 0.1, and cultured at 37 ° C. with shaking.
  • glycerol As the carbon source, glycerol (Japan) was used. Two flask cultures were performed for each strain. Then, 0.5 ml was sampled over time, and OD660 and glycerol concentration and L-lysine concentration in the medium were measured. OD660 was measured using a spectrophotometer DU-800 (Beckman coulter, USA) after diluting the culture solution 50 times with 1 N HCl aqueous solution. Biosensor BF-5 (Oji Scientific Instruments, Japan) was used for measuring the glycerol concentration in the culture solution. Biotech Analyzer AS-300 (Sakura Seiki Co., Ltd., Japan) was used for the measurement of L-lysine concentration.
  • V. natriegens 28-15 ⁇ fucO / pCABD2 accumulated 61 mM L-lysine (Fig. 4). At that time, the yield of glycerol L-lysine consumed was 28% by weight (w / w). In addition, accumulation of 45 mM L-lysine was also observed in VLD01 / pCABD2, and the yield of glycerol L-lysine consumed was 21% (w / w). In V. ⁇ ⁇ natriegens ATCC14048 / pCABD2, little accumulation of L-lysine was observed.
  • SEQ ID NO: 1 Base sequence of V. natriegens fucO gene
  • SEQ ID NO: 2 Amino acid sequence encoded by V. natriegens fucO gene
  • SEQ ID NO: 3 Base sequence of PCR primer for amplifying sacB gene
  • SEQ ID NO: 4 sacB PCR primer base sequence for amplifying gene
  • SEQ ID NO: 5 PCR primer base sequence for amplifying 0.8 kbp before and after fucO gene
  • SEQ ID NO: 6 PCR primer base for amplifying 0.8 kbp before and after fucO gene
  • SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence of PCR primer for amplifying 0.8 kbp before and after fucO gene
  • SEQ ID NO: 8 nucleotide sequence of PCR primer for amplifying 0.8 kbp before and after fucO gene
  • SEQ ID NO: 9 of fucO gene on chromosome PCR primer base sequence for confirming the destruction
  • SEQ ID NO: 12 amino acid sequence encoded by the AKO gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 13 nucleotide sequence of the thrA gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 14 amino acid sequence encoded by the thrA gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 15 nucleotide sequence of the metL gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 16 amino acid sequence encoded by the metL gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 17 nucleotide sequence of the lysC gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 18 of V.
  • natriegens amino acid sequence encoded by the lysC gene SEQ ID NO: 19: nucleotide sequence of the putative-AK gene of V. natriegens
  • SEQ ID NO: 20 amino acid sequence encoded by the putative-AK gene of V. natriegens
  • L-lysine can be efficiently produced using Vibrio bacteria.
  • Vibrio bacteria lacking the fucO gene degradation of L-lysine accumulated with time is suppressed, and L-lysine can be accumulated very efficiently.

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Abstract

Ｌ－リジン生産能を有し、かつ、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたビブリオ属細菌を培地で培養し、Ｌ－リジンを該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ－リジンを採取することにより、Ｌ－リジンを製造する。

Description

ビブリオ属細菌を用いたＬ－リジンの製造法
　本発明は、ビブリオ属細菌を用いたＬ－リジンの製造法に関する。Ｌ－リジンは、動物飼料用の添加物、健康食品の成分、又はアミノ酸輸液等として、産業上有用なＬ－アミノ酸である。
　Ｌ－リジンは、ブレビバクテリウム属、コリネバクテリウム属等に属するコリネ型細菌、バチルス属、エシェリヒア属、ストレプトミセス属、メチロバチルス属等に属する細菌、又はペニシリウム等に属する糸状菌を用いた発酵法により生産されている。
　微生物を用いた発酵法によってＬ－リジンを製造するには、野生株から誘導された栄養要求株を用いる方法、野生株から種々の薬剤耐性変異株として誘導された代謝調節変異株を用いる方法、栄養要求株と代謝調節変異株の両方の性質を持った株を用いる方法等がある。さらに、組み換えＤＮＡ技術を用いることで、効率良くＬ－リジン生産できる微生物が育種されてきている（特許文献１～４）。
　上記のような微生物の育種や製造法の改良により、Ｌ－リジンの生産性はかなり高まってはいるが、今後の需要の一層の増大に応えるためには、さらに安価かつ効率的なＬ－リジンの製造法の開発が求められている。
　Ｌ－アミノ酸の直接発酵法においては、培地中のＬ－アミノ酸の蓄積による浸透圧上昇により、微生物の活性が低下し、長時間生産性が保てないという問題がある。これを解決するものとして、ビブリオ属細菌を用いたＬ－リジン等のＬ－アミノ酸の直接発酵法（特許文献５）が開示されている。
　培地に蓄積したＬ－リジンの分解を減少させるＬ－リジン生産方法として、微生物のＬ－リジンの分解能力を低下させる方法、特にエシェリヒア属に属する微生物におけるcadA遺伝子やldcC遺伝子を欠損あるいはその産物の発現量や酵素活性を低下させる方法が知られていた（非特許文献１、特許文献４）。
　ビブリオ属細菌のうち、Vibrio cholerae、Vibrio parahaemolyticusおよびVibrio vuinificusでは、cadAホモログ遺伝子が存在することが知られていた（非特許文献２～４）。しかしながら、それらVibrio属細菌においてcadAホモログ遺伝子の破壊によりＬ－リジン分解能力の弱化や欠損が起こるかどうかは知られていない。また、Vibrio属細菌ではcadAホモログ遺伝子産物が関与するＬ－リジン分解経路以外のＬ－リジン分解経路の存在は知られていない。
欧州特許出願公開０８５７７８４号明細書 特開平１１－１９２０８８号公報 国際公開第００／５３７２６号パンフレット 国際公開第ＷＯ９６／１７９３０号パンフレット 国際公開WO2008/093829号パンフレット
S. Meng, and G. N. Bennett, J. Bacteriol., 174; 2659-2669 (1992) D. S. Merrell, and A. Camilli, Mol. Microbiol., 34; 836-849 (1999) Y. Tanaka, et al., J. Appl. Microbiol., 104; 1283-1293 (2007) J. E. Rhee, et al., FEMS Microbiol. Lett., 208; 245-251 (2002)
　本発明は、Vibrio属細菌を用いて効率よくＬ－リジンを生産するための方法を提供することを課題とする。特に、Vibrio属細菌では、培地中に蓄積されたL－リジンが培養経過と共に減少するといった現象を本発明者らは見出しており、このＬ－リジンの減少を低減させることを課題の一つとする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ビブリオ属細菌でのＬ－リジン分解に関与する因子をコードする遺伝子を特定した。そして、その遺伝子を破壊することで、蓄積したＬ－リジンの分解を抑制でき、効率よくＬ－リジンを生産できることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下のとおりである。
（１）Ｌ－リジン生産能を有するビブリオ属細菌を培地で培養し、Ｌ－リジンを該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ－リジンを採取する、Ｌ－リジンの製造法において、前記ビブリオ属細菌は、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたことを特徴とする方法。
（２）fucO遺伝子のコード領域及び／又は同遺伝子の発現制御領域に変異が導入されたことにより、前記タンパク質の活性が低下した、前記方法。
（３）前記細菌は染色体上のfucO遺伝子が破壊されたことを特徴とする、前記方法。
（４）前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である前記方法。
　（Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
　（Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ－リジン生産能が向上するタンパク質。
（５）前記fucO遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである前記方法。
　（ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
　（ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ－リジン生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
（６）前記細菌は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、前記方法。
（７）前記ビブリオ属細菌が、ビブリオ・ナトリージェンスである、前記方法。
（８）前記培地が、グリセロールを炭素源として含む培地である、前記方法。
（９）Ｌ－リジン生産能を有し、かつ、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたビブリオ属細菌。
（１０）前記ビブリオ属細菌がビブリオ・ナトリージェンスである、前記細菌。
fucO遺伝子欠損によるＬ－リジン分解の抑制を示す図。(a)51倍希釈された培養液のOD660の経時変化。(b)培地中グルコース濃度の経時変化。(c)培地中Ｌ－リジン濃度の経時変化。各々3サンプルの平均と標準偏差を示す。 V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2を用いたグルコースからのＬ－リジン生産を示す図。(a)51倍希釈された培養液のOD660。(b)培地中グルコース濃度、(c)培地中Ｌ－リジン濃度。(d)培養開始40時間後の対消費糖Ｌ－リジン収率。図中、0% NaClから8% NaClは、それぞれMS培地に0から8 %(w/v) のNaClを添加し培養された場合の平均値と標準偏差を示す。 V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2を用いたグリセロールからのＬ－リジン生産を示す図。(a)51倍希釈された培養液のOD660の経時変化。(b)培地中グリセロール濃度の経時変化。(c)培地中Ｌ－リジン濃度の経時変化。(d)培養開始40時間後の対消費グリセロールＬ－リジン収率。図中、0% NaCl、2% NaCl、4% NaClは、それぞれグリセロールを炭素源としたMS培地に0から4%(w/v) のNaClを添加し培養された場合の平均値と標準偏差を示す。 V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2、及びV. natriegens VLD01/pCABD2を用いたグリセロールからのＬ－リジン生産を示す図。(a)50倍希釈された培養液のOD660の経時変化。(b)培地中グリセロール濃度の経時変化。(c)培地中Ｌ－リジン濃度の経時変化。(d)培養開始24時間後の対消費グリセロールＬ－リジン収率。
＜１＞ビブリオ属細菌
　本発明の細菌は、Ｌ－リジン生産能を有し、かつ、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたビブリオ属細菌である。
　ここで、Ｌ－リジン生産能とは、本発明の細菌を培地中で培養したときに、培地中または菌体内にＬ－リジンを生成し、培地中または菌体から回収できる程度に蓄積する能力をいう。すなわち、本発明の細菌は、糖等を炭素源とする発酵（直接発酵とも呼ばれる）によりＬ－リジンを生産することができるビブリオ属細菌である。具体的には、例えば、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたビブリオ属細菌を好適な条件で培養したときに、1.5倍以上、好ましくは2倍以上、より好ましくは3倍以上のＬ－リジンを培地に蓄積すれば、同細菌はＬ－リジン生産能を有する。
　尚、「Ｌ－リジン」には、フリー体のＬ－リジン及び／またはその塩、例えば硫酸塩、塩酸塩、炭酸塩等が含まれる。
　Ｌ－リジンの生産能を有するビブリオ属細菌としては、本来的にＬ－リジンの生産能を有するものであってもよいが、後述するようなビブリオ属細菌を、変異法や組換えDNA技術を利用して、Ｌ－リジンの生産能を有するように改変したものであってもよい。尚、本発明のビブリオ属細菌は、Ｌ－リジン生産能に加えて、他のアミノ酸、例えばＬ－スレオニン、Ｌ－グルタミン酸等を生産する能力を有していてもよい。
　以下、ビブリオ属細菌について説明する。
　ビブリオ属細菌は、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属するグラム陰性の通性嫌気性菌で、極在性の鞭毛1本を持って運動し、淡水や海水に見られる細菌である。本発明で用いるビブリオ属細菌は、非病原性のものが望ましく、病原性が知られていないビブリオ細菌は、Biosafety level 1(Office of Health and Safety (OHS) 発行のBiosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) 4th Edition)に挙げられており、以下のようなビブリオ属細菌が利用できる。
Vibrio abalonicus ATCC27390
Vibrio adaptatus ATCC19263
Vibrio aerogenes ATCC700797
Vibrio aestuarianus ATCC35048
Vibrio alginolyticus ATCC14582
Vibrio algosus ATCC14390
Vibrio anguillarum ATCC43305
Vibrio calviensis ATCC BAA-606
Vibrio campbellii ATCC25920
Vibrio carchariae ATCC35084
Vibrio coralliilyticus ATCC BAA-450
Vibrio costicola ATCC43147
Vibrio cyclitrophicus ATCC700982
Vibrio cyclosites ATCC14635
Vibrio diazotrophicus ATCC33466
Vibrio fischeri ATCC25918
Vibrio gazogenes ATCC29988
Vibrio halioticoli ATCC700680
Vibrio harveyi ATCC14126
Vibrio hispanica ATCC51589
Vibrio ichthyoenteri ATCC700023
Vibrio iliopiscarius ATCC51760
Vibrio lentus ATCC BAA-539
Vibrio liquefaciens ATCC17058
Vibrio logei ATCC15382
Vibrio marinagilis ATCC14398
Vibrio marinofulvus ATCC14395
Vibrio marinovulgaris ATCC14394
Vibrio mediterranei ATCC43341
Vibrio metschnikovii ATCC7708
Vibrio mytili ATCC51288
Vibrio natriegens ATCC14048
Vibrio navarrensis ATCC51183
Vibrio nereis ATCC25917
Vibrio nigripulchritudo ATCC27043
Vibrio ordalii ATCC33509
Vibrio orientalis ATCC33933
Vibrio pectenicida ATCC700783
Vibrio pelagius ATCC33504
Vibrio penaeicida ATCC51841
Vibrio ponticus ATCC14391
Vibrio proteolyticus ATCC53559
Vibrio psychroerythrus ATCC27364
Vibrio salmonicida ATCC43839
Vibrio shiloii ATCC BAA-91
Vibrio splendidus ATCC33125
Vibrio tyrosinaticus ATCC19378
Vibrio viscosus ATCC BAA-105
Vibrio wodanis ATCC BAA-104
Beneckea pelagia ATCC25916
Listonella anguillarum ATCC19264
　Beneckea pelagia、Listonella anguillarumはビブリオ属細菌と近縁であり、現在の分類ではビブリオ属細菌に分類されるものもある（Thompson, F. L. et al. (2004) Microbiol. Mol. Biol. Rev., 23, 403-431およびMacian, M. C. et al. (2000) Syst. Appl. Microbiol., 23, 373-375.)。したがって、このような細菌も本発明においてビブリオ属細菌として使用することができる。
　なかでもVibrio natriegens（ビブリオ・ナトリージェンス）を用いることが好ましい。Vibrio natriegensは、γ-プロピオバクテリアのVibrionanceae科に属する海洋性の通性嫌気性細菌であり、1958年にウロン酸酸化細菌として分離された（Payne, W. J. (1958) J. Bacteriology, 76, 301）。当初は同じγ－プロピオバクテリアのシュードモナス（Psuedomonas）に属するとされていたが、ベネケア（Beneckea）属に再分類された後、他のBeneckea属と同様にビブリオ属（Vibrio）に編入された．ATCCではBiosafety level 1に分類されており、DSMZ　(the German National Resource Centre for Biological Material)でも、Risk Group 1(German classification))に分類されており、病原性は知られていない。
　ビブリオ・ナトリージェンスとしては、ビブリオ・ナトリージェンスATCC14048（NBRC15636株）株を用いることが出来る。
　上記のビブリオ属細菌を入手するには、例えばアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（住所　P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America）より分譲を受けることが出来る。すなわち各菌株に対応する登録番号が付与されており、この登録番号を利用して分譲を受けることが出来る（http://www.atcc.org/参照）。各菌株に対応する登録番号は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションのカタログに記載されている。また、ビブリオ・ナトリージェンスATCC14048株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構生物遺伝資源部門（NITE NBRC）（〒292-0818 千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8）に、NBRC15636の番号で保存されており、同機構からも分譲を受けることができる。
　ビブリオ属細菌は、アミノ酸発酵の培養後半の物質が高蓄積する高浸透圧条件、あるいは糖の濃度が高い高浸透圧条件で、従来Ｌ－アミノ酸生産に使用されてきた微生物（例えばエシェリヒア・コリやコリネ型細菌）の生育が不十分であるのに比べ、好適に生育できる。ここで、高浸透圧下とは、例えば、925mOsm以上、好ましくは1100mOsm以上、より好ましくは1500mOsm以上の条件であることが好ましい。高浸透圧条件の上限はアミノ酸発酵が可能であれば特に制限されないが、例えば、2000mOsmである。また、「高浸透圧下で好適に生育できる」とは、例えば、E. coli野性株、例えばMG1655株（ATCC 47076）の増殖速度が最大時の50%以下に低下する1100mOsmにおいて、増殖速度が最大時の50%より高く保たれることを意味し、好ましくは増殖速度が最大時の90%程度にしか低下しないことが挙げられる。
＜２＞ビブリオ属細菌にＬ－リジン生産能を付与する方法
　Ｌ－リジン生産能を有するビブリオ属細菌は、上記のようなビブリオ属細菌の野生株にＬ－リジン生産能を付与することにより取得され得る。Ｌ－リジン生産能を付与するためには、従来のコリネ型細菌、エシェリヒア属細菌等の育種に使用されてきた、栄養要求性変異株、Ｌ－リジン等のＬ－アミノ酸アナログ耐性、または代謝制御変異株、Ｌ－リジン生合成系酵素の活性が増強された組み換え株等の創製法を利用して育種することができる（アミノ酸発酵（株）学会出版センター）。Ｌ－リジン生合成系酵素の活性増強は、該酵素をコードする遺伝子のコピー数の増加やプロモーターなどの発現調節配列の改変によって行うことができる。Ｌ－リジン生産菌の育種において、付与される栄養要求性、Ｌ－アミノ酸アナログ耐性、代謝制御変異等の性質の付与と、リジン生合成系酵素の活性の増強が組み合わされてもよい。以下、Ｌ－リジン生産能を付与するための方法を例示する。
　例えば、Ｌ－リジン生産菌は、Ｌ－ホモセリン、又はＬ－スレオニン及びＬ－メチオニンを要求する変異株（特公昭48-28078号、特公昭56-6499号）、イノシトールまたは酢酸を要求する変異株（特開昭55-9784号、特開昭56-8692号）、又はオキサリジン、リジンハイドロキサメート、Ｓ－（２－アミノエチル）-Ｌ－システイン、γ－メチルリジン、α－クロロカプロラクタム、ＤＬ－α－アミノ－ε－カプロラクタム、α－アミノ－ラウリルラクタム、アスパラギン酸アナログ、スルファ剤、キノイド、又はＮ－ラウロイルロイシンに耐性を有する変異株として育種することができる。特にＬ－リジンアナログとして、S-(2-アミノエチル)-Ｌ－システイン（AEC）に耐性を有する変異株として育種することが好ましい。
　ビブリオ属細菌から変異株を得るための変異処理法としては、紫外線照射、またはN－メチル－N'－ニトロ－N－ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処理する方法が挙げられる。また、ビブリオ属細菌の自然突然変異株を選択することによっても、Ｌ－アミノ酸生産能を有するビブリオ属細菌を得ることができる。
　Ｌ－アミノ酸アナログ耐性変異株は、例えば、変異処理したビブリオ属細菌を種々の濃度のＬ－アミノ酸アナログを含有する寒天培地に接種し、コロニーを形成する菌株を選択することにより、取得することができる。
　また、栄養要求性変異株は、ビブリオ属細菌のコロニーを目的の栄養物質（例えば、Ｌ－アミノ酸）を含む寒天培地に形成させ、これを前記栄養物質を含まない寒天培地にレプリカし、同栄養物質を含まない寒天培地で生育できない菌株を選択することにより、取得することができる。
　例えば、AECに耐性を有するビブリオ・ナトリージェンスのＬ－リジン生産株としては、ビブリオ・ナトリージェンス28-15株(FERM BP-10946)株が挙げられる（WO2008/093829）。この株は、AJ110593と命名され、平成１８年１０月２４日付で独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター（〒305-8566 日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１　中央第６）に受託番号FERM P-21066として寄託され、その後、国際寄託に移管され、FERM BP-10946の受託番号が付与された。
　次に、Ｌ－リジン生合成系酵素の活性の増強によってＬ－リジン生産能を付与又は増強する方法を、以下に例示する。
　Ｌ－リジン生産能は、例えば、ジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強することによって付与することができる。
　ビブリオ属細菌のジヒドロジピコリン酸合成酵素活性及び／又はアスパルトキナーゼ活性を増強するには、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子断片及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子断片を、ビブリオ属細菌で機能するベクター、好ましくはマルチコピー型ベクターと連結して組み換えＤＮＡを作製し、これをビブリオ属細菌の宿主に導入して形質転換すればよい。形質転換株の細胞内のジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする遺伝子及び／又はアスパルトキナーゼをコードする遺伝子のコピー数が上昇する結果、これらの酵素の活性が増強される。以下、ジヒドロジピコリン酸合成酵素をDDPS、アスパルトキナーゼをAK、アスパルトキナーゼIIIをAKIIIと略すことがある。
　DDPSをコードする遺伝子及びAKをコードする遺伝子の供与微生物としては、ビブリオ属に属する微生物中でDDPS活性及びAK活性を発現することができる微生物であれば、いかなる微生物でも使用できる。微生物は、野生株及びそれから誘導した変異株のいずれでもよい。具体的にはE. coli（エシェリヒア・コリ(Escherichia coli)）K-12株及びビブリオ・ナトリージェンスATCC14048（NBRC15636）株等が挙げられる。エシェリヒア属細菌由来のDDPSをコードする遺伝子（dapA、Richaud, F. et al. J. Bacteriol., 297 (1986)）及びAKIIIをコードする遺伝子（lysC、Cassan, M., Parsot, C., Cohen, G.N. and Patte, J.C., J. Biol. Chem., 261, 1052(1986)）は、いずれも塩基配列が明らかにされているので、これらの遺伝子の塩基配列に基づいてプライマーを合成し、E. coli K-12やビブリオ・ナトリージェンスATCC14048等の微生物の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲ法により、これらの遺伝子を取得することが可能である。
　また、ビブリオ属細菌の遺伝子は以下のGenBankのデータベースを利用することによって取得できる。
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome I, complete sequence; AE003852
Vibrio cholerae O1 biovar eltor str. N16961 chromosome II, complete sequence; AE003853
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome I, complete sequence; BA000031
Vibrio parahaemolyticus RIMD 2210633 chromosome II, complete sequence; BA000032
Vibrio fischeri ES114 chromosome I, complete sequence; CP000020
Vibrio fischeri ES114 chromosome II, complete sequence; CP000021
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome I, complete sequence; AE016795
Vibrio vulnificus CMCP6 chromosome II, complete sequence; AE016796
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome I, complete sequence; BA000037
Vibrio vulnificus YJ016 chromosome II, complete sequence; BA000038
　本発明に用いるDDPS及びAKは、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害を受けないものであることが好ましい。ビブリオ属細菌由来の野生型DDPSはＬ－リジンによるフィードバック阻害を受けることが知られており、ビブリオ属細菌由来の野生型AKIIIはＬ－リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けることが知られている。したがって、ビブリオ属細菌に導入するdapA及びlysCは、それぞれＬ－リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有するDDPS及びAKIIIをコードするものであることが好ましい。
　尚、本発明においては、DDPS及びAKは必ずしも変異型である必要はない。例えば、コリネバクテリウム属細菌由来のDDPSはもともとＬ－リジンによるフィードバック阻害を受けないことが知られている。
　また、アルパルトキナーゼをコードする遺伝子は、ホモログが存在することがあり、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、遺伝子源は限定されない。
　例えば、ビブリオ・ナトリージェンスのAK遺伝子としては、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子が挙げられる。
　配列番号11はビブリオ・ナトリージェンスのAKO遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号11においては、塩基番号526-528のGTG、塩基番号544-546のGTGあるいは塩基番号568-570のGTGが開始コドンであり、塩基番号1711-1713のTGAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号11の塩基番号526-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号12のアミノ酸番号1-395）、塩基番号544-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号12のアミノ酸番号7-395）、または塩基番号568-1710の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号12のアミノ酸番号15-395）を有するDNAがAKO遺伝子として使用できる。
　配列番号13はビブリオ・ナトリージェンスのthrA遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号13においては、塩基番号486-488のATG、塩基番号591-593のGTGあるいは塩基番号633-635のGTGが開始コドンであり、塩基番号2943-2945のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号13の塩基番号486-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号14のアミノ酸番号1-819）、塩基番号591-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号14のアミノ酸番号35-819）、または塩基番号633-2942の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号14のアミノ酸番号50-819）を有するDNAがthrA遺伝子として使用できる。
　配列番号15はビブリオ・ナトリージェンスのmetL遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号15においては、塩基番号376-378のATG、塩基番号487-489のGTGあるいは塩基番号490-492のGTGが開始コドンであり、塩基番号2782-2784のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号15の塩基番号376-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号16のアミノ酸番号1-802）、塩基番号487-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号16のアミノ酸番号38-802）、または塩基番号490-2781の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号16のアミノ酸番号39-802）を有するDNAがmetL遺伝子として使用できる。
　配列番号17はビブリオ・ナトリージェンスのlysC遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号17においては、塩基番号1060-1062のGTGあるいは塩基番号1117-1119のATGが開始コドンであり、塩基番号2410～2412のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号17の塩基番号1060-2409の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号18のアミノ酸番号1-450）、または塩基番号1117-2409（コードされるアミノ酸配列は配列番号18のアミノ酸番号20-450）を有するDNAがlysC遺伝子として使用できる。
　配列番号19はビブリオ・ナトリージェンスのputative-AK遺伝子を含む領域の塩基配列を示す。配列番号19においては、塩基番号344-346のATG、塩基番号380-382のATGあるいは塩基番号470-472のATGが開始コドンであり、塩基番号1766-1768のTAAが終止コドンであると推定される。したがって、オープンリーディングフレームとして配列番号19の塩基番号344-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号20のアミノ酸番号1-474）、塩基番号380-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号20のアミノ酸番号13-474）、または塩基番号470-1765の塩基配列（コードされるアミノ酸配列は配列番号20のアミノ酸番号43-474）を有するDNAがputative-AK遺伝子として使用できる。
　また、上記のAKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子は、相補鎖又は同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつアスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよい。
　ここで、「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、一例を示せば、相同性が高いＤＮＡ同士、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低いＤＮＡ同士がハイブリダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイゼーションの洗いの条件である60℃、１×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、好ましくは、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳ、さらに好ましくは、68℃、0.1×ＳＳＣ、0.1％ＳＤＳに相当する塩濃度、温度で、１回、より好ましくは２～３回洗浄する条件が挙げられる。プローブの長さは、ハイブリダイゼーションの条件により適宜選択されるが、通常には、100bp～1Kbpである。
　尚、本明細書において、「相同性」（homology）」は、「同一性」（identity）を指すことがある。
　なお、アスパルトキナーゼ活性は、Miyajima,R et al;The Journal of Biochemistry(1968),63(2),139-148に記載される方法によって測定することができる。
　また、上記のAKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子はいずれも野生型遺伝子には限られず、アスパルトキナーゼ活性を有する限り、各遺伝子の上記のオープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列において、１若しくは複数の位置での１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入又は付加等を含むアミノ酸配列を有する保存的バリアントをコードする、変異体又は人為的な改変体であってもよい。
　ここで、「１若しくは数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体構造における位置や種類によっても異なるが、具体的には１～２０個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個を意味する。上記の１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加は、上記機能が維持される保存的変異である。保存的変異とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換であり、保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。また、上記のようなアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、または逆位等には、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子を保持する微生物の個体差、種の違いに基づく場合などの天然に生じる変異（mutant又はvariant）によって生じるものも含まれる。上記のような遺伝子は、例えば、部位特異的変異法によって、コードされるタンパク質の特定の部位のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入または付加を含むように上記オープンリーディングフレームの塩基配列を改変することによって取得することができる。
　さらに、AKO遺伝子、thrA遺伝子、metL遺伝子、lysC遺伝子、およびputative-AK遺伝子は、各遺伝子の上記オープンリーディングフレームにコードされるアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、かつ、アスパルトキナーゼ活性を有するタンパク質をコードする配列を用いることも出来る。なお、アミノ酸配列の相同性は、例えばKarlin and AltschulによるアルゴリズムBLAST(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873 (1993))やFASTA(Methods Enzymol., 183, 63 (1990))を用いて決定することができる。このアルゴリズムBLASTに基づいて、BLASTNやBLASTXとよばれるプログラムが開発されている (http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照)。
　上記保存的バリアント及びそれをコードする遺伝子、並びに保存的変異に関する記載は、アスパルトキナーゼ以外の酵素及び該酵素をコードする遺伝子、並びに後述のFucOタンパク質及びfucO遺伝子にも適用される。
　遺伝子のクローニングに使用されるプラスミドとしては、エシェリア属細菌等の微生物において複製可能なものであればよく、具体的には、pBR322、pTWV228、pMW119、pUC19等が挙げられる。
　また、ビブリオ属細菌で機能するベクターとしては、例えばビブリオ属細菌で自律複製出来るプラスミドであれば、いずれでも用いることが出来る。ベクタープラスミドとしては、pUC系、pACYC184系、IncQ由来のoriを持つvector plasmidならどのようなものでも使用できる．選択に用いるマーカー遺伝子としてはTn903由来カナマイシン耐性遺伝子、Tn9由来クロラムフェニコール耐性遺伝子、ストレプトマイシン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子等を用いることができる．
　dapA及びlysCとビブリオ属細菌で機能するベクターを連結して組み換えＤＮＡを調製するには、dapA及びlysCを含むＤＮＡ断片の末端に合うような制限酵素でベクターを切断する。連結は、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ等のリガーゼを用いて行うのが普通である。dapA及びlysCは、それぞれ別個のベクターに搭載してもよく、同一のベクターに搭載してもよい。
　Ｌ－リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡとしては、118位のヒスチジン残基がチロシン残基に置換された配列を有するタンパク質をコードするＤＮＡが挙げられる。また、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害を受けない変異型アスパルトキナーゼをコードするＤＮＡとしては、352位のスレオニン残基がイソロイシン残基に置換、323位のグリシン残基がアスパラギン残基に置換、318位のメチオニンがイソロイシンに置換された配列を有するAKIIIをコードするＤＮＡが挙げられる（これらの変異体については米国特許第5661012号及び第6040160号明細書参照）。変異型ＤＮＡはＰＣＲなどによる部位特異的変異法により取得することができる。
　なお、変異型変異型ジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードする変異型dapA及び変異型アスパルトキナーゼをコードする変異型lysCを含むプラスミドとして、広宿主域プラスミドRSFD80、pCAB1、pCABD2が知られている（米国特許第6040160号明細書）。RSFD80で形質転換されたエシェリヒア・コリ JM109株（米国特許第6040160号明細書）は、AJ12396と命名され、同株は1993年10月28日に通産省工業技術院生命工学工業技術研究所（現 独立行政法人 産業技術総合研究所 特許生物寄託センター）に受託番号FERM P-13936として寄託され、1994年11月1日にブダペスト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受託番号のもとで寄託されている。RSFD80は、AJ12396株から、公知の方法によって取得することができる。
　上記のように調製した組換えＤＮＡをビブリオ属細菌に導入するには、十分な形質転換効率が得られる方法ならば、いかなる方法を用いてもよいが、例えば、エレクトロポレーション法（Canadian Journal of Microbiology, 43. 197(1997)）が挙げられる。
　DDPS活性及び／又はAK活性の増強は、dapA及び／又はlysCをビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上に多コピー存在させることによっても達成できる。ビブリオ属細菌の染色体ＤＮＡ上にdapA及び／又はlysCを多コピーで導入するには、染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列を標的に利用して相同組換えにより行うことができる。染色体ＤＮＡ上に多コピー存在する配列としては、レペッティブＤＮＡ、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピートなどが利用できる。あるいは、特開平2-109985号公報に開示されているように、dapA及び／又はlysCをトランスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体ＤＮＡ上に多コピー導入することも可能である。いずれの方法によっても形質転換株内のdapA及び／又はlysCのコピー数が上昇する結果、DDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。
　DDPS活性及び／又はAK活性の増幅は、上記の遺伝子増幅による以外に、dapA及び／又はlysCのプロモーター等の発現調節配列を強力なものに置換することによっても達成される（特開平1-215280号公報参照）。たとえば、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター、ＰＬプロモーターまたは、これらのハイブリッドプロモーター等が強力なプロモーターとして知られている。これらのプロモーターへの置換により、dapA及び／又はlysCの発現が強化されることによってDDPS活性及び／又はAK活性が増幅される。発現調節配列の置換は、dapA及び／又はlysCのコピー数を高めることと組み合わせてもよい（Science. 1997 Sep 5;277(5331):1453-74、Nucleic Acids Res. 1993 Apr 11;21(7):1507-16、Proc Natl Acad Sci U S A. 1983 Jan;80(1):21-5、WO98/04715、WO98/17806、US5830690、US5861273）。
　なお、ＤＮＡの切断、連結、その他、染色体ＤＮＡの調製、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、形質転換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採用することができる。これらの方法は、Sambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989)等に記載されている。
　DDPS活性及び／又はAK活性の増強に加えて、他のＬ－リジン生合成に関与する酵素の活性を増強してもよい。そのような酵素としては、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ(dapB)、ジアミノピメリン酸脱炭酸酵素(lysA)、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ(ddh)（以上、国際公開第96/40934号パンフレット）、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(ppc) （特開昭60-87788号公報）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ(aspC)（特公平6-102028号公報）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ(dapF)（特開2003-135066号公報）、アスパラギン酸セミアルデヒド脱水素酵素（asd）(国際公開第00/61723号パンフレット)等のジアミノピメリン酸経路の酵素、あるいはホモアコニット酸ヒドラターゼ（特開2000-157276号公報）等のアミノアジピン酸経路の酵素等が挙げられる。尚、酵素名の後のカッコ内は、遺伝子名である（以下の記載においても同様）。
　前記pCABD2は、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のDDPSをコードする変異型dapA遺伝子と、Ｌ－リジンによるフィードバック阻害が解除された変異を有するエシェリヒア・コリ由来のAKIIIをコードする変異型lysC遺伝子と、エシェリヒア・コリ由来のジヒドロジピコリン酸レダクターゼをコードするdapB遺伝子と、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム由来ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼをコードするddh遺伝子を含んでいる（国際公開第WO95/16042、WO01/53459号パンフレット）。
　本発明のビブリオ属細菌はＬ－リジン排出活性を増強させることによってＬ－リジン生産能が高められた細菌であってもよい。例えば、ybjE遺伝子の発現量を増加させること、lysE遺伝子の発現量を増加させることでＬ－リジン排出活性を高めることができる（特開2005-237379、WO97/23697号パンフレット）。
　本発明の細菌は、さらに、Ｌ－リジンの生合成経路から分岐してＬ－リジン以外の化合物を生成する反応を触媒する酵素の活性や、Ｌ－リジン酸の合成又は蓄積に負に機能する酵素活性が低下または欠損していてもよい。Ｌ－リジン生産において、このような酵素としては、ホモセリンデヒドロゲナーゼ、マリックエンザイム等があり、該酵素の活性が低下または欠損した株は国際公開第WO95/23864号、第WO96/17930号パンフレット、第WO2005/010175号パンフレットを参照にして構築できる。
　これらの酵素活性を低下あるいは欠損させる方法としては、通常の変異処理法又は遺伝子組換え技術によって、ゲノム上の上記酵素の遺伝子に、細胞中の当該酵素の活性が低下または欠損するような変異を導入すればよい。このような変異の導入は、例えば、遺伝子組換えによって、ゲノム上の酵素をコードする遺伝子を欠損させたり、プロモーターやシャインダルガルノ（SD）配列等の発現調節配列を改変したりすることなどによって達成される。また、ゲノム上の酵素をコードする領域にアミノ酸置換（ミスセンス変異）を導入すること、また終止コドンを導入すること（ナンセンス変異）、一～二塩基付加・欠失するフレームシフト変異を導入すること、遺伝子の一部分、あるいは全領域を欠失させることによっても達成出来る（J. Biol. Chem. 272:8611-8617（1997）、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 5511-5515 (1998)、J. Biol. Chem., 266:20833-20839 (1991)）。また、コード領域の全体又は一部が欠失したような変異酵素をコードする遺伝子を構築し、相同組換えなどによって、該遺伝子でゲノム上の正常遺伝子を置換すること、トランスポゾン、又はIS因子を該遺伝子に導入することによっても酵素活性を低下または欠損させることができる。
　例えば、上記の酵素の活性を低下または欠損させるような変異を遺伝子組換えにより導入する為には、以下のような方法が用いられる。目的遺伝子の部分配列を改変し、正常に機能する酵素を産生しないようにした変異型遺伝子を作製し、該遺伝子を含むＤＮＡでビブリオ属に属する細菌に形質転換し、変異型遺伝子とゲノム上の遺伝子で組換えを起こさせることにより、ゲノム上の目的遺伝子を変異型に置換することが出来る。このような相同組換えを利用した遺伝子置換は、「Redドリブンインテグレーション(Red-driven integration)」と呼ばれる方法（Datsenko, K. A, and Wanner, B. L. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97:6640-6645 (2000)）、Redドリブンインテグレーション法とλファージ由来の切り出しシステム（Cho, E. H., Gumport, R. I., Gardner, J. F. J. Bacteriol. 184: 5200-5203 (2002)）とを組合わせた方法（WO2005/010175号参照）等の直鎖状ＤＮＡを用いる方法や、温度感受性複製起点を含むプラスミドを用いる方法などがある（米国特許第6303383号; 特開平05-007491号公報）。また、上述のような相同組換えを利用した遺伝子置換による部位特異的変異導入は、宿主上で複製能力を持たないプラスミドを用いても行うことが出来る。
　上記の酵素活性を低下させる方法は、下記のFucOタンパク質の活性の低下に適用することができる。
＜３＞fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性の低下
　本発明の細菌は、上述したようなL-リジンの生産能を有するビブリオ属に属する細菌を、fucO遺伝子がコードするタンパク質（以下、「FucO」と記載することがある。）の活性が低下するように改変されることによって得られる。Ｌ－本発明のビブリオ属細菌の育種において、L-リジンの生産能の付与とFucOタンパク質の活性が低下するような改変は、どちらを先に行ってもよい。本発明の細菌は、野生株または非改変株と比べてfucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されているものであればよいが、さらに野生株又は非改変株に比べてＬ－リジンの蓄積能が向上していることがより望ましい。
　本発明において、fucO遺伝子とは、E. coliのfucO遺伝子のホモログであって、ビブリオ属細菌から取得され得る遺伝子を意味し、例えば、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子が挙げられる。配列番号１の塩基配列は、V. natiregens 28-15株のfucO遺伝子の塩基配列である。また、配列番号２に、同遺伝子がコードするアミノ酸配列を示す。
　本発明のfucO遺伝子は、E. coliのfucO遺伝子と相同性がある遺伝子である。E. coli MG1655株のfucO遺伝子は、L-1,2-propanediol oxidoreductaseをコードする遺伝子として、 GenBankに登録されている（GenBank NC_000913.2、ヌクレオチド番号2929887..2931038の相補鎖）。
　また、本発明のfucO遺伝子には、Vibrio parahaemolyticus のeutG遺伝子又はそれと相同性のある遺伝子が含まれる。V. parahaemolyticus RIMD 2210633株のeutG遺伝子産物は、iron-containing alcohol dehydrogenaseとして、GenPeptデータベースに登録されている（NP_797614）（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_797614.1?report=genpept）。また、前記eutG遺伝子は、iron-containing alcohol dehydrogenaseとして、GenBankに登録されている（NC_004603.1、ヌクレオチド番号1301840..1303159）。
　E. coliのfucO遺伝子産物とE. coliのeutG遺伝子産物のアミノ酸での相同性は77.3%である（株式会社ゼネティックス製Genetix ver.9.0.3を使用）。
　ビブリオ属細菌のfucO遺伝子のホモログは、例えば、配列番号１の塩基配列を有する遺伝子、E. coliのfucO遺伝子、又は前記eutG遺伝子と相同性の高い遺伝子をBLAST（http://blast.genome.jp/）で検索することによって取得できる。相同性は、遺伝子の発現産物の活性を低下させることによってＬ－リジンの蓄積が向上する限り特に制限されないが、例えば、アミノ酸配列全体に対して８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上である。
　fucO遺伝子がコードするタンパク質としては、配列番号２のアミノ酸配列を有するもの挙げられるが、タンパク質の機能が変わらない限り、保存的バリアントであってもよい。
　また、fucO遺伝子は、FucOタンパク質をコードする限り、配列番号１からなる塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡであってもよい。「ストリンジェントな条件」は、前記と同様である。
　「fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下した」とは、薬剤や遺伝子工学等により、fucO遺伝子のコード領域に変異を導入し、同遺伝子がコードするFucOタンパク質の機能が弱化または消失すること、及び、fucO遺伝子の発現制御領域等に変異を導入することにより、fucO遺伝子の発現又は翻訳が低下することによって、FucOタンパク質の量が低下することが含まれる。また、いわゆる遺伝子破壊、すなわち染色体上のfucO遺伝子全体又はその一部を欠失させることによって、FucOタンパク質の活性を低下させることができる。尚、活性の低下は、活性の完全な消失を含む。
　FucOタンパク質の活性を低下させるには、具体的には、Ｌ－リジン生産能の付与について記載した、酵素活性を低下させる方法を使用することができる。
＜４＞Ｌ－リジンの製造法
　本発明の方法は、本発明の細菌を培地で培養して、Ｌ－リジンを該培地中または菌体内に生成蓄積させ、該培地または菌体よりＬ－リジンを回収する方法である。
　使用する培地は、微生物を用いたＬ－アミノ酸の発酵生産において従来より用いられてきた培地を用いることができる。すなわち、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じその他の有機成分を含有する通常の培地を用いることができる。ここで、炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース、ガラクトース、フラクトースやでんぷんの加水分解物などの糖類、グリセロールやソルビトールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることができる。特に本発明においてはグリセロールを炭素源として使用することが好ましい。
　なお、本発明においては、グリセロールを炭素源として用いることが好ましい。グリセロールは、Ｌ－リジンを製造するのに適した濃度であればどのような濃度で用いてもかまわない。培地中の単独の炭素源として用いる場合、好ましくは０．１ｗ／ｖ％～５０ｗ／ｖ％程度、より好ましくは０．５ｗ／ｖ％～４０ｗ／ｖ％程度、特に好ましくは１ｗ／ｖ％～３０ｗ／ｖ％程度培地に含有させる。グリセロールは、グルコース、フラクトース、スクロース、廃糖蜜、澱粉加水分解物などの他の炭素源と組み合わせて用いることも出来る。この場合、グリセロールと他の炭素源は任意の比率で混合することが可能であるが、炭素源中のグリセロールの比率は、１０重量％以上、より好ましくは５０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上であることが望ましい。他の炭素原として好ましいのは、グルコース、フラクトース、スクロース、ラクトース、ガラクトース、廃糖蜜、澱粉加水分解物やバイオマスの加水分解により得られた糖液などの糖類、エタノールなどのアルコール類、フマール酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類である。これらの中ではグルコースが好ましい。
　培養開始時のグリセロールの好ましい初発濃度は上記のとおりであるが、培養中のグリセロールの消費に応じて、グリセロールを添加してもよい。
　使用するグリセロールは、純粋なグリセロールであってもよいが、粗グリセロールであってもよい。粗グリセロールとは、工業的に生産される不純物を含むグリセロールをいう。粗グリセロールは、油脂を高温、高圧下で水と接触させ加水分解することによって、あるいは、バイオディーゼル燃料生産のためのエステル化反応によって、工業的に生産される。バイオディーゼル燃料とは、油脂とメタノールからエステル交換反応により生成する脂肪酸メチルエステルのことであり、この反応の副生物として粗グリセロールが生成する（Fukuda, H., Kondo, A., and Noda, H. 2001, J. Biosci. Bioeng. 92, 405-416を参照のこと）。バイオディーゼル燃料生産プロセスでは、エステル交換にはアルカリ触媒法が用いられることが多く、中和時に酸を加えるため、水と不純物を含んだ純度７０～９５重量％程度の粗グリセロールが生成する。バイオディーゼル燃料生産において産生される粗グリセロールは、水に加えて、残存メタノールや触媒であるNaOH等のアルカリとその中和に用いられるK2SO4等の酸との塩を不純物として含んでいる。メーカーや製法により差はあるが、このような塩類やメタノールは数パーセントに達する。ここでナトリウム、カリウム、塩化物イオン、硫酸イオン等の、アルカリやその中和に用いられた酸に由来するイオン類は、粗グリセロールの重量に対し、2～7％、好ましくは3～6%、さらに好ましくは4～5.8%含まれていることが好ましい。メタノールは、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。
　さらに、粗グリセロール中には、微量の金属、有機酸、リン、脂肪酸などを含むことがある。含まれる有機酸としては、蟻酸、酢酸等が挙げられ、不純物として含まれていなくてもよいが、望ましくは0.01%以下含まれていることが好ましい。粗グリセロールに含まれる微量の金属としては、微生物の生育に必要な微量金属が好ましく、例えばマグネシウム、鉄、カルシウム、マンガン、銅、亜鉛等が挙げられる。マグネシウム、鉄、カルシウムは、粗グリセロールの重量に対し、合計で0.00001～0.1%、好ましくは0.0005～0.1%、より好ましくは0.004～0.05％、さらに好ましくは0.007～0.01%含まれていることが好ましい。マンガン、銅、亜鉛としては、合計で0.000005～0.01%、より好ましくは0.000007～0.005%、さらに好ましくは0.00001～0.001%含まれていることが好ましい。
　粗グリセロールのグリセロールの純度としては１０％以上であればよく、好ましくは５０％以上であり、さらに好ましくは７０％以上、特に好ましくは８０％以上である。不純物の含有量が上記の範囲を満たす限り、グリセロールの純度は９０％以上であってもよい。
　粗グリセロールを用いる場合は、グリセロールの純度に応じて、グリセロールの量として上記濃度となるように粗グリセロールを培地に添加すればよい。また、グリセロール及び粗グリセロールの両方を培地に添加してもよい。
　窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガス、アンモニア水等を用いることができる。有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、Ｌ－ホモセリンなどの要求物質または酵母エキス等を適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添加される。なお、本発明で用いる培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じてその他の有機微量成分を含む培地であれば、天然培地、合成培地のいずれでもよい。
　培養は好気的条件下で１～７日間実施するのがよく、培養温度は２４℃～３７℃、培養中のｐＨは５～９がよい。尚、ｐＨ調整には無機あるいは有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガス等を使用することができる。
　また、Ｌ－リジン等の塩基性アミノ酸を製造する際には、培養中のｐＨが６．５～９．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２～９．０となるように制御し、培地中の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンが少なくとも２０ｍＭ以上存在する培養期があるようにし、前記重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを塩基性アミノ酸のカウンタイオンとする方法で発酵し、目的の塩基性アミノ酸を回収する方法で製造を行ってもよい（特開2002-65287、US2002-0025564A EP 1813677A）。
　塩基性アミノ酸を生産する能力を有する微生物を培地中で好気培養するに際して、炭酸イオンもしくは重炭酸イオン又はこれらの両方を、塩基性アミノ酸の主なカウンタイオンとして利用することができる。塩基性アミノ酸のカウンタイオンとして必要な量の重炭酸イオン及び／又は炭酸イオンを培地中に存在させる方法としては、培養中の培地のｐＨが６．５～９．０、好ましくは６．５～８．０、培養終了時の培地のｐＨが７．２～９．０となるように制御し、さらに、発酵中の発酵槽内圧力が正となるように制御するか、又は、炭酸ガスもしくは炭酸ガスを含む混合ガスを培地に供給することが知られている（特開2002-65287、米国特許出願公開第20020025564号、EP1813677A）。
　発酵液からのＬ－リジンの回収は通常イオン交換樹脂法（Nagai,H.et al., Separation Science and Technology, 39(16),3691-3710）、沈殿法、膜分離法（特開平9-164323号、特開平9-173792号）、晶析法(WO2008/078448、WO2008/078646）、その他の公知の方法を組み合わせることにより実施できる。なお、菌体内にＬ－リジンが蓄積する場合には、例えば菌体を超音波などにより破砕し、遠心分離によって菌体を除去して得られる上清からイオン交換樹脂法などによって、Ｌ－リジンを回収することができる。
　尚、回収されるＬ－リジンは、Ｌ－リジン以外に細菌菌体、培地成分、水分、及び細菌の代謝副産物を含んでいてもよい。採取されたＬ－リジンの純度は、50％以上、好ましくは85％以上、特に好ましくは95%以上である (JP1214636B, USP 5,431,933, 4,956,471, 4,777,051, 4946654, 5,840,358, 6,238,714, US2005/0025878))。
　また、Ｌ－リジンが培地中に析出する場合は、遠心分離又は濾過等により回収することができる。また、培地中に析出したＬ－リジンは、培地中に溶解しているＬ－リジンを晶析した後に、併せて単離してもよい。
　以下、本発明を実施例により更に具体的に説明する。
〔実施例１〕fucO遺伝子が破壊されたV. natriegensの構築
　リジン生産菌V. natriegens 28-15の染色体上にあるfucO遺伝子を破壊した。
　まず、バチルス・サブチリスのsacB遺伝子を持つpDNR-Dual Donerベクター（Clontech社、USA）を鋳型DNAとして、配列番号３と配列番号４の配列を持つ合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、sacB遺伝子を増幅した。sacB遺伝子はレバンシュークラーゼをコードし、染色体上からベクター部分が脱落した菌株を効率よく選択する為に使用される遺伝子である（Schafer,A.et al.Gene145 (1994)69-73）。すなわち、レバンシュークラーゼを発現させると、シュークロースを資化することによって生成したレバンが致死的に働き、生育することが出来ない。従って、レバンシュークラーゼ遺伝子を搭載したベクターが染色体上に残ったままの菌株をシュークロース含有プレートで培養すると生育できず、ベクターが脱落した菌株のみシュークロース含有プレートで選択することが出来る。
　増幅されたsacB遺伝子断片とpUT399を制限酵素EcoRIで消化し、ライゲーションすることでベクターpUT_sacBを得た。ここでpUT399は、R6Kの複製起点を有するプラスミドで、接合伝達に必要なmob領域を含むプラスミドであり、pir遺伝子を持たない菌株では複製出来ないプラスミドである（米国特許第7090998号）。続いて、V. natiregens 28-15の染色体DNAを鋳型DNAとして配列番号５と配列番号６、又は配列番号７と配列番号８の配列を持つ合成DNAをプライマーとしてPCRを行い、fucO遺伝子の前後800 bpの配列をそれぞれ増幅した。続いて、得られた２種類のPCR産物の混合液を鋳型DNAとし、配列番号５と配列番号７の配列をもつ合成DNAをプライマーとして再度PCRを行った。得られたPCR産物とpUT_sacBを、共に制限酵素SalIおよびSphIで消化し、ライゲーションすることでベクターpUT_sacB_fucOFRを得た。pUT_sacB_fucOFRは、fucOのコード領域の一部を欠損したfucO遺伝子破壊用のプラスミドである。そして、pUT_sacB_fucOFRをE. coli S17-1（λpir+、Biomedal社から入手可能：R. Simon., et al., Bio/Technology 1;784-791 (1983)）に導入し、S17-1/ pUT_sacB_fucOFRを得た。
　続いて、S17-1/ pUT_sacB_fucOFRを、LB培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、5 g/L NaClおよび40 mg/Lクロラムフェニコールを含む。pH 7.0）1.5 mlに植え、37℃で18時間培養した。得られた培養液を遠心（5000rpm、5分間）することで集菌し、新しいLB培地50μlに懸濁した。その菌液をLB-NaCl寒天培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、30 g/L NaCl、0.4 g/L MgSO4および20 g/L寒天を含む。pH 7.0）上に直径2 cmの円状になるようにまき、室温で30分放置し乾燥させた。同時に、V. natriegens 28-15をLB-NaCl培地（10 g/L Bacto-tryptone、5 g/L Bacto-yeast extract、30 g/L NaCl、及び0.4 g/L MgSO4を含む。pH 7.0）1.5 mlに植え、37℃で18時間培養した。得られた培養液を遠心（6000rpm、2分間）することで集菌し、新しいLB-NaCl培地50μlに懸濁した。その菌液を、先にS17-1/ pUT_sacB_fucOFRが円状にまかれた場所にまき、さらに室温で30分放置し乾燥させた。その後、37℃で4時間放置することで、接合伝達によりS17-1/ pUT_sacB_fucOFRの持つpUT_sacB_fucOFRをV. natriegens 28-15へと移動させた。
　得られた菌をかき取り、LB-NaCl培地1 mlに懸濁した後、全量をTCBS寒天培地（5 g/L 酵母エキス、10 g/L ペプトン、17 g/L 白糖、10 g/L チオ硫酸ナトリウム（五水塩）、10 g/Lクエン酸ナトリウム（二水塩）、3 g/L コール酸ナトリウム、1 g/L クエン酸第二鉄、10 g/L 塩化ナトリウム、5 g/L 牛肝汁末、0.04 g/L ブロモチモールブルー、0.05 g/L チモールブルー、15 g/L 寒天および10 mg/L クロラムフェニコールを含む。日水製薬株式会社、日本）に植え、37℃で18時間培養することで黄色いコロニーを形成させた。ここでTCBS培地上ではE. coliは増殖することができない。また、pUT_sacB_fucOFR はV. natriegens 28-15中では複製出来ないため、得られたコロニーはV. natriegens 28-15の染色体上にpUT_sacB_fucOFRが導入されることでクロラムフェニコール耐性を獲得した株であった。
　その株を10 % (w/v) スクロースが添加されたLB-NaCl培地にまきコロニーを形成させることで、染色体上に挿入されたpUT_sacB_fucOFRの脱落と共に染色体上のfucO遺伝子が破壊されたV. natriegens 28-15（V. natriegens 28-15ΔfucO）を得た。fucO遺伝子の破壊の確認は、得られた株から常法により抽出された染色体DNAを鋳型DNA、配列番号９と配列番号１０をプライマーとしたPCRにより行った。
〔実施例２〕
　V. natriegens 28-15ΔfucOのＬ－リジン分解活性を調べた。
　エレクトロポレーションによりV. natriegens 28-15ΔfucO、及びV. natriegens 28-15へpCABD2（米国特許第6040160号明細書）を導入した。エレクトロポレーションは、Gene pluser Xcell(BioRad社、USA)を用い、9 kV/cm、25μF、200Ωのパルス条件で行った。
　得られたV. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2とV. natriegens 28-15/pCABD2をLB-NaCl寒天培地(500 mg/L ストレプトマイシンを含む)で、37℃、10時間培養した。得られた菌体をかき取り、坂口フラスコ（容量500 ml）に入れたMS培地 (500 mg/L ストレプトマイシンを含む) 20 ml にOD660が0.1となるように植え、37℃で振とう培養した。各々3本ずつフラスコで培養を行った。そして、経時的に1 mlずつサンプリングを行い、OD660と培地中のグルコース濃度及びＬ－リジン濃度を測定した。OD660は、培養液を2 %(w/v) NaCl水溶液で51倍に希釈し、分光光度計DU-800（Beckman coulter社、USA）を用いて測定された。また、培養液中のグルコース濃度およびＬ－リジン濃度の測定にはバイオテックアナライザーAS-300（サクラ精機、日本）を用いた。
〔MS培地〕
（最終濃度）
グルコース       40 g/L（別殺菌）
MgSO4・7H2O       1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4        16 g/L
KH2PO4            1 g/L
Yeast Extract     2 g/L
FeSO4             0.01 g/L
MnSO4             0.01 g/L
CaCO3            30 g/L（別殺菌）
NaCl             15g/L
　その結果、V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2では10 mMのＬ－リジン蓄積が観察され、グルコースを消費しきった後のＬ－リジン分解も観察されなかった（図１）。一方、fucO遺伝子が欠損していない株では最大3 mMのＬ－リジン蓄積が観察されたものの、その後Ｌ－リジン分解が観察された。すなわち、fucO遺伝子が欠損した株では、欠損していない株の3倍以上高いＬ－リジン蓄積が観察され、Ｌ－リジン分解も抑制されていた。
　上記のように、fucO遺伝子は、V. natriegensでのＬ－リジン分解に関与している可能性が示唆された。したがって、V. natriegensのＬ－リジン分解経路は、Ｌ－リジンからカダベリンが生成される経路とは異なる可能性がある。
〔実施例３〕
　続いて、V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2を用いて、高塩濃度下で、グルコースを炭素源としたＬ－リジン生産を行った。V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2をLB-NaCl寒天培地（500 mg/L ストレプトマイシンを含む）で37℃、8時間培養した。得られた菌体をかき取り、坂口フラスコ（容量500 ml）に入れたMS培地（500 mg/L ストレプトマイシンを含む。0～8 %(w/v) NaClを含む）20 ml にOD660が0.1となるように植え、37℃で振とう培養した。各々3本ずつフラスコ培養を行った。そして、経時的に1 mlずつサンプリングを行い、OD660と培地中のグルコース濃度及びＬ－リジン濃度を測定した。OD660は、培養液を2 %(w/v) NaCl水溶液で51倍に希釈し、分光光度計DU-800（Beckman coulter社、USA）を用いて測定された。また、培養液中のグルコース濃度とＬ－リジン濃度の測定にはバイオテックアナライザーAS-300（サクラ精機株式会社、日本）を用いた。
　その結果、6 %(w/v) NaClを含む培養条件では最大27 mM Ｌ－リジンの蓄積が観察され、そのときの対消費糖Ｌ－リジン収率は12 %(w/w)であった(図２)。
〔実施例４〕
　続いて、V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2を用いてグリセロールを炭素源としたＬ－リジン生産を行った。具体的には、V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2をLB-NaCl寒天培地（500 mg/L ストレプトマイシンを含む）で37℃、8時間培養した。得られた菌体をかき取り、MS培地（500 mg/L ストレプトマイシンを含む。2 %(w/v)又は4 %(w/v) NaClを含む）20 ml にOD660が0.1となるように植え、37℃で振とう培養した。炭素源のグリセロールは純正化学社製（日本）を用いた。各々3本ずつフラスコ培養を行った。そして、経時的に1 mlずつサンプリングを行い、OD660と培地中のグリセロール濃度及びＬ－リジン濃度を測定した。OD660は、培養液を2 %(w/v) NaCl水溶液で51倍に希釈し、分光光度計DU-800（Beckman coulter社、USA）を用いて測定された。また、培養液中のグリセロール濃度はバイオセンサーBF-5（王子測定機器株式会社、日本）を用いた。Ｌ－リジン濃度の測定にはバイオテックアナライザーAS-300（サクラ精機株式会社、日本）を用いた。
　その結果、4 %(w/v) NaClが添加された培養条件で、最大30 mM のＬ－リジンの蓄積が観察され、対消費グリセロールＬ－リジン収率は15 %(w/w)であった(図３)。
〔実施例5〕
　V. natriegens 28-15株に代えてV. natriegens野生株ATCC14048株（NBRC15636、AJ13670）を用いた以外は、実施例１でV. natriegens 28-15ΔfucOを得たのと同様にして、fucO遺伝子が破壊された株であるVLD01を得た。
〔実施例6〕
　V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2、VLD01/pCABD2、及びV. natriegens ATCC14048/pCABD2を用いて、グリセロールを炭素源として、Yeast Extract が過剰に添加されたMS培地であるMS4Y培地でＬ－リジン生産を行った。はじめに各株をそれぞれLB-NaCl寒天培地（500 mg/L ストレプトマイシンを含む）で37℃、8時間培養した。得られた菌体をかき取り、MS4Y培地20 ml にOD660が0.1となるように植え、37℃で振とう培養した。炭素源のグリセロールは純正化学社製（日本）を用いた。各々の菌株について2本ずつフラスコ培養を行った。そして、経時的に0.5 mlずつサンプリングを行い、OD660と培地中のグリセロール濃度及びＬ－リジン濃度を測定した。OD660は、培養液を1 N HCl水溶液で50倍に希釈し、分光光度計DU-800（Beckman coulter社、USA）を用いて測定された。また、培養液中のグリセロール濃度の測定にはバイオセンサーBF-5（王子測定機器株式会社、日本）を用いた。Ｌ－リジン濃度の測定にはバイオテックアナライザーAS-300（サクラ精機株式会社、日本）を用いた。
〔MS4Y培地〕
（最終濃度）
グリセロール       40 g/L（別殺菌）
MgSO4・7H2O         1 g/L（別殺菌）
(NH4)2SO4          24 g/L
KH2PO4              1 g/L
Yeast Extract       8 g/L
FeSO4            0.01 g/L
MnSO4            0.01 g/L
CaCO3              30 g/L（別殺菌）
NaCl               20 g/L（別殺菌）
　Yeast Extract が過剰に添加された培地では、V. natriegens 28-15ΔfucO/pCABD2は61mMのL-リジンを蓄積した（図4）。そのときの対消費グリセロールＬ－リジン収率は28 %(w/w)であった。また、VLD01/pCABD2においても45 mM L-リジンの蓄積が観察され、対消費グリセロールＬ－リジン収率は21 %(w/w)であった。そして、V. natriegens ATCC14048/pCABD2ではL-リジンの蓄積はほとんど観察されなかった。
〔配列表の説明〕
配列番号１：V. natriegensのfucO遺伝子の塩基配列
配列番号２：V. natriegensのfucO遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号３：sacB遺伝子を増幅するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号４：sacB遺伝子を増幅するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号５：fucO遺伝子の前後0.8kbpを増幅するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号６：fucO遺伝子の前後0.8kbpを増幅するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号７：fucO遺伝子の前後0.8kbpを増幅するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号８：fucO遺伝子の前後0.8kbpを増幅するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号９：染色体上fucO遺伝子の破壊を確認するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号10：染色体上fucO遺伝子の破壊を確認するためのPCRプライマーの塩基配列
配列番号11：V. natriegensのAKO遺伝子の塩基配列
配列番号12：V. natriegensのAKO遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号13：V. natriegensのthrA遺伝子の塩基配列
配列番号14：V. natriegensのthrA遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号15：V. natriegensのmetL遺伝子の塩基配列
配列番号16：V. natriegensのmetL遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号17：V. natriegensのlysC遺伝子の塩基配列
配列番号18：V. natriegensのlysC遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
配列番号19：V. natriegensのputative-AK遺伝子の塩基配列
配列番号20：V. natriegensのputative-AK遺伝子によってコードされるアミノ酸配列
　本発明の方法によれば、ビブリオ属細菌を用いて効率よくＬ－リジンを生産できる。
　特に、fucO遺伝子を欠損したビブリオ属細菌では、時間と共に蓄積したL－リジンの分解が抑制され、Ｌ－リジンを非常に効率よく蓄積させることができる。

Claims (10)

  1. 　Ｌ－リジン生産能を有するビブリオ属細菌を培地で培養し、Ｌ－リジンを該培地中又は菌体内に生成蓄積させ、該培地又は菌体よりＬ－リジンを採取する、Ｌ－リジンの製造法において、前記ビブリオ属細菌は、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたことを特徴とする方法。
  2. 　fucO遺伝子のコード領域及び／又は同遺伝子の発現制御領域に変異が導入されたことにより、前記タンパク質の活性が低下した、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記細菌は染色体上のfucO遺伝子が破壊されたことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記タンパク質が、下記（Ａ）または（Ｂ）に記載のタンパク質である請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
    （Ａ）配列番号２に示すアミノ酸配列を有するタンパク質。
    （Ｂ）配列番号２に示すアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、または付加を含むアミノ酸配列を有し、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ－リジン生産能が向上するタンパク質。
  5. 　前記fucO遺伝子が、下記（ａ）または（ｂ）に記載のＤＮＡである請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
    （ａ）配列番号１の塩基配列を含むＤＮＡ、
    （ｂ）配列番号１の塩基配列または同塩基配列から調製され得るプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、細菌内の活性を低下させたときにＬ－リジン生産能が向上するタンパク質をコードするＤＮＡ。
  6. 　前記細菌は、ジヒドロジピコリン酸合成酵素、アスパルトキナーゼ、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ、及びジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼからなる群より選択される１種または２種以上の酵素の活性が増強されている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記ビブリオ属細菌が、ビブリオ・ナトリージェンスである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記培地が、グリセロールを炭素源として含む培地である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　Ｌ－リジン生産能を有し、かつ、fucO遺伝子がコードするタンパク質の活性が低下するように改変されたビブリオ属細菌。
  10. 　前記ビブリオ属細菌がビブリオ・ナトリージェンスである、請求項９に記載の細菌。
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