JPH11192088A - 発酵法によるｌ−リジンの製造法 - Google Patents

発酵法によるｌ−リジンの製造法

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Abstract

(57)【要約】 【課題】 Ｌ−リジンの生産性を向上させる。 【解決手段】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を
受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤ
ＮＡと、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けな
いアスパルトキナーゼIIIをコードするＤＮＡとが細胞
内に導入されることによって形質転換され、さらにジヒ
ドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子（並びにテトラヒ
ドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺伝子及びスクシニル
ジアミノピメリン酸デアシラーゼ遺伝子）が増強された
エシェリヒア属細菌を好適な培地中で培養し、該培養物
中にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リジ
ンを採取する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物工業に関連し
たものであり、詳しくは、発酵法によるＬ−リジンの製
造法、この製造法に用いる微生物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】従来、発酵法によりＬ−リジンを製造す
る場合、生産性を向上させるために、自然界から分離し
た菌株または該菌株の人工変異株が用いられている。Ｌ
−リジンを生産する人工変異株は数多く知られており、
その多くはＳ−２−アミノエチルシステイン（ＡＥＣ）
耐性変異株であり、ブレビバクテリウム属、コリネバク
テリウム属、バチルス属、またはエシェリヒア属に属し
ている。また、組換えＤＮＡを使用した形質転換体を用
いる（米国特許第4278765号）等、アミノ酸の生産を増
加させる種々の技術が開示されている。
【０００３】例えば、エシェリヒア属においては、特開
昭56-18596号公報、米国特許第4346,170号およびApplie
d Microbiology and Biotechnology, 15, p227-231(198
2)においてジヒドロジピコリン酸合成酵素（以下、「Ｄ
ＤＰＳ」と略すことがある）を増強した株を用いたＬ−
リジンの製造法が示されている。しかし、ここで用いら
れたＤＤＰＳは野生型であり、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害を受けるため、十分満足できるＬ−リジン
の生産性が得られていなかった。尚、上記Applied Micr
obiology and Biotechnology, 15, p227-231(1982)に記
載されているＬ−リジン生産量は、グルコース７５ｇ／
ｌからＬ−リジン塩酸塩３ｇ／ｌであり、消費係数（糖
１ｇに対し生産されるＬ−リジンのｇ数、又はその百分
率）は０．０４もしくは４％と計算される。
【０００４】一方、Ｌ−リジンによるフィードバック阻
害を受けない事が知られているコリネバクテリウム属細
菌由来のＤＤＰＳを導入したエシェリヒア属細菌を用い
たＬ−リジンの製造法が、大韓民国特許公告92-8382号
に示されている（消費係数１７％）。
【０００５】ところで、ジヒドロジピコリン酸合成酵素
（ＤＤＰＳ）は、アスパルトセミアルデヒドとピルビン
酸を脱水縮合させ、ジヒドロジピコリン酸を合成する酵
素であり、この反応はアスパラギン酸系アミノ酸の生合
成において、Ｌ−リジン生合成系への分岐の入口となっ
ている。エシェリヒア属細菌においてはアスパルトキナ
ーゼとともにＬ−リジン生合成の重要な調節部位を担っ
ている事が知られている。
【０００６】ＤＤＰＳはE. coli（エシェリヒア・コ
リ：大腸菌）ではdapAという遺伝子にコードされてい
る。このdapAはすでにクローニングされており、塩基配
列も決定されている（Richaud, F. et al. J. Bacterio
l., 297 (1986)）。
【０００７】一方、アスパルトキナーゼ（以下、「Ａ
Ｋ」と略すことがある）は、アスパラギン酸をβ−ホス
ホアスパラギン酸に変える反応を触媒する酵素であり、
アスパラギン酸系のアミノ酸の生合成系の主な調節酵素
となっている。E. coliのＡＫは３種あり（ＡＫＩ, Ａ
ＫII,ＡＫIII）、うち２つはホモセリンデヒドロゲナー
ゼ（以下、「ＨＤ」と略すことがある）との複合酵素で
ある。複合酵素の内のひとつはthrA遺伝子にコードされ
るＡＫＩ−ＨＤＩであり、もう一方は metLM遺伝子にコ
ードされるＡＫII−ＨＤIIである。ＡＫＩはスレオニン
とイソロイシンによる協奏的抑制及びスレオニンによる
阻害を受け、ＡＫIIはメチオニンによる抑制を受ける。
【０００８】これらに対し、ＡＫIIIのみは単機能酵素
であり、lysCと名付けられた遺伝子の産物であって、Ｌ
−リジンによる抑制及びフィードバック阻害を受けるこ
とが知られている。菌体内でのこれらの活性の割合は、
ＡＫＩ:ＡＫII:ＡＫIII＝約５:１:４となっている。
【０００９】ＡＫIIIの変異酵素についても報告はある
ものの（Boy, E. et al., J. Bacteriol., 112, 84 (19
72)）、同変異酵素がＬ−リジンの生産性を改善できる
ことを示唆した例は知られていない。
【００１０】さらに、Ｌ−リジン生合成系のいずれの酵
素の増強がＬ−リジンの生産性の向上に有効であるかに
ついて検討した例は知られていない。
【００１１】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、以下の
ような観点から、Ｌ−リジン生合成系を強化することを
試みた。すなわち、複数反応からなる生合成系は、直列
に連結された太さの異なる複数のパイプを流れる液体に
たとえることができる。ここで、各々のパイプは個々の
酵素に相当し、そのパイプの太さは酵素反応速度に相当
する。パイプを流れる液体の量を増やすには、最も細い
パイプを太くするのが効果的である。太いパイプをさら
に太くしても、効果は期待できない。さらに流量を増や
すには、２番目に細いパイプを太くすればよい。
【００１２】従って、本発明は、Ｌ−リジン生合成系の
律速段階の順位を解明し、従来よりもさらに改良された
発酵法によるＬ−リジンの製造法を提供することを課題
とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意検討を重ねた結果、Ｌ−リジンに
よるフィードバック阻害が十分に解除されたエシェリヒ
ア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするＤＮＡを取得する
ことに成功した。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害が十分に解除されたE. coli由来のＤＤＰＳをコー
ドするＤＮＡを本明細書において変異型ｄａｐＡあるい
はｄａｐＡ*とよぶことがある。
【００１４】本発明者らはまた、Ｌ−リジンによるフィ
ードバック阻害が解除されたアスパルトキナーゼおよび
変異型ｄａｐＡを保持するエシェリヒア属細菌を創製し
た。尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が十分に
解除されたE. coli由来のアスパルトキナーゼをコード
するＤＮＡを本明細書において変異型ｌｙｓＣあるいは
ｌｙｓＣ*とよぶことがある。
【００１５】そして、E. coliに各遺伝子を個別に導入
した結果、ｌｙｓＣ*、ｄａｐＡあるいはｄａｐＡ*を導
入した株にＬ−リジン生産が認められ、ｄａｐＡ*導入
株が最も高いＬ−リジン生産性を示した。この結果か
ら、ｄａｐＡにコードされる酵素が触媒する反応が第一
の律速段階であることがわかった。次に、ｄａｐＡ*導
入株に各Ｌ−リジン生合成系遺伝子を導入したところ、
ｌｙｓＣ*が最もＬ−リジン生産性向上に効果があり、
ｌｙｓＣにコードされる酵素が触媒する反応が第２の律
速段階であることがわかった。同様にして、ｄａｐＢに
コードされる酵素（ジヒドロジピコリン酸レダクター
ゼ）が触媒する反応が第３の律速段階であることがわか
った。この知見に基づき本発明は完成された。
【００１６】すなわち本発明は、Ｌ−リジンによるフィ
ードバック阻害を受けないジヒドロジピコリン酸合成酵
素をコードするＤＮＡが細胞内に導入されて形質転換さ
れ、かつＬ−リジンによるフィードバック阻害を受けな
いアスパルトキナーゼを保持し、かつジヒドロジピコリ
ン酸レダクターゼ遺伝子が増強されたことを特徴とする
エシェリヒア属細菌を提供する。
【００１７】ジヒドロジピコリン酸合成酵素としては、
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異
を有するジヒドロジピコリン酸合成酵素が挙げられ、そ
のＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除される変
異としては、配列表の配列番号４に記載されるジヒドロ
ジピコリン酸合成酵素のアミノ酸配列中、Ｎ−末端から
８１番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変
異、１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換
させる変異、８１番目のアラニン残基をバリン残基に置
換させかつ１１８番目のヒスチジン残基をチロシン残基
に置換させる変異が挙げられる。
【００１８】Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受
けないアスパルトキナーゼをエシェリヒア属細菌に保持
させる方法としては、Ｌ−リジンによるフィードバック
阻害を受けないアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡ
を細胞内に導入する方法が挙げられる。
【００１９】アスパルトキナーゼとしては、Ｌ−リジン
によるフィードバック阻害が解除される変異を有するエ
シェリヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIIIが挙げ
られ、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が解除され
るアスパルトキナーゼIIIの変異としては、配列表の配
列番号８に記載されるアスパルトキナーゼIIIのアミノ
酸配列中、Ｎ−末端から３２３番目のグリシン残基をア
スパラギン酸残基に置換させる変異、３２３番目のグリ
シン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ４０８番
目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる変
異、３４番目のアルギニン残基をシステイン残基に置換
させかつ３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残
基に置換させる変異、３２５番目のロイシン残基をフェ
ニルアラニン残基に置換させる変異、３１８番目のメチ
オニン残基をイソロイシン残基に置換させる変異、３１
８番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させ
かつ３４９番目のバリン残基をメチオニン残基に置換さ
せる変異、３４５番目のセリン残基をロイシン残基に置
換させる変異、３４７番目のバリン残基をメチオニン残
基に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基をイ
ソロイシン残基に置換させる変異、３５２番目のスレオ
ニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３６９番目
のセリン残基をフェニルアラニン残基に置換させる変
異、１６４番目のグルタミン酸残基をリジン残基に置換
させる変異、４１７番目のメチオニン残基をイソロイシ
ン残基に置換させかつ４１９番目のシステイン残基をチ
ロシン残基に置換させる変異が挙げられる。
【００２０】尚、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害
が解除される変異を有するエシェリヒア属細菌由来のジ
ヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤＮＡ及びＬ
−リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を
有するアスパルトキナーゼIIIをコードするＤＮＡは、
各々エシェリヒア属細菌の染色体に保持されていても、
細胞内で同一または別々のプラスミド上に保持されてい
てもよい。さらに、各々のＤＮＡの一方が染色体に保持
され、もう一方のＤＮＡがプラスミド上に保持されてい
てもよい。
【００２１】ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子
の増強は、ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子が
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに
連結されてなる組換えＤＮＡで形質転換することにより
行うことができる。
【００２２】本発明は、また、増強されたジアミノピメ
リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が導入された前記エシェ
リヒア属細菌を提供する。増強されたジアミノピメリン
酸デヒドロゲナーゼ遺伝子のエシェリヒア属細菌への導
入は、該遺伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製
可能なベクターに連結されてなる組換えＤＮＡで形質転
換することにより行うことができる。
【００２３】本発明はさらに、前記ジアミノピメリン酸
デヒドロゲナーゼ遺伝子のかわりにテトラヒドロジピコ
リン酸スクシニラーゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピ
メリン酸デアシラーゼ遺伝子が増強されたエシェリヒア
属細菌を提供する。これらの遺伝子の増強は、これらの
遺伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能な同
一又は異なるベクターに連結されてなる単一の組換えＤ
ＮＡ又は２つの組換えＤＮＡで形質転換することにより
行うことができる。
【００２４】本発明はまた、上記のエシェリヒア属細菌
のいずれかを好適な培地で培養し、該培養物中にＬ−リ
ジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジンを採取
することを特徴とするＬ−リジンの製造法を提供する。
【００２５】尚、本明細書において、ＤＤＰＳ又はＡＫ
もしくはＡＫIIIをコードするＤＮＡ、あるいはこれら
にプロモーターを含むＤＮＡを、「ＤＤＰＳ遺伝子」又
は「ＡＫ遺伝子」もしくは「ＡＫIII遺伝子」というこ
とがある。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害
が解除された変異酵素を単に「変異型酵素」、これをコ
ードするＤＮＡあるいはこれにプロモーターを含むＤＮ
Ａを「変異型遺伝子」ということがある。さらに、「Ｌ
−リジンによるフィードバック阻害が解除される」と
は、実質的に阻害が解除されていればよいことを意味
し、完全に解除されている必要はない。さらに、また、
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けない酵素を
「非感受性酵素」、これをコードするＤＮＡあるいはこ
れにプロモーターを含むＤＮＡを「非感受性遺伝子」と
いうことがあり、これらはそれぞれ変異型酵素及び変異
型遺伝子を包含する。
【００２６】
【発明の実施の形態】以下、本発明について詳細に説明
する。 ＜１＞本発明に用いる変異型ジヒドロジピコリン酸合成
酵素（ＤＤＰＳ）をコードするＤＮＡ 本発明の変異型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡは、野生型
ＤＤＰＳをコードするＤＮＡにおいて、コードされるＤ
ＤＰＳのＬ−リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れる変異を有するものである。ＤＤＰＳとしては、エシ
ェリヒア属細菌由来のもの、特にE. coli由来のＤＤＰ
Ｓが挙げられる。また、ＤＤＰＳのＬ−リジンによるフ
ィードバック阻害を解除する変異としては、配列表の配
列番号４に記載されるＤＤＰＳのアミノ酸配列中、ＤＤ
ＰＳのＮ−末端から 81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させる変
異、 118番目のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させ
る変異、 81番目のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ11
8番目のヒスチジン残基を チロシン残基に置換させる
変異、が挙げられる。
【００２７】野生型ＤＤＰＳをコードするＤＮＡとして
は、エシェリヒア属細菌由来のＤＤＰＳをコードするも
のであれば特に制限されないが、具体的には配列番号４
に示すアミノ酸配列をコードするＤＮＡが挙げられ、さ
らに具体的には配列番号３に示す塩基配列のうち、塩基
番号２７２〜１１４７で表される配列が挙げられる。こ
れらの配列において、上記アミノ酸残基の置換を起こす
ような塩基配列の変異を有するものが、本発明の変異型
ＤＤＰＳをコードするＤＮＡである。尚、置換されたア
ミノ酸残基に対応するコドンは、そのアミノ酸残基をコ
ードするものであれば種類は特に問わない。また、菌種
や菌株の違いにより保持するＤＤＰＳの配列がわずかに
相異することが予想されるが、このような酵素の活性に
関与しない位置でのアミノ酸残基の置換、欠失あるいは
挿入を有するものも本発明の変異型ＤＤＰＳ遺伝子に含
まれる。
【００２８】このような変異型遺伝子を取得する方法は
以下の通りである。まず、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他
の変異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡをイン
ビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合す
るベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。組
換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、同
形質転換体のうちで変異型ＤＤＰＳを発現するように至
ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子を
保持している。また、野生型ＤＤＰＳ遺伝子又は他の変
異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主に
適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得
て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型ＤＤＰＳを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。
【００２９】野生型酵素を生産する微生物を変異処理
し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異
株から変異型遺伝子を取得してもよい。もしくは、野生
型遺伝子が連結されている組換えＤＮＡが導入されてい
る形質転換体を変異処理し、変異型酵素を生産する変異
株を創成した後、該変異株から組換えＤＮＡを回収すれ
ば、同ＤＮＡ上に変異型遺伝子が創成される。
【００３０】ＤＮＡをインビトロ変異処理するための薬
剤としては、ヒドロキシルアミン等が挙げられる。ヒド
ロキシルアミンは、シトシンをＮ4−ヒドロキシシトシ
ンに変えることによりシトシンからチミンへの変異を起
こす化学変異処理剤である。また、微生物自体を変異処
理する場合は、紫外線照射またはN−メチル−N'−ニト
ロ−N−ニトロソグアニジン（NTG）もしくは亜硝酸等の
通常人工突然変異に用いられている変異剤による処理を
行う。
【００３１】上記野生型ＤＤＰＳ遺伝子あるいは他の変
異を有するＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの供与菌とし
ては、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなる
ものを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトら
の著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and
Salmonella Typhimurium,American Society for Micro
biology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられ
るものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC
1061株などがあげられる。ＤＤＰＳ遺伝子を含有するDN
Aの供与菌として野生株を用いた場合、野生型のＤＤＰ
Ｓ遺伝子を含むDNAが取得できる。
【００３２】（１）野生型ＤＤＰＳ遺伝子の取得 以下に、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するDNAの調製例につい
て述べる。まず、野生型のdapAをもつE. coli例えばMC1
061株を培養して培養物を得る。上記微生物を培養する
には、通常の固体培養法で培養しても良いが、集菌の際
の効率を考慮すると液体培養法を採用して培養するのが
好ましい。また、培地としては、例えば酵母エキス、ペ
プトン、肉エキス、コーンスティープリカーまたは大豆
もしくは小麦の浸出液等の１種類以上の窒素源に、リン
酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、硫酸マグネシウ
ム、塩化ナトリウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、
硫酸第２鉄または硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上
を添加し、更に必要に応じて糖質原料、ビタミン等を適
宜添加した物が用いられる。なお、培地の初発ｐＨは、
６〜８に調製するのが適当である。また培養は３０〜４
２℃、好ましくは３７℃前後で４〜２４時間、通気攪拌
深部培養、振盪培養または静置培養等により行う。
【００３３】このようにして得られた培養物を、例えば
3,000 r.p.m.で５分間遠心分離してE. coli MC1061株の
菌体を得る。この菌体より、例えば斎藤、三浦の方法
（Biochem.Biophys.Acta.,72,619,(1963)）、K. S. Kir
byの方法（Biochem.J.,64,405,(1956)）等の方法により
染色体DNAを得ることができる。
【００３４】こうして得られた染色体ＤＮＡからＤＤＰ
Ｓ遺伝子を単離するために、染色体ＤＮＡライブラリー
を作製する。まず、染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で部
分分解して種々の断片混合物を得る。切断反応時間等を
調節して切断の程度を調節すれば、幅広い種類の制限酵
素が使用できる。例えば、Sau3AIを、温度３０℃以上、
好ましくは３７℃、酵素濃度１〜１０ユニット／mlで様
々な時間（１分〜２時間）染色体ＤＮＡに作用させてこ
れを消化する。
【００３５】ついで、切断された染色体ＤＮＡ断片を、
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターDN
Aに連結し、組換えＤＮＡを作製する。具体的には、染
色体ＤＮＡの切断に用いた制限酵素 Sau3AＩと相補的な
末端塩基配列を生じさせる制限酵素、例えばBamHＩを、
温度３０℃以上、酵素濃度１〜100ユニット／mlの条件
下で１時間以上、好ましくは１〜３時間、ベクターＤＮ
Ａに作用させてこれを完全消化し、切断開裂する。次い
で、上記のようにして得た染色体ＤＮＡ断片混合物と切
断開裂されたベクターＤＮＡを混合し、これにＤＮＡリ
ガーゼ、好ましくはＴ４ＤＮＡリガーゼを、温度４〜１
６℃、酵素濃度１〜１００ユニット／mlの条件下で１時
間以上、好ましくは６〜２４時間作用させて組換えＤＮ
Ａを得る。得られた組換えＤＮＡを用いて、エシェリヒ
ア属の微生物、例えば大腸菌K-12株、好ましくはJE7627
株（ponB704,dacB12,pfv+,tonA2,dapA,lysA,str,malA3
8,metB1,ilvH611,leuA371,proA3,lac-3,tsx-76）のよう
なＤＤＰＳ欠損変異株を形質転換して染色体ＤＮＡライ
ブラリーを作製する。この形質転換は D.M.Morrisonの
方法（Methods in Enzymology 68, 326 (1979)）あるい
は受容菌細胞を塩化カルシウムで処理してＤＮＡの透過
性を増す方法（Mandel,M. and Higa,A.,J.Mol.Biol.,5
3,159(1970)）等により行うことができる。なお、JE762
7株は国立遺伝学研究所（日本国静岡県三島市）より入
手可能である。
【００３６】得られた染色体ＤＮＡライブラリーの中か
ら、ＤＤＰＳ活性が増大した株あるいはＤＤＰＳ遺伝子
欠損に起因する栄養要求性が相補された株よりＤＤＰＳ
遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株を得る。例えば、ＤＤ
ＰＳ欠損変異株はジアミノピメリン酸要求性であるの
で、ＤＤＰＳ欠損変異株を宿主に用いた場合は、ジアミ
ノピメリン酸を含有しない培地上で生育可能となった菌
株を単離し、該菌株から組換えＤＮＡを回収することに
より、ＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を得ること
ができる。
【００３７】ＤＤＰＳ遺伝子を含有する組換えＤＮＡを
もつ候補株が、実際にＤＤＰＳ遺伝子がクローニングさ
れた組換えＤＮＡを保持するかどうかを確認するには、
候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵素液を調
製してＤＤＰＳ活性が増大していることを確認すること
により達成できる。ＤＤＰＳの酵素活性測定法は、Yuga
riらの方法により行うことができる（Yugari,Y. and Gi
lvarg,C., J.Biol.Chem.,240,4710(1962)）。
【００３８】そして、上記菌株より、ＤＤＰＳ遺伝子を
含有するＤＮＡがベクターＤＮＡに挿入された組換えＤ
ＮＡを、例えば P. Guerryらの方法（J. Bacteriol.,11
6,1064,(1973)）、D. B. Clewell の方法（J.Bacterio
l.,110,667,(1972)）などにより単離することができ
る。
【００３９】野生型ＤＤＰＳ遺伝子の取得は、染色体上
にＤＤＰＳ遺伝子を有する株から、斎藤、三浦の方法等
により染色体ＤＮＡを調製し、ポリメラーゼチェインリ
アクション法（ＰＣＲ：polymerase chain reaction；
White,T.J. et al ;Trends Genet., 5,185 (1989)参
照）により、ＤＤＰＳ遺伝子を増幅することによっても
行える。増幅反応に用いるＤＮＡプライマーは、ＤＤＰ
Ｓ遺伝子の全領域あるいは一部領域を含有するＤＮＡ二
重鎖の両３’末端に相補するものを用いる。ＤＤＰＳ遺
伝子の一部領域だけを増幅した場合には、該ＤＮＡ断片
をプライマーとして全領域を含むＤＮＡ断片を染色体Ｄ
ＮＡライブラリーよりスクリーニングする必要がある。
ＤＤＰＳ遺伝子の全領域を増幅した場合には、増幅され
たＤＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片を含むＰＣＲ反
応液をアガロースゲル電気泳動に供した後、目的のＤＮ
Ａ断片を抽出することによってＤＤＰＳ遺伝子を含有す
るＤＮＡ断片を回収できる。
【００４０】ＤＮＡプライマーとしては、例えばE. col
iにおいて既知となっている配列（Richaud, F. et al.,
J.Bacteriol.,297(1986)）を基にして適宜作成すれば
よいが、具体的には、ＤＤＰＳ遺伝子をコードする1150
塩基からなる領域を増幅できるプライマーが好ましく、
配列番号１及び２に示した２種のプライマーが適当であ
る。プライマーＤＮＡの合成は、ホスホアミダイト法
（Tetrahedron Letters,22,1859(1981)参照）等の常法
により、市販のＤＮＡ合成装置（例えば、AppliedBiosy
stems社製ＤＮＡ合成機 model 380B等）を用いて行うこ
とができる。また、PCR反応は、市販のＰＣＲ反応装置
（宝酒造（株）製ＤＮＡサーマルサイクラー PJ2000型
等）を使用し、TaqDNAポリメラーゼ（宝酒造（株）より
供給されている）を用い、供給者により指定された方法
に従って行うことができる。
【００４１】ＰＣＲ法により増幅されたＤＤＰＳ遺伝子
は、エシェリヒア属細菌細胞内において自律複製可能な
ベクターＤＮＡに接続し、エシェリヒア属細菌細胞に導
入することによって、ＤＤＰＳ遺伝子への変異の導入な
どの操作がしやすくなる。用いられるベクターＤＮＡと
形質転換法、さらにＤＤＰＳ遺伝子の存在の確認方法は
上述した方法と同じである。
【００４２】（２）ＤＤＰＳ遺伝子への変異の導入 上記のようにして得られたＤＤＰＳ遺伝子に、アミノ酸
残基の置換、挿入および欠失等の変異を実施する方法と
しては、リコンビナントＰＣＲ法（Higuchi,R.,61,in P
CR Technology (Erlich,H.A.Eds.,Stockton press(198
9))）、部位特異的変異法（Kramer,W. and Frits,H.J.,
Meth. in Enzymol.,154,350 (1987)); Kunkel,T.A. et.
al.,Meth. in Enzymol.,154,367(1987)）などがある。
これらの方法を用いると、目的部位に目的の変異を起こ
すことができる。
【００４３】また、目的遺伝子を化学合成する方法によ
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。
【００４４】さらに、染色体もしくはプラスミド上のＤ
ＤＰＳ遺伝子を直接ヒドロキシルアミンで処理する方法
（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,J.Bacteriol.,159,1
039(1984)）がある。また、ＤＤＰＳ遺伝子を保有する
エシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法またはN−メ
チル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝酸などの化
学薬剤処理による方法を用いてもよい。これらの方法に
よれば、ランダムに変異を導入できる。
【００４５】変異型遺伝子の選択方法としては、まずＤ
ＤＰＳ遺伝子を含有するＤＮＡ断片とベクターＤＮＡか
らなる組換えＤＮＡを、直接ヒドロキシルアミン等で変
異処理し、これで例えば E. coli W3110株を形質転換す
る。次にＬ−リジンのアナログである、Ｓ−２−アミノ
エチルシステイン（ＡＥＣ）を含む最少培地、例えばM9
に形質転換株を培養する。野生型のＤＤＰＳ遺伝子を含
有する組換えＤＮＡを保持する株は、その組換えＤＮＡ
により発現されるＤＤＰＳがＡＥＣにより阻害されるた
めに、Ｌ−リジン及びジアミノピメリン酸(DAP)の合成
が出来なくなり生育が抑えられる。これに対し、Ｌ−リ
ジンによる阻害の解除されたＤＤＰＳ遺伝子を含有する
組換えＤＮＡを保持する株は、同組換えＤＮＡ中のＤＤ
ＰＳ遺伝子にコードされる変異酵素がＡＥＣによる阻害
を受けないので、ＡＥＣが添加された最少培地上での生
育が可能になるはずである。この現象を利用し、生育
が、Ｌ−リジンのアナログであるＡＥＣに耐性となって
いる株、すなわち阻害の解除された変異型ＤＤＰＳ遺伝
子を含有する組換えＤＮＡを保持する株を選択すること
ができる。
【００４６】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な宿主微生物に導入し、発現させる
ことによりフィードバック阻害が解除されたＤＤＰＳを
保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシェリ
ヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌（E. c
oli）が挙げられる。
【００４７】また、組換えＤＮＡから変異型ＤＤＰＳ遺
伝子断片を取り出し、他のベクターＤＮＡに挿入したも
のを使用してもよい。本発明において用いることのでき
ることのできるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベ
クターＤＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR32
2、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pM
W119、pMW118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にも
ファージＤＮＡのベクターも利用できる。
【００４８】さらに、変異型ＤＤＰＳ遺伝子の発現を効
率的に実施するために、変異型ＤＤＰＳをコードするＤ
ＮＡ配列の上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内
で働く他のプロモーターを連結してもよく、ＤＤＰＳ遺
伝子に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅
して用いてもよい。
【００４９】また、上記のように、変異型遺伝子を自律
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molec
ular Genetics, ColdSpring Harbor Lab.(1972)）を用
いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００５０】＜２＞本発明に用いる変異型アスパルトキ
ナーゼIII（ＡＫIII）をコードするＤＮＡ 本発明に用いる変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡは、
野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡにおいて、コードさ
れるＡＫIIIのＬ−リジンによるフィードバック阻害が
解除される変異を有するものである。また、ＡＫIIIの
Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を解除する変異と
しては、配列表の配列番号８に示すＡＫIIIのアミノ酸
配列中、ＡＫIIIのＮ−末端から(イ)323番目のグリシン
残基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、(ロ)323番
目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させかつ
408番目のグリシ ン残基をアスパラギン酸残基に置換
させる変異、(ハ)34番目のアルギニン残基をシステイン
残基に置換させかつ323番目のグリシン残基をアスパラ
ギン酸残基に置換させる変異、(ニ)325番目のロイシン残
基をフェニルアラニン残基に置換させる変異、(ホ)318番
目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させる変
異、(ヘ)318番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に
置換させかつ349番目のバリン 残基をメチオニン残基
に置換させる変異、(ト)345番目のセリン残基をロイシン
残基に置換させる変異、(チ)347番目のバリン残基をメチ
オニン残基に置換させる変異、(リ)352番目のスレオニン
残基をイソロイシン残基に置換させる変異、(ヌ)352番目
のスレオニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ36
9番目のセリン 残基をフェニルアラニン残基に置換さ
せる変異、(ル)164番目のグルタミン酸残基をリジン残基
に置換させる変異、(ヲ)417番目のメチオニン残基をイソ
ロイシン残基に置換させかつ419番目のシステ イン残
基をチロシン残基に置換させる変異、が挙げられる。
【００５１】野生型ＡＫIIIをコードするＤＮＡとして
は、特に制限されないが、エシェリヒア属細菌、例えば
E. coli由来のＡＫIIIをコードするＤＮＡが挙げられ、
具体的には配列番号８に示すアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡ、さらには配列番号７に示す塩基配列のうち、塩
基番号５８４〜１９３０で表される配列が挙げられる。
尚、E. coliのＡＫIIIは、lysC遺伝子にコードされてい
る。
【００５２】これらの配列において、上記アミノ酸残基
の置換を起こすような塩基配列の変異を有するものが、
本発明の変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡである。
尚、置換されたアミノ酸残基に対応するコドンは、その
アミノ酸残基をコードするものであれば種類は特に問わ
ない。また、菌種や菌株の違いにより保持する野生型Ａ
ＫIIIのアミノ酸配列がわずかに相異するものがある。
このような酵素の活性に関与しない位置でのアミノ酸残
基の置換、欠失あるいは挿入を有するものも本発明の変
異型ＡＫIII遺伝子に含まれる。例えば、後記実施例２
で得られた野生型lysC遺伝子の塩基配列（配列番号７）
は、既に発表されている E. coli K-12 JC411株のlysC
の配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Patte,
J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）と６ヶ所相違して
おり、そのうち２ヶ所でコードされるアミノ酸残基が異
なっている（JC411株のlysCは、配列番号８に示すlysC
のアミノ酸配列中、Ｎ−末端から５８番目のグリシン残
基がシステイン残基に、４０１番目のグリシン残基がア
ラニン残基に置き換わっている）。このE. coli K-12 J
C411株のlysCと同一の配列を有するlysCであっても、上
記(イ)〜(ヲ)のいずれかの変異を導入すれば、Ｌ−リジン
によるフィードバック阻害が解除された変異を有するly
sCが得られることが予想される。
【００５３】リジンによるフィードバック阻害が解除さ
れた変異型ＡＫIIIをコードするＤＮＡを取得する方法
は以下の通りである。まず、野生型ＡＫIII遺伝子又は
他の変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡをイ
ンビトロ変異処理し、変異処理後のＤＮＡと宿主に適合
するベクターＤＮＡとを連結して組換えＤＮＡを得る。
組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換体を得、
同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現するように
至ったものを選択すれば、同形質転換体が変異型遺伝子
を保持している。また、野生型ＡＫIII遺伝子又は他の
変異を有するＡＫIII遺伝子を含有するＤＮＡを、宿主
に適合するベクターＤＮＡと連結して組換えＤＮＡを得
て、その後組換えＤＮＡをインビトロ変異処理し、変異
処理後の組換えＤＮＡを宿主微生物に導入して形質転換
体を得、同形質転換体のうちで変異型ＡＫIIIを発現す
るように至ったものを選択しても、同形質転換体は変異
型遺伝子を保持している。
【００５４】あるいは、野生型酵素を生産する微生物を
変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した
後、該変異株から変異型遺伝子を取得してもよい。ＤＮ
Ａを直接変異処理するための薬剤としては、ヒドロキシ
ルアミン等が挙げられる。ヒドロキシルアミンは、シト
シンをＮ4−ヒドロキシシトシンに変えることによりシ
トシンからチミンへの変異を起こす化学変異処理剤であ
る。また、微生物自体を変異処理する場合は、紫外線照
射またはN−メチル−N'−ニトロ−N−ニトロソグアニジ
ン（NTG）等の通常人工突然変異に用いられている変異
剤による処理を行う。
【００５５】上記野生型ＡＫIII遺伝子あるいは他の変
異を有するＡＫIII遺伝子を含有するDNAの供与菌として
は、エシェリヒア属に属する微生物であればいかなるも
のを用いてもかまわない。具体的にはナイトハルトらの
著書（Neidhardt,F.C. et.al.,Escherichia coli and S
almonella Typhimurium,American Society for Microbi
ology,Washington D.C.,1208, table 1）にあげられる
ものが利用できる。たとえば、E.coli JM109株や、MC10
61株などがあげられる。これらの株からＡＫIII遺伝子
を取得するに際し、染色体ＤＮＡの調製、染色体ＤＮＡ
ライブラリーの作製等は、上記のＤＤＰＳ遺伝子の取得
と同様に行えばよい。ライブラリー作製に用いる宿主と
しては、ＡＫＩ、II、III全欠損株、例えばE. coli GT3
株（E. coli Genetic Stock Center（米国コネチカット
州）等から入手できる）等を用いることが好ましい。
【００５６】得られた染色体ＤＮＡライブラリーの内、
ＡＫIII活性が増大した株あるいは栄養要求性が相補さ
れた株としてＡＫIII遺伝子の組換えＤＮＡをもつ菌株
を得る。候補株から細胞抽出液を調製し、それより粗酵
素液を調製してＡＫIII活性を確認する。ＡＫIIIの酵素
活性測定法は、スタットマンらの方法により行うことが
できる（Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBras,G.,and Rob
ichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,236,2033(196
1)）。
【００５７】例えば、ＡＫ完全欠損変異株を宿主に用い
た場合は、Ｌ−リジン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−メチニオ
ンおよびジアミノピメリン酸を含有しない培地上で、ま
たはホモセリンおよびジアミノピメリン酸を含有しない
培地上で生育可能となった形質転換株を単離し、該菌株
から組換えＤＮＡを回収することにより、ＡＫIII遺伝
子を含有するＤＮＡ断片を得ることができる。
【００５８】尚、ＰＣＲ法により染色体ＤＮＡからＡＫ
III遺伝子を増幅する場合には、ＰＣＲ反応に用いるＤ
ＮＡプライマーとしては、例えばE. coliにおいて既知
となっている配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,a
nd Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）を基に
して適宜作成できるが、lysC遺伝子をコードする1347塩
基からなる領域を増幅できるプライマーが適当であり、
例えば配列番号５及び６に示す配列を有する２種のプラ
イマーが適当である。
【００５９】上記のようにして得られたＡＫIII遺伝子
に、アミノ酸残基の置換、挿入および欠失等の変異を実
施する方法としては、前記ＤＤＰＳ遺伝子の変異処理と
同様に、リコンビナントＰＣＲ法、部位特異的変異法な
どがある。
【００６０】また、目的遺伝子を化学合成する方法によ
れば、目的部位への変異、あるいはランダムな変異を導
入することができる。
【００６１】さらに、染色体もしくは染色体外の組換え
ＤＮＡ上のＡＫIII遺伝子ＤＮＡを直接ヒドロキシルア
ミンで処理する方法（Hashimoto,T. and Sekiguchi,M.,
J.Bacteriol.,159,1039(1984)）がある。また、染色体
もしくは染色体外の組換えＤＮＡ上にＡＫIII遺伝子を
保持するエシェリヒア属細菌を紫外線照射する方法、ま
たはN−メチル−N'−ニトロソグアニジンもしくは亜硝
酸などの化学薬剤で処理する方法を用いてもよい。
【００６２】変異型ＡＫIII遺伝子の選択方法として
は、まず変異処理したＡＫIII遺伝子を含有する組換え
ＤＮＡをＡＫ完全欠損株、例えば E. coli GT3株に形質
転換する。次に著量のＬ−リジンを含む最少培地、例え
ばM9で形質転換株を培養する。野生型のＡＫIII遺伝子
を含有する組換えＤＮＡを保持する株は、唯一のＡＫが
Ｌ−リジンにより阻害されるために、Ｌ−スレオニン、
Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノピメ
リン酸(DAP)の合成が出来なくなり生育が抑えられる。
これに対しＬ−リジンによる阻害の解除された変異型Ａ
ＫIII遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株は、著量の
Ｌ−リジンが添加された最少培地上での生育が可能にな
るはずである。この現象を利用し、生育が、Ｌ−リジン
あるいはＬ−リジンのアナログであるＡＥＣに耐性とな
っている株、すなわち阻害の解除された変異型ＡＫIII
遺伝子を含有する組換えＤＮＡ保持株を選択することが
できる。
【００６３】こうして得られた該変異型遺伝子を、組換
えＤＮＡとして適当な微生物（宿主）に導入し、発現さ
せることによりフィードバック阻害が解除されたＡＫII
Iを保有する微生物を取得できる。宿主としては、エシ
ェリヒア属に属する微生物が好ましく、例えば大腸菌
（E. coli）が挙げられる。
【００６４】また、組換えＤＮＡから変異ＡＫIII遺伝
子断片を取り出し、他のベクターに挿入したものを使用
してもよい。本発明において用いることのできることの
できるベクターＤＮＡとしては、プラスミドベクターＤ
ＮＡが好ましく、例えばpUC19、pUC18、pBR322、pHSG29
9、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW
118、pMW219、pMW218等が挙げられる。他にもファージ
ＤＮＡのベクターも利用できる。
【００６５】さらに、変異型ＡＫIII遺伝子の発現を効
率的に実施するために、変異型ＡＫIIIをコードするＤ
ＮＡの上流に、ｌａｃ、ｔｒｐ、ＰＬ等の微生物内で働
く他のプロモーターを連結してもよく、ＡＫIII遺伝子
に含まれるプロモーターをそのまま、あるいは増幅して
用いてもよい。
【００６６】また、上記のように、変異型遺伝子を自律
複製可能なベクターＤＮＡに挿入したものを宿主に導入
し、プラスミドのように染色体外ＤＮＡとして宿主に保
持させてもよいが、変異型遺伝子を、トランスダクショ
ン、トランスポゾン（Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Te
chnol.,1,417(1983)）、Ｍｕファージ（特開平２−１０
９９８５）または相同性組換え（Experiments in Molec
ular Genetics, ColdSpring Harbor Lab.(1972)）を用
いた方法で宿主微生物の染色体に組み込んでもよい。
【００６７】＜３＞非感受性ＤＤＰＳ及び非感受性ＡＫ
遺伝子を保持するエシェリヒア属細菌 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を受けないＡＫを
保持するエシェリヒア属細菌としては、Ｌ−リジンによ
るフィードバック阻害が解除される変異を有するＡＫII
IをコードするＤＮＡが染色体ＤＮＡに組み込まれて形
質転換されたエシェリヒア属細菌、または該ＤＮＡとエ
シェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮ
Ａとを連結してなる組換えＤＮＡが細胞内に導入される
ことによって形質転換されたエシェリヒア属細菌が挙げ
られる。また、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を
受けないＡＫは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害
を受けない野生型ＡＫであってもよく、このような野生
型ＡＫ遺伝子を同様にしてエシェリヒア属細菌に導入し
たものでもよい。さらに、エシェリヒア属細菌細胞を変
異処理することにより、変異型ＡＫIIIを産生するよう
になったエシェリヒア属細菌変異株であってもよい。
【００６８】一方、非感受性ＤＤＰＳ遺伝子をエシェリ
ヒア属細菌に導入することによって形質転換するには、
非感受性ＤＤＰＳ遺伝子を染色体ＤＮＡに組み込んで形
質転換してもよく、非感受性ＤＤＰＳ遺伝子とエシェリ
ヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターＤＮＡとを
連結してなる組換えＤＮＡを細胞内に導入することによ
って形質転換してもよい。
【００６９】非感受性ＤＤＰＳ遺伝子及び非感受性ＡＫ
III遺伝子の両方をエシェリヒア属細菌に導入する場合
には、両方の遺伝子がエシェリヒア属細菌の染色体ＤＮ
Ａ上に組み込まれて保持されていても、細胞内で単一ま
たは別々のプラスミド上に染色体外ＤＮＡとして保持さ
れていてもよい。別々のプラスミドを用いる場合には、
各々が安定して細胞内に保持されるような安定分配機構
を有するプラスミドを用いることが好ましい。さらに、
各々の遺伝子の一方が染色体ＤＮＡ上に組み込まれて保
持され、もう一方の遺伝子が細胞内でプラスミド上に染
色体外ＤＮＡとして保持されていてもよい。非感受性Ｄ
ＤＰＳ遺伝子及び非感受性ＡＫIII遺伝子をエシェリヒ
ア属細菌に導入するに際しては、両遺伝子の導入の順序
は問わない。
【００７０】＜４＞Ｌ−リジン生合成系の他の遺伝子の
増強 非感受性ＤＤＰＳ遺伝子及び非感受性ＡＫ遺伝子を導入
されたエシェリヒア属細菌のジヒドロジピコリン酸レダ
クターゼ遺伝子を増強することにより、Ｌ−リジン生産
性を一層向上させることができる。
【００７１】さらに、非感受性ＡＫ遺伝子及び非感受性
ＤＤＰＳ遺伝子を保持し、ジヒドロジピコリン酸レダク
ターゼ遺伝子が増強されたエシェリヒア属細菌に、通常
にはコリネ型細菌由来のジアミノピメリン酸デヒドロゲ
ナーゼ遺伝子を導入することによって、より一層Ｌ−リ
ジン生産性を向上させることができる。このジアミノピ
メリン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子は増強されている必要
がある。増強されたジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子のエシェリヒア属細菌への導入は、該遺伝子が
エシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクターに
連結されてなる組換えＤＮＡで形質転換することにより
行うことができる。コリネ型細菌としては、コリネバク
テリウム属細菌またはブレビバクテリウム属細菌であっ
て、グルタミン酸生産能を有する野生株及び他のアミノ
酸生産能を有するこれらの変異株が挙げられる。より具
体的には、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム
の他に、ブレビバクテリウム・フラバム、ブレビバクテ
リウム・ディバリカタム、コリネバクテリウム・グルタ
ミカム、コリネバクテリウム・リリウム等が挙げられ
る。
【００７２】また、ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ遺伝子を導入する代わりに、テトラヒドロジピコリン
酸スクシニラーゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピメリ
ン酸デアシラーゼ遺伝子を増強することによっても、同
程度にＬ−リジン生産性を向上することができる。
【００７３】ここで、遺伝子の増強とは、その遺伝子の
発現産物である酵素の細胞当たりの活性を増強すること
をいう。具体的には、例えば、該遺伝子の細胞内コピー
数を高めること、発現効率のよいプロモーターを用いて
遺伝子当たりの発現量を高めること、酵素活性を高める
変異を該遺伝子に導入することなどが挙げられる。細胞
内の遺伝子のコピー数を高めるには、エシェリヒア属細
菌細胞内で自律複製可能なベクターに該遺伝子を挿入
し、このベクターでエシェリヒア属細菌を形質転換すれ
ばよい。このベクターはマルチコピー型のプラスミドで
あることが好ましい。また、Ｍｕファージ等を用いて染
色体ＤＮＡに組み込んだＤＮＡを増幅することによりコ
ピー数を増加させてもよい。プラスミドを用いる際に、
非感受性ＤＤＰＳ遺伝子及び非感受性ＡＫ遺伝子の導入
にプラスミドを用いた場合には、これらのプラスミドが
共に安定して細胞内に保持されるような安定分配機構を
有するプラスミドを用いることが好ましい。尚、各遺伝
子の導入の順序は問わない。
【００７４】上記のようにしてＬ−リジン生合成系遺伝
子を順次増強することによりＬ−リジン生産性を段階的
に向上させることができるメカニズムを以下に説明す
る。複数反応からなる生合成系は、直列に連結された太
さの異なる複数のパイプを流れる液体にたとえることが
できる。ここで、各々のパイプは個々の酵素に相当し、
そのパイプの太さは酵素反応速度に相当する。パイプを
流れる液体の量を増やすには、最も細いパイプを太くす
るのが効果的である。太いパイプをさらに太くしても、
効果は期待できない。さらに流量を増やすには、２番目
に細いパイプを太くすればよい。本発明者らはこのよう
な観点から、Ｌ−リジン生合成系を強化することを試み
た。そのために、後記実施例６に示すように、E. coli
に、E. coli由来のＬ−リジン生合成系遺伝子を段階的
に導入することによって、Ｌ−リジン生合成系の律速段
階の順位を解明した。その際、生合成系の下流に位置す
るdapC（テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ遺伝
子）、dapD（テトラヒドロジピコリン酸スクシニラーゼ
遺伝子）、dapE（スクシニルジアミノピメリン酸デアシ
ラーゼ遺伝子）及びdapF（ジアミノピメリン酸エピメラ
ーゼ遺伝子）の４遺伝子については、これらの遺伝子産
物が関与する反応を単独で触媒し得るブレビバクテリウ
ム ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactoferm
entum）の DDH（ジアミノピメリン酸デヒドロゲナー
ゼ）をコードする遺伝子DDHで代替した。すなわち、導
入したＬ−リジン生合成系酵素遺伝子とそれらがコード
する酵素は次のとおりである。
【００７５】 ppc ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ aspC：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ lysC：アスパルトキナーゼIII lysC*：阻害解除型アスパルトキナーゼIII asd ：アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ dapA：ジヒドロジピコリン酸シンターゼ dapA*：阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ dapB：ジヒドロジピコリン酸レダクターゼDDH ：ジアミ
ノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ブレビバクテリウム
ラクトファーメンタム由来） lysA：ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
【００７６】E. coliに各遺伝子を個別に導入した結
果、lysC*、dapAあるいはdapA*を導入した株にＬ−リジ
ン生産が認められ、dapA*導入株が最も高いＬ−リジン
生産性を示した。この結果から、dapAが触媒する反応が
第一の律速段階であることがわかった。次に、dapA*導
入株に各Ｌ−リジン生合成系遺伝子を導入したところ、
lysC*が最もＬ−リジン生産性向上に効果があり、lysC
が触媒する反応が第２の律速段階であることがわかっ
た。同様にして、dapBが触媒する反応が第３の律速段
階、DDHが触媒する反応が第４の律速段階であることが
わかった。さらに、DDHで代替されたdapC、dapD、dapE
及びdapFによる反応の間の律速段階を調べた結果、dapD
及びdapEが律速となっていることがわかった。
【００７７】以下に、E. coliのＬ−リジン生合成系遺
伝子、及びブレビバクテリウム ラクトファーメンタム
のDDH遺伝子の取得法を例示する。
【００７８】ppc遺伝子は、この遺伝子を有するプラス
ミドpS2（Sabe, H. et al., Gene, 31, 279 (1984)）、
あるいはpT2から得ることができる。pS2をAatIIとAflII
で切断することにより、ppc遺伝子を有するＤＮＡ断片
が得られる。また、pT2をSmaIとScaIで切断することに
よってもppc遺伝子を有するＤＮＡ断片を得ることがで
きる。pT2を保持するE. coli F15株（AJ12873）は、工
業技術院生命工学工業技術研究所（郵便番号３０５日本
国茨城県つくば市東一丁目１番３号）に、FERM BP-4732
の受託番号のもとでブダペスト条約に基づいて国際寄託
されている。
【００７９】aspC遺伝子は、この遺伝子を有するプラス
ミドpLF4（Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res.,
10, 6957 (1982)）から得られる。pLF4をPvuIIとStuI
で切断すると、aspC遺伝子を有するＤＮＡ断片が得られ
る。
【００８０】asd遺伝子は、この遺伝子を有するプラス
ミドpAD20（Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379 (198
2)）から得られる。pAD20をAseIとClaIで切断すると、a
sdを有するＤＮＡ断片が得られる。
【００８１】dapB遺伝子は、既知のdapB遺伝子のヌクレ
オチド配列（Bouvier, J. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14829 (1984)）をもとに作成した２種のオリゴヌク
レオチドプライマー（例えば、配列番号９、10）を用い
たＰＣＲ法により、E. coli染色体ＤＮＡを増幅するこ
とによって得られる。
【００８２】DDH遺伝子は、コリネバクテリウム グル
タミカム（Corynebacterium glutamicum）のDDH遺伝子
の既知のヌクレオチド配列（Ishino, S. et al., Nucle
ic Acids Res., 15, 3917 (1987)）をもとに作成した２
種のオリゴヌクレオチドプライマー（例えば、配列番号
11、12）を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム
ラクトファーメンタムの染色体ＤＮＡを増幅することに
よって得られる。
【００８３】lysA遺伝子は、既知のlysA遺伝子のヌクレ
オチド配列（Stragier, P. et al.,J. Mol. Biol., 16
8, 321 (1983)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（例えば、配列番号13、14）を用いた
ＰＣＲ法により、E. coli染色体ＤＮＡを増幅すること
によって得られる。
【００８４】dapD遺伝子は、既知のdapD遺伝子のヌクレ
オチド配列（Richaud, C. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14824 (1984)）をもとに作成した２種のオリゴヌク
レオチドプライマー（例えば、配列番号15、16）を用い
たＰＣＲ法により、E. coliW3110株染色体ＤＮＡを増幅
することによって得られる。
【００８５】dapE遺伝子は、既知のdapE遺伝子のヌクレ
オチド配列（Bouvier, J. et al.,J. Bacteriol., 174,
5265 (1992)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレオ
チドプライマー（配列番号17、18）を用いたＰＣＲ法に
より、E. coli ＤＮＡを増幅することによって得られ
る。
【００８６】dapF遺伝子は、既知のdapF遺伝子のヌクレ
オチド配列（Richaud, C. et al.,Nucleic Acids Res.,
16, 10367 (1988)）をもとに作成した２種のオリゴヌ
クレオチドプライマー（例えば、配列番号19、20）を用
いたＰＣＲ法により、E. coli染色体ＤＮＡを増幅する
ことによって得られる。
【００８７】本発明において宿主として用いるエシェリ
ヒア属細菌としては、その細胞内で非感受性ＤＤＰＳ遺
伝子及び非感受性ＡＫ遺伝子、もしくは他のＬ−リジン
生合成系遺伝子のプロモーター又はこれらの遺伝子を発
現させるための他のプロモーターが機能し、さらに非感
受性ＤＤＰＳ遺伝子、非感受性ＡＫ遺伝子、あるいは他
のＬ−リジン生合成系遺伝子をプラスミド上に染色体外
ＤＮＡとして導入する場合には、導入するのに用いるベ
クターＤＮＡの複製起点が細胞内で機能して複製可能な
ものであれば利用できる。
【００８８】例えば、Ｌ−リジン生産性のE. coli、具
体的にはＬ−リジンアナログに耐性を有する変異株が例
示できる。このＬ−リジンアナログは、エシェリヒア属
細菌の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制は
Ｌ−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的
に解除されるようなものである。例えば、オキサリジ
ン、リジンハイドロキサメート、ＡＥＣ、γ−メチルリ
ジン、α−クロロカプロラクタム等がある。これらのリ
ジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異
操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られ
る。Ｌ−リジン製造に用いる菌株として、具体的には、
エシェリヒア・コリＡＪ１１４４２（ＦＥＲＭＢＰ−１
５４３及びＮＲＲＬＢ−１２１８５として寄託されてい
る。特開昭５６−１８５９６号及び米国特許第４３４６
１７０号参照）が挙げられる。以上の微生物のアスパル
トキナーゼは、Ｌ−リジンによるフィードバック阻害が
解除されている。
【００８９】その他にも、たとえばＬ−スレオニン生産
菌が挙げられる。Ｌ−スレオニン生産菌も、一般的には
そのアスパルトキナーゼのＬ−リジンによる阻害が解除
されているからである。E. coliのＬ−スレオニン生産
菌としては、B-3996株が現在知られている内で最も高い
生産能を持っている。B-3996株は、Reserch Institute
for Genetics and Industrial Microorganism Breeding
に、登録番号ＲＩＡ１８６７のもとに寄託されている。
【００９０】＜５＞本発明によるＬ−リジンの製造 上記のようにして得られる非感受性ＤＤＰＳ遺伝子を導
入することによって形質転換され、かつＬ−リジンによ
るフィードバック阻害が解除されたＡＫを保持し、かつ
ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝子が増強された
エシェリヒア属細菌を、好適な培地中で培養し、該培養
物中にＬ−リジンを生産蓄積させ、該培養物からＬ−リ
ジンを採取することにより、Ｌ−リジンを効率よく製造
することができる。
【００９１】本発明によるエシェリヒア属細菌の培養に
使用する培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要
に応じその他の有機成分を含有する通常の培地である。
【００９２】炭素源としては、グルコース、ラクトー
ス、ガラクトース、フラクトースもしくはでんぷんの加
水分解物などの糖類、グリセロールもしくはソルビトー
ルなどのアルコール類、またはフマール酸、クエン酸も
しくはコハク酸等の有機酸類を用いることができる。
【００９３】窒素源としては、硫酸アンモニウム、塩化
アンモニウムもしくはリン酸アンモニウム等の無機アン
モニウム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニ
アガス、またはアンモニア水等を用いることができる。
【００９４】有機微量栄養源としては、ビタミンＢ1、
Ｌ−イソロイシンなどの要求物質または酵母エキス等を
適量含有させることが望ましい。これらの他に、必要に
応じて、リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、鉄イオ
ン、マンガンイオン等が少量添加される。
【００９５】培養は、好気的条件下で１６〜７２時間実
施するのがよく、培養温度は２５℃〜４５℃に、培養中
ｐＨは５〜８に制御する。尚、ｐＨ調整には無機あるい
は有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニア
ガス等を使用することができる。
【００９６】発酵液からのＬ−リジンの採取は通常イオ
ン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み合わせ
ることにより実施できる。
【００９７】
【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する
【００９８】
【実施例１】 変異型ＤＤＰＳ遺伝子の取得 ＜１＞野生型dapA遺伝子のクローニング E.coliのdapA遺伝子の塩基配列は既に報告されており
（Richaud, F. et al.,J.Bacteriol.,297(1986)）、オ
ープンリーデイングフレーム(ORF)は876塩基対であり、
292アミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていること
がわかっている。このdapA遺伝子がどのように調節され
ているか不明であるため、プロモーター領域を除き、Ｓ
Ｄ配列とORFのみを含む領域をPCR法を用いて増幅し、ク
ローニングすることにした。
【００９９】E. coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡ
を斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(1
963)）により回収し、配列番号１及び２に示す配列を有
する２種のプライマーを作製し、これらを用いて、エル
リッチらの方法（PCR Technology, Stockton press (19
89)）に従ってＰＣＲ反応を行い、目的ＤＮＡの増幅を
行った。得られたＤＮＡをそのまま市販のＰＣＲ断片用
クローニングベクターｐＣＲ１０００（Invitrogen社
（米国カルホルニア州）より購入）に挿入した。ｐＣＲ
１０００はlacZプロモーター（Placz）を含有してお
り、lacZプロモーターの下流の部位で切断した状態で市
販されている。このｐＣＲ１０００の両切断末端の間に
ＰＣＲ断片を連結して得られる組換えＤＮＡをE. coli
に導入すると、lacZプロモーター制御下でＰＣＲ断片が
転写される。ＰＣＲ断片をＰＣＲ１０００に連結する
際、このlacZプロモーターによる転写方向に対してdapA
の転写の向きが正方向となるように連結されたプラスミ
ドとしてpdapA1、逆方向となるように連結されたプラス
ミドとしてpdapA2の２種のプラスミドを得た（図１）。
【０１００】これらのプラスミドをＤＤＰＳ欠損株であ
るE. coli JE7627に導入したところ、プラスミドを導入
された株は宿主であるJE7627のジアミノピメリン酸の要
求性が相補されたので、両プラスミドに挿入されたＤＮ
Ａ断片は、活性のあるＤＤＰＳをコードする遺伝子dapA
を含有すると確認した。
【０１０１】pdapA1を野生型E. coli W3110株（国立遺
伝学研究所（日本国静岡県三島市）から入手）に導入し
て得られる形質転換株をW3110/pdapA1、pdapA2をE. col
i W3110株に導入して得られる形質転換株をW3110/pdapA
2とそれぞれ命名した。そして以下の組成を有する最少
培地M9にリジンのアナログであるＡＥＣを加え、これら
２種の形質転換株をそれぞれ培養した。コントロールと
してプラスミドを導入していないW3110株も同培地で培
養した。２種の形質転換株もプラスミドを持たないW311
0株も、ＡＥＣにより生育が抑えられたが、その生育阻
害はＬ−リジンの添加によって回復した。
【０１０２】（最小培地Ｍ９） Ａ：（20×M9） Na2HPO4・12H2O 303 g/L KH2PO4 60 g/L NaCl 10 g/L NH4Cl 20 g/L Ｂ： 1M MgSO4 Ｃ： 50％グルコース Ｄ： 1g/L チアミン 上記Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄを別々に滅菌し、Ａ：Ｂ：Ｃ：Ｄ：
水＝5:0.1:1:0.1:95の割合で混合する。
【０１０３】＜２＞変異型ＤＤＰＳ遺伝子（dapA*）の
取得 Ｌ−リジンによる阻害が解除されたＤＤＰＳをコードす
るdapA*を含有するプラスミド保持株は、著量のＡＥＣ
が添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想
し、生育がＡＥＣに耐性となっている株を選択すること
によって、dapA *を含有するプラスミド保持株を選択す
ることにした。
【０１０４】dapA*を効率よく取得するために、＜１＞
で作製したpdapA1およびpdapA2上のdapAに変異処理を行
なうことにした。
【０１０５】（1-2-1）dapA*を含有するプラスミド保持
株の選択条件の検討 上記で得られたW3110/pdapA1株およびW3110/pdapA2株
を、それぞれ種々の濃度のＡＥＣを含有するＭ９寒天平
板培地上で培養した。そしてＡＥＣによる生育阻止濃度
を調べ、dapA*を含有するプラスミド保持株の選択条件
の検討を行なった。各種濃度でＡＥＣを含むＭ９培地で
の形質転換体の生育を表１に示す。尚、表中の＋は形質
転換株が生育することを示し、−は生育しなかったこと
を示す。
【０１０６】
【表１】
【０１０７】pdapA1上のdapA遺伝子の転写方向はlacZプ
ロモーターによる転写の方向と一致している（図１）。
よってpdapA1上のdapA遺伝子はlacZプロモーターにより
発現量が増幅されているため、dapAが野生型のままでも
かなり高濃度のＡＥＣに耐性であったが、pdapA2上のda
pA遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向
であり、dapA自身のプロモーターも欠失しているため発
現量が少なく、より低濃度のＡＥＣで生育が阻害される
ことがわかった（W3110/pdapA1株では30mM、W3110/pdap
A2株では15mMの添加区で生育が抑えられた）。なお、こ
の生育阻害はＬ−リジンの同時添加により消去されるこ
とを確認した。
【０１０８】したがって、変異導入対象にはpdapA2を用
い、最少培地Ｍ９にＡＥＣを60mM添加したものを、dapA
*を含有するプラスミド保持株の選択に用いた。以下、
実施例１においてこの培地を選択培地という。
【０１０９】（1-2-2）ヒドロキシルアミンによるpdapA
2のインビトロ変異処理 pdapA2プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直
接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法
を用いた。
【０１１０】２μgのＤＮＡを0.4Mヒドロキシルアミン
中（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0)100μl、1Mヒドロキ
シルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を
加えて計200μlとする）で、75℃で１〜４時間処理し
た。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製後、E. col
i W3110に導入し、完全培地（L-broth：1％ Bacto tryp
ton, 0.5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl, 1.5％ agar）
に撒き、コロニーを形成させた。これらを（1-2-1）で
述べた選択培地にレプリカし、選択培地上でコロニーを
形成するものを選択した。２度の実験で合計３６株の変
異プラスミドの候補が得られた。
【０１１１】こうして得られた候補株合計３６株を、再
度選択培地にスポットし、AEC耐性を確認した。
【０１１２】（1-2-3）dapA*遺伝子の単離及びdapA*産
物の検討 上記３６株から変異型pdapA2を回収し、これらと野生型
pdapA2のそれぞれでdapA欠損株 JE7627を形質転換し、
各形質転換株から無細胞抽出液を調製し、ＤＤＰＳの酵
素活性を測定した。
【０１１３】無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにし
て調製した。形質転換株を２×TY培地（1.6％ Bacto tr
ypton, 1％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で培養し、６
６０ｎｍにおける濁度（ＯＤ660）が約0.8になったとこ
ろで集菌した。菌体を０℃の条件下で、0.85%NaClで洗
浄し、20mMリン酸カリウム緩衝液 pH7.5−400mM KClに
懸濁し、超音波処理（0℃,200W,10分）で菌体を破砕し
た。菌体破砕液を０℃の条件下で、33krpmで１時間遠心
し、上清をとってこれに80％飽和になるよう硫安を添加
し、０℃で一夜保存した後遠心し、ペレットを20mMリン
酸カリウム緩衝液pH7.5−400mM KClに溶解した。
【０１１４】ＤＤＰＳ酵素活性の測定は、Yugariらの方
法（Yugari,Y. and Gilvarg,C. J.Biol.Chem.240,4710
(1962)）で行った。即ち下記組成の反応液の吸光度を、
37℃で分光光度計中で経時的に270nmの波長で測定し、
生じるジヒドロジピコリン酸を測定した。ブランクとし
ては反応系からピルビン酸ナトリウムを除いたものとし
た。
【０１１５】
【０１１６】ＤＤＰＳの酵素活性を測定する際、酵素反
応液中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンに
よる阻害の度合を調べた。図２に示す様に、野生型ＤＤ
ＰＳはＬ−リジンによる阻害を受けた。野生型に比べて
Ｌ−リジンによる阻害を受けにくくなったＤＤＰＳを有
する形質転換株由来の変異プラスミドは、候補プラスミ
ド３６種中３種類であった。これらをそれぞれ、pdapAS
8、pdapAS9およびpdapAS24と命名した。後の塩基配列の
決定で pdapAS8とpdapAS9は同一変異を有することが判
明した。
【０１１７】pdapAS8、pdapAS9およびpdapAS24上のdapA
*にコードされる３種の変異型ＤＤＰＳのＬ−リジンに
よる阻害の解除の度合は様々ではあったが、３種ともＬ
−リジンによる阻害が解除されていた。酵素の比活性
は、菌体の生育状況や試料の調製に影響されるが、いず
れも野生型より若干の低下が見られた。しかし、育種素
材としては実質的に問題となる程ではないと判断した。
【０１１８】（1-2-4）変異型dapA遺伝子の塩基配列の
決定 DNAシークエンサー ABI Model 373A （Applied Biosyst
ems社製）を使用して、常法に従い、変異型dapA遺伝子
の塩基配列の決定を行った。その結果、配列番号３に示
す野生型dapA遺伝子の配列上で、pdapAS8及びpdapAS9
は、４８７番目のＣがＴに、pdapAS24は５９７番目のＣ
がＴに変化していることが明かとなった。従って配列番
号４に示すＤＤＰＳのアミノ酸配列において、pdapAS8
及びpdapAS9のコードするＤＤＰＳは、８１番目のアラ
ニン残基がバリン残基に、pdapAS24のコードするＤＤＰ
Ｓは、１１８番目のヒスチジン残基がチロシン残基に変
化していることが明かとなった。
【０１１９】（1-2-5）二重変異型dapAの作製 上述のように２種類の変異型dapA遺伝子が得られた。こ
れらの変異は阻害の解除が相加的に働くかどうかを検証
するために、２つの変異を同時に持つ変異型dapAを含有
するプラスミドを作成した。作成の手順は図３に示す通
りである。得られた二重変異プラスミドをpdapAS824と
命名した。
【０１２０】
【実施例２】 変異型ＡＫIII遺伝子の取得 ＜１＞野生型lysC遺伝子のクローニング E. coliのＡＫIII遺伝子（lysC）の塩基配列は既に報告
されており（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,and Pat
te,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）、オープンリ
ーディングフレーム(ORF)は1347塩基対よりなり、449ア
ミノ酸残基からなる蛋白質をコードしていることがわか
っている。この遺伝子にはオペレーターが存在しＬ−リ
ジンによる抑制を受けるため、このオペレーター領域を
除くために、SD配列とORFのみを含む領域を、ＰＣＲ法
を用いて増幅し、クローニングすることにした。
【０１２１】E.coli K-12 MC1061株の全ゲノムＤＮＡを
斎藤、三浦の方法（Biochem.Biophys.Acta.,72,619(196
3)）により調製し、配列番号５及び６に示す配列を有す
る２種のプライマーを作製し、これらを用いてエルリッ
チらの方法（PCR Technology, Stockton press (198
9)）に従ってＰＣＲ反応を行い、lysC遺伝子の増幅を行
った。得られたＤＮＡをBamHIとAseIで消化した後、平
滑末端にし、多コピーベクターpUC18のSmaI部位に挿入
した。このSmaI部位はベクター内に存在するlacZプロモ
ーターの下流側に位置しており、pUC18のSmaI部位にＤ
ＮＡ断片を挿入して得られる組換えＤＮＡをE. coliに
導入すると、lacZプロモーター制御による読み越し（リ
ードスルー）転写により、挿入されたＤＮＡ断片が転写
される。pUC18のSmaI部位にＰＣＲ断片を挿入する際、p
UC18に含まれているlacZプロモーターによる転写方向に
対してlysCの転写の向きが逆方向となるように挿入され
たプラスミドとしてpLYSC1と、正方向となるように挿入
されたプラスミドとしてpLYSC2の２種のプラスミドを得
た（図４）。
【０１２２】これらのプラスミドでＡＫI、II、III完全
欠損株であるE. coli GT3（thrA1016b,metLM1005,lysC1
004）を形質転換したところ、GT3のホモセリンおよびジ
アミノピメリン酸の要求性が相補されたので、両プラス
ミドに挿入されたＤＮＡ断片は、活性のあるＡＫIIIを
コードする遺伝子lysCを含有すると確認した。
【０１２３】pLYSC1をＡＫ完全欠損株E. coli GT3に導
入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC1、pLYSC2をE. c
oli GT3に導入して得られる形質転換株をGT3/pLYSC2と
命名した。最少培地Ｍ９に著量のＬ−リジンを加え、GT
3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ培養した。GT
3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株ともに野生型のlysCを含
有するプラスミドを保持し、同プラスミド上のlysCにコ
ードされるＡＫIIIが唯一のＡＫである。著量のＬ−リ
ジン存在下では唯一のＡＫである野生型ＡＫIIIがＬ−
リジンにより阻害されるために、両株ともＬ−スレオニ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−メチオニン、及びジアミノ
ピメリン酸(DAP)の合成ができなくなり生育が抑えられ
た。
【０１２４】＜２＞変異型ＡＫIII遺伝子（lysC*）の取
得 Ｌ−リジンによる阻害の解除されたＡＫをコードするly
sC*を含有するプラスミド保持株は、著量のＬ−リジン
が添加された最少培地M9上での生育が可能になると予想
し、生育がＬ−リジンあるいはＬ−リジンのアナログで
あるＡＥＣに耐性となっている株を選択することによっ
て、lysC*を含有するプラスミド保持株を選択すること
にした。
【０１２５】lysC*を効率よく取得するために、＜１＞
で作製したpLYSC1およびpLYSC2上のlysCに変異処理を行
なうことにした。
【０１２６】（2-2-1）lysC*を含有するプラスミド保持
株の選択条件の検討 GT3/pLYSC1株およびGT3/pLYSC2株をそれぞれ種々の濃度
のＬ−リジンあるいはAECを含有するＭ９寒天平板培地
上で培養を行なった。そしてＬ−リジンあるいはAECに
よる生育阻止濃度を調べ、lysC*を含有するプラスミド
保持株の選択条件の検討を行なった。
【０１２７】各種濃度でＬ−リジンあるいはAECを含む
Ｍ９培地での形質転換体の生育を表２に示す。尚、表中
の＋は形質転換株が生育したことを示し、±はやや生育
したことを示し、−は生育しなかったことを示す
【０１２８】
【表２】
【０１２９】pLYSC2上のlysC遺伝子の転写はlacZプロモ
ーターによる転写の方向と一致している（図４）。よっ
てpLYSC2上のlysC遺伝子はlacZプロモーターで発現量が
増幅されているためlysCが野生型のままでもかなり高濃
度のＬ−リジン、AECに耐性であったが、pLYSC1上のlys
C遺伝子は転写方向がlacZプロモーターに対して逆方向
であり、自身のプロモーターも欠失しているため発現量
が少なく、より低濃度のＬ−リジン、AECで生育が阻害
されることがわかった（GT3/pLYSC2株ではＬ−リジンに
ついては100mMの添加区まで、AECについては3mMの添加
区まで生育が抑えられなかったのに対し、GT3/pLYSC1株
ではＬ−リジン、AECとも0.2mMの添加区で生育が完全に
抑えられた）。なお、この生育阻害はホモセリン及びジ
アミノピメリン酸の同時添加により消去されることを確
認した。
【０１３０】したがって、変異導入実験にはpLYSC1を用
い、最少培地Ｍ９にＬ−リジン10mM、もしくはＡＥＣ
0.2mMを添加したものを、lysC*を含有するプラスミド保
持株の選択に用いた。以下、実施例２においてこの培地
を選択培地という。
【０１３１】（2-2-2）ヒドロキシルアミンによるpLYSC
1のインビトロ変異処理 pLYSC1プラスミドへの変異の導入には、プラスミドを直
接ヒドロキシルアミンで処理するインビトロ変異処理法
に加え、変異に多様性を与えるため、即ちヒドロキシル
アミンによるシトシンからチミンへの変異以外の変異を
期待して、プラスミドを保持した菌体をニトロソグアニ
ジン（NTG）で処理した後プラスミドを抽出するインビ
ボ変異処理法の２種の方法を用いた。
【０１３２】（ヒドロキシルアミンによるインビトロ変
異処理）2μgのＤＮＡを 0.4M ヒドロキシルアミン中
（0.1M KH2PO4-1mM EDTA (pH6.0)100μl、1Mヒドロキシ
ルアミン-1mM EDTA (pH6.0) 80μl、DNA 2μg、水を加
えて計200μlとする）で、75℃の条件下で、１〜４時間
処理した。処理後のＤＮＡをガラスパウダーで精製後、
ＡＫ完全欠損株E. coli GT3株に導入し、完全培地（ L-
broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extract, 0.5
％ NaCl, 1.5％寒天）に撒きコロニーを形成させた。こ
れを（2-2-1）で設定した選択培地にレプリカし、選択
培地上に生育可能な株を選択し候補株とした。形質転換
体の出現率と変異率は図５のような推移がみられた。４
時間処理では 0.5〜0.8％とかなり高率で変異株が得ら
れた。
【０１３３】（ＮＴＧによるインビボ変異処理）pLYSC1
をE. coli MC1061に導入し、菌体ごとＮＴＧ処理をおこ
なった。処理後の菌体を一夜培養して変異を固定した後
プラスミドを抽出し、E. coli GT3に導入した。すなわ
ち、形質転換株を２×TY培地（1.6％ Bacto trypton, 1
％ Yeastextract, 0.5％ NaCl）で培養し、ＯＤ660が約
０．３になったところで集菌し、下記に示すＴＭ緩衝液
（TM buffer）で洗浄した後、ＮＴＧ液（0.2mg/mlの濃
度でＮＴＧをTM bufferに溶解させて調製）に懸濁し、3
7℃で０〜９０分処理した。菌体をTM buffer及び２×TY
培地で洗浄後、2×TY培地で一夜培養して変異を固定し
た後、菌体よりプラスミドＤＮＡを抽出し、E. coli GT
3株に導入し、候補株のスクリーニングをインビトロ変
異と同様に行い、リジン耐性（LysR）、ＡＥＣ耐性（AE
CR）の変異体を得た。
【０１３４】（TM buffer） Tris 50mM マレイン酸 50mM (NH4)2SO4 1g/L MgSO4・7H2O 0.1g/L Ca(NO3)2 5mg/L FeSO4・7H2O 0.25mg/L NaOHを用いてpH6.0に調整
【０１３５】上記で得られた候補株合計180株(ヒドロキ
シルアミン処理48株、NTG処理132株)を再度選択培地に
スポットし、AEC及びＬ−リジン耐性を確認し153株を得
た。培地中のアミノ酸蓄積パターンの違いに注目して、
この153株を14群に分け各群の代表株を選んでＡＫ活性
を測定することにした。なお、ヒドロキシルアミン処理
による変異株と、NTG処理による変異株との間ではＡＫ
の活性に大きな差はなかったので、それぞれを区別する
ことなく以降の実験を行なった。
【０１３６】（2-2-3）lysC*遺伝子の単離及びlysC*産
物の検討 上記14群の代表株として、No.24, No.43, No.48, No.6
0, No.80, No.117, No.126, No.149, No.150, No.156,
No.158, No.167, No.169, No.172を選び、おのおのから
pLYSC1に由来する変異型プラスミドを回収し、それぞれ
pLYSC1*24, pLYSC1*43, pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1
*80, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLYSC1*149, pLYSC1*15
0, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC1*167, pLYSC1*169,
pLYSC1*172と命名した。これらと野生型pLYSC1でＡＫ
完全欠損株GT3を形質転換し、各形質転換株から無細胞
抽出液を調製し、ＡＫIIIの酵素活性を測定した。
【０１３７】無細胞抽出液（粗酵素液）は次のようにし
て調製した。形質転換株を２×TY培地で培養し、ＯＤ
660が約0.8になったところで集菌した。菌体を０℃の条
件下、0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.03Mβ−メルカプトエタ
ノールで洗浄し、超音波処理（0℃,100W,30秒×4）で菌
体を破砕した。菌体破砕液を０℃の条件下、33krpmで１
時間遠心し、上清をとりこれに80％飽和になるよう硫安
を添加し、遠心後ペレットを0.02M KH2PO4(pH6.75)-0.0
3Mβ−メルカプトエタノールに溶解し、０℃で一夜保存
した。
【０１３８】ＡＫIII酵素活性の測定は、スタットマン
らの方法にしたがった(Stadtman,E.R.,Cohen,G.N.,LeBr
as,G.,and Robichon-Szulmajster,H.,J.Biol.Chem.,23
6,2033(1961))。すなわち、下記組成の反応液を27℃で4
5分インキュベートし、FeCl3溶液（2.8N HCl 0.4ml + 1
2％TCA 0.4ml + 5％FeCl3・6H2O/0.1N HCl 0.7ml）を加
え発色させ、これを遠心後、上清の540nmでの吸光度を
測定した。活性は１分間に生成するヒドロキサム酸の量
で表示（1U=1μmol/min）した。モル吸光係数は600とし
た。尚、反応液からアスパラギン酸カリウムを除いたも
のをブランクとした。
【０１３９】 （反応液組成） reaction mixture*1 0.3ml ヒドロキシルアミン溶液*2 0.2ml 0.1Mアスパラギン酸カリ(pH7.0) 0.1ml 酵素液 水 （バランス） 計 1.0ml *1; 1M Tris-HCl(pH8.1)9ml + 0.3M MgSO4 0.5ml + 0.2M ATP(pH7.0) 5ml *2; 8M ヒドロキシルアミン溶液を直前にKOHで中和したもの
【０１４０】ＡＫの酵素活性を測定する際、酵素反応液
中に種々の濃度のＬ−リジンを加え、Ｌ−リジンによる
阻害の度合を調べた。結果を、図６及び表３に示した。
尚、野生型及びNo.24, 43, 48, 60, 80, 117, 126につ
いては図６Ａに、No.149, 150, 156, 158, 167, 169, 1
72については図６Ｂに示した。
【０１４１】この結果が示すように、野生型ＡＫIIIは
Ｌ−リジンによる阻害を非常に強く受け、Ｌ−リジン約
0.45mMで50％阻害され、5mMになるとほぼ100％阻害され
た。それに対し、今回得られた変異型ＡＫIIIは、解除
の度合は様々ではあったが、14種ともＬ−リジンによる
阻害が解除されていた。特にNo.24、80、117、169、172
では、Ｌ−リジン100mMでも阻害はほとんどみられず、5
0％阻害濃度は野生型のそれと比較して200倍以上であっ
た。また総蛋白当りの比活性は、菌体の生育状況や試料
の調製に影響されるが、いずれもほとんどが野生型と同
等もしくはそれ以上のものであり、変異導入による活性
低下の問題はほとんどなかった（表３）。このことよ
り、ＡＫIIIの活性中心とＬ−リジンによる調節部位が
それぞれ独立していることが予想された。尚、表３中、
阻害解除度（％）とは、反応液中Ｌ−リジン非存在下で
のＡＫ活性に対するＬ−リジン 100 mM存在下でのＡＫ
活性である。熱安定性（％）とは55℃で1.5時間処理後
の活性保持率である。
【０１４２】
【表３】
【０１４３】続いて変異型酵素の熱安定性を調べた。あ
る酵素を改良し活性を上げようとする場合、創成される
酵素が細胞内で安定に保持されることが重要である。細
胞内外でのプロテアーゼの活動の違いや、酵素をインビ
トロ保存するための保存用バッファーの影響などもある
ため、インビトロの測定には問題もあるが、簡便のため
１つのパラメーターとして変異型ＡＫIIIの熱安定性に
ついてインビトロで検討した。
【０１４４】ＡＫIIIの失活温度を種々の条件で検討し
た結果から、55℃、90分処理後の活性保持率を測定する
ことにした。表３に示すように、半数がむしろ野生型よ
りも優れていた。通常変異型酵素は野生型に比べ不安定
なものが多いが、今回得られた変異型ＡＫIIIには安定
性が野生型を上回るものもあり、Ｌ−リジン生産の実用
面でかなり有力と思われるものが多かった。
【０１４５】（2-2-4）野生型lysCおよび変異型lysCの
塩基配列の決定 DNA シークエンサー ABI Model 373A（ Applied Biosys
tems社製）を使用して、常法に従い、今回取得した野生
型lysC遺伝子の塩基配列の決定を行なった（配列番号
７）。その結果、既に発表されている E. coli K-12 JC
411株のlysCの配列（Cassan,M.,Parsot,C.,Cohen,G.N.,
and Patte,J.C.,J.Biol.Chem.,261,1052(1986)）と６ヶ
所（アミノ酸レベルでは２ヶ所）の相違があった。この
６ヶ所の相違は使用菌株の違いによるものであると考え
られる。
【０１４６】同様に、14種の変異型pLYSC1上にあるlysC
*それぞれについて塩基配列を決定し、変異点を明らか
にした。結果を表４に示す。表中、（）内はヌクレオチ
ドの変異に基づくアミノ酸残基の変異を示す。14種のう
ち全く同一の変異型が２組（No.48とNo.167、及びNo.24
とNo.80）あったので、変異の種類は12種類であった。
尚、No.149,150,156,158,167,169,172はヒドロキシルア
ミン処理、No.24、43、48、60、80、117、126はＮＴＧ
処理によって得た変異型であるが、変異のパターンはい
ずれもシトシンからチミンへの変異、あるいは裏鎖のシ
トシンからチミンへの変異による表鎖のグアニンからア
デニンへの変異であった。
【０１４７】
【表４】
【０１４８】
【実施例３】 dapA*を導入した株によるＬ−リジンの
発酵生産 E. coliでＬ−リジンを生産させるためには、特開昭56-
18596号公報、及び米国特許第4,346,170公報及びApplie
d Microbiology and Biotechnology,15,p227-231(1982)
に示されるように、ＤＤＰＳを増強する宿主としては、
アスパルトキナーゼがＬ−リジンによる阻害を受けなく
なっているように変化している事が必須であるとされて
いる。そのような株として、たとえばＬ−スレオニン生
産菌があげられる。E. coliスレオニン生産菌として
は、B-3996株が現在知られている内で最も高い生産能を
持っている。そこで、dapA*を評価するに当たり、B-399
6株を宿主に用いることとした。B-3996株は、染色体外
に唯一のプラスミドとしてｐＶＩＣ４０を保持する。詳
細は特表平３−５０１６８２号公報に記載されている。
当該微生物は、Reserch Institute for Genetics and I
ndustrial Microorganism Breedingに、登録番号ＲＩＡ
１８６７のもとに寄託されている。
【０１４９】また、E. coliに導入するdapA*としては、
酵素の阻害解除度、比活性より判断して、pdapAS24に含
まれているdapA*（１１８番目のヒスチジン残基がチロ
シン残基に変異しているもの）を選択した。まず、dapA
*の発現量を増すためと、プラスミドの安定性を増すた
めに、pdapAS24上にあった変異型dapA*（以下、「dapA*
24」という）をｐＶＩＣ４０のテトラサイクリン耐性遺
伝子プロモーターの下流に連結し、図７に示す様にして
ＲＳＦ２４Ｐを得た。
【０１５０】ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを E. coli JM109
株に導入したものは、ＡＪ１２３９５と命名され、１９
９３年１０月２８日に工業技術院生命工学工業技術研究
所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９３５として寄託さ
れ、１９９４年１１月１日にブダペスト条約に基づく国
際寄託に移管され、FERM BP-4858の受託番号のもとで寄
託されている。pdapAS8およびpdapAS9を保持する株は寄
託しなかったが、各プラスミド上のdapA*の変異点は前
述の通りすべて明らかになっているので、上記寄託菌よ
りプラスミドをマニアティスらの方法（Sambrook,J.,Fr
itsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spr
ing Harbor Laboratory Press,1.21(1989)）により回収
し、サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法
（Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular C
loning, Cold Spring Harbor Laboratory Press,15.63
(1989)）により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容
易である。B-3996株からｐＶＩＣ４０を常法に従い脱落
させて、プラスミドを有しない株としてB-399株を取得
した。ＲＳＦ２４Ｐプラスミドを常法にしたがいB-399
株に導入し、B-399/RSF24Pを得た。B-399/RSF24PのＬ−
リジン生産性について評価を行なった。
【０１５１】一方、コントロールのプラスミドとしてＲ
ＳＦＰを構築した。すなわち、図７に示すｐＶＩＣ４０
のBamHIおよびDraIによる二重消化物より大断片を選択
し、これをＤＮＡポリメラーゼクレノー・フラグメント
によって平滑末端化処理した。平滑末端化処理した大断
片を自己連結させてプラスミドＲＳＦＰを得た。B-399
株にＲＳＦＰを常法に従い導入し、B-399/RSFPを得た。
B-399/RSFPについてもＬ−リジン生産性の評価を行っ
た。
【０１５２】培養は、以下の培地を用い、培養時間48時
間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116rpmで行った。結
果を表５に示す。
【０１５３】 （Ｌ−リジン生産培地） Ａ： (NH4)2SO4 16 g/L KH2PO4 1 g/L MgSO4・7H2O 1 g/L FeSO4・7H2O 0.01 g/L MnSO4・5H2O 0.01 g/L Yeast Ext.(Difco) 2 g/L Ｌ−メチオニン 0.5 g/L Ｌ−スレオニン O.1 g/L Ｌ−イソロイシン 0.05 g/L KOHでpH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ (16/20容) Ｂ： 20％グルコース（115℃で10分オートクレーブ） (4/20容) Ｃ：局方 CaCO3 （180℃で２日間乾熱滅菌） (30g/L) Ａ：Ｂを４：１で混合し、１Ｌに対してＣを３０ｇ加え
て溶解し、抗生物質（ストレフ゜トマイシン 100μg/ml，カナマイシン 5
μg/ml）を加える。
【０１５４】
【表５】
【０１５５】
【実施例４】 dapA*及びlysC*を導入した株によるＬ−
リジンの発酵生産(I) 実施例３で変異型ＤＤＰＳのＬ−リジン生産に対する効
果が示されたが、これをさらに改良するために、実施例
２で得られた変異型ＡＫIII遺伝子を変異型ＤＤＰＳ遺
伝子と共存させる事とした。変異型ＤＤＰＳ遺伝子と共
存させる変異型ＡＫIII遺伝子としては、酵素活性、熱
安定性等からＮｏ．８０株由来のもの（lysC*80）を選
択した。
【０１５６】lysC*80は、lysC*の発現量を増すためにpL
YSC1*80上にあったlysC*（以下、「lysC*80」という）
をpUC18に対して逆位の挿入部位を有するベクターpHSG3
99（宝酒造社製）のlacZプロモーターの下流につなぎか
えることにより作成されたプラスミドpLLC*80（図８）
から切り出したものを使用した。pLLC*80は、pLYSC1*80
上のlysC*80が、転写方向がlacZプロモーターに対して
逆方向に配置されているので、Ｌ−リジンの生産性を向
上させるために、lacZプロモーターに対して転写方向が
正方向となるようにlysC*80を配置させるために作成さ
れたプラスミドである。
【０１５７】pLLC*80と、実施例３で得られたＲＳＦ２
４Ｐから、dapA*及びlysC*を有するプラスミドＲＳＦＤ
８０を図９の様にして作製した。ＲＳＦＤ８０は、テト
ラサイクリン耐性遺伝子のプロモーター（tetP）の下流
に、tetPに対して転写方向が正方向となるようにdapA*2
4及びlysC*80がこの順序で配置されている。
【０１５８】ＲＳＦＤ８０プラスミドをE. coli JM109
株に導入したものを、ＡＪ１２３９６と命名した。ＡＪ
１２３９６は、１９９３年１０月２８日に工業技術院生
命工学工業技術研究所に受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３９
３６として寄託され、１９９４年１１月１日にブダペス
ト条約に基づく国際寄託に移管され、FERM BP-4859の受
託番号のもとで寄託されている。pLYSC1*24, LYSC1*43,
pLYSC1*48, pLYSC1*60, pLYSC1*117, pLYSC1*126, pLY
SC1*149, pLYSC1*150, pLYSC1*156, pLYSC1*158, pLYSC
1*167, pLYSC1*169, pLYSC1*172を保持する株は寄託し
なかったが、各プラスミド上のlysC*の変異点は前記の
通りすべて明らかになっているので、上記寄託菌よりプ
ラスミドをマニアティスらの方法（Sambrook,J.,Fritsc
h,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Cloning, Cold Spring
Harbor Laboratory Press,1.21(1989)）により回収し、
サイト・ダイレクテッド・ミュータジェネシス法（Samb
rook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,Molecular Clonin
g, Cold Spring Harbor Laboratory Press,15.63(198
9)）により目的遺伝子を得ることは当業者にとり容易で
ある。ＲＳＦＤ８０を常法にしたがいBー399株に導入
し、B-399/RSFD80を得た。B-399/RSFD80のＬ−リジン生
産性について評価を行なった。コントロールとして、B-
399/RSFPについてもＬ−リジン生産性の評価を行った。
【０１５９】培養は、実施例３と同様のＬ−リジン生産
培地を用い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌
114〜116rpmで行った。結果を表６に示す。
【０１６０】
【表６】
【０１６１】
【実施例５】 dapA*及びlysC*を導入した株によるL-リシ
゛ンの発酵生産（II） エシェリヒア属細菌に変異型dapA遺伝子と、変異型lysC
遺伝子を保持させて、Ｌ−リジンの生産性が改善できる
ことが実施例４で確認された。この効果が、宿主を変更
した場合にも維持されるかどうかを実験した。宿主に
は、E. coli W3110(tyrA)株を用いた。W3110(tyrA)株は
欧州特許公開９２年４８８４２４号公報に詳しい記載が
あるが、その調製方法について簡単にふれると以下の通
りである。国立遺伝学研究所（静岡県三島市）よりE. c
oli W3110株を入手した。同株をストレプトマイシン含
有のＬＢプレートにまき、コロニーを形成する株を選択
してストレプトマイシン耐性株を取得した。選択したス
トレプトマイシン耐性株と、E. coli K-12 ME8424株を
混合して、完全培地（L-Broth：1％ Bacto trypton, 0.
5％ Yeast extract, 0.5％ NaCl）で３７℃の条件下、
１５分間静置培養して接合を誘導した。E. coli K-12 M
E8424株は、（HfrPO45,thi, relA1, tyrA::Tn10, ung-
1, nadB）の遺伝形質を有し、国立遺伝学研究所より入
手できる。
【０１６２】その後で培養物を、ストレプトマイシン、
テトラサイクリンおよびＬ−チロシンを含有する完全培
地（L-Broth：1％ Bacto trypton, 0.5％ Yeast extrac
t, 0.5％ NaCl, 1.5％寒天）にまき、コロニーを形成す
る株を選択した。この株を、E. coli W3110(tyrA)株と
命名した。
【０１６３】ところで、欧州特許公開９２年４８８４２
４号公報には、W3110(tyrA)株にプラスミドを導入して
形成される株が多く記載されている。例えば、プラスミ
ドpHATermを導入して得られる株は、E. coli W3110(tyr
A)/pHATerm株と命名され、工業技術院生命工学工業技術
研究所に寄託されており、登録番号ＦＥＲＭＢＰ−３６
５３が付与されている。このE. coli W3110(tyrA)/pHAT
erm株からプラスミドpHATermを脱落させることによって
もW3110(tyrA)株を取得することができる。プラスミド
の脱落は常法によって行うことができる。
【０１６４】前記のようにして得られたW3110(tyrA)株
に、実施例４で得られたdapA*とlysC *をともに含有する
プラスミドＲＳＦＤ８０を導入し、W3110(tyrA)/RSFD80
を得た。W3110(tyrA)/RSFD80のＬ−リジン生産性につい
て評価を行なった。コントロールとして、W3110(tyrA)
株にＲＳＦＰを常法に従い導入し、W3110(tyrA)/RSFPを
得た。W3110(tyrA)/RSFPについてもＬ−リジン生産性の
評価を行った。培養は、前記Ｌ−リジン生産培地を用
い、培養時間48時間、温度37℃の条件下、攪拌114〜116
rpmで行った。結果を表７に示す。
【０１６５】
【表７】
【０１６６】
【実施例６】 Ｌ−リジン生合成系の律速段階の解析及
びＬ−リジン産生エシェリヒア属細菌のＬ−リジン生産
性の向上 E. coliのＬ−リジン生合成系の律速段階を解析し、そ
の段階を触媒する酵素の遺伝子を増強することによっ
て、Ｌ−リジン生産性の向上を試みた。
【０１６７】＜１＞第ー律速段階の特定 (6-1-1)Ｌ−リジン生合成系遺伝子の取得 律速段階の特定は、各種リジン生合成系遺伝子を単離
し、それらの遺伝子をE.coliに導入し、それぞれの遺伝
子のＬ−リジン生産能に対する効果を調べることによっ
て行った。導入したＬ−リジン生合成系酵素遺伝子とそ
れらがコードする酵素は次のとおりである。
【０１６８】 ppc ：ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ aspC ：アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ lysC ：アスパルトキナーゼIII lysC*80：阻害解除型アスパルトキナーゼIII asd ：アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナー
ゼ dapA ：ジヒドロジピコリン酸シンターゼ dapA*24：阻害解除型ジヒドロジピコリン酸シンターゼ dapB ：ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ DDH ：ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ（ブレビ
バクテリウム ラクトファーメンタム由来） lysA ：ジアミノピメリン酸デカルボキシラーゼ
【０１６９】以上の遺伝子でホスホエノールピルビン酸
からＬ−リジンに至るＬ−リジン生合成系が網羅でき
る。尚、本来E. coliが保持するＬ−リジン生合成系遺
伝子のうち、dapC、dapD、dapE及びdapF遺伝子は、これ
らの遺伝子産物が関与する反応を単独で触媒し得るブレ
ビバクテリウム ラクトファーメンタム（Brevibacteri
um lactofermentum）の DDH（ジアミノピメリン酸デヒ
ドロゲナーゼ）をコードする遺伝子DDHで代替すること
にした。また、これらの遺伝子を導入する宿主として
は、E. coli K-12系の W3110(tyrA)株を用いた。
【０１７０】dapA及びdapA*24遺伝子は、それぞれpdapA
2及びpdapAS24（実施例１参照）からEcoRI及びKpnIで切
り出すことによって得た（図10）。これらの遺伝子をEc
oRI及びKpnIで消化したpMW118と連結してpdapA及びpdap
A*を得た。また、lysC及びlysC*80遺伝子は、それぞれp
LYSC1及びpLLC*80（実施例２参照）からEcoRI及びSphI
で切り出すことによって得た。これらの遺伝子をEcoRI
及びSphIで消化したpMW119と連結してplysC及びplysC*
を得た（図11）。
【０１７１】ppc遺伝子は、この遺伝子を有するプラス
ミドpT2から得た。pT2をSmaIとScaIで切断し、末端を平
滑化した後、pMW118のSmaI部位に挿入し、プラスミドpp
pcを得た（図12）。pT2を保持するE. coli F15株（AJ12
873）は、通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究
所にFERM BP-4732の受託番号のもとに寄託されている。
【０１７２】aspC遺伝子は、この遺伝子を有するプラス
ミドpLF4（Inokuchi, K. et al., Nucleic Acids Res.,
10, 6957 (1982)）から得た（図13）。pLF4をPvuIIとS
tuIで切断し、末端を平滑化した後、pMW119のSmaI部位
に挿入し、プラスミドpaspCを得た。
【０１７３】asd遺伝子は、この遺伝子を有するプラス
ミドpAD20（Haziza, C. et al., EMBO, 1, 379 (198
2)）から得た。pAD20をAseIとClaIで切断し、末端を平
滑化した後、pMW118のSmaI部位に挿入し、プラスミドpa
sdを得た（図14）。
【０１７４】dapB遺伝子は、既知のdapB遺伝子のヌクレ
オチド配列（Bouvier, J. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14829 (1984)）をもとに作成した２種のオリゴヌク
レオチドプライマー（配列番号９、10）を用いたＰＣＲ
法により、E. coli W3110株染色体ＤＮＡからdapB遺伝
子を増幅することによって得た（図15）。得られた増幅
ＤＮＡ断片をAseIとDraIで切断し、末端を平滑化した
後、pMW119のSmaI部位に挿入し、プラスミドpdapBを得
た。
【０１７５】DDH遺伝子は、コリネバクテリウム グル
タミカム（Corynebacterium glutamicum）のDDH遺伝子
の既知のヌクレオチド配列（Ishino, S. et al., Nucle
ic Acids Res., 15, 3917 (1987)）をもとに作成した２
種のオリゴヌクレオチドプライマー（配列番号11、12）
を用いたＰＣＲ法により、ブレビバクテリウム ラクト
ファーメンタム ATCC13869の染色体ＤＮＡからDDH遺伝
子を増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断
片をEcoT22IとAvaIで切断し、末端を平滑化した後、pMW
119のSmaI部位に挿入し、プラスミドpDDHを得た（図1
6）。
【０１７６】lysA遺伝子は、既知のlysA遺伝子のヌクレ
オチド配列（Stragier, P. et al.,J. Mol. Biol., 16
8, 321 (1983)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレ
オチドプライマー（配列番号13、14）を用いたＰＣＲ法
により、E. coli W3110株染色体ＤＮＡからlysA遺伝子
を増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断片
をSplIとBclIで切断し、末端を平滑化した後、pMW118の
SmaI部位に挿入し、プラスミドplysAを得た（図17）。
【０１７７】上記各遺伝子がクローニングされたことの
確認は、図中に示された制限酵素で切断することにより
行った。また、これらの遺伝子のクローニングに用いた
ベクターpMW118及びpMW119（ニッポンジーン製）は、後
述するリジン生産用プラスミドの作製に使用したベクタ
ーであるRSF1010とE. coli細胞中で共存でき、安定分配
機構も持つため、選択した。
【０１７８】(6-1-2)Ｌ−リジン生合成系遺伝子を導入
したE. coliのＬ−リジン生産性 E. coli W3110(tyrA)を上記のＬ−リジン生合成系遺伝
子を含む各プラスミドで形質転換し、得られた形質転換
体を培養してＬ−リジン生産を行った。培養は以下の培
地を用い、培養温度37℃、撹拌114〜116rpmの条件下で3
0時間行った。結果を表８に示す。
【０１７９】 （培地組成） グルコース 40g/l MgSO4・7H2O 1g/l (NH4)2SO4 16g/l KH2PO4 1g/l FeSO4・7H2O 0.01g/l MnSO4・5H2O 0.01g/l Yeast Extract(Difco) 2g/l L-チロシン 0.1g/l KOH で pH7.0に調整し、115℃で10分オートクレーブ（グルコース、MgSO4・7H2 Oは別殺） 局方CaCO3 25g/l（180℃で２日間乾熱滅菌） 抗生物質（導入するプラスミドの種類に応じストレプトマイシン20mg/l、また はアンピシリン50mg/l）
【０１８０】
【表８】
【０１８１】E. coli W3110(tyrA)は、plysC*、pdapAあ
るいはpdapA*の導入でＬ−リジンを生産するようになっ
た。lysC産物、dapA産物ともにＬ−リジンによるフィー
ドバック阻害を受けることから、これらの酵素がＬ−リ
ジン生合成における主要な調節点であることは予想でき
ることである。dapA産物が触媒する反応は、Ｌ−スレオ
ニン、Ｌ−メチオニン及びＬ−イソロイシンの合成系と
Ｌ−リジン合成系との枝分かれの位置に存在し、Ｌ−リ
ジン固有の合成系の最初の段階である。野生型dapAの増
幅によってもE. coliがＬ−リジンを生産するようにな
ることは既に報告されており（Eur. J. Appl. Microbio
l. Biotechnol., 15, 227 (1982)）、それは上記の結果
からも確認された。一方、E. coliに阻害解除型遺伝子
であるdapA*を導入すると、さらにＬ−リジン収率が増
すという実施例３の結果が再確認された。
【０１８２】W3110(tyrA)、W3110(tyrA)/pdapA及びW311
0(tyrA)/pdapA*から実施例１と同様にして粗酵素液を調
製し、DDPS（ジヒドロジピコリン酸シンターゼ）活性を
測定し、さらにDDPS活性のＬ−リジンによる阻害の度合
いを調べた。結果を表９に示す。
【０１８３】
【表９】
【０１８４】阻害解除型のdapA*産物は、野生型酵素に
比べて比活性は低いが（約1/2)、阻害解除度が高いため
に、Ｌ−リジン生産に与える効果が大きいものと思わ
れ、Ｌ−リジン生産にとってdapA産物が阻害解除される
ことの必要性が示された。
【０１８５】またlysC*がＬ−リジン生産に効果がある
ことについては以下のように考えることができる。第１
の律速段階は、生合成系の枝分かれの点となる基質であ
るASA（アスパラギン酸-β-セミアルデヒド）を HD（ホ
モセリンデヒドロゲナーゼ：thrA又はmetLMの産物）とD
DPS（dapA産物）が取り合う段階であり、上記のようにd
apAを増強すると反応はＬ−リジン生合成の方向に流れ
る。一方、dapAよりさらに上流の反応に関与するlysCを
増強することによって ASAの供給量を増した場合も、HD
と DDPS が関与するいずれの反応も増進するため、Ｌ−
リジンの生産量も増加したものと考えられる。ただし、
野生型のlysCのみの増強ではこの効果はほとんど得られ
ない。その理由は、野生型AKIII(lysC産物)のＬ−リジ
ンによる阻害が、野生型DDPSのそれに比べて厳格である
ためであろう（Ｌ−リジン5mMの存在により、AKIIIはほ
ぼ100%、DDPSは80%阻害される）。
【０１８６】以上のことから、Ｌ−リジン生産効果がよ
り高いDDPSによる反応が第１律速段階であると判断し、
さらにAKIIIによる反応が第２律速段階であると推定し
た。
【０１８７】＜２＞第２律速段階の特定 dapA*が導入された株において、Ｌ−リジン生合成系の
各種遺伝子を増強し、第２律速段階の特定を行った。da
pA*を含むプラスミドを保持するE. coliに、他のプラス
ミドを導入したときに、これらのプラスミドが安定に保
持されるように、dapA*をpdapAからRSF1010に移し、RSF
24Pを得た（図７）。このdapA*を有するプラスミドRSF2
4PでE. coli W3110(tyrA)を形質転換した。
【０１８８】E. coli W3110(tyrA)/RSF24Pに、Ｌ−リジ
ン生合成系遺伝子を有するプラスミドを導入した。得ら
れた各形質転換体は、RSF24P及び他のＬ−リジン生合成
系遺伝子を含むプラスミドの２種類のプラスミドが共存
している。これらの株を、(6-1-2)と同様にしてＬ−リ
ジン生産性を調べた。結果を表10に示す。
【０１８９】
【表１０】
【０１９０】その結果、lysC*のみに顕著なＬ−リジン
生産性増強効果がみられた。野生型のlysCでは全く効果
がなく、その理由は先に述べたようにＬ−リジンによる
阻害が強いためと思われる。これによりlysC*が関与す
る反応が第２律速段階となることが確認された。
【０１９１】lysC*をRSF24Pに組み込み、RSFD80を得た
（図９）。同様に、lysCをRSF24Pに組み込み、得られた
プラスミドをRSFD1と命名した。これらのプラスミドを
E. coli W3110(tyrA)に導入し、(6-1-2)と同様に粗酵素
液を調製してAK活性及びAK活性のＬ−リジンによる阻害
の度合いを調べた。結果を表11に示す。
【０１９２】
【表１１】
【０１９３】RSF24PにlysC、lysC*を組み込むことによ
り、このプラスミドを保持する株のAKの比活性は20〜30
倍に増加した。E. coli には AK は３種類あり、lysCは
そのうちAKIIIをコードしているが、上記の実験では３
種のAKの合計の活性を測定している。野生型lysCを組み
込んだRSFD1を保持する株では、コントロール（W3110(t
yrA)/RSF24P）に比べて、AKI、AKIIに対してAKIIIが占
める割合が高いためにＬ−リジンによる阻害も高くな
り、結果としてＬ−リジン生産能増強には効果を示さな
かったと考えられる。一方、RSFD80を保持する株では、
AKIIIのほぼ100％が阻害が解除されており、これがＬ−
リジン生産の向上に寄与していることがわかった。
【０１９４】＜３＞第３律速段階の特定 次に、E. coli W3110(tyrA)/RSFD80に各種Ｌ−リジン生
合成系プラスミドを導入し、Ｌ−リジン生産培養を行っ
た。培養結果を表12に示す。
【０１９５】
【表１２】
【０１９６】dapBのみにＬ−リジン生産性増強効果がみ
られ、dapBが関与する反応が第３律速段階であることが
わかった。そこで、dapBをRSFD80に組み込み、pCAB1を
得た（図18）。このプラスミドをE. coli W3110(tyrA)
に導入し、粗酵素液を調製して、Tamir,H. and Gilvar
g,C., J.Biol.Chem.,249,3034 (1974)に記載の方法に
従って、DDPR（ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ）の
酵素活性を測定した。同様にして、RSFD80のみを保持す
る株とRSFD80とpdapBを共に保持する株から粗酵素液を
調製し、DDPR活性を測定した。結果を表13に示す。
【０１９７】
【表１３】
【０１９８】DDPR活性は、コントロール（RSFD80のみ保
持する株）に比べて、RSFD80及びpdapBを保持する株で
約３倍、RSFD80にdapBを組み込みこんだpCAB1を保持す
る株では6.5倍に増加した。Ｌ−リジンの蓄積は、W3110
(tyrA)/RSFD80+pdapB、W3110(tyrA)/pCAB1とも同等の1
0.8g/lであったことから、dapBはＬ−リジン生産には十
分量であり、律速段階は次の段階に移ったと判断した。
【０１９９】＜４＞第４律速段階の特定 次に、lysC*、dapA*及びdapBを有するプラスミドpCAB1
を用いて、第４の律速段階の特定を行った。E. coli W3
110(tyrA)/pCAB1に各種リジン生合成系プラスミドを導
入し、Ｌ−リジン生産培養を行った。培養結果を表14に
示す。
【０２００】
【表１４】
【０２０１】DDHのみにＬ−リジン生産性増強効果がみ
られ、DDHが触媒する反応が第４の律速段階となること
がわかった。また、DDH非導入株の培養ブロス中に検出
されたSDAP（N-スクシニル-L,L-α,ε-ジアミノピメリ
ン酸）が、DDH導入株の培養ブロスには検出されなかっ
た。尚、SDAPの検出はTLC展開によって行った（展開溶
媒組成 メタノール：水：10N HCl：ピリジン=80:17.5:
2.5:10）(Bouvier, J., Richaud, C., Higgins, W., Bo
gler, O. and Stragier, P. J., Bacteriol., 174,5265
(1992))。さらに、ブロスの色もDDH非導入株では茶色
であったのが、DDH導入株では黄色に変化した。そこ
で、DDHをpCAB1に組み込んだプラスミドpCABD2を作製し
（図19）、このプラスミドで形質転換したE. coli W311
0(tyrA)のDDH活性を測定した。DDH酵素活性の測定は、
文献（味園春雄 発酵と工業 45,964(1987)）に従って
行った。結果を表15に示す。
【０２０２】
【表１５】
【０２０３】E. coli には本来DDHが存在しないため、
コントロール（W3110(tyrA)/pCAB1）ではDDH活性は検出
されなかった。pCABD2保持株（W3110(tyrA)/pCABD2）の
DDHの比活性はpDDH保持株（W3110(tyrA)/pCAB1+pDDH）
の約2.5倍であるが、両株ともＬ−リジンの蓄積量は同
等（12.23g/l）であったので、pCABD2のDDH発現量は十
分量であると判断した。
【０２０４】＜５＞dapC、dapD、dapE及びdapF間の律速
段階の解析 次に、上記解析においてDDHで代替されたdapC、dapD、d
apE及びdapFの律速順位を調べるため、まずこれらの遺
伝子のクローニングを行った。dapCについては塩基配列
についての報告がないためクローン化は行わなかった
が、残り３種の遺伝子についてはPCR法にてクローニン
グを行った。
【０２０５】dapD遺伝子は、既知のdapD遺伝子のヌクレ
オチド配列（Richaud, C. et al.,J. Biol. Chem., 25
9, 14824 (1984)）をもとに作成した２種のオリゴヌク
レオチドプライマー（配列番号15、16）を用いたＰＣＲ
法により、E. coli W3110株染色体ＤＮＡからdapD遺伝
子を増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断
片をEcoO109IとSacIで切断し、末端を平滑化した後、pM
W118のSmaI部位に挿入し、プラスミドpdapDを得た（図2
0）。
【０２０６】dapE遺伝子は、既知のdapE遺伝子のヌクレ
オチド配列（Bouvier, J. et al.,J. Bacteriol., 174,
5265 (1992)）をもとに作成した２種のオリゴヌクレオ
チドプライマー（配列番号17、18）を用いたＰＣＲ法に
より、E. coli W3110株染色体ＤＮＡからdapE遺伝子を
増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ断片を
MunIとBglIIで切断し、末端を平滑化した後、pMW118のS
maI部位に挿入し、プラスミドpdapEを得た（図21）。
【０２０７】dapF遺伝子は、既知のdapF遺伝子のヌクレ
オチド配列（Richaud, C. et al.,Nucleic Acids Res.,
16, 10367 (1988)）をもとに作成した２種のオリゴヌ
クレオチドプライマー（配列番号19、20）を用いたＰＣ
Ｒ法により、E. coli W3110株染色体ＤＮＡからdapF遺
伝子を増幅することによって得た。得られた増幅ＤＮＡ
断片をPstIで切断し、末端を平滑化した後、pMW118のSm
aI部位に挿入し、プラスミドpdapFを得た（図22）。
【０２０８】上記のようにして得られた各プラスミド
を、W3110(tyrA)/pCAB1に導入し、Ｌ−リジン生産培養
を行った。先の実験で、DDHの導入前と後ではＬ−リジ
ン生産量の他、ブロスの色、中間体（SDAP）の蓄積の有
無についても変化がみられたため、これらも指標とし
て、律速段階の解析を行った。結果を表16に示す。
【０２０９】
【表１６】
【０２１０】Ｌ−リジンの生産量は、dapDあるいはdapE
の増強によって若干増加したが、DDHには及ばなかっ
た。また、DDHの導入により観察されたブロスの色の変
化と中間体であるSDAPの蓄積は各々独立の現象であり、
ブロスの色の変化はdapD、SDAPの消失はdapEに起因する
ものであることがわかった。dapEとSDAPの関係について
はＬ−リジン合成経路からみても予想のつくものであ
る。dapFの増強は、Ｌ−リジン生産性向上には効果がみ
られなかった。
【０２１１】pdapEからdapEを切り出し、pdapDに挿入し
てdapE及びdapDを共に有するプラスミドpMWdapDE1を作
製した（図23）。さらに、pMWdapDE1からdapE及びdapD
を含む断片を切り出し、これをpCAB1に挿入してpCABDE1
を作製した（図24)。pCAB1、pCABDE1あるいはpCABD2を
保持する株、及びpCABDE1とpdapFを共に保持する株を作
製し、これらの株によりＬ−リジン生産培養を行った。
結果を表17に示す。
【０２１２】
【表１７】
【０２１３】dapD、dapEを組み合わせて増強することに
より、Ｌ−リジン生産量、ブロスの色、SDAPの蓄積の有
無ともDDHの導入と同等になることがわかった。また、
さらにdapFを増強してもＬ−リジン生産性向上には効果
はなく、dapFが関与する反応は律速にはなっていないこ
とがわかった。以上の結果は、以下のように解釈でき
る。
【０２１４】pCAB1を導入した段階で中間体はSKAP（N-
スクシニル-ε-ケト-L-α-アミノピメリン酸）とSDAPの
２段階で蓄積している。これらの中間体のうちSDAPにつ
いては菌体外のブロス中に検出された。SKAPは検出され
なかったが、おそらく菌体内に蓄積していたものと考え
られる。そう考えられる理由はブロスの色である。Ｌ−
リジンを生産しない野生株（W3110(tyrA)）などではブ
ロスの色は黄色であるが、生育に負担がかかると、溶菌
などによりブロスが茶色になると考えられる。SDAPは菌
体外に排出されているため生育に対する負担は小さく、
したがって、dapDのみの増強によりSKAPが代謝されると
SDAPの蓄積量が増加するがブロスは黄色に改善したもの
と思われる。但し、dapDを増強しても、より下流のdapE
による律速が解除されないと、Ｌ−リジンの蓄積量は増
加しない。
【０２１５】＜６＞まとめ 以上の結果から、エシェリヒア属細菌において、dapA
*の導入、lysC*の導入、dapBの増強、DDH、ある
いはdapD及びdapEの増強、を行うことによって、段階的
にＬ−リジン生産性が向上することがわかった。また、
段階的にＬ−リジン生産性が向上したE. coliが得られ
た。
【０２１６】＜７＞E. coli C株におけるＬ−リジン生
合成系の律速段階の解析 上記で得られた結論が、E.coli K-12系列以外の株にお
いても適用できるかを調べるために、E. coli C株(IFO1
3891)のＬ−リジン生合成系の律速段階の解析を上記と
同様にして行った。尚、培養条件はW3110(tyrA)と同様
にして行ったが、培地にはL-チロシンを添加しなかっ
た。
【０２１７】（１）第一律速段階の特定 Ｌ−リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドで形質転換
したE. coli C株(IFO13891)をＬ−リジン生産培地で培
養し、Ｌ−リジン塩酸塩の生産量を測定した。結果を表
18に示す。
【０２１８】
【表１８】
【０２１９】W3110(tyrA)の場合と同様に、C株において
も野生型dapA、さらに阻害解除型dapA*の導入により、
Ｌ−リジンを培地中に蓄積するようになった。lysC
*は、Ｌ−リジン生産性に効果がなかった。
【０２２０】（２）第２律速段階の特定 E. coli C株にdapA*を含むプラスミドRSF24Pを導入し、
さらにＬ−リジン生合成系遺伝子を含むプラスミドを導
入し、得られた形質転換体をＬ−リジン生産培地で培養
し、Ｌ−リジン塩酸塩の生産量を測定した。結果を表19
に示す。
【０２２１】
【表１９】
【０２２２】dapA*を導入したC株でも、Ｌ−リジン生産
性向上に効果があるのはlysC*であり、lysC*が関与する
反応が第２律速段階であることがわかった。
【０２２３】（３）第３律速段階の特定 E. coli C株にdapA*及びlysC*を含むプラスミドRSFD80
を導入し、さらにＬ−リジン生合成系遺伝子を含むプラ
スミドを導入し、得られた形質転換体をＬ−リジン生産
培地で培養し、Ｌ−リジン塩酸塩の生産量を測定した。
結果を表20に示す。
【０２２４】
【表２０】
【０２２５】W3110株同様に、dapBのみにＬ−リジン生
産性向上に効果があり、第３律速段階であることがわか
った。
【０２２６】（４）第４律速段階の特定 E. coli C株にdapA*、lysC*及びdapBを含むプラスミドp
CAB1を導入し、さらにＬ−リジン生合成系遺伝子を含む
プラスミドを導入し、得られた形質転換体をＬ−リジン
生産培地で培養し、Ｌ−リジン塩酸塩の生産量を測定し
た。結果を表21に示す。
【０２２７】
【表２１】
【０２２８】W3110株同様に、DDHのみにＬ−リジン生産
性向上に効果があり、第４律速段階であることがわかっ
た。
【０２２９】（５）dapC、dapD、dapE及びdapF間の律速
段階の解析 pCAB1を保持するE. coli C株に、DDHの代わりにdapD、d
apEあるいはdapF遺伝子を有するプラスミドを導入し、
Ｌ−リジン生産培養を行った。結果を表22に示す。
【０２３０】
【表２２】
【０２３１】C株においても、W3110株同様にdapD及びda
pEの２段階が律速となっていることがわかった。
【０２３２】以上のように K-12、Cと系列の異なる株で
も同様の律速順位であったことから、dapA*、lysC*の導
入、dapB、DDH（又はdapD及びdapE）の増強をこの順に
行うことによって、Ｌ−リジン生産性を段階的に向上さ
せることができるという概念は、E. coli全般に適用で
きるものと思われる。
【０２３３】
【発明の効果】本発明により、Ｌ−リジンによるフィー
ドバック阻害が十分に解除されたエシェリヒア属細菌由
来のＤＤＰＳ変異遺伝子が得られた。この遺伝子を、Ｌ
−リジンによるフィードバック阻害が解除されたアスパ
ルトキナーゼを保持するエシェリヒア属細菌に導入する
ことにより、従来よりもさらに改良されたＬ−リジン生
産菌を得ることができた。
【０２３４】さらに、上記Ｌ−リジン生産菌のdapB、DD
H（又はdapD及びdapE）をこの順に増強することによ
り、Ｌ−リジン生産性を段階的に向上させることができ
る。
【０２３５】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGCAACTAC TGACATGACG 20 配列番号：２ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTAAGCCAT CAAATCTCCC 20 配列番号：３ 配列の長さ：1197 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名：MC1061 配列の特徴 特徴を表す記号：prim transcript 存在位置：248 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：CDS 存在位置：272..1150 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：primer bind 存在位置：27..46 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：primer bind 存在位置：1156..1175 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：RBS 存在位置：261..265 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 CCAGGCGACT GTCTTCAATA TTACAGCCGC AACTACTGAC ATGACGGGTG ATGGTGTTCA 60 CAATTCCACG GCGATCGGCA CCCAACGCAG TGATCACCAG ATAATGTGTT GCGATGACAG 120 TGTCAAACTG GTTATTCCTT TAAGGGGTGA GTTGTTCTTA AGGAAAGCAT AAAAAAAACA 180 TGCATACAAC AATCAGAACG GTTCTGTCTG CTTGCTTTTA ATGCCATACC AAACGTACCA 240 TTGAGACACT TGTTTGCACA GAGGATGGCC C ATG TTC ACG GGA AGT ATT GTC 292 Met Phe Thr Gly Ser Ile Val 1 5 GCG ATT GTT ACT CCG ATG GAT GAA AAA GGT AAT GTC TGT CGG GCT AGC 340 Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser 10 15 20 TTG AAA AAA CTG ATT GAT TAT CAT GTC GCC AGC GGT ACT TCG GCG ATC 388 Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile 25 30 35 GTT TCT GTT GGC ACC ACT GGC GAG TCC GCT ACC TTA AAT CAT GAC GAA 436 Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser Ala Thr Leu Asn His Asp Glu 40 45 50 55 CAT GCT GAT GTG GTG ATG ATG ACG CTG GAT CTG GCT GAT GGG CGC ATT 484 His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile 60 65 70 CCG GTA ATT GCC GGG ACC GGC GCT AAC GCT ACT GCG GAA GCC ATT AGC 532 Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser 75 80 85 CTG ACG CAG CGC TTC AAT GAC AGT GGT ATC GTC GGC TGC CTG ACG GTA 580 Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly Ile Val Gly Cys Leu Thr Val 90 95 100 ACC CCT TAC TAC AAT CGT CCG TCG CAA GAA GGT TTG TAT CAG CAT TTC 628 Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe 105 110 115 AAA GCC ATC GCT GAG CAT ACT GAC CTG CCG CAA ATT CTG TAT AAT GTG 676 Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val 120 125 130 135 CCG TCC CGT ACT GGC TGC GAT CTG CTC CCG GAA ACG GTG GGC CGT CTG 724 Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu 140 145 150 GCG AAA GTA AAA AAT ATT ATC GGA ATC AAA GAG GCA ACA GGG AAC TTA 772 Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 ACG CGT GTA AAC CAG ATC AAA GAG CTG GTT TCA GAT GAT TTT GTT CTG 820 Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu Val Ser Asp Asp Phe Val Leu 170 175 180 CTG AGC GGC GAT GAT GCG AGC GCG CTG GAC TTC ATG CAA TTG GGC GGT 868 Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly 185 190 195 CAT GGG GTT ATT TCC GTT ACG ACT AAC GTC GCA GCG CGT GAT ATG GCC 916 His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn Val Ala Ala Arg Asp Met Ala 200 205 210 215 CAG ATG TGC AAA CTG GCA GCA GAA GAA CAT TTT GCC GAG GCA CGC GTT 964 Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu His Phe Ala Glu Ala Arg Val 220 225 230 ATT AAT CAG CGT CTG ATG CCA TTA CAC AAC AAA CTA TTT GTC GAA CCC 1012 Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro 235 240 245 AAT CCA ATC CCG GTG AAA TGG GCA TFT AAG GAA CTG GGT CTT GTG GCG 1060 Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala 250 255 260 ACC GAT ACG CTG CGC CTG CCA ATG ACA CCA ATC ACC GAC AGT GGT CGT 1108 Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg 265 270 275 GAG ACG GTC AGA GCG GCG CTT AAG CAT GCC GGT TTG CTG T AAAGTTTAGG 1158 Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His Ala Gly Leu Leu 280 285 290 GAGATTTGAT GGCTTACTCT GTTCAAAAGT CGCGCCTGG 1197 配列番号：４ 配列の長さ：292 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys 1 5 10 15 Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val 20 25 30 Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser 35 40 45 Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu 50 55 60 Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn 65 70 75 80 Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly 85 90 95 Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln 100 105 110 Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu 115 120 125 Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu 130 135 140 Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile 145 150 155 160 Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu 165 170 175 Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Thr Asn 195 200 205 Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Glu 210 215 220 His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His 225 230 235 240 Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys 245 250 255 Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr 260 265 270 Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His 275 280 285 Ala Gly Leu Leu 290 配列番号：５ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTCCCTTGT GCCAAGGCTG 20 配列番号：６ 配列の長さ：18 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAATTCCTTT GCGAGCAG 18 配列番号：７ 配列の長さ：2147 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 生物名：エシェリヒア・コリ(Escherichia coli) 株名：MC1061 配列の特徴 特徴を表す記号：-35 signal 存在位置：242..249 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：-10 signal 存在位置：265..273 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：primer bind 存在位置：536..555 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：primer bind 存在位置：2128..2147 特徴を決定した方法：Ｅ 特徴を表す記号：RBS 存在位置：575..578 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：CDS 存在位置：584..1933 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：terminator 存在位置：1941..1968 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 TCGAAGTGTT TCTGTAGTGC CTGCCAGGCA GCGGTCTGCG TTGGATTGAT GTTTTTCATT 60 AGCAATACTC TTCTGATTTT GAGAATTGTG ACTTTGGAAG ATTGTAGCGC CAGTCACAGA 120 AAAATGTGAT GGTTTTAGTG CCGTTAGCGT AATGTTGAGT GTAAACCCTT AGCGCAGTGA 180 AGCATTTATT AGCTGAACTA CTGACCGCCA GGAGTGGATG AAAAATCCGC ATGACCCCAT 240 CGTTGACAAC CGCCCCGCTC ACCCTTTATT TATAAATGTA CTACCTGCGC TAGCGCAGGC 300 CAGAAGAGGC GCGTTGCCCA AGTAACGGTG TTGGAGGAGC CAGTCCTGTG ATAACACCTG 360 AGGGGGTGCA TCGCCGAGGT GATTGAACGG CTGGCCACGT TCATCATCGG CTAAGGGGGC 420 TGAATCCCCT GGGTTGTCAC CAGAAGCGTT CGCAGTCGGG CGTTTCGCAA GTGGTGGAGC 480 ACTTCTGGGT GAAAATAGTA GCGAAGTATC GCTCTGCGCC CACCCGTCTT CCGCTCTTCC 540 CTTGTGCCAA GGCTGAAAAT GGATCCCCTG ACACGAGGTA GTT ATG TCT GAA ATT 595 Met Ser Glu Ile 1 GTT GTC TCC AAA TTT GGC GGT ACC AGC GTA GCT GAT TTT GAC GCC ATG 643 Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp Phe Asp Ala Met 5 10 15 20 AAC CGC AGC GCT GAT ATT GTG CTT TCT GAT GCC AAC GTG CGT TTA GTT 691 Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn Val Arg Leu Val 25 30 35 GTC CTC TCG GCT TCT GCT GGT ATC ACT AAT CTG CTG GTC GCT TTA GCT 739 Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu Val Ala Leu Ala 40 45 50 GAA GGA CTG GAA CCT GGC GAG CGA TTC GAA AAA CTC GAC GCT ATC CGC 787 Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu Asp Ala Ile Arg 55 60 65 AAC ATC CAG TTT GCC ATT CTG GAA CGT CTG CGT TAC CCG AAC GTT ATC 835 Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr Pro Asn Val Ile 70 75 80 CGT GAA GAG ATT GAA CGT CTG CTG GAG AAC ATT ACT GTT CTG GCA GAA 883 Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr Val Leu Ala Glu 85 90 95 100 GCG GCG GCG CTG GCA ACG TCT CCG GCG CTG ACA GAT GAG CTG GTC AGC 931 Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp Glu Leu Val Ser 105 110 115 CAC GGC GAG CTG ATG TCG ACC CTG CTG TTT GTT GAG ATC CTG CGC GAA 979 His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu Ile Leu Arg Glu 120 125 130 CGC GAT GTT CAG GCA CAG TGG TTT GAT GTA CGT AAA GTG ATG CGT ACC 1027 Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys Val Met Arg Thr 135 140 145 AAC GAC CGA TTT GGT CGT GCA GAG CCA GAT ATA GCC GCG CTG GCG GAA 1075 Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala Ala Leu Ala Glu 150 155 160 CTG GCC GCG CTG CAG CTG CTC CCA CGT CTC AAT GAA GGC TTA GTG ATC 1123 Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu Gly Leu Val Ile 165 170 175 180 ACC CAG GGA TTT ATC GGT AGC GAA AAT AAA GGT CGT ACA ACG ACG CTT 1171 Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg Thr Thr Thr Leu 185 190 195 GGC CGT GGA GGC AGC GAT TAT ACG GCA GCC TTG CTG GCG GAG GCT TTA 1219 Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Ala Leu 200 205 210 CAC GCA TCT CGT GTT GAT ATC TGG ACC GAC GTC CCG GGC ATC TAC ACC 1267 His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro Gly Ile Tyr Thr 215 220 225 ACC GAT CCA CGC GTA GTT TCC GCA GCA AAA CGC ATT GAT GAA ATC GCG 1315 Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile Asp Glu Ile Ala 230 235 240 TTT GCC GAA GCG GCA GAG ATG GCA ACT TTT GGT GCA AAA GTA CTG CAT 1363 Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala Lys Val Leu His 245 250 255 260 CCG GCA ACG TTG CTA CCC GCA GTA CGC AGC GAT ATC CCG GTC TTT GTC 1411 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile Pro Val Phe Val 265 270 275 GGC TCC AGC AAA GAC CCA CGC GCA GGT GGT ACG CTG GTG TGC AAT AAA 1459 Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu Val Cys Asn Lys 280 285 290 ACT GAA AAT CCG CCG CTG TTC CGC GCT CTG GCG CTT CGT CGC AAT CAG 1507 Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu Arg Arg Asn Gln 295 300 305 ACT CTG CTC ACT TTG CAC AGC CTG AAT ATG CTG CAT TCT CGC GGT TTC 1555 Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His Ser Arg Gly Phe 310 315 320 CTC GCG GAA GTT TTC GGC ATC CTC GCG CGG CAT AAT ATT TCG GTA GAC 1603 Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn Ile Ser Val Asp 325 330 335 340 TTA ATC ACC ACG TCA GAA GTG AGC GTG GCA TTA ACC CTT GAT ACC ACC 1651 Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr Leu Asp Thr Thr 345 350 355 GGT TCA ACC TCC ACT GGC GAT ACG TTG CTG ACG CAA TCT CTG CTG ATG 1699 Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln Ser Leu Leu Met 360 365 370 GAG CTT TCC GCA CTG TGT CGG GTG GAG GTG GAA GAA GGT CTG GCG CTG 1747 Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu Gly Leu Ala Leu 375 380 385 GTC GCG TTG ATT GGC AAT GAC CTG TCA AAA GCC TGC GGC GTT GGC AAA 1795 Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys Gly Val Gly Lys 390 395 400 GAG GTA TTC GGC GTA CTG GAA CCG TTC AAC ATT CGC ATG ATT TGT TAT 1843 Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg Met Ile Cys Tyr 405 410 415 420 GGC GCA TCC AGC CAT AAC CTG TGC TTC CTG GTG CCC GGC GAA GAT GCC 1891 Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro Gly Glu Asp Ala 425 430 435 GAG CAG GTG GTG CAA AAA CTG CAT AGT AAT TTG TTT GAG TAAATACTGT 1940 Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe Glu 440 445 ATGGCCTGGA AGCTATATTT CGGGCCGTAT TGATTTTCTT GTCACTATGC TCATCAATAA 2000 ACGAGCCTGT ACTCTGTTAA CCAGCGTCTT TATCGGAGAA TAATTGCCTT TAATTTTTTT 2060 ATCTGCATCT CTAATTAATT ATCGAAAGAG ATAAATAGTT AAGAGAAGGC AAAATGAATA 2120 TTATCAGTTC TGCTCGCAAA GGAATTC 2147 配列番号：８ 配列の長さ：449 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp 1 5 10 15 Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn 20 25 30 Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu 35 40 45 Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu 50 55 60 Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr 65 70 75 80 Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr 85 90 95 Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp 100 105 110 Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu 115 120 125 Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys 130 135 140 Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala 145 150 155 160 Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu 165 170 175 Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg 180 185 190 Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu 195 200 205 Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro 210 215 220 Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile 225 230 235 240 Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala 245 250 255 Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile 260 265 270 Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu 275 280 285 Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu 290 295 300 Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His 305 310 315 320 Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn 325 330 335 Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr 340 345 350 Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln 355 360 365 Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu 370 375 380 Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys 385 390 395 400 Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg 405 410 415 Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro 420 425 430 Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe 435 440 445 Glu 配列番号：９ 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTTTCACTGA TATCCCTCCC 20 配列番号：10 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAAAAGTGGA CCAAATGGTC 20 配列番号：11 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CATCTAAGTA TGCATCTCGG 20 配列番号：12 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCCCCTCGA GCTAAATTAG 20 配列番号：13 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TGCACGGTAG GATGTAATCG 20 配列番号：14 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTAATGAAAC AAATGCCCGG 20 配列番号：15 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTTATTCATA ATTGCCACCG 20 配列番号：16 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CACGGTAATA CATATAACCG 20 配列番号：17 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCTGCAATTG TCAAACGTCC 20 配列番号：18 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTCGACGCGC TTGAGATCTT 20 配列番号：19 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCATAAAGAG TCGCTAAACG 20 配列番号：20 配列の長さ：20 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAACCGCCCG GTCATCAAGC 20
【図面の簡単な説明】
【図１】pdapA1とpdapA2の製造工程を示す図である。
【図２】野生型及び変異型ＤＤＰＳのＬ−リジンによる
阻害を示す図である。
【図３】二重変異型dapA*遺伝子を有するプラスミドpda
pAS824の製造工程を示す図である。
【図４】pLYSC1とpLYSC2の製造工程を示す図である。
【図５】ヒドロキシルアミン処理後の形質転換体の出現
率と変異率を示す図である。
【図６】野生型及び変異型ＡＫIIIのＬ−リジンによる
阻害を示す図である。
【図７】dapA*24を有するRSF1010由来のプラスミドRSF2
4Pの製造工程を示す図である。
【図８】プラスミドｐＬＬＣ*８０の製造工程を示す図
である。
【図９】dapA*24及びlysC*80を有するRSF1010由来のプ
ラスミドRSFD80の製造工程を示す図である。
【図１０】dapA又はdapA*を有するプラスミドpdapA及び
pdapA*の構造を示す図である。
【図１１】lysC又はlysC*80を有するプラスミドplysC及
びplysC*の構造を示す図である。
【図１２】ppcを有するプラスミドpppcの構造を示す図
である。
【図１３】aspCを有するプラスミドpaspCの構造を示す
図である。
【図１４】asdを有するプラスミドpasdの構造を示す図
である。
【図１５】dapBを有するプラスミドpdapBの構造を示す
図である。
【図１６】DDHを有するプラスミドpDDHの構造を示す図
である。
【図１７】lysAを有するプラスミドplysAの構造を示す
図である。
【図１８】dapA*24、lysC*80及びdapBを有するRSF1010
由来のプラスミドpCAB1の製造工程を示す図である。
【図１９】dapA*24、lysC*80、dapB及びDDHを有するRSF
1010由来のプラスミドpCABD2の製造工程を示す図であ
る。
【図２０】dapDを有するプラスミドpdapDの構造を示す
図である。
【図２１】dapEを有するプラスミドpdapEの構造を示す
図である。
【図２２】dapFを有するプラスミドpdapFの構造を示す
図である。
【図２３】dapD及びdapEを有するプラスミドpMWdapDE1
の製造工程を示す図である。
【図２４】dapA*24、lysC*80、dapB、dapD及びdapEを有
するプラスミドpCABDE1の製造工程を示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 佐野 孝之輔 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社中央研究所内

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を
    受けないジヒドロジピコリン酸合成酵素をコードするＤ
    ＮＡが細胞内に導入されて形質転換され、かつＬ−リジ
    ンによるフィードバック阻害を受けないアスパルトキナ
    ーゼを保持し、かつジヒドロジピコリン酸レダクターゼ
    遺伝子が増強されたことを特徴とするエシェリヒア属細
    菌。
  2. 【請求項２】 ジヒドロジピコリン酸合成酵素が、Ｌ−
    リジンによるフィードバック阻害が解除される変異を有
    するジヒドロジピコリン酸合成酵素であり、Ｌ−リジン
    によるフィードバック阻害が解除される変異が、配列表
    の配列番号４に記載されるジヒドロジピコリン酸合成酵
    素のアミノ酸配列中、Ｎ−末端から８１番目のアラニン
    残基をバリン残基に置換させる変異、１１８番目のヒス
    チジン残基をチロシン残基に置換させる変異、８１番目
    のアラニン残基をバリン残基に置換させかつ１１８番目
    のヒスチジン残基をチロシン残基に置換させる変異より
    なる群から選ばれることを特徴とする請求項１記載のエ
    シェリヒア属細菌。
  3. 【請求項３】 Ｌ−リジンによるフィードバック阻害を
    受けないアスパルトキナーゼをコードするＤＮＡが細胞
    内に導入されたことにより、Ｌ−リジンによるフィード
    バック阻害を受けないアスパルトキナーゼを保持するこ
    とを特徴とする請求項１または２記載のエシェリヒア属
    細菌。
  4. 【請求項４】 アスパルトキナーゼが、Ｌ−リジンによ
    るフィードバック阻害が解除される変異を有するエシェ
    リヒア属細菌由来のアスパルトキナーゼIIIであり、ア
    スパルトキナーゼIIIのＬ−リジンによるフィードバッ
    ク阻害が解除される変異が、配列表の配列番号８に記載
    されるアスパルトキナーゼIIIのアミノ酸配列中、Ｎ−
    末端から３２３番目のグリシン残基をアスパラギン酸残
    基に置換させる変異、３２３番目のグリシン残基をアス
    パラギン酸残基に置換させかつ４０８番目のグリシン残
    基をアスパラギン酸残基に置換させる変異、３４番目の
    アルギニン残基をシステイン残基に置換させかつ３２３
    番目のグリシン残基をアスパラギン酸残基に置換させる
    変異、３２５番目のロイシン残基をフェニルアラニン残
    基に置換させる変異、３１８番目のメチオニン残基をイ
    ソロイシン残基に置換させる変異、３１８番目のメチオ
    ニン残基をイソロイシン残基に置換させかつ３４９番目
    のバリン残基をメチオニン残基に置換させる変異、３４
    ５番目のセリン残基をロイシン残基に置換させる変異、
    ３４７番目のバリン残基をメチオニン残基に置換させる
    変異、３５２番目のスレオニン残基をイソロイシン残基
    に置換させる変異、３５２番目のスレオニン残基をイソ
    ロイシン残基に置換させかつ３６９番目のセリン残基を
    フェニルアラニン残基に置換させる変異、１６４番目の
    グルタミン酸残基をリジン残基に置換させる変異、４１
    ７番目のメチオニン残基をイソロイシン残基に置換させ
    かつ４１９番目のシステイン残基をチロシン残基に置換
    させる変異、よりなる群から選ばれることを特徴とする
    請求項３記載のエシェリヒア属細菌。
  5. 【請求項５】 ジヒドロジピコリン酸レダクターゼ遺伝
    子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベクタ
    ーに連結されてなる組換えＤＮＡで形質転換された請求
    項１〜４のいずれか一項に記載のエシェリヒア属細菌。
  6. 【請求項６】 増強されたジアミノピメリン酸デヒドロ
    ゲナーゼ遺伝子が導入された請求項１〜５のいずれか一
    項に記載のエシェリヒア属細菌。
  7. 【請求項７】 ジアミノピメリン酸デヒドロゲナーゼ遺
    伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能なベク
    ターに連結されてなる組換えＤＮＡで形質転換された請
    求項６記載のエシェリヒア属細菌
  8. 【請求項８】 テトラヒドロジピコリン酸スクシニラー
    ゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラー
    ゼ遺伝子が増強された請求項１〜５のいずれか一項に記
    載のエシェリヒア属細菌。
  9. 【請求項９】 テトラヒドロジピコリン酸スクシニラー
    ゼ遺伝子及びスクシニルジアミノピメリン酸デアシラー
    ゼ遺伝子がエシェリヒア属細菌細胞内で自律複製可能な
    同一又は異なるベクターに連結されてなる単一の組換え
    ＤＮＡ、又は２つの組換えＤＮＡで形質転換された請求
    項８記載のエシェリヒア属細菌。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか一項に記載の
    エシェリヒア属細菌を好適な培地で培養し、該培養物中
    にＬ−リジンを生産蓄積せしめ、該培養物からＬ−リジ
    ンを採取することを特徴とするＬ−リジンの製造法。
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