KR920008382B1 - 재조합 대장균에 의한 라이신 제조방법 - Google Patents

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Description

재조합 대장균에 의한 라이신 제조방법

제1도는 pDHDP 5812의 유전자 지도 및 이의 제작단계를 나타낸 것이다.

본 발명은 라이신 생산균주인 코네박테리움 글루타미쿰 CS 755(KFCC 10672)의 dap A 유전자를 대장균 숙주를 사용하여 크로닝하고, 코리네박테리움 및 대장균에서 발현되는 셔틀벡터인 pECCG 117에 도입하여 이를 대장균에서 발현시킴으로써 라이신을 고농도로 생산함을 특징으로 한다.

라이신은 필수아미노산의 한 종류로써 산업적으로 주로 코리네박테리움 글루타미쿰, 브레비박테리움 프라붐 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀등의 균주에 의해 생산되어지고 있다. 따라서 이들 균주의 생산성을 증가시키기 위해 라이신 생합성에 관여하는 각 효소들에 대한 제어 기작에 대해 연구가 많이 보고되고 있다. 그러나 대장균을 사용한 라이신 생산균주의 개발은 극히 미비한 실정이다.

일반적으로 아미노산을 대량으로 축적하는 균주를 개발하는 방법은 특정 아미노산을 생합성하는데 관여하는 효소의 대사조절 기구가 변형된 변이주를 선별하거나 곁가지로 빠지는 생합성 단계가 차단된 영양요구성 균주를 사용하는 것이다. 또 다른 가능한 방법은, 일반적으로 유전자의 발현에 어떤 제한효소가 없다면 유전자의 복제수가 증가함에 따라 효소의 합성도 증가하게 되므로, 결국 특정 아미노산의 합성에 있어서 율속단계에 관여하는 유전자의 복제수의 증가를 통해 원하는 산물을 양산하는 것이다.

브레비박테리움 프라붐에서 라이신 생합성에 관여하는 아스파토카이네이즈가 하나인 것과 달리 대장균에 서는 3종류에 존재한다. 이들은 각각 라이신에 의해 저해작용을 받는 아스파토카이네이즈 III, 메치오닌에 의해 합성저해를 받는 아스파토카이네이즈 II, 및 스레오닌에 의해 저해작용을 받는 아스파토카네이즈 I이다. 따라서 라이신 생산균주를 얻기 위해서는 이 3종류의 효소에 대해 전해기작이 해제된 균주를 얻는 것이 필요하다. 또한 대장균의 경우 라이신 생합성 단계중 아스파테이트-β-세미알데하이드로부터 다이하이드록시 다이피메릭산을 합성하는데 관여하는 효소인 다이하이드로 다이피코리네이트 신세타제(L-2,3-dihydrodipicolinate synthetase)가 라이신에 의해 저해를 받는 것으로 알려지고 있다.

본 발명자들은 라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755(KFCC:10672)의 dap A 유전자((L-2,3-dihydrodipicolinate synthetase)를 함유한 셔틀벡터 pECCG 117이 대장균에 발현되고 이 효소의 활성이 라이신에 의해 저해받지 않음을 발견하였다. 또한 이 프라스미드를 발현시켜 라이신 생산을 획기적으로 향상시킬 수 있는 대장균 숙주계를 수년간 광범위하게 연구한 결과, 메치오닌, 아이소루이신 영양 요구성 및 스레오닌 아나로그 내성, 라이신 아니로그 내성 대장균에 재조합 유전자 pDHDP 5812를 도입, 발현시킴으로써 라이신의 생산을 숙주에 비해 4배 이상 증가된 재조합 라이신 생산 대장균을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서 본 발명은 사료용, 의약용 및 화학공업 분야에 유용한 라이신의 제조분야에 관한 것이다. 제1도는 pDHDP 5812의 유전자 지도를 나타내고 있으며 각 제한효소의 절단부위를 표시하고 있다. 도면에서 굵은 실선부분은 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자, 실선 부분은 코리네박테리움/대장균 셔틀벡터 pECCG 117단편을 나타낸 것이다. 프라스미드의 크기는 킬로염기(kb)로 표시한다.

본 발명을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

대장균(Escherichia coli W3110)을 사용하여 라이신 생산 균주를 개발하기 위해 자외선 조사나 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘을 변이원으로하여 변이처리를 하였다. 잘 성장시킨 대수기의 대장균을 0.1몰 마그네슘 설페이트 용액에 현탁시키고 자외선을 3O초 내지 180초간 조사하여 변이처리하거나 0.1몰 포스페이트 완충용액(pH 7.0)혹은 0.1몰 사이트레이트 완충액(pH 5.5)에 현탁시키고 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소 구아니딘을 최종농도가 200-500㎍/ml가 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 10분 내지 30분간 처리하여 변이를 유발시켰다.

그 다음에 스레오닌 아나로그 및 라이신 아나로그를 1-20g/1의 농도로 첨가한 최소평판 한천배지에서 변이처리한 균체액을 도말하여 37℃에서 수일 배양하여 아나로그 내성균주들을 얻었다.

경우에 따라서는 변이처리후 아미노산이 적절히 첨가된 최소 배지에서 발현시키거나 페니실린 G를 2000유니트/ml-10000유니트/ml되게 처리하여 0.1몰 마그네슘 설페이트 및 20% 슈크로오즈 용액으로 구성된 하이퍼토닉(hypertonic)최소배지에서 집적(enrichment)배양한 후 원하는 평판배지에 도말하여 군락을 얻었다. 이를 최소배지인 M9 배지외 특정 아미노산이 첨가된 M9한천 평판 배지에 재도말하여 양양요구주를 선별하였다. 선별된 균주를 액체배양에서 상대적인 성장속도 및 효소의 역가를 측정하여 균주의 특성을 확인하였다.

M9 배지의 조성(/1) : 포도당 5g, Na₂HPO₄·7H₂O 12.8g, KH₂PO₄3g, NaCl 0.5g, NH₄Cl 1g

변이처리하여 얻은 균주들은 호기적 조건(진탕배양 : 250-300rpm, pH 5-8, 33-37℃의 온도 조건하에서 48-72시간 배양하여 라이신을 제조하였다.

발효배지의 조성(/1) : 포도당 30-70g, 황산암모니움 10g, KH₂PO₄2g NgSO₄·7H₂O 1g, FeSO₄·7H₂O 10mg, MnSO₄·7H₂O 10mg, CaCO₃20g, 효모엑기스 2g, 필요아미노산 50-400mg

배양후 라이신은 염산염을 기준으로 공지의 산성 닌히드린법(acidic ninhydrin)이나 HPLC로 분석했으며, 배양액의 아미노산 농도는 아미노산 자동분석기로 정량 분석하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자의 크로닝 및 셔틀벡터에의 도입에 대해 좀더 상세히 설명하면 다음과 같다.

코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755를 초기 휴지기까지 키운 뒤 세포를 거둬 10mM Tris-HCl(pH 8.0)으로 세척한 뒤 세포 침전물을 -70℃에서 냉동시켰다. 이를 해동시킨 뒤 40ml의 라이소자임(lysozyme)용액(10mM Tris-HCl 50mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5M 슈크로오즈, 5mg/ml 라이소자임)에 현탁시키고 37℃에서 약 1.5시간 처리하였다. 세포를 원심분리하여 거둔 뒤 10ml의 슈크로오즈와 라이소자임이 빠진 라이소자임 완충용액에 현탁시키고 0.5M EDTA를 0.6ml, 4% SDS를 4.4ml 넣어 세포를 분해시켰다. 세포가 완전히 분해되지 않으면 60℃수조에서 세포현탁액을 가볍게 흔들어 주면서 완전히 분해시켰다.

여기에 CsCl을 ml당 0.96g이 되게 가하고 2ml의 에티드움 브로마이드 용액(10mg/ml)을 넣어 섞어 주었다. 초고속 원심분리기(Backman 70.1 Ti rotor)을 사용하여 15℃에서 50000rpm으로 48시간 원심분리시킨 뒤 직경이 큰 주사기 바늘을 사용하여 크로모좀을 취했다. 아이소프로판올(isopropanol)로 3-4회 에티디움 브로마이드를 추출해 낸 후 TE완충용액(10mM Tris-HCl, 1mM DETA)하에서 3회 완충용액을 바꿔가면 24시간 투석한 뒤 다음 실험에 사용하였다. 얻은 코리네박테리움 글루타미쿰 CS-755 크로모좀 DNA(chromosomal DNA)를 제한 효소 Sau3A로 부분절단(partial digestion)시킨 뒤 저융점 아가로스 젤(low melting temperature agarose gel)에서 전기영동한 뒤 30-50kb크기의 유전자 단편을 취하였다. 이를 68℃에서 10분간 가열하여 젤을 녹인 뒤 동일부피의 Tris-HCl 포화페놀을 넣고 섞어준 뒤 12000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 다시 크로로포름 처리 및 에탄올을 침전을 시켜 30-50kb크기의 유전자 단편을 취하였다. 제1도에 나타낸 것과 같이 코즈미드벡터인 pHC 79를 제한효소 BamHI으로 절단하고 카프 인테스틴 포스파타제(calf intestine phosphatase)를 처리한 뒤 30-50kb DNA 절편과 T4 DNA 리가제(T4 DNA ligase)로 접합시키고 in vitro 페케이지(in vitro package)후 대장균 숙주 NM 554(r-,m+)에 감염시켜 5×10⁵이상의 엠피실린 내성 콜로니(colony)를 획득하였다. 이들 콜로이드로부터 프리즈미드(plasmid)를 분리한 뒤 dap A숙주인 대장균 AT 997에 감염(infection)시켜 12개의 클론(clone)을 LB Amp 한천 평판배지에서 얻었다. 이를 서브크로닝하여 4.5kb 크기의 dap A유전자의 크로닝을 완성하였다.

이상에서 언급한 방법에 의해 크로닝된 dap A 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰/대장균 셔틀벡터인 pECCG 117에 도입하거나 발현되는 각종의 프라즈미드에 도입 후 라이신 생산 대장균 숙주에 도입하여 라이신 생산을 증가시킬 수 있다. 좀더 상세한 내용은 실시예에서 설명하였다.

본 발명에서 사용되거나 개발된 균주 및 프라즈미드는 표1과 같다. 또한 pDHDP 5812를 지닌 재조합 대장균 균주 TF1/pDHDP 5812는 1990년 12월 27일자로 한국 종균협회에 기탁하였다(KFCC 10719).

[표 1]

Km, 카나마이신 ; Ap, 엠피실린 ; AEC, S-(2-아미노에틸)-L-시스테인 ; AHV, α-아미노-β-하이드록시 발레릭산

또한 효소역가를 측정하기 위해 배양시에는 LB배지(1% 트립톤, 5% 효모액기스, 1% NaCl, pH 7.0)를 사용했으며 칼슘 크로라이드를 사용한 형질전환 및 전기장 충격법(electroporation)에 의한 형질전환 후 발현시에는 SOC 배지(2% 트립톤,0.5% 효모엑기스, 10mM NaCl, 2.5mM KCl, 10mM MgCl₂, 10mM MgSO₄, 20mM 포도당)을 각각 사용하였다. 또한 필요한 경우에는 엠피실린, 카나마이신을 50㎍/ml의 농도가 되도록 첨가하여 사용하였다. 전기장 충격법에 의한 대장균의 형질 전환에는 BIO-RAD사 제품의 진펄서(Gene pulser, 165-2076), 펄스조절기(Pulse controller, 165-2098), 0.2cm 간극의 진 펄서 큐벳(Gene pulser cuvette, 165-2086)을 사용하였다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 상세히 설명한다. 그러나 이 실시예들은 본 발명의 이해를 돕기 위한 예도를 본 발명의 내용을 제한하는 것은 아니다.

[실시예 1]

야생균주인 대장균 W3110을 0.1몰 마그네슘 설페이트 용액에 10⁷-10⁸세포/ml로 현탁시켜 자외선을 30초 내지 180초간 조사하여 변이처리하거나 포스페이트 완충액(pH 7.0)혹은 사이트레이트 완충액(pH 5.5)에 10⁷-10⁸세포/ml로 현탁시킨 다음, N-메틸-N-니트로-N-니트로소구아니딘을 최종농도가 200-500㎍/㎖이 되도록 첨가하고 실온 혹은 32℃에서 10분 내지 30분 처리하여 여러 종류의 영양요구성, 대사조절 변이균주들을 얻었다(표 1참조), 250ml 플라스크에 발효배지 20ml와 필요한 아미노산을 50-400㎍/ml되게 첨가한 뒤 균을 1백금이 접종하여 48-72시간 배양한 다음, 축적된 스레오닌 및 라이신을 분석하여 표2에 나타내었다.

본 발명에서 개발한 상기의 균주들은 라이신 생합성에 중요한 효소중 하나인 아스파토카이네이즈의 활성이 발효 산물에 의해 저해받거나 생합성이 억제받는 것을 해제시킴으로써 다음의 실시예에서 언급될 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자의 발현을 통해 라이신 생산을 도모할 수 있도록 개발되었다.

[표 2]

[실시예 2]

코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자의 에스케리키아 콜리/코리네박테리움 글루타미쿰 셔틀벡터 pECCG 117에 도입

제1도에 나타낸 것과 같이 셔틀벡터 pECCG 117의 다발성 크로닝 사이트(multiple cloning site)내 제한 효소 Sal I 위치에서 4.5kb의 dap A 유전자를 함유하는 Sal I단편을 pDH 1으로부터 절단 후 저융점 아가로즈 젤(low melting temperature agarose gel)을 사용하여 분리한 후 T4 DNA 리가제(ligase)로 삽입시켰다. 이저합된 재조합 프라즈미드를 칼슘크로라이드법이나 전기장 충격법에 의해 실시예 1에 언급한 대장균 숙주에 도입시켜 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체로부터 프라즈미드를 분리하고 제한효소 처리를 한 뒤 전기영동을 하여 dap A 유전자의 도입을 확인하였다. 전기장 충격법에 의한 형질전환법은 아래와 같이 수행하였다. LB 배지에서 14-15시간 배양한 대장균을 1ℓ LB 배지에 초기 흡광도(600nm)가 0.07배지 0.1되게 접종한 뒤 흡광도 0.6이 될 때까지 배양하였다. 이 균체를 원심분리한 뒤 1ℓ의 1mM HEPES[N-(2-하이드록시에틸)-피페라진-N'-(2-에탄설폰산)]완충용액에 현탁하고 재차 원심분리하고 다시 500ml의 차가운 멸균 탈이온 증류수에 현탁시켰다. 이들 다시 원심분리한 뒤 균체를 20ml의 10% 글리세롤에 현탁시키고 원심분리한 뒤 최종 2-3ml의 10% 글리세롤 용액에 현탁하여 최종 균체 농도를 2-4×10¹⁰/ml로 조정하여 사용하였다. 이 세포 현탁액을 드라이아이스 에탄올로 냉동시킨 뒤 -70℃로 보관하여 약 1개월간 형질전환 빈도의 감소없이 사용할 수 있었다. 엘리쿼트(aliquots)로 보관된 세포 현탁액 40㎕를 얼음속에서 녹인 뒤 여기에 1ng-1㎕의 프라즈미드를 가해 섞은 뒤 0.2cm간극의 진 펄서 큐벳에 넣고 축전량(capacitance) 및 전기장의 세기를 25uF 및 12.5Kv/cm에 고정하고 200-400Ω의 저항에서 1회의 전기장충격을 가했다. 여기에 전기장 충격후 즉시 1ml의 SOC배지를 넣어 섞은 뒤 다시 취해 32℃에서 1시간동안 진탕 배양하였다. 이를 적절히 희석하여 LBKm 한천 평판에 배지에 도말하여 1-2일 후 형질전환체를 얻을 수 있었다.

[실시예 3]

대장균에서의 코리네박테리움 글루타미쿰 CS755 dap A 유전자의 발현

크로닝된 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755 dap A 유전자의 대장균에서의 발현을 확인하기 위해 효소 활성을 측정하였다. 에스케리키아 콜리 TF1 및 pDHDP 5812를 지닌 재조합 에스케리키아 콜리 TF1/pDHDP 5812를 LB 및 카나마이신이 함유된 LB 배지에서 진탕배양하여 키운 뒤 대수 증식기 중반에서 세포를 두었다.

이를 TE 완충용액에서 세척한 뒤 다시 적은 부피의 TF완충용액에 현탁시키고 초음파 분쇄(ultrasonication)로 세포를 파괴한 후 20000g에서 30분 원심분리시켜 상등액을 얻었으며 이를 조효소액(crude extract)으로 사용했다. 효소반응은 2M Tris-HCl 완충용액(pH 7.5) 45㎕, 10mM 소디움파이루베이트(sodium pyruvate) 45㎕ 10mM 아스파틱 세미알데히드(aspartic-β-semialdehyde)60㎕, 증류수 250㎕, 조효소액 50㎕를 섞어 준 뒤 30℃에서 10분 반응시켰다. 여기에 450㎕의 1N HCl을 가하고 에탄올에 녹인 2% O-아미노벤즈알데히드(O-aminobenzaldehyde)을 100㎕을 넣은 뒤 실온에서 50분 방치하였다. 5000g에서 5분 원심분리 후 540nm을 파장에서 흡광도를 측정하였으며 유니트는 단위분당, 단위 mg 단백질당 흡광도의 증가로 표시하였다.

[표 3]

[실시예 4]

재조합 대장균에 의한 발효

실시예 1에서 개발된 대장균을 pDHDP 5812로 형질전환하여 얻은 재조합 대장균을 사용하여 포도당을 탄소원으로 플라스크 발효를 행하여 숙주와의 라이신 생산성을 비교 검토하여 표4에 나타내었다. 숙주 및 재조합 균주를 LB 및 카나마이신이 함유된 LB 한천 평판배지에서 37℃에서 하룻밤 키운 뒤 1백금이를 발효 배지에 접종하여 37℃에서 48-72시간 배양한 뒤 최종 발효액의 아미노산을 PHLC로 분석, 정량하였다. 필요한 경우에는 아미노산 및 카나마이신을 최종 농도가 50-200mg/λ 및 50mg/λ가 되게 각각 첨가시켜 발효시켰다.

Claims (6)

1. 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰/대장균 셔틀벡터.
2. 제1항에 있어서, 셔틀벡터가 pDHDP 5812을 특징으로 하는 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰/대장균 셔틀벡터.
3. 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰/대장균 셔틀벡터로 형질전환된 대장균.
4. 제3항에 있어서, 형질전환된 대장균이 α-아미노-β-하이드록시 발레릭산 및 S-(2-아미노에틸)-L-시스테인에 대해 내성을 갖고 메치오닌 및 이소루이신 영양요구성을 가지며 스레오닌 및 라이신을 생산함을 특징으로 하는 형질전환된 대장균 KFCC 10719.
5. 코리네박테리움 글루타미쿰 dap A 유전자를 함유한 코리네박테리움 글루타미쿰/대장균 셔틀벡터로 형질전환된 대장균을 배양하여 라이신을 생산하는 제조방법.
6. 셔틀벡터 pDHDP 5812에 함유된 4.5kb Sal I 절편으로부터 dap A 유전자의 기능을 손실받지 않고 일부 유전자를 제거하거나 코리네형 세균 및 대장균의 기타 유전자를 도입하여 형질발현 비히클을 제조하는 방법.