JPH02502065A - 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 低い酢酸産生能を有する微生物、及びこれを用いる有用物質の製造方法 〔技術分野〕 本発明は、新規微生物、特に大腸菌（Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）で野 生型大腸菌に比べて低い酢酸産生能を有する新規微生物、及び高密度で該微生物 を培養することによる収率のよい有用物質の製造方法に関する。本明細書で使用 する「酢酸産生能」または「酢酸生産能」などの語は、適当な培養条件下で大腸 菌を培養した場合に、細菌細胞乾燥重量当りの酢酸蓄積量を意味する。

〔背景技術〕

蛋白質またはビタミンのような有用物質の化学合成は、複雑な工程を要するため 高価である。従って、微生物を用いる発酵方法によりかかる物質の効率的な製造 方法が開発されてきブこ。

ビオチンは、動物、植物および微生物などにとって必須であり、飼料または輸液 添加剤として使用することができる。

ビオチンに関しても発酵方法の開発が、試みられており、日本の未審査特許公開 、すなわち特開昭６１−２０２６８６号および同６２−１５５０８１号公報、な らびにＩ！１０８７１０１３９１は、遺伝子工学的技術により改良された大腸菌 を使用するビオチンの製造方法を公表している。

一般に、前記物質を微生物を用いて生産する場合には、生産物収量の向上はもと より、発酵槽の有効な運用や生産物の効率のよい回収の観点から、流加培養など により培養液中における微生物の高密度化を達成することは有効な手段である。

大腸菌、特に遺伝子工学的技術により改良された大腸菌を用いる場合には、高密 度培養により多大な利益を得ることができる。しかしながら、大腸菌の場合、栄 養物質の代謝に伴って酢酸が生成し、培養液中に著量蓄積するにつれて細胞増殖 活性を阻害するので、高密度培養を実現することは困難であった。前記課題を解 決し、高密度培養を可能にする手段として、培養液を透析または濾過することに より培−系から生成する酢酸を除去する透析培養法または濾過培養法が知られて いる。

また、純酸素を使用して培養液中の溶存酸素を高濃度に維持することで、酢酸の 生成量を抑制する加圧培養法が提案されている（松井ら、昭和６１年度日本醗酵 工学会大会講演要旨集、２０６頁）。

しかしながら、透析培養や濾過培養は専用の装置を必要としたり、装置の維持管 理の複雑化等の問題を伴い、経済的、実用的なものとはいえない。さらに、大腸 菌により生成蓄積される特定の有用物質（例えば、ビオチン）は、培養液から酢 酸と共に透析または濾過されるので、有用物質の回収工程で低濃度の有用物質含 有液を多量に処理することが必要となり、高密度培養を実施することで得られる 利点が著しく損われる。加圧培養法を用いる大腸菌の高密度培養は、培養操作〔 発明の開示〕 本発明者らは、従来技術の観点と異なる（すなわち、大腸菌を遺伝的に改良する ）観点に立ち、前記課題を改善すべく鋭意研究を重ねた結果、野生型の大腸菌株 の人工的変異により低酢酸産生能（野生型大腸菌の酢酸産生能の多くて１７５） を示す変異菌株を得ることに成功した。これらの変異菌株を有用物質の製造に使 用する場合、透析培養法、濾過培養法または加圧培養法などの特殊な培養法を使 用しなくとも、生成する酢酸による増殖活性阻害を受けることなく、高密度培養 が容易に遂行できることを本発明者らは見出した。さらに本発明者らは、これら の変異菌株が有用物質産生に関与する遺伝情報を担う組換えプラスミドにより形 質転換され得ることを見出した。例えば、ビオチンオペロンを含有する組換えプ ラスミドを変異菌株に導入し、得られる菌株を培養する場合には、酢酸による増 殖活性の阻害を伴うことなく菌株細胞が高密度に達するばかりでなく、増殖活性 が維持されるので、常法ではビオチンの生合成中間体としてデスチオビオチンが 残存蓄積されていたのにもかかわらず、中間体デスチオビオチンは効率良くビオ チンまで代謝され、ビオチンの収量は著しく増加する。またさらに、本発明者ら は、培養液に所定量のアラニンを添加することによりデスチオビオチンおよびビ オチンの産生量が著しく増加することを見出した。

従って、本発明は、酢酸産生能が野生型大腸菌のそれの多くて１１５であること を特徴とする大腸菌に関する。

さらに、本発明は、野生型大腸菌の多くて１７５の酢酸産生能を有する大腸菌で あって有用物質産生に関与する遺伝情報を担う組換えプラスミドを含む大腸菌に も関する。

さらにまた、本発明は、野生型大腸菌の多くて１１５の酢酸産生能を有する大腸 菌であって、有用物質産生に関与する遺伝情報を担う組換えプラスミドを含む大 腸菌を高密度で培養し、次いで生成する有用物質を採取することを特徴とする有 用物質の製造方法に関する。

〔図面の簡単な説明〕

第１図は、例１で詳述されるようなプラスミドｐＸＢＡ３１２の作成手順の説明 図である。

〔発明を実施するための最良の形態〕

本発明の微生物の調製 酢酸産生能が野生型大腸菌の多くて１７５の大腸菌（以下ＡＤ変異株と称する） を取得するには、野生型大腸菌に通常用いられる変異誘起処理を施し、得られた 細菌細胞を適当な培養液で振盪培養し、培地中に蓄積した酢酸量および細菌細胞 濃度を定量し、次いで野生型菌株に比べて酢酸の生成量が多くて１７５に低下し たＡＤ変異株を選択すればよい。より好ましい方法としては、変異誘起処理後の 細菌細胞の中からフルオロ酢酸ナトリウムに対して耐性を有する大腸菌（以下、 ＰＲ変異株と称する）を取得し、次いで該ＰＲ変異株の中から酢酸産生能が野生 株に比して低下した株を選択するのが好ましい。なぜなら、酢酸産生能の低い大 腸菌はＦＲ変異株の中に多く見出せるからである。

より具体的には、まず、野生型大腸菌に通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチル −Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジンのごとき変異誘起剤で処理を行ない、 得られた細胞を緩衝液で適当に希釈し、フルオロ酢酸ナトリウムを含んだプロリ ンを単一炭素源とする最少培地寒天平板上で培養し、生じたコロニーをＦＲ変異 株として釣菌分離する。次に、分離したＦＲ変異株を適当な液体培地で振盪培養 し、培地中に蓄積した酢酸量を液体クロマトグラフィーや酵素反応を利用したア ッセイキット（Ｆキット：ベーリンガーマンハイム山之内）などを用いて定量し 、野生型菌株に比べて酢酸の生成量が多にして得た株は、酢酸産生能が低く、か つフルオロ酢酸ナトリウム耐性をも有する。すなわち、°通常の培地を用いて溶 存酸素が不足しないような条件下で培養した場合、培養液中の細菌細胞乾燥重量 当りの酢酸蓄積量が野生型大腸菌では０．５〜１．５であるのに対して、本発明 のＡＤ変異株は０．１以下である。細菌細胞乾燥重量当りの酢酸蓄積量は、酢酸 蓄積量（ｇ／ｉｔ）を前記細胞濃度（ｇ　／　ｌ　）で割った商である。

野生型大腸菌のかわりに、ビオチンによるフィードバック阻害が解除された変異 株（以下、ＤＲ変異株と称する）、例えば、大腸菌ＤＲＫ−３３２［微工研条寄 第２１１３号：なお、「微工研条寄」として本明細で記載されるすべての数字は 、ブタベスト条約に基づく国際寄託当局としての微生物工業技術研究所（ＦＲＩ ）の寄託番号を示し、この菌株は、日本国における国内寄託当局としてのＦＲＩ に原寄託された微工研菌寄第８５８５号から内部移管されている。また、［微工 研菌寄」として本明細書に記載されるすべての数字は、国内寄託当局としてのＦ ＲＩの寄託番号を示す］を親株として用いて同様の変異誘起処理をすれば、酢酸 産生能が低く、フルオロ酢酸ナトリウム耐性を有し、かつビオチンによるフィー ドバック阻害が解除された変異株を得ることができる。このようにして得られる ＡＤ変異株としては、例えば大腸菌ＤＲＫ−３３２３（微工菌条寄第２１１６号 ：微工研菌寄第９６７５号）があげられる。

ビオチン産生能を有する大腸菌から単離されるビオチンオペロンをベクターＤＮ Ａに挿入することにより調製される組換えプラスミドは、特開昭６２−１５５０ ８１号公報に記載された方法により取得することができ、例えば、ＰＫＨＮ３１ があげられる。

また、このようにして得られた組換えプラスミドのベクターの持つ形質をテトラ サイクリン耐性にすることにより、その後の高密度培養を通じてプラスミドが脱 落されない安定な組換えプラスミドを取得することができる。

別法として、組換えプラスミド含有ＡＤ変異株の取得は、前記のごとくして得た 組換えプラスミドを、常法、例えば、Ｍａｎｄｅｌ　Ｍ、、ら、Ｊ６Ｍｏ１．Ｂ ｉｏｌ、、　５３．１０９　（１９７０）に記載のカルシウム処理法によりＡＤ 変異株（例えば、大腸菌ＤＲＫ−３３２３）に導入し、ベクターの持つ形質によ り、組換えプラスミドを含有する細菌細胞のクローンが選択的に生育し得る寒天 培地プレートにて培養し、そして出現するコロニーを釣菌することにより得るこ とができる。

かくして得られた組換えプラスミド含有ＡＤ変異株の例としテハ、例えば大腸菌 ＤＲＫ−３３２３［ＰＸＢＡ３１２］　（微工研条寄第２１１７号：微工研菌寄 第９６７６号）があげられる。

有用物質としてヒトカルシトニン（以下、ｈＣＴと称スル）が望まれる場合には 、対応する組換えプラスミドを含有するＡＤ変異株を調製してもよい。例えば、 コラゲナーゼ切断部位を含むｈＣＴとβ−ガラクトシダーゼとの融合蛋白質をコ ードする遺伝子およびｔａｃプロモーターを有する組換えプラスミド含有の大腸 菌Ｍ　１５　［ｐＺＴ３２］　（微工研条寄第２１１５号：微工研菌寄第９２６ ６号）からプラスミドｐＺＴ３２を単離し、次いで大腸菌ＮＡ−７５（微工研条 寄第２１０５号）のようなＡＤ変異株に導入して大腸菌ＮＡ−７５［ＰＺＴ３２ ］を得ることができる。

他の有用な物質が望まれる場合には、組換えＤＮＡを目的物質産生に関与する遺 伝子とベクターＤＮＡから調製し、次いでＡＤ変異株に導入して目的微生物を得 ることができる。

高密度培養方法 前記のごとくして調製される本発明の大腸菌を培養すれば酢酸による増殖活性の 阻害を受けることなく容易に高密度にすることができる。

本発明の大腸菌の培養に際して用いられる培地としては、炭素源、窒素源、無機 物を含有する合成培地、およびまたは天然培地のいずれも使用可能である。炭素 源としては、グルコース、クリセリン、フラクトース、シュークロース、マルト ース、澱粉、澱粉加水分解液または糖蜜などの炭水化物が使用できる。窒素源と しては、アンモニアまたは塩化アンモニウム、燐酸アンモニウムもしくは硫酸ア ンモニウムなどの各種の無機または有機アンモニウム塩類、あるいは肉エキス、 酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイン加水分解物、脱脂穴豆粕もしく はその消化物などの天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素源の多くは 、窒素源であるとともに炭素源にもなりつる。無機物としては、燐酸第一水素カ リウム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一 鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化マンガン、塩化コバルト、モリブ デン酸アンモンまたはほう酸などが使用できる。

造成された微生物に抗菌薬剤耐性が付与されている場合には、該当する抗菌剤を 培地に添加することによって汚染を防ぐことができる。

これらの栄養物質類は、培養開始前に必要量を全量培地として加えてよい。ある 種の栄養物質は、全必要量が一度に加えられると、大腸菌の増殖活性などの低下 を引き起こす。かかる栄養物質を使用する場合には、培養開始時に培地へその栄 養物質の一部を添加し、次いで培養期間を通じて増殖による消費量に対応する量 ずつ残りを流加するのが好ましい。

本発明の微生物を用いてビオチンを製造する場合には、培地にアラニンを添加す ることでビオチンの収量を増加し得る。

使用されるアラニンは、Ｄ体、Ｌ体、ＤＬ体のいずれを用いてもほぼ同等の効果 が得られる。価格を考慮すると、ＤＬ体が好適である。培地に添加するアラニン 濃度は、１〜１０ｇ／１１更に好ましくは３〜７ｇ／ｊ！である。１０ｇ／ｊ！ を越えて添加するとアラニンが細胞の増殖阻害を起し、特にビオチンの生産性の 低下を招く。アラニンは培養開始時に全てを一度に添加するか、培養期間を通じ て少量ずつ分割して添加してもよい。

本発明の微生物は、通気攪拌条件の影響を受けることなく低い酢酸産生能を示す 。従って、従来技術のように酢酸の蓄積を防ぐ目的で、培地中の溶存酸素濃度を 高く維持する必要はない。しかしながら、栄養物質を効率良く代謝させるために は、溶存酸素濃度を３〜６　ＰＰｌ１ｌに維持することが好ましい。

培養温度は、２５〜３８℃であり、培養期間中のｐＨは中性付近に維持すること が好ましい。培養時間は通常１６〜４８時間程度で十分であり、培養終了時点に おける細胞濃度は乾燥重量で５０ｇ／１２以上になる。

ビオチンの生産 ビオチンオペロンをベクターＤＮＡに組み込むことで調製される組換えプラスミ ドを含有する本発明の大腸菌を、上記の如く高密度培養すれば培養液中にビオチ ンを著量生成蓄積することができる。培養を終了した後、培養液からのビオチン の抽出精製にあたっては、ビオチンの諸性質を利用して、天然物から物質を抽出 精製する方法に類似の抽出精製方法が応用できる。培養物から細菌細胞を除いた 後、活性炭にビオチンを吸着させ、しかるのち溶出させ、次いでイオン交換樹脂 で精製することができる。あるいは、培養濾液を直接イオン交換樹脂で処理する ことにより精製してもよい。水またはアルコールより再結晶することにより精製 ビオチンを取得することができる。

〔実施例〕

次に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明がこれらの実施例 に限定されるものではない。

大腸菌１１３１１０株（ＩＦ０１２７１３）を、Ｌ−培地（ベプ）：／１０ｇ／ ｌ、酵母エキス５ｇ／ＬグルコースＩｇ／ｆ、塩化ナトリウム５　ｇ／　ｌ、　 ｐＨ７，２に調整）中３７℃で３時間振盪培養を行った。対数増殖期の細菌細胞 を集め洗浄した後、これをＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−ニトロソグアニジン １０に／ｄを含有するＴＭ緩衝液（トリス−塩基０．６１％、マレイン酸０．５ ％、ｐＨ６，０に調整）に懸濁し、３７℃で３０分間静置し変異処理を行った。

この細胞を集め洗浄した後、Ｌ−培地に移して３７℃で３時間回復培養を行った 。再び細胞を集め洗浄して無菌水で細胞数がおよそ１０７個／ｄとなるように懸 濁した。

この懸濁液を、フルオロ酢酸ナトリウムを５ｇ／Ｉｔ含むプロリン最少培地寒天 平板（プロリンＩｇ／Ｉ！、硫酸アンモニウム４ｇ／ｉｌ、燐酸第二水素カリウ ム２ｇ／１２．燐酸第一水素カリウムＩｇ／Ａ、硫酸マグネシウム・７水和物Ｏ Ａｇ／Ｉｔ。

塩化ナトリウム５ｇ／Ｃ寒天１５ｇ／ｆ）にシャーレ１枚当たり０．１献づつ塗 末し、３７℃で４８時間培養した。出現したコロニーをＦＲ変異株として釣菌単 離した。耐性を獲得した機構の違いから、ＰＲ変異株には親株に比べて酢酸産生 能が低下したＡＤ変異株と、酢酸産生能が親株と同じで変化していない株が含ま れている。

単離したＦＲ変異株と親株１１３１１０の酢酸産生性を比較するため、それぞれ の細胞を、酢酸産生能試験用培地（硫酸アンモニウム５　ｇ　／　ｌ、燐酸第二 水素ナトリウム・１２水和物１３．２ｇ／Ｉｔ、燐酸第一水素カリウム１．８ｇ ／ｆ、硫酸マグネシウム・７水和物１ｇ／ｊ２．ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキ ス１０ｇ／１１グルコース１０ｇ　／　Ｉｔ　＞　５０ｍｔ’を含有する５００ ｄ坂ロフラスコ中で３７℃、２４時間振盪培養した。振盪速度は、１２０ストロ 一ク／分であった。培養終了後、分光光度計により各培養ブロスについて波長６ ６０止における光学濃度（００−ｓ。）を測定し、次いで乾燥細胞重量とｏｎ、 、、との間で作成した標準曲線に基づき、細胞濃度（ｇ／Ｉｔ＞に換算した。細 胞を遠心分離した後、各培養上澄液中の酢酸量を酵素反応を用いる定量分析キッ ト（Ｆキット：ベーリンガーマンハイム山之内）により定量した。親株に比べて 酢酸産生能が１７５以下に低下したＡＤ変異株ＮＡ−７５（微工研条寄第２１０ ５号）を取得した。親株Ｗ３１１０とＡＤ変異株ＮＡ−７５との酢酸産生能を比 較した結果を第１表に示す。

第１表 親株 ＡＤ変異株 ビオチンによるフィードバック阻害が解除されている大腸菌ＤＲＫ−３３２（微 工研条寄第２１１３号）を、Ｌ−培地（ペプトン１０ｇ／ｌ、酵母エキス５ｇ／ ｊ２．グルコースＩｇ／＃、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、ｐ）１７．２に調整）中 で３７℃、３時間振盪培養した。対数増殖期の細菌細胞を集めて洗浄した後、Ｎ −メチル−Ｎ′−ニトロソグアニジン１０に／ＷＬ１を含有するＴＭ緩衝液（ト リス−塩基０．６１％、マレイン酸０．５％、ｐＨ６，０に調整）に懸濁し、３ ７℃で３０分間静置し変異処理を行った。この細胞を集めて洗浄した後、Ｌ−培 地に移して３７℃で３時間回復培養を行った。再び細胞を集めて洗浄し、無菌水 で細胞数がおよそ１０’個／ｄとなるように懸濁した。この懸濁液を、フルオロ 酢酸ナトリウムを５ｇ／ｊ！含むプロリン最少培地寒天平板（プロリン１ｇ／ｌ 、硫酸アンモニウム４ｇ／ｌ、燐酸第二水素カリウム２ｇ／１２．燐酸第−水素 カリウムＩｇ／！、硫酸マグネシウム・７水和物０．１ｇ／ｉｔ、塩化ナトリウ ム５ｇ／Ｉｔ、寒天１５ｇ／ｊ２）にシャーレ１枚当たり０．１ｄづつ塗末し、 ３７℃で４８時間培養した。出現したコロニーをＦＲ変異株として釣菌単離した 。耐性を獲得した機構の違いから、ＦＲ変異株には親株に比べて酢酸産生能が低 下したＡＤ変異株と、酢酸産生能が親株と同じで変化していない株が含まれてい る。

単離したＰＲ変異株と親株ＤＲＫ−３３２の酢酸産生性を比較するため、それぞ れの細胞を、酢酸産生能試験用培地（硫酸アンモニウム５　ｇ　／　ｉｔ、燐酸 第二水素ナトリウム・１２水和物１３、２ｇ　／　Ｉｔ　、燐酸第一水素カリウ ム１８ｇ／ｌ、硫酸マグネシウム・７水和物１ｇ／Ａ、ペプトン１０ｇ／Ｉｔ、 酵母エキス１０ｇ／ｌ、グルコース１０ｇ／ｊ２）５０−を含有する５００ｒｎ １坂ロフラスコ中で３７℃、２４時間振盪培養した。振盪速度は、ｉ２０ストロ ーク／分であった。通気条件は、２種の培地量（１〇−または１００ｍｆ）とす ることにより変化させた。培養終了後、分光光度計により、各培養ブロスについ て波長６６０ｎｍにおける光学濃度（ｏｎｓｓ。）を測定し、次いで乾燥細胞重 量とＯｎ、、。

との間で作成した標準曲線に基づき、細胞濃度（ｇ／Ｉｔ＞に換算した。細胞を 遠心分離した後、各培養上澄液中の酢酸量を酵素反応を用いる定量分析キット（ Ｆキット：ベーリンガーマンハイム山之内）により定量した。親株に比べて酢酸 産生能が多くて１１５に低下したＡＤ変異株ＤＲＫ−３３２３（微工研条寄第２ １１６号）を取得した。親株ＤＲＫ−３３２とＡＤ変異株口ＲＫ−３３２３との 間の酢酸産生能を比較した結果を第２表に示す。

ＡＤ変異株ＤＲＫ−３３２３は、通気条件の影響を受けず、溶存酸素が十分に存 在しない低通気条件下でさえも菌体乾燥重量当りの酢酸蓄積量は、０．２５以下 であった。

第２表 １）　５００ｍｊｌ！容量のフラスコへの培地仕込み量　１００ｒｎ１２＞５０ ０ｄ容量のフラスコへの培地仕込み量　１０ｍ１実施例３ （１）ベクターＤＮＡの調製 プラスミドｐＢＲ３２２（Ｐｅｄｅｎ、　Ｋ、、　Ｇｅｎｅ、　２２．２７７、 １９８３）を含有する大腸菌に一１２株の一種を、アンピシリン５に／ｍｆを添 加したＬＢ培地〔バクトドリプトン（ディフコ社製）１％、バクト酵母エキス（ ディフコ社製）０．５％、塩化ナトリウム１％、水酸化ナトリウムでｐＨ７，２ に調整〕中、３７℃で一昼夜振盪培養して細胞を得、アルカリ抽出法（Ｂｉｒｎ ｂｏｊｍ、　ＨｏＣ，など、Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５０．７．１５１３． １９７９）を用いてプラスミドＩＩＮＡ　ｐＢＲ３２２を採取した。

第１図に図示するように、得られたプラスミドＤＮＡ　ｐＢＲ３２２タイプ■） で電気泳動を行ない、エチジウムプロミドで染色後、ＤＮＡ断片（約３．７　ｋ ｂ）を切り取り、７０℃で５分間加熱後にＴＥ緩衝液（１０ａ＋Ｍ　）リス塩酸 緩衝液、ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）飽和フェノールをほぼ同量加え、よく 混合し、°遠心分離により水相を得た。この水相に２倍容のエタノールを加えて 沈澱採取したベクターＤＮＡ断片を、ＤＮＡライゲーションキット（全酒造社製 ）を用いて連結させた。

得られた組換えＤＮＡ溶液を用いて、大腸菌Ｍ２Ｓ株（Δ［１ａｃ−Ｐｒｏ］、 ｔｈｉ、φ８０ｄ、１ａｃＺＭ１５．　ａｒａ、ｒｐｓＬ、ｒｅｃＡ、）［ファ ルマシア社より購入］を形質転換した。形質転換は、カルシウム法に準じて行っ た。５０Ｒ／ｍ１のアンピシリンを含むＬＢ培地〔バクトドリプトン（ディフコ 社製）１％、バクト酵母エキス（ディフコ社製）０．５％、塩化ナトリウム１％ 、寒天１．５％、水酸化ナトリウムでｐＨ７，２に調製〕プレート上で生育した 形質転換株大腸菌Ｍ１５［ｐＢＲＲ−Ｂ１１を得た。

大腸菌Ｍ１５［ｐＢＲＲ−８４］を、アンピシリン５０ｇ／ｖｔｌ含むＬＢ培地 で培養し、前述のアルカリ抽出法を用いてプラスミドｐＢＲＲ−８４を採取した 。

得られたプラスミドｐＢＲＲ−８４（ｉｇ＞を、２つの制限エンドヌクレアーゼ ＥｃｏＲ１および、Ｐｓｔ　Ｉで切断し、低温ゲルアガロースを用いた１％アガ ロース電気泳動によりＤＮＡ断片（約３．０　ｋｂ）を前述の方法により分離採 取した。

一方、プラスミドＤＮＡ　ｐＵｃ１３（ファルマシア社より購入）　２Ｋを２つ の制限エンドヌクレアーゼＢｃｏＲ１およびＰｓｔ　Ｉで切断し、１５％ポリア クリルアミドゲル（牛丼社製）電気泳動を行ない、エチジウムプロミドで染色後 、約４０ｂのＤＮＡ断片を切り取り、ダウンスホモジナイザー（ｗｈｅａｔｏｎ 　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いてホモジナイズし、０．５Ｍ酢酸アンモニ ウム（１ｍＭ　ＢＤＴＡを含む）及び同量のＴＥ緩衝液飽和フェノール溶液を加 えてよく混合し、遠心分離により水相を得た。この水相に２倍容のエタノールを 加えて遠心分離後、ＤＮＡ断片を沈澱採取した。

これらの処理により得られた２つのＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（ 全酒造社製）を用いて連結した。

こうして得られたライゲーション反応液を用いて、大腸菌Ｍ２Ｓ株を前述のカル シウム法で形質転換した。テトラサイクリン１０Ｒ／ｍｊ２を含むＬＢ固形培地 上で生育したコロニーを、テトラサイクリン１０ｇ／Ｔｎｌを添加したＬＢ培地 で十分に生育させ、前述と同様のアルカリ抽出法によりｐＢＭ１６プラスミドＤ ＮＡを得た。

（２）ビオチンオペロンを担う組換えプラスミドの造成特開昭６２−１５５０８ １号公報に記載されたビオチンオペロンをバク。ターＤＮＡに組み込むことによ り調製した組換えプラスミドを含む大腸菌ＤＲＫ３３２［ＰＫＩＩＮ３１］　（ 微工研条寄第２１１４号：微工研菌寄第８５８６号）を、アンピシリン５に／ｍ ｆｆ１を添加したＬＢ培地で充分に生育させ、前述のアルカリ抽出法でプラスミ ドＤＮＡ　ｐＫ）ｌＮ３１を採取した。

得られたプラスミドＤＮＡ　ｐＫｆｌＮ３１　（１ｇ　）を制限エンドヌクレア ーゼ旧ｎｄＩＩ［で切断し、６５℃で１０分間の熱処理を行ない、エタノール沈 澱によりＤＮＡを回収した。

得られたＤＮＡ断片を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ緩衝液（５００ｍＭ　）リス 塩酸ｐＨ７，５，６７ｍＭ　ＭｇＣｆ　＊　、１０＋ｎＭメルカプトエタノール ）中、それぞれ５００ＪＩＮのｄＣＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、　ｄＧＴＰ 。

および大腸菌ＤＮＡポリメラーゼクレノーフラグメントを加え、３７℃で３０分 反応させた。次に、６５℃で１０分間加熱することにより反応を停止し、エタノ ール沈澱によりＤＮＡを回収した。得られたＤＮＡの末端に５′−リン酸化Ｘｂ ａ　Ｉリンカ−（ファルマシア社から購入）をＤＮＡライゲーションキット（全 酒造社製）を用いて連結させ、次いでエタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

こうして得られたＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼＸｂａ　Ｉで切断し、低温 ゲルアガロースを用いた１％アガロースゲル電気泳動を行ない、エチジウムプロ ミドで染色後ＤＮＡ断片（約６．　Ｏｋｂ）を前述９方法により分離採取した。

一方、ベクターＤＮＡ　ｐＢＭ１６（１埒）を制限エンドヌクレアーゼＸｂａ　 Ｉで切断し、６５℃で１０分間の熱処理を行った後、エタノール沈澱によりＤＮ Ａを回収した。

以上の処理により得られた２種のＤＮＡ断片をＤＮＡライゲーションキット（宝 酒造社製）を用いて連結した。こうして得られたライゲーション反応液を用い、 特開昭６２−１５５０８１号公報に記載の大腸菌ＪＡ２２１（ｒｅｃＡ、　ｈｓ ｄＭ、　ｈｓｄＲ，］ｃｕＢ、　ｔｒｐΔＢ　、　１ａｃＹ）由来の変異誘導し たビオチン要求大腸菌ＢＲ−４に形質転換した。ビオチン無添加の最少寒天培地 （グリコース０．５％、硫酸アンモニウム０．４％、燐酸第二水素カリウム０． ２％、燐酸第一水素カリウムｏ、ｏｉ％、ビタミンフリーのカザミノ酸０．４％ 、寒天１．５％）プレート上で生育したコロニーを、テトラサイクリンＩｋ／ｒ ｎｌを添加したＬＢ培地で充分に生育させ、前述のアルカリ抽出法によりｐＸＢ Ａ３１２プラスミドＤＮＡを得た。

（３）ビオチンオペロンを含む組換えプラスミドによる大腸菌ＡＤ変異株の形質 転換 先に得られた組換えプラスミドｐＸＢＡ３１２を用いて前述と同様のカルシウム 法により大腸菌ＤＲＫ−３３２３を形質転換した。テトラサイクリンｌｋ／＋ｎ ｌを含むＬＢ寒天培地プレート上で生じたコロニーを単離し、大腸菌ＤＲＫ’： ３３２３［ＰＸＢＡ３１２コ（微工研条寄第２１１７号）を得た。

実施例４ 第３表に示す菌株を、まず前培養としてＬ−培地（ペプトン１　ｈｒ　／　１２ 　、酵母エキス５ｇ／ｌ、グルコースＩｇ／ｆ１塩化ナトリウム５　ｇ／　１　 、ｐＨ７，０に調整；組換えプラスミドを含有する菌株の場合は、さらにテトラ サイクリン２に／ｍｌを添加）に寒天保存培地から一白金耳植菌し、３７℃で８ 〜１２時間培養した。得られた前培養液５０ｒＩｔｌを、下記組成の１７００ｍ ｆの培地−Ａを含むミニジャーファーメンタ−（丸菱バイオエツジＭＤ−３００ 型、５１容量）に植菌し、３７℃で本培養を行った。

ｐＨコントローラーを用い１２％アンモニア水でｐＨを７に制御した。アンモニ ア水の添加は無機窒素源の供給を兼ねて行った。

溶存酸素電極で培養液中の溶存酸素濃度を測定し、溶存酸素濃度が３　ｐｐｍ以 下にならないように純酸素を通気用空気に混合して調整した。攪拌は５００ｒｐ ｍ　、通気量は１　ｖ、　ｖ、ｓ、とじた。

培養液中のグルコース濃度がほぼゼロとなったときに溶存酸素濃度が急激に増加 する現象を指標として、下記組成の流加用グルコース溶液−Ａを培養液中のグル コース濃度が１〜５ｇ／Ｉｌとなるように流加した。２４時間培養を行った結果 を第リン酸二ナトリウム（１２水和物’）　１７．６リン酸−カリウム　２．４ 硫酸アンモニウム　１．０ 酵母エキス　１０．０ ペプトン　１０．。

硫酸第一鉄（７水和物）０．１ 塩化カルシウム（２水和物）　０．０５塩化マンガン（４水和物）　０．０５ 硫酸マグネシウム（７水和物）０．１ グルコース　５．０ グルコース　７５０．０ 硫酸マグネシウム（７水和物）５．０ 第３表 実施例５ 前培養として、第４表に示す菌株を、Ｌ−培地（ペプトン１０ｇ／１２．酵母エ キス５　ｇ　／　１２　、グルコースＩｇ／Ｃ塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、ｆトラ サイクリア　２Ｑ　ｍｇ　／　Ｉ！、ｐＨ７，０に調整）に寒天保存培地から一 白金耳植菌し、３７℃で８〜１２時間培養した。次に、得られた前培養液５０ｒ ｎ１を下記組成の１７００艷の培地−Ｂを含むミニジャーファメンター（丸菱バ イオエツジＭＤ−３００型、５１容量）に植菌し、次いで３７℃で本培養を行っ た。ｐＨコントローラーを用い１２％アンモニア水でｐＨを７に制御した。溶存 酸素濃度が３　ｐｐｍ以下にならないように純酸素を通気用空気に混合して調整 した。攪拌は５００ｒｐｍ　、通気はｌｖ、ｖｏｍ、とじた。培養液中のグルコ ースがほぼゼロとなった時に溶存酸素濃度が急激に増加する現象を指標にして下 記組成の添加用グルコース溶液−Ｂを培養液中のグルコース濃度が１〜５ｇ／ｊ ！となるよう添加した。２４時間培養の結果を第４表に示した。培養液中のビオ チンとデスチオビオチン（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ （ＡＴＣＣ７７５４））を用いたバイオアッセイ法、およびアビジンを用いた比 色定量法（ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ｖｏｌ、　Ｘ■ｐ、　４ １９）により定量した。第４表から明らかなように、親株ＤＲＫ−３３２をプラ スミドｐＸＢＡ３１２で形質転換したＤＲＫ−３３２［ｐＸＢＡ３１２］　テ＋ ｉ、酢酸カ著量蓄積し、菌体収量が低く、ビオチン収量は４０■／Ｉｌで、中間 代謝産物のデスチオビオチンが８３■／ｌ蓄積したのに対し、本発明のＤＲＫ− ３３２３［ＰＸＢＡ３１２］　テハ酢酸ｔｉ積ｍカ６　ｇ／　１２　ト低く、菌 体収１６５ｇ／ｌとなり、さらにデスチオビオチンが効率よくビオチンにまで代 謝されて、ビオチン収量は１０５■／ｌに達した。

リン酸二ナトリウム（１２水和物）　１７．６リン酸−カリウム　２，４ 硫酸アンモニウム　１．０ 酵母エキス　１０．０ ペプトン　１０．Ｏ ｄ−アラニン　３．０ 硫酸第一鉄（７水和物）０．１ 塩化カルシウム（２水和物）　０．０５塩化マンガン（４水和物’）　０．０５ 硫酸マグネシウム（７水和物）０．１ グルコース　５．０ グルコース　７５０．０ 硫酸マグネシウム（７水和物）５．０ 〃−アラニン　７，０ 第４表 （微紐条菌条第２１１７号） ｈＣＴ−１ａｃ’　Ｚ融合遺伝子を担う組換えプラスミドを含有するＡＤ変異株 の調製 融合蛋白質（コラゲナーゼ切断部位を含むｈＣＴペプチド−β−ガラクトシダー ゼ）〔特開昭６３−２２６２８８号公報記載〕および発現プロモーターとしてプ ラスミドｐＫＫ２２３−３由来の亜プロモーターを担う組換えプラスミドを含有 する大腸菌Ｍ１５［ｐＺＴ３２］　（ｗ１工紐条寄第２１１５号）を、アンビシ リン５ｏｌｔ／ｄ含むＬＢ培地で十分に育成し、次に前述のアルカリ抽出法　。

テフラスミドＤＮＡ　ｐＺＴ３２を単離した。前述のカルシウム法により得られ たプラスミドＤＮＡ　ｐＺＴ３２で大腸菌ＮＡ７５を形質転換した。アンピシリ ン５０ｚ／ｒｎｌを添加したＬＢ寒天プレート上で増殖したコロニーを単離して 大腸菌ＮＡ７５　［ｐＺＴ３２］を得た。

実施例７ 前培養として、第５表に示す菌株を、Ｌ−培地（ペプトンＬｏｇ／Ａ、酵母エキ ス５ｇ／ｌ、グルコースＩｇ／ｆ、塩化ナトリウム５ｇ／ｌ、テトラサイタリン ２０■／／２．ｐＨ７，０に調整）に寒天保存培地から一白金耳植菌し、３７℃ で８〜１２時間培養した。次に、得られた前培養液５０−を前記組成の１７００ ｄの培地−Ａを含むミニジャーファメンター（丸菱バイオエツジＭＤ−３００型 、５１容量）に植菌し、次いで３７℃で本培養を行った。ＰＨコントローラーを 用い１２％アンモニア水でｐＨを７に制御した。溶存酸素濃度が３　ＰＰＩＩＩ 以下にならないように純酸素を通気用空気に混合して調整した。攪拌は５００ｒ ｐｏ＋　、通気は１　ｖ、ｖ−ｔａ、とした。培養液中のグルコースがほぼゼロ となった時に溶存酸素濃度が急激に増加する現象を指標にして前記組成の流加用 グルコース溶液−Ａを培養液中のグルコース濃度が１〜５ｇ／ｌとなるよう流加 した。培養経過中、培養液中の酢酸蓄積量が３〜４　ｇ　／　ｌになったとき、 すなわち細菌細胞の増殖活性が低下し始めたとき、イソプロピル−β−Ｄ−チオ ガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．２５ｇ／Ａ添加することによりｂＣＴ− １ａｃ’　Ｚ融合遺伝子を発現させた。ｒＰＴＧは大腸菌Ｍ１５［ｐＺＴ３２］ 株の培養開始後、９時間で添加するか、大腸菌ＮＡ？５　［ＰＺＴ３２］株につ いては１４時間で添加した。さらに培養を続け２４時間後に培養を終了した。遠 心分離により細胞を培養液から採取し、無菌水で洗浄し、１ａ＋ＭのＥＤＴＡと ０．１　ａ＋ＭのＤＴＴを含む１０ｍＭ　）リス塩酸（ｐＨ８，０）で懸濁し、 次いでＸ−プレス（ＡＢ　ＢＩＯＸ製）により破砕した。遠心分離により得られ た上澄を細胞抽出物として使用した。

細胞抽出物に対する定量分析試験は、次のように実施した。

（１）ヒトカルシトニンの定量 定量は、カルシトニンキット「第一」　（第一ラジオアイソトープ研究断裂）を 使用して行った。操作手順は、キット用の説明書に準じて行った。

（２）β−ガラクトシダーゼの定量 本酵素は、基質として０−ニトロフェニルガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ）を用 いるミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）法（Ｍｉｌｌｅｒ、　Ｊ、）Ｉ、５ｘｐ。

Ｍｏｌ、　Ｇｅｎ、Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂ、　Ｃｏ１ ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ発行、Ｎ、Ｙ、３５２頁、１９７２）に準じて 定量した。２８℃、１分間でｌ　ｎ　ｍｏｌｅの０ＮＰＧを分解するのに必要な 酵素活性を１単位として示した。

（３）蛋白質の定量 ローリ−法（Ｌｏｗｒｙ、ロ、Ｈ０，Ｊ、Ｒｉｏｔ、Ｃｈｅｍ、、１９３．　２ ６５゜１９５１）を使用し、検量線はウシ血清アルブミン（シグマ製、フラクシ ョンＶ）を用いて作成した。

結果を第５表に示す。

第５表 酢酸蓄積− （ｇ／Ｉ１５．４ １３．０ 生成蓄積した融合蛋白質（コラゲナーゼ切断部位を含むｈＣＴ−β−ガラクトシ ダーゼ）は、β−ガラクトシダーゼの活性を指標として、蛋白質精製の常法に準 じて精製し、次いで特開昭６３−２２６２８８号公報に記載の方法でコラゲナー ゼ切断した。Ｃ−末端グリシンを有するｈＣＴはＨＰＬＣで分取した。

Ｃ−末端グリシンを有するｈＣＴは、Ｃ−末端アミド化酵素の反応により容易に ｈＣＴへ転換することができる（Ｂｒａｄｕｒｙ。

Ａ、　Ｐ、ら、Ｎａｔｕｒｅ、　２９８．６８６＋　１９８２）　ｏ転換された ｈＣＴは、医薬として有効に使用することができる。

〔産業上の利用可能性〕

本発明の新規微生物は、野生型の多くて１７５の低酢酸産生能を示し、細菌細胞 の増殖が酢酸によりほとんど阻害されないので、高密度で細胞を培養することが でき、それ故に、著しく高収量で有用物質を得ることができる。

本発明の微生物を使用する発酵法でビオチンを製造する場合、従来技術に比し著 しくビオチンの収量が増加する。また、アラニンを含む培地で培養することによ りその収量はさらに増加する。

本発明は、特定の態様を引用して記載しているが、当業者にとって自明な変更は 、本発明の精神、範囲および概念内に包含されるものとみなす。

〔寄託微生物への言及〕

国際寄託当局二通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 住所二日本国茨城県つくば南東１丁目１番３号（郵便番号３０５） 寄託番号および寄託臼 １、微紐条条寄第２１０５号：　１９８８年１０月１７日２、微紐条条寄第２１ １３号：　１９ｇ５年１２月２６日（１９８５年１２月２６日付寄託の微紐条菌 寄第８５８５号から移管）３、　微紐条条寄第２１１４号：　１９８５年１２月 ２６日（１９８５年１２月２６日付寄託の微紐条菌寄第８５８６号から移管）４ 、微紐条条寄第２１１５号：　１９８７年３月１２日（１９８７年３月１２日付 寄託の微紐条菌寄第９２６６号から移管）５、　微紐条条寄第２１１６号二１９ ８７年１０月２８日（１９８７年１０月２８日付寄託の微紐条菌寄第９６７５号 から移管）６、　微紐条条寄第２１１７号：　１９８７年ｌＯ月２８日（１９８ ７年１０月２８日付寄託の微紐条菌寄第９６７６号から移管）ｅｏＲＩ 国際調査報告 ””””””””””””’　ＰＣＴ／、１７Ｐ　８８７０１１２４

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．酢酸産生能が野生型大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の多くて １／５であることを特徴とする大腸菌。
2. ２．有用物質産生に関与する遺伝情報を担う組換えプラスミドを含有する請求項 １記載の大腸菌。
3. ３．ビオチンによるフィードバック阻害が解除された請求項１記載の大腸菌。
4. ４．ビオチン産生能を有する大腸菌由来のビオチンオペロンを担う組換えプラス ミドを含有する請求項１記載の大腸菌。
5. ５．ビオチン産生能を有する大腸菌由来のビオチンオペロンを担う組換えプラス ミドを含有する請求項３記載の大腸菌。
6. ６．野生型大腸菌の多くて１／５の酢酸産生能を有する大腸菌であって、有用物 質産生に関与する遺伝情報を担う組換えプラスミド含む大腸菌を、高密度培養し て生成した有用物質を採取することを特徴とする有用物質の製造方法。
7. ７．前記有用物質がビオチンまたはデスチオビオチンである請求項６記載の方法 。
8. ８．前記大腸菌がビオチンによるフィードバック阻害が解除された大腸菌である 請求項７記載の方法。
9. ９．前記大腸菌をアラニン１〜１０ｇ／ｌ含む培地で培養する請求項８記載の方 法。