KR920008383B1

KR920008383B1 - L-라이신의 제조방법

Info

Publication number: KR920008383B1
Application number: KR1019900022966A
Authority: KR
Inventors: 한종권; 오종원; 이현환; 정 스테펜; 현형환
Original assignee: 제일제당 주식회사; 김정순
Priority date: 1990-12-31
Filing date: 1990-12-31
Publication date: 1992-09-26
Also published as: KR920012424A

Abstract

내용 없음.

Description

L-라이신의 제조방법

제1도는 pAK12의 제한효소 EcoR I, Xba I 및 Sac I의 절단 지도 및 그의 형성단계를 나타낸 것이다.

코리네박테리움 또는 브레비박테리움 속의 코리네형 글루타메이트-생산 박테리아를 사용하여 발효시킴으로써 L-라이신을 제조하는데 있어서, L-라이신의 생성능을 가지며, 이들 박테리아의 야생형 균주로부터 유도된 변이주를 사용하고 있다.

L-라이신 생산 변이주는 아미노산 유사체, 핵산 유사체, 항생제에 대한 내성을 갖는 변이주를 라이신 생합성 경로의 곁가지 부산물인 L-스레오닌, L-메치오닌 및 기타 아미노산에 대한 영양요구성을 부여함으로써 얻어진 변이주가 일본국 특허공기 제55-9759호, 일본국 특허공개 제56-8692호 및 대한민국 특허공고 제79-1782호등에 공지되어 있다.

DNA 재조합 기술에 의해 형성된 균주가 L-라이신의 재조를 위해 사용될 수 있다는 보고는 거의 없는 실정이다. 라이신 생합성에 관여하는 여러 유전자를 오페론(operon)을 형성하지 않고 염색체 DNA상에 퍼져 있는 것으로 대장균의 경우는 보고되어 있으나 아미노산 및 핵산 생산에 널리 쓰이는 코리네형글루타메이트-생산 균주인 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 브레비박테리움 프라붐(Brevibacterium flavum), 브레비박테리움 락토퍼멘툼(Brevibvacterium lactorfermentum) 등의 L-라이신 생합성에 관여하는 유전자의 정보 및 기타 유전현상의 정보는 많지 않은 실정이다. 그러나 최근 코리네형 세균에서의 숙주-벡타계(host-vector system)가 개발됨에 따라 연구가 진행되고 있으며 L-스레오닌, L-페닐알라닌, 및 L-아르기닌 등의 생산균주가 응용한 예가 보고되고 있다. 코리네박테리움 글루타미쿰에서도 라이신 생합성에 관여하는 유전자중 lysA(diaminopimelate decarboxylase). dapA(dihy drobipicolinate synthetase)등의 클로닝의 결과가 보고된 바가 있으나 아스파토키나제에 대한 유전자의 클로닝 및 발현에 대한 보고는 없다.

아스파테이트 계열(aspartate family)의 아미노산들인 L-라이신, L-스레오닌, L-이소루이신 및 L-메치오닌 생합성의 첫단계 효소인 아스파토키나제는 대장균에서는 그 산물들인 L-라이신, L-스레오닌 및 L-메치오닌에 의해 각각 조절을 받는 세가지의 동성효소(isoenzyme)로 구성되어 있으며 각각의 효소들은 다른 기능을 갖는 효소와도 결합되어 있어 매우 복잡한 조절 기작을 보이고 있으나[Ann, Rev, Biochem. 47, 533,(1978)]코리네박테리움 및 브레비박테리움속의 코리네형 글루타메이트-생산 박테리아의 아스파토키나제(EC 1.7.2.4)는 이와는 달리 훨씬 단순한 조절 기작을 보이며, 각 속의 미생물마다 조금씩 다르지만 그 산물들인 L-라이신과 L-스레오닌에 의해 공동으로 저해(concerted feedback innibition)를 받는다는 특징을 갖는다.[J. Biochem. 65,849,(1969)]

본 발명자들은 L-라이신 생산균주로서 야생주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13032를 인공변이시켜 L-라이신에 의한 효소 활성 저해(feedback inhibition)현상을 해제시키기 위해 L-라이신의 아나로그인 s-β-아미노에틸-L-시스테인(이후 AEC라 칭한다)에 대한 내성을 부여하고 L-스레오닌 및 L-메치오닌으로 가는 곁가지 반응경로(side chaia reaction)를 차단시켜 이들에 대한 영양요구성 균주를 제작하여 특허균주로 등록하였으며(대한민국 특허공보 제79-1782호), L-라이신의 생산성을 증가시키기 위해 스레오닌의 아나로그인 α-아미노-β-히드록시발레린산(이후 AHV라 칭한다)에 대한 내성과 아르기닌의 아나로그들에 대한 내성을 부여하여 CS755 균주를 제작하였으며, 균주의 효소역가 분석결과 AEC와 AHV에 대한 내성이 아스파토키나제의 L-라이신 및 L-스레오닌에 의한 공동 저해작용의 해제에 의해 기인함을 확인하고 본 발명을 수행하게 되었다.

또한 코리네형 글루타메이트-생산균의 숙주-벡터계의 개발을 위해 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC 13058 균주로부터 크립틱 플라스미드(cryptic plasmid)인 pCG1을 분리한 뒤 에쉐리시아 콜리속 균주의 클로닝 벡터(cloning vector)인 pACTC177과 결합시켜 코리네박테리움과 에쉐리시아속의 균주들에서 모두 형질전환 및 발현이 가능한 셔틀벡터인 pECCG1을 제조하였으며 pECCG1으로부터 앰피실린 내성 유전자 부분을 제거하고 다발성 절단부위(multicloning site)를 도입하여 코리네박테리움속에서 안정하게 발현되는 셔틀벡터 pECCG117를 제조하여 본 발명에 이용하였다.

즉 본 발명은 AEC 및 AHV에 대하여 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰 CS755 균주의 염색체 DNA로부터 에쉐리시아 및 코리네박테리움 속의 균주들에 형질전환이 가능한 셔틀벡터 pECCG117을 이용하여 아스파토키나제에 대한 유전정보를 갖는 재조합 플라스미드 pAK 12를 분리하고, 이 pAK12를 야생주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032에 형질전환시켜 AEC 및 AHV에 대한 내성 부여와 함께 아스파토키나제의 비효소활성(specific enzyme activity)을 증가시킴으로써 L-라이신의 생산능력을 부여하거나, 또한 재조합 플라스미드 pAK12를 L-라이신 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 CS 755에 형질전환시켜 향상된 L-라이신 생산성을 부여하고, 이 미생물들을 배양배지에 배양하여 배양액에 축적된 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법에 관한 것이며, 본 발명에 사용된 균주 및 플라스미드는 표 1과 같다.

[표 1]

재조합 플라스미드를 운반하는 형질전환체에 의한 L-라이신의 생산은 발효에 의해 L-라이신을 제조하는 공지의 방법과 같은 방법에 의해 수행될 수 있다. 즉 형질전환체를 온도, pH등을 조절하면서 호기성 조건하에 탄소원, 질소원, 무기화합물, 아미노산, 비타민 및 기타 영양물질을 함유한 통상의 배양배지에서 배양하고, 배양배지에 축적된 L-라이신을 회수한다. 탄소원으로는 글루코오즈, 프럭토오즈, 슈크로오즈, 말토오즈, 만노오즈, 및 당밀등과 같은 각종 탄수화물, 피루브산, 푸마르산, 락트산, 및 아세트산과 같은 각종 유기산이 사용될 수 있고, 질소원으로는 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 탄산암모늄 및 초산암모늄과 같은 각종 무기 및 유기 암모늄염, 우레아 및 기타 질소함유물질 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 이스트 추출물, 옥수수 침지액, 가세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해 생성물, 탈지 대두케이크 또는 그의 분해 생성물등이 사용될 수 있다. 무기 화합물로는 인산1 수소칼륨, 인산2 수소칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄 황산마그네슘, 염화나트륨, 황산 제1철, 황산망간, 탄산칼슘등이 사용될 수 있으며 이외에 필요에 따라 비타민 및 기타 아미노산이 첨가될 수 있다. 배양은 호기적 조건하에, 예를 들어, 진탕배양 또는 통기교반 배양에 의해, 바람직하게는 20-40℃의 온도에서 수행된다. 배지의 pH 배양동안 중성 근처에서 유지하는 것이 바람직하며 L-라이신은 보통 1-5일간 배양하므로써 배지에 축적된다. 배양 후 배양액으로부터 균체를 제거하고 활성탄 또는 이온교환수지 처리등의 공지의 방법에 의해 L-라이신을 회수한다.

그러므로, 글루타메이트-생산 코리네형 박테리아로부터 유도된 라이신의 생합성에 관한 효소의 합성에 관한 유전정보를 갖는 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드를 운반하는 미생물을 사용함으로써 이런 제조합 플라스미드를 운반하지 않는 균주를 사용하는 경우에 비해 고수율로 L-라이신을 생산할 수 있다.

본 발명을 상술하면 다음과 같고, 본원에서 사용한 유전자 조작방법은 주로 분자 클로닝 실험조작법(Mulecular Cloning : A laboratory Manual, 2nd. ed. , J. Sambroek, EP. Pritch. T. Maniatis) 및 분자 클로닝 기술의 지표(Guide to Molecular Cloning Techulques, Methods in Enzymology. vol. 152, S. L. Berger. A. R. Kimme)등의 방법에 준하여 실시하였으며, 본 발명에 사용된 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pAK12 균주는 1990년 12월 27일자로 한국 종균 협회에 제10721호에 기탁되었다.

[실시예 1]

[아스파토키나제 유전자의 클로닝]

(1)코리네박테리움 CS755의 염색체 DNA 및 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pECCG117로부터 pECCG117분리

CS755 균주를 LB 배지(1% 트립톤, 0.5% 이스트 추출물, 1% 염화나트륨 : pH 7.4)에서 32℃, 18시간 진탕배양하여 원심분리로 균체를 회수하고 10ml 트리스 완충액(pH 8.0)으로 세척한 뒤 40ml의 라이소자임 반응 완충액(10mM 트리스(pH 8.0), 5mM 염화나트륨, 1mM EDTA, 0.5mM 슈크로오즈, 10mg/ml라이소자임)에 현탁시킨 뒤 37℃, 90분간 처리하였다. 이 세포를 원심분리로 회수하고 10ml의 슈크로오즈와 라이소자임이 배제된 라이소자임 반응 완충액에 현탁시키고 0.5M EDTA를 0.6ml, 4% SDS를 4.4ml에 넣어 세포를 분해시켰다. 여기에 염화세륨을 ml당 1g씩 첨가하고 2ml의 에티디움 브로마이드 농축액(10mg/ml)을 섞어주고, 이 혼합액을 초고속 원심분리기(ultracentrifuge)를 사용하여 16℃에서 50,000rpm으로 48시간 원신분리시킨 뒤, 주가시를 이용하여 염색체 DNA를 취하였다. 이소프로필 알코올로 3-4회 처리하여 에티디움 브로마이드를 제거한 후 TE 완충액(10mM 트리스(pH 8.0), 1mM EDTA)하에서 3회 완충용액을 바꾸어 가며 24시간 투석하여 염색체 DNA를 분리 정재하였다. 셔틀벡터 pECCG117도 이와 동일한 방법으로 분리했으며, 이때 배양배지에 가나마이신을 50㎍/ml되게 첨가하였다.

(2) 유전자 라이브러리(genomic library)의 제조

CS755로 부터 분리 정제된 염색체 DNA를 제한효소 Mbo I으로 미디움염 제한효소 완충액(50mM 염화나트륨, 10mM 트리스(pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오쓰레이톨)에서 37℃, 15-30분간 부분절단(partical digestion)하고 이 제한효소를 65℃에서 20분간 가열하여 불활성화 시킨 다음, 0.7% 저융점 아가로오즈 겔(low-melting point agarose gel)에서 전기영동한 뒤 3-6kb 크기의 DNA 절편을 취하였다. 이를 68℃에서 10분간 물로 중탕 가열하여 겔을 녹인 뒤 동일 부피의 트리스 완충액(pH 8.0)으로 포화된 페놀을 섞어 준뒤 12,000rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 취하고 다시 크로로포름 처리 및 에탄올로 침전시켜 목적 유전자원으로 사용하였다. 목적 유전자 분리를 위하여 프라스미드 pECCG117을 제한효소 BamH I으로 고농도염 제한효소 완충액(100mM 염화나트륨, 50mM 트리스(pH 7.5), 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오쓰레이톨)에서 37℃, 2시간 처리하여 완전 절단하고, 카프 인테스틴 포스파타제(calf-intestine phosphatase)를 처리한 뒤 3-6kb의 DNA 절편과 혼합하여 리가제 완충액(0.5M 트리스(pH 7.4), 0.1M 염화마그네슘, 0.1M 디티오쓰레이톨, 10mM 스퍼미딘, 10mM 스퍼미딘, 10mM ATP, 1mg/ml 소혈청 알부민)에서 T4 DNA 리가제로 14℃에서 16시간 반응시킴으로써 유전자 라이브러리를 제작하였다.

(3) 아스파토키나제의 유전자 클로닝

LB 배제에서 14-15시간 배양한 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032를 1ℓ의 LB 배지에 흡광도(600nm)가 0.1 이하가 되도록 접종하고 32℃에서 진탕배양한 뒤 흡광도가 0.3에 도달했을때 페니실린을 0.3U/ml 첨가하고 0.6까지 배양한 뒤 사용하였다. 이 균체를 원심분리하여 회수한 뒤 1ℓ의 1mM N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-에탄설폰산)(이후 HEPES라 칭한다) 완충액에 현탁하여 재차 원심분리하고 다시 500ml의 냉각된 멸균 탈이온 증류수에 현탁하였다. 이를 다시 원심분리한 뒤 균체를 20ml의 10% 글리세롤 용액에 2회 세척시켜 최종 2-3ml의 10% 글리세롤 용액에 현탁시켜 최종 균체농도를 1-2×10¹⁰/ml이 되도록 조정하여 사용하였다. 이 현탁액을 적당량으로 나누어 드라이아이스-에탄올로 급속 냉동시킨 뒤 -70℃에 보관하면, 약 1개월 동안 형질전환빈도의 감소없이 사용가능하다. 냉동된 균체의 현탁을 얼음속에서 서서히 녹인 뒤 여기에 적당량의 플라스미드 DNA를 첨가해 잘 섞어준 뒤 전기장 충격장치(Bio-Rad, Gene pulser)로 1회 전기장 충격을 가한 뒤 1ml의 SOC 배지(2% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 10mM 염화나트륨, 2.5mM 염화칼륨, 10mM 염화마그네슘, 10mM 황산마그네슘, 20mM 글루코오즈)에 현탁하여 32℃에서 1시간 배양한뒤 5mM AEC, 5mM AHV 및 50㎍/ml의 가나마이신이 포함된 하기 조성의 최소한 천 평판배지도 도말하여 1-2일 32℃네서 배양하여 형질전환체를 얻을 수 있었다.

-최소 평판배지 : 글루코오즈 10g/ℓ, 황산암모늄 2g/ℓ, 요소 2g/ℓ, 인산1 수소칼륨 0.2g/ℓ, 인산2 수소칼륨 0.2g/ℓ, 황산마그네슘 0.1g/ℓ, 염화칼슘 0.1g/ℓ, d-비오틴 100㎍/ℓ, 염산디아민 100㎍/ℓ, 보락스 88mg/ℓ, 몰리브덴산암모늄 36mg/ℓ, 황산아연 8.8mg/ℓ, 황산구리 270mg/ℓ, 염화망간 7.7mg/ℓ, 염화제1철 970mg/ℓ, 한천 18g/ℓ ; pH 7.2

[실시예 2]

코리네박테리움 굴루타미쿰 ATCC13032에서의 아스파토키나제 유전자의 발현

실시예 1에서 얻어진 형질전환체들로 부터 통상의 방법에 의해 플라스미드 DNA를 분리하여 2.9kb의 염색체 DNA를 포함하는 플라스미드 pAK12를 얻을 수 있었으며, 이를 포함하는 형질전환체 코리넥박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pAK12와 코리네박테리움 글루타미쿰 CS755/pAK12들의 아스파토키나제의 효소활성을 측정하였다. 효소액을 얻기 위하여 형질전환제를 LB 배지(필요한 경우 가나마이신을 50㎍/ml 첨가)에서 대수증식기까지 키운 후 원심분리하여 균체를 회수하고 적당량의 TEM 완충액(10mM 트리스, 1mM EDTA, 5mM 염화마그네슘 pH 8.0)에 현탁하여 초음파 균체 분쇄기(ultrasonicator)로 균체를 분쇄한 뒤 원심분리하여 얻어진 상등액에 포화 황산암모늄 용액을 넣고 혼합한 뒤 원심분리하여 침전물을 얻는다. 이 침전물을 소량의 TEM 완충액으로 녹여 효소액으로 사용하였다. 이렇게 얻어진 효소액의 적당량을 0.5ml의 아스파토키나제 반응액(0.1M 트리스 pH 8.0), 10m ATP, 10mM 황산마그네슘, 0.1M 히드록실아민(pH 8.0), 0.4M 황산암모늄, 50mM 칼륨아스파테이트)에 첨가하여 37℃에서 30분-1시간 반응시킨뒤 0.75ml의 반응정지 용액(3.3% 트리클로로아세트산, 10% 염화제 2철 0.7N 염산)을 첨가하고 원심분리한 뒤 상등액의 흡광도를 540nm에서 측정하였다. 그 결과 형질전환주의 아스파토키나제의 비효소활성(specific enzyme activity)은 비형질전환주에 비해 약 3-5배 증가하였으며 AEC와 AHV에 의한 효소활성의 저해특성은 숙주세포인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032가 이들에 의해 공동 저해를 받았으나, 형질전환주인 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pAK12에서는 목적유전자의 출처인 코리네박테리움 글루타미쿰 CS755 균주의 특성과 동일하게 이들에 의해 저해를 받지 않았다. 자세한 결과는 표 2에 기재하였으며, 단위(Unit)는 단위 시간당 540nm에서 증가된 흡광도로써 표시하였다.

[표 2]

[실시예 3]

형질전환 균주들에 의한 L-라이신의 생산

플라스미드 pAK12로 형질전환하여 얻어진 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032/pAK12와 CS755/pAK12 및 에쉐리시아 콜리 TF0601/pAK 균주들을 먼저 전배양으로 가나마이신 50㎍/ml을 포함하는 LB 배지에 한천보존배지로부터 1백금이 식균하여 32℃에서 16시간 200rpm으로 진탕배양기에서 배양하여 이를 종균배양액으로 사용하였다. 다음에 하기조성의 발효배지 50ml을 500ml 진탕플라스크에 분주하여 위의 종균배양액 2ml을 접종하고 32℃에서 48시간 진탕배양하였으며 그 결과를 표 2에 기재하였다.

-코리네박테리움용 발효배지 : 슈크로오즈 75g/ℓ, 황산암노뮴 20g/ℓ, 효모추출물 5g/ℓ, 요소 4g/ℓ, 염화나트륨 2.5g/ℓ, 황산마그네슘 0.6g/ℓ, 인산2 수소칼륨 0.6g/ℓ, d-비오틴 300㎍/ℓ, 염화티아민 500㎍/ℓ, 황산철 12mg/ℓ, 황산망간 12mg/ℓ,^*미량원소액 1ml/ℓ, 탄산칼슘 40g/ℓ ; pH 7.0-8.0. -^*미량원소액 : 소디움보레이트 90mg/ℓ, 몰리브덴산암모늄 40mg/ℓ, 황산아연 10mg/ℓ, 황산동 270mg/ℓ, 염화망간 10mg/ℓ, 염화제2철 100mg/ℓ, 염화칼슘 10mg/ℓ.

-에쉐리시아용 발효배지 : 글루코오즈 50g/ℓ, 황산암모늄 15g/ℓ, 인산1수소칼륨 1g/ℓ, 황산마그네슘 0.5g/ℓ, 황산망간 5mg/ℓ, 황산철 5mg/ℓ, 효모추출물 3g/ℓ, 탄산칼슘 30g/ℓ, 필요한 경우 영양 요구성 아미노산 소량첨가, pH 5.5-7.5

[표 3]

Claims

AEC 및 AHV에 내성을 갖는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 클로닝된 아스파토키나제 유전자를 함유하고 있는 코리네박테리움 및 대장균에서 복제 및 발현이 가능한 발현비히클 pAK12.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 클로닝된 아스파토키나제 유전자를 함유하고 있는 코리네박테리움 및 대장균에서 복제 및 발현이 가능한 발현비히클로 형질전환된 코리네박테리움 글루타미쿰.
코리네박테리움 글루타미쿰에서 클로닝된 아스파토키나제 유전자를 함유하고 있는 코리네형 글루타메이트-생산 박테리아를 배양배지에 배양하여, 배양액에 L-라이신을 축적하고, 그로부터 L-라이신을 회수함을 특징으로 하는 L-라이신의 제조방법.