JP3290473B2 - ビオチンオペロン - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、エシェリヒア コリに
関し、ビオチンオペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コ
ドン近傍いずれかの塩基配列が野性株に比べ変異してい
るビオチンオペロンのＤＮＡ配列に関する。このような
ＤＮＡ配列に従いビオチンオペロンの高発現系を構築で
きる。

【０００２】

【従来の技術】ビオチンは動植物及び微生物にとって必
要なビタミンであり、複雑な工程を要する化学合成法に
代替すべく、遺伝子工学的技術等により改良された微生
物を用いた発酵法による効率的な製造方法が開発されて
いる。（例えば、特開昭６１−１４９０９１号公報、ヨ
ーロッパ特許公開第０３１６２２９号公報、参照）微生
物を改良して特定の有用物質の生産能が向上した高生産
株としては、最終産物による酵素合成系へのフィードバ
ック制御機構が存在する場合には、変異処理によるレプ
レッサー変異株またはオペレーター変異株があり、また
その酵素合成系のプロモーター活性自体が強化された株
等も提案されている。また遺伝子工学的技術を駆使する
場合、酵素合成系を本来のプロモーターとは異なる高発
現系プロモーターに連結する方法もある。ビオチン高生
産変異株に関するレプレッサー変異株としては、例えば
ＤＲＫ３３２株（微工研寄第８５８５号、特開昭６２−
１５５０８１号公報参照）があり、遺伝子工学的技術に
より高発現系プロモーターを用いた例としてＰ_L プロモ
ーターを用いてｂｉｏＢ遺伝子のみを強化した株（特開
昭６１−１４９０９１号公報参照）等がある。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】前述の、ビオチン生産
能の向上を目的に改良された微生物は、いずれも所期の
目的を達成しているとはいえ、いまだ改良の余地があ
り、発酵法におけるビオチンの生産性を向上すべく、さ
らなる改良を加えたビオチン高生産性株を提供すること
の必要性は現在も変わらない。ところでエシェリヒア
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のビオチン
オペロンにはビオチン生合成に関与するｂｉｏＡ，ｂｉ
ｏＢ，ｂｉｏＦ，ｂｉｏＣ，ｂｉｏＤの５つの遺伝子が
コードされているが、その発現を制御する制御領域はｂ
ｉｏＡとｂｉｏＢの間に存在し、ｂｉｏＡは１鎖に、ｂ
ｉｏＢ，Ｆ，Ｃ，Ｄ、はｒ鎖にコードされ、各々反対方
向に転写を受け、また、１つのオペレーターにより両方
向への転写が制御されている。この両方向鎖への転写機
構は、遺伝子工学的手法による高発現プロモーターへの
変更を単純化させないひとつの理由でもある。それにも
かかわらずビオチンオペロンの高発現を達成させること
は、ビオチン生産性を向上させる上で重要である。オペ
レーター変異に関しては一部報告があるが(Nature, 27
6, 689(1978), Gene, 13, 89(1981))ビオチン生産性に
は何等言及されておらず、中にはオペレーター領域とオ
ーバーラップしているプロモーター活性を著しく減じて
いるものもある。

【０００４】本発明の目的は、従来とは全く異なった変
異をビオチンオペロンの制御領域及びその近傍のいずれ
かに起こすことによりビオチンオペロンの高発現系を構
築し、それらを含むビオチン高生産菌株を提供すること
にある。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、エシェリ
ヒア コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）を改
良してビオチン生産能を向上させるべく鋭意研究を重ね
た結果、意外にも、ビオチンオペロンの制御領域及びそ
の近傍の従来とは全く異なった部位に、変異を誘発させ
ることによりビオチンオペロンの高発現系を構築し得る
ことを見いだした。つまりビオチンアナログである代謝
拮抗物質を用い、それに対する耐性変異株を選択する
と、耐性変異株の中に高い頻度でビオチン活性物質の生
産能が顕著に増強された変異株が見出され、それらの中
に、さらに高い頻度でビオチンオペロンの制御領域及び
その近傍の特定の領域に変異が誘発されたものを取得し
うることを見いだし、これらの変異がビオチンオペロン
の高発現を促し、その結果としてビオチン活性物質の生
産能が顕著に増強されていること見いだし本発明を完成
するに至った。

【０００６】すなわちビオチンオペロンの制御領域及び
ｂｉｏＢ開始コドン近傍のある特定の領域の塩基配列が
野性株に比べ変化しているビオチンオペロンのＤＮＡ配
列が提供される。この配列は、エシェリヒア コリのビ
オチンオペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍
いずれかの塩基配列が野性型に比べて少なくとも１塩基
対が変異していることに特徴を有する。より具体的に
は、この変異はオペレータ内であるか、あるいはｂｉｏ
Ｂ開始コドン前後における複数部位の少なくとも１塩基
対が変異している。このようなオペロンは、ビオチン高
発現性となっている。

【０００７】また、本発明によれば、前記のような変異
が起ったＤＮＡ配列を担持する組換えプラスミドで形質
転換したエシェリヒア属に属する微生物を栄養培地で培
養し、培養物からビオチンを採取することを特徴とする
ビオチンの製造方法も提供される。

【０００８】

【具体的な態様及び作用】本発明にかかわるビオチンオ
ペロンは、エシェリヒア コリのビオチンオペロンで、
５つのビオチン生合成酵素遺伝子群ｂｉｏＡ，ｂｉｏ
Ｂ，ｂｉｏＦ，ｂｉｏＣ及びｂｉｏＤを有する。ビオチ
ンオペロンの制御領域とはｂｉｏＡ，ｂｉｏＢ間に存在
するｒ鎖を示す配列表の配列番号１、及びより詳細には
図１に示す塩基配列のうちｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧの
Ａを１として−１番目の塩基対から−８６番目の塩基対
までの領域をいう。またｂｉｏＢ開始コドン近傍とは、
ｂｉｏＢ開始コドンＡＴＧのＡを１として１番目の塩基
対から６番目の塩基対までの領域をいう。

【０００９】ビオチンオペロンのオペレーター領域とは
図１の−４３番目から−８２番目に該当し、図２で示さ
れるバリンドローム構造をとる領域をいい、そして一本
鎖状態では上下線で示される塩基が＊の塩基を中心とし
てＧＣ，ＡＴ対を形成し安定な２次構造を形成するこの
領域がいわゆるレプレッサータンパク質の結合領域であ
る。この領域内、特に上下線で示されたステム構造をと
る塩基対、さらに好ましくはＧＣ対もしくはＣＧ塩基対
が他の塩基対に変異することにより、一本鎖状態でこの
２次構造が変化しレプレッサータンパク質との結合親和
活性が低下し、結果として発現の抑制がはずれ転写活性
が増大することが期待できる。

【００１０】野性型と比較し、特に一本鎖状態で結合力
が強いＧＣ対またはＣＧ対を形成すると考えられるＧ
（２本鎖状態でＧＣ対）及びＣ（２本鎖状態でＣＧ対）
に一塩基対変換が起こった時の、オペレーター領域に限
った一本鎖状態での２次構造の最少自由エネルギーを、
表１に示す。最少自由エネルギー値は遺伝情報処理ソフ
トウエアＧＥＮＥＴＹＸ−ＣＤ（ｖｅｒ５．０、ソフト
ウエア開発株式会社）を用いて行った。変異は２本鎖状
態での対で表す。

【００１１】

【表１】

【００１２】オペレーター領域の変異に関しては、−７
７番目のＧＣ対のＡＴ対への変換、−６５番目のＧＣ対
のＴＡ対への変換、−４８番目のＣＧ対のＴＡ対への変
換が報告されている(Nature, 276, 689(1978), Gene, 1
3, 89(1981))。しかしながら表１から分かるように−５
３番目のＧＣ→ＡＴ変換が最少自由エネルギーが最も高
くオペレーター変異としては最も効率的であることは明
かである。

【００１３】またこの領域はｂｉｏＢ側プロモーターと
オーバーラップしており、特にＲＮＡポリメラーセの認
識、結合に関係する特別な塩基配列であるいわゆる−３
５領域（図１中ｒ鎖−７９番目から−７４番目のTTGTA
A）、及び−１０領域（プリブノウ・ボックスとも言わ
れ、図１中ｒ鎖−５６番目から−５１番目のTAGGTT）は
重要な配列である。プロモーター活性の強度という観点
からは、−３５領域の配列は一般的にTTGACAと言う配列
に近い方が好ましい。

【００１４】この領域の変異としては−７７番目のＧＣ
対のＡＴ対変換が報告されているが、この変異はプロモ
ーター活性を著しく低下させることが予想され好ましく
ない。次にプリブノウボックスの配列は一般的にTATAAT
という配列に近い方が好ましく、またオペレーター変異
の効率からも併せて考えると効果的変異部位は−５４番
目のＧＣ対がＴＡ対に、及び−５３のＧＣ対がＡＴ対へ
の変異であるが、その中でもプロモーター活性の上昇に
対する寄与の面から考えると、−５４番目のＧ→Ｔより
も−５３番目のＧ→Ａへの変異が最も好ましい。

【００１５】以上のように表１から明かなように、−５
３番目のＧＣ→ＡＴ変換が最少自由エネルギーが最も高
くオペレーター変異としては最も効率的であり、また前
述したｂｉｏＢ側プロモーター活性を向上させる意味で
も最も効果的である。次に−１１番目から−８番目の図
１下線で示すGGAG配列はＳＤ配列（シャイン・ダルガノ
配列）と言われ、この配列はｍＲＮＡレベルでリボゾー
ムが結合する部位で、１番目からの開始コドンＡＴＧよ
りｂｉｏＢ遺伝子の翻訳が開始するが、ｍＲＮＡレベル
でＳＤ配列の下流−６番目から６番目の領域が強固な２
次構造（ステムアンドループ構造）を形成し、ＳＤ配列
へのリボゾームの結合及びＡＴＧからの翻訳開始効率を
低下させている可能性が考えられる。

【００１６】そこで特に−６番目から−３番目の配列AG
CCと、３番目から６番目のGGCTで形成されるステム構造
を変異により変化させることにより、ｂｉｏＢの翻訳効
率が高まることが予想される。またｂｉｏＢ，ｂｉｏ
Ｆ，ｂｉｏＣ遺伝子は終始コドンと開始コドン近傍がオ
ーバーラップしている為、ｂｉｏＢの翻訳効率が増加す
ればｂｉｏＦ，ｂｉｏＣの翻訳効率も上がる可能性も考
えられる。

【００１７】本領域のステム構造の変化は前述したよう
に、一本鎖レベルでＧＣ対がより強固であることを考え
ると−５番目のＧ、−４番目のＣ、−３番目のＣ、また
は開始コドンのＡＴＧは保存しなければならないことか
ら、４番目のＧ、５番目Ｃ等を他の塩基に変化させるこ
とにより、より効率的に達成される。ここで注意すべき
ことはｂｉｏＢ構造遺伝子中の変異、つまりここでは、
４番目から６番目の塩基の変異は、場合によりアミノ酸
変換を起こす。そのことによりｂｉｏＢ遺伝子産物その
ものの活性に影響を及ぼす場合、またはタンパク質の安
定性（細胞内寿命）にかかわる場合等が考えられるた
め、それらのことを考慮して変異部位は選択されるべき
である。本発明におけるビオチンオペロンのＤＮＡ配列の造成方
法 本発明における特定部位に変異を誘発したビオチンオペ
ロンを造成するために使用される微生物は、エシェリヒ
ア コリのビオチン生産菌、すなわちビオチン生合成の
酵素系を有している微生物であって、ビオチンオペロン
の制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍の塩基配列が図
１に示す塩基配列を有するものである限り、他にどの様
な性質を持つものであっても、本発明の目的に沿うもの
である限り制限されるものではない。すなわち、ビオチ
ン生産に都合よく用いることができるエシェリヒア コ
リに属する微生物であれば、それらが当該技術分野で既
知の他の薬剤耐性または有用な形質、例えばビオチンに
よるフィードバック抑制が解除された形質、などを併せ
有するものであってもよい。

【００１８】従って、このような微生物の親株としては
ビオチンの生合成酵素系を有するものであればどのよう
なエシェリヒア コリに属する微生物であってもよく、
好ましくは予めビオチンの生産に適するように変異され
た菌株、例えば本発明者らによって作出された、ビオチ
ンによるフィードバック抑制が解除されているＤＲＫ３
３２３（微工研条寄第２１１６号）などがあげられる
（国際公開第８９／４３６５号参照）。

【００１９】本発明のビオチンオペロンのＤＮＡ配列
は、前記親株から次のような変異株の選択培地、目的と
する変異株の選択方法を経て入手することができる。例
えば、ビオチンアナログである代謝拮抗物質に対する耐
性変異株を経て取得する方法である。ここで用いられる
ビオチンアナログとは、ビオチン構造類似化合物であ
り、ビオチンと拮抗し、本発明にかかわる微生物の生育
を阻害するものであればいかなるものでも利用できる。
例えば、アクチチアジン酸（アシドマイシン、以下「Ａ
ＣＭ」と略す）、α−デヒドロビオチン、５−（２−チ
エニル）吉草酸（以下「ＴＶＡ」と略す）、α−メチル
デスチオビオチン、α−メチルビオチン、アミクレノマ
イシン、４−イミダゾリドンカプロン酸、ホモビオチ
ン、ノルビオチンなどがあげられるが、本発明の目的に
沿うものである限り上記物質に制限されるものではな
く、単独または２種以上を併用して用いることも可能で
ある。

【００２０】また、これらの物質は、これらの物質を生
成蓄積する放線菌等の培養液から単離して使用すること
も、また化学的に合成して用いることも可能である。例
えば、ＡＣＭに関しては、〔Clark R.K.；Arch.Bioche
m.Biophys., 40, 270(1952)〕記載の方法により、また
ＴＶＡに関しては〔Melville D.B. ；J.Biol.Chem.146,
487, (1942)〕に記載の方法により合成することができ
る。

【００２１】次に、これらのビオチンアナログ、例えば
ＡＣＭ及びＴＶＡに、耐性を有する変異株の選択に使用
する培地は、ＡＣＭおよびＴＶＡの代謝拮抗作用を顕著
にするために、微生物によって容易に代謝されてエネル
ギー源や細胞構成成分となるような物質、例えば炭素源
では糖類やグリセリンなど、窒素源ではペプトン、酵母
エキスなどの有機質物質、などの使用を制限した最少培
地であることが望ましい。適当な最少培地を用いると、
ＡＣＭに限らずＴＶＡもエシェリヒア コリ属の微生物
に対して顕著な代謝阻害作用を示し（ＴＶＡに関し、詳
細は特願平２−２９５３０７号記載参照）、通常のエシ
ェリヒア コリ属の微生物に対してその最小生育阻止濃
度を決定することができる。

【００２２】このような最少培地に最小生育阻止濃度以
上のＡＣＭ及びＴＶＡを添加した選択培地（寒天平板培
地）に、通常の変異誘起処理、例えばＮ−メチル−Ｎ′
−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンのごとき変異誘起剤
で変異処理を施したエシェリヒア コリ属の微生物を塗
布して培養し、生じたＡＣＭ及びＴＶＡに耐性を有する
変異株コロニーを釣菌分離して適当なビオチン生産培地
に移して培養し、生成蓄積したビオチン活性物質量を、
例えばラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａ
ｃｉｌｌｕｓ ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を指標菌としたバ
イオアッセイによって定量し、親株と比較してビオチン
活性物質生成蓄積能の増加した変異株を選択することに
よって取得し、さらにそれらのビオチンオペロンの制御
領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍いずれかの塩基配列を
決定し野性型の塩基配列と比較して選択することにより
目的のＤＮＡ配列取得することができる。

【００２３】当領域の塩基配列の決定は、上記方法によ
り取得された変異株の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ビオチ
ンオペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍の塩
基配列を挟んで適当な＋鎖、−鎖に対する相補的合成オ
リゴヌクレオチドをプライマーとして、ＰＣＲ(polymer
ase chain reaction) 法により当領域を増幅後、ジデオ
キシ法〔Messing, J. ；Methods Enzymol., 101, 20(19
83) 〕で決定することができる。また、ビオチンオペロ
ンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近傍を含むビオチ
ンオペロンのすべてもしくは一部を一旦クローニングし
た後、当領域の塩基配列をジデオキシ法にて決定するこ
ともできる。

【００２４】こうして得られる本発明のビオチンオペロ
ンのＤＮＡ配列を有する微生物（以下ＤＲＡＴ株と称す
る）の具体的なものとしては、微生物工業技術研究所特
許微生物寄託センターに平成３年７月２４日付で寄託
し、微工研菌寄第１２３７８号、第１２３７６号及び第
１２３７７号の寄託番号が付されている、それぞれエシ
ェリヒア・コリＤＲＡＴ９、ＤＲＡＴ６及びＤＲＡＴ７
株が挙げられる。

【００２５】また、上記方法以外にも、すでにクローニ
ングされたビオチンオペロン、例えば本発明者らにより
提供されたエシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３〔ｐＸ
ＢＡ３１２〕（微工研条寄第２１１７号）、あるいは同
ＤＲＫ−３３２〔ｐＫＨＮ３１〕（微工研条寄第２１１
４号）より、それ自体既知のプラスミド抽出方法で得ら
れる組換えプラスミドｐＸＢＡ３１２，ｐＫＨＮ３１を
使用し、本発明に係わるビオチンオペロンの制御領域及
びｂｉｏＢ開始コドン近傍の塩基配列を有する合成ＤＮ
Ａを用いても、本発明を達成することが可能である。

【００２６】この場合、合成されたＤＮＡはビオチンオ
ペロン内に存在する適当な制限酵素部位を介して容易に
変換、挿入されうるよう設計されていることが望まし
い。合成ＤＮＡはホスホアミダイド法またはホスホトリ
エステル法のいずれによっても良好に造成することがで
きるが、ホスホアミダイド法を用いたＤＮＡ自動合成機
による合成が一般的である。ＤＮＡは一本鎖として合成
されるので、常に相補鎖を合成してアニーリングし、２
本鎖ＤＮＡ遺伝子として用いる。また、上記クローニン
グされたビオチンオペロンを使用して、本発明に関わる
変異を導入した合成オリゴヌクレオチドを用いた部位特
異的突然変異誘発(site-directed mutagenesis) 〔Kram
er, W.ら；Methods in Enzymol., 154, 350(1987) 〕法
によっても本発明のビオチンオペロンを取得することが
できる。

【００２７】さらに、本発明のビオチンオペロンＤＮＡ
配列は点突然変異に限らず、２重及びそれ以上の変異を
上記方法等により構築してもよい。例えば、ＤＲＡＴ９
株よりクローニングされたビオチンオペロンと、ＤＲＡ
Ｔ６またはＤＲＡＴ７株からクローニングされたビオチ
ンオペロンとはビオチン制御領域内に存在する図１に示
す制限酵素Ａｃｃｌ部位を介して容易に組換え、ダブル
変異型ビオチンオペロンを構築すること等が可能であ
る。

【００２８】本発明のビオチンオペロンのＤＮＡ配列
は、産業上の有用性を考えた場合、本発明のビオチンオ
ペロンを有する前記微生物、ＤＲＡＴ株からその配列を
取得し、これをベクターＤＮＡに組み込んだ組換えプラ
スミドとして用い、宿主としてはビオチン生産に都合よ
く用いることができるいずれかのエシェリヒア属に属す
る微生物を形質転換するのに利用できる。この形質転換
体は、一般的にビオチンの高生産性を示す。従って、本
発明のもう一つの態様である前記組換えプラスミドで形
質転換したエシェリヒア属に属する微生物を栄養培地で
培養し、培養物からビオチンを採取することを特徴とす
るビオチンの製造方法が提供できる。

【００２９】宿主として用いる前記エシェリヒア属に属
する微生物は、本発明のビオチンオペロンの発現に悪影
響を及ぼさないものであればいずれも使用できるが、好
ましくは予めビオチンの生産に適するように変異された
菌株、例えば前記微生物ＤＲＡＴ株または、本発明者ら
によって作成された、ビオチンによるフィードバック抑
制が解除されているＤＲＫ３３２３（微工研条寄第２１
１６号）などに形質転換し、それを使用してビオチンを
製造する方法等が提供される。

【００３０】ここで用いられるベクターとしては、エシ
ェリヒア コリを宿主とするｐＢＲ３２２系プラスミ
ド、コリシン（Ｃｏｌ）Ｅ１系プラスミド、ラムダーフ
ァージ系など通常用いられるものが採用されるが、本発
明のビオチンオペロンは高発現系のためその分コピー数
の低いプラスミドベクター、例えばｐＭＷ１１９（ニッ
ポンジーン社製）等を用いて、より宿主への無駄な負担
を軽くすることにより、従来よりも優位にビオチンを生
産を行う方法等も提供される。

【００３１】こうして取得した微生物は、エシェリヒア
属に属する微生物を培養するのに通常用いられている栄
養培地、培養条件下で培養することによって、培養液中
にビオチンを著量蓄積することができる。例えば、栄養
培地としては、それ自体既知の炭素源、窒素源、無機物
を含有する合成培地、または天然培地のいずれも使用可
能である。炭素源としてはグルコース、グリセリン、フ
ラクトース、シュークロース、マルトース、マンノー
ス、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜などの炭水化物が利用
でき、その使用量は０．１〜５．０％程度が望ましい。

【００３２】窒素源としては、アンモニア、塩化アンモ
ニウム、燐酸アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの各
種の無機および有機アンモニウム塩類、あるいはアミノ
酸、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、
カゼイン加水分解物、脱脂大豆粉、あるいはその消化物
などの天然有機窒素源が使用可能である。天然有機窒素
は多くの場合、窒素源であるとともに炭素源にもなりう
る。

【００３３】さらに無機物としては、燐酸第一水素カリ
ウム、燐酸第二水素カリウム、硫酸マグネシウム、塩化
ナトリウム、硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、
硫酸銅、塩化マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸ア
ンモン、ほう酸などが利用できる。また、ヨーロッパ特
許公開第０３１６２２９号明細書記載のアラニンの添加
は本発明の微生物でも有効である。培地に添加する濃度
は、１〜１０ｇ／Ｌが好適であり、さらに好ましくは３
〜７ｇ／Ｌである。アラニンの添加は培養の初期から添
加しておいても良いし、小量ずつ分割して添加しても良
い。

【００３４】造成された微生物の抗菌薬剤耐性が付与さ
れている場合には、該当する抗菌剤を培地に添加するこ
とによって汚染菌の混入を防ぐことができる。培養は振
とう培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条件下で行
うのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃が好適であ
り、培養中の培地のpHは中性付近に維持することが望ま
しい。培養期間は通常２４〜７２時間程度である。培養
を終了した後、培養液からのビオチン活性物質の採取に
あたっては、ビオチン、デチオビオチン等のビオチン活
性物質の諸性質を利用して、一般の天然物からの抽出精
製に利用される諸方法が応用できる。例えば、培養物か
ら菌体を除き、活性炭にビオチン活性物質を吸着させ、
しかるのち溶出させてイオン交換樹脂で分離精製する
か、あるいは培養ろ液を直接イオン交換樹脂で処理して
分離精製し、水またはアルコールより再結晶することに
よりビオチン、デチオビオチン等のビオチン活性物質を
採取することができる。

【００３５】

【実施例】次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に
説明するが、本発明の範囲がこれらの実施例に限定され
ることを意図するものではない。実施例１ （１）ＡＣＭ、及びＴＶＡの最小生育阻止濃度の決定 エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３（微工研条寄第２
１１６号）を、ビルビン酸最少培地（リン酸二ナトリウ
ム（１２水和物）８．８ｇ／１、リン酸一カリウム１．
２ｇ／１、硫酸アンモニウム１．０ｇ／１、硫酸マグネ
シウム（７水和物）０．１ｇ／１、ビルビン酸ナトリウ
ム１．０ｇ／１、pH７．０に調整）に寒天保存培地から
一白金耳植菌し、３７℃で１６〜１８時間振とう培養
後、遠心分離により培養液から菌体を回収し、ビルビン
酸最少培地で十分繰り返し洗浄後、同培地に再懸濁して
接種菌液とした。この菌液を各種濃度のＡＣＭ、及びＴ
ＶＡを添加したビルビン酸最少培地に接種し、３７℃で
２４時間振とう培養を行い、濁度（ＯＤ６６０）によっ
て生育菌体量を定量してＡＣＭ、ＴＶＡの生育阻害効果
を調べた。結果を表２、及び表３に示した。ＡＣＭは
０．１ｇ／１の添加濃度でＤＲＫ−３３２３株の生育を
阻止し、ＴＶＡは２ｇ／１の添加濃度でＤＲＫ−３３２
３株の生育を阻止した。

【００３６】

【表２】

【００３７】

【表３】

【００３８】（２）ＡＣＭ、ＴＶＡ耐性株の調製 エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３株をビルビン酸最
少培地中３７℃で４時間振とう培養を行った。対数増殖
期の菌体を集洗後、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン１００μｇ／mLを含有するＴＭ緩衝液
（トリス−塩基０．６１％、マレイン酸０．５％、pH
６．０に調整）に懸濁し、３７℃で３０分間変異処理を
行った。集洗した菌体をビルビン酸最少培地中で回復培
養し、集洗後、再懸濁液をＡＣＭ ０．１ｇ／Ｌ及びＴ
ＶＡ２ｇ／Ｌを含むビルビン酸最少寒天平板培地に菌数
がシャーレ１枚あたり１０⁷ 個程度となるように塗抹し
た。３７℃４８時間培養後、出現したＡＣＭ耐性変異株
コロニーを釣菌し、Ｌ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母
エキス５ｇ／Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム
５ｇ／Ｌ、pH７．０に調整）に接種して３７℃で４８時
間培養し、培養液中に生成蓄積したビオチン量をラクト
バシルス・プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いた
バイオアッセイ法で定量した。親株ＤＲＫ−３３２３株
に比べてビオチン生成蓄積能が増加したＡＣＭ及びＴＶ
Ａ耐性株として、ＤＲＡＴ６，ＤＲＡＴ７，ＤＲＡ８，
ＤＲＡＴ９株の４株を得た。

【００３９】（３）ＡＣＭ、ＴＶＡ耐性変異株からのビ
オチンオペロンのクローニング （ｉ）染色体ＤＮＡの調製 上記のごとくして得たＡＣＭ及びＴＶＡ耐性株のそれぞ
れをＬ−培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母エキス５ｇ／
Ｌ、グルコース１ｇ／Ｌ、塩化ナトリウム５ｇ／Ｌ、）
中３７℃で３時間振とう培養を行い、対数増殖期の菌体
を集洗後、フェノール法〔Biochim.Biophys.Acta, 72,
619(1963) 〕による通常のＤＮＡ抽出法によって抽出精
製し、染色体ＤＮＡを得た。

【００４０】（ii）ベクターＤＮＡの調製 本発明者らにより提供されたエシェリヒア・コリＤＲＫ
−３３２３〔ｐＸＢＡ３１２〕（微工研条寄第２１１７
号）を、テトラサイクリン１０μｇ／mLを添加したＬ−
培地中３７℃で充分に生育させ、通常のアルカリ抽出法
〔Nucleic acidResearch, 7, 1513(1979)〕でプラスミ
ドｐＸＢＡ３１２を取得した。本プラスミドを制限酵素
ＰｓｔＩで完全に切断後、低温ゲルアガロースを用いた
１％アガロースゲル電気泳動を行い、エチジウムブロミ
ドで染色後約３．６kbのＤＮＡ断片を切取り、７０℃で
５分間加熱後にＴＥ緩衝液（１０mMトリス塩酸緩衝液pH
８．０，１mMEDTA) 飽和フェノールをほぼ同量加え、よ
く混合し、遠心分離により水相を得た。この水相からエ
タノール沈澱によりベクターＤＮＡを回収した。

【００４１】(iii) 組換え体プラスミドの調製 上記（ｉ）で調製した各染色体ＤＮＡを制限酵素Ｐｓｔ
Ｉで完全に切断し、アガロース電気泳動後、上記と同様
の方法で約５．５kb近辺の大きさのＤＮＡを回収し、つ
いで（ii）で得られた約３．６kbのベクターＤＮＡとＤ
ＮＡライゲーションキット（宝酒造社製）を用いて連結
させた。

【００４２】（iv）スクリーニング 上記(iii) で調製した各ライゲーション反応液を、特開
昭６２−１５５０８１号公報に記載のエシェリヒア コ
リＪＡ２２１より変異誘導したビオチン要求株であるＢ
Ｒ−４株に常法のカルシウム法〔Mandel M.,等、J.Mol.
Biol., 53, 109, (1970)〕により形質転換し、テトラサ
イクリン１０μｇ／mLを添加したビオチン無添加の最少
寒天平板培地（グルコース０．５％、硫酸アンモニウム
０．４％、燐酸第二水素カリウム０．２％、燐酸第一水
素カリウム０．０１％、ビタミンフリーのカザミノ酸
０．４％、トリプトファン０．００２％、寒天１．５
％）上で生育したコロニーを、テトラサイクリン１０μ
ｇ／mLを添加したＬ−培地中３７℃で充分に生育させ、
通常のアルカリ抽出法で各プラスミドＤＮＡを取得し
た。

【００４３】抽出された各プラスミドは２種類の制限酵
素ＮｃｏＩ，ＥｃｏＲＩで完全に切断後、そのアガロー
ス電気泳動パターンを見ることにより、ビオチンオペロ
ンの挿入向きがｐＸＢＡ３１２と同一のものを選択し、
ＤＲＡＴ６株から由来の組換え体プラスミドｐＡＭＰ６
４、ＤＲＡＴ７株から由来の組換え体プラスミドｐＡＭ
Ｐ７２、ＤＲＡ８株から由来の組換え体プラスミドｐＡ
ＭＰ８２、ＤＲＡＴ９株から由来の組換え体プラスミド
ｐＡＭＰ９１２、をそれぞれ取得した。

【００４４】（４）塩基配列の決定 ビオチンオペロンの制御領域及びｂｉｏＢ開始コドン近
傍のＤＮＡ塩基配列は、ジデオキシ法〔Messing, J. ；
Methods Enzymol., 101, 20(1983) 〕により行った。Ｍ
１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡ，Ｍ１３ｍｐ１８ＲＦＤＮＡ
（宝酒造社より購入）それぞれの制限酵素ＢａｍＨＩ，
ＳｐｈＩ部位に上記（３）にて得られた各組換え体プラ
スミドｐＡＭＰ６４，ｐＡＭＰ７２，ｐＡＭＰ８２，ｐ
ＡＭＰ９１２のビオチンオペロンの制御領域及びｂｉｏ
Ｂ開始コドン近傍のＤＮＡ領域を含むＢａｍＨＩ，Ｓｐ
ｈＩ約３．９kb断片を挿入し、得られた各組換え体ファ
ージを感染させたエシェリヒア コリＪＭ１０５株を２
×ＹＴ培地（バクトトリプトン１．６％、バクト酵母エ
キス１％、塩化ナトリウム０．５％）を３７℃で充分に
生育させ、培養上清に２０％ＰＥＧ（ポリエチレングリ
コール６０００）−２．５Ｍ塩化ナトリウム液を１７容
量％加え、ファージを沈澱させ、沈澱をＴＥ緩衝液に溶
解した後、フェノール処理し、水相をエタノール沈澱し
た。遠心分離後、乾固した１本鎖ＤＮＡについて、宝酒
造社製Ｍ１３シーケンスキット及びアマシャム社製〔α
−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰ（１４．８ＴＢｑ／mmol）を用い
て、ジデオキシヌクレオチド酵素法の反応を行った。そ
の反応の概略は以下の通りである。

【００４５】エシェリヒア コリビオチンオペロンのｂ
ｉｏＡコーディング領域の一部に相当する１７ｂのプラ
イマーＤＮＡ（５′−CAGATATGGCGTTGGTC −３′）を上
記１本鎖ＤＮＡ（Ｍ１３ｍｐ１９系）にアニールする。
また別に、Ｍ１３ｍｐ１８系１本鎖ＤＮＡには、同様に
ビオチンオペロンのｂｉｏＢコーディング領域の一部に
相当する１７ｂのプライマーＤＮＡ（５′−ATTCTGTGAC
TTGCGAC −３′）をアニールする。これら２本のプライ
マーはビオチンオペロンの制御領域をちょうど挟む形に
なっている。プライマーからのＤＮＡ伸長反応をクレノ
ー酵素を用いて行った。このとき、ラジオアイソトープ
ラベルのため〔α−３２Ｐ〕−ｄＣＴＰを取り込ませ
た。また、チェーンターミネーションのためにｄｄＡＴ
Ｐ，ｄｄＣＴＰ，ｄｄＧＴＰ、またはｄｄＴＴＰをそれ
ぞれ加えた反応系を作って反応させた。それぞれのジデ
オキシヌクレオチドを加えた反応液４つを１組として、
７．５Ｍ尿素を含む８％ポリアクリルアミドゲル（４０
cm、０．３mm厚）にて、２０００Ｖの定電圧で電気泳動
した。泳動後、ゲルをワットマン３ＭＭペーパーに付着
させ、バイオラッド社製ゲル乾燥器にてゲルを乾燥し、
オートラジオグラフを行った。フジ写真フィルム社製Ｘ
線フィルムＲＸＯを用い、室温で１晩露出させてから現
像した。結果を表４に示す。

【００４６】

【表４】

【００４７】上記結果から、ＤＲＡＴ６，ＤＲＡＴ７、
及びＤＲＡＴ９株由来のビオチンオペロンが本発明に関
わるビオチンオペロンであることが分かる。実施例２ ビオチン活性物質の製造 上記のＤＲＡＴ株、ｐＡＭＰ系組換えプラスミドを含有
するＢＲ−４株を、まず前培養としてＬ培地（組換えプ
ラスミドを含有する菌株の場合にはテトラサイクリンを
２０μｇ／mL添加）に寒天保存培地から一白金耳接種し
て３７℃８〜１２時間培養した。この前培養液０．２mL
をＨ培地（リン酸二ナトリウム（１２水和物）１７．６
ｇ／１、リン酸一カリウム２．４ｇ／１、硫酸アンモニ
ウム４．０ｇ／１、酵母エキス１０ｇ／１、ペプトン１
０ｇ／１、硫酸第一鉄（７水和物）０．１ｇ／１、塩化
カルシウム（２水和物）０．０５ｇ／１、塩化マンガン
（４水和物）０．０５ｇ／１、硫酸マグネシウム（７水
和物）０．１ｇ／１、グルコース５．０ｇ／１、ＤＬ−
アラニン５．０ｇ／１、pH７．０に調整）２０mLを含む
５００mL容量の坂口フラスコに接種し、３７℃で２４時
間振とう培養し、菌体量およびビオチン生成蓄積量を測
定した。結果を第５表に示す。

【００４８】

【表５】

【００４９】

【発明の効果】本発明によれば、ビオチン活性物質の生
産に有利に使用することができる新規なビオチンオペロ
ンのＤＮＡ配列を提供し、それらのビオチンオペロンを
有するビオチン活性物質生成蓄積能の増加した微生物を
入手することができ、またこのビオチンオペロンを組み
込んだ組換えプラスミドを含有せしめた微生物は、ビオ
チン活性物質の製造に有利に使用することができる。

【００５０】

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：１１４ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖 配列の種類：Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：エシェリヒア コリ（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ） 配列 CGTCCGTTGT CATAATCGAC TTGTAAACCA AATTGAAAAG ATTTAGGTTT ACAAGTCTAC 60 ACCGAATTAA CAACAAAAAA CACGTTTTGG AGAAGCCCCA TGGCTCACCG CCCA 114

【図面の簡単な説明】

【図１】ビオチンオペロンの塩基配列とその特徴部位を
示す。

【図２】ビオチンオペロンのオペレーター領域の塩基配
列を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岸本 治郎 神奈川県横浜市港北区新羽町1050番地 株式会社資生堂研究所内 (72)発明者 中濱 一雄 京都府長岡京市西の京15番地の59 (56)参考文献 特開 昭61−202686（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−155081（ＪＰ，Ａ) Ｎａｔｕｒｅ，1978，Ｖｏｌ．276, ｐ．689−694 Ｇｅｎｅ，1981，Ｖｏｌ．13，ｐ．89 −102 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12P 17/18 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：1に示すエシェリヒア コリ
   のビオチンオペロンの制御領域を含むDNA配列におい
   て、47位のＧ、95位のＧ及び103位のＧの内少なくとも
   １個のヌクレオチドが他のヌクレオチドにより置き換え
   られている、変異したDNA配列。
2. 【請求項２】 配列番号：1に示すエシェリヒア コリ
   のビオチンオペロンの制御領域を含むDNA配列におい
   て、47位のＧ、95位のＧ及び103位のＧの内少なくとも
   １個のヌクレオチドがＡにより置き換えられている、請
   求項１に記載の変異したDNA配列。
3. 【請求項３】 請求項１又は２に記載のDNA配列を担持
   する組換えプラスミドで形質転換したエシェリヒア属に
   属する微生物を栄養培地で培養し、培養物からビオチン
   を採取することを特徴とするビオチンの製造方法。