CZ285533B6

CZ285533B6 - DNA-fragmenty, plasmidy a mikroorganismy obsahující tyto DNA-fragmenty a plasmidy a způsob biotechnologické výroby biotinu

Info

Publication number: CZ285533B6
Application number: CZ95809A
Authority: CZ
Inventors: Olwen Birch; Johann Brass; Martin Fuhrmann; Nicholas Shaw
Original assignee: Lonza Ag
Priority date: 1992-10-02
Filing date: 1993-10-01
Publication date: 1999-08-11
Also published as: FI117515B; JPH08501694A; HUT71781A; CA2145400A1; EP0667909A1; PL308301A1; AU4820293A; HU9500951D0; SK279669B6; ES2112995T3; EP0667909B1; HU219827B; KR100200542B1; JP3577075B2; JP3566287B2; KR950703648A; DE59308149D1; EP0798384A1; FI951547A0; CA2145400C

Abstract

DNA-fragmenty a plasmidy, které zahrnují geny biosynthesy biotinu bioB, bioF, bioD a bioA nebo jejich funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty z enterobakterií, ve kterých jsou geny uspořádány v jedné transkripční jednotce. Vynález se dále týká mikroorganismů, které tyto DNA-fragmenty a plasmidy obsahují a způsobu výroby biotinu za použití těchto mikroorganismů.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantního genetického materiálu pro expresi genů při látkové přeměně biotinu z enterobakterií, mikroorganizmů, které tento rekombinantní genetický materiál obsahují. Vynález se dále týká použití takovýchto mikroorganizmů při biotechnologickém způsobu výroby biotinu. Vynález se dále týká způsobu výroby biotinu, který zahrnuje přeměnu dethiobiotinu pomocí biotinsynthasy v bezbuněčném systému.

Biotin (vitamin H) je pro člověka a zvíře důležitý vitamin, jehož nedostatek může například vyvolat seborrhoe, dermatitis, nechutenství a únavu. Biotin je proto užitečný jako přídavek do potravin a krmiv.

Dosavadní stav techniky

Výroba biotinu metodami syntetické organické chemie je nákladná a drahá. Z tohoto důvodu se zvyšuje zájem o biotechnologické způsoby, při kterých lze biotin syntetizovat pomocí mikroorganizmů z levných výchozích surovin jako je glukóza.

Escherichia coli (E. coli) ie mikroorganizmus, který je schopný syntetizovat biotin z výchozích jednoduchých zdrojů uhlíku jako je glycerin nebo glukóza (Obr. 1). Geny, které zodpovídají za biosynthesu biotinu v E. coli, jsou v operonu, který už byl klonován a který obsahuje pět genů bioA, bioB, bioC, bioD a bioF (dále označované také jako bio-geny) (Gupta a spol., Gene 1:331-345; 1977). Tyto geny se transkribují do dvou různých směrů pomocí oblasti promotoroperátor, která je mezi geny bioA a bioB. S ohledem na konvenční genovou mapu leží geny bioB, bioF, bioC a bioD vpravo a gen bioA vlevo od oblasti promotor-operátor. DNA vlevo od oblasti promotor-operátor má po směru bioA-genu další gen s označením ORFI (ORF = open reading frame), který kóduje polypeptid se 158 aminokyselinami je transkribován spolu s bioAgenem (Otsuka a spol., J. Biol. Chem., 263:19577-19585; 1988). Funkce tohoto genu je dosud neznámá. Jiné kmeny z čeledi enterobakterií, například rodu Salmonella nebo Citrobacter vykazují analogickou strukturu biotin-operonu (Shiuan a Campbell, Gene 67:203-211; 1988).

Jsou známé biotechnologické způsoby výroby biotinu, které se provádějí pomocí mikroorganizmů, které jsou transformované klonovaným biotin-operonem zE. coli. Tyto způsoby vycházejí z glukózy. EP-B-236 429 popisuje například mikroorganizmy, které jsou transformované biotin-operonem zE. coli. přičemž jsou hostitelské organizmy mutovány v jejich birA/bioR-genu.

VEP-A-316 229 jsou popsány mutanty E. coli, které produkují méně acetátu a také byly transformovány klonovaným biotin-operonem, které dodatečně vykazují mutace, které způsobují nižší spotřebu glukózy.

Z EP-A-266 240 je dále známé klonování genů odpovědných za synthesu biotinu v Bacil lus sphaericus a na to založeném způsobu výroby biotinu. Tento způsob musí jako výchozí látku použít drahou kyselinu pimelinovou, což je podmíněno metabolismem Bacillus sphaericus.

Výtěžky získané dosud známými biotechnologickými způsoby jsou z ekonomického hlediska zatím neuspokojivé.

Podstata vynálezu

Úkolem předloženého vynálezu je tedy poskytnout biotechnologický způsob výroby biotinu, který umožní vyšší výtěžky biotinu a bude tím hospodárnější.

Úkol se řeší použitím DNA-fragmentů a vektorů, které zahrnují geny bioB, bioF. bioC, bioD a bioA nebo jejich funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty z enterobakterií, přičemž jsou tyto geny organizovány do transkripční jednotky.

Pod pojmem transkripční jednotka se zde rozumí DNA-sekvence, ve které jsou geny uspořádány ve směru transkripce a jsou pod společnou kontrolou transkripce přepisovány do průběžného transkriptu, přičemž DNA sekvence zahrnuje vedle uvedených genů také genetické kontrolní elementy jako promotory a vazebná místa ribosomů, které jsou potřebné pro expresi genů.

Pod pojmem „funkčně ekvivalentní genetické varianty a mutanty“ se rozumí geny, které jsou odvozeny od genů divokého typu původních organizmů, tzn. enterobakterií a vykazují výměnu bází v rámci známé degenerace genetického kódu. Takové výměny bází mohou vzniknout přirozeně nebo mohou být způsobeny uměle, například aby se přizpůsobila sekvence genů nej výhodnějšímu využití kodonu určitého mikroorganizmu, ve kterém má dojít k expresi. Genetické varianty a mutanty zahrnují dále delece, inserce a substituce bází nebo kodonů, které nechají genový produkt takto změněné sekvence v jeho funkci v zásadě intaktní. Zahrnuty jsou zejména sekvence, které za obvyklých hybridizačních podmínek, tj. při teplotách mezi 55 a 66 °C a při 0,03 až 0,3 M obsahu soli, hybridizují se sekvencemi divokých typů, tedy se sekvencemi, které vykazují vysokou homologii k sekvencím divokých typů, například vyšší než 70 %.

Obr. 1 ukazuje enzymy látkové přeměny při biosynthese biotinu.

Obr. 2 znázorňuje konstrukční schéma pro plazmid pBO30.

Obr. 3 ukazuje DNA-sekvenci plazmidů pBO30, pBO30A-9 a pBO30A-15 pro rozsah 3'-konec bioD-genu a 5'-konec bioA-genu (přerušovaná šipka: bioA-startkodon je podtržený, bioDstopkodon je tečkované vyznačený) spolu s restrikčními místy štěpení relevantními pro vytvořené plazmidu a Shine-Dalgamo (SD)-sekvencí bioA-genu. Potenciální „stem-loop“struktury jsou vyznačeny spojitými šipkami.

Obr. 4 znázorňuje kroky pro variaci sekvence proti směru bioB-genu. když se vychází z plazmidu pbioB::lacZ-2. pro vytvoření zlepšených ribosomových vazebných míst při označení použitých restrikčních míst štěpení, právě těch Shine-Dalgamo-sekvencí (SD) a bioBstartkodonu (Met). Znázorněny jsou sekvence proti směru bioB-genu a 5'-konec bioB-genu. Přerušované čáry představují inserovaný oligonukleotid 985E. Přeškrtnuté nukleotidy by se podle teorie měly vyskytovat, scházejí však v plazmidu pbioB::lacZ/985E a z toho odvozených plazmidů pbioB::lacZ/9 a pbioB::lacZ/16. což má za následek ztrátu BamHI-místa (BamHI). „fíll-in“: doplnění s Klenow-polymerasou.

Obr. 5 znázorňuje konstrukční schéma pro plazmidy pBO30A-15/9 a ρΒΟ30Α-15/9Δ orfl.

Obr. 6 ukazuje DNA-sekvenci a sekvenci aminokyselin genů kódujících biotin-biosynthesu v plazmidu pBO30A-15/9 spolu s genetickými kontrolními elementy (SD: Shine-Dalgamosekvence). Kursivou vyznačené aminokyseliny na COOH-konci bioD15-genu znázorňují substituce vzhledem k sekvenci divokého typu bioD-genu z E.coli.

-2CZ 285533 B6

Obr. 7 znázorňuje konstrukční schéma pro plazmid ρΒΟ74ΔΒ, když se vychází zplazmidů pBO74-13 a pBO3; šipky udávají polohu a orientaci tac-promotoru a bio-genů. Vektorový podíl plazmidů je vyznačen tučně. Přerušované čáry vyznačují rozsah delece bioB-genu.

Na Obr. 2 a 5 znamenají A: AatlI: B: BamHI; Bg: BglII: C: Clal: E: EcoRI; H: HindlII; K: Kpnl; N: Ncol; Nr: Nru:I; P: Pstl; S: Snol; Sa: Saji; Se: Ssel; Sp: Sphl: Ss: SspI: a X: Xbal. „fíll-in“: doplnění recesivních 3-konců s Klenow-polymerasou; mbn: odstranění převislých 5- nebo 3konců „Mung Beán nukleasou“; Bal31: progresivní delece DNA s exonukleasou Bal31. Vektorový podíl plazmidů je znázorněn tučně. Rozdílně šrafované díly v plazmidech se pokaždé použily pro následující klonovací krok. Šipky vyznačují polohu a orientaci bio-genů.

Pro vytvoření DNA-fragmentů a vektorů podle vynálezu se geny biotin-operonu nejprve účelně izolují zchromosomu vhodného mikroorganizmu a pak se za kontroly genověregulačních elementů jako promotory a ribosomová vazebná místa tak spolu spojí, že jsou organizované v jedné jediné transkripční jednotce. Jako výchozí materiál pro isolaci bio-genů mohou sloužit kmeny bakterií z čeledi enterobakterií, například rodu Escherichia. Salmonella nebo Citrobacter. Výhodně je výchozí materiál mikroorganizmus druhu Escherichia coli, kteiý je nejlépe charakterizován.

Vytvoření DNA-fragmentů a vektorů podle vynálezu se může například uskutečnit tak, že se vyjde z genové banky vhodného mikroorganizmu jako je E. coli, ze které se bio-genv nebo jejich fragmenty mohou izolovat a klonovat známým způsobem pomocí hybridizace se značenými oligonukleotidy, které obsahují částečné sekvence bio-genů. Pak se izolované a klonované biogeny pomocí známých metod DNA-rekombinace za kontroly společného promotoru spolu spojí tak, že jsou jako jediná transkripční jednotka. Účelně se bio-genv uspořádají tak, že bioA-gen leží po směru genů bioB, bioF, bioC a bioD, které jsou už v divokém typu operonu z E. coli v jedné transkripční jednotce. BioB-gen kódu je s biotinsynthasou klíčový enzym celého postupu synthesy biotinu, neboť přeměna dethiobiotinu na biotin biotinsythasou tvoří až dosud krok, který určuje rychlost pětistupňové cesty synthesy biotinu. BioB-gen je proto účelně první gen uvnitř transkripční jednotky, takže se pak z důvodu blízkosti k promotoru může uskutečnit optimální exprese tohoto genu (Obr. 2,4, 5 a 6).

Druhá transkripční jednotka v divokém typu biotin-operonu z E. coli, která obsahuje bioA-gen. zahrnuje ještě další gen, ORFI, který kóduje polypeptid se 158 aminokyselinami. Pokusy, které se prováděly s expresními plazmidy, ve kterých není žádný ORFI-gen, ukazují, že tento gen není při obvyklých fermentačních podmínkách esenciální pro biotin-biosynthesu. Přesto však není možné vyloučit, že tomuto polypeptidu s dosud neznámou funkcí přísluší za určitých podmínek také nějaká role při biotin-biosynthese. Přestože tedy není přítomnost ORFI-genu v DNAfragmentech podle vynálezu nezbytně nutná, zahrnuje transkripční jednotka v účelné formě provedení spolu s bio-genv dodatečně také ORFI-gen (Obr. 2, 5 a 6).

V DNA-fragmentech a vektorech podle vynálezu nejsou bio-genv výhodně pod kontrolou přírodního biotin-promotoru z E. coli. Častěji jsou bio-genv pro zlepšení transkripce účelně pod kontrolou silného cizího promotoru. Volba promotoru závisí na požadovaných podmínkách exprese, například na tom, zdaje požadována konstitutivní nebo indukovaná exprese, nebo závisí na mikroorganizmu, ve kterém se má exprese uskutečnit. Vhodnými promotory jsou například promotory P_L a P_R fázu lamda (srovnej Schauder a spol., Gene 52:279-283; 1987), promotor pxvlS TOL-plazmidu z Pseudomonas putida se sousedním regulátorovým genem xylR (Franklin a spol., J. Bacteriol. 154:676-685; 1983), trc-promotor (Amann a spol., Gene 69:301-315; 1988), trp-promotor (Amann a spol., Gene 25:167-178; 1983), promotor pdegO z Bacillus subtilis, který je aktivní ve stacionární fázi (Dahl a spol., J. Bacteriol. 173:1539-1547; 1991) a lacUV5-promotor (Amann a spol., Gene 25:167-178; 1983). Výhodně se jako promotor volí

-3CZ 285533 B6 tac-promotor. hybrid ztrp-a lacUV5-promotoru z E. coli, který se může použít jako konstitutivní nebo inducibilní promotor (Russell a Bennett, Gene 20:231-243; 1982).

Navíc se zjistilo, že se exprese bioA-genu ve shora popsaném výhodném uspořádání může dále zlepšit, jestliže je odstup mezi za sebou následujícími geny bioD a bioA v transkripční jednotce co nejkratší, tj. výhodně méně než 50pb (párů bází). Překvapivě se zjistilo, že je exprese zvláště vysoká, jestliže sekvence 3'-konce bioD-genu, která kóduje COOH-konec dethiobiotin (DTB)synthetasy, současně obsahuje ribosomální vazebné místo následujícího bioA-genu. Výhodně se současně vyskytuje překryv čtecích rastrů genů bioD a bioA. Takovou konstelaci lze dosáhnout tehdy, když se 5-konec bioA-genu spolu sjeho ribosomálním vazebným místem tak fúzuje s bioD-genem. že jeho 3'-konec je substituován sekvencí s ribosomálním vazebným místem proti směru bioA-genu a popřípadě 5-konce bioA-genu (Obr. 3 a 6; Seq ID No: 1, 6 a 8-16). Tento efekt je tím překvapivější, že při takové fúzi může být vyměněn COOH-konec DTBsynthetasy, aniž by enzym ztratil svoji aktivitu. Podobné překryvy jsou také u divokého typu biotin-operon z E. coli mezi čtecími rastry genů bioB, bioF, bioC a bioD.

Exprese bioB-genu se nechá optimalizaci ribosomálního vazebného místa před bioB—genem dále optimalizovat. Účelně se vychází z takové konstrukce, ve které je bioB-gen právě pod kontrolou silného promotoru, např. tac-promotoru. Optimalizace ribosomálního vazebného místa bioBgenu, tzn. variace Shine-Dalgamo-sekvence a její odstup k 5'-konci strukturního genu, lze dosáhnout pomocí běžných metod DNA-rekombinace. Vliv určitého ribosomálního vazebného místa na translaci lze určit osobě známým způsobem, například genovou fúzí testovaného genu s lacZ-genem a následujícím testem s chromogenním substrátem 5-brom—4-chlor-3-indolyl-|3D-galaktopyranosidem (X-Gal).

DNA-fragmenty, které obsahují bio-geny v jedné transkripční jednotce, mohou být zabudovány pomocí známých technik DNA-rekombinace do řady vektorů. Takto se získají například plazmidy pBO30A-15/9 (Obr. 5 a 6, Seq ID No: 1 a 6; příklad 1.5.2) a pBO47 (příklad 1.7). Plazmid pBO30A-15/9 byl uložen 28. 9. 92 u Německé sbírky pro mikroorganizmy a buněčné kultury GmbH, D-3300 Braunschweig, Mascheroderweg lb, v E. coli XLl-Blue a E. coli BM4062 pod depozitním číslem DSM 7246 popř. 7247, a 17. 9. 1993 v E. coli ED8767 pod depozitním číslem DSM 85534. Plazmid pBO47 byl uložen 17. 9. 93 u Německé sbírky pro mikroorganizmy a buněčné kultury GmbH v Agrobacterium/Rhizobium sp HK4 pod depozitním číslem DSM 8555.

V závislosti na druhu zvolených vektorů mohou být geny pro enzymy pro synthesu biotinu exprimovány v různých organizmech. Jako vektory jsou vhodné jak vektory se specifickým hostitelským spektrem, tak také se širokým hostitelským spektrem („broad host range“). Příklady vektorů se specifickým hostitelským spektrem, např. pro E. coli, jsou pBR322 (Bolivar a spol., Gene 2:95-113; 1977), pUC18/19 (Yanisch-Perron a spol., Gene 33:103-119; 1985), pK18/19 (Pridmore, Gene 56:309-312; 1987) a pRA95 (získaný od Nycomed Pharma AS, Hvidovre, Dánsko).

Jako vektory se širokým hostitelským spektrem („broad host range“) lze použít všechny vektory, které se hodí pro Gram-negativní bakterie. Příklady takovýchto vektorů se širokým hostitelským spektrem jsou pRK290 (Ditta a spol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77:7347-7351; 1980), pKT240 (Bagdasarian a spol., Gene 26:273-282; 1983) deriváty pRK290 jako pLAFRl (long a spol., Nátuře 298:485-488: 1982) a pRK290X (Alvarez-Morales a spol., Nucl. Acid. Res. 14:42074227; 1986), deriváty pTK240 jako pMMB66EH (Furste a spol., Gene 48:119-131; 1986) nebo pGSS33 (Sharpe, Gene 29:93-102; 1984).

Pro výrobu produkčních kmenů pro fermentaci, tzn. kmenů pro produkci biotinu, musí se DNAfragment podle vynálezu vložit do žádaných a pro expresi vhodných hostitelských kmenů.

-4CZ 285533 B6

Mikroorganizmy, které jsou vhodné pro expresi bio-genů. výhodné kmeny se širokým substrátovým spektrem, jsou například enterobakterie, výhodně rodu Escherichia, nebo mikroorganizmy rodu Rhizobium, Agrobacterium, Rhizobium/Agrobacterium, Acinetobacter, Azotobacter, Pseudomonas a Comamonas. Obzvláště výhodné jsou mikroorganizmy druhu E. coli. Rhizobium-ZAgrobacterium sp. HK4 (jak je popsáno v EP-B 158 194), Pseudomonas mendocina. Pseudomonas aeruginosa nebo Acinetobacter calcoaceticus. Mikroorganizmy mohou obsahovat DNA-fragment podle vynálezu buď na molekule vektoru nebo integrovaný ve svém chromosomu. Vložení DNA-fragmentu do mikroorganizmů lze provést například transformací nebo konjugací. Účelně se zvolené mikroorganizmy transformují osobě známým způsobem s vektory, které obsahují DNA-fragmenty podle vynálezu. Vhodnými produkčními kmeny jsou například E. coli XL1—Blue, E. coli BM4062 a E. coli ED8767, vždy obsahující plazmid pBO30A-15/9 (DSM 7246, DSM 7247 a DSM 8554) a Agrobacterium/Rhizobium sp HK4 s plazmidem pBO47 (DSM 8555).

Izolace transformovaných hostitelských kmenů se účelně provádí ze selektivního živného média, ke kterému se přidá antibiotikum, vůči kterému jsou hostitelské kmeny resistentní na základě markerového genu nalézajícího se na vektoru nebo DNA-fragmentu.

Biotechnologická výroba biotinu se uskuteční za použití mikroorganizmů, které obsahují DNAfragmenty nebo vektory podle vynálezu. Způsob výroby biotinu se uskuteční obvykle v kulturách, kdy se vychází z vhodného zdroje uhlíku jako růstového substrátu pro určitý mikroorganizmus, který je nakonec přeměněn na biotin. Jako zdroj uhlíku jsou vhodné zejména jednoduché molekuly cukrů, například glukóza nebo glycerin. Podle toho lze jako růstová média použít komerčně běžně dostupná média jako například kvasinkové živné prostředí (Nutrient Yeast Broth NYB: Nutrient Broth No. 2, Oxoid, 25g/l; extrakt droždí, Oxoid, 5g/l) nebo glycerin-a glukóza-minimální média.

Výhodně probíhá fermentace, tzn. výroba biotinu jako tzv. „fed-batch-způsob“, tzn. v batchfermentaci, které se kontinuálně nebo v intervalech přivádí objemový proud s čerstvými živnými látkami, přičemž se neodčerpává žádný kultivační roztok. Při takovém způsobu se jako „feed“ výhodně přivádí roztok glycerinu s variabilní přítokovou rychlostí přizpůsobenou vývoji určité biomasy.

Fermentace se uskutečňuje v rozsahu pH a teploty, které jsou pro daný mikroorganizmus fyziologicky vhodné. Účelně leží hodnota pH v rozmezí od 6 do 8 a teplota v rozmezí od 20 do 45 °C.

Obměnou živin v médiu a přizpůsobením podmínek fermentace pro určitý mikroorganizmus obvyklým způsobem lze výtěžek biotinu dále zlepšit.

Předmětem předloženého vynálezu je dále způsob výroby biotinu, který zahrnuje přeměnu dethiobiotinu na biotin v bezbuněčném systému pomocí enzymu biotinsynthasy, přičemž se reakce provádí v přítomnosti thiaminpyrofosfátu, NADPH, S-adenosylmethioninu, Fe²⁺-iontů, cysteinu a nejméně jedné další aminokyseliny ze skupiny asparagin, kyselina asparagová, glutamin a serin.

Biotinsynthasa se může použít buď ve vyčištěné formě nebo ve formě buněčného extraktu. Účelně se buněčný extrakt nebo vyčištěná biotinsynthasa získá z kmenu se zvýšenou expresí biotinsynthasy, například zE. coli XLl-Blue s plazmidem pO3OA-15/9 (DSM 7246). Příprava buněčného extraktu a popřípadě čištění biotinsynthasy se mohou uskutečnit v biochemii běžnými metodami, například homogenizací buněk, gelovou filtrací, frakcionací síranem amonným a iontoměničovou chromatografií.

-5CZ 285533 B6

Zjistilo se, že lze přeměnu dethiobiotinu na biotin vbezbuněčném systému pomocí biotinsynthasy uskutečnit s dobrými výtěžky jen tehdy, když se reakce provádí za přidání kofaktorů a aminokyselin.

Kofaktory potřebné pro reakci zahrnují S-adenosylmethionin (SAM), thiaminpyrofosfát (TPP), redukovaný nikotinamidadenindinukleotidfosfát (NADPH) a Fe²⁺-ionty. Kofaktory se účelně přidávají v koncentracích od 1 do 500 μΜ. Účelně se ke směsi také přidává dithiothreitol (DTT) v koncentraci od 0,1 do 10 mM.

Aminokyseliny, které jsou pro reakci potřebné, jsou cystein jako donor síry a alespoň jedna další aminokyselina ze skupiny asparagin, kyselina asparagová, glutamin a serin. Kyselina asparagová se účelně přidává jako aspartát. Cystein se účelně přidává v koncentraci od 10 do 500 pm, další aminokyseliny v koncentracích od 1 do 50 mM.

Dále se zjistilo, že se přeměna dethiobiotinu na biotin při použití čištěné biotinsynthasy uskuteční jen v přítomnosti flavodoxinu a ferredoxinu(flavodoxinu)-NADPI-r-reduktasy. Účelně se proto pro přeměnu přidávají flavodoxin a ferredoxin(flavodoxin)-NADPH⁺reduktasa, zejména když nepoužívá biotinsynthasa ve formě buněčného extraktu. Flavodoxin a ferredoxin(fiavodoxin)-NADPFr-reduktasy (EC-Nr, 1.18.1.2) jsou známé proteiny, které lze získat známým způsobem, například frakcionací síranem amonným s následující iontoměničovou chromatografíí a gelověfíltrační chromatografíí, nezávisle na expresi biotinsynthasy z buněčných extraktů E. coli. Tak se mohly izolovat flavodoxin a ferredoxin(flavodoxin)-NADPH*-reduktasa například jak z E. coli XLl-Blue splazmidem pBO30A-15/9 (DSM 7246), který má zvýšenou expresi biotinsynthasy, tak také zE, coli XLl-Blue splazmidem ρΒΟ74ΔΒ (DSM 7245), ve kterém je biotinsynthasa-gen bioB deletován (Obr. 7). Plazmid ρΒΟ74ΔΒ byl uložen v E. coli XLl-Blue 28. 9. 1992 u Německé sbírky pro mikroorganizmy a buněčné kultury GmbH, D-3300 Braunschweig, Maxscheroderweg lb pod depozitním číslem DSM 7245.

Navíc se zjistilo, že pro přeměnu dethiobiotinu na biotin jsou vedle biotinsynthasy potřebné další proteiny, které jsou obvykle obsažené v buněčném extraktu E. coli. Tyto proteiny jsou obsaženy v proteinové frakci, která se získá precipitací síranem amonným při 45%-ním nasycení síranem amonným z buněčného extraktu E. coli. Jak ukazuje izolace jedné takové proteinové frakce z E. coli XLl-Blue s plazmidem ρΒΟ74ΔΒ (DSM 7245), není exprese biotinsynthasy potřebná pro přítomnost a získání těchto proteinů. Sraženina získaná po precipitaci síranem amonným lze například dále čistit chromatografickými metodami, jako je iontoměničová chromatografie a gelověfíltrační chromatografie. Účelně se proto ke směsi pro přeměnu dethiobiotinu na biotin přidá proteinová frakce získaná shora popsaným způsobem, zejména když není biotinsynthasa použita ve formě buněčného extraktu.

Přeměna se provádí ve vhodné pufračním systému, účelně v rozmezích hodnot pH a teploty, ve kterých jsou enzymy fyziologicky aktivní, výhodně v rozmezí pH od 6 do 9 a při teplotě mezi 4 a 50 °C.

Předložený vynález je dále vysvětlen v následujících příkladech.

Příklady provedení vynálezu

Obecné postupy:

Restrikční endonukleasy byly použity s 3 až 5 jednotkami/pg DNA podle údajů výrobků. Značení a fosforylace DNA-linkerů (zakoupených od Boehringer Mannheim, SRN) pro zabudování restrikčních míst štěpení a syntetických oligonukleotidů (zakoupených od

-6CZ 285533 B6

Microsynth, Windisch, CH), například pro použití jako sond pro DNA/DNA-hybridizace a jako „primer“ pro reakce spojené se sekvenováním, se uskutečnily s T4-polynukleotid-kinasou (Boehringer Mannheim, SRN) podle Sambrooka a spol. (Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY; 11.31 a 5.68;

1989). Ligační reakce se uskutečnily s T4-DNA-ligasou podle údajů výrobce.

DNA-sekvenování se uskutečnila metodou zmenšování řetězce podle Sangera a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94:5463-5467; 1977). Všechny sekvenční reakce se prováděly se sekvenasou-K.it od United States Biochemicals (Cleveland, OH, USA) podle protokolu výrobce. Sekvenasa (verze 2.0, geneticky změněná T7-DNA-polymerasa) poskytovala rovnoměrnou, dobře čitelné DNA-sekvence přes více než 600bp; komprese v DNA-oblastech bohatých na GC se daly lehce uvolnit, když se místo dGTP použil nukleotid dITP. Jako matrice pro sekvenční reakci byly zpravidla použity jednovláknové formy vektorů M13mpl8/19 (Yanisch-Perron a spol., 1985, ibid.) nebo pBluescript KS⁺/SK⁺ (ap^R lacZ'; získaný ze Stratagene, La Jolla, CA), které byly izolovány podle Messinga (Methods Enzymol. 101:20-79; 1983). Pro sekvencování dvouvláknité plazmid-DNA byla plazmid-DNA čištěna pomocí CsCl-gradientu nebo „Gene Clean“ (BIO 101, La Jolla, CA). Jako radioaktivně značený nukleotid byl použit a[³⁵S]-dATP (NEN-Du Pont, NEG-034H). Elektroforetické rozdělení se uskutečnilo buď v běžných 4% popř. 6% bis/akrylamidových gelech se 7M močoviny a 1 x TBE pufrem (90 mM Tris, 90 mM kyseliny borité, 2.5 mM EDTA), nebo v gelech z 5% HydroLink Long Ranger (AT Biochem, Malvem, PA, USA, via Chemie Brunschwig, Basel) se 7M močovinou a 1,2 x TBE-pufrem. Gely byly 550 mm dlouhé a 0,2 mm tlusté; elektroforéza se prováděla v zařízení LKB Macrophor s termostatem při napětí 2100 V a teplotě 60 °C. Pak byly geny sušeny na papíru Whatman 3 MM a podrobeny autoradiografii s rentgenovými filmy Fuji RX nebo Amersham Hyperfilm Pmax.

Izolace extrachromosomální DNA se provedla buď v menších množstvích podle „rapid alkaline SDS“ („miniprep“)-metody podle Bimboim a Doly (Nucl. Acid. Res. 7:1513-1523; 1979), nebo pro izolaci větších množství odstředěním v hustotním gradientu chloridu cesia modifikovanou metodou podle Clewell a Helsinki (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 42:1159-1166; 1969). Alternativně se použily QUIAGEN-packs firmy DIAGEN, Důsseldorf (SRN).

Pro transformaci E. coli s plazmid-DNA se buňky připravily podle Cohena a spol. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 69:2110-2114; 1972) v 50 mM CaCl₂. Transformace s plazmid-DNA a selekce klonů nesoucích plazmid se provedla pole Sambrooka a spol. (1989; ibid. 1.82-1.84).

Příklad 1

Klonování E. coli biotin-operonu v jediné transkripční jednotce

1.1. Vytvoření pBOl aM13bioD

Pro klonování bio-genů byla izolována chromosomální DNA zE. coli DSM 498 (K12 „divoký typ“; Německá sbírka pro mikroorganizmy a buněčné kultury GmbH). Izolace se provedla v podstatě podle Hahna a Hennecka (Mol. Gen. Genet. 193:46-52; 1984). Pak byly 2 pg celkové DNA z E. coli DSM 498 štěpeny restrikčním enzymem Pstl. DNA-fragmenty byly elektroforeticky rozděleny v horizontálním 0,7% agarosovém gelu obvyklým způsobem (Sambrook a spol., 1989, ibid.; 6.19 až 6.9) a transferovány na „Gene Screen“ membránách (nylonová membrána od NEN-Du Pont) podle (Southem, J. Mol. Biol., 98:503—517; 1975). DNA byla dvouhodinovou inkubací při 80 °C ve vakuové peci fixována na vysušených filtrech. Pro identifikaci DNA-fragmentů s bio-operonem byl hybridizován syntetický oligonukleotid dlouhý 25 nukleotidů se sekvencí 5'-GGCTCACCGCCCACGCTGGACATTG—3', odpovídající

-7CZ 285533 B6 sekvenci z 5-konce bioB-genu (Otsuka, A. J., Dizertace, Univerzita v Kalifornii, San Diego, CA.; 1978) jako sonda s DNA vázanou na filtru. Ktomu bylo nejprve 40 pMol tohoto oligonukleotidů koncově značeno s T4-polynukleotid-kinasou a τ-[³²Ρ]-ΑΤΡ (75 pCi). Hybridizace DNA vázané na filtru s radioaktivně značenou sondou se provedla podle Sambrooka a spol., (1989, ibid., 9.52-9.55). Ktomu byla DNA nejdříve předhybridizována 2 h v 5x Denhardt-roztoku (lx Denhardt-roztok: 0,02% hovězí serum-albumin, 0,02% Ficoll, 0,01% polyvinylpyrrolidon), 6x SSC-pufru (lx SSC: 150 mM NaCl, 15 mM Natriumcitrát, pH 7,2) a 150 pg/ml DNA spermatu lososa. Pak byla DNA hybridizována 18 hod. v 2x Denhardt-roztoku, 6x SSc, 0,5% SDS, 150 pg/ml DNA spermatu lososa a 2 hod. promývána a nakonec čtyřikrát promyta pokaždé 30 min. v 2x SSc, 0,1% SDS. Při všech krocích byla teplota 65 °C. Značený oligonukleotid hybridizoval na tomto „Southem blot“ s 5,4 kb dlouhým Pstl-fragmentem.

Pro klonování tohoto 5,4 kb-Pstl-fragmentu s biotin-operonem bylo nejprve 50 pg celkové DNA zE. coli DSM 498 štěpeno s Pstl a rozděleno 0,7% agarosovém gelu jak shora uvedeno. Fragmenty o velikosti od 4,5 kb do 6,5 kb byly z gelu vyřezány a izolovány elektrodialýzou v dialyzaČních střevech. Přibližně 0,6 pg těchto fragmentů bylo ligováno s 0,6 pg vektoru pHE3 (Hennecke a spol., Gene 19:231-234; 1982) rozštěpeného s Pstl. Tento vektor obsahuje gen pro chloramphenicol-rezistenci (Cm^R), ColEl replikon zpACYC184 (Chang und Cohen, J. Bacteriol., 134:1141-1156; 1978) jakož i E. coligen pheS pro fenylalanin-tRNA-synthetasu, který má Pstl-místo.

0,2 ml způsobilých buněk z E. coli RP 28 (Hennecke a spol., 1982, ibid.) v 50 mM CaCl₂ bylo transformováno touto ligační směsí. E. coli RR28 má v chromosomu mutovány pheS-gen (pheS12) a je proto rezistentní vůči p-fluorfenylalaninu (pFphe) v růstovém médiu. Když RR28 nese plazmid pHE3 s pheS divokým typem genu, je kmen na rozdíl od toho sensitivní vůči pFphe. Inserce DNA-fragmentů do Pstl-místa štěpení pHE3 přeruší pheS divoký typ genu; RR28 s rekombinovaným plazmidem je proto pFphe-rezistentní (pFphe^R). Transformované buňky se rozprostřely na destičky s pFphe-minimální médium (7,1 g/1 Na₂HPO₄, 13,6 g/1 KH₂PO₄, 0,014 g/1 CaCl₂x2H₂O, 0,25 g/1 MgSO₄, 1,58 g/1 (NFLi)₂SO₄, 15 g/1 agar, 4 g/1 glukóza, 0,005 g/1 thiamin, 0,05 g/1 leucin, 0,05 g/1 prolin, 0,2 g/1 D,L-p-fluorfenylalanin, 0,02 g/1 chloramphenicol; Hennecke a spol., 1982, ibid.) a izolovalo se ca. 2500 Cm^R pFphe^R klonů, které obsahovaly plazmid pHE3 (Cm^R) s insertem v pheS-genu (pFphe^R). 600 těchto klonů bylo přetištěno na nitrocelulózové filtry, které ležely na Nutrient agar (NA)-destičkách (NA: Blood Agar Base (Oxoid), 40 g/1; extrakt droždí (Oxoid), 5 g/1) s 20 pg/ml Cm. Filtry s narostlými koloniemi (průměr 3 až 5 mm) se zpracovaly podle Grunstein a Hogness (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 72:3961-3965; 1975), aby se buňky lyžovaly a aby se uvolněná DNA vázala. Filtry s lyžovanými a fixovanými buňkami E. coli byly hybridizovány se shora popsaným ³²P značeným bioB-oligonukleotidem o 25 nukleotidech. Hybridizace se provedla podle modifikací pro hybridizaci kolonií podle Sambrook a spol. (1989, ibid., 11.00), tzn. předhybridizace, hybridizace a první růstový proces se uskutečnily v 4x Denhardt-roztoku, 6x SSC, 100 pg/ml DNA spermatu lososa, s následujícím 6x promytím v 2x SSC. Teplota byla 65 °C. 3 klony vázaly bioB-oligonukleotid; z jednoho z těchto klonů byl izolován plazmid pBOl s Pstl-fragmentem dlouhým 5,4 kb (Obr. 2). Restrikční analýzy a srovnání s publikovanými daty (Szybalski a Szybalski, Gene 19:93-103; 1982) ukázaly, že pBOl obsahoval všechny geny biotin-operonu s výjimkou bioD.

Ke klonování bioD-genu se použila sonda s částmi genů bioC a bioD, složená z 520 bp dlouhého SphI/Pstl-fragmentu zpBOl. Tento fragment byl izolován zagarosového gelu. 0,2 pg izolovaného fragmentu bylo radioaktivně značeno pomocí „Nick-Translation“ s DNApolymerasou I (Boehringer Mannheim, SRN; holoenzym zE. coli; tato tzv. „Kombergpolymerasa“ byla použita spolu s DNasou I) a 25 pCi a-[³²P]-dATP (NEN-Du Pont, NEG012H) podle (Sambrook a spol., 1989, ibid. 10.8). Hybridizace této sondy s restrikčními fragmenty E. coli DSM 498-chromosomu vyrobených s SspI na „Southem blot“ jak shora

-8CZ 285533 B6 uvedeno ukázala na jedné straně 1,6 kb-SspI-fragment s bioF a bioC známý z pBOl a na druhé straně 1,1 kb-SspI-fragment s bioD a sekvencemi sousedního genu uvrB (Sancar a spol., Cell,

28; 523-520; 1982).

Ke klonování 1,1 kb-SspI-fragmentu byla opět založena částečná genová banka. K tomu bylo 30 pg DNA E. coli DSM 498 štěpeno s SspI a rozděleno na 0,7% agarosovém gelu. Fragmenty o velikosti od 0,9 kb do 1,3 kb byly vystřiženy a izolovány elektrodialýzou. 0,5 pg těchto fragmentů byly ligovány s 0,5 pg fágové vektoru M13mpl9 štěpeného s Smál (Yanisch-Perron a spol., 1985, ibid.). S touto ligační směsí se provedla transfekce E. coli JM109 (Yanisch-Perron a spol., 1985, ibid.) podle Messinga (Methods Enzymol., 101:20-79; 1983). Bylo izolováno 150 fágových klonů s insertem (fenotyp LacZ~) a rozmnoženo v ΝΎΒ-mediu. Po odstředění E. colibuněk byly fágy pokaždé v 50 pl supematantů naneseny pomocí zařízení Schleicher & Schiill „minifold I“ jako „dot blot“ na nitrocelulózový filtr (Schleicher & Schůll BA 85). Pro denaturaci fágů byly filtry zpracovány 5 min. spufrem 0,1 M NaOH/1,5 M NaCl a pak neutralizovány 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5/2,5 M NaCl (5 min.). DNA byla na filtru fixována 2 hod. inkubací při 80 °C. Filtr byl hybridizován jak popsáno (Sambrook a spol., 1989, ibid., 9.52-9.55) s radioaktivně značeným 520 bp dlouhým SphI/Pstl-fragmentem při 60 °C. Takto byl identifikován fágový klon M13bioD svýše popsaným 1,1 kb-SspI-fragmentem. který obsahuje bioD-gen (Obr. 2).

1.2 Vytvoření pBO2

Vždy 0,5 pg plazmidu pBOl a 0,5 pg fágu M13bioD byly štěpeny restrikčními enzymy Snol a HindlII a v jedné směsi religovány. Po transformaci E. coli RR28 touto směsí byly zjišťovány rekombinované plazmidy pomocí restrikční analýzy. Byl zvolen plazmid pBO2 (Obr. 2), ve kterém je ca. 1,5 kb dlouhý SnoI/HindlII-fragment z pBOl, který obsahuje část bioD-genu a neesenciální sekvenci vektoru pHE3, nahrazen 0,95 kb dlouhým SnoI/HindlII-fragment z M13bioD. Analýza ukázala, že plazmid pBO2 obsahoval kompletní bio-operon. který je v E. coli, spolu se sekvencemi uvrB-promotoru (Sancar a spol., Cell 28:523-530; 1982) ve směru bioD.

1.3 Vytvoření pBO3 a pBO6

Bylo pozorováno, že E. coli RR28 roste hůře s pBO2 na NA-destičkách než s pBOl a tvoří zřetelně menší kolonie. Příčinou toho mohou být uvrB sekvence v pBO2. Pro deleci těchto uvrB sekvencí bylo 20 pg pBO2-DNA štěpeno s HindlII a rozpuštěno ve 150 pl Bal31-pufru (600 mM NaCl, 12,5 mM MgCl₂, 12,5 mM CaCl₂, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,2). Pak byl pro postupné zkracování lineárních plazmidů přidán Bal31 (z Alteromonas espeiiani, Boehringer Mannheim, SRN). Po 3, 6, 9, 12 a 15 min inkubaci při 30 °C byly odebrány alikvoty vždy po 30 pl a Bal31-reakce zastavena přidáním vždy 2 pl 0,5 M EGTA (kyselina ethylenglykol-bis-(2-aminoethyl)-tetraoctová), pH 7,5, a následující extrakcí fenolem. Alikvoty pak byly rozpuštěny ve 40 pl Mung Beán Nuclease-pufřu (30 mM natriumacetát, 50 mM NaCl, 1 mM ZnCl₂, 5% glycerin, pH 4,6) a pro odstranění nespárovaných jednovláknových konců a vytvoření nespecifických tupých konců byly zpracovány 10 min při 37 °C sMung Beán Nucleasou (Boehringer Mannheim, SRN).

Při zpracování s Bal31 se odstraní nejen uvrB-sekvence. ale také esenciální sekvence vektoru pHE3. Proto byly zkrácené pBO2-plazmidy po zpracování s Mung Beán Nucleasou štěpeny s Eco-RI, aby se odstranila část vektor-DNA zpHE3, která byla zkrácena Bal31. Původní vektorová sekvence byla pak regenerována tím, že byly zpracované pBO2-plazmidy ligovány s

1,5 kb-DNA-fragmentem, který byl po restrikci s BamHI. zpracování s Mung Beán Nucleasou a další restrikci s EcoRI izolován z pBO2 a který má předtím deletovanou esenciální vektorovou

-9CZ 285533 B6 sekvenci zpHE3. Protože touto ligací se zcela regeneruje Cm-rezistence vektoru, mohou být rozeznány intaktní plazmidy na základě jejich vlastnosti, zprostředkovat rezistenci proti Cm.

E. coli RR28 byl transformován ligačními směsmi a rozprostřen na NA-destičkách s 20 pg/ml Cm. Byly pozorovány malé pomalu rostoucí kolonie, jak jsou typické pro pBO2, a velké normálně rostoucí kolonie. Počet velkých kolonií na pBO2-alikvot vzrůstal s dobou Bal31inkubace.

Z 22 normálně rostoucích kolonií byla izolována plazmid-DNA a zkoumána restrikční a sekvenční analýzou. Takto byly získány plazmidy pBO3 a pBO6, ve kterých bylo deletováno ca 330 bp popř. 410 bp uvrB oblasti, které ale ještě zcela měly bioD-gen.

1.4. Klonování bio-genů v transkripční jednotce

1.4.1 Vytvoření pBO22: tac promotor před bioB

Pro zabudování vhodného promotoru před gen bioB se musí odstranit nežádoucí divoký typpromotor před geny bioBFCD. To se může provést štěpením s Ncol. čímž se současně uvolní start-kodon bioB-genu. V předloženém případě byl jako promotor zvolen tac-promotor (Russel a Bennett, 1982, ibid.), protože může být použit jako konstitutivní nebo indukovatelný promotor a je dobře aktivní nejen v E. coli, ale i v mnoha jiných Gram-negativních bakteriích.

DNA-fragment s tac-promotorem s konci HindlII a BamHI byl zakoupen u Pharmacia-LKB (Uppsala, Švédsko) a zabudován do plazmidů pUC18 štěpeného HindlII a BamHI (YanischPerron a spol., 1985, ibid.). Vznikl plazmid pUC 18/tac (Obr. 2). 8 pg tohoto plazmidů bylo pak štěpeno s BamHI a pro doplnění recesivních 3'-konců bylo inkubováno s Klenow-polymerasou (DNA-polymerasa I z E. coli: Boehringer Mannheim, SRN) v Klenow-polymerasa-pufru (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 6 mM β-merkaptoethanol) za přidání po 100 pg dATP, dGTP, dCTP a dTTP. Pak se provedla druhá restrikce s AatlI. Takto se izoloval 0,55 kb dlouhý DNA-fragment s tac-promotorem.

3,2 kb-fragment s geny bioB. bioF, bioC a 5'-koncem bioD-genu byl izolován z pBOl. K tomu bylo 8 pg pBOl štěpeno sNeol a pak pro doplnění recesivních 3'-konců zpracováno s Klenowpolymerasou jako shora uvedeno. Pak byla provedena druhá restrikce s Pstl. následována izolací požadovaného 3,2 kb-fragmentu. Nakonec byly 4 pg vektoru pH3 štěpeny s Pstl a AatlI a P15Areplikon byl izolován z pHE3 (Hennecke a spol., 1982, ibid.).

Tyto tři fragmenty byly pro ligaci přečnívajících a hladkých konců zpracovány ve směsi v ekvimolámích množstvích s T4-DNA-ligasou (Boehringer Mannheim, SRN), přičemž byly vždy přečnívající konce od Pstl s Pstl a od AatlI s AatlI spolu ligovány a hladké konce po zpracování s Klenow-polymerasou od BamHI a Ncol byly spolu ligovány. Při ligaci BamHIkonce doplněného pomocí Klenow-polymerasy se stejně opracovaným Ncol-koncem byly regenerovány BamHI- a Ncol-místa štěpení. E. coli RR28 byla touto ligační směsí transformována a podrobena selekci na Cm^R. Plazmid-DNA z transformantů s Cm^R byla zkoumána restrikční analýzou. Takto byl získán plazmid pBO21 (Obr. 2), ve kterém je tacpromotor před bioB-genem. Delecí 1,5 kb dlouhého HindlII-fragmentu z pBO21, který vykazuje neesenciální sekvence z plazmidových vektorů pHE3 a pUC18, se nakonec získal pBO22 (Obr. 2).

1.4.2. Vytvoření pBO27 a pBO28 pg pBO22 byly štěpeny s Pstl a převislý Pstl-konec byl zkrácen na hladký konec zpracováním s Mung Beán nukleasou. Pak byl štěpen s Snol a vzniklý 6,8 kb dlouhý DNA-fragment byl

-10CZ 285533 B6 izolován. 0,76 kb-DNA-fragment s 3'-koncem bioD-genu byl izolován z 5 pg pBO3 po restrikci s Clal. doplnění převislých Clal-konců pomocí Klenow-polymerasy a restrikci s Snol. Oba DNA-fragmenty byly ligovány pomocí T4-DNA-ligasy a pak byla E. coli ligační směsí transformována. Po selekci na chloramfenicolu se z transformantů s Cm^R po restrikční analýze získal plazmid pBO27. Tento plazmid obsahuje tac-promotor spolu s geny bioB, bioF, bioC a úplným bioD-genem v jedné transkripční jednotce (Obr. 2).

Pro deleci BamHI místa štěpení v pBO27 bylo štěpeno 5 pg pBO27 s BamHI. inkubováno s Klenow-polymerasou a nukleotidem dGTP jak shora popsáno a pak zpracováno s Mung Beán nukleasou. Po religaci této DNA s T4-DNA-ligasou a transformaci E. coli DH5 (Hanahan, J. Mol. Biol. 166:557-580; 1983) byl získán plazmid pBO28, ve kterém je deletováno BamHI místo štěpení, zatímco Ncol místo štěpení zůstalo zachováno (Obr. 2).

1.4.3. Vytvoření M13biol8 aM13biol8/13

Pro odstranění nežádoucího promotoru divokého typu před bioA-genem byl nejdříve pomocí restrikce 5 pg pBO3 s BglII a KpnI izolován 4,4 kb-fragment s geny bioB. bioF, bioA a ORFI. 0,5 pg tohoto fragmentu bylo ligováno s 0,5 pg fágového vektoru M13mpl8 štěpeného BamHI a KpnI (Yanisch-Perron a spol., 1985., 1985, ibid.) touto ligační směsí byly identifikovány rekombinované fágové klony, které měly insert, podle Messinga (1983, ibid.); dvouvláknové fágové DNA byly izolovány z těchto klonů a zkoumány pomocí restrikční analýzy. Takto se získal fág M13biol8 s požadovaným 4,4 kb-fragmentem (Obr. 2).

pg dvouvláknové DNA fágu M13biol8 bylo linearizováno pomocí restrikce sNcol. zředěno 160 pl Bal31-pufrem, a hned po tom byl přidán Bal31 pro odstranění bioA-promotoru. Po 20, 40, 60, 80, 100 a 120 sek. inkubace při teplotě místnosti byly odebrány alikvoty po 25 pl a přidáním 2 pl 0,5 M EGTA, pH 7,5 a extrakcí fenolem byla Bal31-reakce zastavena. Vždy 3 alikvoty byly spojeny a štěpeny s Xbal. aby byly odstraněny geny bioB a bioF. Hned potom byla DNA zpracována s Klenow-polymerasou jak shora uvedeno, aby přečnívající 5'-konce byly doplněny na hladké konce. Takto opracovaná DNA byla religována a E. coli JM109 byl transformován s ligovanou DNA. Z 24 fágových klonů byl izolována jednovláknová DNA (Messing, 1983, ibid.) a DNA-sekvence na 5'-konci genu bioA byla analyzována podle Sangera a spol. (1977, ibid.). Takto byl získán fágový klon M13biol8/13, ve kterém je promotor divokého typu před bioA-genem deletován a který má současně Sall-místo štěpení 26 bp proti směru bioA-genu (Obr. 2).

1.4.4. Vytvoření MI3bioDA

Pro uspořádání genů bioD a bioA v jedné transkripční jednotce bylo 5 pg plazmidu pBO6 (Obr. 2) štěpeno s Sphl a Sáli. Vzniklý 0,97 kb dlouhý DNA-fragment, který má gen bioD a 72 bp DNA ve směru bioD-genu až k Sall-konci. byl izolován. 2 pg M13biol8/13 byly také štěpeny s Sphl a Sáli. DNA-fragmenty byly ligovány T4-DNA-ligasou a E. coli JMI09 byl transformován. Ze 24 rekombinovaných klonů byla izolována dvouvláknová fágová DNA a byla charakterizována restrikční analýzou. Takto byl získán klon M13bioDA, ve kterém jsou geny bioD a bioA od sebe vzdáleny 98 bp (Obr. 2).

1.4.2. Vytvoření pBO30 pg DNA z M13bioDA bylo štěpeno s Ecol pro vytvoření transkripční jednotky s tacpromotorem před bio-geny. pro vyplnění převislých EcoRI-konců bylo zpracováno jako shora s Klenow-polymerasou a pak štěpeno s Snol. Vzniklý 2,6 kb dlouhý DNA-fragment s geny bioD, bioA a ORFI byl izolován. 5 pg plazmidu pBO28 (Obr. 2) bylo štěpeno se Sáli, zpracováno s Mung Beán nukleasou pro odštěpení převislých Sall-konců a pak také štěpeno se

-11CZ 285533 B6

Snol. Byl izolován 6,7 kb dlouhý DNA-fragment s vektor-DNA, tac-promotorem a geny bioBFC.

Izolované DNA-fragmenty byly ligovány s T4-DNA-ligasou a biotin-auxotrofní kmen E, coli SA291 (Cleary a Campbell, J. Bacteriol. 112:830-839; 1972) byl touto ligační směsí transformován. Rozprostřením na NA-destičky s 20 pg/ml Cm a 8 pg/ml avidinu byly získány selekcí klony s kompletním biotin-operonem v plazmidu. Plazmidy z těchto klonů byly přezkoumány pomocí restrikční analýzy. Takto byl získán plazmid pBO30, který obsahuje geny bioB, bioF, bioC, bioD a bioA a gen ORFI spolu s tac-promotorem v jedné transkripční jednotce (Obr. 2).

1.5 Vytvoření plazmidů se zlepšenou expresí bio-genů

1.5.1. Vytvoření pBO30A-9 a pBO30A-15

V minibuňkách zE. coli DS410 (Dougan a Sheratt, Mol. Gen. Genet. 151:151—160; 1977) s plazmidem pBO30 byla podstatně slaběji exprimována DAPA-aminotransferasa kódovaná bioA-genem než jiné enzymy pro synthesu biotinu. V jednom pokusu pro zlepšení exprese bioA-genu byl zkrácen odstup mezi bioD-genem a bioA-genem pomocí exonukleasy Bal31, aby se odstranily případné rušivé sekvence jako struktury „stem-loop“. K tomu bylo štěpeno 25 pg pBO30 se Sáli a pak zpracováno jako shora s exonukleasou Bal31 a s Klenow-polymerasou. Sall-místo štěpení bylo regenerováno ligací se syntetickým oligonukleotidem o sekvenci 5'CGTCGACG-3', sall-linkerem. DNA pak byla štěpena Sáli a Snol a na 3-konci zkrácené bioDfragmenty o délce asi 640 bp byly izolovány. Tyto fragmenty byly ligovány s 8,25 kb velkým fragmentem z pBO30, který mohl být izolován po štěpení tohoto plazmidu se Sáli a Snol a který obsahuje nezměněný bioA-gen.

Biotin-auxotrofní kmen E. coli SA291 byl shora uvedenou ligační směsí transformován, aby se získaly selekcí na Na-destičkách se 60 pg/ml Cm a 5 pg avidinu klony s intaktním bioD-genem. Získalo se 26 takových klonů, které byly zkoumány restrikční analýzou. 8 těchto klonů se zřejmým zkrácením oblasti proti směru Sall-místa bylo přesněji charakterizováno DNAsekvenční analýzou. V pěti těchto klonech bylo jak požadováno asi 20 až 45 bp DNA deletováno mezi bioD-genem a bioA-genem. V E. coli-minibuňkách ovlivňovaly opravdu tyto klony zvýšenou expresi bioA-genu o faktor 2 vůči pBO30. Příklad pro plazmid s takto zlepšenou expresí je plazmid pBO30A-9 získaný tímto způsobem (Obr. 3).

Překvapivě byly izolovány tři další plazmidy, ve kterých bylo 70 až 90 bp DNA deletováno mezi bioD-genem a bioA-genem. Delece dosahovaly tedy až do bioD-struktumího genu. Z toho vyplynulo (i) pokaždé rozdílný COOH-konec DTB-synthetasy bez velké změny enzymové aktivity a (ii) překrytí změněných bioD-genů s bioA-čtecím rastrem. Takto se například získal plazmid pBO30A-15 s bioD-gen-mutantem bioD15 (Obr. 3, 5 a 6). V E. coli-minibuňkách s pBO30A-15 je bioA-exprese zvýšena o faktor 4 ve srovnání s pBO30.

DNA-sekvence bioDA-oblasti a z toho odvozená sekvence aminokyselin plazmidů pBO30, pBO30A-9 a pBO30A-15 jsou uvedeny na Obr. 3 (Seq ID No 9-16).

1.5.2. Vytvoření plazmidů se zlepšeným vazebným místem ribosomů před bioB-genem

Pro zlepšení translace bioB-genu. jehož exprese v pBO30 je zřetelně slabší než například bioDgenu, byla proti směru bioB-genu v pBO30 modifikována sekvence, která obsahuje tacpromotor a vazebné místo ribosomů, která je obsažena v klonovaných tac-promotorfragmentech. Proto byly před gen bioB vloženy syntetické, tak zvané smíšené neboli „mixed“ oligonukleotidy s proměnlivými sekvencemi. Pro jednoduchý výběr vhodných vazebných míst

-12CZ 285533 B6 ribosomů byl použit testovací plazmid stranslační bioB::lacZ genovou fúzí, pbioB::lacZ-2. pbioB::lacZ-2 je ve vektorové části, v tac-promotoru s vazebným místem ribosomů a v 5-konci genu bioB identický s plazmidem pBO22 (Obr. 2). Na Nrul-místě štěpení za nukleotidem 326 bioB-struktumího genu byly však deletovány 3'-konec bioB-genu a zbylé bio-genv a lacZ-gen zE. coli (Casadaban a spol., Methods Enzymol. 100:293-3082; 1983) byl tak zabudován, že bioB a lacZ byly fúzovány ve správném čtecím rastru pro expresi bioB::lacZ fúzovány ve správném čtecím rastru pro expresi bioB::lacZ fuzového proteinu, a že Nrul-místo štěpení bylo regenerováno.

Do plazmidu pbioB::lacZ-2 byl ve více krocích vložen oligonukleotid 985E se sekvencí 5CATGGAATCCTCCACTGATCAGTAC-3' před bioB-gen (Obr. 4). K tomu byl pbioB::lacZ-2 nejprve štěpen s BamHI a pak převislé BamHI-konce doplněny jak popsáno sKlenowpolymerasou. Při těchto krocích byl zřetelně nespecificky deletován guaninový zbytek (G), což způsobilo ztrátu jednoho BamHI-místa štěpení v pozdějších plazmidech. Po vložení Kpnllinkeru byla E. coli XLl-Blue (Bullock a spol., Biotechniques 5:376-379; 1987) transformována ligační směsí a byl izolován plazmid pbioB::lacZ/KpnI. Tento plazmid byl částečně štěpen sNeol a pak s KpnI doštěpen. Po ligaci s oligonukleotidem 985E bylo druhé DNA-vlákno doplněno s Klenow-polymerasou. Po transformaci E. coliXLl-Blue a selekci na NA-destičkách s 20 pg/ml Cm, 30 pg/ml X-Gal a 0,5 mM IPTG (isopropylthiogalaktosid) mohl být izolován plazmid pbioB::lacZ/985E (Obr. 4). Plazmid pbioB::lacZ/985E byl dále měněn tím, že vazebné místo ribosomů bylo vykrojeno restrikcí s KpnI a Spěl a nahrazeno třemi různými směsnými oligonukleotidy, SD17, SD19 a SD21 (Obr. 4). Po ligaci s těmito oligonukleotidy byla mezera ve druhém DNA-vláknu zavřena inkubací s Klenow-polymerasou. Bakteriální buňky E. coli XLlBlue byly touto DNA transformovány a jak uvedeno výše rozmístěny na NA-destičkách s 20 pg/ml Cm, 30 pg/ml X-Gal a 0,5 mM IPTG. Bylo vybráno 20 klonů s dobrou expresí bioB::lacZ-fůzového proteinu, které na tomto médiu tvořily tmavě modré kolonie, a byla měřena aktivita β-galaktosidasy těchto klonů pomocí Enzym-Assay podle Millera (Experiments in Molecular Genetics, Clod Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., str. 352-355; 1972). Proto byly nejdříve kmeny E. coli kultivovány s bio::lacZ-plazmidy v kapalné kultuře až k optické hustotě při 600 nm (OD_Ďoo) ca 0,5.

Nejvyšší aktivitu β-galaktosidasy měly plazmidy pbioB::lacZ/985E, pbioB::lacZ/16 a pbioB::lacZ/9 (Obr. 4), u nichž byla aktivita β-galaktosidasy zvýšena o faktor 2,1, 3,4 popř. 5,9 ve srovnání s pbioB::lacZ-2. DNA-sekvence optimalizovaných vazebných míst ribosomů pro bioB-gen v těchto plazmidech byla určena podle Sanger a spol. (1977, ibid.).

Po 5 pg plazmidů pbioB::lacZ/985E. pbioB::lacZ/16 nebo pbioB::lacZ/9 bylo štěpeno s Clal a Nrul a byl izolován ca. 550 bp dlouhý DNA-fragment s tac-promotorem. právě s tímto vazebným místem ribosomů a 5'-koncem bioB-genu. aby se zabudovala optimalizovaná vazebná místa ribosomů do jedné transkripční jednotky s bio-genv. Současně bylo štěpeno 5 pg plazmidu ρΒΘ30Δ A (Obr. 5) s Clal a Nrul a 7,7 kb dlouhý DNA-fragment byl izolován. V ρΒΟ30Δ A, který se odvozuje od pBO30, je deletován SalI/BamHI-fragment s větší částí bioA-genu a rušivým Nrul-místem štěpení (Obr. 5). Oba fragmenty byly ligovány a byly izolovány klony s rekombinovanými plazmidy. Takto byly získány plazmidy ρΒΟ30ΔΑ/9, ρΒΟ30ΔΑ/16 a ρΒΟ30ΔΑ/985. Obr. 5 ukazuje jedno takové vytvořené na příkladu ρΒΟ30ΔΑ/9 s vazebným místem ribosomů z pbioB::lacZ/9.

Po 2 pg plazmidů ρΒΟ30ΔΑ/9, ρΒΟ30ΔΑ/16 a pBO30AA/985E byly štěpeny s Snol a Knpl, přičemž Knpl bylo použito v menším množství, aby jen částečně štěpil. Pak byly izolovány pokaždé 6,6 kb dlouhé DNA-fragmenty, které obsahovaly vektor-DNA, tac-promotor. bioB-gen se zlepšeným vazebným místem ribosomů a geny bioFC. Plazmid pBO30A-15 (4 pg) byl rovněž štěpen s Snol a Ncol a byl izolován 2,8-kb fragment s geny bioDA-ORFT. Izolované fragmenty byly ligovány a E. coli RR28 byla transformována ligační směsí. Rekombinované plazmidy

-13ČŽ 285533 B6 s kompletním biotin-operonem byly identifikovány restrikční analýzou. Takto byly získány plazmidy pBO30A-15/9, pBO30A—15/16 a pBO30A-15/985E. Tyto všechny obsahují optimalizovanou bioDA-oblast zpBO30A-15 s odpovídajícími optimalizovanými vazebnými místy ribosomů zplazmidů pbioB::lacZ/9. pbioB::lacZ/16 popř. pbioB::lacZ/985E. Genetické kontrolní elementy těchto plazmidů, jmenovitě kombinace tac-promotoru a optimalizovaného vazebného místa ribozomů, které jsou v přímém spojení s bioB-genem a jehož efícienční expresi ovlivňují, vykazují následující sekvence:

pBO30A-15/985E (seq ID No: 17)

5'-AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTTAGGAGG TGACTAGTC-3' pBO30A-15/16 (Seq ID No: 18)

5'-AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGG TTTACTAGTC-3' pBO30A-15/9 (Seq ID No: 19)

5-AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGA CTAGTC-3'.

Obr. 5 znázorňuje vytvoření plazmidů, které obsahují geny bioB, bioF, bioC. bioD a bioA spolu s optimalizovaným vazebným místem ribosomů, na příkladě vytvoření pBO30A-15/9.

Celková transkripční jednotka bio-genů vpBO30A-15/9 byla sekvenována. Sekvence a z toho odvozené genové produkty jsou znázorněny na Obr. 6 (Seq ID No. 1 - 8).

1.6 Vytvořené pBO30A-15/9AorfI pg plazmidů ρΒΟ30ΔΑ/9 byly jako shora štěpeny s Snol a Knpl a 6,6 kb dlouhý DNAfragment byl izolován. 4 pg plazmidů pBO30A-15 byly štěpeny s Sspl. Ligací vzniklých lineárních DNA s KpnI-linkerem sekvence 5'-CGGTACCG-3' bylo vloženo nové Kpnl-místo ve směru bioA-genu. Po štěpení s Snol byl izolován 2,1 kb-fragment s geny bioDA. Izolované DNA-fragmenty byly ligovány a E. coli RR28 byla transformována ligační směsí. Rekombinované plazmidy s geny bioBFCDA byly identifikovány restrikční analýzou. Takto byly získány pBO30A-15/9 Δ orfl s delecí ORFI-genu (Obr. 5).

1.7 Vytvoření plazmidů pBO47 pg plazmidů pBO30A-15/9 bylo štěpeno restrikčními enzymy Xbal a EcoRI. Vzniklý 5,8 kb velký restrikční fragment s tac-promotorem a biotin-operonem byl izolován a hned potom ligován s „broad-host-range“ plazmidem pRK290X (Alvarez-Morales a spol., Nucl. Acid. Res. 14, 4207—4227, 1986; modifikovaný delecí Xhol restrikčního místa a vložením Xbal-místa na stejnou pozici), který byl rovněž štěpen s Xbal a EcoRI. E. coli S17-1 (Simon a spol., Biotechnology 1:784-791; 1983) byla transformována ligační směsí. Rekombinované plazmidy byly identifikovány restrikční analýzou; takto byl získán plazmid pBO47, který obsahuje biotinoperon integrovaný v pRK290X.

Konjugací se kmenem E, coli S17-l/pBO47 byl plazmid pBO47 transferován do bakteriálních kmenů Rhizobium/Agrobacterium sp. HK4, Pseudomonas mondocina, Pseudomonas aeruginosa PA01 (Holloway, J. Gen. Microbiol. 13:572-581; 1955) a Acinetobacter calcoaceticus DSM 588.

-14CZ 285533 B6

1.8 Vytvoření ρΒΟ74ΔΒ

Vytvoření plazmidu ρΒΟ74ΔΒ s delecí bioB-genu se uskutečnilo tím, že se vyšlo z plazmidu pBO74-13 (Obr. 7). Plazmid pBO74-13 se skládá ze stejných DNA-stavebních kamenů jako pBO30 (Obr. 2). Pořadí bio-genů uvnitř plazmidu pBO74-13 je však rozdílné.

pg plazmidu pBO74-13 bylo štěpeno s Smál. Po extrakci s fenolem/chloroformem byla plazmid-DNA štěpena s Sphl a byl izolován 6 kb-fragment, který obsahoval vektor-DNA, tacpromotor, geny bioA-ORFI a bioCD. 18 pg plazmidu pBO3 (Obr. 2) bylo štěpeno s SspI a Sphl a byl izolován 1,66 kb-fragment s bioF-genem a částí bioC-genu. Izolované fragmenty byly spolu ligovány a E. coli RR28 byla transformována ligační směsí. Rekombinované plazmidy byly analyzovány restrikční analýzou. Takto byl získán plazmid ρΒΟ74ΔΒ, který se liší od plazmidu pBO74-13 delecí bioB-genu (Obr. 7).

Příklad 2

Fermentace biotinu in vivo

2.1 Fermentace biotinu in vivo s produkčními kmeny Escherichia coli

Buňky kmenu E. coli XLl-Blue spBO30A-15/9 (DSM 7246) byly kultivovány 201 MBRfermentorem v glycerin-minimálním médiu (3% glycerin při zahájení kultury) ve fed batch postupu více než 30 hod. při 37 °C až k optické hustotě 20 při 650 nm (OD₆₅₀). Přítomnost plazmidu pBO30A-15/9 byla zajištěna přidáním chloramfenikolu (50 pg/ml) vpředkultuře (3 1 glycerin-minimální médium) a batch-fázi fermentace. Použití jiných zdrojů uhlíku jako glukóza nebo sukcinát (0,4% při začátku batch-fermentační fáze) bylo rovněž proveditelné. Metabolická aktivita buněk byla sledována na základě jejich specifické rychlosti příjmu kyslíku. Produkce biotinu během fermentace byla sledována titrací hodnot biotinu média fermentoru pomocí bioassay s Lactobacillus plantarum (E. DeMoll a W. Shive, Anal. Chem. 158:55-58. 1986).

Zdroj uhlíku, v tomto případě 50%-ní roztok glycerinu v deionizované vodě, byl přiváděn s variabilní přítokovou rychlostí přizpůsobenou vývoji biomasy. Pro glycerin byla jako základ zvolena empirická hodnota 2 g glycerinu na 1 litr kultury pro přírůstek OD z OD 1 na OD 2 pro „feed„-rychlost.

Hodnota pH fermentoru byla automaticky udržována na 7 připumpováním 40%-ní H₃PO₄ popř. 25%-ního NH₃. Provzdušnění bylo regulováno vháněním vzduchu 10 až 25 NL/min a rotací míchadla 300 až 700 rpm (otáček za min.) podle vývoje biomasy. Usilovalo se o sycení kyslíkem mezi 15 a 40 %. Obsah kyslíku a CO₂ odpadního vzduchu byl měřen paramagneticky popř. pomocí infračerveného světla. Teplota fermentoru byla udržována na 37 °C. Při teplotě 37 °C rostla kultura s dobou zdvojnásobení 2,5 hod. až k ODeso 20 a byla pak stacionární.

Během fermentace se nahromadilo 35 mg/1 D(+)-biotinu během 25 hod. V kmenech E.coli je možné dosáhnout syntézy biotinu, která by stála za zmínku, jen v rostoucích kulturách.

Jako další vhodné produkční kmeny se ukázaly E. coli ED8767 (N. E. Murray a spol., Mol. Gen. Genet. 150:53-61; 1975) s pBO30A-15/9 (DSM 8554) nebo E. coli BM4062 (D. F. Barker a A. M. Campbell, J. Bacteriol. 143:789-800; 1980) s pBO30A-15/9 (DSM 7247).

Obdobným způsobem byly testovány plazmidy pBO3, pBO30 a pBO30A-15/9AORFI a stanovena produktivita biotinu. Následující tabulka I ukazuje silné zlepšení produktivity biotinu kmenů s plazmidy pBO30, pBO30A-15/9 a pBO30A-15/9AORFI, které obsahují bio-geny

-15CZ 285533 B6 v jedné transkripční jednotce, ve srovnání s E. coli S17-1 (divoký typ, biotin-geny na chromosomu a E. coli S17-l/pBO3 (biotin-geny na plazmidu, přesto divergentní transkripce jako v operonu divokého typu). Pokusy dále ukázaly, že nepřítomnost ORFI-genu nemá žádný vliv na produktivitu biotinu.

Tabulka I

Kmen

E. coli S17-1

E. coli S17-l/pBO3

E. coli BM 4062/pB030

E. coli XL1 Blue/pBO30A-15/9

E. coli BM 4062/pBO30A-15/9AORFI

Produktivita biotinu pMol/min x 10⁹ buněk 0,01 - 0,02 0,02 - 0,04 3,0-5,0 10,0-20,0 10,0-20,0

Glycerin-minimální-batch-médiu (v deionizované H₂O)

glycerin	30	g/i
MgCl₂ x 6H₂O	0,8	g/1
CaCl₂	0,16 g/1
(NH^SCU	2,0	g/1
stopové prvky SLF^a)	1,0	ml/1
Fe-EDTA^b	1,5	ml/1
PPG-2000	0,1	g/i
KH₂PO₄	1	g/1
k₂hpo₄	1	g/i
Na₂HPO₄	1	g/1
thiamin	1	g/1
chloramfenikol	50	mg/1
IPTG	0,5	mM

a) Základní roztok stopových prvků SLF (v deionizované H₂)

KOH	15	g/i
EDTA-Na₂ x 2H₂O	100	g/1
ZnSO₄ x 7H₂O	9	g/1
MnCl₂ x 4H₂O	4	g/1
H3BO3	2,7	g/1
CoCl₂ x 6H₂O	1,8	g/1
CuC1₂ x 2H₂O	1,5	g/1
NíC1₂ x 6H₂O	0,18 g/1
Na₂MoO₄ x 2H₂	0,2	g/1

b) Základní roztok Fe-EDTA (v deionizované H₂O)

EDTANa₂x2H₂O 50 g/1

FeSO₄ x 7H₂O 20 g/1

KOH 10 g/1

Antibiotika-suplementy: (konečné koncentrace)

100 pg/ml ampicilinu (sodná sůl, Fluka) a 50 pg/ml chloramfenikolu (Fluka).

-16CZ 285533 B6

2.2 Fermentace biotinu in vivo s produkčním kmenem

Agrobacterium/Rhizobium HK4/pBO47

Buňky biotin-auxotrofního kmenu Agrobacterium/Rhizobium sp HK4 s biton-produkčním plazmidem pBO47 (DSM 8555) byly kultivovány v 2 1 MBR-fermentoru v minimálním médiu obsahujícím kyselinu L-glutaminovou a betain za fed-batch postupu při 30 °C až k hodnotě 70 při optické hustotě ODéso. HK4/pBO47 se vyznačuje zřetelně stabilní rychlostí syntézy biotinu i při extremně pomalém růstu („maintenance growth“). Proto se v tomto pokusu po napěstování biomasy připojila dlouhá maintenance fáze (500 hod.) při silně redukovaném uhlíkovém „feed“.

Po exponenciální růstové fázi, po dosažení hodnoty 12 při OD₆₅o bylo přiživováno pomalými dávkami (1,5 ml/hod.) glukózou-betainem- „feed“ (360 g/1 glukózy plus 103 g/1 betainu rozpuštěné v deionizované vodě), aby byl umožněn dlouho zadržený pomalý růst, popřípadě „maintenance growth“. V časovém bodě 150 hod. bylo přiživováno Fe²⁺-glukonátem až ke konečné koncentraci 100 mg/1 ve fermentoru. V čase 200, 360 a 550 hod. bylo přiživováno 10 ml roztoku soli a 1,36 ml standardního vitaminového roztoku.

pH fermentoru bylo automaticky regulováno na hodnotu 7 připumpováním 85%-ní kyseliny fosforečné, popř. 3M louhu draselného. Provzdušnění bylo regulováno vháněním 1-3 NL/min. vzduchu a rotací míchadla o 300 až 1000 rpm (otáčkách za min.) podle aktuálního vývoje biomasy, takže bylo zajištěno rozpětí kyslíku 1 až 4 mg/1. Teplota fermentoru byla udržována na hodnotě 30 °C. Kultura rostla v exponenciální růstové fázi s dobou zdvojnásobení 5,6 hod., ve fázi se silně limitovaným „feed“ s dobou zdvojnásobení 300 hod. a pak růst přešel na „maintenance growth“.

Pro zahájení fermentace byla po 200 hod. a po 415 hod. přidána ke kultuře kyselina diaminoperalgonová (DAPA; dvakrát na konečnou koncentraci 200 pg/ml nakonec na konečnou koncentraci 100 pg/ml). HK4 sám je biotin auxotrofní. Kmen byl schopný vyrobit z předchůdce biotinu DAPA dethiobiotin a ten nakonec přeměnit na D(+)-biotin s vysokým výtěžkem. Bylo nahromaděno 110 mg/1 D(+)-biotinu. Stojí za zmínku ta skutečnost, že byla tato syntéza uskutečněna s převažujícím podílem nerostoucích buněk.

Glutamin/betain-minimální médium

V 1,25 litrech deionizované vody bylo rozpuštěno, popř. k tomu přidáno:

31,25g monosodné soli kyseliny L-glutaminové x H₂O

12,5 g betainu

0,2 g CaCl₂

1,0 g MgCl₂x6H₂O l,25g K₂SO₄

1,25 ml stopových prvků SLF (příklad 2.1)

1,87 ml Fe-EDTA (příklad 2.1)

0,25 ml tetracyklinu (10 mg/ml v 70% ethanolu)

Roztok solí

0,03 gCaCl₂

0,16 gMgCl₂ x 6 H₂O

0,2 g K₂SO₄

200 pg SLF (příklad 2.1)

300 pg HC1 konc.

(rozpuštěno v 10 ml deionizované H₂O)

-17CZ 285533 B6

Standardní vitaminový roztok (v deionizované H₂O) mg/1 pyridoxalhydrochloridu mg/1 riboflavinu mg/1 amidu kyseliny nikotinové mg/1 thiaminhydrochloridu mg/1 biotinu mg/1 kyseliny pantothenové mg/1 kyseliny 4-aminobenzoové mg/1 kyseliny listové mg/1 vitamin B12

Příklad 3

Výroba biotinu z dethiobiotinu (měření reakce biotinsynthasy in vitro)

3.1 Výhody buněčných extraktů E. coli

Byly připraveny buněčný extrakt zE. coli XLl-Blue (DSM 7246) s plazmidem pBO30A-15/9 (extrakt Z) a buněčný extrakt z E. coli XLl-Blue s plazmidem ρΒΟ74ΔΒ (DSM 7245; extrakt W). K tomu byly buňky mikroorganizmů pěstovány při 37 °C v objemu 800 ml s OD₆₀₀ hodnoty 2 v médiu s 20 g/1 Nutrient Broth, 5 g/1 extraktu droždí a 20 mg/1 Cm. Buňky byly sklízeny filtrací a pak odstředěny při 5000 x g 15 min.

Pro přípravu bezbuněčného extraktu byly buňky promyty 100 mM HEPES-pufrem (pH 7,5) a pak resuspendovány ve stejném pufru, aby se nastavila OD₆₀o přibližně Γ000 a pak zpracovány s DNA-sou. Pak byly buňky rozbity kontinuálním buněčným homogenizátorem při 100'000 Pa. Homogenát byl 30 min. odstředěn při 20'000 x g a vzniklý supematant byl uchován při -80 °C. Extrakt Z mohl být pak buď přímo použit k měření (testování) reakce biotinsynthasy nebo až po čištění gelovou filtrací na sloupci Sephadexu G25M PD-10 (Pharmacia, objem sloupce: 9,1 ml). Extrakt W byl buď přímo použit k testování reakce biotinsynthasy nebo frakcionován podle příkladu 3.3.

3.2. Test reakce biotinsynthasy in vitro (standardní test)

Při testu in vitro byla testována reakce enzymu biotinsynthasy buď s ¹⁴C-značeným dethiobiotinem (0,1 pCi; 1,95 nmol) za vzniku ¹⁴C-značeného biotinu nebo reakce enzymu s neznačeným dethiobiotinem s ³⁴S-značeným cysteinem (20 pCi; 1,32 nmol) za vzniku ³⁵Sznačeného biotinu. Při tomto postupu vzniklý ¹⁴C-biotin nebo ³⁵S-biotin byl snadno stanovitelný po extrakci pomocí kvantitativní HPLC (vysokotlaká kapalinová chromatografie) na „on-line“ radiochemickém detektoru nebo semikvantitativně pomocí tenkovrstevné chromatografie a s následným přiložením rentgenového filmu pomocí autoradiografie.

Typický standardní test se skládal z bezbuněčného extraktu Z nebo W, ze značeného nebo neznačeného dethiobiotinu podle reakce, nebo z toho vyčištěných proteinových frakcí (příklady 3.7 až 3.9) jednotlivě nebo v kombinaci mezi sebou a/nebo z obvyklých kofaktorů jako SAM 92 μΜ), Fe²⁺-glukonát (200 μΜ), NADPH (100 μΜ), TPP (100 μΜ), DTT (1 mM) a/nebo z kombinace aminokyselin. Proteinové frakce k testování, kofaktory nebo aminokyseliny byly k tomu přidány v konečném objemu 250 μΐ. Inkubace se uskutečnila mezi 4 a 50 °C. Po jednohodinové inkubaci při 37 °C byla reakce zastavena přidáním 12% hmotn. kyseliny trichloroctové (TCA) ve vodě. Vysrážený protein byl odstředěn a supematant byl nanesen na

-18CZ 285533 B6 extrakční sloupec Ci8“solid-phase“ (MACHEREY-NAGEL, 100 mg), který byl ekvilibrován methanolem (1 ml), vodou (1 ml) a kyselinou octovou (1 % obj.) ve vodě. Hned potom byl tento sloupec promyt 1 ml 1%-ní kyseliny octové a 1 ml vody, aby pak byl biotin a dethibiotin eluován 0,5 ml methanolem. Získané vzorky byly sušeny ve vakuu a pak resuspendovány v 30 μΐ HPLC-pufru A (25 mM KH2PO4, 5 mM tetrabutylamoniumchlorid, pH 3,4), aby pak bylo injikováno 25 μΐ do HPLC pro kvantitativní analýzu. Podmínky HPLC byly následující: sloupec Shandon-Hypersil-BDS-Cig (velikost částic: 5 pm, velikost sloupce 10 mm x 2,0 mm), průtoková rychlost 0,35 ml/min., teplota 40 °C, eluční prostředek: HPLC-pufr As 10% obj. acetonitrilu.

Po smíchání eluátového toku se scintilačním měřicím roztokem (Zinsser Quickszint Flow 303; průtoková rychlost: 1,25 ml/min.) byl detekován a kvantifikován buď nezreagovaný ¹⁴Cdethiobiotin a vytvořený ¹⁴C-biotin nebo vytvořený ³⁵S-biotin („on-line“ detektor radioaktivity: Berthold).

Alternativně byly vzorky semikvantitativně analyzovány pomocí tenkovrstevné chromatografie a autoradiografie. Vzorky byly k tomuto účelu resuspendovány v 20 μΐ směsi složené z 10% kyseliny octové, 65 % methanolu a 25 % vody a 2,5 μΐ bylo naneseno na silikagel—„high performance“-TLC-destičku (E. Měrek, Darmstadt). Destička byla vyvíjena pohybujícím se prostředkem složeným z chloroformu (17 ml), methanolu (3 ml) a kyseliny mravenčí (0,2 ml). Po chromatografii byla destička sušena a přes noc byl přiložen rentgenový film.

3.3 Reakce biotinsynthasy v přítomnosti aminokyselin

Když byl odsolený bezbuněčný extrakt Z inkubován s dethiobiotinem podle příkladu 3.2 a s kofaktory SAM, TPP, NADPH a Fe²⁺-glukonát, nebyla pozorována žádná přeměna dethiobiotinu na biotin. Když se k tomuto bezbuněčnému extraktu přidal cystein (332 pm) a asparagin (15 mM) nebo cystein a aspartát (15 mM) nebo cystein a glutamin (15 mM) nebo cystein a serin (15 mM) s kofaktory podle příkladu 3.4, bylo možné prokázat produkci biotinu.

Tabulka II

Složení testu extrakt Z¹ extrakt Z¹ + kofaktory² extrakt Z¹ + aminokyseliny³ extrakt Z¹ + kofaktory² + aminokyseliny³

produkovaný biotin pmol 0 0 0 780

1) odsolený

2) kofaktory: SAM, Fe²⁺, TPP, NADPH

3) Cys + Asn nebo Cys + Asp nebo Cys + Gin nebo Cys + Ser

3.4 Reakce biotinsynthasy v přítomnosti jednoho nebo více obvyklých kofaktorů

Když byl shodný odsolený buněčný extrakt jako v příkladě 3.3 inkubován s L-cysteinem, asparaginem, dethiobiotinem, SAM, TPP, NADPH a Fe²⁺-glukonátem, byl dethiobiotin přeměněn na biotin. Aby byl zjištěn vliv těchto kofaktorů na reakci biotinsynthasy, byly tyto kofaktory použity jednotlivě a v kombinaci. Jen kombinace všech těchto kofaktorů prokázala aktivitu biotinsynthasy. Když chyběl jeden kofaktor, nebylo možné měřit aktivitu biotinsynthasy, tzn. všechny kofaktory jsou nutné pro aktivitu biotinsynthasy (příklad 3.3, tabulka Π)

-19CŽ 285533 B6

3.5 Čištění biotinsynthasy

Na důkaz toho, že dodatečně k biotinsynthase je za přeměnu dethiobiotinu na biotin zodpovědno více proteinů, byl nejprve bezbuněčný extrakt Z podroben frakcionaci síranem amonným. Ta se uskutečnila při nasycení 25 % síranu amonného za míchání, 30 min. při 4 °C. Pak se 30 min. odstřeďovalo při 10'000 xg a vzniklá sraženina byla odstraněna. Vzniklý supematant byl nasycen 70 % síranu amonného, přičemž se biotinsynthasa vysrážela. Precipitát byl resuspendován v malém množství 100 mM HEPES-pufru (pH 7,5), odsolen (Sephadex G25M PD-10) a pak čištěn pomocí aniontoměničové chromatografie (Q-Sepharosa Fast-Flow, Pharmacia) s kontinuálním gradientem 100 mM - 1 mM HEPES-pufru (pH 7,5). Frakce s aktivitou biotinsynthasy byly zahuštěny (Amicon ultrafiltrační buňka, YM-10 Membrán), odsoleny jak již bylo popsáno a pak rechromatografovány na „Hi-Load“ sloupci pro aniontoměničovou chromatografii na Q-Sepharose (Pharmacia; 20 mM Tris-pufr (pH 7,5) obsahující 1 mM DTT a 0 až 1 M NaCl-gradient). Frakce s vysokou aktivitou biotinsynthasy byly spojeny, zahuštěny a odsoleny. V těchto frakcích už nebyla biotinsynthasa kontaminována jinými proteiny, které jsou nutné pro aktivitu biotinsynthasy.

Bylo nutné přidat k testované směsi (příklad 3.2) extrakt W, aby se změřila aktivita biotinsynthasy během kroků čištění. Z toho vyplývá, že jsou za přeměnu dethiobiotinu na biotin zodpovědné vedle biotinsynthasy ještě další proteiny.

3.6 Frakcionace proteinů z extraktu W

Extrakt byl vysrážen za sebou následujícím sycením síranem amonným při 45 % a 55 %. Po přidání síranu amonného byla směs míchána při 4 °C po dobu 30 min. a pak odstředěna 30 min. při 10'000xg. Sraženina získaná při 45% nasycení síranem amonným byla resuspendována ve 100 mM HEPES-pufru (pH 7,5). Pak byly odebrány alikvoty z 45%precipitátu, 55%-precipitátu a 55%-supematantu a odsoleny (sloupec Sephadexu G25M PD10). Jednotlivé frakce byly jak jednotlivě, tak také v kombinaci spolu testovány podle příkladu

3.2.

Byly získány dvě frakce, které jsou důležité pro biotinsynthasu. Tyto frakce byly:

- sraženina po 45% nasycení síranem amonným

- supematant po 55% nasycení síranem amonným

3.7 Čištění a identifikace flavodoxinu

Supematant, který vznikl po 55% nasycení síranem amonným z extraktu W (příklad 2.2) byl odsolen (sloupec Sephadexu G25M PD-10) a pak nanesen na sloupec pro anintoměničovou chromatografii (Q-Sepharosa Fast-Flow (Pharmacia)). Tento sloupec byl napřed ekvilibrován 20 mM Tris-pufrem (pH 7,5) obsahujícím 1 mM DTT. Nevázaný materiál byl odstraněn promytím tímto pufrem. Proteiny vázané na sloupec byly eluovány kontinuálním gradientem NaCl (0 až 1 M). Eluované proteinové frakce byly spojeny, zahuštěny (Amicon ultrafiltrační buňka, YM-10 Membrán), odsoleny (Sephadexu G25M PD-10) a pak čištěny na mono Qsloupci pro aniontoměničovou chromatografii ekvilibrovaném 20 mM Tris-pufrem (pH 7,0, obsahujícím 1 mM DTT). Pak byly vyčištěné frakce testovány pomocí SDS-PAGE.

Pro identifikaci frakcí s hledaným proteinem během kroků čištění byl proveden systém testování biotinsynthasy (příklad 3.2) s čištěnou biotinsynthasou, proteinem popř. proteiny ze sraženiny při srážení se 45% síranem amonným, s aminokyselinami (příklad 3.3) a s nízkomolekulámími kofaktory (příklad 3.4). Biotinsynthasová aktivita mohla být změřena jen v těch frakcích, které obsahovaly hledaný protein.

-20CZ 285533 B6

Pak byla určena sekvence aminokyselin tohoto proteinu jak dále uvedeno. Protein byl redukován 4 hod. s DTT v 6 M guanidin-HCl-pufru. Získané vzorky byly karboxymethylovány kyselinou jodoctovou a pak 48 hod. dialyzovány proti hydrouhličitanu amonnému. Po sušení vzorků byly tyto štěpeny prasečím trypsinem v 7 M pufru močoviny a peptidy děleny pomocí „ReversePhase“ HPCL. Byly identifikovány 2 peptidy s odpovídajícími DNA-sekvencemi k flavodoxin z E. coli. Těmito kroky čištění mohl být získán homogenní flavodoxin.

3.8 Čištění a identifikace ferredoxin (Flavodoxin)-NADP⁺-reduktasy

Extrakt W byl nanesen na sloupec pro anintoměničovou chromatografii (Q-Sepharosa Fast-Flow (Pharmacia)). Tento sloupec byl ekvilibrován 20 mM Tris-pufrem (pH 7,5) obsahujícím 1 mM DTT. Proteiny vázané na sloupec byly eluovány kontinuálním gradientem NaCl (0 až 1 M). Eluované proteinové frakce byly spojeny, zahuštěny podle příkladu 3.7, odsoleny a naneseny na sloupec pro mono Q-aniontoměničovou chromatografii. Proteiny vázané na tomto sloupci byly eluovány kontinuálním gradientem NaCl (0 až 0,4 M ve 20 mM Tris-pufru). Pak byly spojené eluované proteinové frakce (zahuštěné a odsolené jak již bylo popsáno) naneseny na chromatografický sloupec Superosy 12 pro preparační gelovou filtraci (Pharmacia; ekvilibrovaný 20 mM Tris-pufrem) a pak na sloupec Sephacrylu HR100 pro gelovou filtraci (Pharmacia; ekvilibrovaný 20 mM Tris-pufrem). Po eluci 20 mM Tris-pufrem mohl být získán další homogenní protein (testovaný pomocí SDS-PAGE). Frakce obsahující tento protein byly identifikovány analogicky k testovacímu systému podle příkladu 3.7. Aktivita biotinsynthasy byla změřena jen po přidání těchto frakcí.

Vyčištěný protein byl přímo sekvenován, aby se stanovila N-koncová sekvence aminokyselin tohoto proteinu. Protein měl N-koncovou sekvenci aminokyselin odpovídající ferredoxin(flavodoxin)-NADP⁺-reduktase. Těmito kroky čištění mohla být získána homogenní ferredoxin(flavodoxin)-NADP⁺-reduktasa.

3.9 Obohacení jednoho nebo více proteinů odpovědných za reakci biotinsynthasy

Čištěná biotinsynthasa (příklad 3.2) neměla s čištěným flavodoxinem plus ferredoxin(flavodoxin)-NADP⁺-reduktasou a s nutnými kofaktory jakož i s aminokyselinami žádnou biotinsynthasovou aktivitu. Aby se dosáhla tato aktivita, hledal se další protein nebo proteiny ve frakci 45% síranu amonného.

Tento protein nebo tyto proteiny se získaly z bezbuněčného extraktu W precipitací síranem amonným při 45% nasycení. Získaná proteinová sraženina byla resuspendována v 20 mM Trispufru, pH 7,5, obsahujícím 1 mM DTT a TPP (1 g/1) a pak odsolena na sloupci PD-10 (Pharmacia). Odsolený materiál byl pak nanesen na sloupec pro chromatografii na měniči aniontů (Q-Sepharosa HP HI-Load), který byl předtím ekvilibrován 20 mM Tris-pufrem, pH 7,5, obsahujícím 1 mM DTT a TPP (1 g/1). Proteinové frakce s požadovanou aktivitou byly eluovány kontinuálním gradientem NaCl (0 až 600 mM NaCl). Pak byly tyto proteinové frakce dále čištěny pomocí gelověfiltrační chromatografíe (sloupec Sephacrylu HR-100, Pharmacia). Takto získaná proteinová sraženina byla resuspendována ve 100 mM HEPES-pufru (pH 7,5) a pak odsolena popsaným způsobem. Z toho se získal proteinový roztok, který byl použit pro test in vitro podle příkladu 3.2.

3.10 Reakce biotinsynthasy v přítomnosti flavodoxinu, ferrodoxin (flavodoxin)-NADP⁺reduktasy, jednoho nebo více proteinů odpovědných za reakci biotinsynthasy, jedné nebo více aminokyselin a obvyklých kofaktorů

K bezbuněčnému extraktu Z byly přidány flavodoxin, ferredoxin (flavodoxin)-NADP⁺reduktasa a jeden nebo více proteinů odpovědných za reakci biotinsynthasy. Přidání proteinů, kofaktorů a aminokyselin ovlivnilo zvýšenou aktivitu biotinsynthasy (tabulka III).

Tabulka III

Složení testů Extrakt Z s kofaktory a aminokyselinami	produkovaný biotin pmol 390
Extrakt Z + kofaktory + aminokyseliny + flavodoxin + ferredoxin(flavodoxin)NADP⁺-reduktasa + jeden nebo více proteinů odpovědných za reakci biotinsynthasy	1560

3.11 Reakce biotinsynthasy s čištěnou biotinsynthasou v přítomnosti kombinací flavodoxinu, ferredoxin(flavodoxin)-NADP⁺-reduktasy, jednoho nebo více proteinů odpovědných za reakci biotinsynthasy, jedné nebo více aminokyselin a obvyklých kofaktorů

Pro testování vlivu těchto složek na reakci biotinsynthasy s čištěnou biotinsynthasou, byly tyto použity jednotlivě nebo spolu v kombinaci. Kofaktory byly použity ve stejném množství jako v příkladě 3.4 a aminokyseliny v množství jako v příkladě 3.3. Když byly přítomné všechny tyto komponenty, byl dethiobiotin úplně přeměněn na biotin čištěnou biotinsynthasou. Když chyběla jedna z těchto komponent, nemohla být naměřena žádná aktivita. Proto jsou nutné všechny tyto komponenty pro přeměnu dethiobiotinu na biotin (tabulka IV).

Tabulka IV

Složení testů čištěna biotinsynthasa	produkovaný biotin pmol 0
čištěna biotinsynthasa + flavodoxin + ferredoxin(flavodoxin)NADP⁺-reduktasa +jeden nebo více proteinů odpovědných za reakci biotinsynthasy + kofaktory + aminokyseliny	800

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) OBECNÉ INFORMACE:

(i) PŘIHLAŠOVATEL:

(A) JMÉNO: LONZAAG (B) ULICE: Muenchensteinerstrasse 38 (C) MÍSTO: Basel (E) ZEMĚ: Švýcarsko (F) PSČ: 4002 (ii) NÁZEV PŘIHLÁŠKY: Biotechnologický způsob výroby biotinu (iii) POČET SEKVENCÍ: 19 (iv) POČÍTAČOVĚ-ČITELNÁ FORMA:

(A) NOSIČ DAT: floppy disk

-22CZ 285533 B6 (B) POČÍTAČ: IBM PC kompatibilní (C) OPERAČNÍ SYSTÉM: PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE: Patentln Release #1.0, verze #1.25 (EPA) (vi) DŘÍVĚJŠÍ DATA PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: CH 2134/92 (B) DATUM PŘIHLÁŠKY: 02-OCT-1992 (vi) DŘÍVĚJŠÍ DATA PŘIHLÁŠKY:

(A) ČÍSLO PŘIHLÁŠKY: CH 2134/93 (B) DATUM PŘIHLÁŠKY: 15-JUL-1993 (2) INFORMACE K SEKVENCI ID Č.: 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5872 párů bází (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (B) KMEN: DSM498 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A-15/9 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 117..1157 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /kodon_start= 117 /produkt= „biotinsynthasa“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /gen= „bioB“ /číslo= 1 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 2295..3050 (D) JINÉ ÚDAJE: /kodon_start= 2295 /funkce= „zahrnutá v synthese pimeloyl-CoA“ /produkt= „protein“ /gen= „bioC“ /číslo= 3

-23CZ 285533 B6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 3750..5039 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /kodon_start= 3750 /EC_číslo= 2.6.1.62 /produkt= „DAPA synthasa /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /gen= „bioA“ /číslo= 5 /standardníjméno= „S-Adenosyl-L-methionin:8-amino-7-oxononanoat aminotransf.“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 5098..5574 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /kodon_start= 5098 /funkce= „neznámá, zahrnutá v synthese biotinu“ /produkt= „protein“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /gen= „ORFI“ /číslo= 6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: -10_signal (B) POLOHA: 45..49 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /standardní_jméno= „promotor ptač“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: -35_signal (B) POLOHA: 23..28 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „promotor ptač“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 105..119 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /standardní_jméno= „bioB RBS č. 9“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 2284..2297 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „bioC RBS“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 3742..3752 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „bioA RBS“ (ix) ZNAKY:

-24CZ 285533 B6 (A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 5088..5100 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „ORFI RBS“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: terminátor (B) POLOHA: 5583..5644 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „rho-nezávislý transkripční terminátor“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: smyčka (stem_loop) (B) POLOHA: 5583..5605 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: promotor (B) POLOHA: L.96 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /funkce= „promotor ptač“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 B1 (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 1:

AAGCITACIC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT 60

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGA1CGGTA CCTAAGGAGA CTAGTC 116

ATG

Ger

CAC

CGC

CCA

CGC

TGG

ACA

TTG

TCG

GAA

GTC

ACA

GAA

TTA

TTT

164

Met

Ala

His

Arg

Pro

Arg

Trp

Thr

Leu

Ser

Gin

Val

Thr

Glu

Leu

Phe

1

5

io

15

GAA

AAA

CCG

T1G

CTG

GAT

CTG

TTT

GAA

GCG

CAG

gtg

CAT

CGC

212

Glu

lys

Pro

Leu

Asp

Leu

Phe

Glu

Ala

Gin

Val

His

Arg

20

25

30

CAG

CAr

TTC

GAT

CCT

CGT

CAG

GTG

CAG

GTC

AGC

AOG

TTG

CTG

TCG

ΛΤΤ

260

Gin

His

Phe

Asp

Pro

Arg

Gin

Val

Gin

Val

Ser

Thr

Leu

Ser

Ile

35

40

45

AAG

ACC

GGA

GCT

TGT

CCG

GAA

GAT

TGC

AAA

TAC

TGC

CCG

CAA

AGC

TCG

308

Lys

Thr

Gly

Ala

Cys

Pro

Glu

Asp

Cys

Lys

Tyr

Cys

Pro

Gin

Ser

50

55

60

GGC

TAC

AAA

ACC

GGG

CTG

GAA

GCC

GAG

CGG

TTG

ATG

GAA

GTT

GAA

CAG

356

Arg

Tyr

lys

Thr

Gly

Leu

Glu

Ala

Glu

Arg

Leu

Met.

Glu

Val

Glu

Gin

65

70

75

80

GTG

CTG

GAG

TCG

GCG

CGC

AAA

GCG

AAA

GCG

GCA

GGA

TCG

ACG

CGC

TTC

404

Val

Lev

Glu

Ser

Ala

Arg

Lys

Ala

Lys

Ala

Gly

Ser

Thr

Arg

Phe

90 95

-25CZ 285533 B6

TGT ATG GGC GCG GCG TGG AAG AAT CCC CAC GAA CGC GAT ATG CCG TAC452

Cys Met Gly Ala Ala Trp LyS Asn Pro His Glu Arg Asp Met Pro Tyr

100 105110

CTG GAA CAA ATG GTG CAG GGG GTA AAA GCG ATG GGG CTG GAG GCG TGT500

Leu G1u Gin Met Val G1n Gly Val Lys Ala Met Gly Leu Glu Ala Cys

115 120125

ATG ACG CTG GGC ACG Πβ AGT GAA TCT CAG GCG CAG CGC CTC GCG AAC548

Met Ihr Leu Gly Thr Leu Ser Glu Ser Gin Ale Gin Arg Leu Ala Asn

130 13S140

GCC GGG CTG GAT TAC TAC AAC CAC AAC CTG GAC ACC TCG CCG GAG TTT596

Ala Gly Leu Asp Tyr Tyr Asn His Asn Leu Asp Thr Ser Pro GluPhe

145 150 155160

TAC GGC AAT ATC ATC ACC ACA CGC ACT TAT CAG GAA CGC CTC GAT ACG544

Tyr Gly Asn Ile Ile Thr Thr Arg Thr Tyr Gin Glu Arg Leu AspThr

165 170175

CTG GAA AAA GTG CGC GAT GOC GGG ATC AAA GTC TGT TCT GGC GGC ATT692

Leu Glu Lys Val Arg Asp Ala Gly Ile Lys Val Cys Ser Gly GlyIle

180 185190

GTG GGC TTA GGC GAA ACG GTA AAA GAT CGC GCC GGA TTA TTG CTG CAA740

Val Gly Leu Gly Glu Thr Val Lys Asp Arg Ala Gly Leu Leu LeuGin

195 200205

CTG GCA AAC CTG CCG ACG CCG CCG GAA AGC GTG CCA ATC AAC ATG CTG78B

Leu Ala Asn Leu Pro Thr Pro Pro Glu Ser Val Pro Ile Asn MetLeu

210 215220

GTG AAG GTG AAA GGC ACG CCG CTT GCC GAT AAC GAT GAT GTC GAT GCC836

Val Lys Val Lys Gly Thr Pro Leu Ala Asp Asn Asp Asp Val AspAla

225 230 235240

TTT GAT TTT ATT CGC ACC ATT GCG GTC GCG CGG ATC ATG ATG CCA ACC884

Phe Asp Phe Ile Arg Thr Ile Ala Val Ala Arg Ile Met Met ProThr

245 250255

TČT TAC GTG CGC OT TCT GCC GGA CGC GAG CAG ATG AAC GAA CAG ACT932

Ser Tyr Val Arg Leu Ser Ala Gly Arg Glu Gin Met Asn Glu GinThr

260 265270

CAG GCG ATG TGC TTT ATG GCA GGC GCA AAC TCG ΑΠ TTC TAC GGT TGC980

Gin Ala Met Cys Phe Met Ala Gly Ala Asn Ser Ile Phe Tyr GlyCys

275 260285

AAA CTG CTG ACC ACG CCG AAT CCG GAA GAA GAT AAA GAC CTG CAA CTG1028

Lys Leu Leu Thr Thr Pro Asn Pro Glu Glu Asp Lys Asp Leu GinLeu

290 295300

TTC CGC AAA CTG GGG CTA AAT CCG CAG CAA ACT GCC GTG CTG GCA GGG1076

Phe Arg Lys Leu Gly Leu Asn Pro Gin Gin Thr Ala Val Leu AlaGly

305 311 315320

-26CZ 285533 B6

GAT AAC GM CM CAG CAA CGT CTT GAA CAG GCG CTG ATG ACC COG GACT124

Asp Asn Glu Gin G1n Gin Arg Leu Glu Gin Ala Leu Met Thr ProAsp

325 330335

ACC GAC GM TAT TAC AAC GCG GCA GCA TTA TGAGCTGGCA GGAGAAAATC1174

Thr Asp Glu Tyr Tyr Asn Ala Ala Ala Leu

340345

AACGCGfiCGC TCGATGCGCG GCGTGCTGCC GATGCCCTGC GTCGCCGTTA TCCGGTGGCG 1234 CAAGGAGCCG GACGCTGGCT GGTGGCGGAT GATCGCCAGT ATCTGAACTT TTCCAGTAAC1294

GATTATTTAG GTTTAAGCCA TCATCCGCAA ATTATCCCTG CCTGGCAGCA GGGGGCGGAG1354

CMTTTGGCA TCGGTAGCGG CGGCTCCGGT CACGTCAGCG GTTATAGCGT QGTGCATCAG1414

GCACTGGMG AAGAGCTGGC CGAGTGGCTT GGCTATTCGC GGGCACTGCT GTTTATCTCT1474

GGTTTCGCCG CTAATCAQGG AGTTATTGCC GCGATGATGG CGAAAGAGGA CCGTATTGCT1534

GCCGACCGGC TTAGCCA7GC CTCATTGCTG GAAGCTGCCA GTTTAAGCCC GTCGCAGCTT1594

CGCCGTTTTG CTCATAACGA TGTCACTCAT TTGGCGCGAT TGCTTGCTTC CCCCTGTCCG1654

GGGCAQCAAA TGGTGGTGAC AGMGGOGTG TTCAGCATGG ACGGCGATAG TGCGCCACTG1714

GCGGMATCC AGCAGGTAAC GCAACAGCAC MTGGCTGGT TGATGGTCGA TGATGCCCAC1774

GGCACGGGCG TTA1CGGGGA GCAGGGGCGC GGCAGCTGCT GGCTGCAAM GGTAAMCCA1834

GAATTGCTGG TAGTGACTTT TGGCMAGGA TTTGGCGTCA GCGGGGCAGC GGTGCTTTGC1894

TCCAGTACGG TGGOGGATTA TCTGCTGCM TTCGCOCGCC ACCTTATCTA CAGCACCAGT1954

ATGCCGCCCG CTCAGGCGCA GGCATTACGT GCGTCGC7GG CGGTCATTCG CAGTGATGAG2014

GGTGATQCAC GGCGCGAAM ACTGGCGGCA CTCATTACGC GTTTTCGTGC CGGAGTACAG2074

GATTTGCCGT TTACGCTTGC TGATTCATQC AGCGCCATCC AGCCA11GAT TGTCGGTGAT2134

MCAGCCGTG CGTTACAACT GGCAGMAM CTGCGTCAGC AAGGCTGCTG GGTCACGGCG2194

ATTCGCCCGC CAACCGTACC CGCTGGTACT GCGCGACTGC GCTTMCGCT AACCGCTGCG22S4

CATGAAATGC AGGATATCGA CCGTCTGCTG GAGGTGCTGC ATG GCA ACG GTT AAT 2309

Met Ala Thr Val Asn

AAA CAA GCC ATT GCA GCG GCA TTT GGT CGG GCA GCC GCA CAC TAT GAG2357

Lys Gin Ala ile Ala Ala Ala Phe Gly Arg Ala Ala Ala His TyrGlu

1520

CM CAT GCA GAT CTA CAG CGC CAG AGT GCT GAC GCC ΠΑ CTG GCA ATG2405

Gin His Ala Asp Leu Gin Arg Gin Ser Ala Asp Ala Leu Leu AlaMet

3035

-27ČZ 285533 B6

CH

CCA

CAG

CGT

AAA TAC

ACC

CAC

GTA

CTG

GAC

GCG

GGT

TGT

GGA

CCT

2453

Leu

Pro

Gin

Arg

Lys Tyr

Thr

His

Val

Leu

Asp

Ala

Gly

Cys

Gly

Pro

40

45

50

GGC

TGG

ATG

AGC

CGC CAC

TGG

CGG

GAA

CGT

CAC

GCG

CAG

GTG

ACG

GCC

2501

Gly

Trp

Het

Ser

Arg His

Trp

Arg

Glu

Arg

His

Ala

Gin

Val

Thr

Ala

55

60

65

TTA

GAT

CTC

TCG

CCG CCA

ATG

CTT

GTT

CAG

GCA

CGC

CAG

AAG

GAT

GCC

2549

Leu

Asp

Leu

Ser

Pro Pro

Met

Leu

Val

Gin

Ala

Arg

Gin

Uya

Asp

Ala

70

75

60

85

GCA

GAC

CAT

TAT

CTG GCG

GGA

GAT

ATC

GAA

TCC

CTG

CCG

TTA

GCG

ACT

2597

Ala

Asp

His

Tyr

Leu Ala

Gly

Asp

11»

Glu

Ser

Leu

Pro

Leu

Ala

Thr

90

95

100

GCG

ACG

T1C

GAT

CTT GCA

TGG

AGC

AAT

CTC

GCA

GTG

CAG

TGG

TGC

GGT

2645

Ala

Thr

Phe

Asp

Leu Ala

Trp

Ser

Asn

Leu

Ala

Val

Gin

Trp

Cys

Gly

105

110

115

AAT

TTA

TCC

ACG

GCA CTC

CGC

GAG

CTG

TAT

CGG

GTG

CGC

CCG

AAA

2693

Asn Leu Ser Thr Ala Leu Arg Glu Leu Tyr Arg Val Val Arg Pro Lys

120 125 130

GGC GTG GTC GCG TTT ACC ACG CTG GTG CAG GGA TCG TTA COC GAA CTG 2741

Gly

Val

Ala

Phe

Thr

Leu

Val

Gin

Gly

Ser

Leu

Pro

Glu

Leu

135

140

145

CAT

CAG

GCG

TGG

CAG

GCG

GTG

GAC

GAG

CGT

CCG

CAT

GCT

AAT

CGC

TTT

2789

His

Gin

Ala

Trp

Gin

Ala

Val

Asp

Glu

Arg

Pro

His

Ala

Asn

Arg

Phe

150

155

160

165

TTA

CCG

CCA

GAT

GAA

ATC

GAA

CAG

TCG

CTG

AAC

GGC

GTG

CAT

TAT

CAA

2837

Leu

Pro

Asp

Glu

11·

Glu

Gin

Ser

Leu

Asn

Gly

Val

His

Tyr

Gin

170

175

180

CAT

ATT

CAG

ccc

ATC

ACG

CTG

TGG

TTT

GAT

GCG

CTC

AGT

GCC

2885

His

Ile

Gin

Pro

Ile

Thr

Leu

Trp

Phe

Asp

Ala

Leu

Ser

Ala

185

190

195

ATG

CGT

TCG

CTG

AAA

GGC

ATC

GGT

GCC

ACG

CAT

CTT

CAT

GAA

GGG

CGC

2933

Met

Arg

Ser

Leu

lys

Gly

n·

Gly

Ala

Thr

His

Leu

His

Glu

Gly

Arg

200

205

210

GAC

CCG

CGA

ATA

TTA

ACG

CGT

TCG

CAG

TTG

CAG

CGA

TTG

CAA

CTG

GCC

2981

Asp

Pro

Arg

Ile

Leu

Thr

Arg

Ser

Gin

Leu

Gin

Arg

Leu

Gin

Leu

Ala

215

220

225

TGG

CCG

CAA

CAG

GGG

CGA

TAT

CCT

CTG

ACG

TAT

CAT

CTT

TTT

TTG

3029

Trp

Pro

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

Tyr

His

Leu

Phe

Leu

230

235

240

245

GGA

GTG

ATT

GCT

CGT

GAG

TAAACGT1

AT TTTGTCACCG GAACGGATAC

3077

Gly

Val

Ile

Ala

Arg

Glu

-28250

CGAAGTGGGG AAAACTGTCG CCAGTTGTQC ACTTTTACAA GCCGCAAAGG CAQCAGGCTA3137

CCGGACGGCA GGTTATAAAC CGGTCQCCTC TGGCAGCGAA MGACCCCGG AAGGTTTACG3197

CAATAGCGAC GCGCTGGCGT TACAQCGCAA CAGCAGCCTG CAGCTGGATT ACGCAACAGT3257

AAATCCTTAC ACCTTCGCAG AACCCACTTC GOCGCACATC ATCAGCGCGC AAGAGGGCAG3317

ACCGATAGAA TCATTGGTAA TGAGCGOCGG ATTACGCGCG CTTGAACAAC AGGCTGACTG3377

GGTGTTAGTG GAAGG1GCTG GCGGCTGGTT TACGCCGCTT TCTGACACTT TCACTTTTGC3437

AGATTGGGTA ACACAGGAAC AACTGCCGGT GATACTGGTA GTTGGTGTGA AACTCGGCTG3497

TATTAATCAC GCGATGHGA CTGCACAGGT AATACAACAC GCCGGACTGA CTCTGGCGGG3557

TTGGGTGGCG AACGATGTTA CGCCTCCGGG AAAAOGTCAC GCTGAATATA TGACCACGCT3617

CACCCGCATG ATTCCCGCGC OGCTGCTGGG AGAGATCCCC TGGCTTQCAG AAAATCCAGA3677

AAATGCGGCA ACCGGAAAGT ACATAAACCT TGCCTTCGTC GACGCGTCGA CTCTAGGGTT3737

TACAAGTCGA TT ATG ACA ACG GAC GAT CTT GCC TTT GAC CAA CGC CAT3785

Met Thr Thr Asp Asp Leu Ala Ph· Asp Gin Arg His

510

ATC TGG CAC CCA TAC ACA TCC ATG ACC TCC CCT CTG CCG GTT TAT CCG3833

Ile Trp His Pro Tyr Thr Ser Met Thr Ser Pro Leu Pro Val TyrPro

2025

GTG GTG A£C GCC GAA GGT TGC GAG CTG ΑΓΓ TTG TCT GAC GGC AGA CGC3881

Val Val Ser Ala Glu Gly Cys Glu Leu Ile Leu Ser Asp Gly ArgArg

3540

CTG GTT GAC GGT ATG TCG TCC TGG TGG GOG GOG ATC CAC GGC TAC ΑΛΤ3929

Leu Val Asp Gly Met Ser Ser Trp Trp Ala Ala Ile H1s Gly TyrAsn

5 50 5560

CAC CCG CAG CTT AAT GCC GCG ATG AAG TCG CAA ATT GAT GCC ATG TCG3977

His Pro Gin Leu Asn Ala A1a Met Lys Ser Gin tle Asp Ala MetSer

7075

CAT GTG ATG TTT GGC GGT ATC ACC CAT GCG CCA GCC ΑΠ GAG CTG TGC4025

H1s Val Met Phe Gly G1y Ile Thr His Ala Pro Ala Ile Glu LeuCys

8590

CGC AAA CTG GTG GCG ATG ACG CCG CAA CCG CTG GAG TGC GTT TTT CTC4073

Arg Lys Leu Val Ala Met Thr Pro Gin Pro Leu Glu Cys Val PheLeu

100W5

GCG GAC TCC GGT TCC GT A GCG GTG GAA GTG GCG ATG AAA ATG GCG TTG4121

Ala Asp Ser Gly Ser Val Ala Val Glu Val Ala Met Lys Het AlaLeu

110 115120

-29CZ 285533 B6

CAG

TAC

TGG

CAA

GCC

AAA

GGC

GAA

GCG

CGC

CAG

CGT

TTT

CTG

ACC

TTC

4169

Gin

Tyr

Trp

Gin

Ala

Lys

Gly

Glu

Ala

Arg

Gin

Arg

Phe

Leu

Thr

Phe

125

130

135

140

CGC

AAT

GGT

TAT

CAT

GGC

GAT

ACC

m

GGC

GCG

ATG

TCG

GTG

TGC

GAT

4217

Arg

Asn

Gly

Tyr

His

Gly

Asp

Thr

Phe

Gly

Ala

Met

Ser

Val

Cys

Asp

145

ISO

155

CCG

GAT

AAC

TCA

ATG

CAC

AGT

CTG

TGG

AAA

GGC

TAC

CTG

CCA

GAA

AAC

4265

Pro

Asp

Asn

Ser

Met

His

Ser

Leu

Trp

Lys

Gly

Tyr

Leu

Pro

Glu

Asn

160

165

170

CTG

TTT

GCT

CCC

GCC

CCG

CAA

AGC

CGC

ATG

GAT

GGC

GAA

TGG

GAT

GAG

4313

Leu

Phe

Ala

Pro

Ala

Pro

Gin

Ser

Arg

Met

Asp

Gly

Glu

Trp

Asp

Glu

175

180

185

CGC

GAT

ATG

GIG

GGC

TTT

GCC

CGC

CTG

ATG

GCG

CAT

CGT

CAT

GAA

4361

Arg

Asp

Met

Val

Gly

Phe

Ala

Arg

Leu

Met

Ala

His

Arg

His

Glu

190

19S

200

ATC

GCG

GTG

ATC

ATT

GAG

CCG

ATT

GTC

CAG

GGC

GCA

GGC

GGG

ATG

4409

Ile

Ala

Val

Ile

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Gly

Ala

Gly

Met

205

210

215

220

CGC

ATG

TAC

CAT

CCG

GAA

TGG

TTA

AAA

CGA

ATC

CGC

AAA

ATA

TGC

GAT

4457

Arg

Met

Tyr

His

Pro

Glu

Trp

Leu

tys

Arg

Ile

Arg

Lys

Ile

Cys

Asp

225

230

235

CGC

GAA

GGT

ATC

TTG

CTG

ATT

GCC

GAC

GAG

ATC

GCC

ACT

GGA

TTT

GGT

4505

Arg

Glu

Gly

Ile

Leu

Ile

Ala

Asp

Glu

11«

Ala

Thr

Gly

Phe

Gly

240

24S

230

CGT

ACC

GGG

AAA

CTG

TTT

GCC

TGT

GAA

CAT

GCA

GAA

ATC

GCG

CCG

GAC

4553

Arg

Thr

Gly

Lys

Leu Phe Ala

Cys

Glu

His

Ala

Glu

Ile

Ala

Pro

Asp

255

260

265

ATT

TTG

TGC

CTC

GGT AAA GCC

TTA

ACC

GGC

ACA

ATG

ACC

CTT

TCC

4601

Ile

Leu

Cys

Leu

Gly Lys Ala

Leu

Thr

Gly

Thr

Met

Thr

Leu

Ser

270

275

280

GCC

ACA

CTC

ACC

ACG CGC GAG

GTT

GCA

GAA

ACC

ATC

AGT

AAC

GGT

GAA

4649

Ala

Thr

Leu

Thr

Thr Arg Glu

Val

Ala

Glu

Thr

Ile

Ser

Asn

Gly

Glu

205 290 295 300

GCC GGT TGC TTT ATG CAT GGG CCA ACT TTT ATG GGC AAT CCG CTG GCC4697

Ala Gly Cys Phe Met His Gly Pro Thr Phe Met Gly Asn Pro LeuAla

305 310315

TGC GCG GCA GCA AAC GCC AGC CTG GCG ATT CTC GAA TCT GGC GAC TGG4745

Cys Ala Ala A1a Asn Ala Ser Leu Ala Ile Leu G1u Ser Gly AspTrp

320 325330

CAG CAA CAG GTG GCG GAT ATT GAA GTA CAG CTG CGC GAG CAA CTT GCC4793

Gin Gin Gin Val Ala Asp Ile Glu Val Gin Leu Arg Glu Gin LeuAla

335 340345

-30CZ 285533 B6

CCC GCC CGT GAT GCC GAA ATG GTf GOC GAT CTG CGC GTA CTG GGG GCC484?

Pro Ala Arg Asp Ala Glu Het Val Ala Asp Val Arg Val Leu Gly Ala

350 355360

ATT GGC GTG GTC GAA ACC ACT CAT CCG GTG AAT ATG GCG GCG CTG CAA4889

11* Gly Val Val Glu Thr Thr His Pro Val Asn Het Ala Ala Leu Gin

365 370 375380

AAA TTC TTT GTC GAA CAG GGT GTC TGG ATC CGG CCT TTT GGC AAA CTG4937

Lys Phe Phe Val Glu Gin Gly Val Trp Ile Arg Pro Phe Gly LysLeu

385 390395

ATT TAC CTG ATG CCG COC TAT ATT ATT CTC CCG CAA CAG TTG CAG CGT4985

Ile Tyr Leu Het Pro Pra Tyr tle Ile Leu Pro Gin Gin Leu GinArg

400 405410

CTG ACC GCA GCG GTT AAC CGC GCG GTA CAG GAT GAA ACA TTT TTT TGC5033

Leu Thr Ala Ala Val Asn Arg Ala Val Gin Asp Glu Thr Phe PheCys

415 420425

CAA TAACGAGAAG TCCGCGTGAG GGTTTCTGGC TACACTTTCT GCAAACAAGA5086

Gin

430

AAGGAGGGTT C ATG AAA CTC ATC AGT AAC GAT CTG CGC GAT GGC SAT AAA5136

Het Lys Leu Ile Ser Asn Asp Leu Arg Asp Gly Asp Lys

5W

TTG CCG CAT CGT CAT GTC TTT AAC GGC ATG GGT TAC GAT GGC GAT AAT5184

Leu Pro His Arg H1s Val Phe Asn Gly Met G1y Tyr Asp Gly AspAsn

2025

ATT TCA CCG CAT CTG GCG TGG GAT GAT GTT CCT GCG GGA ACG AAA AGT5232

Ile Ser Pro H1s Leu Ala Trp Asp Asp Val Pro A1a G1y Thr LysSer

35 4045

TTT GTT GTC ACC TGC TAC GAC CCG GAT GCG CCA ACC GGC TCC GGC TGG5280

Phe Val Val Thr Cys Tyr Asp Pro Asp Ala Pro Thr Gly Ser Gly Trp

5560

TGG CAC TGG GTA GTT GTT AAC TTA CCC GCT GAT ACC CGC GTA TTA CCG5328

Trp His Trp Val Val Val Asn Leu Pro Ala Asp Thr Arg Val Leu Pro

7075

CAA GGG TTT GGC TCT GGT CTG GTA GCA ATG CCA GAC GGC GTT TTG CAG5375

Gin G1y Phe Gly Ser Gly Leu Val Ala Het Pro Asp Gly Val Leu Gin

8590

ACGCGTACCGACTTTGGTAAAACCGGGTACGATGGCGCAGCACCGCCG 5424 Thr Arg Thr Asp Phe Gly Lys Thr Gly Tyr Asp Gly Ala Ala Pro Pro

100105

AAA GGC GAA ACT CAT CGC TAC ATT TTT ACC GTT CAC GCG CTG GAT ΑΤΛ5472

Lys Gly Glu Thr His Arg Tyr ITe Phe Thr Val His Ala Leu AspIle

110 115 120125

-31ČŽ 285533 B6

GAA CGT ATT GAT GTC GAT GAA GGT GCC AGC GGC GCG ATG GTC GGG TTT

GTu Arg Ile Asp Val Asp Glu Gly Ala Ser Gly Ala Met Val Gly Phe

130 135140

AAC GTT CAT TTC CAC TCT CTG GCA AGC GCC TCG ATT ACT GCG ATG TTT 5568

Asn Vat His Phe His Ser Leu Ala Ser Ala Ser Ile Thr Ala HetPhe

145 1501 55

AGT TAATCACTCT GCCAGATGGC GCAATGCCAT CTGGTATCAC TTAAAGGTAT5621

Ser

5520

TAAAAACAAC TTTTTGTCTT TTTACCTTCC CGTTTCGCTC AAGTTAGTAT AAAAAAGCAG 5681

GCTTCAACGG ΑΤΤΟΑΤΠΤΤ CTATTTCATA GCCCGGAGCA ACCTGTGAAC ACATTTTCAG 5741

TTTCCCGTCT GGCGCTGGCA TTGGCTTTTG GCGTGACGCT GACCGCCTGT AGCTCAACCC 5801

CGCCCGATCA ACGTCCTTCT GATCAAACCG CGCCTGGTAC CGAGCTCGAA TTCCTGCAGG 5861

CATGCAAGCT T 5872 (2) INFORMACE K SEKVENCI SEK ID Č.: 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 346 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEQ ID Č.: 2:

Het

Ala

His

Arg Pro

Arg

Trp

Thr

Leu

Ser

Gin Val

Thr

Glu

Leu

Phe

1

5

10

15

Glu

Lys

Pro

Leu Leu

Asp

Leu

Phe

Glu

Ala Gin

Gin

Val

His

Arg

20

25

30

Gin

His

Phe

Asp Pro

Arg

Gin

Vat

Gin

Val

Ser Thr

Leu

Ser

Ile

35

40

45

Lys

Thr

Gly

Ala Cys

Pro

Glu

Asp

Cys

lys

Tyr Cys

Pro

Gin

Ser

50

55

60

Arg

Tyr

Lys

Thr Gly

Leu

Glu

Ala

Glu

Arg

Leu Met

Glu

Val

Glu

Gin

65

70

7S

60

Val

Leu

Glu

Ser Ala

Arg

Lys

Ala

Lys

Ala

Ala Gly

Ser

Thr

Arg

Phe

Θ5

90

95

Cys

Het

Gly

Ala Ala

Trp

Ly»

Asn

Pro

llls

Glu Arg

Asp

Met

Pro

Tyr

100

105

110

Leu

Glu

Gin

Het Val

Gin 1

Gly

Val

Lys

Ala

Het Gly

Leu

Glu

AU

Cys

115 120 125

-32CZ 285533 B6

Met Thr Leu Gly Thr Leu Ser Glu Sar Gin AI* Gin Arg Leu Ala Asn

130

135

140

Ala

Gly

Leu

Asp

Tyr

tyr

Asn

His

Asn

Leu

Asp

Thr

Ser

Pro

Glu

Phe

145

150

155

160

Tyr

Gly

Asn

Ile

tle

Thr

Arg

Thr

Tyr

Gin

Glu

Arg

Leu

Asp

Thr

165

170

175

Leu

Glu

Lys

Val

Arg

Asp

Ala

Gly

Ile

Lys

Val

Cys

Ser

Gly

Ile

1Θ0

185

190

Val

Gly

Leu

Gly

Glu

Thr

Val

Lys

Asp

Arg

Ala

Gly

Leu

Gin

195

200

205

Leu

Al*

Asn

Leu

Pro

Thr

Pro

Glu

Ser

Val

Pro

Ile

Asn

Met

Leu

210

215

220

Val

Lys

Val

Lys

Gly

Thr

Pro

Leu

Ala

Asp

Asn

Asp

Val

Asp

Ala

225

230

235

240

Ptra

Asp

Phe

Ile

Arg

Thr

Ile

Al*

Val

Ala

Arg

Ile

Met

Pro

Thr

245

250

255

Ser

Tyr

Val

Arg

Leu

Ser

Ala

Gly

Arg

Glu

Gin

Met

Asn

Glu

Gin

Thr

260

265

270

Gin

A]*

Met

Cys

Phe

Met

Ala

Gly

Ala

Asn

Ser

Ile

Phe

Tyr

Gly

Cys

275

280

285

Lys

Leu

Thr

Pro

Asn

Pro

Glu

Asp

Lys

Asp

Leu

G1n

Leu

290

295

300

Phe

Arg

Lys

Leu

Gly

Leu

Asn

Pro

Gin

Thr

Al*

Val

Leu

Ala

Gly

305

310

315

320

Asp

Asn

Glu

Gin

Arg

Leu

Glu

Gin

Ala

Leu

Met

Thr

Pro

Asp

325 330 335

Ihr Asp Glu Tyr Tyr Asn Ala Ala Ala Leo

340 345 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 251 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 3:

-33CZ 285533 B6

Met

Ala

Thr

Val Asn

Lys

Gin

Ala

Ile Ala

Ala

, Ala

Phe

Gly

Arg

Ala

1

5

10

15

Ala

H1s

Tyr Glu

Gin

His

Ala

Asp Leu

Gin

Arg

Gin

Ser

Ala

Asp

20

25

30

Ala

Leu

Ala Met

Leu

Pro

Gin

Arg Lys

Tyr

Thr

His

Val

Leu

Asp

35

40

45

Ala

Gly

Cys

Gly Pro

Gly

Trp

Met

Ser Arg

His

Trp

Arg

G1u

Arg

His

50

55

60

Ala

Gin

Val

Thr Ala

Leu

Asp

Leu

Ser Pro

Pro

Met

Leu

Val

Gin

Ala

65

70

75

80

Arg

Gin

Lys

Asp Ala

Ala

Asp

His

Tyr Leu

A1a

Gly

Asp

Ile

Glu

Ser

65

90

95

Leu

Pro

Leu

Ala Thr

Ala

Thr

Phe

Asp Leu

Ala

Trp

Ser

Asn

Leu

Ala

100

105

110

Val

Gin

Trp

Cys Gly

Asn

Leu

Ser

Thr Ala

Leu

Arg

Glu

Leu

Tyr

Arg

115

120

125

Val

Arg

Pro lys

Gly

Val

Ala Phe

Thr

Leu

Val

Gin

Gly

130

135

140

Ser

Leu

Pro

Glu Leu

His

Gin

Ala

Trp Gin

Ala

Va1

Asp

Glu

Arg

Pro

145

150

155

160

His

Ala

Asn

Arg Phe

Leu

Pro

Asp Glu

Ile

Glu

Gin

Ser

Leu

Asn

165

170

175

Gly

Val

His

Tyr Gin

His

Bis

Ile

Gin Pro

Ile

Thr

Leu

Trp

Phe

Asp

180

185

190

Asp

Ala

Lev

Ser

Ala

Met

Arg

Ser

Leu

Lys

Gly

Ile

Gly

Ala

Thr

His

195

200

205

Leu

His

Glu

GV

Arg

Asp

Pro

Arg

Ile

Leu

Thr

Arg

Ser

Gin

Leu

Gin

210

215

220

Arg

Leu

Gin

Leu

Ala

Trp

Pro

Gin

Gly

Arg

Tyr

Pro

Leu

Thr

225

230

235

240

Tyr

His

Leu

Phe

Leu

Gly

Val

Ile

Ala

Arg

Glu

245 250 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 429 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein

-34CZ 285533 B6 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 4:

Met	Thr Thr	Asp	Asp	Leu	Ala	Phe	Asp Gin Arg His Ile	Trp	His	Pro
1			5				10		15
Tyr	Thr Ser	Met	Thr	Ser	Pro	Leu	Pro Val Tyr Pro Val	Val	Ser	A1a
		20					25	30
Glu	Gly Cys	Glu	Leu	Ile	Leu	Ser	Asp Gly Arg Arg Leu	Val	Asp	Gly
	35					40	45
Met	Ser Ser	Trp	Trp	Ala	Ala	Ile	H1s Gly Tyr Asn His	Pro	Gin	Leu
	50				55		60
Asn	Ala Ala	Het	Lys	Ser	Gin	11a	Asp Ala Mot Ser His	Val	Met	Phe
55				70			75			80
Gly	Gly Ile	Thr	His	Ala	Pro	Ala	Ile Glu Leu Cys Arg	Lys	Leu	Val

90 95

Ala Het Thr Pro Gin Pro Leu G1u Cys Val Phe Leu Ala Asp Ser Gly 100 105 110

Ser

Val

Ala

Val

Glu

Va1

Ala

Het

Lys

Het

Ala

Leu Gin

Tyr

Trp

Gin

115

120

125

Ala

Lys

Gly

Glu

Ala

Arg

Gin

Arg

Phe

Leu

Thr

Phe Arg

Asn

Gly

Tyr

130

135

140

His

Gly

Asp

Thr

Phe

Gly

A1a

Het

Ser

Val

CyS

Asp Pro

Asp

Asn

Ser

145

150

155

160

Met

His

Ser

Leu

Trp

Lys

Gly

Tyr

Leu

Pro

Glu

Asn Leu

Phe

Ala

Pro

165

170

175

Ala

Pro

Gin

Ser

Arg

Het

Asp

Gly

Glu

Trp

Asp

Glu Arg

Asp

Het

Val

180

185

190

Gly

Phe

Ala

Arg

Leu

Het

Ala

IHs

Arg

His

Glu Ile

Ala

Val

195

200

205

Ile

Glu

Pro

Ile

Val

Gin

Gly

Ala

Gly

Met

Arg Het

Tyr

His

2)0

215

220

Pro

Glu

Trp

Leu

Lys

Arg

Ile

Arg

Lys

De

Cys

Asp

Arg Glu

Gly

Ile

225

230

235

240

Leu

Ile

Ala

Asp

Glu

Ile

Ala

Hu-

Gly

Phe

Gly

Arg Thr

Gly

Lys

245

250

255

Leu

Phe

Ala

Cys

Glu

His

Ala

Glu

líš

A1a

Pro

Asp

Ile Leu

Cys

Leu

260

265

270

Gly

Lys

Ala

Leu

Thr

Gly

Thr

Het

Thr

Leu

Ser

Ala Thr

Leu

Thr

275

280

285

-35CZ 285533 B6

Thr Arg Glu Val Ala Glu Thr Ba Ser Asn Gly Glu Ala Gly Cys Phe 290 295300

Met His Gly Pro Thr Phe Met Gly Asn Pro Leu Ala CyS Ala AlaAla

305 310 315320

Asn Ala Ser Leu Ala Be Leu G1u Ser Gly Asp Trp Gin Gin GinVal

325 330335

A1a Asp Π· Glu Val Gin Leu Arg Glu Gin Leu Ala Pro Ala Arg Asp

340 345350

Ala

Glu

Met

VaT

Ala

Asp

Val

Arg

Val

Leu

Gly

Ala

Be

Gly

Val

355

3S0

365

Glu

Thr

His

Pro

VaT

Asn

Met

Ala

Leu

Gin

Lys

Phe

Val

370

375

380

Glu

Gin

Gly

Val

Trp

Be

Arg

Pro

Phe

Gly

Lys

Leu

Be

Tyr

Leu

Met

305

390

395

400

Pro

Tyr

Be

Leu

Pro

Gin

Leu

Gin

Arg

Leu

Thr

ATa

Ala

405 410 415

Val Asn Arg Ala Val Gin Asp Glu Thr Phe Phe Cys Gin 420425 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 158 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 5:

Met

Lys

Leu

Ile Ser Asn Asp

Leu

Arg

Asp

Gly

Asp

Lys

Leu

Pro

His

1

5

10

15

Arg

His

Val

Phe Asn Cly Met

Gly

Tyr

Asp

Gly

Asp

Asn

Ile

Ser

Pro

20

25

30

His

Leu

Ala

Trp Asp Asp Val

Pro

Ala

Gly

Thr

Lys

Ser

Phe

Val

35

40

45

Thr

Cys

Tyr

Asp Pro Asp Ala

Pro

Thr

Gly

Ser

Gly

Trp

His

Trp

50

55

60

Val

Asn Leu Pro Ala

Asp

Thr

Arg

Val

Leu

Pro

Gin

Gly

Phe

65

70

75

80

Gly

Ser

Gly

Leu Val Ala Met

Pro

Asp

Gly

Val

Leu

Gin

Thr

Arg

Thr

85

90

95

Asp

Phe

Gly

Lys Thr Gly Tyr

Asp

Gly

Ala

Pro

Lys

Gly

Glu

100 105 110

-36CZ 285533 B6

Thr His Arg Tyr Ile Phe Thr Val His Ala Leu Asp Ile Glu Arg Ile

11S 120125

Asp Val Asp Glu Gly Ala Ser Gly Ala Met Val Gly Phe Asn Val His 130 135140

Phe His Ser Leu Ala Ser Ala Ser 11« Thr Ala Met Phe Ser

145 150155 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 5872 párů bází (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (B) KMEN: DSM498 (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A15-9 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1154..2308 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /kodon_start= 1154 /EC_číslo= 2.3.1.47 /produkt= „KAPA synthasa“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /gen= „bioF“ /číslo= 2 /standardníjméno= „8-amino-oxononanoát synthasa“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 3043-3753 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /kodon_start= 3043 /EC_číslo= 6.3.3.3 /produkt= „DTB synthasa“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /gen= „bioD“ /číslo= 4 /standardní_jméno= „dethiobiotin synthasa“

-37CZ 285533 B6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 1141..1156 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „bioF RBS“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 3030..3045 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „bioD RBS“ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 B1 (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 6:

AAGCT7ACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT60

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGA CTAGTCATGG120

CTCACCGCCC ACGCTGGACA TTGTCGCAAG TCACAGAATT ATTTGAAAAA CCGTTGCTGG180

ATCTGCTGTT TGAAGCGCAG CAGGTGCATC 6CCAGCATTT OGATOCTCGT CAGGTGCAGG240

TCAGCACGTT GCTGTCGATT AAGACCGGAG CTTGTCCGGA AGA7TGCAAA TACTGCCCGC300

AAAGCTCGCG CTACAAAACC GGGCTGGAAG CCGAGCGGTT GATGGAAGTT GAACAGGTGC360

TGGAGTCGGC GCGCAAAGCG AAAGCGGCAfi GATCGACGCG CTTCTGTATG GGCGCGGCGT420

GGAAGAATCC CCACGAAOGC GATATGCCGf ACCTGGAACA AATGGTGCAG GGGGTAAAAG430

CGATGGGGCT GGAGGCGTGT ATGACGCTGG GCACGTTGAG TGAATCTCAG GCGCAGCGCC540

TCGCGAACGC CGGGCTGGAT TACFACAACC ACAACCTGGA CACCrCGCCG GAGTTTTACG600

GCAATATCAT CACCACACGC ACTTATCAGG AACGCCTCGA TACGCTGGAA AAAGTGCGCG660

ATGCCGGGAT CAAAGTCTGT TCTGGCGGCA TTGTGGGCn AGGCGAAAOG GTAAAAGATC720

GCGCCGGATT ATTGCTGCAA CTGGCAAACC TGCCGACGCC GCCGGAAAGC GTGCCAATCA780

ACATGCTGGT GAAGGTGAAA GGCACGCCGC TIGCCGATAA CGATGATGTC GATGCCmG840

ATTTTATTCG CAOCATTGCG GTCGCGOGGA TCATGATGCC AACCTCTTAC GTGCGCCTTT900

CTGCCGGACG CGAGCAGATG AACGAACAGA CTCAGGCGAT GTGCTTTATG GCAGGCGCAA960

ACTCGATTTT CTACGGTTGC AAACTGCTGA CCACGCCGAA TCCGGAAGAA GATAAAGACC1020

TGCAACTGTT CCGCAAACTG QGGCTAAATC CGCAGCAAAC TGOCGTGCTG GCAGGGGATA1080

ACGAACAACA GCAACGTCTT GAACAGGCGC TGATGACCCC GGACACCGAC GAATATTACA1140

-38CZ 285533 B6

ACGCGGCAGC ΑΠ ATG AGC TGG CAG GAG AAA ATC AAC GCG GCG CTC GAT

Met Ser Trp Gin G1u lys Ile Asn Ala Ala Leu Asp

5 10

11S9

GCG

CGG

CGT

GCT

GCC

GAT

GCC

CTG

CGT

CGC

CGT

TAT

CCG

GTG

GCG

CAA

1237

Ala

Arg

Ala

Asp

Ala

Leu

Arg

Tyr

Pro

Val

Ala

Gin

15

20

25

GGA

GCC

GGA

CGC

TGG

CTG

GTG

GCG

GAT

CQC

CAG

TAT

CTG

AAC

TTT

1285

Gly

Ala

Gly

Arg

Trp

Leu

Val

Ala

Asp

Arg

Gin

Tyr

Leu

Asn

Phe

30

35

40

TCC

AGT

AAC

GAT

TAT

TTA

GGT

TTA

AGC

CAT

CCG

CAA

ATT

ATC

CGT

1333

Ser

Asn

Asp

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ser

His

Pro

Gin

Ile

Arg

45

50

55

60

GCC

TGG

CAG

GGG

GCG

GAG

CAA

TTT

GGC

ATC

GGT

AGC

GGC

TCC

1381

Ala

Trp

Gin

Gly

Ala

Glu

Gin

Phe

Gly

Ile

Gly

Ser

Gly

Ser

65

70

75

GGT

CAC

GTC

AGC

GGT

TAT

AGC

GTG

CAT

CAG

GCA

CTG

GAA

GAG

1429

Gly

His

Val

Ser

Gly

Tyr

Ser

Val

His

Gin

Ala

Leu

Glu

eo

85

90

CTG

GCC

GAG

TGG

CTT

GGC

TAT

TCG

CGG

GCA

CTG

TTT

ATC

TCT

GGT

1477

Lev

Ala

Glu

Trp

Leu

Gly

Tyr

Ser

Arg

Ala

Leu

Phe

I1e

Ser

Gly

95

100

105

TTC

GOC

GCT

ΛΑΤ

CAG

GCA

GTT

ATT

GCC

GCG

ATG

GCG

AAA

GAG

GAC

1525

Phe

Ala

Asn

Gin

Ala

Val

Ile

Ala

Met

Ala

Lys

Glu

Asp

110

115

120

CGT

ATT

GCT

GCC

GAC

CGG

CTT

AGC

CAT

GCC

TCA

TTG

CTG

GAA

GCT

GCC

1573

Arg

Ile

Ala

Asp

Arg

Leu

Ser

His

Ala

Ser

Leu

Glu

Ala

125

130

135

140

AGT

TTA

AGC

CCG

TCG

CAG

CTT

CQC

CGT

TTT

GCT

CAT

AAC

GAT

GTC

ACT

1621

Ser

Leu

Ser

Pro

Ser

Gin

Leu

Arg

Phe

Ala

His

Asn

Asp

Val

Thr

145

150

155

CAT

TTG

GCG

CGA

TTG

CTT

GCT

TCC

CCC

TGT

CCG

GGG

CAG

CAA

ATG

CTG

1669

His

Leu

Ala

Arg

Leu

Ala

Ser

Pro

Cys

Pro

Gly

Gin

Met

Val

160 165 170

GTG ACA GAA GGC CTG TTC AGC ATG GAC GGC GAT AGT GCG CCA CTG GCG 1717

Val Thr Glu Gly Va1 Phe Ser Met Asp Gly Asp Ser Ala Pro Leu Ala

175

180

185

GAA

ATC

CAG

CAG GTA ACG

CAA

CAG

CAC

AAT

GGC

TGG

TTG ATG

GTC

GAT

1765

G1u

Ile

Gin

Gin Val Thr

Gin

His

Asn

Gly

Trp

Leu Met

Val

Asp

190

195

200

GAT

GCC

CAC

GGC ACG GGC

GTT

ATC

GGG

GAG

CAG

GGG

CGC GGC

AGC

TGC

1813

Asp

Ala

His

Gly Thr Gly

Val

Ile

Gly

Glu

Gin

Gly

Arg Gly

Ser

Cys

205

210

215

220

-39CZ 285533 B6

TGG

C1G

CAA

AAG

GTA

AAA

CCA

GAA

TTG

CTG

GTA

GTG

ACT

TTT

GGC

AAA

1861

Trp

Leu

Gin

Lys

Val

Lys

Pro

Glu

Leu

Val

Tlv

Phe

Gly

Lys

225

230

235

GGA

ΤΠ

GGC

GTC

AGC

GGG

GCA

GCG

GTG

CTT

TGC

TCC

AGT

ACG

GTG

GCG

1909

Gly

Phe

Gly

Val

Ser

Gly

Ala

Val

Leu

Cys

Ser

Thr

Val

Ala

240

245

250

GAT

1AT

CTG

CAA

TTC

GCC

CGC

CAC

CTT

ATC

TAC

AGC

ACC

AGT

ATG

1957

Asp

Tyr

Leu

Gin

Phe

Ala

Arg

His

Leu

11«

Tyr

Ser

Thr

Ser

Met

255

260

265

CCG

CCC

GCT

CAG

GCG

CAG

GCA

TTA

CGT

GCG

TCG

CTG

GCG

GTC

ATT

CGC

2005

Pra

Pro

Ala

Gin

A1a

Gin

Ala

Leu

Arg

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

ile

Arg

270

275

280

AGT

GAT

GAG

GGT

GAT

GCA

GGG

CGC

GAA

AAA

CTG

GCG

GCA

CTC

ATT

ACG

2053

Ser

Asp

Glu

Gly

Asp

Ala

Arg

Glu

Lys

Leu

Ala

Leu

Tle

Thr

285

290

295

300

CGT

TTT

CGT

GCC

GGA

GTA

CAG

GAT

TTG

CCG

TTT

ACG

CTT

GCT

GAT

TCA

2101

Arg

Phe

Arg

Ala

G1y

Val

Gin

Asp

Leu

Pro

Phe

Thr

Leu

Ala

Asp

Ser

305

310

315

TGC

AGC

GCC

ATC

CAG

CCA

TTG

ATT

GTC

GGT

GAT

AAC

AGC

CGT

GCG

TTA

2149

Cys

Ser

Ala

Ile

Gin

Pro

Leu

Ile

Val

Gly

Asp

Asn

Ser

Arg

Ala

Leu

320

325

330

CAA

CTG

GCA

GAA

AAA

CTG

CGT

CAG

CAA

GGC

TGC

TGG

GTC

ACG

GCG

ATT

2197

Gin

Leu

Ala

Glu

Lys

Leu

Arg

Gin

Gly

Cys

Trp

Val

Thr

Ala

Ile

335

340

345

CGC

CCG

CCA

ACC

GTA

CCC

GCT

GGT

ACT

GCG

CGA

CTG

CGC

TTA

ACG

CTA

2245

Arg

Pro

Thr

Val

Pro

Ala

Gly

Thr

Ala

Arg

Leu

Arg

Leu

Thr

Leu

350

35S

360

ACC

GCT

GCG

CAT

GAA

ATG

CAG

GAT

ATC

GAC

CGT

CTG

GAG

GTG

CTG

2293

Thr

Ala

H1s

Glu

Met

Gin

Asp

Ile

Asp

Arg

Leu

Glu

Val

Leu

365 370 375 380

CAT GGC AAC GGT TAATAAACAA GCCATTGCAG CGGCATTTGG TCGGGCAGCC2345

His Gly Asn Gly

385

GCACACTATG AGCAACATGC AGATCTACAG CGOCAGAGTG CTGACGCCTT ACTGGCAATG2405

CTTCCACAGC GTAAATACAC CCACGTACTG GACGCGGGTT GTGGACCTGG CTGGATGAGC2465

CGCCACTGGC GGGAACGTCA CGCGCAGGTG ACGGCCTTAG ATCTC7CGCC GCCAATGCTT2525

GTTCAGGCAC GOCAGAAGGA TGCCGCAGAC CATTATCTGG CGGGAGATAT CGAATCCCTG2585

CCGTTAGCGA CTGCGACGTT CGATCTTGCA TGGAGCAATC TCGCAGTGCA GTGGTGCGGT2645

-40CZ 285533 B6

AATΓTAT CCA CGGCACTCCG CGAGCTGTAT CGGGTGGTGC GCCCCAAAGG CG1GGTCGCG2705

TTTACCACGC TGGTGCAGGG ATCGTTAQCC GAACTGCATC AGGCGTGGCA GGCGGTGGAC2765

GAGCGTCCGC ATGCTAATCG ClHTTACCG CCAGATGAAA TCGAACAGTC GCTGAACGGC2825

GTGCATTATC AACATCATAT TCAGCCCATC ACGCTGTGGT TTGATGATGC GCTCAGTGCC2885

ATGCOTTCGC TGAAAGGCAT CGGTGCCACG CATCTTCATG AAGGGCGCGA CCCGCGAATA2945 ttaacgcgtt cgcagttqca gcgattgcaa ctggcctggc cgcaacacca ggggcgatat3005

CCTCTGACGT ATCATCTTTT TTTO3GAGTG ATTGCTC GTG AGT ΑΑΑ CGT TAT TTT 3060

Val Ser Lys Arg Tyr Pbe

GTC

ACC

GGA

ACG

GAT

ACC

GAA

GTG

GGG

AAA

ACT

GTC

GCC

AGT

TGT

GCA

3108

Val

Thr

Gly

Thr

Asp

Thr

Glu

Val

Gly

Ly»

Thr

Val

Ala

Ser

Cys

Ala

W

15

20

CTT

TTA

CAA

GCC

GCA

AAG

GCA

GGC

TAC

CGG

ACG

GCA

GGT

TAT

AAA

3156

Leu

Gin

Ala

Lys

Ala

Gly

Tyr

Arg

Thr

Ala

Gly

Tyr

Lys

25

30

35

CCG

GTC

GCC

TCT

GGC

AGC

GAA

AAG

ACC

CCG

GAA

GGT

TTA

CGC

AAT

AGC

3204

Pro

Val

Ala

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

Gly

Leu

Arg

Asn

Ser

40

45

50

GAC

GCG

CTG

GCG

TTA

CAG

CGC

AAC

AGC

CTG

CAG

CTG

GAT

TAC

GCA

3252

Asp

Ala

Leu

Ala

Leu

Gin

Arg

Asn

Ser

Leu

Gin

Leu

Asp

Tyr

Ala

55

60

65

70

ACA

OTA

AAT

CCT

TAC

ACC

TTC

GCA

GAA

CCC

ACT

TCG

CCG

CAC

ATC

3300

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Thr

Phe

Ala

Glu

Pro

Thr

Ser

Pro

His

Ile

75

80

85

AGC

GCG

CAA

GAG

GGC

AGA

CCG

ATA

GAA

TCA

TTG

GTA

ATG

AGC

GCC

GGA

3348

Ser

Ala

Gin

Glu

Gly

Arg

Pro

Ile

Glu

Ser

Leu

Val

Met

Ser

Ala

Gly

90

95

100

TTA

CGC

GCG

CTT

GAA

CAA

CAG

GCT

GAC

TGG

GTG

TTA

GTG

GAA

GGT

GCT

3396

Leu

Arg

Ala

Leu

Glu

Gin

Ala

Asp

Trp

Val

Leu

Val

Glu

Gly

A1a

105

110

115

GGC

TGG

TTT

ACG

CCG

CTT

TCT

GAC

ACT

TTC

ACT

TTT

GCA

GAT

TGG

3444

Gly

Cly-Trp

Phe

Thr

Pro

Leu

Ser

Asp

Thr

Phe

Thr

Phe

Ala

Asp

Trp

120

125

130

OTA ACA CAG GAA CAA CTG CCG GTG ATA CTG GTA GTT GGT GTG AAA CTC3492

Val Thr Gin Glu Gin Leu Pro Val Ile Leu Va1 Val Gly Val Lys Leu

135 140 145150

GGC 1GT ATT AAT CAC GCG ATG TTG ACT GCA CAG GTA ATA CAA CAC GCC3540

Gly Cys Ile Asn His Ala Met Leu Thr Ala Gin Val Ile Gin His Ala

155 160165

GGA CTG ACT CTG GCG GGT TGG GTG GCG AAC GAT GTT ACG CCT CCG GGA3588

Gly Leu Thr Leu Ala Gly Trp Val Ala Asn Asp Val Thr Pro Pro Gly

170 175100

AAA CGT CAC GCT GAA TAT ATG ADC ACG CTC ACC CGC ATG ATT CCC GCG3636

Lys Arg His Ala Glu Tyr Mat Thr Thr Leu Thr Arg Met Ile Pro Ala

1B5 190195

-41CZ 285533 B6

CCG CTG CÍG GGA GAG ATC CCC TGG CTT GCA GAA AAT CCA GAA AAT GCG3684

Pro Leu Leu Gly Glu 11« Pro Trp Leu Ala Glu Asn Pro Glu AsnAla

200 205210

GCA ACC GGA AAG TAC ATA AAC CTT GCC TTC GTC GAC GCG TCG ACT CTA3732

Ala Thr Gly Lys Tyr 11« Asn Leu Ala Phe Val Asp Ala Ser ThrLeu

215 220 225230

GGG TTT ACA AGT CGA TTA TGACAACGGA CGATCTTGCC TTTGACCAAC3780

Gly Phe Thr Ser Arg Leu

235

GCCATATCTG GCACCCATAC ACATCCATGA CCTCCCCTCT GCCGGTTTAT CCGGTGGTGA3840

GCGCCGAAGG TTGCGAGCTG ATTTTGTCTG ACGGCAGACG CCTGGTTGAC GGTATGTCGT3900

CCTQGTGGGC GGCGATCCAC GGCTACAATC ACCCGCAGCT TAATGCGGCG ATGAAGTCGC3960

AAATTGATGC CATGTCGCAT GIGAIGITTG GCGGTATCAC CCATGCGCCA GCCATTGAGC4020

TGTGCCGCAA ACTGGTGGCG ATGACGCCGC AACCGCTGGA GTGCGTTTTT CTCGCGGACT4080

CCGGTTCCGT AGCGGTGGAA GTGGCGATGA AAATGGCGTT GCAGTACTGG CAAGCCAAAG4140

GCGAAGCGOG CCAGCGTTTT CTG*CCn<X GCAATGGTTA TCATGGCGAT ACCTTTGGCG4200

CGATGTCGGT GTGCGATCCG GATAACTCAA TGCACAGTCT GTGGAAAGGC TACCTGCCAG4260

AAAACCTGTT TGCTCCCGCC CCGCAAAGCC GCATGGATGG CGAATGGGAT GAGCGCGAIA4320

TGGTGGGCTT TGCCCGCCTG ATGGCGGCGC ATCGTCATGA AATCGCGGCG GTGATCAT1G4380

AGCCGATTGT CCAGGGCSCA GGCGGGATGC GCATGTACCA TCCGGAATGG TTAAAACGAA4440

TCCGCAAAAT ATGCGATCGC GAAGGTATCT TGCTGATTGC CGACGAGATC GCCACTGGAT4500

TTGGTCGTAC CGGGAAACTG TTTGCCIGTG AACATGCAGA AATCGCGCCG GACATTTTGT4S60

GCCTCGGTAA AGCCTTAACC CGCGGCACAA TGACCCTTTC CGCCACACTC ACCACGCGCG4620

AGGTTGCAGA AACCATCAGT AACGGTGAAG CCGGTTGCTT TATGCATGGG CCAACTTTTA4680

TGGGCAATCC GCTGGCCTGC GCGGCAGCAA ACGCCAGCCT GGCGATTCTC GAATC1GGCG4740

ACTGGCAGCA ACAGGTGGCG GATATTGAAG TACAGCTCCG CGAGCAACTT GCCCCCGCCC4800

GTGATGCCGA AATGGTTGOC GATGTQCGCG TACTGGQGGC CATTGGCGTG GTCGAAACCA4860

CTCATCOGGT GAATATGGCG GCGCTGCAM AATTCTTTGT CGAACAGGGF GTCTGGATCC4920

GGCCTTTTGG CAAACTGATT TACCTGATGC CGCCCTATAT TATTCTCCOG CAACAGTTGC4980

AGCGTCTGAC CGCAGCGGTT AACCGCGCGG TACAGGATGA AACATTTTTT TGCCAATAAC5040

GAGAAGTCCG CGTGAGGGTT TCTGGCTACA CTTTCTGCAA ACAAGAMGG AGGGTTCATG5100

AAACTCATCA GTAACGATCT GCGCGATGGC GATAAATTGC CGCATCGTCA TGTCTTTAAC5160

GGCATGGGTT ACGATGGCGA TMTATTTCA CCGCATCTGG CGTGGGATGA TGTTCCTGCG5220

GGAACGAAAA GTTTTGTTGT CACCTGCTAC GACCCGGATG CGCCAACCQG CTCCGGCTGG5Ž80

TGGCACTGGG TAGTTGTTAA CTTACCCGCT GATACCCGCG TATTACCGCA AGGGTTTGGC5340

-42CZ 285533 B6

TCTGGTCTGG TAGCAATGCC AGACGGCGTT TTGCAGACGC GTACCGACTT TGGTAAAACC

GGGTACGATG GCGCAGCACC GCCGAAAGGC GAAACTCA1C GCTACATTTT TACCGTTCAC

GCGCTGGATA TAGAACGTAT TGATGTCGAT GAAGGTGCCA GCGGCGCGAT GGTCGGGTFT

AACGTTCATT TCCACTCTCT GGCAAGCGCC TCGATTACTG CGATGTTTAG TTAATCACTC

IGCCAGATGG CGCAATGCCA TCTGGTATCA CTTAAAGGTA TTAAAAACAA CTTTTTG1CT

TTTTACCTTC CCGÍTTCGCT CAAGFFAGTA TAAAAAAGCA GGCTTCAACG GATTCAHTT

TCTATTTCAT AGCCCGGAGC AACCTGIGAA CACATTTTCA GTTTCCCGTC TGGCGCTGGC

ATTGGCTTTT GGCGTGAOGC TGAOCGCCTG TAGCTCAACC CCGCCCGATC AACGTCCT1C

TGATCAAACC GCGCCTGGTA CCGAGCTCGA ATTCCTGCAG GCATGCAAGC TT (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 7:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 384 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární ío (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 7:

5400

5460

5520

5500

5640

5700

5760

5820

5872

Met

Ser

Trp

Gin

Glu

Lys

11·

Asn

Ala

Leu

Asp

AU

Arg

AU

1

5

10

15

Ala

Asp

Ala

Leu

Arg

Tyr

Pro

Val

Ala

Gin

Gly

Ala

G1y

Arg

20

25

30

Trp

Leu

Val

Ala

Asp

Arg

Gln

Tyr

Leu

Asn

Phe

Ser

Asn

Asp

35

40

45

Tyr

Leu

Gly

Leu

Ser

His

HIS

Pro

Gin

Ile

Arg

Ala

Trp

Gin

50

55

60

Gly

Ala

Glu

Gin

Phe

Gly

Ile

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

His

Val

Ser

65

70

75

80

Gly

Tyr

Ser

Val

His

Gin

Ala

Leu

Glu

Leu

Ala

Glu

Trp

85

90

95

Leu

Gly

Tyr

Ser

Arg

Ala

Leu

Phe

Ile

Ser

Gly

Kw

AU

Asn

100

105

110

Gin

Ala

Val

Ile

Ala

Met

Ala

Lys

Glu

Asp

Arg

IU

Ala

115

120

125

-43CZ 285533 B6

Asp

Arg

Leu

Ser

His

Ala

Ser

Leu

Glu

Ala

Ser

Leu

Ser

Pro

130

135

140

Ser

Gin

Leu

Arg

Phe

Ala

His

Asn

Asp

Val

Thr

His

Leu.

.Ala

Arg

145

150

155

160

Leu

Ala

Ser

Pro

Cys

Pro

Gly

Gin

Met

Val

Thr

Glu

Gly

165

170

175

Val

Phe

Ser

Met

Asp

Gly

Asp

Ser

Ala

Pro

Leu

Ala

Glu

Ile

Gin

180

185

190

Val

Thr

Gin Gin

His

Asn

Gly

Trp

Leu

Met

Val

Asp

Ala

His

Gly

195

200

205

Thr

Gly

Val Ile

Gly

Glu

Gin

Gly

Arg

Gly

Ser

Cys

Trp

Leu

Gin

Lys

210

215

220

Val

lys

Pro Glu

Leu

Val

Thr

Phe

Gly

Lys

Gly

Phe

Gly

Val

225

230

235

240

Ser

Gly

A1a Ala

Val

Leu

Cys

Ser

Thr

Val

Ala

Asp

Tyr

Leu

245

250

255

Gin

Phe

Ala Arg

His

Leu

Ile

Tyr

Ser

Thr

Ser

Met

Pro

Ala

Gin

260

265

270

Ala

Gin

Ala Leu

Arg

Ala

Ser

Leu

Ala

Val

Ile

Arg

Ser

Asp

Glu

Gly

275

280

285

Asp

Ala

Arg Arg

Glu

Lys

Leu

Ala

Leu

Ile

Thr

Arg

Phe

Arg

Ala

290

295

300

Gly

Va)

Gin Asp

Leu

Pro

Phe

Thr

Leu

Ala

Asp

Ser

Cys

Ser

Ala

Ile

305

310

315

320

Gin

Pro

Leu 1le

Val

Gly

Asp

Asn

Ser

Arg

Ala

Leu

Gin

Leu

Ala

Glu

325

330

335

Lys

Leu

Arg Gin

Gin

Gly

CyS

Trp

VaT

Thr

Ala

Ile

Arg

Pro

Thr

340

345

350

Val

Pro

Ala Gly

Thr

Ala

Arg

Leu

Arg

Leu

Thr

Leu

Thr

Ala

His

3S5

360

365

Glu

Met

Gin Asp

Í1e

Asp

Arg

Leu

Glu

Val

Leu

His

Gly

Asn

Gly

380

370

375 (2) INFORMACE K SEK ID C.: 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 236 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID C.: 8:

-44CZ 285533 B6

Val Ser Lys Arg Tyr Phe Val Thr Gly Thr Asp Thr Glu Val Gly Lys 15 10 15

Thr

Val

Ala

Ser

Cys

Ala

Leu

Gin

Ala

A1a

Lys

Ala

Gly

Tyr

20

25

30

Arg

Thr

Ala

Gly

Tyr

Ly»

Pro

Val

Ala

Ser

Gly

Ser

Glu

Lys

Thr

Pro

35

40

45

Glu

Gly

Leu

Arg

Asn

Ser

Asp

Ala

Leu

Ala

Leu

Gin

Arg

Asn

Ser

SQ

55

60

Leu

Gin

Leu

Asp

Tyr

Ala

Thr

Val

Asn

Pro

Tyr

Thr

ΡΙ»

Ala

Glu

Pro

65

70

75

80

Ihr

Ser

Pro

H1S

Ile

Ser

Ala

Gin

Glu

Gly

Arg

Pro

Ile

Glu

Ser

85

90

95

Leu

Val

Met

Ser

Ala

Gly

Leu

Arg

Ala

Leu

Glu

Gin

Ala

Asp

Trp

100

105

no

Val

Leu

Val

Glu

Gly

Ala

Gly

Trp

Phe

Thr

Pro

Leu

Ser

Asp

Thr

115

120

125

Phe

Thr

Phe

Ala

Asp

Trp

Val

Thr

Gin

Glu

Gin

Leu

Pro

Val

Ile

Leu

130

135

140

Val

Gly

val

Lys

Leu

Gly

Cys

Ile

Asn

His

Ala

Met

Lev

Thr

Ala

145

150

155

150

Gin

Val

[le

Gin

His

Ala

Gly

Leu

Thr

Leu

Ala

Gly

Trp

Val

Ala

Asn

165

170

175

Asp

Val

Thr

Pro

Gly

Ly»

Arg

His

Ala

Glu

Tyr

Met

Thr

Leu

180

185

190

Thr

Arg

Met

Ile

Pro

Ala

Pro

Leu

Gly

Glu

Ile

Pro

Trp

Leu

Ala

195

200

205

Glu

Asn

Pro

Glu

Asn

Ala

Thr

Gly

Lys

Tyr

Ile

Asn

Leu

Ala

Phe

210

215

220

Val

Asp

Ala

Ser

Thr

Leu

Gly

Phe

Thr

Ser

Arg

Leu

225

230

235

(2) INFORMACE K SEK ID Č.: 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 143 párů baží (B) DRUH: molekulová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE

-45CZ 285533 B6 (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..24 (D) JINÉ ÚDAJE: /parciální /EC_číslo= 6.3.3.3. /produkt= „dethiobiotin synthasa“ /gen= „bioD“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 120..143 (D) JINÉ ÚDAJE: /parciální /kodon_start= 120 /EC číslo= 2.6.1.62 /produkt= „DAPA synthasa“ /gen= „bioA“ /pseudo (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 111..122 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „bioA RBS“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: smyčka (stem_loop) (B) POLOHA: 38..85 (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 Bl (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 9:

TAC ATA AAC CTT GCC TTG TTG TAGCCATTCT GTATTTGGTT AAATTGCGAG51

Tyr 11® Asn Leu Ala Leu Leu

CGAGATCGCG TCTTCGATTG ACTGCAATTT AACCCTCTAG AGTCGACTCT AGGGTTTACA 111

AGTCGATT ATG ACA ACG GAC GAT CTT GCC TTT143

Met Thr Thr Asp Asp Leu Ala Phe

-46CZ 285533 B6 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 10:

Tyr Ile Asn Leu Ala Leu Leu

5 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 11 :

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 11:

Met Thr Thr Asp Asp Leu Ala Phe 1 5 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 93 párů baží (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A-9 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..24 (D) JINÉ ÚDAJE: /parciální /kodon_start= 1 /EC_číslo= 6.3.3.3.

-47CZ 285533 B6 /produkt= „DTB synthasa“ /gen= „bioD“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 70..93 (D) JINÉ ÚDAJE: /parciální /kodon_start= 70

ZEC_číslo= 2.6.1.62 /produkt= „DAPA synthasa“ /gen= „bioA“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 61..72 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardníjméno= „bioA RBS“ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 Bl (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 12:

TAC ATA AAC CTT GCC TTG TTG TAGCCATTCT GTATTTGGTT CGTCGACTCT51

Tyr Ile Asn Leu Ala Leu Leu

AGGGTTTACA AGTCGATT ATG ACA ACG GAC GAT CTT GCC TTT93

Het Thr Thr Asp Asp Leu Ala Phe (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 8 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 13:

Tyr Ile Asn Leu Ala Leu Leu

5 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 7 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární

-48CZ 285533 B6 (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 14:

Met Thr Thr Asp Asp Leu Ala Phe 1 5 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 77 párů baží (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A-15 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 1..57 (D) JINÉ ÚDAJE: /parciální /kodon_start= 1 /funkce= „změněný 3-konec“ /EC_číslo= 6.3.3.3.

/produkt= „DTB synthasa“ /gen= „bioD“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: CDS (B) POLOHA: 54..77 (D) JINÉ ÚDAJE: /parciální /kodon_start= 54 /EC_číslo= 2.6.1.62 /produkt= „DAPA synthasa“ /gen= „bioA“ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 45..56 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „bioA RBS“ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 Bl

-49CZ 285533 B6 (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 15:

TAC ATA AAC CFT GCC TTC GTC GAC GCG TCG ACT CTA GGG TTT ACA AGT Tyr Ile Asn Leu Ala Phe Val Asp Ala Ser Thr Leu Gly Phe Thr Ser 1 5 10 1$

CGA TTA TGACAACGGA CGATCTTGCC TTT

Arg Leu (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 18 aminokyselin (B) DRUH: aminokyselina (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: protein (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 16:

Tyr Ile Asn Leu Ala Phe Val Asp Ala Ser Thr Leu Gly Phe Thr Ser ^{1 5} 10 |5

Arg Leu (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 17:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 125 párů baží (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Esycherichia coli (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A-15/985E (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: -10_signal (B) POLOHA: 45..49 (D) JINÉ ÚDAJE: /standardní_jméno= „promotor ptač“

4S

-50CZ 285533 B6 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: promotor (B) POLOHA: 1..96 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /funkce= „promotor ptač“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 B1 (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 17:

AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTTAGGAGG TGACTAGTCA

7GGCT

120

125 (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 126 párů baží (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A-15/16 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: promotor (B) POLOHA: 1„96 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /funkce= „promotor ptač“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: 105..123 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně

-51CZ 285533 B6 (D) JINÉ ÚDAJE: /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /standardní_jméno= „bioB RBS č. 16“ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 B1 (I) JMÉNO PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE: SEK ID Č.: 18:

AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT GTGAGCGGAT AACAATTICA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGG TTrACTAGTO ATGGCT (2) INFORMACE K SEK ID Č.: 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 122 párů baží (B) DRUH: nukleová kyselina (C) FORMA VLÁKNA: dvojitá (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) DRUH MOLEKULY: DNA (genomicky) (iii) HYPOTETICKY: NE (iii) NESMYSL (antisense): NE (vi) PRVOTNÍ PŮVOD:

(A) ORGANIZMUS: Escherichia coli (vii) BEZPROSTŘEDNÍ PŮVOD:

(B) KLON: pBO30A-15/9 (ix) ZNAKY:

(A) JMÉNO/KLÍČ: promotor (B) POLOHA: 1..96 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /funkce= „promotor ptač“ /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ (ix) ZNAKY:

(A) DÉLKA/KLÍČ: RBS (B) POLOHA: J05.. 119 (C) DRUH ZJIŠŤOVÁNÍ: experimentálně (D) JINÉ ÚDAJE: /evidence= EXPERIMENTÁLNĚ /standardní_jméno= „bioB RBS č. 9“ (x) INFORMACE O ZVEŘEJNĚNÍ:

(H) ČÍSLO DOKUMENTU: WO 87/01391 B1 (I) DATUM PŘIHLÁŠENÍ: 26-AUG-1986

120

126

-52CZ 285533 B6 (J) DATUM ZVEŘEJNĚNÍ: 07-APR-1993 (xi) POPIS SEKVENCE ID Č.: 19:

AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT 60

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGA CTAGTCATGG 120

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. DNA-fragment obsahující geny pro biosynthesu biotinu bioB, bioF, bioC. bioD a bioA z enterobakterií, přičemž jde o geny bioB, bioF, bioC, bioD a bioA ze skupiny rodů Escherichia, Salmonella a Citrobacter uspořádané v jedné transkripční jednotce pod jedním společným promotorem.
2. DNA-fragment podle nároku 1 vybraný z druhu Escherichia coli.
3. DNA-fragment podle nároku 1 nebo 2, ve kterém je společný promotor tac-promotor.
4. DNA-fragment podle jednoho z nároků 1 až 3, ve kterém genověregulační prvek transkripční jednotky v přímém spojení s bioB-genem zahrnuje sekvenci:

AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT

TGTAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTTAGGAGG TGACTAGTC
5. DNA-fragment podle jednoho z nároků 1 až 3, ve kterém genověregulační prvek transkripční jednotky v přímém spojení s bioB-genem zahrnuje sekvenci:

AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGG TTTACTAGTC
6. DNA-fragment podle jednoho z nároků 1 až 3, ve kterém genověregulační prvek transkripční jednotky v přímé spojení s bioB-genem zahrnuje sekvenci:

AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAAT GTGTGGAATT

TGTAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAGA CTAGTC
7. DNA-fragment podle jednoho z nároků 1 až 6, ve kterém odstup mezi po sobě následujícími geny bioD a bioA v transkripční jednotce není větší než 50 bp.
8. DNA-fragment podle jednoho z nároků 1 až 7, ve kterém jsou geny bioD a bioA uspořádány tak, že 3'-konec bioD-genu zahrnuje vazebné místo ribosomů pro bioA-gen.

-53CZ 285533 B6
9. Plazmid pBO30A-15/9, obsahující DNA-fragment podle nároku 1, jak je uložen v E. coli XLl-Blue nebo E. coli BM4062 pod depozitními čísly DSM 7246 nebo DSM 7247.
10. Plazmid pBO30A-15/9, obsahující DNA-fragment podle nároku 1, jak je uložen v E. coli ED8767 pod depozitním číslem DSM 8554.
11. Plazmid pBO47, obsahující DNA-fragment podle nároku 1, jak je uložen v Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 pod depozitním číslem DSM 8555.
12. E. coli XLl-Blue produkující biotin a obsahující plazmid pBO30A-15/9 uložený pod depozitním číslem DSM 7246.
13. E. coli BM4062 produkující biotin a obsahující plazmid pBO30A-15/9 uložený pod depozitním číslem DSM 7247.
14. E. coli ED8767 produkující biotin a obsahující plazmid pBO30A-15/9 uložený pod depozitním číslem DSM 8554.
15. Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 produkující biotin a obsahující plazmid pBO47, uložený pod depozitním číslem DSM 8555.
16. Způsob biotechnologické synthesy biotinu, vyznačující se tím, že se látkové přeměnitelný zdroj uhlíku fermentuje pomocí mikroorganizmu podle jednoho z nároků 12 až 15 na biotin.
17. Způsob výroby biotinu, vyznačující se tím, že zahrnuje přeměnu dethiobiotinu na biotin v bezbuněčném systému pomocí biotinsynthasy, přičemž se přeměna provádí v přítomnosti thiaminpyrofosfátu, NADPH, S-adenosylmethioninu, Fe²⁺-iontů, cysteinu a alespoň jedné další aminokyseliny ze skupiny asparagin, kyselina asparagová, glutamin a serin za použití DNA-fragmentu obsahujícího gen pro biosynthesu biotinu bioB.
18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že se přeměna provádí v přítomnosti flavodoxinu a ferredoxin(flavodoxin)-NADP⁺-reduktasy.
19. Způsob podle jednoho z nároků 17 nebo 18, vyznačující se tím, že se přeměna provádí v přítomnosti proteinové frakce, která se získá precipitací síranem amonným při 45%ním nasycení buněčného extraktu z Escherichia coli.
20. Proteinová frakce s biotinsynthasovým stimulačním účinkem, připravitelná precipitací síranem amonným při 45%ním nasycení buněčného extraktu z Escherichia coli.