JPH04169180A - 新規微生物及びそれを用いるビオチン活性物質の製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
に属し、５−（２−チエニル）吉草酸に耐性を有する新
規微生物、特に、ビオチン活性物質を生成蓄積する能力
を有する微生物に関する。また、本発明は、これらの微
生物を用いるビオチン活性物質の製造方法にも関する。

ゴ従来の技術： ビオチンは動植物および微生物にとって必要なビタミン
であり、複雑な工程を要する化学合成法に代替すべく、
遺伝子工学的技術により改良された微生物を用りまた醗
酵法による効工的な製造方法が開発されて□、する。（
例えば、特開昭６１−１４９０９１号公報、ヨーロッパ
特許公開第０３］６２２９号公報、参照） 微生物を改良して特定の有用物質の生産能が向上した高
生産変異株を取得する方法として、従来から、構造類似
物質の代謝拮抗作用を利用して適当な構造類似物質に対
する耐性変異株を選択すれば、それら耐性変異体の中に
効率よく目的とする有用物質の高生産変異株が見出され
ることが知られていた。ビオチン高生産変異株の取得に
関しても、アクチチアジン酸、α−デヒドロビオチン（
例えば、特開昭６１−１４９０９１号公報、参照）、５
−（２−チエニル）吉草酸（例えば、特公昭６３−５４
３６０号公報、参照）等の構造類似物質を利用した例が
知ろれている。

５−く２−チエニル）吉草酸は比較的容易に化学合成す
ることが可能であるが、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａ）属の微生物に対しては代謝拮抗作用を示さな
いと言われており（例えば、Ｉｚｕｍｉ、　Ｙ、。

等、Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｎ、、　　４２．５
７９．　　（１９７８）、参照）、エシェリヒア（Ｅｓ
ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の微生物のビオチン高生産変異
体の取得に５−（２−チエニル）吉草酸を利用した例は
従来技術文献に未載である。

〔発明が解決しようとする課題〕

前述の、ビオチン生産能の向上を目的に改良された微生
物は、いずれも所期の目的を達成しているとはいえ、い
まだ改良の余地があり、醗酵法におけるビオチンの生産
性を向上すべく、さらなる改良を加えた変異株を提供す
ることの必要性は現在も変わりない。本発明の目的は、
ビオチン活性物質生成蓄積能がより一層向上した微生物
を提供し、特に、ビオチンオペロンを組み込んだ組換え
プラスミドを含有せしめた微生物を利用することにより
、さらに効率のよいビオチン活性物質の製造方法を提供
することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、エシェリヒア（ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ
）属に属する微生物を改良してビオチン生産能を向上さ
せるべく鋭意研究を重ねた結果、意外にも、従来、エシ
ェリヒア属（ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）の微生物に対し
ては代謝拮抗作用を示さず、ビオチン高生産変異株の取
得には利用できないと考えられていた５−（２−チエニ
ル）吉草酸が、添加濃度および培地組成を工夫すること
によりエシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ、）
属の微生物に対しても代謝阻害作用を示すことを見出し
た。すなわち、このような５−（２−チエニル）吉草酸
が代謝阻害作用を示す適当な選択培地を用いて、変異誘
導処理したエシェリヒア（巳５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属
の微生物から５−（２−チエニル）吉草酸に対する耐性
変異株を選択すると、耐性変異株の中に高い頻度でビオ
チン活性物質の生産能が顕著に増強された変異株が見出
されること、および、これらのビオチン活性物質の生産
能が増強された変異株にビオチンオペロンをベクターＤ
ＮＡに組み込んだ組換えプラスミドを含有せしめること
によりビオチン活性物質の生産能を極めて顕著に増大さ
せうること、さらに該微生物を用いることにより効率良
くビオチン活性物質を製造できることを見出し、本発明
を完成するに至った。

すなわち、かかる知見に基づく本発明は、エシェリヒア
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈ＋ａ）　属に属し、５−（２−チ
エニル）吉草酸に耐性を有し、ビオチン活性物質を生成
蓄積する能力を有することを特徴とする微生物： 前記微生物を宿主として用い、これにビオチンオペロン
をベクターＤＮＡに組み込んだ組換えプラスミドを含有
せしめてなる微生物：ならびに前記組換えプラスミドを
含有する微生物を栄養培地で培養し、培地中に生成蓄積
されたビオチン活性物質を採取することを特徴とするビ
オチン活性物質の製造方法、 を提供するものである。

以下、本発明をより具体的に説明する。

本発明において生産されるビオチン活性物質には、ビオ
チン生合成経路で生成する７−ケドー８−アミノペラル
ゴン酸や７．８−ジアミノペラルゴン酸、デチオピオチ
ン、ビオチン、ビオチンスルホキシドなどが含まれる。

本発明において使用する５−（２−チエニル）吉草酸（
以下、ｒＴＶＡ−とも記す）は、例えば（Ｍｅｌｖｉｌ
ｌｅ　Ｄ、Ｂ、　、等、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、１４
６．４８７゜（１９４２）　〕に記載の方法によりチオ
フェンと無水グルタル酸から合成することができる。

本発明において使用される微生物は、エシェリヒア属に
属するビオチン活性物質生産菌、すなわちビオチン生合
成の酵素系を有している微生物であって、かつＴＶＡに
耐性を有するものである。

ここでｒ５−　（２−チエニル）吉草酸（ＴＶＡ）に耐
性を有する」とは、後述のような最小培地に最小生育阻
止濃度以上のＴＶＡを添加した選択培地において生育が
可能であることを意味する。通常のエシェリヒア（Ｅｓ
ｃｈｅｒ　ｉｃｈ　ｉａ）属の微生物はこの選択培地で
は生育できない。この基本的性質を有する限りどのよう
な由来の菌株であっても、本発明の目的に沿うものであ
る限り制限されるものではない。すなわち、ビオチン活
性物質の生産に都合よく用いることができるエシェリヒ
ア属に属する微生物であれば、それらが当該技術分野で
既知の他の薬剤耐性または有用な形質、例えばビオチン
によるフィードバック抑制が解除された形質、な素糸を
有するものであればどのようなエシェリヒア属に属する
微生物であってもよく、好ましくは予めビオチンの生産
に適するように変異された菌株、例えば本発明者らによ
って作出された、ビオチンによるフィールドバック抑制
が解除されているＤＲＫ−３３２３（、微工研条寄第２
１１６号）などが挙げられる（国際公開第８９／４３６
５号参照）。

本発明の微生物は、前記親株から次のような変異株の選
択培地、目的とする変異株の選択方法を用いて人手する
ことができる。例えば、ＴＶＡに耐性を有する変異株の
選択に使用する培地は、ＴＶＡの代謝拮抗作用を顕著に
するために、微生物によって容易に代謝されてエネルギ
ー源や細胞構成成分となるような物質、例えば炭素源と
して糖類やグリセリンなど、窒素源としてペプトン、酵
母エキスなどの有機質物質、などの使用を制限した最小
培地であることが望ましい。適当な最小培地を用いると
ＴＶＡはエシェリヒア属の微生物に対しても代謝阻害作
用を示し、通常のエシェリヒア属の微生物に対してその
最小生育阻止濃度を決定することができる。

このような最小培地に最小生育阻止濃度以上のＴＶＡを
添加した選択培地（寒天平板培地）に、通常の変異誘起
処理、例えばＮ−メチル−Ｎ　／−ニトロ−Ｎ−ニトロ
ソグアニジンのごとき変異誘起剤で処理した前記親株の
変異菌株を塗布して培養し、生じたＴＶＡに耐性を有す
る変異株コロニーを釣菌分離して適当なビオチン生産培
地に移して培養し、生成蓄債したビオチン活性物質量を
、例えばラクトバシルス・プランタラム（Ｌａｃｔｏｂ
ａ−ｃｉｌｌｕｓ　ｐｌａｎｔａｒｕｍ）を指標菌とし
たバイオアッセイによって定量し、親株と比較してビオ
チン活件物質生成蓄積能の増加した変異株を選択するこ
とによって取得することができる。

こうして得られる本発明の微生物の具体的なものとして
は、微生物工業技術研究所特許微生物寄託センターに平
成２年１０月１２日付で寄託し、微工研菌寄第１１７７
０号の寄託番号が付されているエシェリヒア・コリＤＲ
Ｔ　９株が挙げられる。

本発明の微生物く以下ｒＤＲＴ株」ともいう）は、例え
ばもうひとつの本発明に有利に使用されるごと〈産業上
の有用性を有している。すなわち、本発明によれば前記
微生物を宿主として用い、ビオチンオペロンをベクター
ＤＮＡに組み込んだ組換えプラスミドで形質転換または
形質導入したビオチン活性物質の高生産能を有する微生
物およびそれを使用するビオチン活性物質の製造方法が
提供される。

本発明の宿主として用いる微生物に導入される前記組換
えプラスミドは、エシェリヒア属にａする前述のような
微生物を宿主とする宿主・ベクター系でビオチン産生能
を発現する組換えベクターであればいずれも使用するこ
とができるが、例えば本発明者らにより提供されたエシ
ェリヒア・コＩＪＤＲＫ−３３２３（：ｐＸＢＡ３１２
Ｆ　　（微工研条寄第２１１７号）、あるいは同ＤＲＫ
−３３２０ρＫＮ〜３１Ｅ　　（微工研条寄第２１１４
号）より、それ自体既知のプラスミド抽出方法で得られ
る組換えプラスミドｐＸＢＡ３１２　、　ｐＫＨＮ３１
を使用することができる。

組換えプラスミドを含有する本発明の微生物の取得は、
上記のような組換えプラスミドを常法、例えばＣＭａｎ
ｄｅｌ　Ｍ、、　　等、Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　
、　５３．１０９゜（１９７０）　）に記載のカルシウ
ム法によりＤＲＴ株に導入し、ベクターの持つ形質によ
り組換えプラスミドを含有する閑のクローンを選択的に
生育せしめる寒天平板培地にて培養し、出現するコロニ
ーとして取得することができる。

こうして得られた組換えプラスミド含有ＤＲＴ株の例と
しては、例えば前記特許微生物寄託センターに平成２年
１０月１２日付で寄託し、微工研菌寄第１１７７１号の
寄託番号が付されているエシエＩＪヒア・コリＤＲＴ　
９　ＣｐＸＢＡ３１２〕が挙げられる。

この微生物は、エシェリヒア属に属する微生物を培養す
るのに通常用いられている栄養培地、培養条件下で培養
することによって、培養液中にビオチン活性物質を著量
蓄積することができる。例えば、栄養培地としては、そ
れ自体既知の炭素源、窒素源、無機物を含有する合成培
地、または天然培地のいずれも使用可能である。炭素源
としてはクリセリン、フラクトース、シュークロース、
マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液、糖蜜
などの炭水化物が利用でき、その使用量は０．１〜５．
０％程度が望ましい。

窒素源としては、アンモニア、塩化アンモニウム、燐酸
アンモニウム、硫酸アンモニウムなどの各種の無機およ
び有機アンモニウム塩類、あるいはアミノ酸、肉エキス
、酵母エキス、コーンステイープリカー、カゼイン加水
分解物、脱脂大豆粉、あるいはその消化物などの天然有
機窒素源が使用可能である。天然有機窒素は多くの場合
、窒素源であるとともに炭Ｓ源にもなりうる。

さらに無機物としては、燐酸第一水素カリウム、燐酸第
二水素カリウム、硫酸マグネンウム、塩化ナトリウム、
硫酸第一鉄、塩化カルシウム、塩化亜鉛、硫酸銅、塩化
マンガン、塩化コバルト、モリブデン酸アンモン、はう
酸などが利用できる。

また、ヨーロッパ特許公開第０３１６２２９号公報記載
のアラニンの添加は本発明の微生物でも有効である。培
地に添加するアラニンの濃度は、１〜１０ｇ／Ｒが好適
であり、さらに好ましくは３〜７ｇ／ｌである。アラニ
ンの添加は培養の初期から添加しておいても良いし、小
量ずつ分割して添加しても良い。

造成された微生物の抗菌薬剤耐性が付与されている場合
には、該当する抗菌剤を培地に添加することによって汚
染菌の混入を防ぐことができる。

培養は振とう培養あるいは通気撹拌培養などの好気的条
件下で行うのが好ましい。培養温度は２５〜３７℃が好
適であり、培養中の培地のｐＨは中性付近に維持するこ
とが望ましい。培養期間は通常２４〜７２時間程度であ
る。培養を終了した後、培養液からのビオチン活性物質
の採取にあたっては、ビオチン、デチオビオチン等のビ
オチン活性物質の諸性質を利用して、一般の天然物から
の抽出精製に利用される諸方法が応用できる。例えば、
培養物から菌体を除き、活性炭にビオチン活性物質を吸
着させ、しかるのち溶出させてイオン交換樹脂で分離精
製するか、あるいは培養ろ液を直接イオン交換樹脂で処
理して分離精製し、水またはアルコールより再結晶する
ことによりビオチン、デチオビオチン等のビオチン活性
物質を採取することができる。

〔実施例〕

次に、実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない
。

実施例１ （１）ＴＶＡの最小生育阻止濃度の決定エシェリヒア・
コリＤＲＫ−３３２３（微工研条寄第２１１６号）を、
ピルビン酸最小培地（リン酸二ナトリウム（１２水和物
）８．８ｇ／β、リン酸−カリウム１．２ｇ／β、硫酸
アンモニウム１．ｏｇ／ｆ、硫酸マグ不ンウム（７水和
物）０．１ｇ／ｎ、ピルビン酸ナトリウム１．０ｇ／β
、ｐＨ７，０に調整）に寒天保存培地から一白金耳植閑
し、３７℃で１６〜１８時間振とう培養後、遠心分離に
より培養液から菌体を回収し、ピルビン酸最小培地で十
分繰り返し洗浄後、同培地に再Ｖ濁して接種菌液とした
。この菌液を各種濃度のＴＶＡを添加したピルビン酸最
小培地に接種し、３７℃で２４時間振とう培養を行い、
濁度（ＯＤ６６０）　によって生育菌体量を定量してＴ
ＶＡの生育阻害効果を調べた。結果を第１表に示す。

ＴＶＡは２ｇ／βの添加濃度でＤＲＫ−３３２３株の生
育を阻止した。

第１表 １　　２．０　　　　　　　０　　１ （２）ＤＲＴ株の調製 エシェリヒア・コリＤＲＫ−３３２３株をビルビル酸最
小培地中３７℃で４時間振とう培養を行った。対数増殖
期の菌体を集洗後、Ｎ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニ
トロソグアニジン１０に／ｍｌ！ヲ含有するＴＭ緩衝液
（トリス−塩基０．６１％、マレイン酸０．５％、ｐＨ
６，ｏに調整）に懸濁し、３７℃で３０分間変異処理を
行った。集洗した菌体をピルビン酸最小培地中で回復培
養し、集洗後、再懸濁液をＴＶＡ２ｇ／βを含むピルビ
ン酸最小寒天平板培地に菌数がシマーレ１枚あたり１０
個程度となるように塗布した。３７℃４８時間培養後、
８現したＴ　Ｖ　、Ａ、耐性変異体コロニーを釣菌し、
Ｌ培地（ペプトン１０ｇ／ｐ１酵母エキス５ｇ／β、グ
ルコース１ｇ／！、塩化す）　ＩＪウム５ｇ／β、Ｉ］
８７．０に調整）に接種して３７℃で４８時間培養し、
培養液中に生成蓄積したビオチン量をラクトバシルス・
プランタラム（ＡＴＣＣ８０１４）を用いたバイオアッ
セイ法で定量した。親株ＤＲＫ−３３２３株に比べてビ
オチン生成蓄積能が増加したＴＶＡ耐性株の一株として
エシェリヒア・コリＤＲ７９株を得た。

本菌株はＤＲＫ−３３２３株の約１，５倍のビオチン生
成蓄積能を示した。

実施例２　組換えプラスミドを含有するＤＲＴ変異株の
調製 常法のカルシウム法により、ビオチンオペロンをベクタ
ーＤＮＡに組み込んだ組換えプラスミドｐＸＢＡ３１２
で［ｌＲＴ　９株を形質転換し、次いでテトラサイクリ
ンＬｏｇ／ｍｆ！を含むし寒天培地プレート上で生じた
コロニーを分離してエシェリヒア・コリＤＲＴ　９　Ｃ
ｐＸＢＡ３１２Ｅを得た。

実施例３　ビオチン活性物質の製造 上記の組換えプラスミドを含有するＤＲＴ株を、まず前
培養としてＬ培地（組換えプラスミドを含有する菌株の
場合にはテトラサイクリンを２０■／ｍｌ添加）に寒天
保存培地から一白金耳接種して３７℃８〜１２時間培養
した。この前培養液０．２ｍｆをＨ培地（リン酸二すｌ
−ＩＪウム（１２水和物）１７．６ｇ／β、リン酸−カ
リウム２．４ｇ／／、硫酸アンモニウム４．０ｇ／β、
酵母二キスＩＱ　ｇ　／　ｆ＜、ペプトン１０　ｇ　／
　ｎ、硫酸第一鉄（７水和物）０．１ｇ／ｉ！、塩化力
ルンウム（２水和物）０．０５ｇ／β、塩化ガンマン（
４水和物）０．０５ｇ／ｆ、硫酸マク不ンウム（７水和
物）０．１ｇ／β、グルコース５．０ｇ／ｌ、ＤＬ−ア
ラニン５．０　ｇ／　Ｉ、　ｐＨ７，０に調整）２０−
を含む５０〇−容量の坂ロフラスコに接種し、３７℃で
４８時間振とう培養し、菌体量およびビオチン生成蓄積
量を測定した。結果を第２表に示す。

第　　２　　表 １　　菌株名称　　　菌体量　　ビオチン生成蓄１１　
　　　　　　　　　（００６６０）　　積置（ｍｇ／Ａ
）、１こ発明の効果： 本発明によれば、ビオチン活性物質の生産に有利に使用
することができる新規な５−く２−チエニル）吉草酸に
耐性を有しビオチン活性物質生成蓄債能の増加した微生
物、さらにこの微生物を宿主として用いビオチンオペロ
ンを組み込んだ組換えベクターを含有せしめた微生物が
提供される。

後者の微生物は、ビオチン活性物質の製造に有利に使用
することができる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、エシェリヒア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属に属し
   、５−（２−チエニル）吉草酸に耐性を有し、ビオチン
   活性物質を生成蓄積する能力を有することを特徴とする
   微生物。 ２、ビオチンオペロンをベクターＤＮＡに組み込んだ組
   換えプラスミドを含有せしめてなる請求項１記載の微生
   物。 ３、請求項２記載の微生物を栄養培地で培養し、培地中
   に生成蓄積されたビオチン活性物質を採取することを特
   徴とするビオチン活性物質の製造方法。