JPH0424038B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

＜産業上の利用分野＞ 本発明は発酵法によるピルビン酸の製造方法に
関するものである。 ピルビン酸は生体代謝の重要な中間体であり、
各種医・濃薬などの有効な合成原料であるのみな
らず酵素法によるＬ−トリプトフアン、Ｌ−シス
テイン、Ｌ−チロシンなどのアミノ酸合成の主要
原料である。よつて安価に製造し得れば、種々の
合成原料として有用である。 ＜従来の技術＞ 将来トルロプシス・属微生物を用いて、発酵法
によりピルビン酸が製造できることは、既に知ら
れている（日本農芸化学会誌第32巻第573ページ、
特開昭62−14789号公報）。 ＜発明が解決しようとする問題点＞ しかしながら、かかる従来方法においてはピル
ビン酸の蓄積量、収率が低く、工業的に実用化す
ることはできない。すなわち、日本農芸化学誌第
32巻第573ページによると、トルロプシス・キヤ
ンデイダを用いたピルビン酸の蓄積量は高々0.5
ｇ／と低い。また、特開昭62−14789号公報に
よると、トルロプシス・エツチエルシーを用いた
ピルビン酸の蓄積量は高々5.1ｇ／と低い。 ＜問題点を解決するための手段および作用＞ したがつて本発明者らは、上記問題点を解決す
ることができ、さらに生産性の高いピルビン酸の
製造方法について鋭意研究した結果、トルロプシ
ス属に属し、ピルビン酸生産能を有する微生物
に、アラニンのアナログであるアミノオキシ酢酸
に対する耐性を付与した変異株を使用することに
よつてピルビン酸を著量蓄積せしめることが可能
であることを見出した。 すなわち、本発明はトルロプシス属に属し、ア
ミノオキシ酢酸に対する耐性を有し、かつピルビ
ン酸生産能を有する微生物を培養して、培養液中
にピルビン酸を生成蓄積せしめ、培養液中よりピ
ルビン酸を採取することを特徴とする発酵法によ
るピルビン酸の製造方法である。 本発明に用いられる微生物は、トルロプシス属
に属し、アミノオキシ酢酸に耐性を有する微生物
である。かかる性質を有していれば、他の栄養要
求性、他の薬剤抵抗性を持つものでも本発明の範
囲に含まれる。 本発明で用いられる変異株の代表的なものとし
ては、たとえばトルロプシス・グラブラータ
AOA−８（FERM BP−1427）（ニコチン酸、チ
アミン、ピリドキシン、ビオチン要求性、アミノ
オキシ酢酸耐性）が挙げられる。この変異株は、
トルロプシス・グラブラータTR−2026（FERM
BP−1425）（ニコチン酸、チアミン、ピリドキシ
ン、ビオチン要求性）を親株として、通常の変異
処理方法によつて得られるものでアミノオキシ酢
酸に耐性を有する変異株である。 このような変異株は、アミノオキシ酢酸に耐性
を有しない野生株または親株に紫外線照射、ある
いはＮ−メチル−Ｎ−ニトロ−Ｎ−ニトロソグア
ニジン処理、エチルメタンスルホネート（以下、
EMSと略す）処理などの通常の変異処理したの
ち、親株が十分生育できないような濃度のアミノ
オキシ酢酸を含む寒天培地で親株より有意に生育
可能な菌体を取得すればよい。 本発明におけるアミノオキシ酢酸耐性株とは、
その親株より強い耐性を有する菌体のことであ
り、好ましくは、親株の24時間後の相対生育度が
40％以下になるような濃度のアミノオキシ酢酸を
含む培地で培養した場合の相対生育度が50％以上
を示すようなものをいう。 たとえば、アミノオキシ酢酸8mMとなるよう
に添加した培地で培養した時の24時間後の相対生
育度が、無添加の場合の50％以上のものをアミノ
オキシ酢酸耐性株という。 ここで、相対生育度は培養液の660nmにおける
吸光度を測定し、各菌株のアミノオキシ酢酸を添
加していない培養液の吸光度を100％として表わ
した場合の相対吸光度で示す。 本発明で用いられる培地は発酵に通常使用され
る炭素源、窒素源、無機塩類、ビタミン類などを
ほとんどよく含有するものであればよいが、炭素
源としては、グルコースなどの糖質、有機酸、エ
タノール、メタノールなどの使用酵母菌が利用し
得るものが使用される。窒素源としては硫安、硝
安、塩安、尿素、ペプトン、肉エキス、味液、そ
の他の有機および無機窒素化合物が使用される
が、望ましくはアミノ酸をバランスよく含む有機
窒素化合物がよい。無機塩類としてはリン酸カリ
ウム、硫酸マグネシウム、鉄、マンガン、その他
の無機塩類が用いられ、さらに必要に応じてチア
ミン、ナイアシン、ピリドキシン、ビオチンなど
の要求ビタミン、またはこれらを含有する酵母エ
キス、コ−ンスチープリカー、その他の天然物を
添加した培地を使用すればよい。 培養中はピルビン酸の生成蓄積にともない、PH
の低下が起こるので炭酸カルシウム、苛性ソー
ダ、苛性カリなどのアルカリでPH３〜７に調節す
ることがピルビン酸生産には有効である。培養中
の温度は22℃〜32℃が適当である。培養終了後、
系内に蓄積したピルビン酸は常法により、単離採
取することができる。 たとえば、酸性エーテル抽出、フエニルビドラ
ゾン化して沈澱単離する方法なども採用すること
ができる。 ＜作用＞ 本発明で使用するアミノオキシ酢酸は、トルロ
プシス属微生物のアラニンアナログに相当するも
のである。 したがつて、トルロプシス属微生物は、アミノ
オキシ酢酸の共存によつて生育が阻害され、その
生育阻害はＬ−アラニンの添加により回復する。 アミノオキシ酢酸はトルロプシス属微生物のア
ラニンアナログであるため、その耐性株すなわ
ち、アミノオキシ酢酸に耐性を有する変異株の一
部は、アラニン生合成経路が強化された株とな
る。本発明で使用するトルロプシス・グラブラー
タAOA−８は、アラニン生合成の前駆体である
ピルビン酸の供給量を増加させる経路が強化され
た株と考えられる。 ＜実施例＞ 以下、実施例によつて本発明を具体的に説明す
る。 実施例 １ Ａ （アミノオキシ酢酸耐性株の取得） トルロプシス・グラブラータTR−2026（ニ
コチン酸、チアミン、ピリドキシン、ビオチン
要求）の菌体を常法により、EMS処理（1W／
Ｖ％、30℃で３時間）したのち、第１表に示す
基本培地に、8mMのアミノオキシ酢酸を加え
た寒天培地へ接種し、30℃で５時間培養し、生
育してきた大きなコロニーを釣菌した。 次に、第１表に示す発酵培地３mlを18mmφの
試験管に分注し、滅菌後、別滅菌した炭酸カル
シウム４％を添加し、各々のコロニーを植菌
し、ピルビン酸発酵を行い、ピルビン酸の蓄積
量、対糖収率を調べ、有意に収率の向上した株
トルロプシス・グラブラータAOA−８を得た。 Ｂ （アミノオキシ酢酸の耐性度の検定） 親株トルロプシス・グラブラータTR−2026
およびトルロプシス・グラブラータAOA−８
を、アミノオキシ酢酸を各々０ｍＭ、2.5nM、
5mM、8mM含む第１表に示す基本培地に、同
量接種して30℃で24時間培養し、菌体の生育度
を測定した。 結果は第２表に示すように、トルロプシス・
グラブラータAOA−８は、親株に比し、高濃
度のアミノオキシ酢酸を含む培地で生育が阻害
されず、アミオノキシ酢酸の耐性株となつてい
る。

【表】 各菌株のアミノオキシ酢酸を添加していな
い培養液の吸光度を100％として表わした。
実施例 ２ （ピルビン酸の発酵生産） 第１表に示す発酵培地を１のマイヤーフラス
コに40mlずつ分注し、滅菌後、別滅菌した炭酸カ
ルシウム４％を添加し、第３表に示す菌株を各々
一白金耳植菌したのち、30℃で60時間培養した。
培養後、ピルビン酸を高速液体クロマトグラフイ
ーで定量した。結果を第３表に示す。

【表】 なお、収率は消費グルコールに対するピルビン
酸の重量で表わした。 本発明例のトルロプシス・グラブラータAOA
−８を用いた方法は蓄積濃度、ピルビン酸生成収
率とともに親株より顕著に向上している。

【表】 次に、AOA−８の培養液200mlを除菌後、上澄
液に塩酸を加えPH2.0とし、エチルエーテルで抽
出し、次いで苛性ソーダでPHを5.5に中和したの
ち40℃で減圧濃縮し、５ml程度とした。この濃縮
液にエタノールを滴下させピルビン酸ソーダ6.01
ｇ（純度97％）を得た。 ＜発明の効果＞ 本発明方法によれば、ピルビン酸の蓄積量、収
率が向上し、より安価なピルビン酸の生産が可能
になつた。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ トルロプシス属に属し、アミノオキシ酢酸に
   対する耐性を有し、かつピルビン酸生産能を有す
   る微生物を培養して、培養液中にピルビン酸を生
   成蓄積せしめ、培養液中よりピルビン酸を採取す
   ることを特徴とする発酵法によるピルビン酸の製
   造方法。