PL179166B1 - Sposób wytwarzania biotyny PL PL PL - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania biotyny, obejmujacy przemiane detiobiotyny w biotyne w ukla- dzie bezkomórkowym za pomoca syntazy bioty nowej, znamienny tym, ze przemiane pro- wadzi sie w obecnosci pirofosforanu tiaminy, S-adenozylometioniny, jonów Fe2+, cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujacej asparagine, kwas asparagi- nowy, glutamine i seryne. 4. Sposób wytwarzania biotyny, obejmujacy przemiane detiobiotyny w biotyne w ukla- dzie bezkomórkowym za pomoca syntazy biotynowej, znamienny tym, ze przemiane pro- wadzi sie w obecnosci NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidowo adeninowego), cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujacej asparagine, kwas asparaginowy, glutamine i seryne. PL PL PL

Description

Niniejszy wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania biotyny obejmujqcego przemian? detiobiotyny za pomocq syntazy biotynowej w ukladzie bezkomórkowym.

Biotyna (witamina H) jest waznq witaminq dla ludzi i zwierzqt, której niedobór moze przykladowo wywolywaó lojotok, zapalenie skóry, brak apetytu i zm?czenie. Dlatego tez biotyna jest przydatnym dodatkiem do zywnosci i paszy.

Wytwarzanie biotyny metodami syntetycznej chemii organicznej wymaga duzych nakladów i jest kosztowne. Z tego powodu coraz wi?ksze znaczenie majq sposoby biotechnologiczne, w których biotyn? mozna zsyntetyzowaé za pomocq mikroorganizmów z tanich materialów wyjsciowych, takich jak glukoza.

Escherichia coli (E. coli) jest mikroorganizmem zdolnym do tego, by wychodzqc z prostych zródel w?gla, takich jak gliceryna lub glukoza, zsyntetyzowac biotyn? (fig. 1). Geny odpowiedzialne za biosyntez? biotyny u E. coli, wyst?pujq w operonie, który juz sklonowano i który obejmuje pi?c genów: bioA. bioB, bioC, bioD oraz bioF (dalej okreslanych takze jako geny bio) (Gupta i in., Gene 1: 331-345; 1977). Geny te sq przez obszar promotora-operatora, znajdujqcy si? pomi?dzy genami bioA i bioB, transkrybowane w dwóch róznych kierunkach. W odniesieniu do konwencjonalnej mapy genów, geny bioB, bioF, bioC oraz bioD znajdujq si? na prawo, a gen bioA - na lewo od obszaru promotor-operator. DNA na lewo od obszaru promotor-operator obejmuje w dól sekwencji od genu bioA. dalszy gen oznaczony jako ORFI (ORF = open reading frame, otwarta ramka odczytu), kodujqcy polipeptyd o 158 aminokwasach i transkrybowany wraz z genem bioA (Otsuka i in., J. Biol. Chem., 263: 19577-19585; 1988). Funkcja tego genu dotqd jest nieznana. Inne szczepy rodziny enterobakterii, przykladowo z gatunku Salmonella lub Citrobacter, majq struktur? operonu biotyny analogicznq do E. coli (Shiuan i Campbell, Gene, 67; 203-211; 1988).

179 166

Znane sq juz biotechnologiczne sposoby wytwarzania biotyny, wykonywane za pomocq mikroorganizmów, transformowanych klonowanym operonem biotyny E. coli. Te sposoby realizuje si? wychodzqc z glukozy. EP-B-236 429 opisuje np. mikroorganizmy, transformowane operonem biotyny E. coli, przy czym organizmy gospodarza ulegajq mutacji w swoim genie bioA/bioR.

W EP-A-316 229 opisano mutanty E. coli, które wytwarzajq mniej octanu i które równiez przetransformowano klonowanym operonem biotyny.

EP-A-449 724 ujawnia mikroorganizmy transformowane operonem biotyny, wykazujqce dodatkowo mutacje, powodujqce w nast?pstwie mniejsze zuzycie glukozy.

Z EP-A-266 240 znane jest ponadto klonowanie genu odpowiedzialnego za syntez? biotyny w Bacillus sphaericus oraz oparty na tym sposób wytwarzania biotyny. Metabolizm Bacillus sphaericus warunkuje, ze ten sposób musi byc realizowany wychodzqc z kosztownego kwasu pimelinowego.

Wydajnosci, uzyskiwane wedlug dotychczas znanych sposobów biotechnologicznych sq jednak z gospodarczego punktu widzenia niezadowalajqce.

Celem niniejszego wynalazku jest zatem, dostarczenie sposobu wytwarzania biotyny, umozliwiajqcego wyzsze wydajnosci biotyny i tym samym majqcego wi?ksze znaczenie gospodarcze. Cel ten osiqgni?to dzi?ki opracowaniu sposobu wedlug wynalazku.

Sposób wytwarzania biotyny, obejmujqcy przemian? detiobiotyny w biotyn? w ukladzie bezkomórkowym za pomocq syntazy biotynowej, wedlug wynalazku polega na tym, ze przemian? prowadzi si? w obecnosci pirofosforanu tiaminy, S-adenozylometioniny, jonów Fe²⁺, cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujqcej asparagin?, kwas asparaginowy, glutamin? i seryn?.

Korzystnie, zgodnie z wynalazkiem przemiany dokonuje si? w obecnosci flawodoksyny.

W sposobie wedlug wynalazku przemiany korzystnie dokonuje si? w obecnosci reduktazy ferredolkyno(ifawodoksyno)-NADP⁺.

Sposób wytwarzania biotyny, obejmujqcy przemian? detiobiotyny w biotyn? w ukladzie bezkomórkowym za pomocq syntazy biotynowej, zgodnie z wynalazkiem, alternatywnie polega na tym, ze przemian? prowadzi si? w obecnosci NADPH, cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujqcej asparagin?, kwas asparaginowy, glutamin? i seryn?.

Korzystnie, w tym sposobie przemiany dokonuje si? w obecnosci flawodoksyny i reduktazy ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP+.

W sposobie wedlug wynalazku - w obu wyzej okreslonych odmianach - przemian? korzystnie prowadzi si? w obecnosci frakcji proteinowej, otrzymywanej przez wytrqcenie siarczanem amonowym przy nasyceniu 45% ekstraktu komórkowego Escherichia coli.

Wynalazek obecny jest wynikiem kompleksowych prac, których cz?sc b?dqca przedmiotem odr?bnego patentu nr.......(zgloszenie nr P-308301 z dnia 1.10.1993 r.) dotyczy scisle biotechnologicznego sposobu wytwarzania biotyny. We wskazanych pracach wykorzystano fragmenty DNA oraz wektory, zawierajqce geny bioB, bioF, bioC, bioD oraz bioA lub ich funkcjonalnie równowazne genetyczne warianty i mutanty z enterobakterii, przy czym te geny sq zorganizowane w jednostk? transkrypcyjnq.

Przez jednostk? transkrypcyjnq rozumie si? tu sekwencj? DNA, w której geny sq ustawione w kierunku transkrypcji i pod wspólnq kontrolq t^^rnskrypcji sq przepisywane w nieprzerwany transkrypt, przy czym sekwencja DNA obok kazdorazowych genów obejmuje takze genetyczne elementy kontrolne wymagane dla ekspresji genu, takie jak promotory i miejsca wiqzania rybosomów.

Przez .funkcjonalnie równowazne genetycznie warianty i mutanty” rozumie si? geny, które pochodzq od genów dzikiego typu organizmów pierwotnych, tzn. enterobakterii i cechujq si? zumianq zasad w ramach znanej degeneracji kodu genetycznego. Tego rodzaju zamiany zasad mogq byc pochodzenia naturalnego lub mogq byc wytworzone sztucznie, np. aby dopasowaó sekwencj? genu do uprzywilejowanego zastosowania kodonu okreslonego mikroorganizmu, w którym powinna nastqpic ekspresja. Genetyczne warianty i mutanty obejmujq ponadto delecje, inserty i substytucje zasad lub kodonu, które pozostawiajq produkt genu o tego rodzaju zmienionej sekwencji przy zasadniczo nienaruszonej funkcji. Obj?te sq

179 166 w szczególnosci sekwencje, które w zwyklych warunkach hybrydyzacji, tzn. w temperaturach mi?dzy 55 i 66°C i przy 0,03 do 0,3 M zawartosci soli, hybrydyzujq z sekwencjami dzikiego typu, a takze sekwencje, które wykazujq w wysokim stopniu homologi?, np. wyzszq niz 70%.

Figura 1 przedstawia enzymy drogi metabolizmu biosyntezy biotyny.

Figura 2 przedstawia schemat budowy plazmidu pBO30.

Figura 3 przedstawia sekwencj? plazmidu pB030, pB030A-9 oraz pB030A-15 dla obszaru kohca 3' genu bioD oraz kohca 5' genu bioA (przerywane strzalki; kodon starlo wy bioA podkreslono, stop-kodon bioD zaznaczono kropkami) wraz z miejscami ci?cia przez enzymy restrykcyjne zwiqzanymi z konstrukcjq plazmidu oraz sekwencjq Shine-Dalgamo (SD) genu bioA. Potencjalne struktury „stem-loop” zaznaczono przerywanymi strzalkami.

Figura 4 przedstawia kroki zmiany sekwencji w gór? sekwencji od genu bioB dla przypadku wyjscia z plazmidu pbioB:: lacZ-2 dla konstrukcji ulepszonych miejsc wiqzania rybosomów przy danych stosowanych miejscach ci?cia enzymami restrykcyjnymi, kazdorazowych sekwencjach Shine-Dalgamo (SD) oraz kodonie startowym bioB (Met). Przedstawiono sekwencj? w gór? sekwencji od genu bioB oraz kohca 5' genu bioB. Linie kreskowane oznaczajq wstawiony oligonukleotyd 985E. Nukleotydy przekreslone powinny wedle teorii wyst?powac, nie ma ich jednak w plazmidzie pbioB:: lacZ/985E oraz w wyprowadzonych z niego plazmidach pbioB:: lacZ/9 oraz bioB:: lacZ/16. co powoduje w rezultacie utrat? miejsca BamHI (BamHI). „fill-in”: uzupelnienie za pomocq polimerazy Klenowa.

Figura 5 przedstawia schemat budowy plazmidów pBO30A-15/9 oraz BO30A-15/9 orfl.

Figura 6 przedstawia sekwencj? DNA i aminokwasowq genu kodujqcego w plazmidzie pBO30A-15/9 biosyntez? biotyny wraz z genetycznymi elementami kontrolnymi (SD: sekwencja Shine-Dalgarno). Aminokwasy przedstawione kursywq na kohcu COOH genu bioD15 przedstawiajq. substytucje w stosunku do sekwencji dzikiego typu genu bioD E. coli.

Figura 7 przedstawia schemat budowy plazmidu pB074 B wychodzqc z plazmidów pB074-13 oraz pB03; strzalki podajq polozenie oraz orientaci? promotora tac oraz genu bio. Udzial wektora plazmidów wytluszczono. Linie przerywane przedstawiajq zakres delecji genu bioB.

Na figurach 2 oraz 5 zastosowano nast?pujqce oznaczenia: A: AatlI; B: BamHI: Bg: BgUI; C: ClaI; E: EcoRI: H: HindIII; K: KpnI; N: NcoI; Nr: Nru:I; P: PstI; S: SnoI; Sa: SalI; Se: SseI: Sp: SphI; Ss: SspI oraz X: XbaI. „fill-in” uzupeinienie recesywnych kohców 3' za pomocq polimerazy Klenowa; mbn: usuni?cie wystajqcych kohców 5'- lub 3' za pomocq nukleazy Phaseolus aureus (nukleaza mung bean); Bal31: progrcsywna delecja DNA egzonukleazq Bal31. Udzial wektora plazmidów wytluszczono. Za pomocq róznie zakrcskowanych elementów oznaczono cz?sci plazmidów zastosowane kaZdorazowo w nast?pujqcym po tym etapie klonowania. Strzalki podajq polozenie i orientaci? genów bio.

Aby skonstruowac wskazane fragmenty DNA i wektory, geny operonu biotyny najpierw celowo wyodr?bnia si? z chromosomu odpowiedniego mikroorganizmu, a nast?pnie wzajemnie si? lqczy pod kontrolq elementów regulujqcych geny, takich jak promotory i miejsca wiqzania rybosomów, tak by znalazly si? one w jednej jednostce transkrypcyjnej. Materialem wyjsciowym do izolowania genów bio mogq byc szczepy bakteryjne z rodziny enterobakterii, np. gatunku Escherichia, Salmonella lub Citrobacter. Celowo materialem wyjsciowym jest mikroorganizm gatunku Escherichia coli, który jest najlepiej scharakteryzowany.

Konstrukcja omawianych fragmentów DNA i wektorów moze nastqpió biorqc za punkt wyjscia np. bank genów odpowiedniego mikroorganizmu, takiego jak E. coli, z którego w znany sposób mozna wyodr?bnic i klonowac geny bio lub ich fragmenty przez hybrydyzacj? znaczonymi oligonukleotydami zawierajqcymi cz?sciowe sekwencje genów bio. Nast?pnie wyodr?bnione i klonowane geny bio sq przy pomocy znanych metod rekombinacji DNa pod kontrolq wspólnego promotora wzajemnie lqczone, tak aby utworzyly pojedynczq jednostk? transkiypcyjnq. Celowo ustawia si? geny bio w ten sposób, ze gen bioA znajduje si? w kierunku przeciwnym do genów bioB, bioF, bioC oraz bioD. które juz sq obecne w jednostce transkrypcyjnej w operonie dzikiego typu E. coli. Gen bioB koduje syntaz? biotynowq kluczowy enzym calej drogi syntezy biotyny, poniewaz przemiana detiobiotyny w biotyn? przy udziale syntazy biotynowej stanowi dotqd stadium okreslajqce szybkosc pi?cioetapowej

179 166 drogi syntezy biotyny. Gen bioB jest zatem celowo pierwszym genem w obr?bie w jednostki transkrypcyjnej, poniewaz z powodu bliskosci promotora moze nastqpic optymalna ekspresja tego genu (fig. 2, 4, 5 oraz 6).

Druga jednostka transkrypcyjna w operonie dzikiego typu biotyny E. coli, która zawiera gen bioA, obejmuje ponadto dalszy gen, ORFI, kodujqcy polipeptyd o 158 aminokwasach. Próby przeprowadzone z plazmidami ekspresyjnymi, w których nie bylo zadnego genu ORFI wykazujq, ze gen ten w zwyklych warunkach fermentacji nie ma zasadniczego znaczenia dla biosyntezy biotyny. Nie mozna jednak wykluczyc, ze wspomniany polipeptyd o dotychczas nieznanej funkcji w okreslonych warunkach takie odgrywa pewnq rol? w syntezie biotyny. Choc obecnosc genu ORFI we fragmentach DNA istotnych z punktu widzenia obecnego wynalazku równiez nie jest absolutnie niezb?dna, jednostka transkrypcyjna. z genami bio w celowej postaci wykonania zawiera dodatkowo takze gen ORFI (fig. 2, 5 oraz 6).

We fragmentach DNA oraz wektorach istotnych dla realizacji obecnego wynalazku geny bio korzystnie nie znajdujq si? pod kontrolq naturaanego promotora biotyny E. coli. W znacznie wi?kszym stopniu geny bio dla polepszenia t^^^.skrypcji celowo sq ustawione pod kontrolq silnego obcego promotora. Wybór promotora zalezy od zqdanych warunków ekspresji, np. od tego, czy pozqdana jest ekspresja konstytutywna czy tez indukowana lub tez od mikroorganizmu, w którym ma nastqpic ekspresja. Odpowiednimi promotorami sq np. promotory Pl oraz Pr fagu Lambda (por. Schauder i in., Gene 52: 279-283; 1987), promotor pxylS plazmidu TOL Pseudomonas putida z sqsiednim genem regulatorem xylR (Franklin i in., J. Bacteriol. 154: 676-685; 1983), promotor trc (Amann i in., Gene 69: 301-315; 1988), promotor trp (Amann i in., Gene 25: 167-178; 1983), promotor pdegQ z Bacillus subtilis, czynny w fazie stacjonarnej (Dahl i in., J. Bacteriol. 173: 1539-1547; 1991) oraz promotor lacUV5 (Amann i in., Gene 25: 167-178; 1983). Jako promotor jest korzystnie wybrany promotor tac, hybryda z promotora trp i lacUV5 z E. coli, który mozna zastosowac jako promotor konstytutywny lub indukowalny (Russell i Bennett, Gene 20: 231-243; 1982).

Ponadto ustalono, ze ekspresj? genu bioA w wyzej opisanym korzystnym ustawieniu mozna jeszcze udoskonalic, gdy odleglosc mi?dzy genami bioD i bioA jest mozliwie najkrótsza, tzn. korzystnie jest mniejsza niz 50 bp (par zasad). Nieoczekiwanie stwierdzono, ze ekspresja jest szczególnie wysoka, gdy sekwencja koóca 3' genu bioD, który koduje zakoóczenie COOH syntetazy detiobiotynowej (DTB), zawiera równoczesnie miejsce wiqzania rybosomów nast?pujqcego po nim genu bioA. Korzystnie wyst?puje równoczesnie nakladanie si? genów bioD i bioA. Tego rodzaju konstelacj? mozna osiqgnqc, gdy podda si? fuzji koniec 5' genu bioA razem z ich miejscem wiqzania rybosomów z genem bioD, tak ze koniec 3' jest podstawiony przez sekwencj? z miejscem wiqzania rybosomów w gór? sekwencji od genu bioA i, w danym przypadku, koócem 5' genu bioA (fig. 3 i 6; Seq. ID nr: 1, 6 i 8-16). Efekt ten jest tym bardziej zaskakujqcy, ze przy tego rodzaju fuzji zakoóczenie COOH syntetazy DTB mozna wymienic, bez utraty aktywnosci enzymu. Podobne nakladanie si? wyst?puje takze w operonie biotyny dzikiego typu E. coli mi?dzy rastrami odczytu genów bioB, bioF, bioC i bioD.

Ekspresj? genu bioB mozna przez optymalizacj? miejsca wiqzania rybosomów genu bioB jeszcze zwi?kszyc. Celowo wychodzi si? tu z konstruktu, w którym gen bioB juz znajduje si? pod kontrolq silnego promotora, np. promotora tac. Optymalizacja miejsca wiqzania rybosomów genu bioB. tzn. zmiana sekwencji Shine-Dalgarno i ich odleglosci od koóca 5' genu struktury, moze nastqpic za pomocq zwyklych metod rekombinacji DNA. Wplyw okreslonego miejsca wiqzania rybosomów na translacj? mozna okreslic w znany sposób, np. przez fuzj? genu badanego z genem lacZ i nast?pujqcq po tym prób? z chromogennym substratem 5-bromo-4-chk)iO-3-indolilo-3-D-galaktopiranozydem (X-Gal).

Fragmenty DNA obejmujqce geny bio w jednostce transkrypcyjnej, mozna wbudowac przy pomocy znanych technik rekombinacji DNA w wiele wektorów. W ten sposób otrzymano np. plazmidy pBo30A-15/9 (fig. 5 i 6, Seq. ID nr: 1 i 6; przyklad 1.5.2) oraz pBO47 (przyklad 1.7). Plazmid pBO30A-15/9 zlozono 28.9.1992 w Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-3300 Braunschweig, Mascheroderweg 1b, w E. coli XL1Blue oraz E. coli BM4062 pod numerami zgloszenia DSM 7246, wzgl?dnie 7247 oraz

179 166

17.9.1993 w E. coli ED8767 pod numerem zgloszenia DSM 8554. Plazmid pB047 zlozono 17.9.1993 w Deutsche Sammlung fùr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, w Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 pod numerem zgloszenia DSM 8555.

Zaleznie od rodzaju wybranych wektorów mozna poddac ekspresji geny dla enzymów drogi syntezy biotyny w róznych organizmach. Jako wektory nadajq si? zarówno wektory o specyficznym, jak tez wektory o szerokim spektrum gospodarzy (ang.: „broad host range”). Przykladami wektorów o specyficznym spektrum gospodarzy np. dla E coli sq pBR322 (Bolivar i in., Gene 2: 95-113;1977), pUC18/19 (Yanisch-Perron i in., Gene 33: 103-119; 1985), K18/19 (Pridmore, Gene 56: 309-312; 1987) oraz pRA95 (mozna otrzymac z Nycomed Pharma AS, Hvidovre, Dania).

Jako wektory o „szerokim spektrum gospodarzy” mozna zastosowac wszystkie wektory, które sq odpowiednie dla bakterii Gram-ujemnych. Przykladami takich wektorów o „szerokim spektrum gospodarzy” sq pRK290 (Ditta i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 73477351; 1980), pKT240 (Bagdasarian i in., Gene 26: 273-282; 1983), pochodne pRK290, jak pLAFRl (Long i in., Nature 298: 485-488; 1982) oraz pRK290X (Alvarez-Morales i in., Nuci. Acid. Res. 14: 4207-4227; 1986), pochodne pKT240, jak pMMB66EH (Furste i in., Gene 48: 119-131, 1986) lubpGSS33 (Sharpe, Gene 29: 93-102;1984).

Do wytwarzania szczepów produkcyjnych dla fermentacji, tzn. szczepów dla produkcji biotyny, nalezy fragment DNA wedlug niniejszego wynalazku wstawic w zqdane i odpowiednie dla ekspresji szczepy gospodarza. Mikroorganizmami odpowiednimi dla ekspresji genów bio, korzystnie szczepów o szerokim spektrum substratów, sq np. enterobakterie, korzystnie gatunku Escherichia lub mikroorganizmy gatunku Rhizobium, Agrobacterium, Rhizobium/Agrobacterium, Acinetobacter, Pseudomonas oraz Comamonas. Szczególnie korzystne sq mikroorganizmy gatunku E. coli, Rhizobium/Agrobacterium s. HK4 (jako opisano w EP-B 158 194), Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa lub Acinetobacter calcoaceticus. Mikroorganizmy mogq zawierac fragment DNA istotny dla sposobu wedlug wynalazku na czqsteczce wektora lub zintegrowany w swoim chromosomie. Wstawienie fragmentu DNA w mikroorganizmy moze np. nastqpic przez transformacj? lub koniugacj?. Celowo transformuje si? wybrane mikroorganizmy znanym sposobem wektorami, które zawierajq wskazane fragmenty DNA. Odpowiednimi szczepami produkcyjnymi sq np. E. coli XL 1-Blue, E. coli BM4062 i E. coli ED8767, kazdorazowo zawierajqc plazmid pB030A-15/9 (DSM 7246, DSM 7247 i DSM 8554) i Agrobacterium/Rhizobium sp. HK4 z plazmidem pB047 (DSM 8555).

Wyodr?bnienie trasformo wanych szczepów gospodarza nast?puje celowo z selektywnej pozywki, do której dodaje si? antybiotyk, wobec którego szczepy gospodarza sq odporne dzi?ki genowi markera znajdujqcemu si? na wektorze lub fragmencie DNA.

Jak wspomniano, obecny wynalazek realizuje sposób wytwarzania biotyny, obejmujqcy przemian? detiobiotyny w biotyn? w ukladzie bezkomórkowym za pomocq enzymu syntazy biotynowej, w którym przemiana dokonuje si? w obecnosci tiaminopirofosforanu. NADPH, S-adenozylometioniny, jonów Fc²⁺, cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujqcej: asparagin?, kwas asparaginowy, glutamin? i seryn?.

Syntaz? biotynowq mozna zastosowac bqdz w postaci oczyszczonej lub w postaci ekstraktu komórkowego. Celowo uzyskuje si? ekstrakt komórkowy lub oczyszczonq syntaz? biotynowq ze szczepu o zwi?kszonej ekspresji tej syntazy, np. z E. coli XL 1-Blue z plazmidem pB030A-15/9 (DSM 7246). Wytwarzanie ekstraktu komórkowego i ewentualnie oczyszczanie syntazy biotynowej moze nastqpic wedlug metod typowych w biochemii, np. przez homogenizacj? komórek, filtracj? zelowq, frakcj onowanie siarczanu amonowego i chromatografi? jonowymienna.

Ustalono, ze przemian? detiobiotyny w biotyn? w ukladzie bezkomórkowym za pomocq syntazy biotynowej mozna przeprowadzic z dobrymi wydajnosciami tylko wtedy, gdy nast?puje ona przy dodaniu kofaktorów i aminokwasów.

Kofaktory niezb?dne dla przemiany obejmujq S-adenozylometionin? (SAM), tiaminopirofosforan (TPP), zredukowany fosforan adeninodinukleotydu amidu kwasu nikotynowego

179 166

Ί (NADH) oraz jony Fe²⁺. Kofaktory dodaje sip celowo w stpzeniach od 1 do 500 μΜ. Do mieszaniny dodaje sip takze celowo ditiotreitol (DTT) w stpzeniu od 0,1 do 10 mM.

Aminokwasami niezbpdnymi dla przemiany sq cysteina jako donor siarki i co najmniej jeden inny aminokwas z grupy obejmujqcej: asparaginp, kwas asparaginowy, glutaminp i serynp. Kwas asparaginowy dodaje sip celowo w postaci asparaginianu. Cysteinp dodaje sip celowo w stpzeniach od 10 do 500 μΜ, dalsze aminokwasy w stpzeniach od 1 do 50 mM.

Ponadto stwierdzono, ze przemiana detiobiotyny w biotynp przy zastosowaniu oczyszczonej syntazy biotynowej zachodzi jedynie w obecnosci flawodoksyny i reduktazy ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP⁺. Stqd celowo dodaje sip przy przemianie, zwlaszcza gdy syntazp biotynowq stosuje sip nie w postaci ekstraktu komórkowego, flawodoksynp i reduktazp ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP⁺. Flawodoksyna i reduktaza ferredoksyno(flawodoksyno)NADP+ (EC nr 1.18.1.2) sq znanymi proteinami, które w znany sposób, np. przez frakcjonowanie siarczanu amonowego i nastppnie chromatografip jonowymiennq i chromatografip z filtracjq zelowq, niezaleznie od syntazy biotynowej mozna otrzymac z ekstraktów komórkowych E. coli. Tak np. flawodoksynp i reduktazp ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP+ mozna wyodrpbnic zarówno z E. coli XL1-Blue z plazmidem pB030A-15/9 (DSM 7246), wykazujqcym zwipkszonq ekspresjp syntazy biotynowej, jak równiez z E. coli XL 1-Blue z plazmidem pB074 B (DSM 7245), w którym gen syntazy biotynowej bioB ulegl delecji (fig. 7). Plazmid pB074 B w E. coli XL 1-Blue zlozono 28. 9. 1992 w Deutsche Sammlung fur Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-3300 Braunschweig, Mascheroderweg 1b, pod numerem zgloszenia DSM 7245.

Ponadto stwierdzono, ze dla przemiany detiobiotyny w biotynp oprócz syntazy biotynowej potrzebne sq dalsze proteine, które w typowy sposób sq zawarte w ekstrakeie komórkowym E. coli. Proteiny te sq zawarte we frakcji proteinowej, którq mozna uzyskac z ekstraktów komórkowych E. coli przez wytrqcanie siarczanem amonowym przy 45% nasyceniu. Jak wynika z wyodrpbniania takiej frakcji proteinowej z E. coli XL 1-Blue z plazmidem pB074 B (DSM 7245), ekspresja syntazy biotynowej nie jest niezbpdna dla obecnosci oraz uzyskania tej proteiny. Osad uzyskany po wytrqcaniu solq amonowq mozna dalej oczyscic np. metodami chromatograficznymi, takimi jak chromatografia jonowymienna i chromatografia z filtracjq zelowq. Dlatego do mieszaniny reakcyjnej (przemiana detiobiotyny w biotynp), zwlaszcza gdy nie stosuje sip syntazy biotynowej w postaci ekstraktu komórkowego, dodaje sip wyzej opisanq frakcjp proteinowq.

Przemiana odbywa sip w odpowiednim ukladzie buforowym, celowo wewnqtrz obszarów pH i temperatury, w których enzymy sq czynne fizjologicznie, korzystnie w obszarze pH od 6 do 9 i w temperaturze mipdzy 4 a 50°C.

Niniejszy wynalazek zostanie objasniony blizej przez ponizsze przyklady.

Ogólne metody

Endonukleazy restrykcyjne zastosowano wedlug danych producenta w iloSci od 3 do 5 jednostek/pg DNA. Znaczenie i fosforylowanie linkerów DNA (uzyskanych z Boehringer Mannheim, RFN) dla wbudowywania miejsc cipcia enzymami restrykcyjnymi i syntetycznych oligonukleotydów (uzyskanych z Microsynth, Windisch, CH), np. do zastosowania jako sondy dla hybrydyzacji dNA/dNa i jako „primer” dla reakcji sekwencjonowania, nastqpily przy uzyciu kinazy T4-polinukleotydowej (Boehringer Mannheim, RFN) wedlug Sambrooka i in. (Molecular Cloning: A laboratory manual. 2^nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour, NY; 11.31 i 5.68; 1989). Reakcje ligacji przeprowadzono przy uzyciu ligazy T4-DNA wedlug danych wytwórcy.

Sekwencjonowanie DNA przeprowadzono wedlug metody przerwania lancucha wedlug Sangera i in. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5463-5467; 1977). Wszystkie reakcje sekwencyjne przeprowadzono przy uzyciu zestawu do sekwenazy z United States Biochemicals (Cleveland, OH, USA) wedlug protokolu wytwórcy. Sekwenaza (wersja 2,0, polimeraza T7DNA zmieniona za pomocq technik genetycznych) dala równomierne, dobrze czytelne sekwencje DNA o ponad 600 bp. Kompresje w obszarach DNA bogatych w GC mozna bylo latwo rozwiqzac, jesli zamiast dGTP zastosowano nukleotyd dITP. Jako matryce dla reakcji sekwencyjnej stosowano z reguly jednoniciowe postacie wektorów M13mp18/19 (Yanisch8

175» 166

Perron i in., 1985, ibid.) lub pBluescript KS+/SK+ (ap^R lacZ': moz^ uzyskac z Strategene, LaJolla, cA), które wyadr?byiono wedlug (Methods En^mol. 101: 20-79; 1983). Dla sekwoycjonawayia dwunic1owogo plazmidowoga DNA, plazmidowe DNA aczyszrzoya za pomocq gradientów CsCl lub „Gene Clean” (BIO 101, La Jolla, CA). Jako yuOeeotyd znaczony radioaktywnio kZyta a-p^Sj-dATP (NEN-Du Pont, NEG-034H). Razdzielonio οΙοΟ^farotyrzno o^t^pilo bqdz przez typawo 4%, wzgl?dnie 6% zele eis/nOeylamidowo z 7 M moczmka oraz 1 x bkfarom TBE (90 mM Tris, 90 mM kwasu baeyega, 2,5 mM EDTA), lub przez zele z 5% HydraLiyO Long Ranger (AT B1ochom, Malvery, PA, USA, via Chemie Brunschwig, Basel) z7M marryiOa i 1,2 x buforem TBE. Zele mialy 550 mm dlugocci i 0,2 mm gekbaCri; eloktroforoza nastqpila w nparatkezo mnke-faeowej LKB z yormostntem przy napi?^ 2100 V i tompeeatkeze 60°C. Nast?poie zele suszono na papie^e 3 MM Whatmaoa i paddnyo aktoeadiografi1 przy uzyciu filmu eeytgenowskiega Fuji RX lub Amersham Hyperfilm pmax.

Wyodr?bnionie pozach^(^^(^^(^^<^wego DNA wyOoonno bqdz w malych ieoCrinch wedlug metody „szybOiega alOaliczyega SDS” («Miniprep”) wedlug Birybaima i Doly (Nucl. Acid. Res. 7: 1513-1523; 1979), lub, dla wyodr?bnienia wi?kszych ΐ^ώ, przez adwirowywnyie gendieotów g?staCci cheaeOu cezu wedlug zmadyfi0ownnej metody Clewell i Helsinki (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 42: 1159-1166; 1969). Alteryntywyie znstosawnyo pakiety QIAGEN Fa. DIAGEN, Dusseldorf (RFN).

Aby przeksztalcic E. coli plazmidem DNA, 0amór0i u^niono „kompeteytnymi” wedlug Cohen i in. (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69: 2110-2114; 1972) w 50 mM CaCh- PrzeOszynlceyio DNA plazmidawogo i selekcja Otanów nasrqcyrh plaz.midy yasyqpila wedlug Sambrookai in., (1989; ibid. 1.82-1.84).

PrzyOlad I. Klanownyie aperana biatyyy E. coli w pajedyyczej jedoostce transOeypcyjyoj.

I.1. Konstrukcja pBO1 oraz M13bi^.

Dla keayawayin genów bio wy-dr?eyioya chromosamowe DNA z E. coli DSM 498 (K12 Typ dziki; Deutsche Sammlung fur Mi0eooeganismoy und Zel^^re! GmbH). Wyod^οϊοοϊο wyOonnya zasndyirzo wedlug Hahoa i Henne^e (Mol. Geo. Geoet. 193: 46-52; 1984). Nnstςpmo 2 pg calkowitogo DNA z E. coli DSM 498 pereri?ta eozymem eesyeyOryjnym PstI. Fragmeoty DNA rozdziolooa oloktroforetyrrnie w haryzoytnlyym zelu agarazowym 0,7% w zwykly sposób (Sambr-O i io., 1989, ibid.; 6.19 do 6.9) i przeniesiano na membrany „Gene Screen” (membraoy oylooawe NEN-Du Pont) (Southern, J. Mol. Biol., 98: 503-517; 1975). DNA utrwalono przez dwugodziooq iyOubnrj? w 80°C w piecu prózniowym oa wysksranych fìltrach. W celu idenyyfikncji fragmentów DNA aperooem eia poddayo jako sond? syotetyczyy aligaouOleotyd o dlkgaCri 25 yuOleotydów o sekweocji 5'-GGCTCACCGCCcAcgCtGGACATTG-3', odpawiadajqroj seOwencji z kohca 5' genu bioB (Otsuka, A.J., Dysoetacja, University of Califaroia, San Diego, CA; 1978) hybrydyzncji z DNA zwiqzanym z filtrem. Nnst?poie 40 pMoli tego oeigooukloatydk z kinazq palmkkleatydowq T4 i -[r]-ATP (75 μ Ci) znnrzono na koncu. Hybrydyrncj? DNA zwiqzanoga z rndionOyywnio znaczaoq soodq pezepeowadzayo wedlug Sambrook i in., (1989, ibid., 9.52-9.55). Na^pn^ prehybrydyzowano DNA 2 godz. w 5 x roztwarze De^ardta (1 x roztwór Denhardta: 0,02% albumina osorrn Orwi wolu, 0,02% Firall, 0,01% poliwinylapirolidoo), 6 x bufor SSC (1 x SSC: 150 mM NaCl, 15 mM cytryninn sodawy, pH 7,2) oraz 150 pg/ml DNA ze spermy losasin, a ynst?pnio hybrydyzownna 18 godz. w 2 x eaztwoeze Doyhaedta, 6 x SSC, 0,5% SDS, 150 pg/ml dNa ze spermy lososia, 2 godz. przomywnno i ostateczoie rzteraOeotnìe przemyto Onzdarnrawo 30 min. w 2 x SSC, 0,1% SDS. Temperatura padcrns wszystOirh etapów wymosla 65°C. Znarzany aligonukleatyd hybrydyzowal na tym „Southern biot” z fragmeotem Pstl o 5,4 kb.

Dla sklaoawaoia tego fragmeotu 5,4 kb PstI z oporooom biotyoy przeci?to nnjpiorw 50 pg rnlOowitego E. coli DSM 498 przy uzyciu PstI i rozdziolona oa zelu ngneozawym 0,7% jak wyzej. Fragmeoty o wìoIOoccì 4,5 Ob do 6,5 kb wy^to z zelu i wyodr?boiono przez eleOyradinliz? w ws^L· do dializy. Okolo 0,6 pg tych .iéagmeytów poddayo ligacji z 0,6 pg weOtara pHE3 pezeri?toga PstI (Henne^e i in., Gene 19: 231-234; 1982). WbOtor teo znwiora

179 166 gen opornosci na chloramfenikol (Cm^R), replikon ColE1 z pACYC184 (Chang i Cohen, J. Bacteriol., 134: 1141-1156; 1978) jak równiez gen pheS z E. coli syntetazy-tRNAfenyloalaninowej, charakteryzujqcy si? miejscem PstI.

0,2 ml „kompetentnych” komórek E coli RR28 (Hannecke i in., 1982, ibid.) w 50 mM CaCl2 transformowano przy uzyciu powyzszego tworu ligacyjnego. E. coli RR28 ma w chromosomie mutowany gen pheS (pheS12) i dlatego jest oporny na p-fluorofenyloalanin? (pFphe) na podlozu wzrostu. Jesli RR28 jest nosnikiem plazmidu pHE3 z genem dzikiego typu pheS, szczep jest wrazliwy na pFphe. Wstawienie fragmentów DNA w miejsce ci?cia PstI pHE3 przerywa gen dzikiego typu pheS; stqd RR28 z rekombinowanym plazmidem jest oporny na pFphe (pFpheR). Transformowane komórki przelozono na pozywce minimalnej (7,1 g/l Na2HPO₄, 13,6 g/l KH2PO4, 13,6 g/l KH2PO4, 0,014 g/l CaCh x 2H2O, 0,25 g/l MgSO₄, 1,58 g/l (NH4)2SO4, 15 g/l agaru, 4 g/l glukozy, 0,005 g/l tiaminy, 0,05 g/l leucyny, 0,05 g/l proliny, 0,2 g/l D,L-p-fluorofenyloalaniny, 0,02 g/l chloramfenikolu; (Hennecke i in., 1982 ibid.) i wyodr?bniono ok. 2500 klonów pFpheR CmR, zawierajqcych. plazmid pHE3 (CmR) z insertem w genie pheS (pFpheR). 600 tych klonów replikowano na filtrze z nitrocelulozy, lezqcym na plytkach z pozywkq agarowq (NA) (NA: zasada agarowa krwi (Oksoid). 40 g/l; ekstrakt drozdzy (Oksoid), 5 g/l z 20 pg/ml Cm. Na filtry z wyroslymi koloniami (3-5 mm srednicy) podzialano wedlug procedury Grunsteina i Hognessa (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965; 1975), aby poddac komórki lizie i wiqzac uwalniany DNA. Filtr z uleglymi lizie i utrwalonymi komórkami E coli poddano hybrydyzacji z wyzej opisanym oligonukleotydem bioB o 25 nukleotydach znaczonym ³2p. Hybrydyzacja nastqpila wedlug modyfikacji dla hybrydyzacji kolonii wedlug Sambrooka i in., (1989, ibid., 11.00), tzn. prehybrydyzacja, hybrydyzacja i pierwsza operacja przemywania nastqpify w 4 x roztworze Denhardta, 6 x SSC, 100 pg/ml DNA ze spermy lososia, po czym nastqpilo 6 x przemywanie w 2 x SSC. Temperatura wyniosla 65°C. 3 klony zwiqzaly oligonukleotyd bioB; z jednego z klonów wyodr?bniono plazmid pBO1 o fragmencie PstI (fig. 2) o 5,4 kb. Analizy restrykcyjne i porównanie z danymi publikowanymi (Szybalski, Szybalski, Gene 19: 93-103;1982) wykazaly, ze pBO1 zawieralo wszystkie geny operonu biotyny z wyjqtkiem bioD.

W celu klonowania genu bioD zastosowano sond? z cz?sciami genów bioC oraz bioD, skladajqcq si? z fragmentu SphI/PstI z pBO1 o dlugosci 520 bp. Fragment ten wyodr?bniono z zelu agarozowego i 0,2 pg wyodr?bnionego fragmentu znaczono radioaktywnie (Sambrook i in., 1989, ibid. 10.8) za pomocq translacji „Nick” polimerazq I DNA (Boehringer Mannheim, RFN; Holoenzym z E. coli; tq tzw. Polimeraz? Kronberga zastosowano wraz: z DNazq I) oraz 25 pCi a-[32p]-dATP (NEN-Du Pont, NEG-012H). Hybrydyzacja tej sondy na „Southern biot”, jak opisano powyzej, przy uzyciu chromosomu fragmentu restrykcyjnego E. coli DSM498 wytworzonego przez SspI wykazala z jednej strony fragment SspI o 1,6 kb znany z pBO1 z bioF i bioC, a z drugiej strony fragment SspI o 1,1 kb z bioD i sekwencjach sqsiadujqcego genu uvrB (Sancar i in., Celi, 28: 523-520; 1982).

W celu klonowania fragmentu SspI o 1,1 kb znów nalozono cz?sciowy bank genów. 30 pg DNA E. coli DSM498 poddano ci?ciu za pomocq SspI i rozdzielono na zelu agarozowym 0,7%. Fragmenty o wielkosci od 0,9 kb do 1,3 kb wyci?to i wyodr?bniono przez elektrodializ?. 0,5 pg tych fragmentów poddano ligacji z 0,5 pg fagowektora M13mp19 ci?tego SmaI (Yanisch-Perron i in., 1985, ibid.). Przy uzyciu tego tworu ligacyjnego nastqpila transfekcja E. coli JM109 (Yanisch-Perron i in., 1985, ibid.) wedlug Messing (Methods Enzymol., 101: 20-79; 1983). 150 klonów fagowych z insertem (fenotyp LacZ') wyodr?bniono i namnozono w pozywce NYB. Po odwirowaniu komórek E. coli naniesiono fagi kazdorazowo w 50 pl pozostalosci przy uzyciu aparatury Schleicher & Schuell „minifold I” jako „dot blot” na filtrze nitrocelulozowym (Schleicher & Schuell BA 85). W celu denaturacji fagów na filtry przez 5 min. podzialano buforem 0,1 M NaOH/1,5 M NaCl, a nast?pnie zneutralizowano 0,5 M Tris-HCl, pH 7,5/2,5 M NaCl (5 min.). dNa utrwalono na filtrze przez inkubacj? (2 godz.) w 80°C. Filtr, tak jak opisano (Sambrook et al., 1989, ibid., 9.52-9.55), zhybrydyzowano ze znaczonym radioaktywnie fragmentem Sphl/Pstl o 520 bp w 60°C. W ten sposób zidentyfikowano klon fagu M13bioD o wyzej opisanym fragmencie SspI o 1,1 kb, zaw'ierajqcym gen bioD (fig. 2).

179 166

1.2. Konstrukcja pBO2.

Kazdorazowo poddawano ci?ciu 0,5 pg plazmidu pBO1 i 0,5 pg fagu M13bioD enzymem restrykcyjnym Snol und HindlII i poddano powtórnej ligacji. Po transformacji E. coli RR28 otrzymanym tworem ligacyjnym badano rekombinowane plazmidy za pomocq analizy restrykcyjnej. Wybrano plazmid pBO2 (fig. 2), w którym fragment SnoI/HindIII z pBO1 o ok. 1,5 kb, zawierajqcy cz?sc genu bioD i niezasadnicze sekwencje wektora pHE3, jest zamieniony przez fragment SnoI/HindIII (0,95 kb) z M13bioD. Analiza wykazala, ze plazmid pB02 zawieral kompletny operon bio, tak jak w E. coli, wraz z sekwencjami promotora uvrB (Sancar et al., Celi 28: 523-530; 1982) w dól sekwencji od bioD.

1.3. Konstrukcja pB03 i pB06.

Zaobscrwowa.no, ze E. coli RR28 z pB02 na plytkach NA slabiej rosnie niz przy uzyciu pBO1 i tworzy wyraznie mniejsze kolonie. Powodem tego mogq byc sekwencje uvrB w pB02. W celu delecji tych sekwencji, 20 pg pB02-DNA przeci?to przy uzyciu HindIII i umieszczono w 150 pl buforu Bal31 (600 mM NaCl, 12,5 mM MgCh, 12,5 mM CaCl2, 1 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 7,2). Nast?pnie w celu stopniowego skracania liniowych plazmidów dodano Bal31 (z Alteromonas espejiani, Boehringer Mannheim, RFN). Po 3, 6, 9, 12 i 15 min. inkubacji w 30°C pobierano próbki kazdorazowo 30 pl i reakcj? Bal31 zatrzymano przez dodanie kazdorazowo 2 pl 0,5 M EGTA (kwasu etylenoglikolo-bis-(2-ammoetylo)-c2terooctowego), pH 7,5, a nast?pnie ekstrakcj? fenolem. Potem przeniesiono próbki do 40 pl bufora nukleazy (mung bean) z Phaseolus aureus (30 mM octanu sodowego, 50 mM NaCl, 1 mM ZnCh, 5% gliceryny, pH 4,6) oraz podzialano nukleazq Phaseolus aureus (Boehringer Mannheim, RFN) przez 10 min. w 37°C w celu usuni?cia niesparowanych pojedynezych kobców nici oraz wytworzenia kobców „st?^^^n^ch”.

Przy dzialaniu B^Hsq usuwane nie tylko sekwencje uvrB. lecz takze zasadmcze sekwencje wektora pHE3. Zatem skrócone plazmidy pBO2 po dzialaniu nukleazq. z Phaseolus aureus roz^to EcoRI. aby usunqc cz?só DNA wektora pHE3, skróconq przez Ba!31. Nast?pnie zregenerowano pierwotnq sekwencj? wektora przez ligacj? plazmidu pB02, na który dzialano z fragmentem DNA (1,5 kb), który po ci?ciu BamHI. dzialaniu nukleazq z Phaseolus aureus oraz dalszym ci^ciu EcoRI wyodr?bniono z pB02 i który posiada uprzednio deletowane zasadnicze sekwencje wektora pHE3. Poniewaz wskutek tej ligacji zregenerowano w pelni opornosc Cm, mozna rozpoznac nienaruszone plazmidy na podstawie ich wlaéciwosci: opornosci przeciw Cm.

E. coli RR28 transformowano przy uzyciu tworów ligaeyjnych i przelozono na plytkach NA pg/ml Cm. Zaobserwowano male, powoli rosnqce kolonie typowe dla przypadku BO2 oraz wielkie, normalnie rosnqce kolonie. Liczba wielkich kolonii na próbk? pBO2 wzrastala wraz z trwaniem inkubacji Bal31.

Z 22 normalnie rosnqcych kolonii wyodr?bniono plazmid DNA i zbadano za pomocq analizy restl·ykeyjncj i sekwencyjnej. W ten sposób otrzymano plazmidy pB03 i pB06, w których poddano delecji 330 bp, wzgl?dnie 410 bp obszaru uvrB, lecz które jednak wciqz zawieraly gen bioD.

1.4. Klonowanie genów bio w jednostce

I.4.1. Konstrukcja pBO22: promotor tac przed bioB.

Dla wbudowania odpowiedniego promotora przed genem bioB nalezy usunqc niepozqdany promotor dzikiego typu przed genami bioBFCD. Moze to nastqpió przez ei?eie za pomocq NcoI, wskutek czego równoezesnie odslania si? kodon startowy genu bioB. W danym przypadku wybrano w charakterze promotora tac (Russell i Bennett, 1982, ibid.), poniewaz moze on byc zastosowany jako promotor konstytutywny lub indukowalny i wykazuje bardzo dobrq aktywnosc nie tylko w E. coli, ale równiez w wielu innych bakteriach Gram-ujemnyeh.

Fragment DNA z promotorem tac z koncami HindIII oraz BamHI uzyskano z Pharmacia-LKB (Uppsala, Szwecja) i wbudowano w plazmid pUC18 poci?ty HindIII i BamHI (Yanisch-Perron i in., 1985, ibid.). W wyniku uzyskano plazmid pUC 18/tac (fig. 2). 8 pg tego plazmidu ci?to nast?pnie BamHI. a dla wypelnienia recesywnych kobców 3' za pomocq polimerazy Klenowa (Polimeraza I DNA z E. coli; Boehringer Mannheim, RFN) w buforze polimerazy Klenowa (20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCh, 6 mM β-merkaptoetanol) inku179 166 bowano przy dodatku po 100 μΜ dATP, dGTP, dCTP i dTTP. Nast?pnie wykonano drugie ci?cie przy uzyciu AatlI. W ten sposób, przy uzyciu promotora tac mozna bylo wyodr?bnic fragment DNA o diugosci 0,55 kb.

Fragment 3,2 kb z genami bioB, bioF. bioC oraz koùcem 5' genu bioD wyodr?bniono zpBO1. Ponadto poddano ci?ciu 8 μg pBO1 za pomocq NcoI. a nast?pnie dla wypelnienia recesywnych koùców 3' poddano jak wyzej dzialaniu polimerazy Klenowa. Nast?pnie wykonano drugie ci?cie przy pomocy PstI, po czym nastqpilo wyodr?bnienie zqdanego fragmentu o 3,2 kb. Na koniec, 4 μg wektora pHE3 poddano cieciu przy uzyciu PstI oraz AatlI i wyodr?bniono z pHE3 replikon P15A (Hannecke i in., 1982, ibid.).

Te trzy fragmenty poddano w równomolowych ilosciach ligacji wystajqcych i gladkich koùców przy uzyciu ligazy T4-DNA (Boehringer Mannheim, RFN), przy czym kazdorazowo ligowano wystajqce koùce PstI przy pomocy PstI, AatII - przy pomocy AatII z gladkimi koùcami BamHI i NcoI. Przy ligacji koùca BamHI uzupeinionego za pomocq polimerazy Klenowa z poddanym równiez obróbce NcoI regeneruje si? miejsca ci?cia BamHI i NcoI. E. coli RR28 poddano transformacji przy uzyciu uzyskanego tworu ligacyjnego i selekcjonowano na CmR DNA plazmidu transformowane przez Cm^R zbadano za pomocq analizy restrykcyjnej. W ten sposób otrzymano plazmid pB021 (fig. 2), w którym promotor tac znajduje si? przed genem bioB. Wskutek delecji fragmentu HindIII o 1,5 kb z pBO21, charakteryzujqcego si? niezasadnicz.ymi sekwencjami z wektorów plazmidów pHE3 i pUC18, otrzymano ostatecznie pBO22 (fig. 2).

1.4.2. Konstrukcja pBO27 i pBO28.

pig pBO22 poddano ci?ciu za pomocq PstI, a wystajqcy koniec PstI skrócono przez dzialanie nukleazq z Phaseolus aureus do gladkiego koùca. Nast?pnie poddano ci?ciu za pomocq SnoI i wyodr?bniono otrzymany fragment DNA o 6,8 kb. Wyodr?bniono fragment DNA o 0,76 kb z koùcem 3' genu bioD z 5 pg pBO3 po restrykcji za pomocq ClaI, dopelniono wystajqce koùce ClaI za pomocq polimerazy Klenowa i ci?to przy uzyciu SnoI. Obydwa fragmenty DNA ligowano za pomocq ligazy T4-DNA, a nast?pnie E. coli transformowano za pomocq tego tworu ligacyjnego. Po selekcji na chloramfenikolu otrzymano z transformantu CmR po analizie restrykcyjnej plazmid pBO27. Plazmid ten zawiera promotor tac wraz z genami bioB, bioF, bioC i kompletnym genem bioD w jednostce transkrypcyjnej (fig. 2).

W celu delecji miejsca ci?cia BamHI w pBO27, poddano ci?ciu 5 pg pB027 za pomocq BamHI, inkubowano za pomocq polimerazy Klenowa i nukleotydu dGTP jak opisano wyzej, a nast?pnie poddano dzialaniu nukleazy z Phaseolus aureus. Po powtórnej ligacji tego DNA ligazq T4-DNA i transformacji E. coli DH5 (Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557-580; 1983) otrzymano plazmid pB028, w którym miejsce ci?cia BamHI uleglo delecji, podczas gdy miejsce ciecia NcoI zostalo zachowane (fig. 2).

1.4.3. Konstrukcja M13biol8 oraz M13bio18/13.

W celu usuni?cia niepozqdanego promotora dzikiego typu przed genem bioA najpierw wyodr?bniono przez ci?cie 5 pg pBO3 za pomocq BgIII oraz KpnI fragment o 4,4 kb z genami bioB, bioF, bioA i ORFI. 0,5 pg tego fragmentu poddano ligacji z 0,5 fig wektora fagu M13mp18 ci?tego za pomocq BamHI oraz KpnI (Yanisch-Perron i in., 1985, ibid.). Po transformacji E. coli JM109 (Yanisch-Perron i in., 1985, ibid.) tym tworem ligacyjnym zidentyfikowano (wedlug Messinga, 1983, ibid.) rekombinowane klony fagowe, które posiadaly insert. Wyodr?bniono dwuniciowe fagi DNA z takich klonów i zbadano za pomocq analizy restrykcyjnej. W ten sposób otrzymano fag M13bio18 z zadanym fragmentem o 4,4 kb (fig. 2).

pg dwuniciowego DNA fagu M13biol8 zlinearyzowano przez. ci?cie za pomocq NcoI. wprowadzono do 160 pl buforu Bal31 i nast?pnie dodano Bal31 w celu usuni?cia promotora bioA. Po 20, 40, 60, 80, 100 i 120 sekundach inkubacji w temperaturze pokojowej pobierano próbki po 25 pl i zatrzymywano reakcj? Bal31 przez dodanie 2 pl 0,5 M EgtA, pH 7,5 oraz ekstrakcj? fenolem. Kazde 3 próbki lqczono i poddano ci?ciu za pomocq XbaI, aby usunqc geny bioB i bioF. Nast?pnie poddano DNA dzialaniu polimerazy Klenowa jak wyzej, aby wystajqce koùce 5' dopelnic do gladkich koùców. Po takie obróbce DNA poddano powtórnej ligacji, a E. coli JM109 poddano transformacji ligowanym DNA. Z 24 klonów fagowych wyodr?bniono jednoniciowy DNA (Messing, 1983, ibid.), a sekwencj? DNA na koùcu

179 166

5' genu bioA zanalizowano wedlug Sangera i in., (1977; ibid.). W ten sposób otrzymano klon fagu M13bk>18/13, w którym promotor dzikiego typu przed genem bioA ulegl delecji w którym równoczesnie wystppuje miejsce cipcia Sali 26 bp w górp sekwencji od genu bioA (fig. 2).

1.4.4. Konstrukcja M13bioDA.

Aby umiescic geny bioD oraz bioA w jednostce transkrypcyjnej poddano cipciu 5pg plazmidu pBO6 za pomocq Sphi i Sali. Wyodrpbniono otrzymany fragment DNA o dlugosci 0,97 kb, zawierajqcy gen bioD i 72 bp DNA w dól sekwencji od genu bioD az do koùca Sali.

μg M13bio18/13 równiez poddano cipciu za pomocq Sphi i Sali. Fragmenty DNA poddano ligacji ligazq T4-DNA i za pomocq otrzymanego produktu transformowano JM109 E. coli. Z 24 rekombinowanych klonów wyodrpbniono dwuniciowe DNA fagu i scharakteryzowano za pomocq analizy restrykcyjnej. W ten sposób otrzymano klon M13bioDA. w którym geny bioD oraz bioA sq oddalone o 98 bp (fig. 2).

1.4.5. Konstrukcja pBO30.

Dla skonstruowania jednostki transkrypcyjnej z promotorem tac przed genami bio poddano cipciu 5 ng DNA M13bioDA za pomocq EcoRi. dla dopelnienia w'ystajqcych koùców EcoRi poddano dzialaniu polimerazy Klenowa, a nastppnie cipciu za pomocq Snoi. Wyodrpbniono otrzymany fragment DNA o dlugosci 2,6 kb z genami bioD, bioA i ORFi. 5 μg plazmidu pBO28 (fig. 2) poddano cipciu za pomocq Sali, podzialano nukleazq z Phaseolus aureus dla odlqczenia wystajqcych koùców Sali, a nastppnie poddano cipciu za pomocq Snoi. Wyodrpbniono fragment DNA o dlugosci 6,7 kb z wektorem DNA, promotorem tac i genami bioBFC. Wyodrpbnione fragmenty DNA poddano ligacji za pomocq ligazy T4-DNA i transformowano za pomocq tego tworu ligacyjnego biotyno-auksotropowy szczep E. coli SA291 (Campbell, J. Bacteriol. 112: 830-839; 1972). Przez przelozenie na plytkach NA za pomocq 20 μg/ml Cm i 8 μg/ml awidyny wyselekcjonowano klony o kompletnym operonie biotyny w plazmidzie. Plazmidy z takich klonów zbadano za pomocq analizy restrykcyjnej. W ten sposób otrzymano plazmid pB030, zawierajqcy geny bioB, bioF, bioC, bioD i bioA oraz gen ORFi wraz z promotorem tac w jednostce transkrypcyjnej (fig. 2).

1.5. Konntruukjaplazmiddw o ulepszonej ekspresji genów bùi·

i.5.1. Konstrukcja pBO30A-9 i pBO30A-15.

W minikomórkach E. coli DS410 (Dougan i Sheratt, Mol. Gen. Genet. 151: 151-160; 1977) z slazmidem pBO30 ammoteaósfsraoa DAPA kodowana przez gen bioA jest oóacoóis slabiej sktpeymowaóa niz inne eóoymy dla synteoy biotyny. Przy próbie pnlepsosnia ekspeesji genu bioA sfocono ndleglnsc mipdzy genem bioD i esópm bioA za pomocq egzonuklsazy Bal31. aby usunqc mozliwe oaklócajqce sskwsncje, takie jak ..stern-loop”. Naztppnip 25 μg BO30 poddano cipciu za pomocq Sali i podoialano egznnukleaoq Bal31 i polimseaoq Klenowa, jak npisann wyzej. Przez ligacjp z syntstycznym nlignóuklsotydsm o sekwencji 5'-CGTCGACG-3', linkerem Sali, zeeepósrowaóo miejsce cipcia Sali. Nastppnis DNA poddano cipciu za pomocq Sali i Snoi i wyndrpbóioón feagmsnty bioD o dlugosci ok. 640 bp skróconych na koùcu 3'. Fragmenty te poddano ligacji z fragmentem z pB030 o 8,25 kb, wyodrpbninóym po cipciu tego plazmidu za pomocq Sali i Snoi i zawierajqcym niezmisninny gen bioA.

Bi()tyóo-auksotropow'y szczep E. coli SA291 t^^isfo^owano pnwyzzzym tworem ligacyjnym, aby nastppnie za pomocq 60 μg/ml Cm i 5 μg/ml awidyny wysslekcjnnowac na plytkach NA klony z nIenaeusznóym genem bioD. Otrzymano 26 takich klonów, które zbadano za pomocq analizy rsstrykcyjóej. 8 sposród tych klonów o widocznym skrócsóiLl obszaru w górp tskwsncji od mieasca Sali schaeakteΓyznwaón dnkladóiej za pomocq analizy sskweócyjóej DNA. W pipciu z tych klonów byly, jak tego oczekiwano, deletowane odcinki od 20 do 45 bp DNA mipdzy genem bioD i bioA. W minikomórkach E. coli klony te wywolaly faktycznie owipksooóq skspresjp genu bioA o czynmk 2 w stnsuóku do pBO30. Przykladem plazmidu o ulspsoonej eksprssji tego rndoaju jest otrzymany w ten sposób plazmid pB030A-9 (fig. 3).

Nisoczskiwaóie wyodrpbnioóo trzy dalsze plazmidy, w których byly deletowane odcinki od 70 do 90 bp DNA mipdzy genem bioD i genem bioA. Delecje sipgaly takze do genu struktury bioD. Z tego wynikly: (i) kaZdnrazown zrózóicowaóy koniec COoH syntetaoy DTB bez duzej zmiany aktywnosci enzymu i (ii) nakladanie zmienionych genów bioD i rastru odczytu bioA. W ten sposób otrzymano np. plazmid pBO30A-15 z mutantem genu bioD-bioD15 (fig. 3, 5 i 6). W minikomórkach E. coli z BO30A-15 ekspresja bioA jest w porównaniu do B030 zwi?kszona o czynnik 4. Sekwencje DNA obszaru bioDA i wyprowadzone stqd sekwencje aminokwasów plazmidów pBO30, pBO30A-9 i pBO30A-15 przedstawiono na fig. 3 (Seq. ID nr 9-16).

I.5.2. Konstrukcja plazmidów o ulepszonym miejscu wiqzania rybosomów przed genem bioB.

W celu polepszenia translacji genu bioB, którego ekspresja w pB030 jest wyraznie slabsza niz np. genu bioD, zmodyfikowano sekwencj? w gór? sekwencji od genu bioB w pBO30, który obejmuje promotor tac i miejsce wiqzania rybosomów, zawarte w klonowanym fr^igm^n<cie promotora tac. Wstawiono tu syntetyczne, tzw. mieszane („mixed”) oligonukleotydy ze zmiennymi sekwencjami przed genem bioB. W celu prostego wyboru korzystnych miejsc wiqzania rybosomów zastosowano próbny plazmid o translacyjnej fuzji genów: bioB: :lacZ, pbioB: :lacZ-2. pbioB: :lacZ-2 jest w cz?sci wektora, w promotorze tac z miejscem wiqzania rybosomów i w koùcu 5' genu bioB identyczny z plazmidem pBO22 (fig. 2). W miejscu ci?cia NruI o nukleotydzie 326 genu struktury bioB ulegly delecji koniec 3' genu bioB oraz pozostale geny bio i wbudowano gen lacZ E. coli (Casadaban i in., Methods Enzymol. 100: 293-308; 1983) w taki sposób, ze bioB i lacZ poddano fuzji w poprawnym rastrze odczytu dla ekspresji proteiny fuzji bioB: :lacZ oraz, ze zregenerowano miejsce ci?cia NruI.

W plazmidzie pbioB: :lacZ-2 wstawiono w szeregu etapach oligonukieotyd 985E o sekwencji 5'-CATGGAATCCTCCACTGATCAGTAC-3' przed genem bioB (fig. 4). Nastypnie rozdzielono pbioB: :lacZ za pomocq BamHI. a wystajace koùce BamHI dopelniono, jak opisano, za pomocq polimerazy Klenowa. W trakcie tych etapów widocznie niespecyfìcznie deletowano reszt? guaninowq (G), czego nastqpstwem byla utrata miejsca ciccia BamHI w pózniejszych plazmidach. Po wstawieniu linkera KpnI transformowano XL 1-Blue E. coli (Bullock i in., Biotechniques 5: 376-379; 1987) za pomocq tworu ligacyjnego i wyodr?bniono plazmid bioB: :lacZ/KpnI. Plazmid ten poddano cz?sciowo ci?ciu za pomocq NcoI a nast?pnie ci?ciu za pomocq KpnI. Po ligacji z oligonukleotydem 985E dopelniono drugq nic dNa za pomocq polimerazy Klenowa. Po transformacji XL 1-Blue E. coli i selekcji na plytkach NA za pomocq 20 pg/ml Cm, 30 pg/ml X-Gal i 0,5 mM IPTG (izopropylotiogalaktozyd) wyodrebniono plazmid pbioB: :lacZ/985E (fig. 4). Plazmid pbioB: :lacZ/985E poddano dalszej modyfikacji, wycinajqc miejsce wiqzania rybosomów przez restrykcj? za pomocq KpnI oraz SpeI i zamieniajqc przez trzy rózne oligonukleotydy, SD17, SD19 oraz SD21 (fig. 4). Po ligacji tymi oligonukleotydami zamkni?to luk? w drugiej nici przez inkubacj? polimerazq Klenowa. Komórki bakterii XL 1-Blue E. coli transformowano za pomocq tego DNA i jak wyzej przelozono na plytkach NA za pomocq 20 pg/ml Cm, 30 pg/ml X-Gal i 0,5 mM IPTG. Wybrano 20 klonów o dobrej ekspresji proteiny fuzji bioB: :lacZ. które na tej pozywce utworzyly ciemnobiale kolonie i zmierzono aktywnosc β-galaktozydazy tych klonów za pomocq próby enzymu wedlug Millera (Experiments in Molecular Genetics, Cold Springs Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, N.Y., str. 352-355; 1972). Ponadto uprzednio wyhodowano szczepy E. coli z plazmidami bio: :lacZ w pozywce plynnej az do g?sto0di optycznej przy 600 nm (OD 600) okolo 0,5.

Najwyzszq aktywnoSc β-galaktozydazy wykazaly plazmidy pbioB: :lacZZ985, pbioB: :lacZ/16 i pbioB: :lacZ/9 (fig. 4), dla których aktywnosc β-galaktozydazy w porównaniu z pbioB: :lacZ-2 wzrosla o czynnik 2,1 3,4, wzgl?dnie 5,9. Sekwendj? DNA zoptymalizowanych miejsc wiqzania rybosomów dla genów bioB w tych plazmidach okreslono wedlug Sangera i in., (1997, ibid.).

W celu wbudowania zoptymalizowanych miejsc wiqzania rybosomów- w jednostk? transkrypcyjnq z genami bio poddano ci?ciu kazdorazowo 5 pg plazmidów pbioB: :lacZ/985E, pbioB: :lacZ/16 lub pbioB: :lacZ/9 za pomocq ClaI i NruI i wyodr?bniono fragment DNA o dlugosci 550 bp z promotorem tee, kaadorazowym miejs cem ciecia rybosomów- i koùcem 5' genu bioB. Równodze0nie poddano ci?ciu 5 pg plazmidu pBO30 A (fig. 5) za pomocq ClaI i NruI i wyodr?bniono fragment DNA o dlU5o0di 7,7 kb. W pBO30 A, wyprowadzonym \79 166 z pBO30, ulegl delecji fragment SalI/BamHI ze znacznq cz?sciq genu bioA i zaklócajqcym miejscem ci?cia NruI (fig. 5). Obydwa fragmenty poddano ligacji i wyodr?bniono klony z rekombinowanymi plazmidami. W ten sposób otrzymano plazmidy pBO30 A/9, pBO30 A/16 oraz pBO30 A/985. Fig. 5 przedstawia takq konstrukcj? na przykladzie pBO30 A/9 z miejscem wiqzania rybosomów z pbioB: :lacZ/9.

Po 2 gg plazmidów pBO30 A/9, pBO30 A/16 oraz pBO30 A/985E poddano ci?ciu za pomocq SnoI i KpnI. przy czym KpnI uzyto w malej ilosci, aby ciqc jedynie cz?§ciowo. Nast?pnie wyodr?bniono kazdorazowo fragmenty DNA o dlugosci 6,6 kb, zawierajqce wektor DNA, promotor tac, gen bioB z ulepszonym miejscem wiqzania rybosomów i geny bioFC. Plazmid pBO30A-15 (4 gg) równiez poddano ci?ciu za pomocq_ SnoI i NcoI i wyodr?bniono fragment 2,8 kb z genami bioDA-ORFI. Wyodr?bnione fragmenty poddano ligacji i RR28 E. coli poddano transformacji tq mieszankq ligacyjnq. Rekombinowane plazmidy z kompletnym operonem biotyny zidentyfikowano przez analiz? restrykcyjnq. W ten sposób otrzymano plazmidy pBO30-15/9, pBO30A-15/16 oraz pBO30A-15/985E. Zawieraly one wszystkie zoptymalizowany obszar bioDA z pBO30A-15 z odpowiadajqcymi zoptymalizowanymi miejscami wiqzania rybosomów z plazmidów pbioB: :lacZ/9. pbioB: :lacZ/16. wzgl?dnie pbioB: :lacZ/985E. Genetyczne elementy kontrolne tych plazmidów, mianowicie kombinacja z promotora. tac i zoptymalizowanego miejsca wiqzania rybosomów, które sq bezposrednio powiqzane z genem bioB i oddzialujq na jego skutecznq ekspresj?, wy'kazujqnast?pujqce sekwencje:

5'—AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATAATT GTGT1G3AATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA TGACTAGTC-3 ' pBO30A—15/16 (Seq ID Nr: 18)

5'-AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATTAT GTGTGGAATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGGTA CCTAAGGAG TTTACTAGTC-3' pBO30A—15/9 (Seq ID Nr: 19)

5'—AAGCTTACTC CCCATCCCCC TGTTGACAAT TAATCATCGG CTCGTATTAAYT GTGTGGAATT

GTGAGCGGAT AACAATTTCA CACAGGAAAC AGGATCGG'i’A CCTAAGGAGA CTAGTC—3 '

Figura 5 przedstawia konstrukcj? plazmidów zawierajqcych geny bioB, bioF, bioC, bioD i bioA wraz ze zoptymalizowanym miejscem wiqzania rybosomu, na przykladzie konstrukcji pBO30A-15/9.

Zsekwencjonowano calq jednostk? transkrypcyjnq genów bio w BO30A-15/9. Sekwencj? i wyprowadzone z niej produkty genowe przedstawiono na fig. 6 (Seq. ID nr: 1-8).

I.6. Konstrukcja pBO30A- 15/9DorfI.

gg plazmidu pBO30 A/9 poddano ci?ciu jak wyzej za pomocq SnoI i KpnI i wyodr?bniono fragment DNA o dlugosci 6,6 kb. 4 gg plazmidu pBO30A-15 poddano ci?ciu za pomocq Sspi. Przez ligacj? otrzymanego liniowego DNA z linkerem KpnI o sekwencji 5'CGGTACCG-3' dodano w dól sekwencji od genu bioA nowe miejsce KpnI. Po ci?ciu za pomocq SnoI wyodr?bniono fragment o 2,1 kb z genami bioDA. Wyodr?bnione fragmenty DNA poddano ligacji i RR28 E. coli transformowano otrzymanq mieszankq ligacyjnq. Rekombinowane plazmidy z genami bioBFCDA zidentyfikowano przez analiz? restrykcyjnq. W ten sposób otrzymano BO30A-15/9 orfI z delecjqgenu ORFI (fig. 5).

179 166

1.7. Konstrukcja plazmidu pBO47.

pg plazmidu pBO30A-15/9 poddano ci?ciu enzymami restrykcyjnymi XbaI i EcoRI. Otrzymany fragment restrykcyjny o 5,8 kb z promotorem tac i operonem biotyny wyodr?bniono, a nast?pnie poddano z ligacji z plazmidem pRK290X o „szerokim spektrum gospodarzy” (Alvarez-Morales i in., Nuci. Acid. Res. 14: 4207-4227, 1986; zmodyfikowany przez delecj? miejsca restrykcyjnego XhoI i dodanie miejsca XbaI w tej samej pozycji), który równiez poddano ci?ciu XbaI i EcoRI. S17-1 (Simon i in., Biotechnology 1: 784-791; 1983) E. coli transformowano tworem ligacyjnym. Rekombinowane plazmidy scharakteryzowano przez analiz? restrykcyjnq. W ten sposób otrzymano plazmid pBO47, zawierajqcy operon biotyny wcielony w pRK290X.

Przez koniugacj? ze szczepem E. coli S17-1/pBO47 plazmid pBO47 przeniesiono do szczepów bakteryjnych RhizobiumlAgrobactenum sp. HK4, Pseudomonas mendocina, Pseudomonas aeruginosa PA01 (Holloway, J. Gen. Microbiol. 13: 572-581; 1955) i Acinetobacter calcoaceticus DSM 588.

1.8. Konstrukcja pBO74 B.

Konstrukcji plazmidu pBO74 B z delecjq genu bioB dokonano wychodzqc z pl.az.midu pBO74-13 (fig. 7). Plazmid pBO74-13 sklada si? z równych elementów DNA, jak pBO30 (fig. 2). Nast?pstwo w szeregu genów bio w obr?bie plazmidu pBO74-13 jest jednak rózne.

pg plazmidu pBO74-13 poddano ci?ciu za pomocq SmaI. Po ekstrakcji fenolem/chloroformem DNA plazmidu poddano ci?ciu za pomocq SphI i wyodr?bniono fragment 0 6 kb zawierajqcy DNA wektora, promotor tac, geny bioA-ORFI oraz bioCD. 18 pg plazmidu pBO3 (fig. 2) poddano ci?ciu za pomocq SspI i SphI i wyodr?bniono fragment. 1,66 kb z genem bioF i cz?sciq genu bioC. Wyodr?bnione fragmenty poddano wzajemnej ligacji i RR28 E. coli transformowano za pomocq otrzymanej mieszanki ligacyjnej. Rekombinowane plazmidy zanalizowano za pomocq analizy restryOcyjnej. W ten sposób otrzymano plazmid pBO74B, rózniqcy si? od plazmidu pBO74-13 delecjq genu bioB (fig. 7).

Przyklad II. Wytwarzanie biotyny z detiobiotyny (mierzenie reakcji syntazy biotynowej in vitro).

II. 1. Wytvwrzanieekstraktó'w komórkoowcc E. coli.

Wytworzono po jednym ^straScie OomórOowym z E. coli XLd-Blue (DSM 7246) z plrzmidkm pBO30A-15/9 (ekstrakt Z) i jednym eOstrakcie 0omórkowym z E. coli XL1Blue z plazmidem pBO74 B (DSM 7245; eOstraOt W). Ponadto komórOi mikroorganizmu w 37°C hodowano w obj?tosci 800 l o OD600 w pozywce zawierajqcej 20 g/l Nutrient Broth, 5 g/l eOstraOtu drozdzy i 20 mg/l Cm. KomórOi zebrano przez sqczenie, a nast?pnie w 5000 x g wirowano przez. 15 min.

W celu wytworzenia bezkomórOowego eOstraOtu OomórOi przemyto 100 mM buforem HEPES (pH 7,5), a nast?pnie w taOim buforze powtórnie przeprowadzono w stan zawiksiny, aby doprowadzic OD600 do okolo 1000 i podzialano DNAzq. Potem komórki rozrywano w ciqglym homogenizatorze OomórOowvm przy 100000 Pa. Produkt homogenizacji wirowano przez 30 min. przy 20000 x g, a uzyskanq pozostalosc przechowywano w -80°C. EkstraOt Z mógl byc zastosowany do mierzenia (badania) reakcji syntazy biotynowej bez^oÉredmo lub tez dopiero po oczyszczeniu przez filtracj? zelowq na Oolumnie zaiadowanej przez Sephadex G25M PD-10 (Pharmacia, obj?tosc kolumny: 9,1 ml). EkstraOt W zastosowano bezposrednio do badania reaOcji syntazy biotynowej lub poddano frakcjonowaniu wedlug przykladu II.3.

II.2. Pròba in vitro reaOcji syntazy biotynowej (proba standardowa).

W próbie in vitro badano przkmirn? detiobiotyny znaczonej ¹⁴C (0,1 pCi; 1,95 nmoli) do biotyny znaczonej ^HC albo przemian? nie znaczonej detiobiotyny z cysteinq znaczonq 3$S (20 pCi; F32 nmoli) do biotyny 35S przy uzyciu enzymu (syntaza biotynowa). Utworzonq przy tym ^C-biotyn? lub 3⁵S-biotyn? mozna bylo po ekstraOcji latwo oznaczyc przez ilosciowe HPLC na deteOtorze radiochemicz.nym ..on-line” lub pólilosciowo za pomocq chromatografii cienkowarstwowej, a nast?pnie naìozenie blony rentgknowsOiej i autoradiografi?.

Typowa próba standardowa skladala si? z eOstraOtu bezkomórkowego Z lub W, ze znaczonej lub nie znaczonej det^obiot/ny, w zaleznosci od reakcji lub oczyszczonych z nich frakcji protein (przyOiady II.7-II.9) pojedynczo lub w polqczeniu mi?dzy sobq i/lub ze zwy16

179 166 klych Oofaktorów, takich jak SAM (92 μΜ'), glukoniao Fe²⁺(200 pM), NADH (100 pM), TPP (100 pM), DTT (1 mM) i/lub z kombioacji nmiooOwasów. Frakcje proteio, Oofaktory lub amiooOwasy padlegajqce badaniu dodano do koήcawej obj?taCci 250 pi. InO^a^a onst?pujo w temperaturze mi?dzy 4 a 50°C. Po jedyagt-dz1nnej iokubacji w 37°C eoaOcj? zntrzymnoo przez dodanie 12% wag. kwasu trój rhlarooctowogo (TCA) w wodzie. Wytrqcoyq proteio? odwirawnoa, a pozostalaCc ynyiesiayo na stalo-fazowq kolumn? oOstrinocyjoq C18 (MACHERE-Y-NAGEL, 100 mg), którq kondycjoyownna metanolem (1 ml), wodq (1 ml) i kwasem acyawym (1% obj.) w wodzie. Nast?poie t? kolumn? przemyto 1 ml 1% kwasu artowego i 1 ml wody, aby wymyc biotyn? i detiobiatyo? za pomocq 0,5 ml metanolu. Uzyskane próbki osuszaoa pod próziiq, pawtórnie utworzooo znwiosin? w 30 pl buforu A HPLC (25 mM KH2PO4, 5 mM chlorOu tetrabutyloamoniowego, pH 3,4), aby onsy?poie 25 pl wstrzyknqc w HPLC dla celów analizy 1loCriowej. Warunki HPLC byly oast?pujqce: kolumna Shnndon-HyperriieBDS-Cl8 (wtelkoCc czqstek: 5 mm, wielkoCc Oalumyy 10 mm x 2,0 mm), szybkoCc pr^iep^ywu 0,35 ml/min., temperatura 40°C, eluent: bufor HPLC A zaw. 10% obj. arotanitrylu.

Po rmiesznyiu strumienia eluatu z roztworem do pamineu sryotylncji (Ziosser Quickszint Flow 303; szybkaCc przeplywu: 1,25 ml/min.) wykryto i arnarzono iloCriawo nie przetworzonq ¹⁴C-detiobiotyo? oraz uyworzonq ¹⁴C-eiotyo? bqdz utworzonq /⁵S-eiotyn? (detektor radioaktywooCci ^o-lìoe”: Berthold).

Alternntywnie zaoalizowana próbki póliloCciowa za pomocq rhromatografπ ctenkowarsywawej i autoradiografii. Ponndta przeprowndzooo próbki powtórote w stai znwiosiyy w 20 p1 mieszanioy skladajqcej si? z 10% kwasu actowega, 65% metanolu i 25% wody i naoiosiano 2,5 μ.1 oa plytk? silikazelowq „high perforInay<ro” do rheomat.ogra.fπ ciooOawaestwowej (E. Merck, Darmstadt). Plytk? rozwini?to za pomocq fazy razwijajqrej, sOlndajqcoj si? z chlaralΌrmu (17 ml), metanolu (3 ml) i kwasu mnówkowego (0,2 ml). Po tym plytk? osuszooo i na ooc nnlozaoa film eentgoyawsO1.

II.3. RenOcjn syntazy biotynawej w oboroaCc1 amiyokwasów.

Gdy poddano iyOubncji demioernlirawnny bozOomórkawy ekstrakt Z z detiobiotyyq wedlug przykladu II.2 i OafnOtornm1 SAM, TP, NADPH i glukonianem Fo2+, nie znabserwowano zadyej przominny detiobiotyoy w biotyo?. Gdy dodano cystein? (332 pM) i asparagiii? (15 mM) lub cysteio? i nsparagininn (15 mM) lub cystein? i glutamin? (15 mM) lub cysteiy? i seryo? (15 mM) z OofnOtornmi wedlug przykladu II.4 do tego eozOomóekowoga eOstraOtu, mozna bylo stwierdzic produOcj? biayyoy.

Tabela 1

Sklad prób	Pmole wytwoezanej biotyny
EOstraOt Z1		0
	+ OafaOtoey2	0
-55“	+ nminokwnsy/	0
	+ OafaOtoey2 + nm1naOwnsy/	780

’) dom1noealirawnny;

2) OofmOtoi-y: SAM, Fe²’, TPP, NADPH;

³) Cys + Asn lub Cys + Asp, lub Cys + Gin, lub Cys + Ser.

II.4. RonOrjn syntazy biotynowej w oeornoCr1 jedoego lub w^i?^ typowych OafaOtorów. Gdy poddano ioOubncji eOstraOt roClinny, taki sam jak opisany w przyOladzte II.3, zLcysteinq, asparagioq, dotiaeiotyn^q, SAM, TPP, NADPH i geuOaoiaoem im’, detiobiotyna ulegla przemiaote w biatyo?. Aby zbadac wplyw tych kofaktorów na reakcj? syotazy biotynowej, rastosownna jq pojedyyrza lub w Oombioacji mi?dzy sobq. Jed^oie przy uzyciu wszystkich tych Oofaktarów stw1erdzaoa aOtywnaCc syntazy biatyoawej. W przypadku braku kofeOtora, nie mozoa bylo zmterzyc nOtywnaCci syntazy biotynowej. Oznaczn to, ze wszystkie OafnOyory sq niozb?doo dla aktywooCci syntazy biotynowej (przyklad II.3, tabela 2).

179 166

11.5. Ocoyszczaóie syntazy biotyóowej.

Aby wykaoac, ze nprócz syntazy biotyóowei za proemiaóp detinbiotyóy w biotynp odpowiedzialóych jest szereg protein, beoknmórknwy skstrakt Z poddano óaapieew feakcjoóowaniu siarczanem amoónwym. Przesrowadzoóo to przez nazycanie ekstraktu 25% siaecoanem amonowym mieszajqc przsz 30 min. w 4°C. Naztρpóie odwieowywaóo przy 10000 x g przez 30 min. i ntrzymaóy osad odezucnóo. Uzyskanq poz^ia^c óasycoóo 70% siaecoaópm amonowym, przy czym wytrqcoóo syntazp biotynowq. Osad ponownie prosprowadznno w zawissinp w malej objptosci 100 mM buforu HEPES (pH 7,5), dsmióeralioowaóo (Sephadex G25M PD-10), óaztppóis ncoysocznóo za pomocq chromatografii anioónwymieóóea (Q-Sephaense Fast-Flow, Pharmacia), z ciqglym gradisntem 100 mM - 1 M buforu HEPES (pH 7,5). FraS^s o aktywnosci syntazy poddano zatpzeniu (komora ultrafilteacyana Amicon, membrana YM-10), demiópralioowaóo jak opisaón wyzej, a naztρpnie poddano powtórinie cheomatogeafii na knlumóie cheomatngrafii anioóowymisóósj „Hi-Load” Q-Sephauoss (Pharmacia; 20 mM bufor Tris (pH 7,5) zawierajqcy 1 mM DTT i gradient 0-1 M NaCl).

Feakcje o wysokiej aktywóosci syntazy biotynow'ej po^zono, zatρznón i demmeralizowano. W tych frakcjach syntaza bintynnwa nie byla juz oraóieczyszczona ióóymi proteinami, óieobpdnymi dla aktywnosci syótaoy biotynowsj.

Aby zmierzyc aktywóosc syntazy biotyóowej sndczas npeeacji oczysz.czania, óieobpdóe bylo dodanie do mipszanióy badaópj (przyklad II.2) ekztraktu B. Wskulek tego za przsmίaóp detiobiotyóy w biotynp sq obok syntazy biotyóowsj ndpowiedoialóe jpszcze inne proteiny.

11.6. Feakcjonowanie protein z eksteaktu W.

Ekstrakt zostal wytrqcony ko^no przy 45% i 55% nasycenia siarczanem amonowym. Po dodaniu siarczanu amonowsgo calosc missoaóo w 4°C przez 30 min., a óastppóie odwirowywano puzsz 30 min. przy 10000 x g. Osad ott^many pr-zy 45% nasycemu siaeczanem amonowym pezeprowadzonn pnwtómie w stan oawistiny w 100 mM buforu HEPES (pH 7,5). Naztppóie pobrano i demmsraliznwaóo próbki osadu 45%, osadu 55% oraz poz^ta^^ 55% (kolumna Sephadex G25M PD-10). Oddzielns feakcje zbadano jak i w kombmacji frakcji mipdzy sobq, ogodóie z przykladsm ii.2.

Otrzymano 2 frakcje óieobpdne do syótaoy biotynowej. Tymi frakcjami byly:

- osad z nasycenia 45% ziaecoaóem amonowym,

- pozostalosc z 55% nasycenia siarcoansm amonowym.

11.7. Ocoyszczanie i idsntyfikacja flawodnksyóy.

Pozostaìnsc ot^^ymana z ekstraktu W po 55% óasycsóiu siaeczaósm amonowym (przyklad II.6), demmeraliznwaóo (kolumna Sephadex G25M PD-10), a nastppóie óanissinón na kolumnp chenmatoeeaficoóq anionowymisnnq (Q-Spphaensp Fast-Flow (Pharmacia)). Kolumnp tq pezedtem knódycjonnwaóo 20 mM buforsm Tris (pH 7,5) zawiprajqcym 1 mM DTT. Material nie owiqoaóy usunipto pezso wymycis tym buforem. Protemy owiqoaóe na tsj kolumme wymyto ciqglym gradientem NaCl (0-1 M). Wymyte fUakcje protein po^zono, oatpZono (komora ultrafilteacyjóa Amicon, membrana YM-10), demióeraliznwaóo (Sephadex G25m PD-10), a nastppnie nczyszcooón na kolumóis chromatogeafìcoóej mono Q-aóionnwymisnósj, kondycjnóowaóej 20 mM buforem Tris (pH 7,0, zawiprajqcym 1 mM DTT). Nastppóie zbadano ncoysoconns feakcjs za pomocq SDS-PAGE.

Aby podczas etapów oczyszczaóia zidentyfikowac frakcje oawieeajqcp soukaóq prntsióp wy^nano zestaw prób syntazy (przyklad II.2) z ncoyszconnq syntazq bintynowq, proteinq woglpdóIe proteinami z osadu z wytrqcania 45% siaecz.ansm amomowym, z aminokwasami (przyklad II.3) i z niskocoqstsczkowymi kofaStorami (przyklad II.4). Aktywnosó tyntaoy biotyóow'sj mozna bylo omisrzyc jsdynie we frakcjach, zawierajqcych soukaóq proteinp.

Naztppóip wyznaczoóo nastppujqco spkwencjρ amióokwasow'q. Proteine eedukowann puzsz 4 godz. DTT w 6 M bufoeze chlneowodnrku euaóidyny. Ote/wmane peóbki kaeboksymetylowano za pomocq kwasu jodnnctowsgn, a óastpsóie pezez 48 godz. dialionwaón wobec 0,1% wodnenwpglaóu amonowsgo. Po susoeóiu próbsk strawiono je trypsynq swini w 7 M buforze mocoóikowym, a peptydy eozdzislono za pomocq HPLC z odweócnrlymi fazami. Zi18

179 166 dentyfkowano 2 peptydy z sekwencjami DNA odpowiednimi dla flawodoksyny z E. coli. Po tych operacjach oczyszezania uzyskano homogennq flawodoksyn?.

11.8. Oczyszczanie i idcntyflkaeja reduktazy ferredoksyno(ifawodoksyno)-NADP''.

Ekstrakt W wprowadzono na kolumn? chromatografi anionowymiennej (Q-Sepharose

Fast-Flow (Pharmacia)). Kolumn? t? kondycjonowano za pomocq 20 mM bufora Tris (pH 7,5) zawierajqcego 1 mM TPP. Proteiny zatrzymane na kolumnie wymyto ciqglym gradientem NaCl (0-1 M). Wymyte frakcje proteinowe polqczono i zat?zono wedlug przykladu II.7, demineralizowano i wprowadzono na kolumn? chromatografii anionowymiennej mono-Q. Prt^A^tiiny zatrzymane na tej kolumnie wymyto ciqglym gradientem NaCl (0-0,4 M w 20 mM buforze Tris). Nast?pnie polqczone wymyte frakc^je proteinowe (jak wyzej opisano) zat?zono i demineralizowano na preparatywnej kolumnie ehromatograflczncj z filtracjq zelowq Superose 12 (Pharmacia; kondycjonowano 20 mM buforem Tris), a nast?pnie wprowadzono na kolumn? z filtracjq zelowq Sephacryl HR100 (Pharmacia; kondycjonowano 20 mM buforem Tris). Po wymyciu 20 mM buforem Tris otrzymano dalszq homogennq protein? (badanq za pomocq SDS-PAGE). Frakcje zawierajqce t? protein? zidentyfikowano analogicznie do ukladu próbnego wedlug przykladu II.7. Aktywnosc syntazy biotynowej zmierzono dopiero po dodaniu tych frakcji.

Aby okreslic z tej proteiny N-kobcowq sekwencj? aminokwasowq, oczyszczonq protein? bezposrednio sekwencjonow^ano. Proteina miala N-koncowq sekwencj? aminokwasowq^ odpowiadajqcq reduktazie ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP+. Wskutek tych operaeCi oczyszezania otrzymano homogennq reduktaz? ferredoksyny(flawodoksyny)-NADP⁺.

11.9. Wzbogacanie jednej lub wi?kszej liczby protein odpowiedzialnych za reakcj? syntazy biotynowej.

Oczyszczona syntaza biotynowa (przyklad II.2) nie wykazywala z oczyszczonq flawodok^s^^rqi reduktazq ferredoksyny(flawodoksyny)-NADP⁺oraz niezb?dnymi kofaktorami, jak równiez z aminokwasami zadnej aktywnosci. Aby osiqgnqc aktywnosc- szukano dalszej proteiny lub protein we frakeji 45% siarczanu amonowego.

T? protein? lub te proteiny otrzymano z bezkomórkowego ekstraktu W przez wytrqcanie za pomocq siarczanu amonowego przy nas^yceniu 45%. Otrzymany osad proteiny przeprowadzono ponownie w stan zawiesiny w 20 mM buforze Tris, pH 7,5, zawierajqcym 1 mM DTT oraz TPP (1 g/l), a nast?pnie demineralizowano na kolumnie PD-10 (Pharmacia). Odsolony material wprowadzono nast?pnie na chromatograficznq kolumn? anionowymiennq (Q-Sepharose HP Hi-Load), którq uprzednio kondycjonowano 20 mM buforem Tris, pH 7,5, zawierajqcym 1 mM DTT oraz TPP (1 g/l). Frakcje proteinowe o zqdanej aktywnosci wymyto ciqglym gradientem NaCl (0 mM - 600 mM NaCl). Nast?pnie te frakcje proteinowe dalej oezyszezano za pomocq chromatografii z filtra<^.jq zelowq (kolumna Sephacryl HR-100, Pharmacia). Uzyskany osad proteiny przeprowadzono powtórnie w stan zawiesiny w 100 mM buforze HEPES (pH 7,5), a nast?pnie demineralizowano, jak opisano powyzej. Uzyskano w wyniku tego roztwór proteiny, który zastosowano w próbie in vitro wedlug przykladu II.2.

11.10. Reakcja syntazy biotynowej w obecnosei flawodoksyny, reduktazy ferredoksyny(flawodoksyny)-NADP⁺, jed^j lub wì?ccc protein odpowiedzialnych za reakcj? syntazy biotynowej, jednego lub wi?cej aminokwasów i typowych kofaktorów.

Do bezkomórkowego ekstraktu Z dodano flawodoksyn?, reduktaz? ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP⁺ oraz jednq lub wi?cej protein odpowiedzialnyeh za reakcj? syntazy biotynowej. Dodanie protein, kofaktorów i aminokwasów wplyn?lo na zwi?kszonq akty wnosc syntazy biotynowej (tabela 2).

179 166

Tabela 2

Sklad prób	Pmole wytworzonej biotyny
Ekstrakt Z + kofaktory i aminokwasy	390
Ekstrakt Z + kofaktory + aminokwasy + flawodoksyna + reduktaza ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP+ + jedna lub wi?cej protein odpowiedzialnych za reakcj? syntazy biotynowej	1560

II.11. Reakcja oczyszczonej syntazy biotynowej w obecnosci kombinacji flawodoksyny, reduktazy ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP⁺, jednej lub wi?cej protein odpowiedzialnych za reakcj? syntazy biotynowej, jednego lub wi?cej aminokwasów i typowych kofaktorów.

Aby zbadaé wplyw tych skladników na reakcj? oczyszczonej syntazy biotynowej, skladniki te uzyto pojedynczo albo w kombinacji. Kofaktory uzyto w identycznej ilosci jak w przykladzie II.4, a aminokwasy - jak w przykladzie II.3. Gdy wszystkie z tych skladników wyst?powaly, detiobiotyna przy uzyciu oczyszczonej syntazy biotynowej przeksztalcala si? w pelni w biotyn?. Gdy jednego z tych skladników brakowaio, nie stwierdzano aktywnosci. Zatem do przeksztalcenia detiobiotyny w biotyn? niezb?dne sq wszystkie te skladniki (tabela 3).

Claims (6)

1. Sposób wytwarzania biotyny, obejmujqcy przemian? detiobiotyny w biotyn? w ukladzie bezkomórkowym za pomocq syntazy biotynowej, znamienny tym, ze przemian? prowadzi si? w obecnosci pirofosforanu tiaminy, S-adenozylometioniny, jonów Fe²⁺, cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujqcej asparagin?, kwas asparaginowy, glutamin? i seryn?.

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przemiany dokonuje si? w obecnosci flawodoksyny.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze przemiany dokonuje si? w obecnosci reduktazy ferredoksyno(ffawodoksyno)-NADP⁺ (fosforan dinukleotydu nikotynoamidowoadeninowego).

4. Sposób wytwarzania biotyny, obejmujqcy przemian? detiobiotyny w biotyn? w ukladzie bezkomórkowym za pomocq syntazy biotynowej, znamienny tym, ze przemian? prowadzi si? w obecnosci NADPH (zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynoamidowoadeninowego), cysteiny i co najmniej jeszcze jednego aminokwasu z grupy obejmujqcej asparagin?, kwas asparaginowy, glutamin? i seryn?.

5. Sposób wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze przemiany dokonuje si? w obecnosci flawodoksyny i reduktazy ferredoksyno(flawodoksyno)-NADP⁺.

6. Sposób wedlug zastrz. 1 albo 4, znamienny tym, ze przemian? prow^;adzi si? w obecnosci frakcji proteinowej, otrzymywanej przez wytrqcenie siarczanem amonowym przy nasyceniu 45% ekstraktu komórkowego Escherichia coli.