JPH05506570A - コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするｄｎａ配列、調製方法およびそれらの使用 - Google Patents

コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするｄｎａ配列、調製方法およびそれらの使用

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチド、それらの ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、調製方法およびそれらの使用 本発明は、コバラミンおよび／またはコバミド、ことに補酵素Ｂ１２の生合成に 関係する新規なポリペプチドに関する。本発明は、また、これらのポリペプチド の発現の原因となる遺伝子物質、ならびに遺伝子物質が調製することができる方 法に関する。最後に、本発明は、組み換えＤＮＡ技術による、コバラミン、より ことに補酵素Ｂ＋Ｚの産生を増幅する方法に関する。
ビタミンＢ１２はビタミンのＢ群に属する。それは水溶性ビタミンであり、悪性 貧血に悩む患者の処理を可能とする因子として同定された。
それは疲労した被検体において造血素を刺激するように一般に処方されるが、ま た、肝臓の疾患および神経欠損からなる多数の他の場合において、あるいは食欲 刺激剤または強壮活性をもつ活性成分として、ならびに皮膚科学において使用さ れる（Ｂｅｒｃｋ、１９８２、Ｆｒａｓｅｒｅｔ　ａｌ、　、１９８３）。非反 すう動物を飼う産業において、飼料は植物由来のタンパク質に基づき、飼料の１ 日量の中に飼料の１トン当たり１０〜１５ｍｇのビタミンＢＩ２を混入すること が必要である（Ｂａｒｒｅｒｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）。
ビタミン８１２はコバラミン（ｃｏｂａｌａｍｉｎｓ）として知られている分子 のクラスに属し、その構造は第１図に表されている。コバミドは低級ヌクレオチ ドの塩基においてコバラミンと異なり、このコバミドの塩基は５．６−シメチル ベンズイミダゾールではなく、他の塩基、例されるビタミンＢ１□−因子ＩＩＩ について５−ヒドロキシベンズイミダゾールである（Ｉｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８４）ｏこれらの構造の類似性は、コバラミンおよびコバミドの生合成の代 謝経路が、大部分について、共有されているという事実を説明する。
コバラミンは、はとんどもっばらバクテリアにより、複雑であり、まだよく理解 されていないプロセスに従い合成され、そのプロセスは４つの段階に分割するこ とができる（第２図）：ｉ）ウロポルフィリノゲンＩＩＩ　（またはウロ゛ゲン ＩＩＩ）の合成、次いで ｉｉ）ウロ゛ゲンＩＩＩのコピリン酸への転化、次いでＩ　Ｉ　Ｉ）コピリン酸 のコピナミドへの転化、およびｉｖ）特定の塩基を組み込んだ低級ループの構成 （コバラミンの場合において５．６−シメチルベンズイミダゾール）。
補酵素ＥＬｚについて、５′−デオキシアデノシル基の付加は、コリン環系の合 成後、短時間に起こるであろう（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ　ｅｔａｌ、　、１９８ ２）。
コバミドの場合において、低級塩基の合成および組み込みの工程のみが異なる。
コバラミンの生合成の最初の部分は非常によく知られている。なぜなら、それは ヘムの生合成ならびにクロロフィルの生合成に共通するからである（Ｂａｔｔｅ ｒｓｂｙ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８０）ｏそれは、順次に、δ−アミルブリネー トシンターゼ（ＥＣ２，３，１３７）　、δ−アミルブリネートデヒドラーゼ（ ＥＣ４，２，１，２４）およびウロ゛ゲンＩＩＩコシンターゼ（ＥＣ４，２，１ ，７５）　、これはスクシニル−ＣｏＡおよびグリシンをウロ゛ゲンＩＩＩに転 化する、を包含する。しかしながら、第１工程はある有機体［例えば、Ｅ、ｃｏ ｌｉ（Ａｖｉｓｓａｒ　ｅｔ　ａｌ　、１９８９）およびメタノジェニック（ｍ ｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ）バクテリア（Ｋａｎｎａｎｇａｒａ　ｅｔａ　１．． １９８９）　、例えば］において、マルチ酵素複合体によるグルタミン酸のδ− アミルプリン酸への転化により起こる。
ウロ′ゲンＩＩＩとコピリン酸との間において、わずかに３つの中間誘導体が今 日までに精製された。それらは因子ＦＩ、ＦＩＩおよびＦＩＩＩであり、これら は、それぞれ、３つの中間体プレコリン−１、プレコリン−２およびプレコリン −３の酸化産生物であり、これらはウロ′ゲンＩＩＩのモノ−、ジーおよびトリ メチル化誘導体に相当する（第３図）、これらの中間体はメチル基のＳＡＭ（Ｓ −アデノシル−Ｌ−メチオニン）からウロ°ゲンＩＩＩへの位置Ｃ−２、Ｃ−７ およびＣ−２０における連続的転移である。コピリン酸を産生ずる他の反応は、 ＳＡＭからＣ−１７、Ｃ−１２、Ｃ−１５およびＣ−５におけるメチル基の５つ のそれ以上の転移を別として、Ｃ−２０における炭素の排除、Ｃ−１２における 脱カルボキシル反応およびコバルト原子の挿入である（第４図）。これらの生合 成の工程は、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）またはクロストリジウム・チタノモルツム （Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）の細胞を含まない抽 出物について試験管内で実施した実験から推定されてきている。これらの抽出物 において、コピリン酸は、適当な嫌気性条件下にインキュベーション後、ウロ゛ ゲン■ＩＩの転化により得られる（Ｂａｔｔｅｒｂｙ　ｅ’ｔ　ａｌ、　、１９ ８２）。コバラミン産生バクテリアの抽出物との引き続くインキュベーションに よりコリノイドに転化することができるプレコリン−３とコピリン酸との間の中 間体は、今日まで分離されてきていない。これらの中間体を分離および同定する 困難は、 ｌ）それらのより大きい不安定性、 ｉｉ）酸素に対するそれらの感受性、およびｉ　ｉ　ｉ）それらの生体内蓄積の 低いレベル、のためであると思われる。この経路のこの部分において、シュード モナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃ ａｎｓ）のただ１つの酵素が精製されそして研究されてきている：それはＳＡＭ ：ウロ°　ゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（Ｂａｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａ ｌ、　、１９８９）であり、これはＳＵＭＴと呼ばれる。
コピリン酸とコピナミドとの間において、次の反応を実施する：ｉ）５゛　−デ オキシアデノシル基の付加（補酵素Ｂ１２が合成すべき化合物である場合）、 ｉｉ）アミン基の付加による７つのカルボキシル官能性の６つのアミド化、およ び ｉ　ｉ　１）（Ｒ）−１−アミノ−２−プロパツールの付加による最後のカルボ キシル官能性（ピロール環りのプロピオン鎖）のアミド化（第２図）。
アミド化のある順序が実際に存在するかどうかは説明されなかった（Ｈｅｒｂｅ ｒｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９７０）ｏ最後に、経路のこの部分における活性のアッ セイは、５′−デオキシアデノシル基の付加に関するものを除外して、記載され なかった（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８２）。
コバラミン、例えば、補酵素ＢＩ２の生合成の最後の工程は、第５図に記載する ４つの連続的相からなる（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ　ｅｔ　ａｌ。
、１９８２Ｌすなわち： ｉ）コピナミドのアミノプロパツール残基のヒドロキシル基のコピナミドホスフ ェートへのリン酸化、次いでｌｌ）グアノシン５°　−トリホスフェートとの反 応によりグアノシンジホスフェートの付加：得られた化合物はＧＤＰ−コピナミ ドであり（Ｆｒ　ｉｅｄｍａｎｎ、１９７５）　、これをｉ　ｉ　ｉ）リボフラ ビンからそれ自体合成した、５．６−シメチルベンズイミダゾールと反応させて 、アデノシルコバラミン５゛　−ホスフェートを産生ずる（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ 　ｅｔ　ａｌ、　、１９６８）、これは ｉｖ）脱リン酸化すると、補酵素Ｂ＋ｚに導（（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒ 　ｉｅｄｍａｎｎ、１９７２）。
コバラミンを産生ずることができるバクテリアのうつで、次のものをと（に述べ ることができる： アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ） アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍクロストリ ジウム・スチックランジイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　５ｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ ） クロストリジウム・チタノモルツム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｏｍ ｏｒｐｈｕｍ） クロストリジウム・テルモアセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｈｅｍｏａ （ｅｔ　ｉｃｕｍ） コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃ　ｔｅｒ　ｉ　ｕｍ）ＸＧフバクテリ ウム・リモスム（Ｆｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ　Ｉｉｍｏｓｕｍ） メタノバクテリウム・アルボフィリクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　 ａｒｂｏｐｈｉｌｉｃｕｍ）メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａｎｏｖ　ｉ　ｉ） メタノバクテリウム・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｒ ｕｍｉｎａｎｔ　ｉｕｍ） メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）メタノサルシナ・パルケリ （Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ　ｂａｒｋｅｒｉ） プロピオニバクテリウム・シエルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ） プロタミノバクテル骨ルベル（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ　ｒｕｂｅｒ） シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎ　ｉ　 ｔ　ｒ　ｉ　ｆ　１ｃａｎｓ）シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ　ｐｕｔｉｎａ）リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏ ｔｉ）ロドシュードモナス・ンヤエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍ。
スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ　ｐａｌｔｅｎｓｉ互） ストレプトミセス・アンチビチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｎｔ　１ｂ ｉｏｔ　１ｃｕｓ） ストレプトミセス・アラレオファシェンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｕｒ ｅｏｆａｃｉｅｎｓ） ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｇｒｉｓｅｕｓ） ストレプトミセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍ　ｃｅｓ　ｏｌｉｖａｃｅ ｕｓ） 工業的レベルにおいて、生合成のメカニズムの複雑さが大きい結果、コバラミン 、ことにビタミンＢ１２の産生はもっばら微生物学的である。
それはバクチリアンニードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉ積の培養 により実施される（Ｆｌｉｒｅｎｔ、１９８６）。工業的産生に使用する菌株は 野生型菌株から誘導される；それらはランダム突然変異の多数のサイクルおよび コバラミン産生のために改良されたクローンの多数の選択を実施することができ る（Ｆｌｏｒｅｎｔ、１９８６）。
突然変異は、突然変異誘発因子との突然変異誘発によるか、あるいは物理的処理 、例えば、紫外線による処理により得られる（Ｂ　ａ　ｒ　ｒａｒ　ｅｅｔ　ａ ｌ、　、１９８１）。この実験的方法により、ランダム突然変異は得られ、そし てコバラミンの産生を改良する。例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびロウセ ンハイム（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ）（１９６０、米国特許第２，９３８．８２２号 ）により最初に分離されたシュートモ前述の技術により、０．６ｍｇ／ｌから６ ０ｍｇ／ｌに徐々に増加したことが記載されている（Ｆｌｏｒｅｎｔ、１９８６ ）。プロピオニバクテリアについて、同一の産生値が文献に記載されているよう に思われる：例えば、６５ｍｇ／Ｉの産生は記載された（欧州特許第８７，９２ ０号）。しかしながら、コバラミンを過度に産生ずる突然変異またはコバラミン のそれらの産生を顕著に改良する突然変異の容易な選択または同一を可能とする スクリーンはまだ記載されていない。
遺伝子のレベルで、研究は今日までほとんど実施されてきていない。
ｃｏｂ遺伝子（生合成プロセスに関係する酵素をコードする）のクローニングは 巨大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において記載された（Ｂｒ ｅｙ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８６）、１１の相補的基は、巨大歯（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＤＮＡの異なる断片を有するプラスミドをもつ 巨大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅ　ｒ　ｉ　ｕｍ）のＣＯｂ突然変異の 化合物により同定された。これらの遺伝子は、１２ｋｂの断片により支持される 同一位置にグループをなす。
研究は、また、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ ｍ）のｃｏｂ遺伝子について実施された。これらのクローニングは記載されてき ていないが、コバラミン生合成のためのほとんどすべての遺伝子は染色体のマイ ニュート遺伝子の間で一緒にグループなっていることが示された（Ｊｅｔｅｒお よびＲｏｔｈ１１９８７）。ウロ′ゲンＩＩＩのプレコリン−２への転化を可能 としなくてはならない、ｃｙｓＧ位置のみは、遺伝子のこの群の一部分を形成し ない。しかしながら、この位置によりエンコードされる活性およびまたそに生化 学的性質は記載されてきていない。
巨大歯（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において、ｃｏｂ突然変異 は炭素源としてまたは窒素源としてエタノールアミンを有する最小培地上で成長 をもはや示さない（ＲｏｏｆおよびＲｏｔｈ、１９８８）。これはエタノールア ミンの異化の酵素、すなわち、エタノールアミンアンモニア−リアーゼ（ＥＣ４ ，３，１，７）はコファクターとして補酵素Ｂ１２を有する；且旦互突然変異は 補酵素Ｂ１２をもはや合成せず、そして炭素源としておよび／または窒素源とし てエタノールアミンでもはや成長することができる。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍ ｏｎｅｌｌａｔｙｐｈ　ｉｍｕｒ　ｉ　ｕｍ）のｒｎｅｔＥ突然変異は、メチル コバラミン依存性ホモシスティンメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２，１，１， １３）のみを保持する。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍ ｕｒｉｕｍ）ｍｅｔＥのｃｏｂ突然変異はメチオニンについて栄養要求変異種で ある（Ｊｅｔｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８４）。
シュードモナス中デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄて、コバラ ミンの合成の完全な欠如に関連する表現型は今日まで記載されてきていない。
最後に、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）についての研究（Ｃａｍｅｒｏｎｅｔ　ａｌ、　、１ ９８９）は、このバクテリアのｃｏｂ遺伝子を有するＤＮＡ断片のクローニング に導いた。これらは少なくとも３０ｋｂのＤＮＡが有する４つの相補性の群に分 布している。少なくとも１４の相補性の群が、アグロバクテリウム・ツメファシ ェンス（Ａｇｒｏｂａｃ−ドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ ｄａ）の異種相補性により同定された。
しかしながら、従来、これらの遺伝子のいずれも精製されず、そしてヌクレオチ ド配列は記載されてきていない。同様に、タンパク質の同定およびこれらの遺伝 子に起因する触媒機能は記載されてきていない。組み換えＤＮＡ技術によるコバ ラミンの産生は改良することができなかった。巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｍｅ ｇａｔｅｒｉｕｍ）のｃｏｂ遺伝子の増幅は、それらをクローニングした菌株に おいて、コバラミンの産生の改良を生じない（Ｂｒｅｙ　ｅｔ　ａｌ、、１９８ ６）。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）にお いて、研究したｃｏｂ遺伝子の強い転写が観察される条件を決定するために、生 理学的研究が実施されてきている。これらの条件下に、コバラミンの産生は存在 しないが、生合成経路の遺伝子あ標準の条件下より多く発現される。
本発明は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチド をコードするＤＮＡ配列の正確な同定から生ずる。それゆえ、本発明の主題は、 コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードす るＤＮＡ配列に関する。よりことに、本発明の主題は、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃ ｏｂＣ，ｃｏｂＤ、ｃｏｂＥ、ｃ。
ｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ，ｃｏｂｌ、ｃｏｂＪＳｃｏｂＫ、ｃｏｂＬ。
ｃｏｂＭ、ｃｏｂＮ、ｃｏｂｏ、ｃｏｂＱ、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ、ｃ。
旦Ｕ、旦旦旦Ｖ１旦旦旦Ｗ、ｃｏ旦Ｘおよび旦旦工Ａ遺伝子、遺伝暗号の同義性 から生ずるこれらの遺伝子と相同性、およびまたこれらのＤＮＡ配列またはこれ らのＤＮＡ配列の断片とハイブリダイゼーションしおよび／またはそれらと有意 の相同性を示し、そして）バラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係する ポリペプチドをコードする、ＤＮＡ配列（自然、合成または組み換え）。本発明 の主題は、また、これらのＤＮＡ配列を含有する遺伝子である。
本発明によるＤＮＡ配列は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 　ｐｕｔｄａ）のｃｏｂ突然変異の相補性；およびメタノバクテリウム・イバノ ビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｖａｎｏｖｉ　ｉ）の相補性により 誘導された、工業的菌株、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒ　ｉ　ｆ　ｉ　ｃａｎｓ）ＳＣ５１０から分離された 。得られたクローンは、正確に、とくにトランスポゾンＴｎ５の誘導体の挿入を 使用するマツピングにより分析することができた。これらの遺伝子研究は、ｃｏ ｂまたは一〇〇ｒ−遺伝子を制限地図上の局在化を可能としそしてこれらの配列 決定の実施を可能とした。次いで、オープンリーディングフレームの分析は、こ れらのＤＮＡ断片の解読領域の実証を可能とした。
本発明の主題は、また、他のバクテリアのｃｏｂ遺伝子をクローニングするため のこれらのヌクレオチド配列の使用である。事実、同一の活性を触媒するタンパ ク質について、配列は保存され、発散は発展する発散である（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｉ ｕｎｇ　ｅｔ　ａｔ、　、１９８５）ｏ本発明において、コバラミンおよび／ま たはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードする異なる微生物のヌク レオチド配列の間の相同性が存在することが示された。見られる差は発展する同 義性から、および研究する微生物のゲノムの中のＧＣの百分率に連鎖した遺伝暗 号の同義性から生ずる（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｉｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ　、１９８５）。
本発明によれば、とくにシュードモナス・デニトリフィカンス（ハのＤＮＡ配列 、またはこれらの断片を使用するか、あるいはコドンの使用および研究しようと するバクテリアのＤＮＡの中のＧＣの百分率に関して特定の程度の同義性を表す 同様な配列を使用して、プローブを作ることができる。これらの条件下に、プロ ーブと研究するゲノムのＤＮＡの断片との間の特定の／％（ブリダイゼーション シグナルを検出することができる；この特定のハイブリダイゼーションシグナル はプローブと〕くクチリアの等しい機能の艶遺伝子とのハイブリダイゼーシヨン に相当する。次いで、戯遺伝子ならびにそれらの産生物を分離し、精製し、そし て特性決定することができる。こうして、本発明は、ノ）イブリダイゼーション により、微生物のコバラミンおよび／またはコノくミドの生合成に関係するヌク レオチド配列およびポリペプチドへのアクセスを得ることのできる手段を提供す る。
本発明の主題は、また、コバラミンおよび／またはコノくミドの生合成に関係す るポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有する組み換えＤ ＮＡ、およびとくに前記１または２以上の配列が発現シグナルのコントロール下 に配置されている組み換えＤＮＡである。
これに関して、プロモーターの領域は、とくに、ＤＮＡ配列の５′末端に位置す る。強いバクテリアのプロモーター、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉのトリプトファンの オペロンＰｔｒｐまたはラクトースのオペロンＰＩｔｅｒｉａ）のファージの強 いプロモーター、グラム陰性バクテリアの機能的プロモーター、例えば、Ｅ、ｃ ｏｌｉのＰｔａｃプロモーター、ＴＯＬプラスミドのキシレン異化遺伝子のＰｘ ｙ　ｌ　Ｓプロモーターおよび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ） Ｐａｍｙのアミラーゼのプロモーターを使用するすることができる。酵母のグリ コール分解遺伝子から誘導されるプロモーターを、また、述べることができ、そ れらの例は次の通りである：ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド −３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ラクターゼまたはエノラーゼをコードす る遺伝子のプロモーター、これらは、組み換えＤＮＡを真核生物の宿主の中に導 入するとき、使用することができる。リポソーム結合部位は、また、ＤＮＡ配列 の５′末端に位置し、そして相同性または異種であることができ、例えば、バク テリオファージラムダのｃｌＩ遺伝子のリポソーム結合部位である。
次いで、本発明による組み換えＤＮＡを選択した発現シグナルと適合性の宿生細 胞の中に直接導入するか、あるいは問題のＤＮＡ配列を安定な方法で宿主細胞の 中に導入することができるプラスミドベクターの中にクローニングすることがで きる。
本発明の他の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポ リペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する、これにより得られたプラスミド に関する。さらに詳しくは、これらのプラスミドは、また、機能的複製系および 選択可能なマーカーを含有する。
本発明の主題は、また、上に定義した１または２以上のＤＮＡ配列、または前に 定義したプラスミドが導入された宿主細胞である。
本発明の他の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポ リペプチドを産生ずる方法に関する。この方法に従い、宿主細胞を前述のＤＮＡ 配列で形質転換し、この形質転換された細胞を前記配列の発現のための条件下に 培養し、次いで産生されたポリペプチドを回収する。
この目的に使用できる宿主細胞は、原核生物または真核生物、動物の細胞または 植物の細胞である。好ましくは、それらはバクテリア、ことに属大腸菌（Ｅ、ｃ ｏｌｉ）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ、ｃｌｅｎ　ｉ　ｔ　ｒ　 ｉ　ｆ　１ｅａｎｓ）　、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）またはりゾビウム・メリロチ（Ｒ，ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のバ クテリアから選択されるであろう。
本発明によるＤＮＡ配列の他の使用は、組み換えＤＮＡ技術による、コバラミン および／またはコバミドの産生の増幅法である。実際には、コバラミンおよび／ またはコバミドの生合成の代謝フラックスの制限が生合成経路の活性の制限のた めである場合、組み換えＤＮＡ技術（遺伝子の増幅、転写／翻訳シグナルとより 有効なシグナルとの置換など）を使用してこの同一の酵素の発現を増加すること によるこの活性の増加は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成の増加に 導くであろう。この場合において、調節された酵素に相当する１または２以上の ｃｏｂ遺伝子を特別に試験管内で突然変異誘発して、その産生物が産生の改良を 妨害する調節メカニズムを失った、突然変異された遺伝子を産生ずることができ る。
本発明による方法は、コバラミンおよび／またはコバミドを産生ずるか、あるい はこれらの化合物を部分的に産生ずる（すなわち、生合成の１または２以上の工 程を欠く）微生物を、上に定義したＤＮＡ配列で形質転換し、次いでこの微生物 を前記配列の発現およびコバラミンおよび／またはコバミドの合成のための条件 下に培養し、そして最後に産生されたコバラミンおよび／またはコバミドを回収 することにある。このような方法は、と（に、５および６ページに述べたすべて の産生的微生物、ｆａｃｉｅｎｓ属の微生物に適用可能である。好ましい実施態 様において、微生物はＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｌことに菌株５Ｃ５１０ である。潜在的に産生的な微生物に関すると、使用する配列はその微生物が実施 することができない生合成の工程に相当するものである。
本発明を使用して、そして前述の種々の方法により、コバラミンおよび／または コバミドの産生の改良はコバラミンおよび／またはコバミドを産生ずるか、ある いは部分的に産生ずる微生物について得ることができる。この微生物をコバラミ ンの産生および導入したＤＮＡ配列の発現に適当な条件下に培養することで十分 であろう。この培養はバッチ式で、あるいは連続的方法で実施することができ、 そしてコバラミンの精製は工業的に既に使用されている方法により実施すること ができる（Ｆｌｏｒｅｎｔ、１９８６）。これらの方法は、なかでも、次の工程 からなる： １）コバラミンの可溶化およびそれらのシアノ型への転化（例えば、発酵マスト （ｍｕｓｔ）を亜硝酸ナトリウムの存在下にシアン化カリウムとともに熱処理す る）１次いで １１）種々の工程における／アノコバラミンの精製、種々の工程の例は次のもの であることができる・ ａ）異なる基質、例えば、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲＣ−５０ 、ドウウエクス（Ｄｏｗｅｘ）ＩＸ２またはアンバーライトＸＡＤ−２上の吸着 、引き続く水／アルコールまたは水／フェノール混合物を使用する溶離、次いで ｂ）有機溶媒の中の抽出、および最後にＣ）試薬の添加または適当な溶媒の中の 希釈によるか、あるいは発現ベクターによる、有機相からの沈澱または結晶化。
本発明は、さらに、コバラミンを産生ずるバクテリアのコバラミンの産生を累積 改良により改良することが、組み換えＤＮＡ技術により、可能であることを示す 。これは、まず前述したように最初の改良を獲得し、次いでなお組み換えＤＮＡ 技術を使用して、すなわち、例えば、コバラミン生合成のための遺伝子を増幅す ることによって、この改良を改良することである。
本発明の他の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポ リペプチドポリペプチドに関する。と（に、本発明の主題は、前述のＤＮＡ配列 によりエンコードされ、そしてコバラミンおよび／またはコバミドの生合成経路 に関係する、すべてのポリペプチド、またはこれらのポリペプチドの誘導体また は断片である。これらのポリペプチドのアミノ酸配列、ならびにそれらの物理化 学的のい（つかを記載する。
酵素の活性または特定した性質は、また、それらの各々に関連する。
これに関して、本発明の主題は、プレコリン−３のコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミド への転化に参加する、よりことにメチル基のＳＡＭから位置Ｃ−１、Ｃ−５、Ｃ −１１、Ｃ−１５およびＣ−１７への転移に参加するポリペプチドである。
本発明の主題は、また、 ・コピリン酸のコピナミドへの転化に参加するか、あるいは・Ｓ−アデノシル− し−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフエラーゼ（ＳＰ２ＭＴ）活性 を有するか、あるいは・コピリン酸および／またはヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ− ジアミドシンターゼ活性を有するか、あるいは ・プレコリン−８Ｘムターゼ活性を有するか、あるいは・ニコチネート−ヌクレ オチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を 有するか、あるいは・コバラミン−５′　−ホスフェートシンターゼ活性を有す るか、あるいは ・コピリン酸配列特異的活性を有するか、あるいは・コブ（１）アラミンアデノ シルートランスフエラーゼ活性を有するか、あるいは ・プレコリン−６Ｘリダクターゼ活性を有するか、あるいはヒドロゲノビリン酸 ａ、Ｃ−ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転化に参加する、 ポリペプチドである。
有利には、本発明の主題は、第１５図、第１６図、第４０図、第４１図および第 ４７図に表わされているＣ０ＢＡ、Ｃ０ＲＡ、Ｃ０ＢＢ、Ｃ０ＢＤＳＣＯＢＥ、 Ｃ０ＢＦ、Ｃ０ＢＧＳＣＯＢＨ，Ｃ０Ｂｌ１ＣＯＢＪ、Ｃ０ＢＫ、Ｃ０ＢＬ、Ｃ ＯＢＭ、Ｃ０ＢＮ１ＣＯＢＯ，Ｃ０ＢＰ。
Ｃ０ＢＱ、Ｃ０Ｂ５．Ｃ０ＢＴ、Ｃ０ＢＵＳＣＯＢＶＳＣＯＢＷ、Ｃ０ＢＸおよ びＣ０ＲＡのタンパク質から選択されるポリペプチドである。
さらに、前述のハイブリダイゼーションプローブの使用は、他の微生物において 分離された遺伝子から、他の微生物の等しい機能的ポリペプチドを特性決定およ び分離することを可能とする。このようにして、本発明は、シュードモナス・デ ニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ、ｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉＮｃａｎｓ）の ＣＯＢタンパク質の配列が同一の型の活性を表す他の微生物のタンパク質配列と 有意に相同性であることを示す。異なる微生物において同一反応を触媒するこれ らのＣＯＢタンパク質の間において、他の進化する距離のみは導入された変異型 を有する（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｌｉｕｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８５）ａ本発明の 主題は、また、これらの等機能のポリペプチドである。
特定の酵素活性の帰属は、種々の方法に従い実施することができる分析の結果で ある。とくに、ＳＡＭ　（Ｓ−アデノシル−し−メチオニン）に関する試験管内 親和性の研究は、メチルトランスフェラーゼ活性をＳＡＭに結合できるタンパク 質への帰属、それゆえウロ°ゲンＩＩＩとコピリン酸との間に存在するメチル基 の転移の工程の１つへのその関係の帰属を可能とする。これらのポリペプチドの 活性を評価する他の手段は、これらのポリペプチド（相補的実験により同定され た）を発現することができない突然変異の中に蓄積するコバラミンの生合成経路 における中間体をアッセイすることにある。これらの分析により、問題のポリペ プチドがその基質として蓄積された中間体を有し、これにより生合成経路の中に その活性を位置させかつ定めることができることを推定することができる。本発 明は、また、コバラミンおよび／またはコバミドを産生する菌株に適用できる、 生合成経路の酵素活性をアッセイする方法を記載する。これらのアッセイにより 、これらの化合物を産生ずる菌株からアッセイした酵素活性を精製することがで きる。この精製された活性から、問題のＣＯＢタンパク質のＮＨ２末端配列、あ るいはこのタンパク質のサブユニットのそれを決定することができ、これにより 問題の活性をコードする１または２以上の構造遺伝子を同定することができる。
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒ ｉ　ｆ　１ｃａｎｓ）について、生合成経路の活性をコードする構造遺伝子は、 各ＮＨ２末端配列について、同一のＮＨ２末端配列を有するＣＯＢタンパク質を 見いだすことによって同定される。
本発明は、また、コバラミンまたは他のコリノイドの生合成経路における中間体 を同定し、そしてコバラミンを産生ずる菌株においてアッセイする方法を記載す る。これらの中間体は培養マストおよび細胞それら自体の両者においてアッセイ することができる。アッセイできる中間体は、生合成経路においてコピリン酸の 後に存在するすべてのコリノイド、すなわち、コピリン酸を別として、コピリン 酸モノアミド、コピリン酸ジアミド、コピリン酸トリアミド、コピリン酸テトラ アミド、コピリン酸ペンタアミド、コビル酸、コピナミド、コピナミドホスフェ ート、ＣＤＧ−コピナミド、補酵素ＢＩ２ホスフェートおよび補酵素Ｂ１２であ る。
これらの産生物の非アデノシル化形態は、また、この技術によりアッセイするこ とができる。
本発明の他の主題および利点は、以下の実施例および図面を読むと明らかにとな るであろう。これらの実施例および図面は例示であるかつ非限定的であると考慮 すべきである。
使用する用語および略号の定義 ＡＴＰ　アデノノル５゛−トリホスフェートｂｐ：　塩基対 ＢＳＡ：　ウシ血清アルブミン ＣＡＤＡＳ　：　コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼクラスター、　遺伝子 の群 Ｃａｂ　コバラミンの産生のレベルが減少した（対照より少なくとも１０倍低い ）表現型対応するｃｏｂ遺伝子　ウロ′ゲンＩＩＩからのコバラミンおよび／ま たはコバミドの生合成に関係する遺伝子 ＣＯＢタンパク質：　コバラミンの生合成経路における触媒として、あるいはｃ ｏｂ遺伝子の調節のネットワークにおける調節タンパク質として、あるいは両者 として参加するタンパク質 ｃｏｒ遺伝子：　ウロ゛ゲンＩＩＩからのコリノイドの生合成に参加する遺伝子 ＣＯＲタンパク質：　コリノイドの生合成経路における触媒として、あるいはｃ ｏｒ遺伝子の調節のネットワークにおける調節タンパク質として、あるいは両者 として参加するタンパク質 コリノイド：　コリン環系を有するコピリン酸誘導体ｄＧＴＰ　：　２’　−デ オキシグアノシン５°　−トリホスフェート ＤＭＢＩ：　ジメチルベンズイミダゾールｄＮＴＰ　：　２’　−デオキシリボ ヌクレオシド５°　−トリホスフェート ＤＴＴ　＋　ジチオスレイトール ＨＰＬＣ：　高性能液体クロマトグラフィーｋｂ：　キロ塩基 ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴ：ニコチネート−ヌクレオチド：ジメチルベンズイミダ ゾールホスホリポシルトランスフェラーゼ ○ＲＦ：　オープンリーディングフレーム組み換えＤＮＡ　：　自然にそのよう に組み合わせられていない同一の微生物のＤＮＡ配列内の組み合わせ、あるいは ＤＮＡ断片の特異的突然変異を可能とする技術の組ＳＡＭ：　Ｓ−アデノシル− し−メチオニンＳＤＳ　：　ドデシル硫酸ナトリウム ＳＰ２ＭＴ・　ＳＡＭ−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフエラ ーゼ 停止コドン：　翻訳停止コドン ＳＵＭＴ：　ＳＡＭ：ウロ′ゲンＩＩＩメチルトランスフエラーゼ ウロ゛ゲンＩＩＩ：　ウロポルフィリノゲンＩＩＩ断片に対する凡例 第１図：補酵素Ｂ、□の構造＝５゛　−デオキシアデノシル基がメチルコバラミ ンについてＣＨ３により、ジアノコバラミンについてシアン基により、ヒドロキ ソコバラミンについてヒドロキシル基により置換されている。
第２図：コバラミンの生合成およびこの生合成の種々の工程。Ｘ：コバルトの軸 方向のリガンド：ａにおけるリガンドはｂにおけるリガンドと異なることがある 。Ｒ：コバラミン型を定めるコバルトのａにおけるリガンド（参照、第１図）。
第３図、ウロ゛ゲンＩＩＩ、プレコリン−１、プレコリン−２およびプレコリン −３の構造。
第４図・ウロ′ゲンＩＩＩおよびコピリン酸の構造式。ウロ゛ゲンＩＩＩとコピ リン酸との間に、Ｃ−２、Ｃ−７、Ｃ−２０、Ｃ−１７、Ｃ−１２、Ｃ−１、Ｃ −１５およびＣ−５における連続的な８つのＳＡＭ依存性メチルの転移、Ｃ−１ ２において脱カルボキシル反応、Ｃ−２０における炭素の排除およびコバルト原 子の挿入が存在する。Ｘ：コバルトの軸方向のリガンド；ａにおけるリガンドは ｂにおけるリガンドを異なることがある。
第５図：コバラミンの生合成の最終工程。線図を明瞭にするために、コリン環系 の詳細は省略されている。５つの酵素工程が表されている＝１、コピナミドキナ ーゼ、２．コピナミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼ、３　コバラミ ン−５°−ホスフェートシンターゼ；４、コバラミン５゛−ホスフェートホスホ ヒドラーゼ：５．ニコチネートヌクレオチド：　ＤＭＢＩホスホリボンルトラン スフェラーゼ。
第６図＋５．４ｋｂのＣｌ　ａ　ｌ−Ｈｌｎｄ　Ｉ　Ｉ　ｌ−Ｈｌ　ｎｄ　Ｉ　 Ｉ　Ｉ　−ＨｌｎｄｌＩ　Ｌ　８．７ｋｂの旦ｃｏＲＩ、４７４８ｂｐのＳａ± Ｉ一旦見↓Ｉ一旦Ａ±Ｉ一旦見↓Ｉ一旦見±■一旦呈±Ｉおよび３８５５ｂｐの 旦且杏Ｉ一旦且±Ｉ一旦且ｍＨＩの断片の制限地図。ＤＮＡの切断の頻度が最も 少ない２０の制限酵素を示す。各酵素の切断部位は垂直線ａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉ ｆｉｃａｎｓ）の５３７８ｂｐのＣ１ａｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ−ＨｉｎｄＩＩ　ｌ −ＨｌｎｄＩＩ　Ｉの両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は５゛か ら３°に左から右の方向に読まれるべきであり、これは第６図に表す配列決定し た断片の左から右の向きに相当する。ＣｌａＩ部位は位置２３（切断部位の開始 ）に存在する。なぜなら、この配列において、配列決定を満て多数の部位におけ るクローの両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は５°から３゛に左 から右の方向に読まれるべきであり、これは第６図に表す配列決定した断片の左 から右の向きに相当する。
トン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２ ）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分 析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停 止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に 配置されているフレームである。
１　ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１２００に延びる配列。この分析により、オ ーブンリーディングフレーム１が同定される。それは位置５４９におけるＡＴＧ において開始し、そして位置１０１１におけるＴＧＡにおいて終わる。
２、ヌクレオチド１０００〜ヌクレオチド２２００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム２が同定される。それは位置１１４１におけ るＡＴＧにおいて開始し、そして位置１９８１におけるＴＧＡにおいて終わる。
３、ヌクレオチド１８００〜ヌクレオチド３４００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム３が同定される。それは位置１９８０におけ るＡＴＧにおいて開始し、そして位置３２８２におけるＴＧＡにおいて終わる。
４、ヌクレオチド３０００〜ヌクレオチド４５００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム４が同定される。それは位置３２８１におけ るＡＴＧにおいて開始し、そして位置４２８０におけるＴＧＡにおいて終わる。
５、ヌクレオチド３８００〜ヌクレオチド５３７８に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム５が同定される。それは位ｆｆ１１４２８４ におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置５２５３におけるＴＧＡにおいて終 わる。
第１０図：　８７５３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片の６つのリーディングフレームにつ いてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレー ムの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフ レームは、停止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率 の線より下に配置されているフレームである。
１−、ヌクレオチド６５０〜ヌクレオチド１６５０に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム６が同定される。それは位置７３６における ＡＴＧにおいて開始し、そして位置１５１９におけるＴＧＡにおいて終わる。
２、ヌクレオチド１４００〜ヌクレオチド３１００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム７が同定される。それは位置１６２０におけ るＡＴＧにおいて開始し、そして位置２９９７におけるＴＧＡにおいて終わる。
３、ヌクレオチド２７００〜ヌクレオチド３７００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム８が同定される。それは位置３００２におけ るＡＴＧにおいて開始し、そして位置３６３２におけるＴＧＡにおいて終わる。
４、ヌクレオチド３５００〜ヌクレオチド４１００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム９が同定される。それは位置３６３１におけ るＡＴＧにおいて開始し、そして位置４３６６におけるＴＧＡにおいて終わる。
５、ヌクレオチド４１５０〜ヌクレオチド５１５０に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム１０が同定される。それは位置４３６５にお けるＡＴＧにおいて開始し、そして位置５１２７におけるＴＧＡにおいて終わる 。
６　ヌクレオチド５０００〜ヌクレオチド６０００に延びる配列。この分析によ り、オープンリーディングフレーム１１が同定される。それは位置５８９３にお けるＡＴＧにおいて開始し、そして位置５１１０におけるＴＧＡにおいて終わる 。
７　ヌクレオチド５７００〜ヌクレオチド７２００に延びる配列。この分析によ り、オーブンリーディングフレーム１２が同定される。それは位置５８６２にお けるＡＴＧにおいて開始し、そして位置７１０１におけるＴＧＡにおいて終わる 。
８　ヌクレオチド７０００〜ヌクレオチド８０００に延びる配列。この分析によ り、オープンリーディングフレーム１３が同定される。それは位置７１７２にお けるＡＴＧにおいて開始し、そして位置７９３１におけるＴＧＡにおいて終わる 。
第１１図ニブラスミドｐＸＬ５５６、ｐＸＬ５４５およびｐＸＬ６２３の構成。
見立ｂＡおよび旦旦丸Ｅを含有する２、４ｋｂのＣ１ａｒ−ＥｃｏＲＶを５．４ ｋｂの断片から切除し、次いで精製する。ＥｃｏＲＩリンカ−をＥｃｏＲＶ部位 に付加し、次いでこの断片をＣ１ａ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩ部位の間のｐＸＬ５９の 中に挿入する。これにより構成されたプラスミドをｐＸＬ５５６と表示する。
この構成体はｐＸＬ５４５に匹敵する：１．９ｋｂの見上ａＩ−Ｈ±ｎｄＩ　ｒ 　ｌ−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片を５．４ｋｂの断片から切除し、次いで精製する 。ＥｃｏＲＩリンカ−をＨｊｎｄｌＩＩ部位に付加し、次いでこの断片をＣ１ａ Ｉ−ＥｃｏＲＩ部位の間のｐＸＬ５９の中に挿入する。
ｐＸＬ６２３は次のようにして構成する：２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ 　Ｔ　Ｉ断片を５．４ｋｂの断片から切除し、次いで精製し、次いで末端をＥ、 ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片でフィルインする。この断片をＥ ｃｏＲＩで消化したｐＰＫ２９０　（Ｄ　ｉ　ｔ　ｔ　ａｅｔ　ａｌ、　、１９ ８１）の中にクローニングし、次いでＥｃｏＲＩリンカ−をＨｉｎｄＩ　Ｉ　１ 部位に付加し、次いでＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で処理 して、末端をフィルインする。
括弧内に示す制限部位は、Ｅ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で 処理後消失した部位に相当する。
ＨＩ断片（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）；３゜第１２ 図：トランスホゾ：、ｚＴｎ５ｓｐ’およびＴｎ５の５３７８ｂｐの断片の中へ の挿入の研究。プラスミドｐＸＬ６２３の中のトランスポ体の中のトランスポゾ ンＴｎ５Ｓｐ’の挿入はボックスで囲まれている。カナマイシン抵抗性遺伝子（ １６３０および１６３１）を有するカッセトの５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の染色体の 中の挿入は、カナマイノン抵抗性遺伝子の転写の向きに従い、矢印で挿入番号の 下に示す。配列から推定されたオーブンリーディングフレームはこの図面に記載 されている（ｃ　ｏ　ｂＡからｃｏｂＥに）；＋または−のしるしは、トランス ポゾンまたは抵抗性カッセットの各挿入の下に、挿入が不活性化（−）またはそ うでない、すなわち、異なる突然変異の相補性について（トランスポゾンＴｎ５ の挿入の場合）、こと、あるいは挿入がコバラミンの産生が起こる菌株のその産 生を壊滅することを示すために示されている。組み換えの突然変異がその突然変 異を産生ずる菌株の合成レベルより３倍すくないコバラミンを合成するとき、相 補性は存在しない。プラスミドｐＸＬ５４５、ｐＸＬ１５００．ｐＸＬ１３９７ およびｐＸＬ３０２のインサートは、それらの末端に存在する制限部位で示され ている。これらのインサートを広い宿主範囲のプラスミド、ｐＸＬ４３５および ｐｘＬ５９の中にクローニングする（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８ ９）。
ｐＸＬ５４５は第１１図に記載するプラスミドｐＸＬ５４５に相当し、さらに、 ｐＸＬ５４５のＢａｍＨＩ部位においてクローニングされたスペクチノマイシン 抵抗性遺伝子を含有するｐＨＰ４５の２ｋｂのＢａｍＨＩ断片（Ｐｒｅｎｔｋｉ およびＫｒ１ｓｃｈ）を有するニブラスミドｐＸＬ１５００は、この断片に表さ れている４、２ｋｂの旦ｇｌｌｌ−３ｓｔＩ断片に相当し、第３０図に表されて いるｐＫＴ２３０　（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）の ＢａｍＨ■および５ｓｔＩ部位においてクローニングされている；プラスミドｐ ＸＬ１３９７はこの図面に示す２．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−３ｓｔＩに相当し 、第３０図に記載するｐＸＬ４３５　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９ ８９）のマルチ部位のＨｉｎｄＩＩＩおよび５ｓｔＩの間に挿入されている；プ ラスミドｐＸＬ３０２はこの図面に記載する２、３ｋｂの旦旦旦ＲＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片に相当し、第３０図に記載するｐＸＬ５９　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅ　 ｔ　ａ　１．．１９８ｐＸＬ７２３は、ｐＸＬ５４５ど同様に、第１１図に記載 されている。
十または−は、これらのインサートの各々の上に、下に示す染色体の挿入の問題 のプラスミドによる相補性が存在するかどうかを示す。Ｃ１ｐ上ａＩ；Ｅ１旦ｃ ｏＲＩ　；Ｈ，ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　；ＲＶ、旦ｃｏＲＶ；Ｓａｕ、５ａｕ３Ａ Ｉ　；Ｓ、５ｓｔＩ。
第１３図ニブラスミドｐＸＬ２５３およびｐＸＬ３６７の構成。８゜７ｋｂのＥ ｃｏＲＩ断片を切除し、次いでプラスミドｐＸＬ１５１から精製する。それをｐ ＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングしてｐＸＬ２５３を生成する 。この同一断片をｐＲＫ２９０　（Ｄ　ｉ　ｔ　ｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８ １）のＥｃｏＲ１部位に挿入してｐＸＬ３６７を生成する。１、Ｒ３ＦＩＯＩＯ の旦互工■一旦且↓ｌＤＮＡ断片（Ｄｅ　Ｇｒａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７ ８）；２、ｐＡＣＹＣ１７７のＰｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片（Ｂａｇａ ｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）；ｏｒ±、複製起源：ユ土旦、 緩和部位；二す、移動化に必須な位置（Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ 、、↓ｎｄｌ　ＩＩ　；ＰＳＰｓｔｌ；Ｓ、５ｓｔｌ　；Ｓａ、Ｓａ±１．Ｘ、 Ｘｈｏｌ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；ｔｅｔ’　、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；Ｋｍ ’　、カナマイシン抵抗性遺伝子。
第１４図：ｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８０）の中にク ローニングした８、７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の中へのトランスボいである。配列 から推定されたオーブンリーディングフレーム（ｃｏｂＦ−ｃｏｂＭ）はこの図 面に記載されており、そして不活性化挿入の８つの群（１〜３の番号）が表され ている；十または−のしるしは各トランスポゾンの挿入の下に示されており、挿 入が異なる突然変異の相補性について不活性化（−）またはそうでなければ（＋ ）であることを示す。
組み換えの突然変異がその突然変異を産生ずる菌株の合成レベルより３倍すくな いコバラミンを合成するとき、相補性は存在しない。不活性化挿入のこれらの群 は次の突然変異に相当する：１、Ｇ６１５：２、Ｇ６１４およびＧ６１．６：３ 、Ｇ６１３およびＧ６１４；４、Ｇ６２０；５、Ｇ６３８；６、Ｇ６１０および Ｇ６０９ニア、Ｇ６１２＋８、Ｇ６１１゜これらの突然変異は既に記載されてい るアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕ ｍｅｆａｃｊｅｎｓ）のＣｏ　ｂ突然変異である。８．７ｋｂの断片の制限地図 はこの図面の下部に記載されている。
第１５図　それぞれ、５．４ｋｂの断片、−ｉ旦カーＡ−見立互Ｅ１の遺伝子の 各の解読配列かが示されている。これらの配列によりエンコードされるタンパク 質Ｃ０ＢＩ−ＣＯＢＢの配列は、それぞれの解読配列、仝ｏｂＡ−ｃｏｂＥの下 に見える。Ｃ０ＢＡ−ＣＯＢＥの、それぞれ、番号および百分率の、各タンパク 質のアミノ酸組成、ならびに分子量、極性指数、等電点および１ｍｇ／ｍｌの精 製したタンパク質を含有する溶液の２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける光学密 度が表されている。
それぞれ、各Ｃ０ＢＡ−ＣＯＢＥタンパク質の親水性プロフィルが示されている ；それはホップ（Ｈｏｐｐ）およびウソヅ（Ｗｏｏｄｓ）（１９８１）のプログ ラムに基づいて計算された。正の値は親水性であるタンパク質の領域に相当する 。アミノ酸の位置は横座標として示されており、親水性指数の値は縦座標として 示されている；この値が正であるとき、これはタンパク質の領域が親水性である ことを示す。
第１６図：それぞれ、８．７ｋｂの断片、ｃｏｂＦ−ｃｏｂＭ、（Ｄ遺伝子の各 の解読配列が示されている。これらの配列によりエンコードされるＣＯＢＦ−Ｃ ＯＢＭの配列はそれらの配列の下に見える。凡例は第１５図についての凡例と同 一である。注。Ｃ０ＢＦは位置７３６に位置するＡＴＧにおいて開始するとして 示した：位置７５１に位置するＡＴＧはこのタンパク質の真の開始コドンである 。
第１７図：コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼにより触媒される反応。ＣＡ ＤＡＳは、コピリン酸の周辺のアセテート鎖ａおよびＣのカルボン酸官能性をア ミド化してコピリン酸ジアミドを生成する反応を触媒する；酵素試験において使 用するアミン基のドナーはＬ−グルタミンである；それは脱アミン反応のときＬ −グルタミン酸を生成する。Ｘはコバルトの軸方向のリガンドであり、互いに異 なることができる。
第１８図　ＳＰ２ＭＴにより触媒される反応。ＳＰ２ＭＴはメチルがＳ、八Ｍか らノヒドロノロヒドロコリンまたはプレコリン−２に転移してプレコリン−３を 生成する反応を触媒する。メチル基はポルフィリン環系の位置Ｃ−２０に転移さ れる。
第１９図　ヒドロゲノビリン酸およびヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドの構 造。
第２０図　ＳＡＭに対するＣ０ＢＡおよびＣ０ＢＦの親和性。曲線は、このカラ ムに適用した各タンパク質についてのＴＳＫ−１２５カラムから出る放射能を任 意の単位で与える。保持時間は分で示し、そして遊離ＳＡＭに相当する放射能の ピークは１０分３０秒の時間で観測である。
第２１図：　Ｃ０ＢＡおよびＣ０ＢＩの配列の比較。強い相同性の領域１．２お よび３のみが表されている。＝のしるしは同一残基の間に配置され、そして−の しるしは相同性の残基の間に配置されている（ＨＫＲ。
Ｌ　ＩＶＭ、ＡＧＳＴ、ＹＦＷ、ＤＥＱＮＢＺ、Ｐ、Ｃ）。
第２２図　ンユードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のタンパク質Ｃ０ＢＡおよびＥ。
ｃｏｌｉのＣＹＳＧの一次配列の比較。整列はカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）、 １９８４のプログラムに従い実施した。＝のしるしは同一残基の間に配置され、 そして−のしるしは相同性の残基の間に配置されていル（ＨＫＲＳＬ　ＩＶＭＳ ＡＧＳＴ、　ＹＦＷ、　ＤＥＱＮＢＺ、　Ｐ、　Ｃ）。
第２３図＼Ｅ、ｃｏｌｉのＣＹＳＧとシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣ０Ｂ９ンバク’ｌ　 （ＣＯＢＡ、Ｃ０ＢＦ、Ｃ０ＢＩ、Ｃ０ＢＪ、Ｃ０ＢＬおよびＣＯＢＭ）との配 列の比較。比較は、ＣＹＳＧ、Ｃ０ＢＡおよびＣ０ＢＩの間に存在する、強い相 同性の領域１．２および３に関する。
相同性を示す領域のタンパク質の配列の中の位置はこの図面に表されている。相 同性残基の次の群を考慮した：ＨＫＲＳＬＩＶＭ、ＡＧＳＴ、ＹＦＷ、ＤＥＱＮ ＢＺＳＰ、Ｃ０同一位置における少なくとも３つの相同性残基が存在する場合、 これらのアミノ酸をボックスで囲んだ。
第２４図ニブラスミドｐＸＬ１１４８およびｐＸＬ１１４９の構成。
ｐＸＬ１１４８は次のようにして構成する：ｃｏｂＨおよび見立±■を含有する ８、７ｋｂのの１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｂａｍ、ＨＩ−Ｓｓ　ｔｆ−Ｓｓｔｌ 断片を精製し、そしてＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩリンカ−を、それぞれ、Ｂａｍ ＨＩおよび５ｓｔＩ末端に配置する。次いで、この断片を広い宿主範囲のプラス ミドｐＸＬ５９（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔａｌ、　、１９８９）のＸｂａｌおよび 旦ｃｏＲＩ部位の間に挿入して、プラスミドｐＸＬ１１４８を生成する。
ｐＸＬ１１４９はｐＸＬ１１４８ど同様に構成が、ただし最初に精製した断片は ｐＸＬ１１４８のために使用した小さい４００ｂｐの旦且工■断片をさらに含有 する断片の代わりに１．５ｋｂののＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−３ｓｔｌ断片であ る。次いで、断片を同一の処理に付し、そして同じようにｐＸＬ５９の中にクロ ーニングする。
１、Ｒ８ＦＩＯＩＯ（Ｄｅ　Ｇｒａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７８）のＰｓ± ｌ−５ｓｔｌ断片；２、ｐＡｃＹｃ１７７　（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　 ａｌ、　、１９８１）のＰｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片；３．１ａｃＺのプロモ ーター、オペレーター、翻訳開始部位および最初の８つの非必須コドンをもたな いＥ、ｃｏｌｉのラクトースオペロンを含有１９８３）：４、ンユードモナス・ プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｄａ）ＫＴ２４４０の５ａｕ３ＡＩ断片 （Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）；旦工工、複製起源： ユ上旦、緩和部位；Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝子：工旦互、移動化に必須 な位置（Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）；Ｂ、旦ａｍ Ｈ１，Ｃ，Ｃ±ａＩ；Ｅ、旦ｃｏＲＴ　；Ｈ，ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　；Ｐ、Ｐｓ ｔＩ：ｓ、旦ｓｔｒ；Ｓａ、Ｓａ±Ｉ　；Ｘ、ＸｈｏＩ　；Ｘｂ、Ｘｂａｌ。
第２５図、記載したように１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥの中で精製した菌株５Ｃ５ １０Ｒｉｆ’、５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’ｐＫＴ２３０．５Ｃ５１０Ｒ，ｉｆ’ｐＸ Ｌ１１４８．５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’ｐＸＬ１１４９゜バクテリアをＰＳ４培地の 中で４日間培養し、次いで全体のタンパク質のリゼイトを作った。レーン１．５ Ｃ５１０Ｒｉｆ’；レーン２．５Ｃ５１０Ｒ４ｆ’ｐＸＬ１１４９　；レーン３ ．５Ｃ５１０Ｒｉｆ’ｐＸＬ１１４８；レーン４．５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’ｐＫＴ ２３０．分子量のマーカーの分子量を示す。Ｃ０ＢＩおよびＣ０ＢＨタンパク質 が移動する位置を示す。
第２６図ニブラスミドｐＸＬ１４９６およびｐＸＬ１５４６の構成。
プラスミドｐＸＬ１４９６はＥ、ｃｏｌｉの中のＣ０ＢＦタンパク質の過度の発 現を可能とし、そしてプラスミドｐＸＬ１５４６はシュードモナス・デニトリフ ィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｃｌｅｎｉｔｒｉ２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ −Ｘｈｏｌ断片を切除し、そして８．　７ｋｂの断片を精製する。それをファー ジＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩにおいてクローニングしてプラスミドｐＸＬ４０ ５を生成する。次いで、Ｎｄ然変異により導入する：このようにして、ＮｄｅＩ 部位はｃｏｂＦ遺伝子の仮定した開始コドン上で正確に存在する。これにより得 られた新しいプラスミドをｐＸＬ１４０６と表示する。１．５ｋｂのＮｄｅｒ− ＳｓｔＩ−８ｓ±Ｉ断片は、その仮定した開始コドンから出発するｃｏｂＦ遺伝 子を含有し、適当な酵素で部分的に消化した後、精製し、そしてプラスミドｐＸ Ｌ６９４の適当な断片と結合する（Ｅ、ｃｏｌｉの発現シグナルを含有する１２ ０ｂｐの見立旦ＲＩ−ＮｄｅＩ断片−テキストを参照−およびアンピシリン抵抗 性遺伝子、このプラスミドの複製機能およびまたＥ、ｃｏｌｉのｒ　ｒｎＢオペ ロンのターミネータ−を含有する３、１ｋｂの旦見立ＲＩ−見立ｈｆ断片、この テキストに記載されている）。これにより構成されたプラスミドをｐＸＬ１４９ ６と表示する。
ｐＸＬ１５４６は次のようにして構成する：ｐＸＬ１４９６の２ｋｂの旦ｃｏＲ Ｉ−ＢａｍＨＩ一旦ａｍＨＩ断片を適当な酵素で部分的に消化して精製する；こ の断片はＥ、ｃｏｌｉの発現シグナル、引き続いてｃｏｂＦ遺伝子および次いで ｃｏｂＧ遺伝子を含有し、この部分それ自体の次に、このテキストに記載するよ うに、Ｅ、ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネータ−が存在する。この断片 を第３０図に記載するようにマルチ宿主プラスミドｐＫＴ２３０（Ｂａｇｄａｓ ａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）の中にクローニングする。Ｂ、Ｂａｍ ＨＩ　；Ｃ１旦土ａＩ　；Ｅ、ＥｃｏＲＩ　；Ｈ，Ｈｉｎｄｌ　Ｉ　Ｉ　；ＰＳ Ｐｓｔｌ　：Ｓ。
５ｓｔｌ；Ｓａ、５ｓｔＩ；Ｘ、Ｘｈｏｌ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；Ｋｍ’、カナマイ シン抵抗性遺伝子；Ａｍｐ、アンピシリン抵抗性遺伝子。
第２７図：記載したように１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥの中で分析した５Ｃ５１０ Ｒｉｆ’、５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’ｐＫＴ２３０．５Ｃ５１０Ｒｉｆ′ｐＸＬ１． ５４．６の全体のタンパク質。バクテリアをＰＳ４培地の中で４日間培養し、次 いで全体のタンパク質のリゼイトを作った。レーン１．５Ｃ５１０Ｒ４ｆ’；レ ーン２．５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’ｐＫＴ２３０　；レーン３．５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ ’ｐＸＬ１５４６゜分子量マーカーの分子量を示す。Ｃ０ＢＦタンパク質が移動 する位置を示す。
第２８図：記載したように１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥの中で分析した菌株臥　ｃ ｏｌｉおよびＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ　ｐＸＬ１４９６の全体のタンパク質。レーン１ １　トリプトファンの不存在下に培養したＥ、ｃｏｌ±　ｐＸＬ１４９６　；レ ーン２、トリプトファンの存在下に同一条件下に培養したＥ、ｃｏｌｉ　ｐＸＬ １４９６；レーン３、トリプトファンの不存在下に培養したＥ、ｃｏｌｉ；レー ン４、トリプトファンの存在下に同一条件下に培養したＥ、ｃｏｌｉａ分子量マ ーカーの分子量を示す。Ｃ０ＢＦタンパク質が移動する位置を示す。
第２９図、プラスミドｐＸＬ５２５およびｐＸＬ３６８の構成。プラスミドｐＸ Ｌ３６８は次のようにして構成する＋２．４ｋｂのＥｃｏＲＶ−Ｃ１ａｌ断片（ ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有する）をプラスミドｐＸＬ５５６から精製 し、これにより末端にＢａｍＨ１部位およびＸｂａ１部位をもつこの断片を得る ことができる：この断片をｐＸＬ２０３のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位の中に クローニングする。
ｐＸＬ５２５の構成のために、ＸｂａＴリンカ−を８．７ｋｂの旦且ｏＲＩ断片 の右の末端に位置するＥｃｏＲ１部位に付加する：次いでこｔ））８．７ｋＭ） ＥｃｏＲＩ　−ＸｂａＩ断片を、ｐＸＬ５５６から由来しそしてｃｏｂＡおよび ｃｏｂＥを含有する２、４ｋｂのＥｃｏＲｉ−Ｘ括弧内に示す制限部位は、Ｅ、 ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■の大きい断片で処理後消失した部位に相当する 。
１、Ｒ３ＦＩＯＩＯ（Ｄｅ　Ｇｒａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７８）のＰｓｔ ［−３ｓ±Ｉ：２、ｐＡｃＹｃ１７７　（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ 、　、１９８１）のＰｓ±Ｉ一旦ａｍＨＩ断片：旦工工、複製起源：ユ１旦、緩 和部位：工旦ｌ、移動化に必須な位置；Ｋｍ’　、カナマイシン抵抗性遺伝子； （Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１）；　Ｂ、ＢａｍＨＩ　 ；Ｃ，Ｃ１ａ　Ｉ　；ＥＳＥｃｏＲＩ　；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ；ＰＳＰｓｔＩ； Ｓ、Ｓｓ杏ｒ　；Ｓａ、ＳｓｔＩ：Ｘ、ＸｈｏＩ　；Ｘｂ、ＸｂａＩ　；　ｔｅ ｔ、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；Ａｍ　ｐ　Ｉ！およびＡｍｐ、アンピシリ ン抵抗性遺伝子。
第３０図ニゲラム陰性バクテリアにおいて広い宿主範囲を有する不適合性群Ｑの プラスミド。これらのプラスミドは前の刊行物（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 　、１９８９）に記載されており、そして本発明において使用する。
１、Ｒ８ＦＩＯＩＯ（Ｄｅ　Ｇｒａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７８）のＰｓｔ ｌ−３ｓｔＩ断片；２゜ｐＡｃＹｃ１７７　（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　 ａｌ、　、１９８１）のＰｓ杏Ｉ一旦ａｍＨＩ断片：３゜↓ａｃＺのプロモータ ー、オペレーター、翻訳開始部位および最初の８つの非必須コドンをもたないＥ 、ｃｏｌｉのラクトースオペロンを含有する旦ａｍＨＩ−５ｓｔｒ断片（Ｃａｓ ａｄａｂａｎ　ｅ　ｔ　ａ　１．．１９８３）；４．　シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｐｕｔｄａ）ＫＴ２４４０の５ａｕ３ＡＩ断片（Ｂａ ｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）；ユニ±、複製起源；ユ去旦 、緩和部位；Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝子；　Ｓｍ’、ストレプトマイシ ン第３１図：実施例７に記載する分割系上の異なるコリノイド標準（１ｍｇ／標 準）の保持時間。使用するカラムはヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）Ｃ−１ ８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅ　１）　である。
各吸収ピークについて、数字は下に記載するコリノイドに対応して示す。
保持時間は横座標として示し、そして３７１ｎｍにおける吸収は縦座標として示 す。
１　コピリン酸：２．コピリン酸ａ−アミド：３．コピリン酸ｇ−アミド：４． コピリン酸ａ９ｇ−ジアミド：５　コピリン酸Ｃ−アミド。
６、コピリン酸Ｃ１ｇ−ジアミド；７．コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミド：８　コピ リン酸トリアミド：９．コピリン酸テトラアミド；１０．コピリン酸ペンタアミ ド：１１．コビル酸；１２．ＧＤＢ−コピナミド；１３゜コピナミドホスフェー ト；１４．コピナミド；１５．ジアノコバラミン５′−ホスフェート：１６．ジ アノコバラミン。
第３２図：ンユードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の４７４８ｂｐのＳａｌＩ−３ａｌＩ− ８ａｌＩ−３ａｌＩ−３ａｉｌ−ＢｇｌＩ断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。
上部に位置する鎖は、第６図に表す制限地図の断片の左から右への向きに相当す る左から右への方向に５゛から３′に読むべきである。
第３３図：シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の３８５５ｂｐのＳａｌｌ−３ａｌｌ− ＢａｍＨＩ断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、第６図に 表す制限地図の断片の左から右への向きに相当する左から右への方向に５′から ３°に読むべきである。
第３４図：４７４８ｂｐのＳａｉｌ−８ａｌＩ−ＳａｌＩ−Ｓａｌｌ−８ａｉｌ −ＢｇｌＩ断片の６つのリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄ ｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラム を使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読 鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより 中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に配置されている フレームである。
４ａ０ヌクレオチド２００〜８００に相当する配列の分析。この分析はオーブン リーディングフレーム１４の同定を可能とする。それは位置６６０におけるＡＴ Ｇにおいて開始し、そして位置３７９におけるＴＧＡにおいて終わる。４ｂ０ヌ クレオチド８００〜１５００に相当する配列の分析。この分析はオーブンリーデ ィングフレーム１５の同定を可能とする。それは位置９２５におけるＧＴＧにお いて開始し、そして位置１４４０におけるＴＡＡにおいて終わる。４ｃ０ヌクレ オチド１４５０〜２６００に相当する配列の分析。この分析はオーブンリーディ ングフレーム１６の同定を可能とする。それは位１５１２におけるＡＴＧにおい て開始し、そして位置２５１０におけるＴＧＡにおいて終わる。４ｄ０ヌクレオ チド２５００〜４６５０に相当する配列の分析。この分析はオーブンリーディン グフレーム１７の同定を可能とする。それは位置２６１６におけるＴＧＡにおい て開始し、そして位置４５１１におけるＴＧＡにおいて終わる。
第３５図：３８５５ｂｐのＳａ　ｌ　ｌ−３ａ　ｌ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の６つ のリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマフラ千 うン（ＭａｃＬａｃｂｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの 優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームに ついて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線 がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。５ａ ｏヌクレオチド１〜９０５に相当する配列の分析。この分析はオーブンリーディ ングフレーム１８の同定を可能とする。それは位置８０９におけるＡＴＧにおい て開始し、そして位置１０８におけるＴＧＡにおいて終わる。５ｂ、ヌクレオチ ド９５５〜２１０５に相当する配列の分析。この分析はオーブンリーディングフ レーム１９の同定を可能とする。それは位置１９７１におけるＡＴＧにおいて開 始し、そして位置１０６３におけるＴＡＡにおいて終わる。５ｃｏヌクレオチド ２０００〜３３ｆＯに相当する配列の分析。
この分析はオーブンリーディングフレーム２０の同定を可能とする。それは位置 ２０９９におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３１５５におけるＴＡＧに おいて終わる。５ｄ０ヌクレオチド３２５０〜３８５５に相当する配列の分析。
この分析はオーブンリーディングフレーム２１の同定を可能とする。それは位置 ３３４４におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３７５７におけるＴＧＡに おいて終わる。
第３６図：ｐＸＬ１５４からのプラスミドｐＸＬ２３３、ｐＸＬ８４３およびｐ ＸＬ１５５８の構成。
プラスミドを次の方法で構成する。切頭ｃｏｂＳ遺伝子および上流の配列を含有 する３、５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ１５４から切除し、次いで精製し、そ してｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。これにより構成された プラスミドをｐＸＬ２３３と表示する。Ｃ０ｂＴ遺伝子および下流する配列を含 有する３、５ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｘｈｏ　Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ断片をｐＸＬ１５４か ら部分的消化により切除しそして精製する。ｃｏｂＳ遺伝子および上流の配列を 含有する４、３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ１５４ から切除および精製し、次いで上の３．５ｋｂの断片に結合する。これにより得 られたほぼ８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏｌをｐＸＬ５９のＥｃｏＲＩおよび５ａ ｉｌ部位の中にクローニングして、プラスミドｐＸＬ８４３を生成する。プラス ミドｐＸＬ１５５８を次の方法で構成する：１．２ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ− ＨｌｎｄＩ　Ｉ　Ｉ断片をｐＸＬ１５４から切除し、そして精製し、次いで末端 をＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■の大きい断片でフィルインする。このイ ンサートをＥｃｏＲＩで消化したｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　 、１９８１）の中にクローニングし、次いでＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ Ｉの大きい断片で処理して、末端を平滑にする。括弧内に示す制限部位はクロー ニングの間に消失した部位に相当する。１、Ｒ３ＦＩＯＩＯ（Ｄｅｇｒａｆｆ　 ｅｔ　ａｌ、、１９７８）のＰｓｔＩ−３ｓｔｌ断片；２、ｐＡｃＹｃ１７７　 （Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨ Ｉ断片；Ｂ、ＢａｍＨＩ　；Ｃ，Ｃ１ａＩ　；Ｅ、ＥｃｏＲＩ　；Ｈ，Ｈｉｎｄ ＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、５ｓｔｌ；Ｓａ、５ａｌｌ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、 ＸｂａＩ； Ｔｅ　ｔ、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；　Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝 子；Ｓｍ’、　ストレプトマイシン抵抗性遺伝子。
第３７図：ｐＸＬ１５４の１２ｋｂのＨｉｎｄＩＩ　ｌ−ＨｌｎｄＩＩＩの中へ のトランスポゾンＴｎ５Ｓｐの挿入の研究。
トランスポゾンの挿入を、ｐＸＬ１５５８の中へクローニングされた１２ｋｂの ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｌ−Ｈ１ｎｄｌＴＩ上ニマッピングする。菌株５Ｃ５１０Ｒｉ ｆ’中の染色体の挿入をボックスで囲み、これは菌株５ＢＬ２７Ｒｉｆ’の中に 導入されない。プラスまたはマイナスのしるしを各挿入の下に示し、この挿入を 有する菌株のＣｏｂ表現型を示す。プラスミドｐＸＬ１５５８　：　：Ｔｎ５Ｓ ｐによる菌株Ｇ２０３５の相補性の不存在（または相補性）を、各挿入より下に マイナス（またはプラス）で示す。第３６図に記載するプラスミドのインサート を示す。これらのプラスミドの上に位置しそしてトランスポゾンの挿入と整列し たプラス（またはマイナス）のしるしは、プラスミドによるトランスポゾン突然 変異した菌株の相補性（または不存在）を線図的に示す。配列から推定されるオ ーブンリーディングフレームを、また、この図面に記載する（ＯＲＦ１４〜１７ 、ならびに対応するｃｏｂ遺伝子（ｃｏｂｓおよびｃｏｂＴ））、Ｅ：ＥｃｏＲ Ｉ；Ｈ，ＨｉｎｄＩＩＩ　；Ｘ：ＸｈｏＩ。
第３８図ニブラスミドルＸＬ１２８６、ｐＸＬ１３０３、ｐＸＬ１３２４、ｐＸ Ｌ１４９ＱＢおよびｐＸＬ１５５７およびｐＸＬ５１９の構成。配列決定した断 片の位置は、この図面の上部のクラスターの制限地図に見える：それは３．９ｋ ｂのＳａｌＩ−５ａｌｌ−８ａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片である。プラスミドは次の 方法で構成する。ｃｏｂＵ遺伝子および下流を含有する２ｋｂのＢｇｌ　Ｉ　Ｉ −ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ５１９から切除し、次いで精製し、ｐＫＴ２３０のＢ ａｍｆ（ＩおよびＥｃｏＲｉ部位においてクローニングして、プラスミドｐＸＩ 、１２８６を生成する。切頭したｃｏｂＶ遺伝子、ｃｏｂＵ遺伝子および下流の 配列を含有する２、７ｋｂのＳｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ５１９上で 切除し、次いで精製し、そしてｐＫＴ２３０の５ｓｔＩおよびＥｃｏＲＩにおい てクローニングして、プラスミドｐＸＬ１３２４を生成する。切頭ｃｏｂＶ遺伝 子および上流の配列を含有する１、６ｋｂの５ｓｔＩ−ＳｓｔＩをｐＸＬ５１９ から切除し、次いでｐＫＴ２３０の５ｓｔＩ部位においてクローニングして、ｐ ＸＬ１３０３を発生させる。３．８５ｋｂ０）Ｓｓｔ　ｌ−５ｓ　ｔ　Ｉ−Ｂａ ｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩでｐＸＬ５１９で完全に消化し、そして５ｓｔＩで部 分的に消化した後、精製する。
次いで、この断片をｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩおよび５ｓｔＩ部位においてクロ ーニングして、ｐＸＬ１４９０Ｂを発生させる。プラスミド１ｐＸＬ５５７を次 の方法で構成する：　９ｋｂのＨｉｎｄｌ　ＩＩ−ＢａｍＨ１断片をｐＸＬ５１ ９から切除し、そして精製し、次いでＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■の大 きい断片でフィルインする。このインサートをＥｃｏＲＩで消化したｐＲＫ２９ ０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１）の中にクローニングし、次いでＥ 、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■の大きい断片で処理して末端を平滑にする。
括弧内に示す制限部位は、クローニングの間に消失した部位に相当する。１、Ｒ ３ＦＩＯ１０（Ｄｅｇｒａｆｆ　ｅｔ　ａｌ、、１９７８）のＰｓｔＩ−５ｓｔ Ｉ断片：２、ｐＡｃＹｃ１７７（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ８１）のＰｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片；Ｂ、ＢａｍＨＩ　；Ｂｇ、Ｂｇｌｌｌ ；Ｃ５Ｃ１ａＩ；Ｅ、、ＥｃｏＲＩ：Ｈ，ＨｉｎｄｌｌＩ；Ｐ。
ＰｓｔＩ　；Ｓ、５ｓｔＩ　；Ｓａ、５ａｌＩ　；Ｘ、Ｘｈｏｌ　；Ｘｂ、Ｘｂ ａＩ；Ｔｅｔ’、テトラサイクリン抵抗性遺伝子：Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性 遺伝子：Ｓｍ’、ストレプトマイシン抵抗性遺伝子。
第３９図：ｐＸＬ５１９の９ｋｂのＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＴインサート の挿入の研究。トランスポゾンの挿入を、ｐＸＬ１５５７の中にクローニングさ れた９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサート上でマツピングする。菌株 ５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の中への染色体の挿入をボックスで囲み、そうでないものは 菌株５ＢＬ２７Ｒｉ　ｆ’の中に導入される。プラスまたはマイナスのしるしは 各挿入の下に示し、この挿入を有する菌株のＣｏｂ表現型を示す。プラスミドｐ ＸＬ１５５７　：Ｔｎ５Ｓｐによる菌株Ｇ２０４０の相補性の不存在（または相 補性）を、各挿入より下にマイナス（またはプラス）で示す。第３６図に記載す るプラスミドのインサートを示す。これらのプラスミドの上に位置しそしてトラ ンスポゾンの挿入と整列したプラス（またはマイナス）のしるしは、プラスミド によるトランスポゾン突然変異した菌株の相補性（または不存在）を線図的に示 す。配列から推定されるオーブンリーディングフレームを、また、この図面に記 載する（ＯＲＦ１８〜２１）、ならびに対応するｃｏｂ遺伝子（ｃｏｂＵおよび ｃｏｂＶ））。
第４０図：４．３ｋｂの断片の遺伝子の各々、それぞれ、ｃｏｂＸ、ｃｏｂｓお よびｃｏｂＬ、の解読配列を示す。これらの配列によりエンコードされるＣ０Ｂ ＸＳＣＯＢＳおよびＣ０ＢＴタンパク質の配列は、それぞれのｃｏｂＸ、ｃｏｂ ＳおよびｃｏｂＴの下に見られる。凡例は第１５図についてのそれと同一である 。
第４１図：３．９ｋｂの断片の遺伝子の各々、それぞれ、ｃｏｂＵおよびｃｏｂ Ｖ、の解読配列を示す。これらの配列によりエンコードされるＣ０ＢＵおよびＣ ０ＢＶタンパク質の配列は、それぞれのｃｏｂＵおよびｃｏｂＶの下に見られる 。凡例は第１５図についてのそれと同一である。
第４２図・Ａ１１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した菌株Ｅ、ｃ。
１ｉ　ＢＬ２１　ｐＬｙｓＳ　ｐＥＴ３ｂおよびＥ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｐＬ ｙｓＳ　ｐＸＬ１９３７の全体のタンパク質。レーン１、ＢＬ２１　ｐＬｙｓＳ 　ｐＥＴ３ｂ；レーン２、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１ｐＬｙｓＳ　ｐＸＬ１９３７ ゜Ｂ１１０％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した菌株菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ１２ 、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ１２　ｐＸＬ１８７４およびＥ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｐ ＸＬ１８７５゜レーン１、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１；レーン２、Ｅ、ｃｏｌｉ　 ＢＬ２１　ｐＸＬ１８７４　：レーン３、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｐＸＬ１８ ７５゜マーカーの分子量は示されている。過度に発現したタンパク質に相当する バンドは矢印で示す。
第４３図：シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１３１４４ｂｐの５ａｌｌ−３ａｌ　 ｌ−３ａｌ　ｌ−５ａｌ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇｌ　ＩＩ断片の両者の鎖の ヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、第４６図に表す制限地図の断片の左か ら右の向きに相当する左から右の方向において５′から３′に読むべきである。
第４４図：シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１３１４４ｂｐの５ａｌｌ−３ａ　］ 　ｌ−３ａ　１１−Ｓａ　ｌ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片の制限 地図。存在する制限部位の１または２以上の位置を配列決定した断片上の切断し た番号の増加する順序で示す１位置は第４３図に表す配列に相当する。
第４５図：ソユードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ。
ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１３１４４ｔｌの５ａｌｌ−３ａ　Ｉ 　ｌ−５ａ　１１−８ａ　ｌ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片の６つ のリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマフラチ ラシ（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの 優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームに ついて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線 がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。
１　ヌクレオチド１〜２２６６に延びる配列。この分析により、オーブンリーデ ィングフレーム２２が同定できる。それは位置４２９におけるＡＴＧにおいて開 始し、そして位置１８８４におけるＴＧＡにおいて終わる。
２、ヌクレオチド２２６６〜４０００に延びる配列。この分析により、オーブン リーディングフレーム２３が同定できる。それは位置３３６４におけるＡＴＧに おいて開始し、そして位置３８８６におけるＴＧＡにおいて終わる。
３、ヌクレオチド３８００〜５０００に延びる配列。この分析により、オーブン リーディングフレーム２４が同定できる。それは位置３８９２におけるＡＴＧに おいて開始し、そして位置４９５４におけるＴＧＡにおいて終わる。
４　ヌクレオチド５０００〜９０００に延びる配列。この分析により、オーブン リーディングフレーム２５が同定できる。それは位置５０６０におけるＡＴＧに おいて開始し、そして位置８８８５におけるＴＧＡにおいて終わる。
５　ヌクレオチド９０００〜９７００に延びる配列。この分析により、オーブン リーディングフレーム２６が同定できる。それは位置９０３４におけるＡＴＧに おいて開始し、そして位置９６７６におけるＴＧＡにおいて終わる。
６、ヌクレオチド９６００〜１３１４４延にびる配列。この分析により、オーブ ンリーディングフレーム２７．２８．２９および３０が同定できる。それらは、 ことに、位置９６７８．１０８９５．１１６５６および１３０５９におけるＡＴ Ｇにおいて開始し、そして位置１０１０１．１０３０４．１２１８１および１２ ３６６におけるＴＧＡにおいて終わる。オーブンリーディングフレーム２８およ び３０は、すべての他のオーブンリーディングフレームに相当する解読鎖に対し て相補性の鏡上に存在する。
第４６図：ｉ３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ Ｉ断片、９．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の中へのトランスポゾンＴｎ５ＳＩ）の挿 入の位置、プラスミドｐＸＬ１８９のインサートの中のトランスポゾンＴｎ５の 挿入の位置ならびに菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’：Ｔｎ５ＳＩ）の相補性について の実験の間に使用した種々のプラスミドのインサート。プラスミドによる突然変 異５Ｃ５１０Ｒｉｆ’：・Ｔｎ５Ｓｐの相補性は、（十）−親の５Ｃ５１０Ｒｉ ｆ’−のレベルの５％〜０５〜５％、あるいは（−）−相補性の不存在、すなわ ち、ＳＣ５１０Ｒｉｆ’−より１０００倍少ない、プラスミドのインサートを線 図的に示す線より直ぐ上に位置し、そして対応する突然変異の挿入部位と整列す る。プラスミドｐＸＬ１８９のインサートの中へのトランスポゾンＴｎ５の挿入 のマツピングより下において、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）突然変異Ｇ６３２およびＧ６ ３３についてのこれらの突然変異のプラスミドの相補性（＋）または相補性の不 存在（−）が示されている。この図面の右の部分上に、異なるプラスミドによる 突然変異Ｇ６２２、Ｇ６２３およびＧ６３０　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 　、１９８９）の相補性を示す表が存在する：（＋）一完全な相補性、親の５Ｃ ５１０Ｒｉｆ゛−のレベルの１００％−１（・）一部分的相補性、５Ｃ５１０Ｒ ｉｆ゛−のレベルの１０〜５０％、あるいは（−）−相補性の不存在。
挿入を示す異なるプラスミドは次のようにして構成する（断片はｐＸＬ１５６ま たはｐＸＬ１５７から切除する）：ｐＸＬ６１８はｐＫＴ２３０の同一部位にお いてクローニングした２゜５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇ ｄａｓａｒｉａｎｅｔ　ａｌ、　、１９８１）； ｐＸＬ５９３はｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩ部位においてクローニンクした３、１ ｋｂのＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒ　１ａｎｅｔ　ａｌ、　、１９ ８１）： ｐＸＬ６２３はｐＸＬ５９のＢａｍＨＩ−３ａＩ　Ｉ部位においてクローニング した１、９ｋｂのＢａｍＨＩ−Ｘｈｏｌ断片に相当する（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、　、１９８９）；ｐＸＬ１９０９はｐＫＴ２３０のＢａｍＨ１部位にお いてクローニングした８、４ｋｂのＢ　ａｍＨＩ　−Ｂ　ａｍＨＩ　−Ｂ　ａｍ ＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１）；ｐＸＬ ２２１はｐＸＬ５９の同一部位においてクローニングした１゜６ｋｂのＥｃｏＲ Ｉ−Ｃ１ａＩ断片に相当する（この断片がクローニングされたＣｌａＩ部位はｐ ＸＬ５９のマルチ部位のＣｌａＩ部位である）（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、 　、１９８９）：ｐＸＬ１９０８および１９３８は同一挿入、すなわち、Ｘｂａ Ｉリンカ−が付加された、６．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片 に相当する；このインサートはｐＸＬ４３５のＸｂａＩ部位において両者の向き にクローニングする（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）；図面上に 位置した矢印は２つのプラスミドのインサートの末端に関するカナマイシン抵抗 性遺伝子の位置を示す：ｐＸＬ２０８はｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩ部位において クローニングした５、２ｋｂのＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）； ｐＸＬ２９７はｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングした９、１ ｋｂのＥｃｏＲＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎｅｔ　ａｌｌ、１９８１ ）： 断片の配列決定により定められたオーブンリーディングフレーム（ＰＲＦ）（Ｏ ＲＦ２２〜３０）、ならびに対応するＣＯｂ遺伝子が示されている：矢印は転写 の極性を示す。
ＥＳＥｃｏＲＩ　；Ｂ、ＢａｍＨＩ　；ＢｇＳＢｇｌ　ＩＩ　：ＣＩ、Ｃ１ａＩ 　；Ｓａｕ、５ａｕ３ＡＩ　；Ｘ、Ｘｈｏｌ　；第４７図・１３．４ｋｂの断片 の遺伝子の各々、それぞれ、ｃｏｂＱ。
ｃｏｂＰおよびｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂｏの解読配列を示す。
これらの配列によりエンコードされるＣ０ＢＱ、Ｃ０ＢＰ、、Ｃ０ＢＷ。
Ｃ０ＢＮおよびｃｏ３ｏタンパク質の配列は、それぞれのｃｏｂＱ。
ｃｏｂＰおよびｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂｏの下に見られる。凡例は第１ ５図についてのそれと同一である。
第４８図：Ａ−メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ、ｉ　ｖ　ａ　ｎ　ｏ　ｖ ｌｌ）のＳＵＭＴのＮＨ２末端の配列およびオリゴヌクレオチド９２３．９４６ ．９４７：−１この位置において、残基が決定することができないこと意味、ア ンチセンスオリゴヌクレオチドについて、配列の下に示したアミノ酸は示したア ンチコドンに相当する。Ｂ−オリゴヌクレオチド９４６および９４７をもつメタ ノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ。
１ｖａｎｏｖｉ　ｉ）のＳＵＭＴの構造遺伝子に対して内部の断片の酵素の増幅 の調製。
第４９図　組み換え複製の形態ｐＧ１０の構成。増幅により得られた６１５ｂｐ の断片をＨｉｎｄｌＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで記載したように精製 した。次いで、この断片を同一酵素で消化したファージＭ１３ｍｐ１９の複製形 態と結合する。組み換えクローンをこのテキストに記載されているように見いだ す。
第５０図二種々の酵素で消化し、アガロースゲルの電気泳動により分割し、次い で前述したようにナイロン膜上に移した。この膜を前述したようにｐＧ１０プロ ーブとハイブリダイゼーションさせる。１、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩｌ、２、 Ｋｐｎｌ−ＢｇｌｌＩ；３、ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ：４、ＢｇｌｌＩ−Ｐｓｔ Ｉｏこのプローブとハイブリダイゼーションする異なる断片の大きさはｋｂで示 す。
第５１図：メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ、１ｖａｎｏｖｉ　ｉ）の９５ ５ｂｐの断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、左から右の 方向に５゛から３′に読む。
第５２図：　９５５ｂｐの配列から得られたメタノバクテリウム・イバノビイ（ Ｍ、１ｖＢｎｏｖｉｉ）のｃｏｒＡ遺伝子の解読配列。Ｃ０ＲＡタンパク質の一 次配列は、また、示されている。アミノ酸はそれらのコドンの上に示されており 、そして停止コドンは星印で表示されている。
メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｆ）のＣ０ＲＡタンパク 質の主な物理的性質、すなわち、アミノ酸組成、数および百分率、分子量、極性 の指数、等電点および１ｍｇ／ｌの精製したタンパク質を含有する溶液の２８０ ｎｍにおける光学密度。メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ、１ｖａｎｏｖｉ ｉ）のＣ０ＲＡタンパク質の親水性プロフィルは：このプロフィルはホップ（Ｈ ｏｐｐ）およびウッヅ（Ｗ。
ｄｄｓ）（１９８１）のに基づいて得られた。正の値は親水性であるタンパク質 の領域に相当する。アミノ酸の位置は横座標として示し、そして親水性指数の値 は縦座標として示されている；この値が正であるとき、これはタンパク質がこの 領域において親水性であることを示す。
第５３図：シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａ ｎｓ）のＣ０ＢＡおよびメタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ、１ｖａｎｏｖｉ 　ｉ）のＣ０ＲＡのタンパク質の比較。タンパク質はカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓ ａ）（１９８４）のプログラムにより整列した。＝、同一のアミノ酸ニー、相同 性アミノ酸、上で定義した基準のに基づ（（参照、第２２図および第２３図）。
第５・４図　プラスミドｐＸＬ１８３２およびｐＸＬ１８４１の構成。
記載され、この図面に配置されている凡例により、この構成に従うことができる 。
クローニング、分子生物学および生化学の一般技術分子生物学の古典的方法、例 えば、塩化カルシウム／臭化エチジウムの勾配のプラスミドＤＮＡの遠心、制限 酵素による消化、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の電気溶離、 Ｅ、ｃｏｌｉなどの中の形質転換は文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ　 ｅｔ　ａｌ、、１９８２、Ａｕ５ｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ　、１９８７）。
制限酵素はニュー−イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）（Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂ ｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）（ＢＲＬ）また はアマ−ジャム・リミテッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から供給された。リンカ−の オリゴヌクレオチドはＢｉｏｌａｂｓから供給された。
結合のために、ＤＮＡ断片をそれらの大きさに従い０．　７％のアガロースまた は８％のアクルアミドゲル上で分割し、電気溶離により精製し、フェノールで抽 出し、エタノールで沈澱させ、次いで５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐ Ｈ７，４，１０ミリモルのＮａＣ１２，１０ミリモルのＤＴＴ、２ミリモルのＡ ＴＰ中で、ファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下にインキュ ベーションする。
必要に応じて、突出した５′末端を有するＤＮＡ断片を次の緩衝液の中で３７℃ において３０分間子ウつ腸アルカリ性ホスファターゼ（（、ＩＰ、Ｐｈａｒｍａ ｃｉａ）で処理することによって脱リン酸する＝１００ミリモルのグリシン、１ ミリモルのＭｇＣｌ　２、ｌミリモルのＺｎＣｌ２、ｐＨ１０，５゜同一技術を 突出または平滑３゛末端の脱リン酸のために使用するが、処理を３７℃において １５分間、次いで５６℃において１５分間実施する。酵素は反応混合物を１％の ＳＤＳおよび１００ミリモルのＮａＣ１の存在下に６８℃に１５分間加熱するこ とによって不活性化し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタ ノール沈澱する。
突出５゛末端のフィルインをＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断 片（Ｂｉｏｌａｂｓ）で実施する。この反応は室温において５０ミリモルのＴｒ ｉｓ−Ｅ（ＣＩ緩衝液ｐＨ７，２，０，４ミリモルのｄＮＴＰｓ、１０ミリモル のＭｇ５Ｏ＜　、０．１ミリモルのＤＴＴ。
５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの中の３０分間実施する。突出３′末端のフィルインを ファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下に製造業者の推奨 に従い実施する。突出末端の消化を８１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ）を使用する制限 処理により製造業者の推奨に従い実施する。
リンカ−のオリゴヌクレオチドを既に記載されているようにＤＮＡ断片の末端上 に付加する（Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ、１９８２）。
オリゴデオキシヌクレオチドを使用する試験管内突然変異誘発は、タイラー（Ｔ ａｙｌｏｒ）ら、１９８５により開発された方法に従い、アマ−ジャムから入手 されるキットを使用して実施する。
結合したＤＮＡを受容性とした菌株を形質転換するニブラスミドについてＥ、ｃ ｏｌ　ｉ　ＭＣ１０６０［Ｄ　（ｌａｃＩＯＰＺＹＡ）Ｘ７４、ｇａ　ＩＵ、ｇ ａ　ＩＫＸ　ｓ　ｔ　ｒＡ’、ｈｓｄＲコまたはバクテリオファージＭ１３から 誘導されたファージの複製形態についてＥ、ｃｏｌｉＴＧｌ　［Ｄ　（ｌａｃ　 ｐｒｏＡ、Ｂ）　、５ｕｐＥ１　ｔｈｉＳｈｓｄＤ５／Ｆ’　ｔｒａＤ３６、ｐ ｒｏＡ”、Ｂ１．１ａｃｌｑ、ＩａｃＺＤＭ１５］。
プラスミドＤＮＡは、バーンポイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドリイ（Ｄｏ　 ｌ　ｙ）　、１９７９の技術に従い精製する。プラスミドＤＮＡのミニ調製物は フレイン（Ｋｌｅｉｎ）ら、１９８０のプロトコルに従いつくる。グラム陰性バ クテリアの染色体ＤＮＡの調製物は既に記載されているようにして生成する（Ｃ ａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）。
放射性プローブは既に詳述されている方法に従いニック翻訳により調製する（Ｒ ４ｇｂｙ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７７）、ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーション ならびにニトロセルロース膜上のニコチン酸の固定化は既に記載されているよう にして実施する（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔａｌ、　、１９８９）。所望の組み換え クローンの小さい確率が存在するクローニングにおいて、組み換えクローンは既 に記載されているようにフィルター上のハイブリダイゼーション後に見いだされ る（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、１９８２）。
ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は連鎖停止法により決定する（Ｓａｎｇｅｒ　ｅ ｔ　ａｌ、　、１９７７）ｏ反応混合物において、ｄＧＴＰを７−ジアザ−ｄＧ ＴＰで置換して、ＤＮＡの中のＧＣの高い百分率により引き起こされるアガロー スゲルの電気泳動の間のバンドの抑制を回避する。
細菌学的部分のために使用する培地は既に発表された（Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ 　ａｌ、　、１９８２）、ＰＳ４培地の中の培養は既に記載されているように実 施する（Ｃａｍｅ　ｒａｎ　ｅ　ｔ　ａ　Ｉ、、１９８９）＋ンユードモナス・ デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ） 菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’およびＧ２Ｒｉｆ’を次のようにして培養する：ＰＳ４ 培地（２５ｍｌ）および、必要に応じて、各菌株かをもつプラスミドのための選 択的抗生物質を含有する２５０ｍ１のエルレマイヤーを、Ｌ培地（Ｍｉｌｌｅｒ 　１９７２）の中の飽和予備培養物の１／１００希釈物および、必要に応じて、 各菌株かをもつプラスミドのための選択的抗生物質で接種する：これらの培養物 を３０℃において６日間インキュベーションし、次いでマスト（ｍｕｓｔ）をコ バラミンについて分析するか、あるいは経路のある酵素の酵素的活性について分 析する。アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス中プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓ　ｐｕｔｄａ）およびリゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉ ｌｏｔｉ）を３０℃において培養する；ただし特記しない限り、それらはＬ培地 中で培養する。
バクテリアの接合は既に記載されているように実施する（Ｃａｍｅ　ｒｏｎ　ｅ ｔ　ａｌ、　、１９８９）。
全体のタンパク質の抽出物を既に記載されているように生成する（Ａｕｓｕｂｅ ｌ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８７）。
変性条件下にアクリルアミドゲル中のタンパク質の分析的電気泳動（ＳＤＳ−Ｐ ＡＧＥ）は、既に記載されているように実施する（Ａｕｓｕｂｅｌ　ｅｔ　ａｌ 、　、１９８７）ｏファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）装置（Ｐｈ　 ａ　ｒｍａ　ｃ　ｉ　ａ）をラエンリ（Ｌａｅｍｌ　ｉ）の不連続的緩衝液系（ Ｌａｅｍｌｉ、１９７０）を、また、使用する；異なるゲルを分析すべきタンパ ク質の分子量ならびにそれらの精製に従い使用する： ファストゲル（Ｐｈａ　ｓ　ｔＧｅ　Ｉ：’の勾配８−２５フアストケル・ホモ ゲネアス（ＰｈａｓｔＧｅｌ　Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）１２．５ 染色はクーマソンーブルー（Ｃｏｏｍａｓ　ｉ　ｅ　ｂ　Ｉ　ｕｅ）を使用して ファストゲル・ブルーＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の助けにより、あるいはファス トゲル銀キット（Ｐｈａｒｍａｃ　ｉ　ａ）を使用して製造業者のインストラク ションに従い実施する。
タンパク質のＮＨ２末端配列は、エドマン（Ｅｄｍａｎ）劣化技術により、自動 化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４０７Ａ型）およびこ れにカップリングしたフェニルチオヒダントイン誘導体の同定のためのＨＰＬＣ 装置を使用して決定する。
実施例１−Ｃａｂ遺伝子を含有するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ、 ｄｅｎ　ｉ　ｔ　ｒ　ｉ　ｆ　ｉ　ｃａｎｓ）のＤＮＡ断片の分離この実施例は 、Ｃｏｂ遺伝子を有するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡ断片の分離を記載する。それ らの断片は、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐ、ｐｕｔｄａ）のＣｏｂ突然変異のた めの相補性実験により実証した（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９） 。
これらのＣｏｂ突然変異は、ミラーの技術（Ｍｉｌｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ７２）に従いＮ−メチル−Ｎ′−二トローＮ−二トロソグアニジンを使用する突 然変異誘発によるか、あるいはトランスポゾンＴｎ５の挿入により得た。この方 法において、コバラミンを合成することができない菌株が実証され、そしてこと にｐ、ｐｕｔｄａのＣｏｂ突然変異Ｇ５７２およびＡ、ｔｕｍｅｆａＣｉｅｎＳ のＣｏｂ突然変異Ｇ１５９、Ｇ１６１、Ｇ１６４、Ｇ１６９、Ｇ１７１、Ｇ２５ ８、Ｇ６０９、Ｇ６１０、Ｇ６１１、Ｇ６１２、Ｇ６１３、Ｇ６１４、Ｇ６１５ 、Ｇ６１６、Ｇ６２０．Ｇ６２２、Ｇ６２３、Ｇ６３０、Ｇ６３２、Ｇ６３３、 Ｇ６３４、Ｇ６３８、Ｇ６４２、Ｇ６４３、Ｇ２０３４、Ｇ２０３５、Ｇ２０３ ７、Ｇ２０３８、Ｇ２０３９、Ｇ２０４０、Ｇ２０４１、Ｇ２０４２およびＧ２ ０４３が実証された。
同時に、Ｐ、ｄｅｎｉ　ｔｒｉ　ｆ　１ｃａｎｓのゲノムのＤＮＡのライブラリ ーを移動可能な広い宿主範囲のベクターｐＸＬ５９の中で、制限酵素の存在下に ５μｇのＤＮＡの消化により産生ずる（Ｃａｍｅｒｏｎｅｔ　ａｌ、　、１９８ ９）。
相補性により、いくつかのプラスミドを分離し、Ｐ、ｐｕｔｄａおよびＡ、ｔｕ ｍｅｆａｃｉｅｎｓのＣｏｂ突然変異を相補性とすることができる。これらのう ちで、プラスミドｐＸＬ１５１、ｐＸＬ１５４、ｐＸＬ５５６、ｐＸＬ１５７お よびｐＸＬ５１９がことに指摘されるであろう。
これらのプラスミドを分離し、そしてＤＮＡ断片を切除し、精製し、そして制限 により分析することができた。これらの断片は第６図および第４４図に表す：５ ．４ｋｂのＣ１ａｌ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　ｌ−ＨｌｎｄｌＩＩ−ＨｉｎｄｌＩ！断 片、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片、４．８ｋｂのＳａ　ｌ　ｌ−３ ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　ｌ　ｌ−８ａ　１１−３ａ　ｌ　Ｉ　−ＢｇｌＩ断片、３． ９ｋｂのＳｓ　ｔ　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片および１３．４ｋｂのＥ ｃｏＲＩ−Ｂｇ　ｌ　Ｉ　Ｉ断片。
実施例２−分離のＤＮＡ断片の配列決定この実施例は、シュードモナス・デニト リフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０のｃｏｂ遺伝子を有する ＤＮＡ断片の配列決定を例示する。
２１．５．４ｋｂのＣ１ａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈｉｎｄｌｌ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩ ＩＩ断片の配列決定 この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ１５７の中に含有されている。
切除後、５．４ｋｂの断片の下位断片をファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍ ｐ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｔ、　、１９８３）あるいはＭ１３ｔ ｇ１３１またはＭ１３ｔｇ１３０　（Ｋｉｅｎｙｅｔ　ａｌ　、１９８３）の中 に両方の向きでクローニングした。次いで、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１ ９８７）の方法により、欠失を試験管内で生成した。次いで、これらの欠失を連 鎖停止反応の合成プライマーとして「汎用プライマー」を使用して配列決定した 。これらの異なる欠失の間のオーバーラツプは、両者の鎖にわたって、５．　４ ｋｂの断片の全体の配列の確立を可能とした（第７図）。この断片は５３７８ｂ ｐからなる。第７図に記載する配列において、Ｃｌａｌ部位前に、３つの制限部 位（ＰｓｔＩ、５ａｌＩおよびＸｂａＩ）が見られ、これらのクローニングマル チ部位における配列決定を目的として問題のの断片のクローニングの間に現れた 。本発明において、このＣ１ａｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄｌＩＩ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ断片の配列について言及するとき、これは第７図に表されている配列であ り、ここで最初の２２塩基はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡに相当しない（こうして、 制限部位またはオーブンリーディングフレームの開始の位置のすべては第７図に 表す配列である）。
２．２．８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片のヌクレオチド配列 この断片は実施例１に記載するｐＸＬ１５１が有する。ＥｃｏＲ１部位ならびに この断片の右に位置する隣接する７０ｂｐはｐＸＬ５９から由来し、ｐＸＬ５９ はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０の５ａｕ３ＡＩ断片をクローニングすることによ ってｐＸＬ１５１を構成するために使用するベクターである。切除後、８．７ｋ ｂの断片の下位断片をファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９　（Ｎｏｒ ｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８３）あるいはＭ１３ｔｇ１３０またはＭ １３ｔｇ１３１　（Ｋｉ　ｅｎｙ　ｅ　ｔ　ａ　１．．１９８３）の中に両方の 向きでクローニングした。次いで、欠失をヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９ ８７）の方法により生成した。次いで、これらの欠失を連鎖停止反応の合成プラ イマーとして「汎用プライマー」で配列決定した。これらの異なる欠失の間のオ ーバーラツプは、８．７ｋｂの断片の全体の配列を、両者の鎖にわたって、確立 することを可能とする。この断片は８７５３ｂｐからなる。
２．３．４．８ｋｂのＳａ　１１−５ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ 　−３ａｌＩ−ＢｇｌＩ断片の配列決定 この断片は実施例１に記載するプラスミドＤＸＬ１５４の中に含有される。この プロトコルは実施例２２において使用するものと同一である。４．８ｋｂの断片 の両者の鏡上の全体の配列を第３２図に表す。この断片は４７４９ｂｐを含有す る。
２４．３．９ｋｂのＳｓ　ｔ　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片のヌクレオチ ド配列 この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ５１９の中に含まれる。このプ ロトコルは実施例２．２において使用するものと同一である。
３．９ｋｂの断片の両者の鏡上の全体の配列を第３３図に表す。この断片は３８ ５５ｂｐを含有する。
２．５．１３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　ＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇＩＩＩ断 片のヌクレオチド配列 この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ５５６およびｐＸＬ１５７の中 に含有される。使用するプロトコルは実施例２．２のそれと同一である。１３． １５ｋｂの断片の両者の鏡上の配列は第４３図に表わす。それは１３．４ｋｂの 断片の全体の配列に相当し、ただしＥｃ。
ＲＩ−３ｓｔＩ断片に相当し、この断片の左端に存在する２５０ｂｐを除外する 。
これらのヌクレオチド配列から、最も少ない頻度で切断する酵素について制限地 図を得た（第６図および第４４図）。シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ１５０のＤＮＡ中の ＧＣ塩基の百分率は比較的高＜　（６５，５％）そして配列決定ゲル上の圧縮に おいてそれ自体現れる。これらの問題を回避するために、２つのアプローチを適 合させる：ｉ）配列決定反応においてｄＧＴＰの代わりに７−ジアザ−ｄＧＴＰ を使用して、配列決定ゲル中の電気泳動の間に形成する二次構造を減少ｉｉ）両 者の鎖の配列決定。
実施例３−これらのヌクレオチド配列の分析・オーブンリーディングフレームの 決定 ５．４ｋｂのＣ１ａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄｒＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ　（ 第７図）　、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲｒ　（第８図）、４．８ｋｂの Ｓａ　Ｉ　ｌ−３ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　Ｉ　ｒ−８ａ　Ｉ　Ｉ　− ＢｇｌＩ（第３２図）、３．９ｋｂのＳｓ　ｔ　ｌ−８ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨｒ （第３３図）および１３．４ｋｂのＥｃｏＲｒ−ＢｇＩ　ｒ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ− ＢｇｌＩＩ（第４３図）断片はオーブンリーディングフレームの定義を可能とす る。問題のＤＮＡは高い百分率のＧＣを含有するので、オーブンリーディングフ レームは翻訳停止コドンの低い頻度にかんがみて多数である。ステイデン（Ｓｔ ａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）を使用す るコドンの優先性に基づく解読フレームの確率の標準を実施する。それはオーブ ンリーディングフレームを特性決定し、このフレームは同−ＤＮＡ鎖の他のフレ ームに関して解読である最大の確率を有し、この確率はシュードモナス＠（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のバクテリアから由来する既に配列決定した遺伝子のコド ンの優先性に依存する。このようにして：３．１．５つのオーブンリーディング フレームを５．４ｋｂのＣ１ａ１−Ｈｉｎｄｒ　ｒ　ｌ−Ｈｌｎｄｌ　Ｉ　ｌ− Ｈｌｎｄｌ　Ｉ　Ｉ断片について特性決定する。それらはフレーム１〜５と表示 し、そして５．４ｋｂの断片の配列におけるそれらの位置は次の通りである（Ｃ ｌ　ａ　Ｉ部位からＨｉｎｄ１１１部位ヘノ５゛→３′配列）：表：５，４ｋｂ のＣ１ａｌ−ＨｉｎｄｌＩ　ｌ−ＨｌｎｄＩ　Ｉ　ｌ−Ｈ１ｎｄＩＩＩ断片の確 からしいオープンリーディングフレーム。配列中の位置は第７図に記載する配列 中の位置に相当する；解読鎖はこの図面において上の鎖に相当する５゛→３゛鎖 である。
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並 列の他のフレーム（合計５）について観測されるものとともに、第９図に記載す る。これらの５つのフレームは同−鎖によりエンコードされる。それらのうちで ４つ（オープンリーディングフレーム１〜４）は翻訳カップリングにおいて解読 フレームの特性を表す（Ｎｏｒｍａｋ　ｅｔ　ａｌ　、１９８３）、すなわち、 フレームｘ＋１の翻訳開始コドンはフレームＸの翻訳停止コドンとオーバーラツ プするか、あるいはこれらのコドンは非常に密接する。
３２．８つのフレームを８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片について特性 決定する。それらは６〜１３と表示し、そして８．　７ｋｂの配列中のそれらの 位置を下表に記載する。
青：ｓ、７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の確からしいオープンリーディングフレーム。
配列中の位置は第８図に記載する配列中の位置に相当する。
この図面において、解読鎖は上の鎖に相当する。
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並 列の他のフレーム（合計６フレーム）について観測されるものとともに、第１０ 図に記載する。フレーム１１を除外して、これらの８つのフレームは同−鎖によ りエンコードされる。それらのうちで４つ（７〜１０）は翻訳カップリングにお いて解読フレームの特性を表す（Ｎｏｒｍａｋ　ｅｔ　ａｌ、、１９８３）、す なわち、フレームＸ＋１の翻訳開始コドンはフレームＸの翻訳停止コドンとオー バーラツプするか、あるいはこれらのコドンは非常に密接する。
３３．４つのオープンリーディングフレームを４．８ｋｂの５ａ１１−３ａ　ｌ 　ｌ−８ａ　ｌ　ｌ−３ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ−Ｂｇ　Ｉ　Ｉ断片ニツイて 特性決定する。それらは相１４〜１７と表示し、そして４．８ｋｂの断片の配列 中のそれらの位置は次の通りである（ＳｓｔＩ部位からＢｇ１１１部位へ５′− ３′配列において）：表：４．３ｋｂのＳａ　ｌ　ｌ−３ａ　Ｉ　Ｉ　−３ａ　 ｌ　ｌ−３ａ　ｌ　ｌ−８ａ　１１−Ｂｇ１１断片の確からしいオープンリーデ ィングフレーム。配列中の位置は第３２図に記載する配列中の位置に相当し、こ こで上の鎖はその５゛→３′の向きで記載する。フレーム１５．１６および１７ は、フレーム１４と対照的に、上の鎖によりエンコードされる。
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並 列の他のフレーム（合計４）について観測されるものとともに、第３４図に記載 する。フレーム１５．１６および１７は同−鎖により、フレーム１４は相補性鎖 によりエンコードされる。
３．４．４つのフレームを３．９ｋｂのＳｓ　ｔ　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨ １断片について特性決定される。それらを１８〜２１と表示し、そして３．９ｋ ｂの断片の配列中のそれらの位置を下表に記載する。
表：３．９ｋｂのＳｓ　ｔ　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片の確からしいオ ープンリーディングフレーム。配列中の位置は第３３図に記載する配列中の位置 に相当し、ここで上の鎖の極性はその５°→３゛である。フレーム１８および１ ９は、フレーム２０および２１と対照的に、下の鎖によりエンコードされる。
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並 列の他のフレーム（合計４）について観測されるものとともに、第３５図に記載 する。フレーム１９および２０は異なる方法で転写される。
３．５．９つのオープンリーディングフレームを１３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂ ｇｌ　Ｉ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片について特性決定する。それら をフレーム２２〜３０と表示し、そして１３．１ｋｂの断片の配列中のそれらの 位置は次の通りである（ＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩへ５′−３′配列）： 酉：１３．ｌｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩ■断片の確 からしいオーブンリーディングフレーム。配列中の位置は第４３図に記載する配 列中の位置に相当し、ここで上の鎖はその５′→３゛の向きである。フレーム２ ２．２３．２４．２５．２６．２７および２９は、フレーム２８および３０と対 照的に、上の鎖によりエンコードされる。
オーブンリーディングフレーム２２．２３．２４．２５および２６が解読フレー ムである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計５）について観測されるもの とともに、第４５図に記載する。これらの５フレームは同−鎖によりエンコード される。
特表千５−５０６５７０　（２０） 実施例４−ｃｏｂ遺伝子を有するＤＮＡ断片について遺伝学的研究この実施例は 、上で同定した異なるオーブンリーディングフレームおよびこれらの断片が有す るコバラミンおよび／またはコピナミドの生合成に関係する遺伝子の間に存在す る関係を示す。これらの遺伝子は後述するように遺伝学的研究により同定される 。
４．１．５．４ｋｂの遺伝学的研究 ｐＸＬ７２３は、研究し、ｐＲＫ２９０のＥｃｏＲ１部位にクローニングした断 片の右の部分に相当する２２６４ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有 するプラスミドｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔａｌ、　、１９８０）である （第１１図）。この研究において使用した池のプラスミドの構成（ｐＸＬ３０２ 、ｐＸＬ１３９７、ｐＸＬ５４５、ｐＸＬ５４５Ω、ｐＸＬ５５６およびｐＸＬ １５００）を第１１図および第１２図に対する凡例に記載する。
挿入はプラスミドｐＸＬ７２３においてブルイジン（Ｂｒｕｉｊｎ）およびルブ スキ（Ｌｕｐｓｋｉ）　、１９８４の技術を使用して得た。プラスミドｐＸＬ７ ２３の中へのトランスポゾンＴｎ５の挿入お選択し、次いで５．４ｋｂの断片に おいてマツピングした（第１２図）。ｐＸＬ７２３は、シュードモナス・プチダ （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄａ）のＣｏｂ突然変異Ｇ５７２およびア グロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）のＣａｂ突然変異Ｇ６３４と相補性である。これらの挿入を不 活性化挿入の２つの群に分類される：Ｃｏｂ突然変異Ｇ５７２の相補性をもはや 可能しない群、またはＣａｂ突然変異Ｇ６３４の相補性を壊滅する群。
突然変異Ｇ５７２の相補性を不活性化する挿入はオーブンリーディングフレーム ４においてマンピングされる（これらは挿入１５．２７．６８．８１および９７ ）、オーブンリーディングフレーム４はそれゆえｃａｂ遺伝子に相当する。後者 をｃｏｂＣと表示する。突然変異Ｇ６３４の相補性を不活性化する挿入はオーブ ンリーディングフレーム５においてマツピングされる（これらは挿入６６および １０７、第１２図）；オーブンリーディングフレーム４はそれゆえｃｏｂ遺伝子 に相当する。後者をｃｏｂＤと表示する。そのうえ、トランスポゾンＴｎ５Ｓｐ ’をもつ挿入が産生された。トランスポゾンＴｎ５Ｓｐ’は、実験室において、 プラスミドｐＨＰ４５Ｑ　（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒ１ｓｃｈ、１９８４）か ら由来するストレプトマイシン抵抗性遺伝子を含有するＢａｍＨＩカッセットを Ｔｎ５のＢａｍＨＩ部位クローニングすることによって構成した（Ｊｏｒｇｅｎ ｅｓｅｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９７９）ｏこれらの挿入はシュードモナス・デニ トリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｊｃａｎｓ）撹拌５ ＢＬ２７Ｒｉ　ｆ’の染色体中で作った。菌株５ＥＬ２７は、５Ｃ１５０をいく つかの突然変異誘発により誘導する、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の菌株である。５ＢＬ２ ７はＰＳ４培地上で５Ｃ１５０より１０倍す（ないコバラミンを産生ずる。各々 がトランスポゾンの挿入を有する菌株５ＢＬ２７Ｒｉｆ’の１０，０００クロー ンのうちで、３０より多くはコバラミンを合成する能力を損失した。これらのク ローンのいくつかは、この実施例において研究した断片の中に挿入を有する。こ れらの挿入はサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）に 従う制限分析によりマツピングした。
これらの異なる突然変異におけるトランスポゾンの挿入部位を第１２図に記載す る。これらの挿入のうちで、番号２６３９はｃｏｂＣ遺伝子の中に存在する。こ の挿入はプラスミドｐＸＬ３０２と相補性をもち、ｐＸＬ３０２はｃｏｂＣ遺伝 子を含有する断片を有する（第１２図）。２つの挿入を２６３６および２６３８ と表示し、これらはオーブンリーディングフレーム３の中に存在する。これらの 突然変異をコバラミンの生合成においてブロッキングされ、そしてそれらはプラ スミドｐＸＬ１３９７と相補性をもち、ｐＸＬ１３９７はオーブンリーディング フレーム３のみを含有するが、ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子を含有するプラス ミドｐＸＬ３０２と非相補性である（第１２図）。これらの挿入の両者はそれゆ え他の遺伝子の中に存在する。オーブンリーディングフレーム３と、われわれは ｃｏｂＢ遺伝子を関係づける。挿入２９３３をオーブンリーディングフレーム２ の中に配置する：それはオーブンリーディングフレーム２を含有するプラスミド ｐＸＬ１５００と相補性をもっ；この挿入はプラスミドｐＸＬ１３９７と相補性 をもち、ｐＸＬ１３９７はｃｏｂＢを含有し、そしてｃｏｂＢ中の２つの挿入と 相補性である。この場合において、挿入はそれゆえ他の遺伝子の中に存在する； オーブンリーディングフレーム２と、われわれはｃｏｂＡと表示する遺伝子に関 係づける。
プラスミドｐＵｃ４Ｋから由来するカナマイシン抵抗性カッセット（Ｂａｒａｎ ｙ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８５）は、プラスミドｐＵＣ８（ＶｉｅｒａおよびＭ ｅｓｓｉｎｇ、１９８２）の中にクローニングしたＣ１ａＩ　（配列中の位置０ ）−ＲｓａＩ　（配列中の位置１６８６）断片のＮｏｔ１部位に導入する：問題 のＮｏｔＩ部位はフレーム１中の位置１７７に位置する（参照、第７図における 配列）：２つの挿入を適合させ、各々は抵抗性カッセットの異なる向きに相当し た。これらの断片は、各々抵抗性カッセットの挿入を有し、プラスミドｐＲＫ４ ０４　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、）の中にクローニングして、プラスミドｐＸ Ｌ１６３０および１６３１を生成した。これらのプラスミドを接合的転移により シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉ ｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒｉｆ’の中に導入し、次いで、プラスミドのだめの 選択的抗生物質（テトラサイクリン）の不存在下に１系列の培養／希釈により、 二重組み換え体が見いだされ、これらの組み換え体はプラスミドの断片を染色体 の断片と交換しており、そしてプラスミドを損失していた。２つの菌株はこれに より特性決定された。
ｉ）カナマイシン抵抗性カッセットは染色体のＮｏｔ１部位（フレーム１の中に 存在する）に挿入する。カナマイシン抵抗性遺伝子の転写の極性およびオーブン フレーム１のそれは反対である、ｉｉ）他方の挿入を５Ｃ１５０・１６３０Ｒｉ ｆ’；抵抗性カッセットを同一部位に挿入するが、抵抗性遺伝子の転写は完全な オープンリーディングフレーム１の極性と同一の極性を有する。
これらの２つの菌株は、５Ｃ１５０のそれより少な（とも１０倍低いコバラミン の合成速度を有する。
プラスミドｐＸＬ５４５Ωは、プラスミドｐＨＰ４５Ωのスペクチノマイノン抵 抗性カッセットがＢａｍＨＩ部位に挿入されたプラスミドｐＸＬ５４５である。
このプラスミド（第１２図）は、８１４ｂｐのＣ１ａ１−ＨｉｎｄｌＩｒ断片（ ここでオーブンリーディングフレーム１のみは完全である）を含有し、突然変異 ５Ｃ５１０：　１６３０Ｒｉ　ｆ’のみと相補性である。これは新しい遺伝子を 定義するために十分である。なぜなら、この突然変異は完全なオープンリーディ ングフレーム１のみを含有するプラスミドと相補性であるからである。オープン リーディングフレーム１はコバラミンおよび／またはコピナミドの生合成の経路 の遺伝子に相当する。この遺伝子をｃｏｂＥと表示する。プラスミドｐＸＬ５４ ５Ｑによる突然変異５Ｃ５１０：　１６３１Ｒ４ｆ’の相補性の不存在は、多分 ｃｏｂＡＳｃｏｂＢＳｃｏｂＣＳｃｏｂＤおよびｃｏｂＥ遺伝子、あるいはそれ らの一部分が同一のオペロンに属するという事実、およびオペロンの転写方向の 転写を保存するｃｏｂＥ中の挿入がｃｏｂＥ遺伝子のトランス発現によってのみ 相補性であることができるという事実のためである。対照的に、突然変異５Ｃ５ １０：　１６３１Ｒｉ　ｆ’は、その一部分について、ｃｏｂＡのｃｏｂＥ遺伝 子へのトランス発現を可能とするプラスミドとのみ相補性であることができる。
それゆえ、５．４ｋｂのＣｏａｌ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉ　−ＨｌｎｄＩＩ　１− ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂｃ、ｃｏｂＤおよびｃｏｂ Ｅと表示する５つのｃｏｂ遺伝子を含有する。
４．２．８．７ｋｂの断片の遺伝学的研究プラスミドｐＸＬ３６７は、ＥｃｏＲ １部位（第１３図）においてクローニングした８、７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含 有するｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８０）である。
プラスミドｐＸＬ３６７中のトランスポゾンＴｎ５の挿入は、既に記載された技 術を使用して選択した（ｄｅ　ＢｒｕｉｊｎおよびＬｕｐｓｉ、１９８４）を使 用して選択した。８．７ｋｂの断片中の挿入をマツピングした。同様な方法にお いて、トランスポゾンＴｎ５の挿入は既に記載された方法（Ｓｔａｃｈｅｌ　ｅ ｔ　ａｌ、　、１９８５）に従い生成し、そしてマツピングした。トランスポゾ ンＴｎ５の２９の挿入およびトランスポゾンＴｎ３１ａｃＺの１３の挿入がこう してマツピングされた。８．７ｋｂの断片中のこれらの挿入の正確な位置を第１ ４図に記載する。各々が８．７ｋｂの断片の中に単一の断片を有するプラスミド を、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｃｏｂ突然変異、Ｇ１６４、Ｇ６０９、Ｇ６１０、Ｇ ６１１、Ｇ６１２、Ｇ６１３、Ｇ６１４、Ｇ６１５、Ｇ６１６、Ｇ６２０および Ｇ６３８の中に導入した。これらの突然変異はｐＸＬ３６７と相補性である。異 なる突然変異の相補性を可能としない挿入を探した。それらは対応する突然変異 の相補性の原因となる遺伝子の中の挿入に相当する。コバラミンの産生の特徴を 示す異なる突然変異の相補性の結果（Ｃｏｂ表現型）を第１４図に記載する。組 み換え突然変異がプラスミドｐＸＬ３６７をもつ同一の突然変異により産生され るより３倍少ないコバラミンを産生ずる場合、それは非相補性と考慮する。研究 した突然変異、Ｇ１６４、Ｇ６０９、Ｇ６１０、Ｇ６１１、Ｇ６１２、Ｇ６１３ 、Ｇ６１４、Ｇ６１５、Ｇ６１６、Ｇ６２０およびＧ６３８のうちで、突然変異 した表現型に導くトランス発現ンの不活性化挿入の８つの異なるクラスが観察さ れる。これらのクラスは、これらの同一挿入をもつプラスミドｐＸＬ３６７によ り１または２以上の突然変異の相補性の不存在により挿入を特性決定する。それ ゆえ、各クラスは突然変異した遺伝子に相当する。同一クラスに属する挿入は互 いの側面に位！することが観察される。挿入の８つのクラスがこうして観察され 、これらは８つの遺伝子を明らかにする。挿入の各クラスは、対応する遺伝子の 中に含有されなくてはならない最小の断片を定める。第１４図は、制限地図、お よび前述（実施例３）のオープンリーディングフレームに関して、各クラスによ り境界された領域の間の完全な相関関係を実証する。事実、挿入の各クラスにつ いて、トランスポゾンは単一のオープンリーディングフレームの中に含有される ８、７ｋｂの断片の一部分の中に常に挿入されることが発見された。それゆえ、 挿入の各クラスは１つ、およびただ１つのオープンリーディングフレームと関連 する。それゆえ、上に示したオープンリーディングフレームの各々は、コバラミ ンおよび／またはコピナミドの生合成経路に関係するタンパク質をコードする。
オープンリーディングフレームの各々はコバラミンおよび／またはコピナミドの 生合成に関係する遺伝子に相当する。これらのオープンリーディングフレームを 、それぞれ、フレーム６〜１３のためのｃｏｂＦ、ｃｏｂＧＳｃｏｂＨ，ｃｏｂ ＩＳｃｏｂＪＳｃｏｂＫ、ｃｏｂＬおよびＣｏｂＭについて言及する。制限地図 に関するこれらの遺伝子の位置を第１４図に示す。
４．３−４．８ｋｂの断片の遺伝学的研究プラスミドｐＸＬ１５５８は、ｐＲＫ ２９０のＥｃｏＲ１部位においてクローニングしたｐＸＬ１５４　（Ｃａｍｅｒ ｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）の１２ｋｂのＨｉｎｄｌ　Ｉ　ｌ−Ｈｌｎｄ Ｉ　Ｉ　Ｉ断片を含有するプラスミドｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ 、　、１９８０）である（第３６図）。この研究において使用した他のプラスミ ド（ｐＸＬ２３３およびｐＸＬ８４３）の構成を第３６図に対する凡例に記載す る。
Ｔｎ５Ｓｐ挿入はプラスミドｐＸＬ１５５８において得た。まず、トランスポゾ ンＴｎ５Ｓｐを含有する菌株を構成した：これは菌株Ｃ２１１０　（Ｓｔａｃｈ ｅｌ　ｅｔ　ａｔ、、１９８５）をプラスミドｐＲＫ２０１３Ｔｎ５Ｓｐ（Ｂｌ ａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８５）Ｔ形質転換することによって実施した： それは複製のＣｏ１Ｅ１由来を有するので、プラスミドｐＲＫ２０１３Ｔｎ５ｓ ｐはｐｏｌＡ−である菌株Ｃ２１１０中で複製しない。形質転換後に得られるコ ロニーは、スペクトマイシンに対して抵抗性であり、それゆえそれらの染色体の 中にトランスポゾンＴｎ５ＳＩ）を有する；次いでコロニーを再分離し、次いで トランスポゾンの挿入を従来記載されているように菌株ＭＣ１０６０中でファー ジＰＩで形質導入する（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）。菌株ＭＣｌ０６０　Ｔｎ５ ＳＩ）をプラスミドｐＸＬ１５５８で形質転換する：次いでプラスミドｐＸＬ１ ５５８を接合によりＣ６００Ｒｉｆ’中のｐＸＬ２０１３を使用して移動化する 。次いで、テトラサイクリン（プラスミドｐＸＬ１５５８について）およびスペ クトマイシン（トランスポゾンについて）に対して抵抗性である接合体を選択す る。このような接合体は、トランスポゾンＴｎ５Ｓｐが挿入されているプラスミ ドｐＸＬ１５５８を含有しなくてはならない。次いで、プラスミドｐＸＬ１５５ ８の中に、より正確には１２ｋｂの断片の中に支持される挿入を制限消化により マツピングする。これにより、２３の挿入が得られ、そして１２ｋｂのの断片上 にマツピングされる；この断片の中のこれらの異なる挿入の位置を第３７図に表 す。これらの２３の挿入を、ｐ−Ｘ１１５８８・・Ｔｎ５Ｓｐの接合的転移後、 菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の染色体の中に導入し、次いでプラスミドｐＲ７５１ を導入する。プラスミドｐＲ７５１はｐＸＬ１５５８　（ｉｎｃｐ、Ｔｈｏｍａ ｓおよびＳｍ１ｔｈ、１９８７）と同一の不適合性群のトリメトプリム抵抗性プ ラスミドである。
ｐＸＬ１５５８について非選択的（テトラサイクリンの不存在）であるが、ｐＲ ７５１およびトランスポゾンについて選択的（トリメトプリムおよびスペクトマ イシンの存在）に培養することによって、ｐＸＬ１５５８：・Ｔｎ５Ｓｐが支持 する突然変異と染色体との交換およびまたｐＸＬ１５５８の分離は、既に記載さ れているように（Ｓｃｈｅｌｌ　ｅｔ　ａｌ、、１９８８）、マーカー交換技術 により、二重相同性組み換えにより得られる。これにより選択される菌株はそれ らの染色体の中にトランスポゾンを有する。二重相同性組み換えはサザン法（Ｓ ｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）により評価される。このようにして、１２ｋｂの断 片中の２３の５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５Ｓｐ菌株が同定された。
さらに、菌株５ＢＬ２７Ｒｉｆ’（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、、１９８９） 中のトランスポゾンＴｎ５ＳＩ）のランダム突然変異誘発により得られる他のＴ ｎ５Ｓｐ挿入を、サザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）に従い制限分析によ り１２ｋｂの断片上でマツピングした、参照、第３７図：この菌株を５ＢＬ２７ Ｒｉｆ’：　：Ｔｎ５Ｓｐ１４８０と表示する。
コバラミンの合成レベルを、既に記載されているプロトコル（Ｃａｍｅｒｏｎ　 ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）に従いＰＳ４培地中で培養した、これらの２４の菌 株について決定し、モしてＣｏｂ−表現型を親の５ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’　（ＳＢ Ｌ２７Ｒｉ　ｆ’）より少なくとも１０００　（または１００）倍少ないビタミ ンＢ１２を産生ずる菌株に帰属させる、第３７図。
こうして、これらの染色体の挿入のうちで６はＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ におけるＣｏｂ−表現型に導く、それらは挿入３１．１．４１．３．４５．５５ ．２２．１および１４８０である。
３つのプラスミドｐＸＬ２３３、ｐＸＬ８３７　（Ｃａｍｅ　ｒｏｎ　ｅｔ　ａ ｔ　、１．９８９）およびｐＸＬ８４３を、接合的転移により、Ｃ０ｂ−表現型 を有する３つの菌株、すなわち、５Ｃ５１０Ｒｉｆ’；Ｔｎ５Ｓｐ３１．１．５ Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５Ｓｐ４５および５ＢＬ２７Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔ ｎ５Ｓｐ１４８０の中に導入する。これらの３つの突然変異の各々は、コバラミ ン合成について異なる相補的プロフィルを有する。事実、５ＢＬ２７Ｒｉ　ｆ’ ：　：Ｔｎ５Ｓｐ１４８０はｐＸＬ８３７およびｐＸＬ８４３と相補性であるが 、ｐＸＬ２３３と相補性ではない、突然変異５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５ Ｓｐ４５はｐＸＬ８４３と相補性である：突然変異５Ｃ５１０Ｒｉｆ’：　：Ｔ ｎ５Ｓｐ３１゜１はプラスミドｐｘＬ８４３およびまたｐＸＬ８４３ｐＸＬ２３ ３と相補性である（参照、第３７図）。それゆえ、表わされるデータから、３つ の突然変異の相補性の結果に基づいて、３つの突然変異は異なること、そして、 それらの各々について、トランスポゾンＴｎ５ＳＴ）は異なるＣＯｂ遺伝子の中 に挿入されていることが結論される。
さらに、プラスミドｐＸＬ１５５８：　：Ｔｎ５Ｓｐ４１．３、ｐＸＬ１５５８ 　：　：Ｔｎ５Ｓｐ４５およびｐＸＬ１５５８　：Ｔｎ５Ｓｐ２２゜１を、接合 的転移により、菌株Ｇ２０３５　（Ｃａｍｅ　ｒｏｎ　ｅ　ｔ　ａｌ　、１９８ ９）の中に導入し、そしてそれらはそれと相補的ではない。
プラスミドｐＸＬ１５５８は、プラスミドｐＸＬ１５５８　：　：　Ｔｎ５Ｓｐ ３’１．　１対照的に、この突然変異と相補性である。
表現型および相補性のデータにより、挿入の３つのクラスを定めることができる ：これらのクラスの各々は次の挿入により表される：３１゜１、クラス１：４５ ．４１，３．５５および２２１、クラス２：１４８０、クラス３゜ 挿入の各クラスについて、トランスポゾンは、単一のオープンリーディングフレ ーム（ＯＲＦ１４．０ＲＦ１６および０ＲＦ１７、実施例３において定義した） の中に含有される４、８ｋｂの断片の部分の中に常に挿入される。挿入の各クラ スは単一のオープンリーディングフレームに関連する。それゆえ、上に示すオー プンリーディングフレームは、コバラミンおよび／またはコピナミドの生合成経 路に関係するタンパク質をコードする。これらのオープンリーディングフレーム をフレーム１４．１６および１７についてｃｏｂＸ、ｃｏｂＳおよびｃｏｂＴと 呼ぶ。制限地図に関するこれらの遺伝子の位置を第３７図に示す。オープンリー ディングフレーム１５は、補酵素ＢＩ２の生合成に関係する遺伝子ではな４．４ −３．９ｋｂの断片の遺伝学的研究ｐＸＬ１５５７１ｔ、ｐＲＫ２９０（ＤＥｃ ｏＲＩＩ＜位１ｍおいてりｏ　−ニングされたｐＸＬ５１９の９ｋｂのＨｉｎｄ Ｉ　Ｉ　Ｉ−ＢａｍＨＩ断片を含有するプラスミドｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔｔａ 　ｅｔ　ａｌ、、１９８０）である（第３８図）。この研究において使用する他 のプラスミドの構成（ｐＸＬ１２８６、ｐＸＬ１３０３、ｐＸＬ１３２４）は第 ３８図に対する凡例に記載されている。そのうえ、ｐＸＬ５１９の２ｋｂのＢｇ ｌＩＩ−Ｘｂｏｌ断片（この配列中の位置は第３３図に表されている＝２５１お よび２２３４）を、プラスミドｐＸＬ４３５　（Ｃａｍｅｒ。
ｎ　ｅｔ　ａｌ、）のＢａｒｎＨＩ−８ａｉ１部位においてクローニングしてｐ ＸＬ６９９を発生させる。
Ｔｎ５Ｓｐの挿入はｐＸＬ１５５７において実施例４．１に記載する技術に従い 得られた。プラスミドｐＸＬ１５５７の中にトランスポゾンＴｎ５Ｓｐの挿入、 次いでｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ５Ｓｐと表示する、を選択した。９ｋｂの断 片においてマツピングされるもの（第３９図）を、４３に記載されティるように 、ｐＸＬ１５５７　：　：　Ｔｎ５Ｓｐの接合的転移および二重相同性組み換え によるマーカー交換後、撹拌５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の染色体の中に導入した。
二重相同性組み換えをサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）により評価した 。このようにして、２０の５Ｃ５１０Ｒｉｆ’菌株を同定した。
さらに、菌株５ＢＬ２７Ｒｉｆ’におけるトランスポゾンＴ　ｎ、　５　Ｓ　ｐ のランダム突然変異により得られた２つの他のＴｎ５挿入（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　、１９８９）を、サザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）に従う 制限分析により９ｋｂの断片上でマツピングした、参照、第３９図における挿入 １００３および１１４７゜コバラミンの合成レベルを、既に記載されているプロ トコル（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）に従いＰＳ４培地中で培 養した、これらの２２の菌株について決定し、そしてＣｏｂ−表現型を親の５Ｃ ５１０Ｒｉｆ’（ＳＢＬ２７Ｒｉｆ’）より少なくとも１０００　（または１０ ０）倍少ないビタミンＢ１２を産生ずる菌株に帰属させる、第３９図。
わずかに４つの挿入１．１００３．２３および１１４７は、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉ ｆｉｃａｎｓにおいてＣｏｂ−表現型を生ずる。
４つのブラスミ）’ｐＸＬ６９９、ｐＸＬ１２８６、ｐＸＬ１３０３およびｐＸ Ｌ１３２４を、接合的転移により、Ｃｏｂ−表現型を有する４つの菌株、すなわ ち、５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５Ｓｐｌ、５ＢＬ２７Ｒｉｆ’：　：Ｔｎ ５ＳｐｌＯ０３，５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’：　：　Ｔｎ５Ｓｐ２３および５ＢＬ２ ７Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５ＳｐＨ４７の中に導入する。
プラスミドｐＸＬ６９９は最初の２つの突然変異（ＳＣ５１０Ｒｉｆ’：　：Ｔ ｎ５Ｓｐｌ、５ＢＬ２７Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５ＳｐｌＯ０３）と相補性である が、プラスミドｐＸＬ１３０３はそれらと相補性ではなく、プラスミドｐＸＬ１ ３２４は他の２つの突然変異（ＳＣ５１０Ｒｉｆ’：　：Ｔｎ５Ｓｐ２３および ５ＢＬ２７Ｒｉ　ｆ’：　：Ｔｎ５ＳｐＨ４７）と相補性であるが、プラスミド ｐＸＬ１２８６はそれらと相補性ではない。
さらに、プラスミドプラスミドｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ５Ｓｐｌを、接合的 転移により、菌株Ｇ２０３５の中に導入し、そしてそれはそれと相補的ではない が、これに対してプラスミドｐＸＬ１５５７、ｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ５Ｓ ｐ６Ａ、ｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ５Ｓｐ５４、ｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ ５Ｓｐ４８、ｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ５Ｓｐ２１、ｐＸＬ１５５７　：　： Ｔｎ５Ｓｐ８、ｐＸＬ１５５７　：　：Ｔｎ５Ｓｐ２３を、また、接合的転移に より、導入し、これらはそれと相補性である（参照、第３９図）。
表現型および相補性のデータにより、挿入の２つのクラスを定めることができる 。これらのクラスの各々について、トランスポゾンは、単一のオーブンリーディ ングフレーム（ＯＲＦ１９および０ＲＦ２０、実施例３において定義した）の中 に含有される３、９ｋｂの断片の部分の中に常に挿入される。
挿入の各クラスは単一のオーブンリーディングフレームに関連する。
上に示すオーブンリーディングフレームは、コバラミンおよび／または：ヒナミ ドの生合成経路に関係するタンパク質をコードする。これらのオーブンリーディ ングフレームをフレーム１９および２０１こついてＣ０ｂｖおよびｃ　ｏ　ｂ　 Ｕと呼ぶ。フレーム１８および２１は補酵素１１３１２の生合成経路に関係する 遺伝子ではない。制限地図に関するこれらの遺伝子の位置は第３９図に示す。挿 入４８．２１および８はｃｏｂＵ、：ｃａｂ■遺伝子との間にマツピングされる 。
４．５−１３　４ｋｂの断片の遺伝学的研究４５１．４３２７ｂｐのＥｃｏＲＩ −Ｂｇｌ　Ｉ　Ｉ断片についての研究 プラスミドｐＸ！、、１８９　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９） は、少なくとも１つのｃｏｂ遺伝子を含有し、３．１ｋｂのインサートを有し、 これは、３００ｂｐを除外して、４．　２ｅｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣＩａＩ断片に 相当する（参照、第４５図）。ｐＸＩ、１８９を、従来記載されたように（Ｄｅ 　ＢｒｕｉｊｎおよびＬｕｐｓｋｉ　（１９８４））、Ｔｎ５で突然変異誘発さ せた。これにより、１３の挿入が、第４６図に示すように、ｐＸＬ１８９の挿入 の中にマツピングされた。これらの１；３の突然変異のプラスミド、ならびにｐ ＸＬ１８９を、ｐＸＬ１８９（Ｃａｍｅ　ｒｏｎ　ｅ　ｔ　ａ　１．．１９８９ ）と相補性である突然変異である２一つのＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの突然変 異、Ｇ６３２およびＧ６３３、中で接合した。挿入５８のみは不活性化突然変異 であることが証明された。この結果が示すように、２つの突然変異Ｇ６３２およ びＧ６３３は同一遺伝子における突然変異に相当し、そして、そのうえ、それら の相補性の原因となりうるＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの遺伝子のみはオー ブンリーディングフレーム２６に相当する（参照、第４６図）。なぜなら、挿入 ５８はこのオーブンリーディングフレームにおいてマツピングされるからである ；さらに、このオーブンリーディングフレームにおいてマツピングされるのはこ の１３の挿入のみである。それゆえ、ｃｏｂ遺伝子はオーブンリーディングフレ ーム２６に関連する。
この断片の中で同定された４つのオーブンリーディングフレーム（オーブンリー ディングフレーム２７〜３０）がｃｏｂ遺伝子に相当するかどうかを知るために 、プラスミドｐＨＰ４５Ω（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒ１ｓｃｈ、１９８４）か らのスペクチノマイシン抵抗性カッセットをこれらの遺伝子の各々の中に特別に 挿入し、次いでＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の染色体 の中に相同性組み換えにより導入して、これらのオーブンリーディングフレーム の各々の中に挿入の突然変異を得た。この目的で、ＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａｌ断片（ 第４３図に表す配列においてそれぞれの位置８８１８および１３０８）を使用し た。この断片は、オーブンリーディングフレーム２７〜３０を有し、ｐＸＬ１５ ７　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）から精製した；Ｃ１ａＩ末 端をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片断片でフィルインした後 、ＥｃｏＲＩリンカ−をＣ１ａＩ末端に付加した。次いで、この断片をプラスミ ドｐＵｃ１３　（Ｖｉｅｒａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８２）の中にＥｃｏＲＩ部 位においてクローニングした。この構成されたプラスミドをｐＸＬ３３２と呼ぶ 。ｐＨＰ４５Ω（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒ　ｉ　ｓｃｈ、１９８４）からのス ペクチノマイシン抵抗性カッセットｎｏ挿入をｐＸＬ３３２について実施した。
これらの挿入は、別々に、Ｓｍａｌ（位置１０６６４、オーブンリーディングフ レーム２８）、Ｃ１ａｌ（位置１１６７８、オープンリーディングフレーム２９ ）およびＮｃｏＩ（位置１２４７４、オーブンリーディングフレーム３０）部位 において、ｐＸＬ３３２を対応する酵素で完全にまたは部分的に消化し、次いで 、必要に応じて、これらの末端をＥ、ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼのクレノー断 片断片でフィルインし、次いでスペクチノマインン抵抗性遺伝子を含有するｐＨ Ｐ４５Ｑ（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒ１ｓｃｈ、１９８４）の２ｋｂのＳｍａ　 ｒ断片と結合することによって実施した；これらの挿入は、第４６図に示すよう に、それぞれ、Ｇ２、Ｑｌ、Ｇ３およびＧ４と表示する。次いで、これらの異な る挿入を有するＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ４０４　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８５）の中に２つのＥｃｏＲｒ部位においてクローニングした。次いで、こ れらの異なる挿入を有する４つのプラスミドを、前述したように、５Ｃ５１０Ｒ ｉｆ’の中に接合により導入する。次いで、プラスミドｐＲ７５１（Ｔｈｏｍａ ｓおよびＳｍｉ　ｔｈ、１９８７）をこのトランス接合体の中に導入した。ｐＲ Ｋ４０４の４つの異なる誘導体および５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の染色体が有する突然 変異の交換を記載したように選択することができた（参照、実施例４．３）。こ れにより４つの菌株が得られた。これらの菌株の各々は、４つのオーブンリーデ ィングフレーム２７〜３０の１つの中に抵抗性カッセットの挿入を有する。これ らの挿入はサザンブロソティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）にょるゲノム のＤＮＡの分析により評価した。これらの異なる菌株のコバラミン産生を研究し た。それらのすべてはＰＳ４培地中の培養でＣｏｂ十表視表現型した。この結果 が示すように、４つのオーブンリーディングフレームは補酵素Ｂｌｉ’の生合成 に関係しない。しかしながら、これらのフレームの１または２以上は、例えば、 補酵素Ｂ１□のメチルコバラミンへの転化、すなわち、他のコバラミンまたはな お他のコリノイドの合成に参加するタンパク質をコードすることができる。
４、５．　２．９．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の研究種々のプラスミ ドをこの研究において使用する；プラスミドｐＸＬ１５６０は、ｐＲＫ２９０の ＥｃｏＲ１部位においてクローニングされたｐＸＬ１５６の９．１ｋｂのＥｃｏ ＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（実施例１）を含有するプラスミドｐＲＫ２９０　（Ｄｉ ｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８０）である（参照、第４６図）。この研究にお いて使用した他のプラスミドの構成（ｐＸＬ６１８、ｐＸＬ５９３、ｐＸＬ６２ ３、ｐＸＬ　１９０９、ｐＸＬ１９３８、ｐＸＬ１９０８、ｐＸＬ２２１、ｐＸ Ｌ２０８、ｐＸＬ２９７）を第４５図に対する凡例に記載する。
Ｔｎ５Ｓｐの挿入はプラスミドｐＸＬ１５６０において得た。プラスミドｐＸＬ １５６０で形質転換した菌株ＭＣ１０６０Ｔｎ５Ｓｐを使用して、ｐＸＬ１５６ ０断片のの中へのトランスポゾンＴｎ５Ｓｐの挿入を得た。これにより２７の挿 入が得られ、そして９．ｌｋｂの断片上にマツピングされた：この断片中のこれ らの異なる挿入の位置を第４図に表す。これらの２７の挿入を、ｐＸＬ１５６０ 　：　：　Ｔｎ５Ｓｐの接合的転移および引き続くプラスミドｐＲ７５１の挿入 後、菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の染色体の中に導入した。プラスミドｐＲ７５１ はｐＸＬ１５６０と同一の不適合性群のトリメトプリム抵抗性プラスミドである （ｌｎｃＰ、ＴｈｏｍａｓおよびＳｍｉ　ｔｈ、１９８７）　。ｐＸＬ１５６０ について非選択的（テトラサイクリンの不存在）であるが、ｐＲ７５１およびト ランスポゾンについて選択的（トリメトプリムおよびスペクチノマイシンの存在 ）に培養することによって、ｐＸＬ１５６０　：　：Ｔｎ５Ｓｐが有する突然変 異とｐＸＬ１５６０の染色体およびまた分離との交換を得た。二重相同性組み換 えによるマーカーの交換のこの技術は、シェル（Ｓｃｈｅ　ｌ　ｌ）ら、１９８ ８が既に記載する技術に等しい。こうして選択された菌株はそれらの染色体の中 にトランス接合体を有する。
二重相同性組み換えはサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）により評価する 。このようにして、各々が９．１ｋｂの断片の中にトランスポゾンＴｎ５Ｓｐの 異なる挿入を有する２７の５Ｃ５１０Ｒ４ｆ’：　：Ｔｎ５Ｓｐ菌株が同定され た。
コバラミン合成のレベルをＰＳ４培地中で培養したこれらの２７の菌株について 決定し、モしてＣｏｂ−表現型を親の菌株５Ｃ５１０Ｒ１ｆ゛より少なくとも１ ００倍少ないビタミンＢＬ２を産生ずる菌株に帰属させる、第４６図。こうして 、これらの染色体の挿入の２７のうちで１８は、第４６図に示すように、Ｐ、ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおけるＣ０ｂ−表現型に導くことが観察される。
挿入１９．３２．２４．２７．３７．３９．２６．１１および１４はオーブンリ ーディングフレーム２２においてマツピングされる（参照、第４６図）。すべて のこれらの挿入は、オーブンリーディングフレーム２２のみを含有するプラスミ ドｐＸＬ６１８と相補性である。われわれはこれから、オーブンリーディングフ レーム２２は、われわれがｃｏｂＯと呼ぶ、ｃａｂ遺伝子に相当すると推定する 。オーブンリーディングフレーム２３において挿入は得られなかった；しかしな がら、プラスミドｐＸＬ６２３は、このオーブンリーディングフレームのみを含 有しく参照、第４６図）、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の２つのｃａｂ突然変異、Ｇ６４ ２およびＧ２０４３　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）と相補性 である。それゆえ、オーブンリーディングフレーム２３はｃＯｂｐと表示するｃ ｏｂ遺伝子に相当する。オーブンリーディングフレーム２４および２５において マツピングされる挿入２３．１３．１２．３０．２２．４０．３５．１０および １７は、５Ｃ５１０Ｒｉｆ’におけるＣｏｂ−表現型に導く。それゆえ、その産 生物がコバラミンの生合成に関係する、２つのオーブンリーディングフレームが 存在するように思われる。しかしながら、これらの挿入が３°側に位置する遺伝 子、例えば、ｃｏｂｏに極性作用を有することを除外することができない。それ ゆえ、これらの突然変異の相補性を研究して、Ｃｏｂ−表現型が極性作用から生 じないことを決定することは適当である。
ｐＸＬ５５６と相補性である、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣａｂ突然変異、Ｇ６２２ 、Ｇ６２３およびＧ６３０を研究した。これらの突然変異は、唯一のｃｏｂ遺伝 子としてｃｏｂｏを含有するプラスミドｐＸＬ１８９　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ 　ａｌ、　、１９８９）と相補性ではない。対照的に、それらはプラスミドｐＸ Ｌ１９０ｇと相補性であり、このｐＸＬ１９０８は、オーブンリーディングフレ ーム２７〜３ｏに加えて、ｃｏｂｏおよびオーブンリーディングフレーム２５を 含有する（参照、第４５図）。オーブンリーディングフレーム２７〜３ｏはこれ らの突然変異の相補性の原因となることができない。なぜなら、それらかをコー ドするタンパク質は補酵素ｆ３＋ｚの経路に参加しないからである。
それゆえ、観察される相補性はオーブンリーディングフレーム２５のみを生ずる ことができる。さらＩこ、この同一のオーブンリーディングフレ−ムにおいてマ ツピングされる５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’Ｔｎ５Ｓｐ突然変異（これらは突然変異２ ２．４０．３５．１０および１７である）はプラスミドｐＸＬ１９０８と相補性 である、参照、第４６図、（ｃｏｂｏおよびフレーム２５を有する）が、これら のうちの少なくとも２つはＣＯｂ遺伝子としてｃｏｂＯのみを含有するｐＸＬ１ ８９と相補性ではない。
これらの結果が明瞭に示すように、オーブンリーディングフレーム２５はｃｏｂ 遺伝子である；このｃｏｂ遺伝子をｃｏｂＮと表示する。
Ｃｏｂ−表現型を有する、５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’Ｔｎ５Ｓｐの突然変異２３．１ ３および１２はオーブンリーディングフレーム２４においてマツピングされる。
これらの突然変異は、ｃｏｂＰ遺伝子のみを含有するプラスミドｐＸＬ６２３と 相補性ではない。対照的に、これらの突然変異はｃｏｂＰおよびオーブンリーデ ィングフレーム２４を含有するプラスミドｐＸＬ５９３と相補性であり、これに よりオーブンリーディングフレーム２４はそれらの相補性の原因となることが示 される。それゆえ、オーブンリーディングフレーム２４はｃｏｂ遺伝子であり、 これをｃＯｂｗと表示する。
実施例５−遺伝子およびタンパク質 ５１〜５．４ｋｂの断片 それゆえ、５つの遺伝子（ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ，ｃｏｂＤおよびｃ　 ｏ　ｂ　Ｅ）が５．４ｋｂのＣ１ａｌ−ＨｉｎｄｌｌＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｈｉ ｎｄｌＩＩ断片上に定められる。それらは、それぞれ、次のＣｏＢタンパク質を コードする：　Ｃ０ＢＡ、Ｃ０ＢＢ、Ｃ０ＢＣ，Ｃ０ＢＤおよびＣ０ＢＥ０遺伝 子（ｃｏｂＡ−ｃｏｂＥ）の解読部分、ならびにＣ０ＢＡ−ＣＯＢＥタンパク質 の配列は第１５図に記載されている。これらのタンパク質の各々の性質は、また 、表されている（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性のプロフィル ）。
５．２〜８．７ｋｂの断片 それゆえ、８つの遺伝子が８．７ｋｂの断片上に定められる。これらのｃｏｂＦ −ｃｏｂＭ遺伝子は、それぞれ、次のＣＯＢタンパク質をコードする：　Ｃ０Ｂ Ｆ、Ｃ０ＢＧ、Ｃ０ＢＨ，ＣＯＢ　Ｉ、Ｃ０ＢＪ、Ｃ０ＢＫ、Ｃ０ＢＬおよびＣ ０８Ｍ０遺伝子（ｃ　ｏ　ｂ　Ｆ−ｃ　ｏ　ｂＭ）の解読部分、ならびにＣＯＢ Ｆ−ＣＯＢＭタンパク質の配列は、第１６図に記載されている。これらのタンパ ク質の各々の性質をまた表す（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性 のプロフィル）。
５６３〜４．８ｋｂの断片 ３つの遺伝子（ｃｏｂＸＳｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ）が４．８ｋｂのＳａＩＩ−３ａ ｌＩ−８ａｌＩ−３ａｌＩ−８ａｌＩ−Ｂｇｌｌ断片上に定められる。それらは 、それぞれ、次のタンパク質をコードする：　Ｃ０ＢＸ、Ｃ０Ｂ５およびＣ０Ｂ Ｔ０これらの遺伝子の解読部分、ならびにＣ０ＢＸ、Ｃ０Ｂ５およびＣ０ＢＴタ ンパク質の配列を第４０図に表す。
任意に、ｃｏｂＳの位置１５１２におけるＡＴＧを、位置１４８５に位置するも のよりむしろ、開始コドンとして選択した（参照、第３２図）。
これらのタンパク質の各々の性質をまた示す（アミノ酸組成、等電点、極性の指 数および親水性のプロフィル）。
Ｃ０ＢＴはアミノ酸２１４〜３０５に相当する親水性ポケットを有する。
５４〜３．９ｋｂの断片 ２つの遺伝子（ｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ）が３．９ｋｂの５ｓｔｌ−５Ｓ　ｔ　 ｌ−ＢａｍＨＩ断片上に定められる。それらは、それぞれ、次のタンパク質をコ ードする：　Ｃ０ＢＵおよびＣ０ＢＶ、これらの遺伝子の解読部分、ならびにＣ ０ＢＵおよびＣ０ＢＶタンパク質の配列を第４１図に記載する。これらのタンパ ク質の各々の性質をまた示す（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性 のプロフィル）。
５５〜１３．４ｋｂの断片 ５つのｃｏｂ遺伝子が１３．４ｋｂの断片上に定められる（ｃｏｂＱ。
ｃｏｂＰ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂｏおよびｃ　ｏ　ｂ　Ｖ）　ｏそれ らは、それぞれ、次のタンパク質をコードする　Ｃ０ＢＱ、Ｃ０ＢＰ。
Ｃ０ＢＷＳＣＯＢＮおよびＣ０ＢＯ，これらの遺伝子（ｃｏｂＱ、ｃ。
ｂＰ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂＯ）の解読部分、ならびにＣ０ＢＱ、Ｃ ０ＢＰ、Ｃ０ＢＷ、Ｃ０ＢＮおよびＣ０ＢＯタンパク質の配列を第４６図に記載 する。これらのタンパク質の各々の性質をまた示す（アミノ酸組成、等電点、極 性の指数および親水性のプロフィル）。
ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッヅ（Ｗｏｏｄｓ）（１９８１）のプログラムに従 い生成した、親水性プロフィルから、Ｃ０ＢＶを除外したすべてのＣＯＢタンパ ク質は、膜タンパク質と反対に、多分可溶性タンパク質である。なぜなら、疎水 性の大きいドメインの不存在が認められるからである。Ｃ０ＢＶは、４つの長い 疎水性ドメインが認められるので（参照、第４１図）、膜タンパク質であるか、 あるいは大きい疎水性ドメインを有する細胞質タンパク質である。
ＣＯＢタンパク質のすべてのアミノ酸配列について、メチオニンはＮＨ２末端位 置における最初のアミノ酸として示されている。このメチオニンは生体内で切除 されることがあることが理解される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅ　ｒ 、１９８４）。メチオニンアミノペブチターゼによるＮＨ２末端のメチオニンの 生体内切除に関するルールは提案されていることが知られている（Ｈｉｒｅｌ　 ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）。
そのうえ、これらのタンパク質の配列をゲンプロ（Ｇｅｎｐｒｏ）タンパク質、 Ｇｅｎｐｒｏは２００アミノ酸より大きい推定上の解読部分により増大されるゲ ンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）タンパク質の抽出（バージｉン５９）である、と、 カネヒサ（ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムに従い比較した。Ｃ０ ＢＴを除外して、ゲンバンクのバージョン５９について使用したパラメーターで 有意な相同性を実証することができなかった。事実、Ｃ０ＢＴタンパク質は（ア ミノ酸）位置２２４と２９３との間に「酸性アミノ酸のコア」を有する（参照、 第４０図）：このタンパク質のこの部分において、２のうちで１より多いアミノ 酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸の残基である；この酸性アミノ酸のコア は、カネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムに従い、この領域 にわたってタンパク質を、また、このような酸性コアを有する他のタンパク質と 相同性とする。最も相同性のタンパク質は次の通りである：プラスモジウム・フ ァルシパルム（Ｐ　ｌ　ａ　ｓｍｄ　ｉ　ｕｍｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＧＡＲ Ｐタンパク質（Ｔｒｉｇｌｉａ　ｅｔａｌ、　、１９８８Ｌラツトの心臓のトロ ボニンＴ（ＪｉｎおよびＬｉｎ、１９８９Ｌヒトおよびラットのプロチモシン（ ＥｓｃｈｅｎｆｅｌｄおよびＢｅｒｇｅｒ、１９８６）、スペルミンに結合する アンドロゲン依存性のラットのタンパク質（Ｃｈａｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、１９ ８７）、およびヒト、ラットおよびニワトリの「中程度の大きさの神経フィラメ ントのサブユニット」、タンパク質（Ｍｙｅｒｓ　ｅｔ　ａｌ、１９８７、Ｌｅ ｖｙ　ｅｔ　ａｌ　、１９８７、Ｚｏｐｆ　ｅｔ　ａｌ　、１９８７）。酸性残 基に富んだこれらのコアの機能は未知である、しかしながら、この酸性コアは金 属カチオン、例えば、ＣＯ−の結合を可能とすべきであり、金属カチオンはＣ０ ＢＴタンパク質にコバルトメタロチオネインの役割を与えか、あるいは金属カチ オンは他のタンパク質との相互作用を可能とすべきである。
実施例６−酵素の研究 ６．１−精製した酵素活性からのＣＯＢタンパク質およびそれらの遺伝子の同定 この実施例は、精製したタンパク質から、そのＮＨ２末端配列が確立された後、 配列決定したｃｏｂ遺伝子の中から対応する構造遺伝子を発見することができる 方法を記載する。
６１１、ｃｏｂＡ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＡタンパク質の同定 シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎ　ｌｔ 　ｒ　ｉ　ｆ　ｉ　ｃａｎｓ）ＳＵＭＴの精製は記載された（Ｆ、Ｂ］ａｎｃｈ ｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）ｏこの精製されたタンパク質のＮＨ２末端配列 は、前述の技術に従い決定することができた。最初の１０のアミノ酸を同定した Ｍｅｔ　Ｉｌｅ　Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｐｈｅ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　 Ｐｒ。
Ｃ０ＢＡタンパク質のＮＨ２末端配列（第１５図）はこの配列に正確に相当する 。精製したＳＵＭＴの分子量は、１２，５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により 推定すると、３０．０００である。Ｃ０ＢＡタンパク質は、２９．２２３のその 配列から推定された分子量を有する（第１５図）。ＮＨ２末端配列と分子量との 間の対応は、Ｃ０ＢＡタンパク質がＳＵＭＴに相当することを明瞭に示す。ｃｏ ｂＡ遺伝子はＳＵＭＴの構造遺伝子である。
６．１．２、ｃｏｂＢ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＢタンパク質の同定 。
ａ）コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼ活性のアッセイこの実施例は、まだ 決して記載されてきていないコリノイドの生合成経路の活性のアッセイを例示す る。問題の酵素はコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼ（ＣＡＤＡＳ）であり 、これは位置ａおよびＣにおけるコリンまたはデコバルトーコリン環系の２つの カルボン酸官能性のアミド化を触媒する（第１７図）。ＮＨ２基のドナーはＬ− グルタミンであり、そしてこの反応は各カルボン酸官能性のアミド化当たり１個 のＡＴＰ分子を消費する。下に記載するアッセイはコピリン酸のジアミド化反応 に適用される；わずかの変更（と（に３３０ｎｍにおいてＨＰＬＣにおける検出 ）を加えると、それはヒドロゲノビリン酸のジアミド化反応に適用される。
ＡＴＰ　（１ミリモル）　、ＭｇＣｌ２　（２，５ミリモル）、グルタミン（１ ００μモル）、コピリン酸（５０μモル）またはヒドロゲノビリン酸（５０μモ ル）およびコピリンａ、Ｃ−ジアミドシンターゼ（はぼ１ユニツトの活性）を含 有するインキュベーション混合物（０，１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８（２ ５０μｍ）を３０℃において１時間インキュベーションする。このインキュベー ションの終わりにおいて、ＫＣＮ（２，６ｇ／Ｉ）および０２モルのＨＣＩ　（ １２５μｍ）の水溶液（１２５μｌ）をこの混合物に添加し、次いでこれを８０ °Ｃに１０分間加熱し、その後５．０００ｇで５分間遠心する。遠心した上澄み 液のアリコート（５０μｌ）をＨＰＬＣにおいて分析する。それを２５ｃｍのヌ クレオンル５　Ｃ＋ｓカラム上の注入し、そして緩衝液Ａ中の０〜１００％の緩 衝液で３０分かけて溶離する。緩衝液Ａ：１１モルのリン酸カリウムｐ）［３， ５，１０ミリモルのＫＣＮ、緩衝液Ｂ：Ｑ、１モルのリン酸カリウムｐＨ８，１ ０ミリモルのＫＣＮ／アセトニトリル（１・１）。コリノイドを３７１ｎｍにお ける紫外線吸収により検出する。酵素活性の単位は、記載条件下に１ナノモルの アミド基／時間を合成するために必要な酵素の量として定義される。
ｂ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）のコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼ活性の精製 この実験は、コバラミンの生合成経路に参加するシュードモナス・デニトリフィ カンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）タンパク質を 精製できる方法を例示する。
実施例６．　１．　２ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デ ニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｊｃａｎｓ）の コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼ活性の精製を後述するように実施する。
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ１５００　（参照、ｐＸＬ１５０ ０の記載について実施例４．１、ならびに第１２図）が導入されている菌株５Ｃ ５１０Ｒｉｆ’の湿潤細胞（７ｇ）を０．　１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７ ，７（３０ｍｌ）の中に懸濁させ、そして４°Ｃにおいて１５分間超音波処理す る。次いで粗製の抽出物を５０．０００ｇで１時間遠心することによって回収し 、そしてこの抽出物の一部分（１０ｍｌ）を同一緩衝液で平衡化したモノ（Ｍｏ ｎｏ）Ｑ　ＨＲＩＯ／１０カラム上に注入する。タンパク質を直線のＫＣＩの勾 配（０〜０．５モル）で溶離する。酵素活性を含有する分画（実施例６．２ｂ） に記載する試験により実証される）を−緒にし、そして２．５ｍｌに濃縮する。
２５ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７（１ｍｌ）で希釈した後、タンパ ク質をモノＱ　ＨＲ５１５で分画し、上のＫＣＩの勾配（０〜１５モル）を使用 する。活性の分画を一緒にし、そして１．７モルの硫酸アンモニウムを含有する ０、１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７（１ｍｌ）を試料に添加し、次いで これをフェニルースペロース（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａ）カラムのりＤ？トゲラフイーにかけ、減少する硫酸アンモニウムの勾 配（１，０〜０モル）で溶離する。所望の活性を含有する分画を一緒にし、そし てバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）ＨＰＨＴ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムのりｏ ｖトゲラフイーにかけ、リン酸カリウムの勾配（０〜０．３５モル）で溶離する 。
この工程後、この酵素は９５％より高い純度を有する。それは５ＤＳ−ＰＡＧＥ において汚染タンパク質を示さない。このタンパク質の純度はＮＨ２末端配列の 独特性により確証される。この技術におけるその分子量は４５．０００である。
ＣＡＤＡＳの精製の異なる工程を、それらの精製ファクターおよびそれらの収率 とともに、下表に記載する。
表　ＣＡＤＡＳの調製 １　このファクターは精製の間に分画の比活性の増加から計算する。
Ｃ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆ　１ｃａｎｓ）のコピリン酸ａ、ｃ−ジアミドシンターゼのＮＨ２末端配 列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定 この実施例は、コバラミンの生合成経路に参加するタンパク質のＮＨ２末端配列 により、このタンパク質をコードする構造遺伝子を同定する方法を例示する。
実施例６．　１．　２ｂ）に記載されているように精製した、シュードモナス・ デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ） コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンターゼのＮＨ２末端配列を前述したように決定 した。１５の残基を同定した。
Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　＾１ａ　＾ｌａ　Ｐｒｏ　＾ｌａ　 Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ　ＧｌｙＣＯＢＡタンパク質のＮＨ２末端配列（第１５ 図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第１５図に表す配列において、メ チオニンは直接の配列決定により決定したペプチド配列に先行する。これから理 解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダ ーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８ ７）。精製したＣＡＤＡＳの分子量は、１２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動 により推定して、４５，０００である。Ｃ０ＢＢタンパク質は、４５，６７６の その配列から推定される分子量を有する（第１５図）。ＮＨ２末端配列と分子量 との間の対応が明瞭に示すように、Ｃ０ＢＢタンパク質はＣＡＤＡＳに相当する 。ｃｏｂＢ遺伝子はＣＡＤＡＳの構造遺伝子である。
６、　１．　３、ｃｏｂ　Ｉ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＩタンパク質 の同定。
ａ）Ｓ−アデノシル−し−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフエラー ゼ活性のアッセイ この実施例は、まだ決して記載されてきていないコリノイドの生合成経路の活性 のアッセイを例示する。問題の酵素はＳ−アデノシル−し−メチオニン：プレコ リン−２メチルトランスフエラーゼ（ＳＰ２ＭＴ）であり、これはメチル基のＳ −アゾノンルーム−メチオニン（ＳＡＭ）からプレコリン−２に転移してプレコ リン−３を生成することを触媒する（第１８図）。因子ＩＩおよびＩＩＩは、そ れぞれ、プレコリン−２およびプレコリン−３の酸化生成物であり、プロピオニ バクテリウム・ノエルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒ ｍａｎｉｉ）（ＢａｔｔｅｒｓｂｙおよびＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８２．５ｃ ｏｔｔ　ｅｔ　ａｌ、１９８４）の細胞抽出物から既に精製された；プレコリン −２およびプレコリン−３は補酵素Ｂ１２生合成の仮定した中間体として認識さ れているが、それらはそれ自体決して精製されてきていない。この理由で、対応 する活性は決して前辺てアッセイまたは精製されてきていない。酵素反応の基質 、プレコリン−２、は、非常に不安定な分子であり、これは無限に微量の酸素の 存在下に自発的に酸化するので、貯蔵することができない（Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ およびＭａｃＤ。
ｎａｒｄ、１９８２）。それゆえ、この酵素試験の原理は、プラスミドｐＸＬ１ ５００が導入されている菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の酵素抽出物を使用して、要 求される瞬間に、ＳＡＭおよびδ−アミルプリン酸からプレコリン−２を発生す る可能性にある。インキュベーションは厳格に嫌気性条件下に実施することがで きる。
ＳＰ２ＭＴを含有する分画は、０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７（１ ｍｌ）中で、５ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＥＤＴＡ。
１００μモルの［メチル−３ＨコＳＡＭ（１μＣｉ）、・０．８ミリモルのδ− アミルプリン酸およびシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’のｐＸＬ１５０ ０の粗製の酵素抽出物（６ｍｇ）の存在下に３０°Ｃにおいて３時間インキュベ ーションする。菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’のｐＸＬ１５００は強いＳＵＭＴ活性を 含有する（Ｆ、１３１ａｎｃｈｅｅｔ　ａｌ　、１９８９）。インキュベーショ ンの間に生成したテトラビロール化合物を、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓ　ｅ 　ｐ　ｈ　ａ　ｄ　ｅ　ｘ）アニオン交換カラムに結合し、そして５％の硫酸を 含有するメタノール中で酸素の不存在下にエステル化する。次いで、ウロ°ゲン ＩＩＩのジメチル化およびトリメチル化誘導体をンリカゲルの薄層クロマトグラ フィーにより分割し、溶離系としてジクロロメタン／メタノール（９８゜３：１ ．７）を使用する（Ｆ、Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）。ＳＰ２ ＭＴ活性は、得られたトリメチル化誘導体／生成した（ジおよびトリ）メチル化 誘導の量の比として表し、タンパク質の量を呼ぶ。
この試験において導入された５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’のｐＸＬ１５００抽出物は、 アッセイの条件下に検出可能なＳＰ、ＭＴ活性を示さない（試験の間に生成した プレコリン−３／生成したプレコリン−２の比は００５より小さい）。
ｂ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチル トランスフエラーゼの精製この実験は、問題の活性についてのアッセイが存在す るとき、コバラミンの生合成経路に参加するシュードモナス・デニトリフィカン ス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）タンノ（り質を精 製できる方法を例示する。
タンパク質をプラスミドｐＸＬ２５３を含有する５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’細胞から 精製する。これは、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が挿入されているプラスミドｐ ＫＴ２３０である（第１３図）。典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ ２５３が導入されている菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ゛の湿潤細胞（５０ｇ）を０．　 １モルのリン酸カリウムｐ）ｆ’７．　７．５ミリモルのＤＴＴ　（２５０ｍｌ ）の中に懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波処理する。５０，０００ ｇで１時間遠心した後、上澄み液をＤＥＡＥ−セファデックスのカラム（１０ｍ ｌのゲル）に通過させて、テトラビロール化合物を除去する。これにより得られ た粗製抽出物のｐＨを０．１モルのＫＯＨでｐＨ７，７に調節する。硫酸アンモ ニウム飽和の３３％および４５％の間で沈澱するタンパク質を集め、そして０１ モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７，５ミリモルのＤＴＴ　（４０ｍｌ）の中 に溶解する。この溶液をセファデックスＧ−２５のカラムに通過させ、１０ミリ モルのＴｒｉｓ−ＭＣＩ　ｐＨ７，７，５ミリモルのＤＴＴで溶離し、そして集 めたタンパク質をＤＥＡＥ−トリサクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）−Ｍカラム上 に注入する。タンパク質を０〜０．２５モルのＫＣＩの直線の勾配で溶離し、そ してＳＰ２ＭＴ活性を含有する分画を一緒にし、そして上のようにしてセファデ ックスＧ−２５のカラムに第２回目に通過させる。タンパク質の分画を１０ミリ モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７，５ミリモルのＤＴＴ中で平衡化したウル トロゲル（Ｕｌ　ｔ　ｒｏｇｅ　Ｉ）ＨＡ、（ＩＢＦ）上に注入する。タンパク 質を５ミリモルのＤＴＴを含有するＯ〜５０ミリモルのリン酸カリウムｐＨ７， ８の直線の勾配で溶離する。所望の活性を含有する分画を一緒にし、そして５０ ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７，５ミリモルのＤＴＴ中で平衡化した モノＱ　ＨＲ５１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に注入する。ＳＰ２ＭＴを ＫＣＩの直線の勾配（０〜２゜５モル）で溶離する。モノＱ工程から出るとき、 銀塩で染色した１２゜５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動はこの酵素の純度が９９ ％より大きいことを明らかにする。これはタンパク質のＮＨ２末端配列の独特性 により確証される。変性条件下に電気泳動から計算した分子量（１２５％の５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ）は２６，５００である。ＳＰ２ＭＴの精製工程およびそれらの収 率を下表に記載する。
ｃ）ＳＰ２ＭＴのＮＨ２末端配列およびこの活性をコードする構造遺伝子の同定 この実施例は、コバラミンの生合成経路に参加するタンパク質のＮＨ２末端配列 により、このタンパク質をコードする構造遺伝子を同定する方法を例示する。こ の実施例において、問題の構造遺伝子はＳＰ２ＭＴについてのそれである。
精製したタンパク質のＮＨ２末端配列を前述したように決定した。最初の１５の 残基を同定した Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ｌｉｅ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　ＴｈｒＣＯＢＩタンパク質のＮＨ２末端配列（第１６ 図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第１６図に表す配列において、メ チオニンはヌクレオチド配列から推定するペプチド配列に先行する。これから理 解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダ ーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ＳａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８ ７）ｏ精製したＳＰ２ＭＴの分子量は、１２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥｔｌｉｉ ｋ動ｉ：より推定して、２６，５００である。ＣＯＢ　Ｉタンパク質は、２５， ８７８のその配列から推定される分子量を有する（第１６図）。ＮＨ２末端配列 と分子量との間の対応が明瞭に示すように、Ｃ０ＢＩタンパク質はＳＰ２ＭＴに 相当する。ｃｏｂＩ遺伝子はＳＰ２ＭＴの構造遺伝子である。
６１．４、ｃｏｂＨ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＨタンパク質の同定。
ａ）プレコリン−８ｘムターゼ活性のアッセイこの実施例は、まだ決して記載さ れてきていないコリノイドの生合成経路の活性のアッセイを例示する。問題の酵 素はプレコリン−８ｘムターゼであり、これはプレコリン−８Ｘのヒドロゲノビ リン酸への転化の間のメチル基の位置Ｃ−１１から位置Ｃ−１２に転移すること を触媒する（参照、第１９図における炭素原子の名称；ＰＬ６８）。より一般に 、それはメチル基Ｃ−１１のＣ−１２への転移を触媒し、これによりコリン環系 に導く触媒である。この酵素はここでムターゼと呼ぶが、メチル基の転移が分子 内であるが、これは非常に確からしいことは正式に実証されてきていない。
酵素活性は、酵素分画の存在下に０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７， １，ミリモルのＥＤＴＡ中で３０℃において１時間インキュベーションする間に おける、プレコリン−８ｘ（５μモル）のヒドロゲノビリン酸への転化により実 証される。インキュベーションの終わりにおいて、この反応を８０℃に１０分間 加熱することによって停止しそして、３０００ｘｇで１０分間遠心後、上澄み液 の中に存在する、形成したヒドロゲノビリン酸をＨＰＬＣにより分析する（参照 、実施例６．　１．　２゜ａ）。
ｂ）プレコリン−８ｘムターゼの精製 シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅ、ｎｉ　 ｔｒｉ　ｆ　１ｃａｎｓ）のプレコリン−８ｘムターゼの精製は次のようにして 実施する。
この精製の間に、すべての緩衝液を＋）Ｈ７，７に調節する。
典型的な精製実験において、ｐＸＬ２５３　（８，７ｋｂの断片がＥｃｏＲＩ部 位においてクローニングされたｐＫＴ２３０、第１３図）を有しそしてＰＳ４培 地中で培養後得られた、菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の細胞（５０ｇ）を０．　１ モルのリン酸カリウム（２００ｍｌ）の中に再懸濁させ、そして１２分間超音波 処理する。５０．０００ｇで１時間遠心した後、上澄み液をＤＥＡＥ−セファデ ックスのカラム（１０ｍｌのゲル）に通過させて、テトラビロール化合物を除去 する。これにより得られた粗製抽出物のｐＨを０．１モルのＫＯＨで７．７に調 節する。硫酸アンモニウム飽和の４０％および６０％の間で沈澱するタンパク質 を集め、そして０．　１モルのＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１（５０ｍｌ）の中に溶解す る。
次いで、この試料をウルトロゲル（Ｕｌ　ｔ　ｒａｇｅ　］）ＡｃＡ　（ＩＢＦ 。
フランス国）カラム（ゲル体積１．０００ｍ１）上に注入し、そしてタンパク質 を６０ｍ１／時間の流速で５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩで溶離する。活性を 含有する分画をプールし、そして５ＱｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌと平衡化したＤＥ ＡＥ−トリサクリル（Ｔｒ　ｉ　ｓ　ａｃ　ｒｙ　ｉ）−Ｍ（ＩＢＦ、フランス 国）カラム上に注入し、そしてタンパク質を０〜領　２モルのＫＣＩの勾配で溶 離する。精製すべきタンパク質を含有する分画をプールし、そして１０ミリモル のＴｒｉｓ−ＨＣＩと平衡化したセファデックスＧ−２５のカラムに通過させる 。タンパク質の分画を１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩで平衡化したウルトロゲ ル（Ｕｌｔｒｏｇｅ　１）ＨＡ　（ＩＢＦ、フランス国）上に注入し、タンパク 質を０〜０．１モルのリン酸カリウムの勾配で溶離し、次いで活性の分画を１０ ミリモルのリン酸カリウム中でフェニル−セファ０−スＣＬ　（Ｐｈａｒｍａｃ ｉａ）４Ｂカラムのクロマトグラフィーにかけ、このカラムを０．６５〜０モル の硫酸アンモニウムの勾配で溶離する。これにより得られたタンパク質はタンパ ク質の純度は９５％より大きい（１２５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀 塩による染色の結果に従う）。タンパク質の純度はＮ８２末端配列の独特性によ り確証される。この技術を使用して計算したその分子量は２２．０００である。
プレコリン−８Ｘムターゼの精製工程およびそれらの精製収率を下表に記載する 。
１　このファクターはタンパク質の収率から計算する。
Ｃ）プレコリ〉−８ＸムターゼのＮＨ２末端配列およびその構造遺伝子の同定 この実施例は、コバラミンの生合成経路に参加するタンパク質のＮＨ２末端配列 により、このタンパク質をコードする構造遺伝子を同定する方法を例示する。
このタンパク質のＮ８２末端配列を前述したように決定した。１５の残基を同定 した Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｙｒ　Ａｓｐ　Ｔｙｒ　Ｉｌｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　 Ａｓｎ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　ＴｙｒＣＯＢＨタンパク質のＮＨ２末端配列（第１６ 図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第１６図に表す配列において、メ チオニンは前述の配列決定により決定されたペプチド配列に先行する。これから 理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチ ダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９ ８７）。第２残基はプロリンであるので、この切除は既に述べたルールと一致す る（Ｈｉｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）ｏ精製したプレコリン−８Ｘムタ ーゼの分子量は、１２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定して、２２ ，０００である。Ｃ０ＢＨタンパク質は、２２．０５０のその配列から推定され る分子量を有する（第１６図）。ＮＨ，末端配列と分子量との間の対応が明瞭に 示すように、Ｃ０ＢＨタンパク質はプレコリン−８ｘムターゼに４相当する。ｃ ｏｂＨ遺伝子はプレコリン−８ｘムターゼの構造遺伝子である。
ｄ）プレコリン−８Ｘみら調製、分離および同定プレコリン−８Ｘの典型的な実 験において、菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’のｐＸＬ２５３の粗製酵素抽出物（１００ ０ｍｇのタンパク質）を、領１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７，７（１０ ０ｍｌ）中で、従来記載されたように（Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ　ｅｔ　ａｌ　、１ ９８２）調製したトリメトルイソバクテリオコリン（１０００ナノモル）、ＥＤ ＴＡ（１ミリモル）、ＡＴＰ（１００μモル）　、ＭｇＣＬ　（２５０ｇモル） 　、ＮＡＤＨ（５０μモル）　、ＳＡＭ　（５０μモル）およびヒドロゲノビリ ン酸（２０μモル）とともに嫌気的に３０℃において２０時間インキュベーショ ンする。インキュベーションの終わりにおいて、プレコリン−８Ｘは形成した優 勢のテトラピロール生成物である。それを分離し、そしてμＢｏｎｄａｐａｋ　 Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）カラムのＨＰＬＣにより精製し、リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ５，８中の０〜５０％のアセトニトリルの直線の溶離勾配を使用する。プレ コリン−８ｘの質量（ｍ／ｚ＝８８０）およびそのメチルエステル誘導体（ｍ／ ｚ＝９７８）の質量が示すように、それはヒドロゲノビリン酸と同一の実験式を 有する化合物である。紫外線／可視光線および蛍光の特性はヒドロゲノビリン酸 のそれらと非常に異なり、そしてその分子が２つの別々の発色団を有することを 示す。プレコリン−８ｘ　（Ｔｈｉｂａｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）とヒド ロゲノビリン酸との間の酵素異性化反応のみはメチルのＣ−１１からＣ−１２へ の移動であるので、プレコリン−８Ｘはヒドロゲノビリン酸の前の最後の中間体 であり、そして対応する反応は、ブレフリン−８Ｘムターゼにより触媒される、 メチルのＣ−１１からＣ−１２への移動である。
６１５、ｃｏｂＵ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＵタンパク質の同定 ａ）ニコチネート−ヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシル トランスフェラーゼ活性（第５図、反応５）。
この実施例は、コバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例 示する。問題の酵素はニコチネート−ヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾー ルホスホリポフルトランスフエラーゼ（ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴ）（ＥＣ２，４ ，２，２１）である。ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴ活性（はぼ５単位）を含有する分 画を、１ミリモルのＮａＭＮにコチン酸モノヌクレオチド）および１０μモルの ＤＭＢＩの存在下に０゜１モルのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９，７（５００ μｌ）中の３０℃において８分間インキュベーションする。次いで反応を８０℃ に１０分間加熱することによって停止し、反応混合物を水（４体積）で希釈し、 そしてこの溶液（１００μＩ）を１．５ｃｍのヌクレオチド（Ｎｕｃｌｅｏｓ　 ｉ　１）５−Ｃ８ＨＰＬＣカラム上に注入し、０．　１モルのリン酸カリウムｐ Ｈ２，９／アセトニトリル（９３ニア）混合物で１　ｍ　ｌ　／分の流速で溶離 する。α−リバゾール５゛　−ホスフェートをフルオリメトリー（励起：２６０ ｎｍ；放射＞３７０ｎｍ）により検出および定量する。
酵素活性の単位はこれらの条件下に１ナノモルのα−リバゾール５゛−ホスフェ ート／時間を発生するために必要な酵素の量として定義される。
ｂ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴ活性の精製。
この実験は、コバラミンの生合成経路に参加するシュードモナス・デニトリフィ カンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）タンパク質を 精製する方法を例示する。実施例６．　１．　５．　ａ）に記載するアッセイを 使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴの精製は後述するように実 施する。典型的な精製実験において、ｐＸＬ１４９０Ｂが前述したように導入さ れた菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の湿潤細胞（］、Ｏｇ）を使用する。プラスミドｐ ＸＬ１４９０Ｂは第３８図に記載されている：このプラスミドはｐＸＬ５１９の ３８５ｋｂのＢａｍＨＩ−３ｓ　ｔ　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉ断片をクローニングする ことによって得た（参照、第３８図）。それゆえ、このプラスミドはＰ、ｄｅｎ ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ遺伝子を有する。
細胞を、従来記載されたように、リビドマイシンを補充したＰＳ４培地中で培養 し、ＰＳ４培地中で９６時間培養した後、収穫する。それらを０、モルのＴｒｉ ｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐ）（’７．２の（２５０ｍ　ｌ　）の中に再再懸濁させ、そ して４℃において１５分間超音波処理する。粗製の抽出物を５０，０００ｇで１ 時間遠心することによって回収し、その後間−と平衡化したＤＥＡＥ−１−リス アクリルＭ（ＩＢＦ、フランス国）カラムに通過させる。溶離液の１０％（１２ ０ｍｇのタンパク質）をモノＱ　ＨＲ１０／１０カラムで分画し、ＫＣＩの勾配 （０−０，６モル）を使用する。活性の分画をプールし、そして超遠心により２ 　ｍ　ｌ　ｉ：、ａ縮し、次いで、３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＭＣＩ緩衝液ｐＨ ７，２（１体積）と混合した後、試料を前述のようにモノＱ　ＨＲ５１５カラム で第２回の分画を実施する。活性分画をプールし、次いで試料を硫酸アンモニウ ムを使用して１モルのモル濃度にし、そしてフェニルースペロースＨＲ５１５カ ラムのクロマトグラフィーにかけ、減少する硫酸アンモニウム勾配（１〜０モル ）で溶離する。所望の活性を含有する分画をプールし、超遠心により濃縮し、モ してＢｌｏ−３ｉ１２５０ゲル透過カラムのクロマトグラフィーにがけ、２０ミ リモルのリン酸ナトリウム１５０ミリモルの硫酸ナトリウムｐＨ６，８で溶離す る。
この工程後、酵素の純度は９５％より大きい。それは５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて 汚染するタンパク質を示さない。この純度はＮＨ，末端配列の独特性により確証 される。この技術におけるその分子量は３５．　０００である。ＮＮ：ＤＭＢＩ 　ＰＲＴの精製工程を下表に記載する。
表：Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴの精製ｃ）Ｐ、 ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴのＮＨ２末端配列および この活性をコードするンユードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏ ｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定 シュードモナス−デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒ ｉｆｉｃａｎｓ）ＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴのＮＨ，末端配列を、実施例６．　１ ．　５ｂ）に記載するように精製し、前述の技術に従い実施した。最初の１５の 残基を同定した：Ｓｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｐｈｅ　 Ａｓｐ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ａｒｇ　Ｇｌｕ　ＬｅｕＣＯＢＵタンパク質のＮＨ２ 末端配列（第４１図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第４１図に表す 配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定されたペプチド配列に先 行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオ ニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよび Ｂａｕｅｒ、１９８７）。精製したＮ−トランスグリコシダーゼの分子量は、１ ２．５％の５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定して、３５．０００である。Ｃ ０ＢＵタンパク質は、３４．６４２のその配列から推定される分子量を有する（ 第４１図）。ＮＨ２末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、Ｃ０Ｂ Ｕタンパク質はＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴに相当する。ｃｏｂＵ遺伝子はＮＮ：Ｄ ＭＢＩ　ＰＲＴの構造遺伝子である。
ｄ）ＤＢＩに対するＮＮ：ＤＭＢＩ　ＰＲＴの特異性この実施例は、Ｐ、ｄｅｎ ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　ＮＮ：ＤＭＢＩＰＲＴの特異性の研究により、問題のヌ クレオチド塩基の合成を実施するＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　ＮＮ：ＤＭ ＢＩ　ＰＲＴの触媒性質を使用して、Ｐ、ｄｅｎ　ｉ　ｔ　ｒ　ｉ　ｆ　１ｃａ ｎｓが種々のコバミドを生合成する方法を例示する。
コバラミンを合成する酵素基質は５．６−ジメチルベンズイミダゾールである。
ベンズイミダゾールおよび５−メチルベンズイミダゾールは、それぞれ、自然の 基質（５，６−ジメチルベンズイミダゾール）と比較して、それぞれ、１５７％ および９２％の反応速度の反応のための基質であり、ＮａＭＮの濃度は２ミリモ ルに固定する。それゆえ、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　ＮＮ：ＤＭＢＩ　 ＰＲＴの特異性は、ベンズイミダゾールの環系を含有する基質について低い。そ れゆえ、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’（Ｃａｍｅｒ ｏｎ　ｅｔ　ａ　］、１．９８９）を使用すること、および５．６−ジメチルベ ンズイミダゾールを、それぞれ、ベンズイミダゾールまたは５−ジメチルベンズ イミダゾールで置換したＰＳ４培地中でそれを培養して、このバクテリアが、そ れぞれ、Ｃｐα−（ベンズイミダゾリル）−Ｃｏ３−シアノコバミドまたはＣｐ α−（５−メチルベンズイミダゾリル）　−Ｃ。
β−ンアノコバミドを合成するようにすることができる。他のコバミドをこの方 法で合成できることは疑いない。
６．１６、ｃｏｂＶ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＶタンパク質の同定 この実施例は、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中の補酵素Ｂ１２の生合成経路 の活性、次いでこの活性の部分的精製により、この酵素の構造遺伝子をＰ、ｄｅ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中で同定できる方法を例示する。
ａ）ＧＤＰ−コビンアミド：α−リバゾール−５°　−ホスフェ−トコビンアミ ドホスホトランスフェラーゼ（またはコビンアミド−５゛　−ホスフェートシン ターゼ）活性のアッセイこの実施例はコバラミンの生合成経路に直接関係する活 性のアッセイを例示する。問題の酵素はコバラミン−５′〜ホスフエートシンタ ーゼである。この活性（はぼ５〜１０単位）を含有する分画を、暗所で３０℃ｌ ：オイテ０．　３Ｔ　ｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ緩ｌｉ液ｐＨ９，Ｏ（５００ｔｔ　 １）中で、１　ミ’Ｊモル（７）ＥＤＴＡ、１２．５　ミ’）モル（１）ＭｇＣ １２，５０ミリモルのα−リバゾール５゛−ホスフェートおよび２０ｇモルのＧ ＤＰ−コビンアミド［５゛　〜チオキシ−５°−アデオノシル（Ａｄｏ）または 補酵素の形態］とともにインキュベーションする。１５分のインキュベーション 後、２０ミリモルのシアン化カリウム（５００μｌ）を添加し、そしてこの溶液 を８０℃に１０分間加熱する。遠心して沈澱した物質を除去した後、上澄み液の 中に存在するビタミンＢＩ２５’　−ホスフェートを実施例９に記載されている ようにアッセイする。１単位のコバラミン−５°−ホスフエートシンターゼの１ 単位を、前述の条件下に１ナノモルのコバラミン５°−ホスフェートシンターゼ を発生するために必要な酵素の量として定義する。
Ａｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドは、ＡｄＯ−コビンアミドポスフェート　（Ｂｌ ａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ　、　１９８９）　をｓｏｒ　ｐＸＬ６２３抽出物と、 コビンアミドデホスフェートグアニルトランスフェラーゼのアッセイの条件下に インキュベーションすることによって１与られる（参照、６．１．１Ｌ　ｂ）。
α−リハゾールおよびα−リハゾール５“　−ホスフェートを５Ｃ５１０Ｒｉｆ ’培養物から分離し、そして実施例６゜１５ａ）に記載するアンセイ条件下にＨ ＰＬＣにより精製する。
ｂ）コバラミン−５′　−ホスフェートの部分的精製この実験は、Ｐ、ｄｅｎｉ ｔｒｉｆｉｃａｎｓのコバラミンの生合成経路に参加するＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓｗｚａを部分的に精製する方法を例示する。前述のアッセイを使用し て、コバラミン５゛−ホスフェートシンターゼの精製を実施する。この目的で、 典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ１４９０Ｂが前述したように導入 された菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の湿潤細胞（１０ｇ）を使用する。プラスミドｐ ＸＬ１４９０Ｂは第３８図に記載されている；このプラスミドはｐＫＴ２３０の 中にクローニングされたｐＸＬ５１９の３．８５’ｋｂのＢａｍＨＩ−８ｓ　ｔ 　ｌ−３ｓ　ｔ　Ｉ断片に相当する。このプラスミドはＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉ ｃａｎｓのｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ遺伝子を有する。
ｐｄｆｓｃ５１０Ｒｉ　ｆ’中のこのプラスミドの存在は、はぼ１００のファク ターでコバラミン−５ｐシンターゼの活性を増幅させる：それゆえ、ｐＸＬ１４ ９０Ｂが有するインサートはこの酵素の構造遺伝子を含有するであろう：それゆ え、この遺伝子はｃｏｂＵまたはｃｏｂＶのみであることができる。５Ｃ５１０ Ｒｉ　ｆ’細胞は、前述したように、リビドマイシンを補充したＰＳ４培地中で 培養することによって得られる。
細胞を遠心し、次いで０．１モルのＴｒ　ｉ　ｓ　−ＨＣｌ　（ｐＨ８，３）　 ／１ミリモルのＥＤＴＡ　（緩衝液Ａ）（２５ｍｌ）の中に再＠濁させ、そして ４℃において１５分間超音波処理する。次いで、粗製の抽出物を５ｏ、０００ｇ で１時間遠心し、そして緩衝液Ａと平衡化したセフ７デ・ソクスＧ−２５カラム ｊこ通過させる。タンパク質の分画を回収し、そして３００μｌの分画（７，５ ｍｇのタンパク質）でスペロース１２ＨＲ１０／３０カラム上に注入し、緩衝液 Ａで溶離する。排除した分画を回収し、等しい体積の緩衝液Ａ／１．０モルの硫 酸アンモニウムと混合し、そしてフェニルースペロースＨＲ５１５カラムのクロ マトグラフィーにかける。タンパク質を緩衝液Ａ中の減少する硫酸アンモニウム 勾配（０゜５〜０モル）で溶離し、次いでコバラミン−５′−ホスフェートシン ターゼ活性を溶離する目的で０モルの硫酸アンモニウムでプラトーにする。
この酵素の部分的精製を下表に、精製プロセスにおいて開始のとき導入した７５ ｍｇのタンパク質に基づいて、記載する。
表：Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのコバラミン−５′　−ホスフェートシン ターゼの部分的精製 Ｃ）コバラミン−５′　−ホスフェートシンターゼの特異性（Ａｄｏ）ＧＤＰ− コビンアミドについてのＫｍは０．　９μモルである。しかしながら、この酵素 は（ＣＮ、ａｑ）形態の基質について同一の親和性および事実上同一の反応速度 を有する。α−リバゾール５′−ホスフエートについてのこの酵素のＫｍはほぼ ２．７μモルである。さらに、コバラミン−５゛　−ホスフェートシンターゼの 最も純粋な調製物はＡｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドとα−リバゾールとの補酵素 Ｂ１□を生成する反応を触媒しそして、これらの条件下に、コノくラミン５′　 −ホスフェートの蓄積は観測されない。それぞれ、３０および７００ｇモルの細 胞内のα−リバゾール５゛　−ホスフェートおよびα−リノ（ゾールの濃度は、 実施例６．　１．　５ａ）に記載する培養条件下にＰＳ４培地中の５Ｃ５１０Ｒ ｉ　ｆ’によるコバラミンの産生の間に、ＨＰＬＣにより測定された。これが示 すように、補酵素Ｂ１□は直接Ａｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドからコバラミン− ５′−ホスフェートシンターゼにより、コノくラミン５°　−ホスフェートの参 加なしで、発生させることができる。
Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｓｏｒ培養物中のコノくラミン５′−ホスフ ェートの蓄積の不存在または微量の存在は、補酵素Ｂ１□がＡｄｏ−ＧＤＰ−コ ビンアミドとα−リバゾールとの直接の生体内の反応により産生されることを確 証する。
この直接の反応は、試験管内でプロピオニバクテリウム・シエルマニイ（Ｐｒｏ ｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）（Ｒｏｎｚｉｏ　ｅｔ　 ａｌ　、１９６７；Ｒｅｎｚ、１９６８）において既に観察されそして記載され た。コバラミン−５′　−ホスフェートシンターゼの構造遺伝子はｃｏｂＵおよ びｃｏｂＶのみであるので、これらの２つのＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの ｃｏｂ遺伝子を有する断片のＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中の増幅は１００ のファクターでコバラミン−５′　−ホスフェートシンターゼ活性を増加するの で、そしてｃｏｂＵ遺伝子はＮＮ＋ＤＭＢＩ　ＰＲＴの構造遺伝子であるので、 ＣｏｂＶはそれゆえコバラミン−５°　−ホスフェートシンターゼの構造遺伝子 である。
６１７、ｃｏｂＫ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＫタンパク質の同定 ａ）プレコリン−６ｘリダクターゼ活性のア・ソセイこの実施例は、コバラミン の生合成経路に直接関係する新規な酵素活性を例示する。問題の酵素はプレコリ ン−６ｘリダクターゼである。
プレコリン−６Ｘリダクターゼ活性を含有する分画（はぼ０．０５単位、Ｕ）を ３０℃において０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７゜７　（２５０μｌ ）中で１ミリモルのＥＤＴＡ、５００ミリモルのＮＡＤＰＨ，２５ミリモルの［ メチル−３ＨコＳＡＭ（８０μＣｉ／μモル）、４μモルのプレコリン−６ｘ　 （Ｔｈｉｂａｕｔ　ｅｔ　ａｌ、、１９９０）および部分的に精製したジヒドロ プレコリン−６Ｘメチラーゼ（０゜５Ｕ）（参照、下の調製）の存在下に６０分 間インキュベーションする。
次いでこの反応を８０℃に５分間加熱することによって停止させそして、５００ ０Ｘｇにおいて５分間遠心した後、上澄み液をＤＥＡＥ−セファデックスカラム （２００μｌのゲルを含有する）上に注入する。次いでこのカラムをＴｒｉｓ− ＨＣＩ緩衝液で広範に洗浄し、そして結合した化合物を１モルのＨＣＩ　（４ｍ ｌ）で溶離する。この溶離液中の放射能の活性を液体シンチレーションカウンタ ーにより計数する。酵素活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのプレコリ ン−６ｘ／時間を還元するために必要な酵素の量として定義する。
／ヒドロプレコリンー６Ｘメチラーセを、５Ｃ５１０Ｒｉｆ’のｐＸＬ２５３の 粗製の抽出物から、モノＱ　ＨＲ５１５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオン交換カ ラムで部分的に精製する。このカラムは０１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ ７，７中のＯ〜０４モルのＫＣＩの直線の勾配で溶離する。酵素活性を０．３５ モルのＫＣＩにおいて溶離する。この活性は上で定義したプレコリン−６ｘリダ クターゼにより検出および定量する（インキュベーション媒質中のプレコリン− ６Ｘリダクターゼ（０，５Ｕ）の存在下に）。モノＱ工程後、ジヒドロプレコリ ン−６ｘメチラーゼ活性を含有する分画はプレコリン−６Ｘリダクターゼ活性を 完全に欠（。メチラーゼ活性の単位は前述の条件下に１ナノモルのメチル基がジ ヒドロプレコリン−６ｘ／時間に転移するために必要な酵素の量として定義する 。
ｂ）プレコリン−６Ｘリダクターゼ活性の精製前述のアッセイを使用して、シュ ードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ）のプレコリン−６Ｘの精製は後述するように実施する。
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ２５３　（８，７ｋｂの断片がＥ ｃｏＲＩにおいてクローニングされたプラスミドｐＫＴ２３０、第１３図）が前 述したように導入された菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の湿潤細胞（１００ｇ）を０ ．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐ）（’７．７／１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液（ 緩衝液Ａ）（２００ｍｌ）の中に懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波 処理する。次いで、粗製の抽出物を５０．０００ｇで１時間遠心し、そして緩衝 液Ａと平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに３つの部分で通過させる。ゲ ルから排除された３つの部分をプールし、そして緩衝液Ａで１リツトルに調節す る。２５　、および４０％の硫酸アンモニウムの飽和の間で沈澱するタンパク質 を遠心により集め、そして緩衝液Ａ　（５０ｍｌ）の中に再懸濁させ、そしてこ の溶液を緩衝液Ｂ（２５ミリモルのＴｒ　ｉ　５−ＨＣ１１５００ミリモルのＤ ＴＴ／１５％のグリセロール）と平衡化したセファデックスＧ−２５カラムを通 して脱塩する。次いでタンパク質溶液を緩衝液Ｂで平衡化したＱセファロース・ ファースト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ）（Ｐｈａｍａ ｃｉａ）カラム上に２．５ｍｌ／分で注入し、そして緩衝液Ｂ１０．２モルのＫ ＣＩ混合物で溶離する。この分画を緩衝液Ｃ（５０ミリモルのＴｒ　ｉ　５−Ｈ Ｃ１１５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロール）で平衡化したセファデ ックスＧ−２５カラムで脱塩する。次いでタンパク質溶液をモノＱ　ＨＲＩＯ／ １０（Ｐｈ　ａｍａ　ｃ　ｉ　ａ）カラムで分画しく各クロマトグラフィーの実 験において１００ｍｇのタンパク質）緩衝液Ｃ中のＯ〜０４モルのＫＣＩの勾配 を使用し、その後活性を含有する分画を減少する硫酸アンモニウムの勾配（１〜 ０モル）でフェニルースペロースＨＲＩＯ／１０　（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラム のクロマトグラフィーにかける。活性の分画を脱塩し、そしてプレコリン−６ｘ リダクターゼをモノＱ　ＨＲ５１５カラムで再び精製する。それを５０ミリモル のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８゜１１５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロ ール緩衝液中で０−０゜２モルのＫＣＩの勾配で溶離する。精製を完結するため に、タンパク質をＢｉｏ−Ｓｉ　１２５０　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムのりＯ’ ？トゲラフイーにかけ、２０ミリモルのリン酸カリウム１５０ミリモルの硫酸ナ トリラムｐ）（６，８１５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロールで溶離 する。この工程において、この酵素の純度は９５％より大きい。それは５ＤＳ− ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さず、タンパク質を硝酸銅で可視化する。
この純度の程度はＮＨ２末端配列の独特性により確証される。この技術における その分子量は３１．０００である。プレコリン−〇ｘリダクターゼの精製の異な る工程、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を下表に記載する 。
Ｃ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆ　１ｃａｎｓ）のプレコリン−６ＸリダクターゼのＮＨ２末端配列および 部分的内部の配列およびこの活性をコードするンユードモナス・デニトリフィカ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の 同定前述したように精製したシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレコリン−６Ｘリダクターゼ のＮＨ２末端配列を、前述したように決定した。６つの残基が同定された。
Ａｌａ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ同様に、トリプシンの消化お よび断片をＣ−１８逆相カラムのＨＰＬＣにより分割した後、３つの内部の配列 が得られた・Ｉ　ｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａ ｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｖａ　ｌ−Ｐｒｏ− Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａ　１−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ −１１ｅ−Ｇｌｙ ＣＯＢＫタンパク質のＮＨ２末端配列（第１６図）はプレコリン−６Ｘリダクタ ーゼのＮＨ２末端配列に正確に相当するが、ただし、第１６図に表す配列におい て、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。こ れから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノ ペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅ　 ｒ、１９８７）ａ同様に、３つの内部の配列はＣ０ＢＫタンパク質の３つの配列 ６０〜６９．１１２〜１２２および１４３〜１４８に相当する。精製したプレコ リン−６Ｘリダクターゼの分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により３１．　０ ００と推定される。Ｃ０ＢＫタンパク質は、２８．０００のその配列から推定さ れる分子量を有する（第１６図）。内部のＮ　Ｈ２末端配列と分子量との間の対 応が明瞭に示すように、Ｃ０ＢＫタンパク質はプレコリン−６ｘリダクターゼに 相当する。ｃｏｂＫ遺伝子はプレコリン−６ｘリダクターゼの構造遺伝子である 。
ｄ）プレコリン−６ｘリダクターゼにより触媒される反応プレコリン−６Ｘの還 元の酵素反応はＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎＳにおいて厳格にＮＡＤＰＨ依存 性である。ＮＡＤＰＨはＮＡＤＨと置換することができない。精製した酵素（ま たは精製の間の活性分画、またはなお粗製の酵素抽出物）を活性のアッセイの条 件下に、しかしＳＡＭおよびジヒドロプレコリン−６Ｘメチラーゼの不存在下に インキュベーションするとき、この反応の生成物を次いでプレコリン−６ｘの精 製について記載した系においてＨＰＬＣにより精製することができる（参照、実 施例６．　１．　４．　ｄ）。脱塩およびエステル化（４％のメタノール性硫酸 、２０°Ｃ１２時間、アルゴン雰囲気）後、対応するエステルは質量ｍ、／ｚ＝ １００８を有する。それゆえ、プレコリン−６ｘリダクターゼにより触媒される 反応の生成物はジヒドロプレコリン−６ｘ、また、プレコリン−６ｙとして知ら れている、である。
６、　１．　８、ｃｏｂＱ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＱタンパク質の 同定 ａ）プレコリン−６ｘリダクターゼ活性のアッセイこの実施例は、従来法して記 載されてきていないコバラミンの生合成経路の酵素活性のアッセイを例示する。
問題の酵素はコビル酸ノンターセである。この酵素のシンターゼはコリン環系上 の位置ｂＳｄ、ｅおよびｇにおける周辺カルボン酸官能性のアミド化を触媒する （参照、第１９図：ＰＬ、６８）。ＮＨ２基のドナーはＬ−グルタミンであり、 そして毎にアミド化は１つのＡＴＰ分子の消費を伴う。
アッセイすべき分画を暗所で３０℃において０１モルのＴｒｉｓ塩酸塩緩衝液ｐ Ｈ７，５（２５０μｌ）中で１ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミ リモルのＡＴＰ、２．５ミリモルのＭｇＣ１，，１ミリモルのグルタミンおよび １０ミリモルのＡｄｏ−コピリン酸ジーまたはペンタアミドとともに６０分間イ ンキュベーションする。この反応を０．１モルの水性シアン化カリウム溶液（２ ５μｌ）の添加により停止する。８０℃に１０分間加熱しそして５０００ｘｇに おいて５分間遠心した後、上澄み液の中に存在する形成した化合物をＨＰＬＣに より分析する。活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのアミド官能性／時 間を発生するために必要な酵素の量として定義する。
５°　−デオキシ−５′　−アデノシル（Ａｄｏ）−コピリン酸ジアミドおよび ペンタアミドを、ＰＳ４培地中の撹拌５Ｃ１５０の培養物から、実施例９に記載 する方法および原理を使用して分離する。
ｂ）コビル酸シンターゼの精製 実施例６．１．８ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニト リフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレ コリン−６Ｘの精製は後述するように実施する。
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ６１８　（参照、実施例４、　５ ．　２）導入された菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の湿潤細胞（６ｇ）を０１モルのＴ ｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７，１ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝 液（１５ｍｌ）の中で超音波処理する。遠心（５０，０００Ｘｇ、１時間）後、 抽出物を２０％のグリセロール（Ｖ／ｖ）にする。１０ミリモルのＴｒｉｓ−Ｈ ＣＩ、１ミリモルのＤＴＴ。
２０％のグリセロール緩衝液（２４ｍｌ）を粗製の抽出物（８，５ｍｌ；２０３ ．５ｍｇのタンパク質）に添加する。この溶液をモノＱ　ＨＲ１０／１０　（Ｐ ｈａｍａｃｉａ）上に注入し、５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７， １ミリモルのＤＴＴ、２０％のグリセロール緩衝液と平衡化する。タンパク質を ０５モルのＮａＣ１の直線の勾配で溶離し、そして活性タンパク質をプールし、 そして１ミリモルのＥＤＴＡにする。この溶液を硫酸アンモニウムに関して０． ８５モルにし、そしてＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，７，１ミリモルのＤＴＴ、０ ．８５モルの硫酸アンモニウム緩衝液と平衡化したフェニルースペロースＨＲ５ １５（Ｐｈａｍａｃ　ｉａ）カラム上に注入し、そしてタンパク質を０゜０８５ 〜０モルの硫酸アンモニウムの直線の減少する勾配で溶離する。
分画を直ちに２０％のグリセロールにする。活性分画を超遠心により２゜５ｍ１ ｌ：濃縮しそして平衡化したＰＤＩＯ（Ｐｈａｍａｃ　ｉ　ａ）カラムのクロマ トグラフィーにかけ、そして５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ８，３，１ミ リモルのＤＴＴ、２０％のグリセロール（ｖ／ｖ）で溶離する。タンパク質の分 画を集め、そして同一緩衝液で平衡化したモノＱ　ＨＲ５１５カラム上に注入し 、そしてタンパク質を０．５モルのＮａＣ１の直線の勾配で溶離する。最後に５ ０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７，５，１ミリモルのＤＴＴ、２０％のグ リセロール、０１モルのＮａＣｌ緩衝媒質中のＢｌｏ−５ｉ１２５０　（Ｂｉｏ −Ｒａｄ）のゲル透過クロマトグラフィーにより、純度が９７％より高いタンパ ク質を得ることができる。それは５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示 さない。この純度はＮＨ２末端配列の独特性により確証される。
この技術におけるその分子量は５７，０００である。コビル酸シンターゼの精製 の異なる工程、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を下表に記 載する。
ａ／基質としてＡｄｏ−コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドｂ／基質としてＡｄｏ−コ ピリン酸ペンタアミドＮＤ＝決定せず タンパク質の精製プロセスを通して、精製したタンパク質の純度の非常に高い程 度、ならびにコピリン酸ジアミドおよびペンタアミドの活性の比の不変性（参照 、上の表）が明瞭に示すように、１つのかつ同一のタンパク質が位置す、　ｃｊ 、　ｅおよびｇにおけるコリン環系のアミド化の４つの活性の原因となる。
Ｃ）ツユ−トモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビル酸ンンターゼのＮＨ２末端配列およびこの活性をコ ードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定 ンユードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒ ｉｆ　１ｃａｎｓ）のコビル酸ノンターゼのＮＨ２末端配列を、前述したように 決定した。１６の残基が同定されたＴｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔ　ｌｅ−Ｍｅｔ −Ｌｅｕ−Ｇｉｎ−Ｇａｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇａｙ −Ｌｙｓ−３ｅｒＣＯＢＱタンパク質のＮＨ２末端配列（第４７図）はプレコリ ン−６ＸリダクターゼのＮＨ２末端配列に正確に相当するが、ただし、第４７図 に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列 より先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内で メチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔ およびＢａｕｅｒ、１９８７）ｏ精製したコビル酸シンターゼの分子量は５ＤＳ −ＰＡＧＥ電気泳動により５７゜０００と推定される。Ｃ０ＢＱタンパク質は、 ５２，０００のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ，末 端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、Ｃ０ＢＱタンパク質はコビル 酸ンンターゼに相当する。ｃｏｂＱ遺伝子はコビル酸ンンターゼの構造遺伝子で ある。
６１．９、ｃｏｂｏ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＯタンパク質の同定 ａ）コブ（１）アラミンアデノシルトランスフエラーゼ（ＥＣ２，５゜１．１７ ）活性のアッセイ この実施例は、コバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例 示する。問題の酵素はコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ ２，５，１，１７）である。この酵素はバクテリアの細胞（Ｏｈｔａ　ｅｔ　ａ ｌ、、１９７６、Ｂｒａｙ　ｅｔ　ａｔ、、１９６２）および動物細胞（Ｆｅｎ ｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、４９７８）において実証された。それはクロストリジ ウム・テクノモルツム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ ）から精製された（Ｖｉｔｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ、　、１９６６）。
コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフエラーゼ活性（はぼ２０単位）を含有 する分画を３０℃において０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ８，０（１ ｍｌ）中で５ミリモルのＤＴＴ、４００ミリモルノ［８−１４Ｃ］　−ＡＴＰ　 （２，５μＣｉ／μモル）、８００μモルのヒドロキソコバラミンまたはジアク アコビナミドおよびＫＢＨ４（３ｍｇ）の存在下に嫌気的に光から保護して３０ 分間インキュベーションする。
次いで、この反応を８０℃に１０分間加熱することによって停止しそして、５０ ００Ｘｇにおいて５分間遠心した後、上澄み液（２００ＡＬｌ）をＨＰＬＣによ り分析する（Ｇｉｍｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ、、１９８６゜Ｊａｃｏｂｓｅｎ　ｅ ｔ　ａｌ、、１９８６）。
酵素活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのアデノンルコリノイド／分を 発生するために必要な酵素の量として定義する。
ｂ）コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの精製実施例６．１．９ ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ　（１）アラミ ンアデノシルトランスフェラーゼの精製は後述するように実施する。
典型的な精製実験において、ｃｏｂｏ遺伝子が増幅された菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ ’の湿潤細胞（Ｌｏｇ）を０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ８，０の中に懸濁 させ、そして４℃において４０分間超音波処理する。次いで、粗製抽出物を５０ ，０００Ｘｇで１時間遠心することによって回収し、そして５０ミリモルのＴｒ ｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０，０゜５ミリモルのＤＴＴ緩衝液遠心（緩衝液Ａ）と 平衡化したＰＤＩＯ（Ｐｈａｍａｃｉａ）で脱塩する。次いでタンパク質溶液を モノＱ　ＨＲＩＯ／１０　（Ｐｈａｍａｃ　ｉ　ａ）カラムで分画しく各クロマ トグラフィーの展開において２８０ｍｇのタンパク質）緩衝液Ａ中の０〜０．５ モルのＫＣｌの勾配を使用し、次いで活性を含有する分画をプールし、超遠心に より濃縮し、そして直線の減少する硫酸アンモニウムお勾配（１゜７〜０モル） におＬ’Ｃ１エニルースベロースＨＲＩＯ／１０　（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラム のクロマトグラフィーにかけ、カラムを０．　１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ ８，０，５ミリモルのＤＴＴ緩衝液で平衡化する。精製を完結するために、タン パク質を、超遠心により濃縮後、Ｂｌｏ−３ｉ１２５０　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カ ラムの親和的にり０７トグラフイーにかけ、５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　 ｐＨ７，５，０，１モルのＮａＣ１，５ミリモルのＤＴＴ緩衝液で溶離する。
この工程後、この酵素の純度は９５％より大きい。それは５ＤＳ−ＰＡＧＥにお いて汚染タンパク質を示さない。この技術におけるその分子量は２８，０００で ある。この純度の程度はＮＨ２末端配列の独特性により確証される。コブ（１） アラミンアデノシルトランスフエラーゼの精製の異なる工程、ならびにそれらの 精製ファクターおよびそれらの収率を、次の２つの基質について、下表に記載す るニジアクアコビンアミド（ａ）およびヒドロキソコバラミン（ｂ）。これらの 結果は、コリノイド基質の性質に対するこの酵素の特異性の不存在を実証する。
そのうえ、コピリン酸ジアミドとＢ１２との間の生合成経路のすべてのコリノイ ドがそれらの自然の形態で分離され（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、、発表され ない結果）、そして補酵素の形態であることが証明された。これが実証するよう に、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフエラーゼの自然の基質はコピリン 酸ａ、Ｃ−ジアミドジアミドである。
表、コブ（１）アラミンアデノノルトランスフエラーゼの精製Ｃ）ンユードモナ ス憂デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎ　ｉ　ｔ　ｒ　ｉ　ｆ 　１ｃａｎｓ）のコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフエラーゼのＮＨ２末 端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓ ｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定 ソニートモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎ　ｉ　 ｔ　ｒ　ｉ　ｆ　１ｃａｎｓ）のコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラ ーゼのＮＨ２末端配列を、実施例６．　１．　９　ｂ）に記載するように精製し 、前述したように決定した。１３の残基が同定された：Ｓｅ　ｒ−Ａｓｐ−Ｇｌ ｕ−Ｔｈｒ−？−Ｖａ　Ｉ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌ　ａ−Ｐｒｏ−Ａｌ ａ−Ｌｙｓ−ＬｙｓＣＯＢＯタンパク質のＮＨ２末端配列（第４７図）はコブ（ Ｉ）アラミンアデノシトランスフェラトランスフエラーゼのＮＨ２末端配列に正 確に相当するが、ただし、第４７図に表す配列において、メチオニンは直接の配 列決定により決定してペプチド配列より先行する。これから理解されるように、 アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペブチダトランスフエラー ゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７ ）ｏ精製したコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフエラーゼの分子量は５Ｄ Ｓ−ＰＡＧＥ電気泳動により２８，０００と推定される。Ｃ０ＥＩＯタンパク質 は、２４．０００のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ ２末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、Ｃ０ＢＯタンノくり質は コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフエラーゼに相当する。ｃｏｂＫ遺伝子 はコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフエラーゼの構造遺伝子である。
６、　１．　１０、ｃｏｂＮ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＮタンパク質 の同定 ａ）ヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転 化の活性の実証 この実施例は、従来法して記載されてきていないコノくラミンの生合成経路に直 接関係する酵素活性の実証を例示する。問題の活性はヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ −ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転化の活性である。
この活性は、なかでも、次の典型的な実験により実証される。菌株５Ｃ５１０Ｒ ｉｆ’の湿潤細胞（１０ｇ）を０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣ１緩衝液ｐＨ８，０ （２０ｍｌ）中で超音波処理し、次いで５０．　０００Ｘｇで１時間遠心するこ とによって細胞の破片を除去することによって、菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の粗製 の抽出物を得る。この抽出物のタンパク質（１０００ｍｇ）を、７ミリモルのＡ ＴＰおよび２００ミリモルのＣｏＣ１，を含有するり　２モルのＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ緩衝液ｐＨ８゜０　（４０ｍｌ）中で、炭素−１４標識したヒドロゲノビリン 酸ジアミド（３２ナノモル；５０μＣｉ／μモル）と３０℃において１時間イン キュベーションする。この反応を１モルのＫＨ２Ｐｏ４（７，５ｍ１）および０ ３モルのＫＣＮ　（６ｍｌ）を添加することによって停止させ、次いで８０℃に １０分間加熱する。１５０００Ｘｇにおいて５０分間遠心した後、ＨＰＬＣ分析 は次のことを示す＝　（１）出発ヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドと同一の 比放射能を有するコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミド（１９２ナノモル）のインキュベ ーションの間の形成、および（２）ヒトロケノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドの対応 する量の消失。この産生物が事実コピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドであることを確証 するために、産生物をＨＰＬＣにより精製し、次いで５％の硫酸を含有するメタ ノール中でエステル化する（１８時間、２０°Ｃ）。産生ずるコピリン酸ａ、Ｃ −ジアミドペンタメチルエステルの真偽はＴＬＣ（参照試料に関する）および質 量スペクトルにより実証される。放射性標識っけを、ヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ −ジアミドの中ではなく、コバルトの中に導入する（コバルト−５７を使用する ）同様なインキュベーション下に、コバルト−５７標識したコピリン酸ａ、Ｃ− ジアミドを生合成し、そして同一の結論を引き出すことができるであろう。
炭素−１４標識したヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドは次の方法で得られる ：ヒドロゲノビリン酸を試験管内で［メチル−”ＣＩ　ＳＡＭを使用して生合成 し、次いでヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドに転化し、そして実施例６．　 １．　２に記載されているようにＨＰＬＣにより精製する。
この研究は、コバルトの挿入がＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中でヒドロゲノ ビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドのレベルにおいて起こることを実証する。記載する条 件下に、ヒドロゲノビリン酸はコバルトによる酵素的キレート化のための基質で はない。
ｂ）ヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転 化に関係する菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の調製のアッセイおよび精製 アッセイすべき分画（０，５〜２単位）を、３０℃において、前述したように得 られた菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の粗製の抽出物（５０μｌ）、７ミリモルのＡ ＴＰ、２００ミリモルのＣｏＣ１ｔおよび７ミリモルの炭素−１４標識したヒド ロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミド（５０μＣｉ／μモル）とともニｏ、１モルの Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ８，０（４００μｌ）中で６０分間インキュベーシ ョンする。この反応を１モルのＫＨ２Ｐｏ４（７５μｌ）および０．３モルのＫ ＣＮ（６０μｌ）を添加することによって停止させ、次いで８０℃に１０分間加 熱する。１５０００Ｘｇにおいて５０分間遠心した後、上澄み液をＨＰＬＣによ り分析して、形成したコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドを定量する（参照、実施例９ ）。酵素活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのコピリン酸ａ。
Ｃ−ジアミド／時間を発生させるために必要な酵素の量として定義される。これ らの条件下に、明らかなように、プラスミドｐＸＬ１９０９が導入された菌株５ Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’　（参照、実施例４．　５．　２）の抽出物は５Ｃ５１０Ｒ ｉｆ’の抽出物の２０〜５０倍の活性を有する。この基準に基づいて、単独でこ の活性の増幅の原因となるタンパク質を精製する。
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ１９０９が導入された菌株５Ｃ５ １０Ｒｉｆ’の湿潤細胞（１０ｇ）を０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８， ０の中に懸濁させ、そして４℃において３０分間超音波処理する。次いで、粗製 抽出物を５０．ＯＯＯｘｇで１時間遠心することによって回収し、そして０．　 １モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８゜０（緩衝液Ａ）と平衡化したＰＤＩＯ（Ｐ ｈａｍａｃ　ｉ　ａ）で脱塩する。
タンパク質溶液をモノＱ　ＨＲＩＯ／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで分画し く各クロマトグラフィーの展開において２１３ｍｇのタンパク質）緩衝液Ａ中の Ｏ−領　５モルのＫＣＩの勾配を使用し、次いで活性を含有する分画をプールし 、超遠心により濃縮し、そして０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ７，２ （緩衝液Ｂ）で平衡化したＰＤＩＯ（Ｐｈａｍａｃ　ｉ　ａ）カラムで脱塩し、 そしてモノＱ　ＨＲＩＯ／１０（Ｐｈａｍａｃ　ｉ　ａ）カラムのクロマトグラ フィーにかけ、緩衝液Ｂ中のＯ〜０．５モルのＫＣＩの勾配を使用する。活性を 含有する分画をプールし、超遠心により濃縮し、そして緩衝液Ｂで平衡化したＰ ＤＩＯ（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで脱塩し、そしてモノＱ　ＨＲＩＯ／１０　 （Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、緩衝液Ｂ中の０〜０ ，５モルのＫＣｌの勾配を使用する。精製を完結するために、タンパク質を、超 遠心により濃縮後、Ｂｉｏ−Ｓｉ　１２５０　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムの親和 的にクロマトグラフィーにかけ、２０ミリモルのリン酸カリウム１５０ミリモル の硫酸ナトリウムｐＨ６，８で溶離する。
この段階後、この酵素の純度は９５％より大きい。それは５ＤＳ−ＰＡＧＥにお いて汚染タンパク質を示さない。この技術におけるその分子量は１３５，０００ である。この純度の程度はＮＨ，末端配列の独特性により確証される。ヒドロゲ ノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転化に関係する 菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の精製の異なる段階、ならびにそれらの精製ファクタ ーおよびそれらの収率を、下表に記載する。
ドへの転化に関係する菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の精製Ｃ）ヒドロゲノビリン酸ａ 、Ｃ−ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転化に関係するシュードモナ ス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎ ｓ）のタンパク質のＮＨ！末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス ・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ）の構造遺伝子の同定 実施例６．１．１０ｂ）に記載するように精製したタンパク質のＮＨ２末端配列 を、前述したように決定した。６つの残基が同定された：Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅ ｕ−Ａｌａ−ＧｉｎＣＯＢＮタンパク質のＮＨ２末端配列（第４７図）は精製し たタンパク質のＮＨ２末端配列に正確に相当するが、ただし、第４７図に表す配 列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行 する。これから理解されるように、アミン末端のメチオニンは生体内でメチオニ ンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　１３ａｓｓａｔおよび Ｂａｕｅｒ、１９８７）ｏ精製したタンパク質の分子量は５ＤＳ−ＰＡＧＥ電気 泳動により１３５．０００と推定される。Ｃ０ＢＮタンパク質は、１３８，００ ０のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ２末端配列と分 子量との間の対応が明瞭に示すように、Ｃ０ＢＮタンパク質はヒドロゲノビリン 酸ａ、Ｃ−ジアミドのコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドへの転化に関係するタンパク 質に相当する。それゆえ、ｃｏｂＮ遺伝子はこのタンパク質の構造遺伝子である 。
６、　１．　１１、ｃｏｂＰ遺伝子によりエンコードされるＣ０ＢＰタンパク質 の同定 ａ）コビンアミドキナーゼ活性のアッセイこの実施例は、従来決して研究されて きていないコバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例示す る。問題の活性はコビンアミドキナーゼの活性である。それはコビンアミドホス フエートを発生するＡｄｏ−コビンアミドの（Ｒ）−１−アミノ−２−プロパツ ール残基のヒドロキシル基のＡＴＰ−依存性リン酸化反応を触媒する。
アッセイすべき分画を、暗所で３０℃において、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリ モルのＡＴＰ、２．５ミリモルのＭｇＣ１□、１６ミリモルのＡｄｏ−ニアビン アミド（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）を含有する０、１モルの Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ緩衝液ｐＨ８，８（５００μｌ）中で６０分間インキュベーシ ョンする。この反応を２０ミリモルの水性シアン化カリウム溶液（５００ｍｌ） の添加により停止させる。８０℃に１０分間加熱し、そして１５０００Ｘｇにお いて５０分間遠心した後、上澄み液の中に存在する形成したコビンアミドをＨＰ ＬＣ（参照、実施例９）により次の簡素化した直線の勾配を使用してアッセイす る：１５分かけてＡ中の２５〜３０％のＢ１次いで１２分かけて３０〜１００％ のＢ、そして３分１００％のＢ０ 活性の単位は、これらの条件下にコビンアミドから１ナノモルのコビンアミドホ スフエート／時間を発生させるために必要な酵素の量として定義される。
ｂ）コビンアミドホスフエートグアニルトランスフエラーゼ活性のアッセイ この実施例は、従来決して研究されてきていないコバラミンの生合成経路に直接 関係する酵素活性のアッセイを例示する。問題の活性はコビンアミドホスフェー トグアニルトランスフエラーゼの活性である。それはＡｄｏ−コビンアミドホス フェートへのＧＴＰ分子のＧＭＰ部分の付加を触媒し、これにより１分子のＧＤ Ｐ−コビンアミドを発生し、そして１分子のピロホスフェートを遊離する。
この活性はコビンアミドキナーゼと同一条件下にアッセイするが、ただしインキ ュベーションの間にＡｄｏ−コビンアミドホスフェート（１６ミリモル）（Ｂｌ ａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）およびＧＴＰ（２ミリモル）を、それ ぞれ、Ａｄｏ−コビンアミドおよびＡＴＰの代わりに使用する。
活性の単位は、これらの条件下にコビンアミドホスフエートから１ナノモルのＧ ＤＰ−コビンアミド／時間を発生させるために必要な酵素の量として定義される 。
ｂ）コビンアミドキナーゼの精製 実施例６．１．１ｌａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニ トリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の精 製を次のようにして実施する。
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ６２３　（参照、実施例４、　５ ．　２）が導入された菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の湿潤細胞（５ｇ）を０１モルの Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ１ｐＨ７，６（緩衝液Ａ）（２０ｍｌ）中で超音波処理する 。超遠心（５０，ＯＯＯＸｇ、１時間）および緩衝液Ａに対して４時間の透析後 、保持された物質（４，５ｍ１）を緩衝液Ａと平衡化したモノＱ　ＨＲＩＯ／１ ０（（Ｐｈａｍａｃｉａ）上に注入する。タンパク質を０．４モルのＮａＣ１の 直線の勾配で溶離し、そしてプールした活性分画を３０ミリモルのＴｒｉｓ−Ｈ ＣＩ１５ミリモルのリン酸カリウム１５ミリモルの塩化カルシウムｐＨ７，６（ 緩衝液Ｂ）中で平衡化したＰＤ−１０（Ｐｈａｍａｃ　ｉ　ａ）カラムに通過さ せる。このタンパク質溶液を緩衝液Ｂ中で平衡化したＢｌｏ−Ｇｅ１　ＨＰＨＴ 　（Ｂ　ｉ　ｏ−Ｒａ　ｄ）カラムで分画し、そして５〜３５０ミリモルのリン 酸カリウムの勾配で溶離する。活性分画をプールし、そしてリン酸カリウムに関 して５００ミリモルにし、次いでフェニルースペロースＨＲ５１５（Ｐｈａｍａ ｃ　ｉ　ａ）カラムで分画し、減少する硫酸アンモニウムの勾配で溶離する。活 性を含有する分画を最終的にＴｒｉｓ−ＨＣ１ｐＨ７，３中でモノＱ　ＨＲ５１ ５カラムで再び精製する。この段階後、このタンパク質の純度は９７％より大き い。それは５ＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さない。この技術にお けるその分子量は２０，０００である。コビンアミドキナーゼの精製の異なる段 階、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を、表Ａに記載する。
コビンアミドキナーゼ活性を含有する分画は、また、コビンアミドホスフエート グアニルトランスフエラーゼ活性を有する。そのうえ、上の表に表す結果により 示されるように、これらの２つの活性の比は精製を通じて分画において一定に止 まる。最後に、精製したタンパク質は非常に高い純度、９７％を越える純度を有 する。それゆえ、これらの結果が総合的に示すように、１つのかつ同一のタンパ ク質はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎ ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）におけるコバラミンの生合成経路の両者の連続的活性、 すなわち、コビンアミドキナーゼおよびコビンアミドホスフエートグアニルトラ ンスフエラーゼの原因となる。
ｄ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉ　 ｔｒｉ　ｆ　１ｃａｎｓ）のコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフエート グアニルトランスフェラーゼのＮＨ２末端配列およびこの活性をコードするシュ ードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅ ｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆ　１ｃａｎｓ）のコビンアミドキナーゼ／ コビンアミドホスフエートグアニルトランスフエラーゼのＮＨ２末端配列を、前 述したように決定した。１０の残基が同定された・５ｅｒ−９ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓ ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ ＣＯＲＰタンパク質のＮＨ２末端配列（第４７図）はこの配列のＮＨ２末端配列 に正確に相当するが、ただし、第４７図に表す配列において、メチオニンは直接 の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。
これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミ ノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅ ｒ、１９８７）。精製したコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフエートグ アニルトランスフエラーゼの分子量はＳＤＳ〜ＰＡＧＥ電気泳動により２０，０ ００と推定される。Ｃ０ＲＰタンパク質は、１９．０００のその配列から推定さ れる分子量を有する（第４７図）。ＮＨ２末端配列と分子量との間の対応が明瞭 に示すように、Ｃ０ＲＰタンパク質はコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホス フェートグアニルトランスフェラーゼに相当する。ｃｏｂＰ遺伝子はコビンアミ ドキナーゼ／コビンアミドホスフエートグアニルトランスフェラーゼの構造遺伝 子である。
６．２−蓄積した生合成の中間体によるＣＯＢタンパク質の決定この実施例は、 シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質に酵素活性を帰 属させることができる方法を例示する。この活性は、問題の段階においてブロッ クされたＣａｂの１または２以上の突然変異における蓄積された生合成中間体に 関して得られたデータにに基づいて帰属される。事実、ある突然変異が生合成中 間体を蓄積する場合、この突然変異がその基質として問題の中間体をを有する段 階においてブロックされる可能性が非常にある。
６、　２．　１、ＣｏＢＣおよびＣ０ＢＤタンパク質の性質実施例１および４に 既に記載したＣｏｂ突然変異Ｇ６４３（Ａｇｒ。
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＧ５７２　（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔ　１ｄａ）は、ｃｏｂＣタンパク質に相当する段階におい てブロックされる。事実、これらの２つの突然変異は、ＣｏｂＣ遺伝子の中に存 在するトランスポゾンＴｎ５の不活性化挿入と相補性ではない。２つの菌株Ｇ６ ４３およびＧ５７２、ならびに突然変異しない親の菌株［Ｃ５８−Ｃ９Ｒ１ｆ’ およびＫＴ２４４０Ｒｉ　ｆ’　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９ ）］を、Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓについてＰＳ４’培地およびＰ、ｐｕｔｉ ｄａについてＰＳ４”培地（Ｐ　Ｓ　４’　およびＰＳ４”は、前述のＰＳ４よ り、それぞれ、１００倍および１０００倍少ないコバルトを含有するＰＳ４培地 に相当する）中で前述したように３日間培養した。”ＣｏＣｌ２を培養物に添加 した（２５ｍｌの培養物について２．５μＣｉ／領　１μモル）。細胞内コリノ イドをそれらの自然の形態で分離し、そしてそれらのＨＰＬＣ挙動により同定し た。親の菌株は補酵素Ｂｌ！以外のコリノイドを蓄積しない。
２つの突然変異Ｇ６４３およびＧ５７２はアデノシル化コビル酸をそれぞれ１１ ％および６％の比率で蓄積する。これらの％比率は親の菌株により合成された補 酵素Ｂ１□のレベルに関して計算する。コビル酸を別として、突然変異Ｇ６４３ はコピリン酸ペンタアミドを２％の比率で蓄積する；コピリン酸ペンタアミドは コビル酸に先行する中間体である。これらの突然変異の研究により、これらの突 然変異はコビル酸後にブロックされることがわかる。すべてのこれらのＣｏｂ突 然変異は、ウロ゛ゲンＩＩＩとコビンアミドとの間に、あるいはコビンアミドと コバラミンとの間においてブロックされる。突然変異Ｇ６４３およびＧ５７２は ウロ゛ゲンＩＩＩとコビンアミドとの間にブロックされる。ここで、これらの突 然変異がコビンアミドの前にブロックされ、そして両者がコビル酸を蓄積する場 合、それらがコードするタンパク質がアミノプロパツール残基でコビル酸をアミ ド化してコビンアミドを住成する反応を触媒する酵素的段階（コビンアミドシン ターゼと呼ぶ）にのみ参加することができる；それらは、また、アミノプロパツ ールそれ自体でないはない場合でも、アミノプロパツールを提供する反応の基質 の合成に多分参加することができる。ｃｏｂＣ遺伝子は、コビンアミドシンター ゼまたはそのサブユニットの１つであるタンパク質をコードする。
ｃｏｂＤ遺伝子に相当する段階においてブロックされるアグロバクテリウム・ツ メファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣ ｏｂ突然変異Ｇ６３４を同一の方法で分析した。この突然変異はｃｏｂＢ遺伝子 における不活性化挿入と相補性ではない（実施例４１）。この突然変異の中に見 いだされる唯一の細胞内コリノイドはアデノシル化コビル酸である。上の突然変 異ど同様に、この突然変異はコビル酸のコビンアミドへの転化に参加するか、あ るいは多分この反応の他の基質の合成に参加するタンパク質をコードする。
これらの２つの異なる遺伝子（ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ）は、同一段階に参加す る２つのタンパク質をコードする。
６、　２．　２、ＣＯＢＦ−Ｃ０８Ｍタンパク質の性質既に記載したアグロバク テリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓ）の突然変異を研究し、実施例４．２に記載する研究はこれらの突然変異 の各々がブロックされることを示した。それらは次の突然変異である：Ｇ６１２ 　（ｃｏｂＦ）　、Ｇ６１５　（ｃｏｂＧ）　、Ｇ６１６　（ｃｏｂＨ）　、Ｇ ６１３　（ｃｏｂＬ）、Ｇ６１１　（ｃｏｂＪ）　、Ｇ６２０　（ｃｏｂＫ）　 、Ｇ６３８　（ｃｏｂＬ）およびＧ６０６　（コバミド）：われわれは括弧内に これらの突然変異の相補性の原因となるシュードモナス・デニトリフィカンス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の遺伝子（実施例５） を示す、それゆえこの遺伝子はこの突然変異において突然変異される遺伝子に相 当する。これらの突然変異は前述したように標識したコバルトを有するＰＳ４培 地中で培養した。４日のインキュベーション後、突然変異をコリノイドおよびデ コバルトコリノイドの細胞内含量について分析した（参照、実施例６．　１．　 ２および９）。
表　シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉ　ｆ　ｊｅａｎｓ）の８．７ｋｂの断片の遺伝子においてブロックされたア グロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｆｕｍ　ｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）により蓄積された中間体ＨＢＡ　：ヒドロゲノビリン酸 ＨＲＡＭ：ヒドロゲノビリン酸モノアミドＨＢＡＤ・ヒドロゲノビリン酸ジアミ ド＊事実、これは既に記載された菌株Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉ　ｆ　’Ｎａ　］　’　 （Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ　、１９８９）１値は突然変異しない菌株Ｃ５８ −Ｃ９Ｒｉ　ｆ　’Ｎａ　１　’の中に蓄積した同一の中間体の％として表す。
これらの結果が示すように、突然変異のいずれもコリノイドを蓄積しない（ｃｏ ｂＦ遺伝子において不活性化される突然変異、Ｇ６１２、を除外する、これは、 その一部分について、コビンアミドを蓄積するが、そのレベルは突然変異しない 菌株が合成するコバラミンの２．２％に等しい）。しかしながら、いくつかの突 然変異（Ｇ６１２、Ｇ６１５およびＧ６１６）は、親の菌株のコバラミンのレベ ルの１０％より多くを表すコバラミンのレベルを有する。すべてのこれらの突然 変異は多分少な（ともコピリン酸ジアミドの前にブロックされる。すべての突然 変異は、突然変異しない菌株より小さい量でヒドロゲノビリン酸およびヒドロゲ ノビリン酸ジアミドを蓄積する：それゆえ、それらはヒドロゲノビリン酸の前に ブロックされる可能性が非常に多い。すべてのｃｏｂＦ−ｃ。
ｂＧ遺伝子はヒドロゲノビリン酸の前に参加するタンパク質をコードすると結論 することができる。突然変異Ｇ６１３は、とくにヒドロゲノビリン酸の前に参加 する、ＳＰ２ＭＴをコードするｃｏｂｌ遺伝子の中で突然変異される。この突然 変異について、中間体の蓄積に関する本発明の実施例の結果は、この突然変異に おいて不活性化される段階と完全に一致する、すなわち、この突然変異はヒドロ ゲノビリン酸後の中間体を突然変異しない菌株で観測されるより高いレベルで蓄 積しない。この結果は、ｃｏｂＦＳｃｏｂＪ、ｃｏｂＬおよびｃｏｂＭ遺伝子ニ ツいテであり、実施例４．６の結果と一致し、ここでこれらの遺伝子はメチルの ＳＡＭ依存性転移を触媒し、それゆえヒドロゲノビリン酸の前に参加するタンパ ク質をコードする。ＳＰ！ＭＴの構造遺伝子であるｃｏｂＩを除外して、これら の遺伝子はプレコリン−３後に参加する。事実、それらはＳＵＭＴまたはＳＰ、 ＭＴの構造遺伝子ではないので、それらは後に、すなわち、プレコリン−３の後 に必ず参加する（本発明において記載するすべてのｃａｂ遺伝子はウロ′ゲンＩ ＩＩとコバラミンとの間に参加する）。これらのｃｏｂＦ−ｃｏｂＨおよびｃｏ ｂＪ−ｃｏｂＭの遺伝子は、プレコリン−３とヒドロゲノビリン酸との間に参加 する酵素をコードする。
６、　２．　３、Ｃ０Ｂ５およびＣ０ＢＴタンパク質の性質実施例１および４． ３に記載する突然変異Ｇ２０３５は、Ｃ０Ｂ５タンパク質に相当する段階におい てブロックされる。実施例１に記載する突然変異Ｇ２０３７は、Ｃ０ＢＴタンパ ク質に相当する段階においてブロックされる。これらの菌株、ならびに親の菌株 （Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　Ｃ５８Ｃ９Ｒｉｆ’ ）を、ＰＳ４゛培地（これは塩化コバルト濃度がＰＳ４培地より１００倍低いＰ Ｓ４培地である）中で放射性コバル）”ＣｏＣｌ２の存在下に３日間培養し、モ してデコバルトコリノイドの細胞内含量、ならびにコリノイド含量を、既に前述 したように分析する（参照、実施例６．　２．　２）。菌株Ｇ２０３５およびＧ ２０３７はコリノイドを蓄積せず、そして大きい濃度（親の菌株で観測される濃 度より大きい）のヒドロゲノビリン酸およびヒドロゲノビリン酸モノアミドおよ びジアミドは菌株Ｇ２０３５でのみ存在する。この突然変異は、多分、ヒドロゲ ノビリン酸ジアミドの後にかっコピリン酸ジアミドの前に位置する段階において ブロックされる。結局、ｃｏｂＳ遺伝子はヒドロゲノビリン酸ジアミドのコピリ ン酸ジアミドへの転化に関係する酵素の１つをコードすると考えられる；それゆ え、このタンパク質はコバルトの挿入に、あるいは非アデノシル化コピリン酸ａ 、Ｃ−ジアミドのコバルトの還元に参加するすることができる。対照的に、突然 変異Ｇ２’０３７はヒドロゲノビリン酸の上流に位置する段階においてブロック されると考えられる。ｃｏｂＴ遺伝子はヒドロゲノビリン酸の上流およびプレコ リン−３の下流の酵素的段階に関係するタンパク質をコードすると考えられる（ プレコリン−３の下流に関係する酵素をコードする他の構造遺伝子は既に同定さ れた）。ｃｏｂＴタンパク質についての他の可能性は、それが、実施例５におい て提案されているように、コバルト結合性タンパク質としておよび／または他の １または２以上のタンパク質とその酸性部分を経て相互作用するタンパク質とし て参加することである。
６２．４、Ｃ０ＢＶタンパク質の性質 実施例１および４．４に記載する突然変異Ｇ２０３９およびＧ２０４０は、Ｃ０ ＢＶタンパク質に相当する段階においてブロックされる。これらの菌株、ならび に親の菌株をＰＳ４’培地中で放射性コバルト５７ＣＯＣ１２の存在下に３日間 培養し、次いでデコバルトコリノイドの細胞内含量を実施例９に記載するように 分析する。菌株Ｇ２０３９およびＧ２０４０はコビル酸、コビンアミド、コビン アミドホスフェートおよびＧＤＰ−コビンアミドを蓄積する。これらの突然変異 は、多分、ＧＤＰ−コビンアミドの下流の酵素的段階においてブロックされるｏ 　ｃｏｂＶ遺伝子はＧＤＰ−コビンアミドのコバラミンへの転化に関係する酵素 をコードする、参照、実施例５゜この結果は、基質としてＡｄｏ−ＧＤＰ−コビ ンアミドを有するＣ０ＢＶタンパク質のコバラミン−５゛　−ホスフェートシン ターゼ活性と完全に一致する。
６．３、ＳＡＭに対する親和性の研究によるＣＯＢタンパク質の決定この実施例 は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｊｔｒｉｆｉｃａｎｓ）から精製したＣＯＢタンパク質を使 用して、ＳＡＭ結合活性を試験管内で実証する方法を例示する。
ＣＯＢタンパク質がこのような活性を有する場合、それはこのＣＯＥタンパク質 が経路のメチルトランスフェラーゼであること、およびそれがウロ°ゲンＩＩＩ とコピリン酸との間で起こる８つのメチル基の転移の１つに参加することを意味 する。
６、　３．　１、精製したタンパク質に対するＳＡＭの親和性の試験この試験は 、コバラミンの生合成経路のメチルトランスフェラーゼが明確にＳＡＭ結合部位 を有するという原理に基づく。この部位は、ＳＡＭに特異的に結合しないタンパ ク質についてより高いＳＡＭの親和性により実証されなくてはならない。研究す るタンパク質を過剰の放射性ＳＡＭの存在下にインキュベーションした後、タン パク質をゲル透過クロマトグラフィーにより遊離ＳＡＭから分離する。このタン パク質の分子量を有する分画の中に現れる放射能はインキュベーションの間に結 合したＳＡＭに相当する。クロマトグラフィーを２℃において実施して、分離の 間に結合したＳＡＭの解放を最大に制限する。
タンパク質（はぼ１０ｇｇ）を３０℃において０．　１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ 　ｐＨ７，７（２００μｍ）中で［メチル−３８］　ＳＡＭ　（５ナノモル、１ μＣｉ）とともに１０分間インキュベーションする。インキュベーション後、こ の混合物の一部分（１００μｍ）を直ちにＴＳＫ−１２５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カ ラム上に注入し、このカラムの分配会社により推奨されるように、５０ミリモル の硫酸ナトリウム／２０ミリモルのリン酸二水素ナトリウム混合物で１ｍ１／分 で溶離する。Ｑ、５ｍｌの分画を集め、そして液体ソンチレーノヨンカウンター で計数する。タンパク質およびＳＡＭの保持時間は２８０ｎｍにおける溶離液の 吸収の記録から直接得られる。
６．３２、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣ０ＢＡおよびＣ０ＢＦへのＳＡＭの結合の試験 管内研究 ａ）ＣＯＢＦおよびＣ０ＢＡタンパク質の精製シュードモナス・デニトリフィカ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆ　１ｃａｎｓ）ｃｏｂＦタン パク質を後述するように精製する。典型的な実験において、ＰＳ４培地中の培養 後に得られた、プラスミドｐＸＬ１５４６が導入された菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ ’　（参照、実施例７．３）　の湿１細胞（１０ｇ）を、０．１モルのＴｒｉｓ −ＨＣＩｐＨ７，７（３０ｍｌ）の中に再懸濁し、そして４℃において１５分間 超音波処理する。次いで、粗製の抽出物を５０．０００ｇで１時間遠心機するこ とによって回収し、そして上澄み液をＤＥＡＥ−セフアゾ・ソクス（Ｓｅｐｈ、 ａｄｅｘ）カラム（１ｍｌのゲル）に通過させて存在するテトラピロール化合物 を除去する。次いで、この抽出物のタンパク質（１０ｍｇ；０．７ｍ１）を同一 緩衝液と平衡化したモノＱ　ＨＲ５１５カラム上に注入する。タンパク質を直線 のＫＣＩ勾配（０〜領　２５モル）で溶離する。Ｃ０ＢＦタンパク質を０．２０ モルのＫＣＩで溶離する。それは０．１モルのＴｒｉｓ−ＭＣＩ　ｐＨ７，７で ２倍に希釈し、そして２回目にモノＱ　ＨＲ５１５で精製する。５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅおよびクーマツシーブルーの可視化を使用してタンパク質を明らかにする。そ のうえ、この技術はＣ０ＢＦはこの精製工程後はぼ９５％の純度である。精製し たタンパク質のＮＨ２末端配列を前述したように決定する。２つのＮＨ２末端配 列は各劣化サイクルにおいて同時に現れる：それらは次の順序で、示す比率で存 在する：配列１（存在量３４％） Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　 Ｉｌｅ　Ｉｌｅ配列２（存在量６６％） Ｍｅｔ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　Ｉｌｅ　Ｌｅｕ　Ｉｌｅ　Ｉｌｅ　Ｇｌｙ　Ｉｌｅ　 Ｇｌｙ　Ｓｅｒ配列１は第１６図に記載するＣ０ＢＦタンパク質のＮＨ２末端配 列に相当するが、ただしアミノ末端のメチオニンはメチオニンアミノペプチダー ゼ（Ｂｅｎ　Ｂａ５ｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）により既に述べられた ルール（Ｈｉｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）に従い切除される。配列２は 、より大きい量で存在し、同一タンパク質に相当するが、このタンパク質はわれ われが仮定した翻訳開始ＡＴＧコドンにおいて実施されない翻訳開始を有し、そ こに解読フレーム上の下流の５つのコドンが位置する（第１６図）。事実、この 配列のアミノ酸は、正確には、この配列の第２メチオニン（アミノ酸Ｎ０６）か ら出発するＣ０ＢＦタンパク質の配列の中に見いだされるものである。この場合 において、アミノ末端のメチオニンは切除されず、これは既に述べられたルール （Ｈｉｒｅｌ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）を確証する。プラスミドｐＸＬ１５ ４６を有する菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’において、２つの翻訳開始が存在し、それ らは、一方において、われわれの構成において、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎ ｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）配列から正しい距離に位置するメチオニンのコドンに相当 し、そして一方において第１６図に表すｃｏｂＦ遺伝子の配列の中に存在する第 ２のメチオニンのコドンにおいて実施される。これから理解されるように、Ｃ０ ＢＦタン／々り質は多分第１６図に示すメチオニンにおいて開始されず、５アミ ノ酸以後に存在するメチオニンにおいて開始される。
すべての場合において、この結果が示すように、Ｃ０ＢＦタンパク質は、事実、 発現され、そして後者は４アミノ酸だけ伸長した形態で発現される。精製の間に 、両者のタンパク質は精製される。この実施例において、これらの２つの精製さ れたタンパク質の混合物をわれわれは精製したタンパク質と呼ぶ。
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒ ｉｆ　１ｃａｎｓ）のＣ０ＢＡを、前述したように精製する（ＢＩａｎｃｈｅ　 ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）。
ｂ）ＳＡＭの結合 これらの２つのタンパク質へのＳＡＭの結合を、実施例６．３ａ）において前述 したように研究する。ウシ血清アルブミンおよび精製したＣ０ＢＨタンパク質を 陰性の対照として使用する。Ｃ０ＢＡおよびＣ０ＢＦタンパク質について、放射 能のピークはＴＳＫ−１２５カラムからこれらのタンパク質の出現時間において 出現するとき観測される（第２０図）。この試験において、Ｃ０ＢＩタンパク質 は同一のＳＡＭの結合性質を示す。対照的に、ＢＳＡおよびＣ０ＢＨタンパク質 ではこのような放射能のピークは存在しない。この試験はＣ０ＢＡ、Ｃ０ＢＩお よびＣ０ＢＦタンパク質へのＳＡＭの試験管内を実証する。これらの結果が示す ように、ＣｏＢＡｌＣＯＢＩおよびＣｏＢＦはＳＡＭメチルトランスフェラーゼ である。この結果はＣ０ＢＡおよびＣＯＢ　Ｉの活性と完全に一致する。なぜな ら、それらはシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　 ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の、それぞれ、ＳＵＭＴおよびＳＰ２ＭＴである からである。それゆえ、Ｃ０ＢＦタンパク質は多分コバラミンの生合成経路のＳ ＡＭメチルトランスフエラ−ゼである。この試験はＣ０ＢＦがメチルトランスフ ェラーゼであることを実証する。
６．４−配列の相同性の研究による活性の決定この実施例は、シュードモナス・ デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の種々のＣＯＢタンパク質の配列を 比較することによって、コバラミンの生合成経路のＳＡＭトランスフェラーゼで あるＣＯＢタンパク質を発見することができる方法を例示する。
Ｃ０ＢＩおよびＣ０ＢＡタンパク質は、生合成経路の両者メチルトランスフェラ ーゼである。これらの２つのタンパク質をカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉ　ｓａ）　、 １９８４のプログラムに従い比較する。この比較は強い相同性の３つの領域を生 ずる（第２１図）。これらの領域の各々において、２つのタンパク質の間に４５ ％より大きい厳格な相同性が存在する。
Ｃ０ＢＡおよびＣＹＧＳの間の強い相同性の２つの領域が、また、表される（第 ２２図）、それらはＣ０ＢＩと強い相同性を表すＣＯＢ　Ａの同一領域である。
Ｃ０ＢＡ、ＣＹＧＳおよびＣ０ＢＩの強い相同性のこれらの領域は他のＣＯＢタ ンパク質との相同性を表す。問題のタンパク質はＣ０ＢＦ、Ｃ０ＢＪＳＣＯＢＬ およびＣＯＢＭＴある（４２３図）。
領域１に関すると、Ｃ０ＢＦ、Ｃ０ＢＬおよびＣ０８Ｍタンパク質はすべてのゲ ンブロ（Ｇｅｎｐｒｏ）タンパク質に関して有意な相同性を表し、Ｇｅｎｐｒｏ は、カネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムに従い、２００よ り大きいアミノ酸の推定上の解読部分により増大されたゲンバンク（Ｇｅｎｂａ ｎｋ）（バージョン９）タンノ（り質抽出である。領域２に関すると、Ｃ０ＢＪ 、Ｃ０ＢＬおよびＣ０８Ｍタンパク質は、すべてのゲンブロ（バージョン５９） タンノ々り質（二関して有意な相同性を示す。相同性の第３領域に関すると、Ｃ ０ＢＪ、Ｃ０ＢＬおよびＣＯＢＭはすべてのゲンプロ（バージョン５９）タンノ ＜り質に関して有意な相同性を示す。それゆえ、配列を比較すると、４つのタン パク質、Ｃ０ＢＦ、Ｃ０ＢＪ、Ｃ０ＢＬおよびＣＯＢＭは、メチルトランスフェ ラーゼの３つの型、Ｃ０ＢＡ、Ｃ０ＢＩおよびＣ０ＢＦの配ダｊの保存された領 域と有意の相同性を示す。Ｃ０ＢＧ、Ｃ０ＢＨおよびＣ０ＢＫタンパク質は、メ チラーゼの保存された領域と有意の相同性を示さない。Ｃ０ＢＦタンパク質は領 域１においてのみ他のタンノくり質と有意の相同性を示す。これらの相同性は、 多分、すべてのこれらのタンノくり質がメチルトランスフェラーゼであるという 事実に相当する１こ違し）ない。この結果は、試験管内のＳＡＭへの結合につい てこのタン／くり質が有する能力に関して、Ｃ０ＢＦについて記載した生物学的 データと合致する（実施例６．３）。これらの相同性は、一方薯こお０て、ＣＯ Ｆがコバラミンの生合成経路のＳＡＭメチルトランスフェラーゼであることを確 証し、そして、他方において、Ｃ０ＢＪ、Ｃ０ＢＬおよびＣＯＢＭ力（コバラミ ンの生合成経路のＳＡＭメチルトランスフェラーゼでありうることを実証する。
これらの結果が、また、示すように、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣＯＢ タンパク質と他の微生物の等しＬ）機能のタンパク質との間に相同性が存在する 。
実施例６（Ｂ）−メタツバクチｉ功ム・イ／くノビイ（Ｍｅｔｈａｎ。
ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの構造遺伝子の精製およびク ローニング この実施例は、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｉこおＬ）で同定されたものに 属するＣＯＢ酵素およびｃｏｂ遺伝子を、他の微生物において、得る方法を例示 する。
６（Ｂ）、１、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ　ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの精製この実施例は、メタノバクテリウム ・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａｎｏｖｉ　ｉ）ＳＵ ＭＴの精製およびその触媒の性質を記載する。
メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａ ｎｏｖｉ　ｉ）菌株ＤＳＭ２６１１を記載したように培養する（Ｓｏｕｉｌｌａ ｒｄ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８８Ｌ湿潤細胞（１２ｇ）を得る。後者を５ミリモ ルのＤＴＴおよび１ミリモルのＥＤＴＡを含有する０　１モルのＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ緩衝液ｐＨ７，６（８０ｍｌ）の中に再懸濁し、そして４℃において１時間３ ０分間超音波処理し、次いで５０．０００ｇで１時間遠心する。次いで、同一緩 衝液中で構成した小さいＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５カラムを通過させて、 遊離テトラピロール化合物を抽出物から除去する。５５〜７５％の硫酸アンモニ ウム飽和において沈澱するタンパク質を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣＩｐＨ７， ５，０，５ミリモルのＤＴＴ、１．７モルの硫酸アンモニウム緩衝液中で可溶化 し、そしてフェニルースペロースＨＲＩＯ／１０　（Ｐｈａｍａｃｉａ、フラン ス国／ＳＡ）カラム上に注入し、減少する勾配（硫酸アンモニウムに関して１， ７〜０モル）で溶離する。活性分画を０．１モルのＴｒｉｓ−ＭＣＩ　ｐＨ７， ５，０，５ミリモルのＤＴＴ。
２５％のグリセロール緩衝液（緩衝液Ａ）と平衡化したセファデックスＧ−２５ カラムに通過させ、次いで緩衝液Ａと平衡化したフェニルースペロースＨＲＩＯ ／１０　（Ｐｈａｍａｃ　ｉ　ａ、フランス国ＳＡ）カラム上に注入し、そして ０〜０．３モルのＫＣＩの勾配で溶離する。この工程を同一条件下に第２回目を 反復する。Ｂｌｏ−３ｉｌ　ＴＳＫ−２５０（ＢｉｏＲａｄ　フランス国ＳＡ） の先行する工程の活性分画のゲル透過クロマトグラフィーによりタンパク質が得 られ、このタンパク質は５ＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８μＢ ｏｎｄａｐａｋ）において相同性である。精製の異なる工程、それらの収率、な らびにそれらの精製ファクターを下表に記載する。
この表に示すように、合計の精製ファクターは４，５００より大きい。
純粋な酵素のいくつかの性質を既に記載されている方法に従い研究した（Ｂｌａ ｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）ｏこの酵素は、事実、ＳＵＭＴ活性を有 する、すなわち、それはウロ′ゲンＩＩＩのＣ−２およびＣ−７における２つの メチル基のＳＡＭ依存性転移を触媒する。ゲル透過により推定されるこの酵素の 分子量は６０，０００＋／−１，５００であるが、５ＤＳ−ＰＡＧＥによると、 それは２９，０００であり、これはそれがホモ二量体の酵素であることを示す。
既に記載されている条件（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）下に、 この酵素はウロ′ゲンＩＩＩについて５２＋／−ｎｏウロ′ゲンＩＩＩのＫｍを 有する。さらに、この酵素は２０ｇモル以下の濃度において基質による阻害を示 さないが、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＵＭＴは２μモル以上の濃度においてウロ′ゲン ＩＩＩによる阻害を示す（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔａｌ、　、１９８９）。
１／タンパク質の収率がら計算する。
Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴのＶｍａＸを決定した。この値は、この反応の 最適な条件下に既に決定された、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓについて見い だされた値（ウロ′ゲンＩＩＩによるその阻害を考慮する）、４８９Ｕ／ｍｇの タンパク質（Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ　、１９８９）より大きい／ ６（Ｂ）、２、Ｅ、ｃｏ）ｉにおけるＭ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴの構造遺 伝子のクローニング ６　（Ｂ）、２．　１、Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴの構造遺伝子のクロー ニング。
この目的で、この手順は次の通りである：　２００ピコモルのＭ、１ｖａｎｏｖ ｉｉ　ＳＵＭＴを前述したようにタンパク質のＮＨ２末端配列のために使用する 。さらに、このタンパク質のトリプシンの消化により得られるペプチド断片を同 様にそのＮＨ２末端配列の配列決定に付す。
得られる配列を第４８図に表す。それぞれ、センスおよびアンチセンスのオリゴ ヌクレオチド９４６．９２３および９４７を前述したように合成する。これらの オリゴヌクレオチドはそれらの５゛末端に制限部位を含有し、制限部位はセンス オリゴヌクレオチドについてＥｃｏＲＩであるか、あるいはアンチセンスオリゴ ヌクレオチドについてＨｉｎｄｌＩＩである。これらのオリゴヌクレオチドは、 第４８Ｂ図に線図的に示すように、酵素のＤＮＡ増幅実験のために使用する（Ｓ ａｉｋ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８８）。
Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｉゲノムＤＮＡを次の方法で調製する：Ｍ、１ｖａｎｏｖｉ 　ｉ　（ＤＳＭ２６１１）細胞（０，４ｇ）を０１５モルのＮａｃ１溶液で洗浄 する。次いで、細胞を２５％のスクロース、５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＭＣＩ　 ｐＨ８、リゾチーム（４０ｍｇ）の溶液（４ｍｌ）中でインキュベーションし、 その後プロイティナーゼＫ（４０ｍｇ）および０．２％のＳＤＳ、０．１モルの ＥＤＴＡ　ｐＨ８の溶液（８ｍｌ）の添加後、５０℃において２〜３時間インキ ュベーションする。次いでＤＮＡをフェノール／クロロホルム（５０％１５０％ ）で２回、次いでクロロホルムで２回抽出し、その後イソプロパツールで沈澱［ させ、そしてＴＮＥ　（１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，１ミリモル のＥＤＴＡ、１００ミリモルのＮａＣ１）（３ｍｌ）（７１中ニ取ル。
Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＤＮＡの酵素的増幅をサイキ（Ｓａｉｋｉ）ｅｔ　ａｌ 、　、１９８８のプロトコルに従い、Ｏ，１ｍｌの体積でＭ。
１ｖａｎｏｖｉ　ｉのゲノムＤＮＡ　（６００ｎｇ）およびプライマー９４６お よび９４７（反応１）ｍ製９２３および９４７（反応２）を使用して実施する。
この反応に使用する緩衝液は１ミリモルのＭｇＣ１□、５０ミリモルのＫＣＩ、 ０．００１％のゼラチンおよび各０．　２ミリモルの濃度のｄＮＴＰである；各 増幅反応について、１０ｍｇの各オリゴヌクレオチド、ならびにＴａｇ　ＤＮＡ ポリメラーゼ（２，５単位）　（Ｃｅｔｕｓ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用 する。増幅は３０サイクルにわたってパーキン−エルマー・センス（Ｐｅｒｋｉ ｎ−ＥｌｍｅｒＣｅｔｕｓ）ＤＮＡ増幅系で実施する：各すイクルの間に、ＤＮ Ａを９５℃において１分間変性し、オリゴヌクレオチドのプライマーを一本鎖Ｄ ＮＡと３８℃において２分間ハイブリダイゼーションし、そして新しく形成した 鎖を７２℃において３分間重合させる。次いで増幅産生物をクロロホルムで抽出 し、その後エタノール沈澱させる１次いで、それらをアクリルアミドゲル上で移 動後可視化し、その後制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消 化することができる。
反応１の場合において、２つの断片が観察される：　６１５ｂｐならびに２４０ ｂｐにおいて。反応２に関して、２つの断片がまた観察される：　６３０ｂｐな らびに１７０ｂｐにおいて。オリゴヌクレオチド９４６〜９４７の間の酵素増幅 反応の産生物の全体をアクリルアミドゲル上の移動により分離する；６１５ｂｐ の断片を前述したように精製する。次いで、この断片ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ｌ　Ｉ　Ｉで消化して、断片の粘着末端をつくる。次いで断片をファージＭ１３ ｍｐ１９の複製の形態のＤＮＡと結合する。結合体をＥ、ｃｏｌｉ　ＴＧＩの中 に形質転換する。
６１５ｂＥ）のインサートを含有する６つの組み換えクローンを汎用プライマー −２０（Ｐｈａｍａｃ　ｉａ　ＳＡ、フランス国）で配列決定することによって 分析する。第４９図に示すように、６１５ｂｐのインサートを含有する組み換え ファージの一本鎖ＤＮＡを配列決定するとき、ＥｃｏＲＩ部位の下流において、 オリゴヌクレオチド９４６のそれに相当する非同義性配列および、同一フレーム における、引き続くアミノ酸ＬＩＴＬＫＡＶＮＶＬＫ？ＡＤＶＶＬ　（？ｉ；！ 、コノ位置ニおいて、残基を決定することができないこと意味する）をコードす る配列が観測されなくてはならない：この配列は、ＳＵＭＴのＮＨ，末端配列に おいて、オリゴヌクレオチド９４６に相当するアミノ酸に引き続く配列に相当す る（参照、第４８図）。２つのクローンについて、実際に、メタノバクテリウム ・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａｎ。
ｖｉ　ｉ）ＳＵＭＴのＮＨ２末端領域をコードすることができる配列が観察され 、この配列はオリゴヌクレオチド９４６を含有する配列によりエンコードされる アミノ酸である配置Ｐｒｏ−Ｇａｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕで開始する。この 観察が示すように、これらの２つの複製形態はメタノバクテリウム・イバノビイ （Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｉｖａｎｏｖｉ　ｉ）ＳＵＭＴの構造遺伝 子に対して内部の断片に相当するインサートを含有する。Ｍ、１ＶａｎＯＶｉ　 ｉの構造遺伝子に対して内部のこの断片を有する複製形態をｐＧｌｏと呼ぶ。
６　（Ｂ）、２．　２、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａｎｏｖｉ　ｉ）ＳＵＭＴの構造遺伝子のクローニング メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａ ｎｏｖｉ　ｉ）のゲノムＤＮＡをい（つかの酵素で消化する（一本領または二本 鎖）。消化後、断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、次いで前述した ようにナイロン膜上に転移する。こうして転移された断片の変性および予備ハイ ブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションを複製形態のｐＧｌｏをｓ！ｐ 標識したプローブとしてを使用して前述したように実施する。こうして、メタノ バクテリウム・イパノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｖａｎｏｖ ｉ　ｉ）のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌｌＩ消化から発生する３、２ｋｂの断片をプロー ブとハイブリダイゼーションすることが発見された（参照、第５０図）。次いで 、ゲノムのＤＮＡ　（４０μｇ）のＭ、１ｖａｎｏｖｉｉをＥｃｏＲＩおよびＢ ｇｌＩＩで消化し、その後アクリルアミドゲル上の移動により分割する。３〜３ ．５ｋｂの大きさを有する断片を前述したように電気溶離する。こうして精製し た断片を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＢＫＳ＋　（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙ３ｔｅｍ、ラジョラ）と結合する。結合体 をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５α（Ｇｊｂｃｏ　ＢＲＬ）の中に形質転換する。形質転 換体をアンピシリンおよびＸ−ｇａ］を補充したＬＢ培地上で選択する。８００ の白色のコロニーをフィルター上で二次培養物する；バクテリアの成長および引 き続く溶菌後、コロニーのハイブリダイゼーションをグリュンステイン（Ｇｒυ ｎ５ｔｅｉｎ）およびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）（１９７５）の技術に従い実 施する。使用するプローブは！！ｐで標識した複製形態のｐＧｌｏである。この プローブを使用するハイブリダイゼーション試験後、単一の陽性のクローンが発 見された。このクローンのプラスミドＤＮＡをｐＸＬ１８０９と呼ぶ（参照、第 ５６図）。このＤＮＡをＥｃ。
ＲＩ−Ｘｂａｌで消化すると、期待するように、３．２ｋｂの挿入を可視化する ことができる。ｐＸＬ１８０９を両者鏡上でチェノ（Ｃｈ　ｅ　ｎ）およびシー バーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）（１９８５）の技術により配列決定する。９５５塩基 の配列が得られる（第５１図）。オーブンリーディングフレームを分析すると、 塩基３４　（ＡＴＧ）から塩基７２９（ＴＧＡ）のオーブンリーディングフレー ムが同定される。このオーブンリーディングフレームは、その配列が第５２図に 示されているタンパク質をコードする。このタンパク質は２４，９００の分子量 を有しく参照、第５３図）、この分子量はＭ、１ｖａｎｏｖｉｉから精製したタ ンパク質の分子量に近い。このタンパク質のＮＨｚ末端配列は、正確に、精製し たＭ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴについて決定された配列である（参照、第４ ８図および第５２図）。これらの観察は、クローニングしそして配列決定した遺 伝子が事実Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴの構造遺伝子であることを明瞭に確 立する。この活性はすべてのバクテリアにおけるコリノイドの生合成に参加する と仮定されるので、この遺伝子はＣｏｒＡ遺伝子と表示し、そしてこの同一遺伝 子のＣ０ＲＡタンパク質によりエンコードされる。Ｍ、１ｖａｎｏｖｉｉのＣ０ ＲＡタンパク質の親水性プロフィルを、ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウツヅ（Ｗｏ ｏｄｓ）（１９８１）のプログラムから生成し、これが示すように、それは、期 待するように、第５４図に示すように、親水性タンパク質である。Ｍ。
１ｖａｎｏｖｉ　ｉのＣ０ＲＡタンパク質は、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ のＣ０ＢＡに関して４０％より多い厳格な相同性の程度を示す（第５７図）。こ の相同性は両者のタンパク質の事実上全体にわたって存在する。なぜなら、それ はＭ、１ｖａｎｏｖｉｉのＣ０ＲＡの残基３〜２２７およびＰ、ｄｅｎｉｔｒｉ ｆｉｃａｎｓのＣ０ＢＡの残基１７〜２５１に関するからである。この相同性は 同一の反応を触媒する２つの反応の間に存在する構造の相同性を反映する。Ｐ、 ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣ０ＲＡおよびＣ０ＢＡの間で最も高度に保存さ れる領域は、Ｐ、ｄｅｎｉ　ｔｒｉ　ｆ　１ｃａｎｓのＣ０ＢＡとＥ、ｃｏｌｉ のＣＹＳＧとの間に保存されるものと同一である（第２２図）。
実施例７−ＣＯＢタンパク質の発現 ７１−シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎ ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の発現この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカ ンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中のンユードモナス・デニトリフィ カンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎＳ）のＣＯＢタン パク質の構造遺伝子の増幅がＣＯＢタンパク質の活性の増幅に導くことを例示す る。
７．１．１−ＣＯＢＡタンパク質の発現プラスミドｐＸＬ５５７は、５．４ｋｂ の断片の２．４ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片（第７図の配列中の、それぞ れ、位置８０および２３９４において）がクローニングされているプラスミドｐ ＸＬ５９に相当する。この断片はｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有する。
ｐＸＬ５４５はｃｏｂＥ遺伝子のみを含有する。その構成は実施例４゜１に記載 した。
これらの２つのプラスミドは接合的転移により５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の中に導入 した。菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’、５Ｃ５１０Ｒｆｆ’　ｐＸＬ５９．５Ｃ５１ ０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ５５７および５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ５４５をＰＳ４培 地中で培養した。第４日に、培養を停止し、そしてＳＵＭＴ活性を既に記載され ている標準のプロトコルに従いアッセイした（Ｆ、Ｂｌａｎｃｈｅ　ｅｔ　ａｌ 、　、１９８９）ｏ活性を下に記載する。
青：５ｃ５１０Ｒｉｆ’およびその誘導体のいくつかのＳＵＭＴ活性これらの結 果から明らかなように、プラスミドｐＸＬ５５７のみは５Ｃ５１０Ｒｉｆ’にお けるＳＵＭＴの活性を顕著に増加する（５０のファクター）。この増加はｃｏｂ ＥではなくｃｏｂＡの増幅から生ずる。なぜなら、ｃｏｂＥのみの増幅を可能と するプラスミドｐＸＬ５４５はＳＵＭＴの活性を増加しないからである。この結 果はＣ０ｂＡがシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ 　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳＵＭＴの構造遺伝子であることを確証する 。この結果が示すように、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏ ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳＵＭＴの構造遺伝子の増幅によ り、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉ ｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中でＳＵＭＴ活性を増幅することができる。
７．１．２−ＣＯＢＩタンパク質の発現ＳＰＩＭＴの構造遺伝子（ｃｏｂｌ）を 含有する８、７ｋｂのＤＮＡ断片から由来する断片をグラム陰性バクテリアにお ける広い宿主範囲を有するプラスミドの中にクローニングし、次いでこのプラス ミドを接合によりシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａ ｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒｉｆ′の中に導入する。
次いで、この菌株のＳ−アデノシル−し−メチオニン：プレコリン−２メチルト ランスフエラーゼ活性をこのベクターを有する菌株のそれに関して測定する。
ｃｏｂＨおよびｃｏｂＩ遺伝子を含有する１、９ｋｂのＢ　ａｍＨＩ　−Ｂａｍ Ｈｒ−Ｓｓ　ｔ　ｌ−５ｓ　ｔ　Ｉ断片を８．９ｋｂの断片から精製する。
ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩリンカ−を、それぞれ、ＢａｍＨＩおよび５ｓｔＩ末 端に、後者がバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼでフィルインされた後 、位置する。次いで、この断片を広い宿主範囲のプラスミドｐＸＬ５９のＸｂａ ＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に挿入する。これにより得られたプラスミドをｐＸ Ｌ１１４８と表示する（第２４図）。
別々に、関係するプラスミドを構成する：ｃｏｂＨ遺伝子全体およびｃｏｂＩ遺 伝子の５゛部分のみを含有する１、５ｋｂのＢ　ａｍＨＩ　−ＢａｍＨＩ−３ｓ ｔｌ断片を、８．７ｋｂの断片から精製した。ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩリンカ −を、それぞれ、ＢａｍＨＩおよび５ｓｔｌに、後者がファージＴ４ＤＮＡポリ メラーゼでフィルインまたは消化された後、付加した。次いで、この断片をｐＸ Ｌ５９のＥｃｏＲＩおよびｘｂａＩ部位の間に挿入してプラスミドｐＸＬ１１４ ９を生成した。プラスミドｐＸＬ１１４８およびｐＸＬ１１４９は、ｃ　ｏ　ｂ 　Ｉ遺伝子ノ３’　末端を含有する０、３ｋｂの５ｓｔｌおよび５ｓｔｌ断片の ｐＸＬ１１４８中の存在においてのみ異なる。ｐＸＬ１１４８は、ｐＸＬ１１４ ９と対照的に、ｃｏｂ　ｒの全構造遺伝子を有する。
これらの２つのプラスミドは接合により５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の中に導入した。菌 株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’、５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ５９．５Ｃ５１０Ｒｉｆ ’　ｐＸＬ１１４８および５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ１１４９をＰＳ４培地中 で培養する。４日間の培養後、細胞を収穫し、そしてＳＰ、ＭＴ活性を実施例６ ．　１．　３ａ）に記載するようにアッセイする。
これらのアッセイの結果を、実施例６．　１．　３ａ）におけるように定義した ＳＰ２ＭＴ活性とともに下に記載する。
表：シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）から誘導体された種々の菌株のＳＰ２Ｍ１試験において導入 した粗製の抽出物の５００μｇ当たり。
活性は実施例６．　１．　３ａ）において定義したように％で表す。
プラスミドｐＸＬ１１４８のみはＳＰ２ＭＴ活性の実質的な増加を生ずる。対照 的に、プラスミドｐＸＬ１１４９は対照の５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ゛および５Ｃ５１ ０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ５９で観測されたのと異なる結果を与えない。ｐＸＬ１１４ ８はｃｏｂｌ遺伝子を含有する唯一のプラスミドであり、そしてそれはＳＰ、Ｍ Ｔ活性を増幅するただ１つである：この結果はシュードモナス・デニトリフィカ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｊｔｒｊｆｊｃａｎｓ）のＳＰ２ＭＴの 構造遺伝子がｃｏｂＴ遺伝子であることを確Ｅする。さらに、これらの異なる菌 株の合計のタンパク質を変性条件下に電気泳動により分割する（１０％のアクリ ルアミドゲルを使用して５ＤＳ−ＰＡＧＥ）場合、２５，０００の分子量を有す るタンパク質に相当するバンドの存在はｐＸＬ１１４８の場合において特別に観 察される（第２５図）。このタンパク質の分子量はＣ０ＢＩタンパク質のそれに 相当する。プラスミドｐＸＬ１１４８はシュードモナス−デニトリフィカンス（ Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中でＣ０ＢＩタンパク 質の過剰産生を得ることを可能とする。
７．１．３−ＣＯＢＦの発現 この発現は、Ｅ、ｃｏｌｉのＰｔｒｐプロモーターおよびバクテリオファージラ ムダのｃＩＩ遺伝子のリポソーム結合部位をｃｏｂＦ遺伝子の上流に配置するこ とによって得られる。これにより得られた発現は、同一のマルチコピーのプラス ミドを使用する簡単な遺伝子の増幅により観察されるものより非常に高い。
ｐＸＬ１４９６　（下の実施例７．　２．　１）の２ｋｂのＥ　ｃ　ｏＲＩ　− ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩを精製する（第２６図）。この断片は、ｃｏｂＦ遺伝子 の上流に、Ｅ、ｃｏｌｉのＰｔｒｐプロモーターおよびバクテリオファージラム ダのｃＩＩ遺伝子のリポソーム結合部位を含有する。ＣｏｂＦ遺伝子の下流に、 Ｅ、ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネータ−が存在する。この断片をプラ スミドｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨ１部位においてクローニングしてｐ ＸＬ１５４６を生成した（第２６図コ。ｐＫＴ２３０はほとんどすべてのグラム 陰性バクテリアの中で複製する不適合性群Ｑのプラスミドである（Ｂａｇｄａｓ ａｒｊａｎｅｔ　ａｌ、　、１９８１）；このプラスミドはカナマイシン抵抗性 である。プラスミド、ＸＬ　１５４６およびｐＫＴ２３０を接合により５Ｃ５１ ０Ｒｉｆ’の中に導入する。菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’、５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐ ＫＴ２３０および５Ｃ５１０Ｒｊｆ’　ｐＸＬ１５４６を前述したようにＰＳ４ 培地の中で培養する。４日間の培養後、異なる菌株の合計のタンパク質を１０％ の５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。第２７図に示すように、過度に発現される分子 量３２，０００のタンパク質が５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　］）ＸＬ１５４６の抽出物 の中に観測される：このタンパク質はＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ　ｐＸＬ１４９６により 過度に発現されるタンパク質と同時に移動する（下の実施例７．　２．　１）。
さらに、このタンパク質はｐＸＬ１５４６を含有する菌株５Ｃ５１０Ｒｆ　ｆ’ の中で特別に発現され、ここでそれは合計のタンパク質の少なくとも２０％を表 す。対照的に、このタンパク質は菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’および５Ｃ５１０Ｒ ｉ　ｆ’　ｐＫＴ２３０の合計のタンパク質において観察されない。
それゆえ、この過度に発現されるタンパク質はＣ０ＢＦタンパク質である。
７．１．４−ＣＯＢＨの発現 この実施例は、ｃｏｂＨ遺伝子を含有するシュードモナス・デニトリフィカンス （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡ断片の増幅 を記載する。この遺伝子によりエンコードされるタンパク質を精製する：それは Ｃ０ＢＨタンパク質である。実施例７１゜２に記載するプラスミドｐＸＬ１１４ ９は、８．７ｋｂの断片から由来するＤＮＡインサートの中に全ｃｏｂＨ遺伝子 のみを含有する。５Ｃ５１０Ｒｉｆ’において、このプラスミドは、このベクタ ーと対照的に、分子量２２，０００のタンパク質の過度の発現を生ずる（第２５ 図）。
７．１．５−ＣＯＢＶの発現 この実施例は、ｃｏｂＶのみを含有するプラスミドによるコバラミン−５゛−ホ スフェートシンターゼの増幅を記載する（ｐＸＬ６９９、参照、第３８図）。コ バラミン−５“−ホスフェートシンターゼ活性は、５Ｃ８７７Ｒｉ　ｆ’におい て、ベクターｐＸＬ４３５、ｐＸＬ１３０３、ｐＸＬ１３２４またはｐＫＴ２３ ０をもつ同一菌株に関して、プラスミドｐＸＬ６９９により５０のファクターで 増幅される。このプラスミドは、そのインサートの中に、ｃｏｂＶの全体＋ＯＲ Ｆ１ｇおよびｃｏｂＶの５′末端部分のみを含有する。このような菌株（ＳＣ８ ７７Ｒｉ　ｆ’ｐＸＬ６９９）において、Ｃ０ＢＶタンパク質は明確に過度に発 現される；この過度の発現は菌株５Ｃ８７７Ｒｉ　ｆ’の発現に関して５０のＰ ｔｒｐプロモーターおよび次いでバクテリオファージλのＲＢＳｃ　Ｉ　１．、 Ｍ、ｉ　ｖａｎｏｖ　ｉ　ｉ　ＳＵＭＴ構造遺伝子およびＥ、ｃ。
１１のｒｒｎＢオペロンのターミネータ−領域を含有するｐＸＬ　１８３２の１ ．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片（参照、実施例７．　２． 　４）を、ｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位においてクローニングす る。（Ｂａｇｃｉａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９８１）。この方法におい て、プラスミドｐＸＬ１８４１が得られる（参照、第５６図）。このプラスミド を前述したようにＰ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ　５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の中で 移動化する。トランス接合体をより詳細に研究する。この菌株をＰＳ４培地中で 培養し、そしてバクテリアの抽出物のＳＵＭＴ活性を対照の菌株５Ｃ５１０Ｒｉ ｆ’　ｐＸＬ４３５　（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）のそれと 同時にアッセイする。これらの菌株の活性を下に記載する。
この結果が明瞭に示すように、菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ１８４１のＳＵ ＭＴ活性は５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ４３５のそれより顕著に大きいので、プ ラスミドｐＸＬ１８４１の結果、Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中のＭ、１ｖ ａｎｏｖｉｉのＳＵＭＴ活性の発現が存在する。
７、　２−Ｅ、ｃｏｌｉ中の発現 この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質をＥ。
ｃｏｌｉの中で過度に発現することができる方法を例示する。
７．２．１−ＣＯＢＦの発現 ８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の２２５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片（第８ 図に表す配列におけるそれぞれの位置０および２２５０において）を、７７一ジ Ｍ１３ｍｐ１９　（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ　ｅｔ　ａｌ。
、１９８３）の中にＥｃｏＲＩおよび５ａｉ１部位の間にクローニングした。こ れにより構成されたプラスミドをｐＸＬ１４０５と表示する。
Ｎｄｅ１部位を特異的突然変異誘発により導入し、こうしてこの制限部位の最後 の３つの塩基（ＡＴＧ）がｃｏｂＦ遺伝子の翻訳開始部位を構成するようにする 。これはｃｏｂＦ遺伝子のＡＴＧに先行する３塩基、ＧＡＡ　（Ｇは第８図に表 す配列において位置７３３に存在する）をＣＡＴに修飾する。次いで、ｃｏｂＦ 遺伝子を含有するＮｃｉｅｌ−３ｐｈＩ−３ｐｈＩ断片（第２６図）を、プラス ミドｐＸＬ６９４　（Ｄｅｎｅｆｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８７）のＮｄｅＩ −ＳｐｈＩ部位の間にクローニングする。これにより構成されるプラスミドはｐ ＸＬ１４９６と表示する（第２６図）。Ｅ、ｃｏｌｉ中の遺伝子の発現の調節の ためのシグナルは、ｃｏｂＦ遺伝子に先行する１２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｎｄｅ Ｉ断片（これはｐＸＬ６９４から由来する）。これらのシグナルはＥ。
ｃｏｌｉのＰｔ　ｒｐプロモーターの［＝４０＋１］領域、次いでバクテリオフ ァージλのｃＩＩ遺伝子のリポソーム結合部位を含有する７３ｂｐから成る（Ｄ ｅｎａｆ　ｌｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８７）ｏ　ｃｏｂＦ遺伝子の下流に、Ｅ 、ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネータ−が存在する（Ｈｉｎｄｌ　ＩＩ −ＢａｍＨＩ断片の中に）。プラスミドｐＸＬ１４９６をＥ、ｃｏｌｉ菌株の中 に形質転換により導入する（Ｍｏｎ。
ｄおよびＷｏＩ　１ｍａｎ、１９４７）。ｃｏｂＦ遺伝子の発現を既に記載され ているように（ＤｅｎＱｆ　Ｉｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８７）Ｐｔｒｐプロモ ーターが抑制される（トリプトファンの存在下に）か、あるいは抑制されない（ トリプトファンの不存在下に）条件下に研究した。
この発現を実施する培地は、０．４％のグルコース、０．４％のカサミノ酸、１ ０ミリモルのチアミンおよびＰｔ　ｒｐプロモーターを抑制しようとする場合４ ０μｇ／ｍｌのトリプトファンを補充したＭ９最小培地（Ｍｉ　Ｉ　Ｉｅｒ、１ ９７２）中で実施した。Ｅ、ｃｏｌｉ菌株ＢのｐＸＬ１４９６を３７℃において 前述の培地中でアンピシリン（１００μｇ）とともに培養した。第２８図に示す ように、トリプトファンの不存在は分子量３２，０００のタンパク質の発現を生 ずる。事実、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ　ｐＸＬ１４９６の 合計のタンパク質の抽出物において、合計のタンパク質の１〜４％を表す分子量 ３２，０００のタンパク質が明瞭に観察される。このタンパク質は、同一の条件 下であるが、トリプトファンの存在下に培養したＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ　ｐＸＬ１４ ９６の合計の抽出物の中に顕著により少ない量で存在する。これらの条件下に発 現されるタンパク質の分子量は、このタンパク質のアミノ酸配列から推定される Ｃ０ＢＦの分子量、すなわち、２８．９２７に近い（第１６図）。こうしてＥ、 ｃｏｌｉの中で発現されるタンパク質はＣ０ＢＦタンパク質である。
７．２．２−ＣＯＢＴの発現 Ｅ、ｃｏｌｉのｌａｃプロモーターおよび１ａｃＺの最初の３つのコドンをｃｏ ｂ遺伝子の５′末端に融合することによって、過度の産生が得られる。
４．８ｋｂの断片の第３２図に表す配列中の位置２６２４に位置するＥｃｏＲＩ 部位は、ｃｏｂＴ遺伝子の第４コドンを含有する。ｐＸＬ８３７の３．５ｋｂの ＥｃｏＲＩ−Ｘｂａｌ断片を、ｐＴＺ１８ＲまたはｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｍａｃ 　ｉ　ａ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位においてクローニングして、それぞ れ、ｐＸＬ１８７４またはｐＸＬ１８７５を発生させる：これらの２つのプラス ミドは、Ｅ、ｃｏｌｉ　（ＰｉａＣ）のラクトースオペロンのプロモーターに関 して、切頭ｃｏｂＴ遺伝子の向きにおいて異なる。ＰｌａｃはｐＸＬ１８７４中 のｃｏｂＴの上流に存在するが、その反対はｐＸＬ１８７５において真実である 。ｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位においてｐＸＬ８３７のＥｃ。
Ｒ１−ＸｂａＩ断片をクローニングすると、タンパク質の融合を、Ｅ。
ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼの最初の４アミノ酸とその第４のコドンからの ｃｏｂＴ遺伝子との間で実施することができる。１ａｃｅ”ｃｏｂＴ遺伝子の発 現は１ａｃＺの発現シグナルのコントロール下にある。プラスミドｐＸＬ１８７ ４、ｐＸＩ、１８７５およびｐＴＺ１８ＲＷＯＥ、Ｃ０１ｉ菌株ＢＬ２１の中に 形質転換により導入する。ｃｏｂＴ遺伝子の発現は既に記載されているように研 究する（Ｍａｎｉａｔｉｓｅｔ　ａｌ、　、’　１９８９）。
第４２Ｂ図に示すように、分子量７２，０００のタンパク質をｐＸＬ工８７４の みで発現させ、そしてこのタンパク質は、５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＢＬ２１ 、ｐＸＬ１８７４の合計のタンパク質の抽出物において、合計のタンパク質の１ 〜４％を表す。これらの条件下に発現されるタンパク質の分子量は、第４０図に おいてアミノ酸配列から推定されるＣ０ＢＴタンパク質の分子量、すなわち、７ ０，３３５に近い。この実験が明瞭に示すように、ｃｏｂＴ遺伝子の第４コドン に位置するＥｃｏＲＩ部位から、ｃｏｂＴ遺伝子について見いだされるもと適合 性のオーブンリーディングフレームを発現することができる。
７２．３−切頭Ｃ０Ｂ５タンパク質の発現ＢａｍＨＩ部位はＣ０Ｂ５遺伝子の第 ４５コドンに位置する。ｃｏｂＳ遺伝子の３°部分およびこの遺伝子より下流の 配列を含有する１、２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＸＬ８４３から切 除し、そしてプラスミドｐＥＴ−３ｂ　（Ｒｏｓｅｎｇｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、、 １９８７）のＢａｍＨＩにおいてクローニングしてｐＸＬ１９３７を発生させる 。このＢａｍＨＩ断片は、ｃｏｂＳ遺伝子の切頭部分が、フレーム中で、バクテ リオファージＴ７または遺伝子１０　（Ｒｏｓｅｎｇｅｒｇｅｔ　ａｌ、　、１ ９８７）の主要なキャプシドタンパク質の最初の１２コドンと融合する方法で、 向いている。このハイブリッド遺伝子はファージＴ７のφプロモーターのコント ロール下にある。プラスミドｐＸＬ１９３７およびまたｐＥＴ−３ｂを形質転換 によりＥ、ｃｏｌｉ　ＢＬ２１　ｐＬｙｓＳ　（Ｗ、５ｔｕｄｉｅｒ、個人的通 Ｍ）の中に導入する。
選択培地上の再分離後、両者の菌株をＬ液体培地の中で６１０ｎｍにおいて１の ＯＤに培養する；この段階において、この培地をｉミリモルのＩＰＴＧ（イソプ ロピルβ−チオガラクトシド）濃度に調節して、バクテリオファージＴ７のポリ メラーゼの発現を誘発する（（Ｒｏｓｅｎｇｅｒｇ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８７ ）ｏ次いで、培養物を３７℃において２時間インキュベーションし、その後バク テリアのリゼイトを調製する。
こうして培養したバクテリアの合計のタンパク質をＰＡＧＥにより変性条件下に 分割する。第４２Ａ図において見られるように、培養物ＢＬ２Ｌ　ｐＬｙｓＳ　 ｐＸＬ１９３７で３３，０００のタンパク質の特別な過度の産生が存在する。こ の分子量は融合タンパク質について期待される分子量（３３ｋＤ）と完全に適合 性である。この実験が明瞭に示すように、ｃｏｂＳ遺伝子の第４５コドンに位置 するＢａｍＨＩ部位から、ｃｏｂＳ遺伝子について見いだされるものと適合性の オープンリーディングフレームを過度に発現することができる。
７、　２．　４、Ｃ０ＲＡタンパク質の発現次のオリゴヌクレオチドを前述した ように合成した・オリゴヌクレオチド　１２７７ ５’　ＧＧＣＣＧＡ　ＡＴＴ　ＣＡＴ　ＡＴＧ　ＧＴＡ　ＧＴＴ　ＴＡＴ　ＴＴ Ａ　３’−−−−−−−１２３４５（１−５最初の５オリゴヌクレオチド　１２ ７８ ５’　ＧＧＣＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＴＡ　ＴＴＡ　ＣＡＴ　ＡＡＴ　Ｔ５ｔＩ （＝第５１図に現れる配列、位置９２６−９１５、解読績に対して相補性の鏑に おいて） オリゴヌクレオチド１２７７は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩのために認識 配列を有する。ＮｄｅＩ部位の最後の３塩基（Ａ　Ｔ　Ｇ）は翻訳開始コドンに 相当し、その直ぐ後に、第５２図に表す配列において現れるように、Ｍ、１ｖａ ｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴの構造遺伝子のコドン２−５が存在する。オリゴヌクレオ チド１２７８は５ｓｔｒのための認識配列を含有し、それに直ぐに引き続いて、 配列ＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴが存在し、これは第５１図に表すｃｏｒＡ遺伝子 を含有する９５５ｂｐの断片の中に存在する配列に相当する：この配列はＣ０Ｒ Ａタンパク質を解読する鎖に対して相補性の鎖中の位置９２６−９１５　（参照 、第５１図）に存在する。それゆえ、２つのオリゴヌクレオチドエ２７７および １２７８は、それぞれ、ｃｏｒＡ遺伝子の解読績およびこの遺伝子より下流の相 補性鎖に相当する、それらの３°部分の中に配列を含有する。これらの２つのオ リゴヌクレオチドを使用して、鋳型としてプラスミドｐＸＬ１８０９を使用する 酵素増幅実験を実施することができる。
この実験により、ｃｏｒＡ遺伝子のＡＴＧにおけるＮｄｅＩ部位、およびｃｏｒ Ａ遺伝子の末端の後の断片の他方の末端における５ｓｔｌ部位を有するＭ、１ｖ ａｎｏｖｊｉのｃｏｒＡ遺伝子を含有する９１０ｂｐの断片を得ることができる 。酵素的増幅はＭ、１ｖａｎｏｖｉｉのゲノムＤＮＡについて実施した酵素的増 幅について前述したように実施するが、ただし鋳型はプラスミドｐＸＬ１８０９ のＤＮＡ　（１０ｎｇ）から成る：使用する温度は同一であるが、２０のみの増 幅サイクルを実施する。前述したように、増幅産生物をＮｄｅＩおよび５ｓｔｌ で消化した後、アクリルアミドゲル上の移動により分割する。期待するように、 ９１０ｂｐの大きさの断片が事実可視化される。この断片を既に記載したように 精製する。この断片をｐＸＬ６９４　（Ｄｅｎｅｆ　ｌｅ　ｅ　ｔ　ａｌ、　、 １９８７）のＮｄｅＩおよび５ｓｔｌ部位においてクローニンクする。生ずるプ ラスミドをｐＸＬ１８３２と表示し、第５６図に記載する。このプラスミドにお いて、実施例７．２に記載するのと同一の方法で、バクテリオファージλのｃＩ Ｉ遺伝子のリポソーム結合部位の後にＭ、１ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴの構造遺 伝子は存在する。このＲＢＳの上流に、Ｐｔｒｐプロモーターが存在する。プラ スミドｐＸＬ８３２を、突然変異ｃｙｓＧ４４を有するＥ、ｃｏｌｉ菌株である Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｂ５５４８　（Ｃｏｓｓａｒｔおよび５ａｎｚｅｙｓ　１９８２ ）（Ｄ中に形質転換により導入する。菌株Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｂ５５４８　ｐＵｃ１ ３およびＥ、ｃｏｌｉ　Ｂ５５４８　ｐＸＬ１８３２のＳＵＭＴ活性を、アンピ シリンを補充したＬＢ培地中で培養した細胞から得た抽出物についてアッセイす る。ＳＵＭＴ活性のアッセイは既に記載されているように実施する（Ｂｌａｎｃ ｈｅ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８９）ｏこのアッセイの結果を下に記載する。
上の表に表す結果が明瞭に示すように、Ｅ、ｃｏＪｉ菌株Ｂ５５４８あＭ、１ｖ ａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴを発現するプラスミドｐＸＬ１８３２を含有するとき、 Ｅ、ｃｏｌｉ菌株Ｂ５５４８の中でＳＵＭＴ活性が発現される。それゆえ、Ｍ、 １ｖａｎｏｖｉｉ　ＳＵＭＴはＥ、ｃｏｌｌの中で発現されることができる。
実施例８−組み換えＤＮＡ技術によるコバラミンの産生の増幅８．１−Ｐ、ｄｅ ｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中の増幅この実施例は、シュードモナス・デニトリフィ カンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１ＱＲｉｆ’において、シュ ードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎ　ｉ　ｔ　ｒ 　ｉ　ｆ　１ｃａｎｓ）ＳＣ１５０のｃｏｂ遺伝子の増幅により、コバラミンの 産生を改良する方法を例示する。
８１．１　コバラミンの生合成における制限段階の除去によるシュードモナス・ デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ） におけるコバラミンの産生の改良この実施例は、シュードモナス・デニトリフィ カンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中のコバラミンの産生性をソニート モナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃ ａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子の増幅により改良できる方法を例示する。この改良は生 合成経路の制限段階の除去から生ずる。
プラスミドｐＸＬ３６７は実施例４．２（第１３図）に記載されている。このプ ラスミドは、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が挿入されているｐＲＫ２９０　（Ｄ ｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）に相当する。このプラスミドｐＸＬ３６ ７は菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’中のコバラミンの生合成を改良する。菌株５Ｃ５１ ０Ｒｉｆ’、５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’　ｐＲＫ２９０および５Ｃ５１０Ｒｔｆ’　 ｐＸＬ３６７をエルレンマイヤー内でＰＳ４培地の中で実験のプロトコルに記載 する条件に従い培養する。
プラスミドｐＸＬ３６７の存在のための産生力価の改良が観測される。
事実、菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ３６７は菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’および ５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　ｐＲＫ２９０より３０％多いコバラミンを産生ずる。この 改良はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎ ｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の非特定遺伝子の増幅のためではなく、８．７ｋｂのＥ ｃｏＲＩ断片が有する遺伝子の特異的増幅のためである。事実、第１１図に記載 するプラスミドｐＸＬ７２３は改良を生成せず、そして同一の産生力価はこのプ ラスミドならびに菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’および５Ｃ５１０Ｒ７ｆ’　ｐＲＫ ２９０で観測される。
８、　１．　２　コバラミンの生合成における２つの制限段階の除去によるシュ ードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ）中の補酵素ＢＩ２の産生の改良この実施例は、ツユ−トモナス・デ ニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｃ！ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株中のコバラミンの産生性をシ ュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子の増幅により改良できる方法を例示する。この改良 は生合成経路の２つの制限段階の除去から生ずる。
５．４ｋｂの断片から誘導体された２、４ｋｂのＣ１ａｌ−ｅ７断片（ｃｏｂＡ およびｃｏｂＥ遺伝子を含有する）を、８．７ｋｂのＥｃ。
Ｒ１断片とともに、広い宿主範囲のプラスミドｐＸＬ２０３の中に共クローニン グする。これにより構成されるプラスミドをｐＸＬ５２５と呼ぶ（第２９図）。
このプラスミドを５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’の中に接合により導入する。菌株５Ｃ５ １０Ｒｉｆ’　ｐＸＬ５２５は５Ｃ５１０Ｒｉｆ’　Ｉ）ＸＬ３６７より２０％ 多いコバラミンを産生する。ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子の増幅は、コバラミ ンの生合成における５Ｃ５１０Ｒｉｆ’におけるそれ以上の制限段階の除去を可 能とする。シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株５Ｃ５１０Ｒｉ　ｆ’は、２つの制限段階の連 続的除去により、この実施例において改良される。この実施例が示すように、コ バラミンの生合成における２つの制限段階の除去は産生をさらに改良する。
８．２−アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中のコバラミンの産生の改良この実施例は、シュー ドモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄ。
ｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ１５０のｃｏｂＪｉ伝子の増幅 によるコバラミンの菌株の産生におけるコバラミンの産生の改良を例示する。
使用する菌株はグラム陰性バクテリアの菌株である；それはアグロバクテリウム ・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） の菌株である。
実施例４．２および８．１に記載するプラスミド、ｐＸＬ３６７およびｐＸＬ５ ２５、ならびにベクターｐＲＫ２９０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔａｔ、　、１９８１ ）およびプラスミドｐＸＬ３６８　（第２９図）を、接合的転移により、アグロ バクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ）菌株Ｃ５８−Ｃ９Ｒ１ｆ’（Ｃａｍｅｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ、、１９ ８９）の中に導入する。菌株Ｃ５８−Ｃ９Ｒｊ　ｆ’、Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆ’　 ｐＲＫ２９０、Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆ’　ｐＸＬ３６７、Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆ’　 ＤＸＬ３６８およびＣ５８−Ｃ９Ｒｉ　ｆ’ｐＸＬ５２５を、前述したように、 ３０℃１ｍおいてＰＳ４培地中で培養する。産生されるコバラミンを前述したよ うにアッセイする。産生力価を下表に記載する。
嚢　アグロバクテリウム・ツメファシェンス（ＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉＨｌ　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の異なる組み換え菌株により産生されたビタミンＢ１□ の力価 上の表から明瞭に明らかなように、コバラミンの産生は使用したアグロバクテリ ウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ）菌株において改良される。２つの異なるプラスミドは使用したアグロバクテ リウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅ ｎｓ）菌株中のコバラミンの産生を改良する：Ｉ）ＸＬ３６７およびｐＸＬ３６ ８゜これらのプラスミドは、それぞれ、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（ｃｏｂＦ −ｃｏｂＭ遺伝子）および２．４ｋｂの断片（ｃｏｂＥ−ｃｏｂＡ遺伝子）を含 有する。別々に、それらはアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆ’によるコバ ラミンの産生を２のファクターで改良する：この結果が示すように、シュードモ ナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎ　ｉ　ｔ　ｒ　ｉ　 ｆ　１ｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子を有する断片を増幅することによって、アグロ バクテリウム・ツメファシェンス（Ａ　ｇ　ｒ　ｏ　ｂ　ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるコバラミンの産生を改良することができる。この 場合において、異種の改良、すなわち、１つの菌株によるコバラミンの産生を他 の菌株のｃａｂ遺伝子の増幅により改良すること、を述べることができる。
ｃｏｂ遺伝子を含有する異なるシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｊｆｉｃａｎｓ）の断片により提供されるコバラ ミンの産生の改良は、累積することができ、すなわち、同一プラスミドの中に、 別々にｐＸＬ３６７およびｐＸＬ３６８の中にクローニングされた２つの断片を 入れることによって、付加的改良が観察され、この意味において、プラスミドｐ ＸＬ５２５はアグロバクテリウム−ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉ ｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆ’において、同一ベクター の中に別々にクローニングされた断片の各々により提供されるより大きい産生の 改良を提＃する。
８３−リゾビウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌ。
ｔｉ）の産生の改良 この実施例は、コバラミンを産生ずる他の菌株によるコバラミンの産生の改良を 例示する。
実施例８．２に記載するプラスミド、ｐＸＬ３６８、ならびにベクタｐＲＫ２９ ０　（Ｄｉｔｔａ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８１）を、接合的転移により、リゾビ ウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌ。
ｔｉ）菌株１０２Ｆ３４Ｒｉｆ’（Ｌｅｏｎｇ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８２）の 中に導入する。トランス接合体、すなわち、１０２Ｆ３４Ｒｉ　ｆ’、１０２Ｆ ３４Ｒｉｆ’　ｐＲＫ２９０および１０２Ｆ３４Ｒｉ　ｆ’　ｐＸＬ３６８を前 述したように３０℃においてＰＳ４培地中で培養する。産生するコバラミンを前 述したようにアッセイする。産生力価を下表に記載する。
の異なる組み換え菌株により産生されたコバラミンの力価上の表において明瞭に 明らかなように、コバラミンの産生は使用したりゾビウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚ ｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）菌株において改良される。プラスミドｐＸＬ３ ６８は使用したりゾビウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｆ ）菌株によるコバラミンの産生を改良する。このプラスミドは２．４ｋｂのＣＩ ａＩ−ＥｃｏＲＶ断片（ｃ　ｏ　ｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子）を含有する。それ はりゾビウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２Ｆ３ ４Ｒｉｆ’によるコバラミンの産生を２のファクターで改良する。この結果が示 すように、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子を有する断片を増幅することによっ て、リゾビウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の菌株に よるコバラミンの産生を改良することができる。この場合において、異種の改良 、すなわち、１つの菌株によるコバラミンの産生を他の菌株のｃｏｂ遺伝子の増 幅により改良すること、を述べることができる。
実施例９−コリノイドを産生ずる菌株のマストおよび細胞中のコリノイドおよび デコバルトコリノイドのアッセイこの実施例は、コリノイドを産生ずる異なる菌 株により産生された異なるコリノイドおよびデコバルトコリノイドの同定および アッセイの方法を例示する。このアッセイは、なかでも、補酵素Ｂ１２のアッセ イを可能とする。
マスト（または細胞単独）を既に記載されているようにシアニド処理する（Ｒｅ ｎｚ、１９７１）。遠心後、上澄み液のアリコートをＤＥＡＥ−セファデックス 細胞に通過させ、次いでこれを１１モルのリン酸塩緩衝液で洗浄する。集めた分 画を一緒にし、そして５ｅｐ−ｐａｋＣ−１８（Ｗａｔｅｒｓ）遠心機で脱塩す る。蒸発および水中の再懸濁（存在するコリノイドに依存して１００μｍ〜１ｍ １）後、コリノイドをＮｕｃｌｅｏｓｉｌ　Ｃ−１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ −Ｎａｇｅｌ）のＨＰＬＣにより同定およびアッセイする。このカラムを１ｍｌ ／分で１０ミリモルのＫＣＮを含有する０、１モルのリン酸カリウム緩衝液中の アセトニトリルの勾配（０％〜１００％）で溶離する。
コリノイドを３７１ｎｍにおける紫外線検出によりおよび／または５７ＣＯの特 別の検出（培養は”ＣｏＣＩｇの存在下に実施した）によりベーフルド（Ｂｅ　 ｒ　ｔｈｏ　１ｄ）ＬＢ５０５検出器を使用して可視化する。
それゆえ、それらはそれらの保持時間を標準と比較することによって同定される 。同様に、「金属不含コリノイド」　（ヒドロゲノビリン酸、ヒドロゲノビリン 酸モノアミドおよびヒドロゲノビリン酸ジアミド）は３３Ｑｎｍにおける紫外線 の検出により可視化する。この技術により、次の中間体が分割されるニコビリン 酸、コピリン酸モノアミド、コピリン酸ジアミド、コピリン酸トリアミド、コピ リン酸テトラアミド、コピリン酸ペンタアミド、コビル酸、コビンアミド、コビ ンアミドホスフェート、ＧＤＰ−コビンアミド、Ｂ、２ホスフエートおよびビタ ミンＢ、□。これらの産生物のアデノシル化された形態を、また、この技術によ り、分割し、そしてアッセイする。この目的で、シアニド処理の初期工程を実施 し、そしてＨＰＬＣカラムをＫＣＮ不含の緩衝液で溶離する。第３１図は、この 系により分割し、そして紫外線の吸収によりこのカラムを出るとき同定した、異 なる標準の保持時間を記載する。
菌株５Ｃ５１０Ｒｉｆ’の試料は、１９９０年１月３０日に、セントラール・ビ ューロウ・ブーア・シンメルカルッレン（ＣｅｎｔｒａａｌＢｕｒｅａｕ　ｖｏ ｏｒ　Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｒｅｎ）（オランダ国）に寄託し、ここでそれ は参照ＣＢ５１０３．９０で登録された。
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ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）、３２６：３１５゜ブランシエ（Ｂ　Ｉ　ａｎｃｈ ｅ）　、Ｆ、　、Ｌ、デブッシエ（Ｄｅｂｕｓｓｃｈｅ）、Ｄ、チバウト（Ｔｈ ｉｂａｕｔ）　、Ｊ、クロウゼト（Ｃｒｏｕｚｅｔ）およびＢ、カメｏン（Ｃａ ｍｅｒｏｎ）　、１９８９゜シュードモナス・デニトリフィカンスからのＳ−ア デニル−Ｌ−メチオニン、ウロポルフィリノゲンＩＩＩ　メチルトランスフェラ ーゼのｆｍ製および特性決定。ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａ ｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）　、１７１　：４２２２−４２３１゜プレイ（Ｂｒｅｙ） 　、Ｒ，Ｎ　１バンナー（Ｂａｎｎｅｒ）　、Ｃ，Ｄ。
Ｂ、およびウォルフ（Ｗｏ　Ｉ　ｆ）　、Ｊ、Ｂ、　、１９８６゜バチルス・メ ガテリウムの中のコバラミン（ビタミンＢ１２）の生合成に関係する多数の遺伝 子のクローニング。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ。
Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１６７．６２３−６３０゜カメ０：／　（Ｃａｍｅ 　ｒｏｎ）、Ｂ、　、Ｋ、ブリックス（Ｂｒｉｇｇｓ）、Ｓ、ブリドモア（Ｐｒ 　ｉｄｍｏｒｅ）　、Ｇ、　プレフォート（Ｂｒｅｆ。
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Ｗ）、１９７８゜大腸菌に−１２の中の非接合プラスミドＲ５ＦＩＯＩＯの複製 。ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉ。
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リアング（Ｌｉａｎｇ）Ｘ、−Ｗ、　、フィンレイ（Ｆｉｎｌａｙ）Ｄ。
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ホップ（Ｈｏｐｐ）Ｔ、Ｐ、およびに、　Ｒ，ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）、１９８１ ゜アミノ酸配列からのタンパク質の抗原決定基の予測。プロシーディンゲス・オ ブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａ ｃａｄ、Ｓｃｊ、）ＵＳＡ、７８．３８２４−３８２８゜ フエンネケン；Ｚ、（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ）Ｆ、Ｍ、　、ヴイトルス（ｖｌｔ 　ｏ　Ｉ　ｓ　）　Ｋ、Ｓ　、　、フジイ（Ｆｕ　ｊ　ｉ　ｉ）　Ｋ、およびジ ャコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）Ｄ、Ｗ４．１９８２゜コバラミン補酵素の生合 成。
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イリオン（Ｉ　ｒ　ｔｏｎ）　Ｒ，およびルジュングダール（Ｌｊｕｎｇｄａｈ ｌ）Ｌ、Ｇ、　、１９６５゜クロストリジウム・テルモアセチクムからの因子１ １１ｍ補酵素およびコビル酸補酵素＋他のＢ１２因子の分離。
バイオケミストリー（Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ　ｓ　ｔ　ｒｙ）　、４．２７８０− ２ジェター（Ｊｅｔｅｒ）Ｒ，Ｍ、　、オリベラ（０１ｊｖｅｒａ）ＢＭ、およ びロス（Ｒｏｔｈ）Ｊ、Ｒ，，１９８４゜ネズミチフス菌は嫌気性成長条件下に コバラミン（ビタミンＢ１２）を新たに合成する。ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１．５９．２０６−２１３゜ ジェター（Ｊｅｔｅｒ）Ｒ，Ｍ、およびＪ、　Ｒ，ｏス（Ｒｏｔｈ）、１９８７ ゜チフス菌のコバラミン（ビタミンＢ１２）の生合成遺伝子。
ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１６９ ．３１８９−３１９８゜ ジョルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ　（Ｒ，Ａ、　、ｏススティン（Ｒｏｔｈ ｓｔｅｉｎ）Ｓ、Ｊ、およびレズニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）Ｗ、Ｒ，，１９ ７９゜Ｔｎ５の制限酵素の切断地図およびネオマイシン抵抗性をエンコードする 領域の位置。モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティックス（Ｍｏ１． Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）、１７７．６５−６２゜ カナンガラ（Ｋａｎａｎｇａｒａ）Ｃ，Ｇ、　、Ｓ、Ｐ、プルヤント（Ｂｒｕｙ ａｎｔ）　、Ｊ、に、ツーバー（Ｈｏｏｂｅｒ）　、Ａ、カーノ（Ｋａｈｎ）お よびり、ヴオン・ウニラッテイン（ｖｏｎ　Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ）、１９８８゜ ｄ−アミルブリネートの生合成におけるコファクターとしてのｔＲＮＡ”″：ク ロロフィルの合成を調節する工程。トレンズ・イン・バイオケミカル・ソサイア ティ（Ｔｒｅｎｄｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓｃ　ｉ、）　、１３９１４３゜ ケネヒサ（Ｋｅｎｅｈｉｓａ）Ｍ、１９８４゜核酸配列における潜在的相同性を スクリーニングするための統計学的基準の使用。核酸の研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１２：２０３−２１５゜キエニイ（Ｋｉｅｎｙ）Ｍ、Ｐ、　 、Ｒ，レイズ（Ｌａｔｈｅ）およびＪ、Ｐ、レコクク（Ｌｅｃｏｃｑ）　、１９ ８３゜バクテリオファージＭ１３に基づく新規な融通性のあるクローニングベク ター。遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２６．９１−９９゜ クルジキ（Ｋｒｚｙｃｋｉ）Ｊ、およびＪ、　Ｇ、ゼイクス（ＺｅｉｋＵＳ）、 メタノジェニックバクテリアにおけるコリノイドの定性。１９８０゜Ｃｕｒｒ、 Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、３．２４３−２４５゜Ｌ、スカトラド（Ｓｋａ　ｔ　 ｒｕｄ）　、Ａ、Ｊ、チェツズ（Ｔｉｅｔｚ）、Ｔ、　Ｄ、インボリア（Ｉｎｇ ｏ　１　ｉ　ａ）　、Ｃ，Ａ、カントウェル（Ｃａｎｔｗｅ　ｌ　］）　、Ｄ、 Ｌ、ツイツタａｒ−（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｊ、Ｌ、チャプマン（Ｃｈ　ａ　ｐｍａ 　ｎ）およびＳ、Ｗ、クイーナー（Ｑｕｅｅｎｅｒ）、１９８９゜セファロスポ リウム・アクレモニウムによりセファロスポリンＣの産生を改良する組み換えＤ ＮＡの使用。バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　、１９ ８９．７．４７７−４８５゜ラエムリ（Ｌａｅｍｌ　ｉ）Ｕ、に、　、１９７０ ｏバクテリオフアージＴ４のヘッドのアセンブリーの間の構造タンパク質の切断 。ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７．６８０−６８５゜レオング（Ｌｅｏｎ ｇ）Ｓ、Ａ、　、ディツタ（Ｄｉ　ｔ　ｔａ）　Ｇ、Ｓ、　、ヘリンスキ（Ｈｅ ｌｉｎｓｋｉ）Ｄ、Ｒ，，１９８２ａ　リゾビウムにおけるヘムの生合成。リゾ ビウム・ミリロチからのｄ−アミル−プリン酸シンセターゼをコードするクロー ニングした遺伝子の同定。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（ Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、）、２５７．８７２４−８７３０゜ マクドナルド（Ｍａｃｄｏｎａ　１ｄ）Ｈ，およびＪ、コール（Ｃｏｌｅ）。大 腸菌に１２のｃｙｓＧおよびｎ１ｒＢ遺伝子のモレキュラークローニングおよび 機能的分析、ＮＡＤＨ依存性レダクターゼ活性に要求される２つの密接に連鎖し た遺伝子。発行に付した。
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ６、Ｅ、Ｆ、　フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ ）およびＪ、サンプルツク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）　、１９８２ａ分子クローニン グ：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃ１゜ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏ ｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）、−１−ルドースプリング・ハーバ−・ラボラト リ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コー ルド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニュ ーヨーク。
マズンダー（Ｍａ　ｚ　ｕｍｄ　ｅ　ｒ）　Ｔ、　Ｋ、　、Ｎ、　ニシオ（Ｎｉ ｓｈｉｏ）　、Ｍ、　ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）およびＳ、ナガイ（Ｎａｇａｉ ）、１９８７゜メタノサルキナ・パルケリによるビタミンを包含するコロニドの 産生。１９８６゜Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２．８４３：８４ ８゜　マズンダー（Ｍａｚｕｍｄｅｒ）Ｔ、に、　、Ｎ、−１−ジオ（Ｎｉｓｈ ｉｏ）　、Ｓ、フカザキ（Ｆｕｋａｚａｋｉ）およびＳナガイ（Ｎａｇａｉ）、 １９８７゜メタノサルキナ・パルケリによるメタノールからの細胞外ビタミンＢ １２化合物の産生。Ａｐｐｌ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　 、２６．２１１−５１６゜ミラー（Ｍｉ　１１ｅｒ）Ｊ、Ｈ，１９７２゜分子遺 伝学における実験。
コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバ−（Ｃｏ ｌｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、＝ニーＥｌ−り。
モノド（Ｍｏｎｏｄ）Ｊ、およびＥ、ウオールマン（Ｗｏｌｌｍａｎ）、１９４ ７゜バクテリオファージで感染したバクテリアにおける成長の阻害および酵素的 適合。Ａｎｎ、Ｉｎ５ｔ、Ｐａ５ｔｅｕｒ、７３．９３７−９５６゜ マーフィー　（Ｍｕ　ｒｐｈｙ）Ｍ、Ｊ、　、シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）Ｌ。
Ｍ３、カミン（Ｋａｍｉ　ｎ）Ｈ，およびロウセンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ ）Ｄ、　、１９７３゜ヘムのプロテーゼの群の新しいクラス＝８つのカルボン酸 基をもつ鉄−テトラヒドロポルフィリン（イソバクテリオコリン型）の同定。ジ ャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、） 、２４８．２８０１−２８１４゜マーフィー　（Ｍｕｒｐｈｙ）Ｍ、Ｊ、　、シ ーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）Ｌ。
Ｍ、、１９７３゜同化および異化のサルファイドリダクターゼの両者に共通する ポルフィリン関係プロテーゼ基の新しい型のための基準。ジャーナル・オブ・バ イオロジカル・ケミストリー（Ｊ、　Ｂｉｏｏｌ、　Ｃｈｅｍ、）、２４８．６ ９１１−６９１９゜ネクソ（Ｎｅｘｏ）Ｅ、およびオレセン（Ｏｌｅｓｅｎ）ｏ 固有の因子、トランスコバラミンおよびハプトコリン。ドルフィン（Ｄｏｌｐｈ ｉｎ）Ｄ、　、Ｂ１２．５７−８５、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏ ｈｎ　Ｗｉｅｌｙ　＆　５ｏｎｓ）、＝ニーヨーク。
ノーマーク（Ｎｏｒｍａｒｋ）Ｓ、　、Ｓ、ベルブトレム（Ｂｅｒｇｔｒｏｍ） 　、Ｂ、ジャウリン（Ｊａｕｒｉｎ）　、Ｆ、リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ ）および０．オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ）、１９８３゜オーバーラッピングする遺 伝子。Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、　、１７．４９９−５２５゜ フラング−（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）Ｊ、　、Ｔ、ケンペ（Ｋｅｍｐｅ）およびＪ 、メッレンズ（Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ）、１９８３゜オリゴヌクレオチド特異的突然 変異誘発を使用する改良されたＭ１３ベクターの構成。
遺伝子（Ｇｅｎｅ）２６．１０１−１０６゜ノイエ７．（Ｎｏｙｅｓ）Ｒ，，１ ９７０、ビタミンＢ１２の調製、１４５−１８２、ノイエス・ディベロップメン ト（Ｎｏｙｅｓ　Ｄｅｖｅｌｏｐｐｍｅｎｔ）Ｓ、Ａ、　、米国ニュージャーシ イ州パークリッジ。
ブレントキ（Ｐｒｅｎｔｋｉ）Ｐ、およびＨ，Ｍ、コリン、（Ｋｒｉｓｃｈ）　 、１９８４゜選択可能なりＮＡ断片を使用する試験管内挿入の突然変異誘発。遺 伝子（Ｇｅｎｅ）　、２９．３０３−３１３゜レンズ（Ｒｅｎｚ）Ｐ、　、１９ ７０゜ビタミンＢ１２の生合成におけるいくつかの中間体。メソッズ・イン・エ ンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８．８２−９ ２゜リグビー（Ｒｉｇｂｙ）Ｐ、Ｗ、Ｊ、　、ディークマン（Ｄｉｅｃｋｍａｎ ｎ）Ｍ、　、ｏウデス（Ｒｈｏｄｅｓ）Ｃ８、ルーフ（Ｂｅｒｇ）Ｐ。
、１９７７゜ＤＮＡポリメラーゼ■を使用するニック翻訳による高い特異性の活 性に対するデオキシリボ核酸の標識つけ。ジャーナル・オブ・モレキュラー・バ イオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）、１１３．２３７゜ ルーフ（Ｒｏｏ　ｆ）　Ｄ、　Ｍ、およびＪ、　Ｒ，ｏス（Ｒｏｔｈ）　、１９ ８８゜チフス菌の中のエタノールアミンの利用。ジャーナル・オブ・バクテリオ ロノー（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１７０，３８５５−３８６３゜ サンガー（Ｓａｎｇｅ　ｒ）Ｆ、　、Ｓ、＝７クレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ）および Ａ、　Ｒ，コウル”／：／　（Ｃｏｕ　ｌ　５ｏｎ）　、１９７７゜連鎖停止阻 害因子を使用するＤＮＡ配列決定。プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・ア カデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、） 、７４．５４６３−５４６８゜サランダース（Ｓａｕｎｃｌｅｒｓ）Ｇ、、ツア イト（Ｔｕ　ｉ　ｔ　ｅ）　Ｍ。
Ｆ、およびボルト（Ｈｏ　Ｉ　ｔ）Ｇ、　、１９８６゜菌のクローニングベクタ ー。Ｔｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、、４．９３−９８゜シエーレル（Ｓ ｃｈｅｒｅｒ）Ｐ、　、ヘルリーゲル（Ｈｏｌｌｒｉｅｇｅｌ）Ｖ、、クルゾ（ Ｋｕｒｇ）Ｃ，、ボウケル（Ｂｏｋｅｌ）Ｍ。
およびレンズ（Ｒｅｎｚ）Ｐ、、１９８４゜メタノサルシナ・パルケリの中の５ −ヒドロキシベンズイミダゾリルコバミド（ビタミンＢ１２−因子１１１）の生 合成について。アーチーブス・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ、Ｍｉｃｒｏｂ ｉｏ＋、）　、１３８．３５４−３５９゜シュナイダ−（Ｓｃｈｎｅ　１ｄｅｒ ）Ｚ、およびフリートマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）Ｈ，，１９７２゜ビタミンＢ １２５’　−ホスフェートの酵素的脱リン酸反応についての研究。アーチーブス ・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ 　ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ１１５２．４ ８８−４９５゜ スコツト（Ｓｃｏｔ　ｔ）　Ａ、１．　、Ｎ、　Ｅ、　７ツケンジー（Ｍａｃｋ ｅｎｚ　ｉ　ｅ）　、Ｐ、Ｊ、　サンタンダ−（Ｓａｎｔａｎｄｅｒ）、Ｐ、Ｅ 。
フエイガーネス（Ｆａｇｅｒｎｅｓｓ）、Ｇ、ムラ−（Ｍｕｌｌｅｒ）、Ｅ　シ ュナイダ−（Ｓｃｈｎｅ　ｉｄｅ　ｒ）　、Ｒセルトメイア−（Ｓｅｌ　ｄｍｅ 　ｉ　ｅ　ｒ）およびＧ、ウオーナ−（Ｗｏｒｎｅｒ）　、１９８４゜ウロゲン ＩＩＩおよびコピリン酸の間のメチル化工程のビタミンＢ１２タイミングの生合 成。Ｂｊｏｏｒｇ、Ｃｈｅｍ、１２：３５６−３５２゜サウザーン（Ｓｏｕｔｈ ｅｒｎ）Ｅ、　、１９７５゜ゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ断片の間の特 定の配列の検出。ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、）、９８．５０３−５１７゜ ステイナェル（Ｓｔａｃｈｅ　Ｉ）Ｓ、Ｅ、　、Ｇ、アン（ア：／）　、Ｃ。
フロウアス（Ｆｌｏｒｅｓ）およびＥ、Ｗ、ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、１９８ ５゜β−ガラクトシダーゼ遺伝子の融合のランダム発生のためのＴｎ３１ａｃＺ ）ランスボゾン：アグロバクテリウムの中の遺伝子の発現の分析への応用。ＥＭ ＢＯＪ、、４．８９１−８９８゜ステイデン（Ｓ　ｔａｄｅｎ）Ｒ，およびＡ、 　Ｄ、　？クラチラン（ＭｃＬａｃｈｌａｎ）　、１９８２゜長いＤＮＡ配列の 中のタンパク質解読領域の同定におけるコドンの優越性およびその使用。核酸の 研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、Ｌ、１０．１４１−１５６゜スツッパリ ッチ（Ｓｔｕｐｐｅｒｉｃｈ）Ｅ、　、１．ステイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）およ びＨ，Ｊ、エイシンガー（Ｅｉ　ｓ　ｉｎｇｅｒ）　、１９８７゜メタノバクテ リウム・ターモアウトトロフィクムの中のビタミンＢ１２によりＣｏａ−（５− ヒドロキシベンズイミダゾリル）コバミドの置換。ジャーナル・オブ・バイオケ ミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、）　、１６９　：　３０７６−３０８１゜タ イラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｊ、Ｗ、　、Ｊ、オツド（Ｏｔｔ）およびＦ。
エクスティン（Ｅｃｋｓ　ｔ　ｅ　ｉｎ）　、１９８５゜ホスホロチオエート修 飾ＤＮＡを使用する高い頻度におけるオリゴヌクレオチド特異的突然変異の急速 な発生。核酸の研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）、１３．８７６４−８ ７６５゜ ビエラ（Ｖｏｅｒａ）Ｊ　およびメソレンズ（Ｍｅｓｓ　ｉｎｇ）Ｊ、。
１９８２゜突然変異原を挿入しそして合成汎用プライマーを使用する配列決定の ためのｐＵＣプラスミド、Ｍ１３ｍｐ誘導系。遺伝子（ＧｅｎｅＬ１９．２５９ −２６８゜ ウエイーシウング（Ｗｅ　１ｎ−Ｈｓ　ｉｕｎｇ）Ｌ、　、Ｌ、チーチェング（ Ｃｈｉ−Ｃｈｅｎｇ）およびＷ、チュング（ｃｈｕｎｇ）−Ｌ　１９８５゜ＤＮ Ａ配列の発生、ｐｉ−９４゜Ｒ，Ｊ、マクインタイア（Ｒ。
Ｊ、Ｍｃｌｎｔｙｒｅ）編、モレキュラー・エボルーショナリー・ジェネテイッ クス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ　ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、 プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ）、＝ニーヨークおよびロンドン 。
ラック（Ｌａｔｔａ）、Ｍ、　、Ｍ、アイゾツト（Ｐｈｉｌｉｔ）、■０、マウ リイ（Ｍａ　ｕ　ｒ　ｙ）　、Ｆ、フルブリール（Ｓｏｕｌｂｒｉｅｌ）、Ｐ、 デネフレ（Ｄｅｎｅｆ　ｌ　ｅ）およびＪ、　−Ｆ、　マヤウクス（Ｍａｙａｕ ｘ）　、１９９０゜マルチコピーのプラスミド上のトリプトファンプロモーター の誘導体：大腸菌の中の発現潜在性の比較分析。ＤＮＡ　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、 、９．１２９−１３７゜マヤウクス（Ｍａｙａｕｘ）　、Ｊ、−Ｆ、　、Ｅ、セ ルベラウド（Ｃｅｒｂｅ　１ａｕｄ）、Ｆ、ソウブリーア（Ｓｏｕｂ　ｒ　ｉ　 ｅ　ｒ）　、Ｄ、　ファウチ＋−（Ｆａｕｃｈｅｒ）およびり、ペトレ（Ｐａｔ 　ｒ６）　、１９９０゜ブレビバクテリウムｓｐ、Ｒ３１２からの対称選択的ア ミダーゼの精製、クローニングおよび一次構造。ニトリル−ヒドラーゼとの遺伝 的カップ、リングについての構造的証拠。１９９０゜ジャーナル・オブ・バクテ リウムジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１７２．６７６４−６７７３゜ ベルヤエブ（Ｂｅ　Ｉｙａｅｖ）　、Ｓ、Ｓ、　、Ｒ，ウォルキン（Ｗｏｌｋ　 Ｉ　ｎ　）　、ｗ、　Ｒケネアリイ（Ｋｅｎｅａ　ｌｙ）　、Ｍ、Ｊ、デ・二。
（Ｄｅ　Ｎｉ　ｒｏ）　、Ｍ、Ｊ、　ニブスティン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）およびＪ 、Ｇ、ゼイクス（Ｚｅ　１ｋｕｓ）　、１９８３゜ボンジウズスケ油田からのメ タノジェニックバクテリア：安定な炭素のアイソトービック分画の一般の特性決 定および分析。Ａｐｐ　１．　Ｅｎｖ　ｉ　ｒａｎ、　Ｍｉ　ｃ　ｒ。
ｂｉｏｌ、　、４５．６９１−６９７゜サイキ（Ｓａｉｋｔ）、Ｒ，Ｋ、　、Ｄ 、　Ｈ，ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）　、Ｓ、スッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ ）、Ｓ、シャーフ（Ｓｃｈａｒｆ）、Ｒ，ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）　、Ｇ、Ｔ 、ホーン（Ｈｏｒｎ）、Ｋ、Ｂ、ムリス（Ｍｕ　Ｉ　１　ｉ　ｓ）およびＨ，Ａ 、エーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）。１９８８゜熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用 するＤＮＡのプライマー特異的酵素的増幅。サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）　 、２３９．４８７−４９１゜ ソウラード（Ｓｏｕｌｌａｒｄ）Ｎ、　、Ｍ、７ゴツト（Ｍａｇｏｔ）、０、ボ ッソト（Ｐｏｓｓｏｔ）およびり、シポルト（Ｓｉｂｏｌｄ）、１９８８゜アー チエバクチリアのメタノコツカス・サーモリトロフィクムおよびメタノバクテリ ウム・イバノビを固定する窒素からのＮｉ　ｆＨにトロゲナーゼＦｅタンパク質 ）に対して相同性の領域のヌクレオチド配列・進化的関係。Ｊ、Ｍｏ１．Ｅｖｏ ｌ、　、２．６５−７９゜チェノ（Ｃｈｅｎ）　、Ｅ、Ｌ、およびＰ、　Ｈ，シ ーバーブ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）　、１９８５゜スーパーコイルの配列決定・プラス ミドのＤＮＡを配列決定するための迅速なかつ簡単な方法。ＤＮＡ、４．１６５ −１７０゜ サイキ（Ｓａｉｋｉ）Ｒ，に、　、Ｄ、Ｈ，ゲルファント（Ｇｅｌｆａｎｄ）　 、Ｓ、ストラフエル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）、Ｓ、Ｊ、シャー７（Ｓｃｈａｒｆ）、 Ｒ，ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）　、Ｇ、Ｔ、　ホーン（Ｈ。
ｒｎ）　、Ｋ、　Ｂ、ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）およびｌ（、ｘ−リッヒ（ＥｒＩ 　１ｃｈ）　、１９８８゜熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡのプラ イマー特異的酵素の増幅。サイエンス（Ｓｃ　１ｅｎｃｅ）　、２３９．４８７ −４９１゜ グルンステイン（Ｇｒｕｎｓ　ｔｅ　ｉｎ）Ｍ、　、ホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ ）Ｄ　、１９７５゜コロニーのハイブリダイゼーション：特異的遺伝子を含有す るクローニングしたＤＮＡの分離の方法。プロシーディンゲス・オブ・ナショナ ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。
Ｎａ　ｔ　Ｉ、Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、７２．３９６１−３９７１゜コ ツサート（Ｃｏｓｓａｒｔ）Ｐ、およびＢ　ギククエルーサンゼイ（Ｇｉｃｑｕ ｅｌ−３ａｎｚｅｙ）、１９８２゜大腸菌に１２のａｒｐ遺伝子のクローニング および配列。核酸の研究（Ｎｕｃｌ、Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、Ｌ　１０．１３６３− １３７８゜ビエラ（Ｖｉｅｒａ）Ｊ、およびＪ、メッレンズ（Ｍｅｓｓｉｎｇ） 、１９８７゜一本領ＤＮＡの産生。エンジモロジー（Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１５ ３．３−１１゜ バルビエリ（Ｂａｒｉｂｉｅｒｉ）Ｐ、Ｇ、　、ポレッチ（Ｂｏｒｅｔｔ　ｆ） 　Ａ、　、ジ・マルコ（Ｄｉ　Ｍａｒｃｏ）Ａ、　、ミグリアッシ（Ｍｉｇｌ　 １ａｃｃ　ｉ）Ａ、およびスパラ（Ｓｐａｌ　１ａ）Ｃ１１９６２゜ノルカルシ ア・ルゴサ（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ　ｒｕｇａｓａ）におけるビタミンＢ１２の生 合成についてのそれ以上の観察。バイオヒミカ・ニド・バイオロジカル ｔａ）、５７．５９９−６００゜ レンズ（Ｒｅｎｚ）Ｐ、１９６８゜プロピオオニバクテリウムによるコピナミド からのビタミンＢ１２の酵素的合成の反応法。Ｚ、Ｐｙｓｉｏ　１．Ｃｈｅｍ、 　、３４９．９７９−９８１゜ロンジオ（Ｒｏｎｚ　１ｏ）Ｒ，Ａ、およびバー カー（Ｂａｒｋｅｒ）Ｈ，Ａ、　、１９６７゜プロピオン酸のバクテリアの抽出 によるグアノシンジホスフェートコピナミドの酵素的合成。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ。
６．２２４４−２３５４゜ チバウト（Ｔｈｉｂａｕｔ）Ｄ、　、デブッシエ（Ｄｅｂｕｓｓｃｈｅ）Ｌ、お よびプランチェ（Ｂｌａｎｃｈｅ）Ｆ、１９９０ｏビタミンＢ１２の生合成：５ つのアデノシルメチオニン誘導周辺メチル基を保持するコリンのマクロサイクル の金属不含前駆体のプレコリン−６Ｘの分離。
プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ ｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８７．８７９５−８７ ９９゜ オーク（Ｏｈ　ｔ　ａ）　Ｈ，およびベック（Ｂｅｃｋ）Ｗ、Ｓ、１９７６゜ラ クトバチリルス・レイチマンニイのリポソーム関連ビタミンＢ１２のアデノシル 化酵素の研究。アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィ ジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉ ｏｐｈｙｓｊｃｓ）、１７４．７１３−７２５゜ プレイディ　（Ｂｒａｄｙ）Ｒ，Ｏ、カスタネラ（Ｃａｓｔａｎｅｒａ）　Ｅ、 Ｇ　およびバーカー（Ｂａｅｋｅｒ）Ｈ，Ａ、１９６２゜コウハミドの補酵素の 酵素的合成。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ 、Ｃｈｅｍ、）、２３７．２３２５−２３３２゜ フェントン（Ｆｅｎ　ｔｏｎ）Ｗ、Ａ、およびロウセンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅ ｒｇ）Ｌ、Ｅ、１９７８゜ヒドロキソコバラミンのミトコンドリアの代謝：完全 なラットの肝臓のミトコンドリアによるアデノシルコバラミンの合成。アーチー ブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖ ｅｓ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ）、１ ８９．４４１−４４７゜バイトールス（Ｖｉｔｏｌｓ）Ｅ、　、ウォーカー（Ｗ ａ　ｌ　ｋ　ｅ　ｒ）　Ｇ。
Ａ、およびフエンネケンス（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ）Ｆ、Ｍ、１９６６゜コバミ ドの補酵素、α−（５，６−シメチルーペンズイミダゾリル）デオキシアデノシ ルコバミド（アデノシル−Ｂ１２）へのビタミンＢ１２の酵素的転化。Ｊ、Ｂｉ ｏｌ、Ｃｈｅｍ、２４１．１４５５−１４６１゜ギムレング（Ｇｉｍｓ　ｉｎｇ ）Ｐ、およびベック（Ｂ　ｅ　ｃ　ｋ）　Ｗ、Ｓ。
１９８６゜生物学的物質の中のコバラミンの決定。メソッズ・イン・エンジモロ ジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）、１２３．３−１４゜ ジャコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）Ｗ、Ｊ、　、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）Ｒｏお よびブラウン（Ｂｒｏｗｎ）Ｋ、Ｌ、１９８６゜高性能液体クロマトグラフィー によりコバラミン補酵素および他のコリノイドの分析。
メソッズ・イ：／　・工：／ジモロシー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、） 。
図　５ 図石 ＣＧＣＴＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＣＧＣＴ　ＣＣＡＣＣ入ＣＧＣＣＧＡＣＧＣ ＧＣＧ丁ＣＧＣＧＡＧＣＴＧＡＣＣＴＡＧＣＣＧＣＧＣＣＧＧＡＴＧＣＧＧＣＡ ＧＣＣＧＡＴＧＣＣＧＴ（ゴ＾丁：ゴ℃ＣＧＧＧＧＧ＋−了＾ＴＣＣＧＧＡＧＣ ＴＧ　Ｃ＾ＴＧＣＧＧＧＧＣＧＣＣ？ＡＣＧＣＣＧ　ＴＣＧＧＣＴＡＣＧＧ　Ｃ ＡＧＡＴＡＧＡ入Ｇ　ＧＣＣＣＣＣＣ入八τ　ｅｃ　へＧＴ入ＣＧＣＣＣＣＧＦ ＩＣＬＩＲＥ　７．６ ＣＡＴＧＣＣＴＧ入Ｇ　ＴＡＴＣＡ〒ＴＡＣ入　〒〒１’：ＧＣ１’：ｌ〒Ｃｎ 　ｒλ１ｒ（’！’Ｌ”ＬＷ　７Ｍ”ｌ：シシＹｉ〒　ｒｒ|ｈ内ｒｐ−乳−ｎ 配列　５３９８ｂｐの断片１〜１２００長さ＝１２００ｂｐｂｐ　５３９８８Ｐ の断片１０００〜２２００長さ一１２０１ＢＰ図　９．２ 配列　５３９８ＢＰの断片１８００〜３４００長さ＝１６０１ＢＰ　−１６０１ ＢＰス１ｓ＠　２０１　２２テ＠　２４１＠　２ツ＠９　２フ３１　九１・　コ ・フ・　１２コ・Ｃ８相補性鎮 図　９．３ ＱＺｉｌｌｌ；ＱＱＱＱＤ小に＋ＱＱ八〇へ電ＱＱＱ里六〇Ｉ　ＢＯＯＱＤ配列 　５３９８８Ｐの断片３０００〜４５００長さ−１５０１ＢＰ３１４＠コ２＠＠ ３４４１１３３＠９ｍ７４１３・Ｃ９４・４９４１智１４コ４１ｆＢ＋Ｉ　Ｑ７ 　Ｂ　Ｑ　ｆｔ　＋＋のＭｌ＋ＲＦ＋０−１６５０長さ一１００１ＢＰ■ツリ　 ３．１”ｄ’６ｂＦ’Ｕ）町Ｈ６６ＵＵ−０，３’ｄ５炊Ｅ＝Ｌ３’ｄ”Ａｋ５ Ｆ’配列　８７５３Ｂｐの断片１４００−３１００長さ＝１７０１ＢＰ！＄６９ 　３？３９　１９＠９　２８７９　２２４９　２４ヱ９　２５Ｍ９　２７５９　 ２９２９配列　８７５３８Ｐの断片２７００〜３７００長さ＝１００１８Ｐ２７ ９９　２Ｈ１９２ＱＨ３＠９９　３１９９　コ２９９　３３９９　３４１）９　 ３５＠９配列　８７５３８Ｐの断片３５００−４５００Ｍ？１００１８Ｐ３５９ Ｑ　３６９９　３７ＱＱ　３１１９９　３（１９９４・９１ｉ１　４１’Ｈ４２ ９９４３９９オーフンリーデイノグフレーム９ 図１Ｏ１６ 配列　８７５３８Ｐの断片４１５０〜５１５０長さ＝１００１ＢＰ図　ｌＯ９５ 配列　８７５３８Ｐの断片５０００−６０００長さ一１００］、ＢＰオープンリ ーディノグフレーム１１ 配列＋　８７５３ＢＰの断片５７００〜７２００長さ−１００］−Ｂ　Ｐオープ ／リーディ／グフレーム１２ 配ダｌ＋：８７５１Ｐの断片７０００〜８０００長さ＝１００１８Ｐ？０９　７ １０９　７２Ｈ７３Ｈ７４Ｈ７５９９７６９９７７９９７１１９９オ一ブンリー デイノグフレーム］３ 図　１０．８ ＦＩ［；ＵＲＥ　１４ ｃｏｂＡ遺伝子およびＣ０ＢＡタノノ＜り質５３９６ＢＰのＣ１ａｌ−Ｈｉｎｄ ｌｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌｌ−Ｈｉｎｄｌｌ＋断片の配ＷＩＬ１１４１〜１９８０ 図　１５．１ 第１残基−１ 数　Ｎｏ、Ｚ　Ｍ量　重量　２ 第１残基−１ 数　ＮＯ工　重量　重量　２ 極性指数（％）　−騎 図　１５．１＋ ｃｏｂｃ遺伝子およびＣ０ＢＣり／ノくり質５３９６ＢＰのＣ１ａｌ−Ｈｉｎｄ ｌｌｌ−ＨｉｎｄＩＩｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列、図１５．５ 第１残基　−１ ７１−″”°　最後の残基　−３３３ 数　Ｎｏ　ｚ　重量　重量　Ｘ 図１５．７ 数　Ｎｏ　ｚ　重量　重量　工 Ｉ　ＰＲＩＥ　Ｆ　１４　４．３３　２０５Ｂ、９８　６．０２つｖｒ＋＋ｖｔ Ｅ１１Ｑ＊（ｎｌｌｌｌ−ＧｏＸＪ、＠９図１６．１ ＣＯＢＦ　タノハク質　第１残基−１ 図１６２ 図　１６．３ Ｐ！ｒ、、５３ Ｃｏ釦タンパク質　第１残基−１ ｃｏｂＨ遺伝子およびＣ０ＢＨタンパク質Ｇｏ！ＩＩ　９７１４’）質　第１Ｐ Ｉ基　−１最後の残基　−２４５ 同数　Ｎｏ、！　重量　重量　Ｘ 残基　＋　２４５ 分子量　−２５８７８゜ 極性指数（％）　−３６゜ 等電点　−６，１７ ００２６０（１園８ノーｄ）　−０，５１２００２８０（１■名ノー＋ｍｌ）　 −０，１１４３ＣＯＢＪ　タン・バク質　第１残基　−１最後の残基　−２５４ 数　Ｎｏ、！　重量　重量　Ｘ 残基　−２５４ 分子量　−２７０８８ 極性指数（％）　−３５゜ 等電点　−５，４３ ００２６０（１ｍ＆／ｍｌ）　−０，５７５０ｔｌ　２１０　（Ｌ　ｍｄ＋ｉＬ ）　−０，９２２ｃｏ＆Ｊ　ｌ−２５４ ２５Ｓ＠　７！　１会・　１２５　１！・　１７５　２・自　２２ツ　ズ５・図 　１６．１０ ｃｏｂＫ遺伝子およびＣ０ＢＫタンパク質８７５３ＢＰのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片の配列２８６１−３６４６、相補性鏡上図　不、イイ ？ＩＡＮＦ、　−Ｃ０ＲＫ　第１残基　；１図　プロ、４フー ｃｏｂＬ遺伝子およびＣ０ＢＬタノバク質図　１６．１３ ＣＯＢＬ　タフバク實　第１残基−１ 図　１６．１ム 図　１６．１５ ｃｏ聞タ／バク實　第１残基　−１ 等電点　−５５８ カラム上の保持時間 ツユ−トモナス・デニトリフィカンスのＣ０ＢＡおよびＥ、ｃｏｌｉのＣＹＳＧ のり／バク質の間の整列 Ｃ０ＢＡ配列 ＣＹＳＧ配列 ｃｏＢＡ配列３−２５９ ＣＹＳＧ　配列２０４−４６０ アミノ酸の厳格な相同性；　４１６χ 図２２ 図２３ 図２４ Ｆｌ＆υば２５ Ｆ’Ｉ［ｌ；ＩＪＲＥ　２７ 図　３４ 図　３４．１ ！’＋　３９ 数　Ｎｏ　χ　ＩＩＩ　ＩＩ鳳　χ ３３　６６　９９　１コ２　１６５　１９８　２コ１　２６４　２９７　ココの 閏　４０ ｅｏｂｓｊｒｉ＋およびＣ０Ｂ５タノバク實４７４９ＢＰのＳａ　ｌ　１−８ｓ 　ｌ　ｌ−５・１！−５碓ｌｌ−３ａｌｌ−Ｂｉｌｌ断片の４門１！１１２〜２ ５１０ｎ＠ＶａｌＬｅｕＧ１ｕＡ工１τｈｒ入ユａ会会会入ＴＣ ２４９６２５０ｇ 図　４０．１ 随、α恵τ　蒙１１１ＪＩ　ｍ１ ５ｗ６ｆｉｊ！”　６３１ ｃａｂＴＪ伝子およびＣ０ＢＴタンパク質４フ４９８Ｐのｇａｌｌ−８ａｌｌ− Ｂａｌｌ−５ａｌｌ　−Ｓａミロ−１１１１１片の配Ｎ２６１６−４６１１Ｆｌ （、ＬＩＲＥ　４０．４ Ｉ’ｌｌ朋　＝　１ ｇｓ　−Ｃ０ＲＸ　、、、、、　＝　９３ｍ　４０．５ ｃａｂＸｊｅＴｌＩＡびｃｏａｘりＩバク賃４フ４９１１Ｐｆ１５ｊｌｌ−５ａ ｌｌ−３ａｌｌ−８ａｌｌ−！ｔａｌｌ−１１ｇｌｌＷＡ片の配Ｐ１４０８９− ４３７０名％　−ＣＤＢｏ　２　ｍ’ｌｌ践ＪＫ　−１３ｍ盪の改悪　−３３８ 誼　ＮＯ，！　、層　軸　Ｉ ココ　６６　９９　１コ２　１６５　１９１１　２コ１　２６４　２９７　３コ ０ｃａｂＵＪ伝了およσＣＱＢＩＪタノハク宵３Ｐ５５ＢＰのＳ＋＋ｌ−９＋＋ ｌ−Ｒａｍ＋Ｎｍ片の配Ｎ　２０９９−３１１５園　４１．２ 鵠　−ＣＯＢＶ　１度、Ｉ Ｈ虐ｅｍＭ　−ａ　３０２ 数　ＮＯ・”　１ｌｆｉ　Ｉｌｌ　１ 図　４１．３ ｃｏｂＶ遣云了およびｃｏａｖり／バク胃３８５５ＢＰのＳ＊＋ｌ−３ｓｔｌ１ −３ｓｔｌ−Ｂａ＋の配Ｎ　１８１１５−２７９３配ばＩ　ＩＩさ　−１３１４ ４１〜　ＤＩ４４ＴＧＣＣＧＧＴＣＧＴ　ＧｃｒＧＧＴｃＧＧｃＧＡＣＡＴＣＧ ＡＣＣＧＣＧＧＧＧＧＧＧＴ　ＧＡＴＣＧＣＣＴＣＧ　ＣＴＧＧＴＣＧＧＣＡＡ ＣＧＧＣユα講α講ＣロＬＧＣＣＧαに７Ｍに一力α’１ｃｃｃｃα講σ＾α℃ ａ駅℃詰αスズ℃ごα工講ＣＣＴＣに丁ＣＡＡＣＧ入ｑにＣｍ≧コズエゴつαＸ 工Ｃアｉに℃への’ＣＧＧｉに℃丁ａシリＩＣＡ％入ＴＧｃＧｃｃＴｃｃＴＧＡ ＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＣＧＧＣＧＣＣＣＧＣＡ↑ＣＧＡｅｃＡＡＴＡＴＴＡＣＣ Ａｃｃｃｃｃｃｃ〒ｃｃτ入ＣＧＣＧＧＡＧＧ　ＡＣＴＡＧＧＴＣＣＧ　Ｃ０＾ ＧＣＣＧＣＧＧ　ＧＣＧＴ入ＧＣＩ’ＧＧ　ＴＴＡＴＡＡＴＧＣＴ　ＧＧＣＧＣ ＧＧOＣＣ 仁＾ＧＧＧＣＧＴＧＧ　Ａσ＝■コ℃＾ＴＩ：　ＡＧＣＣ＾０ＧＣＴ　Ｇ−コ５ ℃？Ｇ　ＧＧＣ！　ＴＣＣ＆ＣＧＣＣ’ｒＣＴＣＣＣＧｉｕＣＣＴＣＡＡＧＡＣ ＴＡＣＴＣΩＣｒＣＴｃＧＡＣＣＧＴＣＡＡＱ＆ＣＣＣＧＣＧＡＣＧＭ　八ＧＣ ＣＧＧＣＧＧ＾ｘｃＣＣＡＴｃｃａ　ＧＣ％Ｃ（：ＧＣλＣＴ！’ＣＣ丁λＣα ℃口ｋｃＡＧＣ■℃ＣＧＧＣＣｅＴλｘｔＣＧＧＣＴＣＣＣＧ’？ｒｌｃｌＩＲ ［ｆｔ３．１２ ＦＩＧＵＲＥ　４３．１３ オーブ／リーディノグフレーム　２２ 図　６５．１ リ　リ　− １３１４４−ｂｐ　ｒ）ｙｑ　４２９　−　１１１６６　９８ＤＭＧＴ１３１４ ４−ｂｐ　の配列　。３６４〜３８８８　。９粋旦　、。□Ｃ０ＢＰ　タンパク 宵　１１１１１１基　＋　１Ｍ鐵のｅｔａ　−１７４ 散　＜、２　重量　重量Ｘ １３１４４−ｂｐ　の配列　３ｇ９２−４９５６　””　ａｒｉ：ＴＣＯＢ−タ ノバク宵　ＩＴＩＦｊ基　＋　１ＪＩＩ！のｆ１基　＋　３５４ ！！７＠Ｉ＠Ｓ＋４＠ｌフ５ズｌ＠２４ｆｆ２１・】１５１５１図４７．５ １３１４４−ｂｐ　ｌ’１ｌｌｉＪ１　１　２　ｎ０６Ｇ−１１８８７””　” ”図４７．６ Ｃ０ＢＯタッパクー　ＦＩＲ（，１１１１残蔦　−ＩＬＪ　ｍ虚の騒　：　−２ １４ 囚 Ｍ、ｌｖｍｎａｖｌｉのＳＵＭＴのＮ１１＋末端配列ＶＶＹＬＶＧＡＧＰＧＤＰ ＥＬＩＴＬＫＡＶＮＶＬＫ−ＡＤＶＶＬセンスオリゴヌクレオチド−９２３（２ ７７−）ＶＹＬＶＧ　＾ センスオリゴヌクレオチド９４７　（２５？−１ＮＥ　ＬＴ　Ｇ Ｍｍ　Ｍ、ｌマ・ｎａマロの ＳＵＭＴの横盈遺伝了 図　４８ Ｈｉｄ　Ｅｅａ Ｈｉｎｄ　Ｅｃ。
冒　ファージＭ１３ｍｐ１９の■ＯＮ＾のプライマー−２０のハイブリダイゼ− ７Ｗ）部位 ニ　セ・スオリゴ１クレオチド ９４６に対してＴ＋１補性の配列 図　４う ＦＩＧＵＲＥ　５０ 図５３ 要　約 コバラミンおよび／またはコビンアミド、と（にの生合成に関係する新規なポリ ペプチド、これらのポリペプチドの発現の原因となる遺伝子物質、およびそれら を調製する方法を記載する。組み換えＤＮＡ技術を使用してコバラミン、とくに 補酵素Ｂ１２の産生を増幅する方法を、また、記載する。
補正音の写しく翻訳文）提出口　（特許法第１８４条の８）１．特許出願の表示 ＰＣＴ／ＦＲ９１１０００５４ ２、発明の名称 ３、特許Ｉｆ５願人 ４、代理人　〒１０７ （１）補正音の写しく翻訳文）　１通 （７〜１０）は翻訳カップリングにおいて解読フレームの特性を表す（Ｎｏｒｍ ａｋ　ｅｔ　ａｌ、　、１９８３）、すなわち、フレームｘ＋１の翻訳開始コド ンはフレームＸの翻訳停止コドンとオーバーラツプするが、あるいはこれらのコ ドンは非常に密接する。
３．３．４つのオーブンリーディングフレームを４．８ｋｂの５ａ１１−３ａ　 ］　ｌ−３ａ　Ｉ　ｌ−３ａ　］　ｌ−３ａ　ｌ　Ｉ−Ｂｇ　ｌ　Ｉ断片につい て特性決定する。それらは相１４〜１７と表示し、そして４．８ｋｂの断片の配 列中のそれらの位置は次の通りである（Ｓｓｔ１部位からＢｇｌＩＩ部位へ５゛ →３′配列において）：青：４．８ｋｂのＳａｉｌ−５ａｉｌ−３ａｌｌ−８ａ ｌｌ−３ａｌＩ−ＢｇｌＩ断片の確からしいオーブンリーディングフレーム。配 列中の位置は第３２図に記載する配列中の位置に相当し、ここで上の鎖はその５ ′→３′の向きで記載する。フレーム１５．１６および１７は、フレーム１４と 対照的に、上の鎖によりエンコードされる。
これらのオーブンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並 列の他のフレーム（合計・４）について観測されるものとともに、第３，４図に 記載する。フレーム１５．１６および１７は同−鎖により、フレーム１４は相補 性路によりエンコードされる。
３４．４つのフレームを３．９ｋｂのＳ　ｓ　ｔ　ｒ−５ｓ　ｔ　Ｔ−ＢａｍＨ Ｉ断片について特性決定される。それらを１８〜２１と表示し、そして３．９ｋ ｂの断片の配列中のそれらの位置を下表に記載する。
表　３．９ｋｂのＳｓ　ｔ　ｌ−８ｓ　ｔ　Ｔ−ＢａｍＨＩ断片の確からしいオ ーブンリーディングフレーム。配列中の位置は第３３図に記載する配列中の位置 に相当し、ここで上の鎖の極性はその５’　−＋３°である。フレーム１８およ び１９は、フレーム２０および２１と対照的に、下の鎖によりエンコードされる 。
される。
３．５．９つのオーブンリーディングフレームを１３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂ ｇｌＴＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌｌ断片について特性決定する。それらをフレー ム２２〜３０と表示し、そして１３．１ｋｂの断片の配列中のそれらの位置は次 の通りである（ＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩへ５゛→３′配列）： 青：ｉ３．ｌｋｂのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　ＩＩ−ＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌ　Ｉ■断片 の確かししいオーブンリーディングフレーム。配列中の位置は第４３図に記載す る配列中の位置に相当し、ここで上の鎖はその５゛→３′の向きである。フレー ム２２．２３．２４．２５．２６．２７および２９は、フレーム２８および３０ と対照的に、上の鎖によりエンコードされる。
オーブンリーディングフレーム２２．２３．２４．２５および２６が解読フレー ムである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計５）について観測されるもの とともに、第４５図に記載する。これらの５フレームは同−鎖によりエンコード される。
請求の範囲 ■、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコー ドする部分的に精製したＤＮＡ配列。
２、・第１５図、第１６図、第４０図、第４１図、第４７図および第５２図に示 す、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ，ｃｏｂＤ、ｃｏｂＥ。
ｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ，ｃｏｂｌ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃ。
・遺伝暗号の同義性から生ずるこれらの配列の相同体、および・これらのＤＮＡ 配列またはこれらのＤＮＡ配列の断片とハイブリダイゼーションしおよび／また はそれらと有意の相同性を示し、そしてコバラミンおよび／またはコバミドの生 合成に関係するポリペプチドをコードする、自然、合成または組み換え由来の配 列、から選択される請求の範囲第１項記載のＤＮＡ配列。
３、請求の範囲第１〜２項のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含有する部分的に調 製した遺伝子。
４、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含 有する組み換えＤＮＡ。
５、前記ＤＮＡ配列は発現シグナルのコントロール下に配置されている請求の範 囲第４項記載の組み換えＤＮＡ０６、発現シグナルはＤＮＡ配列に対して相同性 または異種であることができる請求の範囲第５項記載の組み換えＤＮＡ０７、発 現プラスミドの一部分を特徴する請求の範囲第４〜６項のい８、コバラミンおよ び／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードする少なくとも１ つのＤＮＡ配列、およびそれらの発現を可能とする配列を含有するプラスミド。
９、・請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の組み換えＤＮＡ、・複製系、お よび ・少なくとも１つの選択可能なマーカー、を含有する請求の範囲第８項記載のプ ラスミド。
１０、・見立互Ａ１旦旦互Ｂ、−ε旦ｂｃおよび見立旦Ｅ遺伝子を含有するプラ スミドｐＸＬ１５００、 ・ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ７２３およびｐＸ Ｌ３０２． ５５７、および ・９旦旦Ｅ遺伝子を含有するｐＸＬ５４５およびｐＸＬ５４５Ｑ、−ｃｏｂＦ、 ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ，ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃミドｐＸＬ８４３、ｃ ｏｂＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ６９９、それぞれ、ｃｏｂＰおよびｃ ｏｂＷ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ５９３および立見立Ｐ１且旦旦Ｗ１旦 旦互Ｎおよびｃｏｂｏ遺伝子を含有するｐＸＬ１９０９、 から選択される請求の範囲第８項記載のプラスミド。
１１、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＤＮＡ配列または請求の範囲第 ８〜１０項のいずれかに記載のプラスミドが導入されている細胞。
１２、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチド。
１３、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＤＮＡ配列によりエンコードさ れた請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。
１４．５°−デオキシ−５′−アデノシル（Ａｄｏ）：Ｉビリン酸ａ。
Ｃ−ジアミドへのプレコリン−３の転化に参加する請求の範囲第１２項記載のポ リペプチド。
１５、第１５図、第１６図、第４０図および第４１図に表すＣ０ＢＢ。
Ｃ，ＯＢＦ、Ｃ０ＢＧＳＣＯＢＨ，Ｃ０ＢＪ、Ｃ０ＢＫ、Ｃ０ＢＬ、ＣＯＢＭＳ ＣＯＢＮ、Ｃ０ＢＯ１ＣＯＢＳおよびＣ０ＢＴペプチドの配列のすべてまたは一 部分を含有する請求の範囲第１４項記載のポリペプチド。
１６、プレコリン−３とコピリン酸ａ、Ｃ−ジアミドとの間に存在する位置Ｃ− １、Ｃ−５、Ｃ−１１、Ｃ−１７へのメチル基の転移を触媒する請求の範囲第１ ４項記載のポリペプチド。
１７、第１６図に表すＣ０ＢＦ、Ｃ０ＢＪおよびＣＯＢＭペプチドの配列のすべ てまたは一部分を含有する請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。
１８、コビル酸のコビンアミドへの転化に参加する請求の範囲第１２項記載のポ リペプチド。
１９、第１５図に表すＣ０ＢＣおよびＣ０ＢＤペプチドの配列のすべてまたは一 部分を含有する請求の範囲第１８項記載のポリペプチド。
２０、Ｓ−アゾノンルーム−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフエラ ーゼ（ＳＰ２ＭＴ）活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。
２１、第１６図に表すＣ０ＢＩペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２０項記載のポリペプチド。
２２、コピリン酸および／またはヒドロゲノビリン酸ａ、Ｃ−ジアミドシンター ゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。
２３、第１５図に表すＣ０ＢＢペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２２項記載のポリペプチド。
２４、プレコリン−８ｘムターゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペ プチド。
２５、第１６図に表すＣ０ＢＨペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２４項記載のポリペプチド。
２６、第１５図に表すＣ０ＢＥペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。
２７、ニコチネート−ヌクレオチド・ジメチルベンズイミダゾールホのポリペプ チド。
２８、第４１図に表すＣ０ＢＵペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２７項記載のポリペプチド。
２９、コバラミン−５゛　−ホスフェートシンターゼ活性を有する請求の範囲第 １２項記載のポリペプチド。
３０、第４１図に表すＣ０ＢＶペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２７項記載のポリペプチド。
３１、コビル酸シンターゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド 。
３２、第４７図に表すＣ０ＢＱペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第４７項記載のポリペプチド。
３３、プレコリン−６Ｘリダクターゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポ リペプチド。
３４、第１６図に表すＣ０ＢＫペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第３３項記載のポリペプチド。
３５、コビンアミドのＧＤＰ−コビンアミドへの転化に参加する請求の範囲第１ ２項記載のポリペプチド。
３６、コビンアミドキナーゼおよびコビンアミドホスフエートグアニルトランス フエラーゼ活性を有する請求の範囲第３５項記載のポリペプチド。
３７、第４７図に表すＣ０ＲＰペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第３６項記載のポリペプチド。
３８、第４０図に表すＣ０Ｂ５．Ｃ０ＢＴおよびＣ０ＢＸペプチドのプチド。
３９、第１５図、第１６図、第４０図、第、４１図、第４７図および第５７図に 表わされているＣ０ＢＡ、Ｃ０ＲＡ、Ｃ０ＢＢ、Ｃ０ＢＤ、Ｃ０ＢＥ、Ｃ０ＢＦ 、Ｃ０ＢＧ、Ｃ０ＢＨ，Ｃ０ＢＩ、Ｃ０ＢＪ、Ｃ０ＢＫ、Ｃ０ＢＬ、ＣＯＢＭ、 Ｃ０ＢＮ、Ｃ０ＢＯ１ＣＯＢＰ、Ｃ０ＢＱ、Ｃ０Ｂ５．Ｃ０ＢＴ、Ｃ０ＢＵ、Ｃ ０ＢＶ、Ｃ０ＢＷおよびＣ０ＢＸのタンパク質から選択される請求の範囲第１３ 項記載のポリペプチド。
４０、請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のＤＮＡ配列、またはこのような 配列を含有する請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載のプラスミドを宿生細 胞の中に導入し、 ・この組み換え細胞を前記配列の発現のための条件下に培養し、そして・産生さ れたポリペプチドを特徴する 請求の範囲第１２〜３９項のいずれかに記載のポリペプチドを産生ずる方法。
４１、宿主細胞は原核生物、真核生物および動物または植物の細胞から選択され る請求の範囲第４０項記載の方法。
４２、宿主細胞は古細菌（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）または真正細菌（ ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である請求の範囲第４１項記載の方法。
４３、宿主細胞が、大腸菌（Ｅ、ｃｏ　］　ｉ）　、シュードモナス・デニトリ フィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃ’ａｎＳ）、リゾ ビウム・ミリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、アグロバクテリ ウム・ツメファシェンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔ　ｕ　ｍ　ｅ　ｆ　ａ 　ｃ　ｊ−正正」ｐまたはネズミチフス菌（Ｓａ　Ｉｍｏｎｅ　Ｉｌａ　ｔｙｐ ｈｉｍｕｒｉｕｍ）である請求の範囲第４２項記載の方法。
４４、・コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドを コードするｌまたは２以上のＤＮＡ配列を、これらの化合物を産生ずるか、ある いは部分的に産生ずる微生物の中に導入し、・これにより得られた微生物をコバ ラミンおよび／またはコバミドの合成および前記配列の発現のための条件下に培 養し、そして・コバラミンおよび／またはコバミドまたはそれらの前駆体を回収 する、コバラミンおよび／またはコバミドまたはそれらの前駆体の産生を増加さ せる方法。
４５、請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の１または２以上のＤＮＡ配列、 または請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載のプラスミドを微生物の中に導 入する請求の範囲第４４項記載の方法。
４６、微生物の中に導入されたＤＮＡ配列が、コバラミンおよび／またはコバミ ドの生合成の制限工程を触媒するポリペプチドを特徴とする請求の範囲第４５項 記載の方法。
４７、微生物の中に導入されたＤＮＡ配列が、コバラミンおよび／またはコバミ ドの生合成の制限工程を触媒するポリペプチドを特徴とする請求の範囲第４５項 記載の方法。
４８、微生物が、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ、ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓＬ　リゾビウム・ミリロチ（Ｒ，ｍｅ　Ｉ　ｉ　ｌｏｔ上）およびア グロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から選択 される請求の範囲第４４〜４７項のいずれかに記載の方法。
ｔｒｌｉｃａｎｓ）である請求の範囲第４８項記載の方法。
記載の方法。
５１、請求の範囲第１０項記載のプラスミドを微生物の中に導入する請求の範囲 第４４〜５０項のいずれかに記載の方法。
５２、プラスミドｐＸＬ５２５をシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ、ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒｉｆ’の中に導入する請求の範囲第４ ４〜５１項のいずれかに記載の方法。
５３、産生じたコバラミンおよび／またはコバミドは、・可溶化、 ・ンアノ型への転化、および ・精製、 により回収する請求の範囲第４４〜５２項のいずれかに記載の方法。
５４、コバラミンが補酵素Ｂ１□である請求の範囲第４４〜５３項のいずれかに 記載の方法。
５５、前駆体はデコバルトコリノイドおよびコリノイドから選択され国際調査報 告 国際調査報告 ＦＲ９１０００５４ ＳＡ　４４５２７

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコー ドするＤＮＡ配列。 ２、・第１５図、第１６図、第４０図、第４１図、第４７図および第５２図に示 す、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ、ｃｏｂＤ、ｃｏｂＥ、ｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ 、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬ、ｃｏｂＭ、ｃｏｂＮ、 ｃｏｂＯ、ｃｏｂＱ、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ、ｃｏｂＵ、ｃｏｂＶ、ｃｏｂＷ、ｃ ｏｂＸおよびｃｏｒＡ遺伝子、・遺伝暗号の同義性から生ずるこれらの配列の相 同体、および・これらのＤＮＡ配列またはこれらのＤＮＡ配列の断片とハイブリ ダイゼーションしおよび／またはそれらと有意の相同性を示し、そしてコバラミ ンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードする、自然 、合成または組み換え由来の配列、から選択される請求の範囲第１項記載のＤＮ Ａ配列。 ３、請求の範囲第１〜２項のいずれかに記載のＤＮＡ配列を含有する遺伝子。 ４、請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載の少なくとも１つのＤＮＡ配列を含 有する組み換えＤＮＡ。 ５、前記ＤＮＡ配列は発現シグナルのコントロール下に配置されている請求の範 囲第４項記載の組み換えＤＮＡ。 ６、発現シグナルがＤＮＡ配列に対して相同性または異種であることができる請 求の範囲第５項記載の組み換えＤＮＡ。 ７、発現プラスミドの一部分を形成する請求の範囲第４〜６項のいずれかに記載 の組み換えＤＮＡ。 ８、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコー ドする少なくとも１つのＤＮＡ配列、およびそれらの発現を可能とする配列を含 有するプラスミド。 ９、・請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の組み換えＤＮＡ、・複製系、お よび ・少なくとも１つの選択可能なマーカー、を含有する請求の範囲第８項記載のプ ラスミド。 １０、・ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有するプラス ミドｐＸＬ１５００、 ・ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ７２３およびｐＸ Ｌ３０２、 ・ｃｏｂＢおよびｃｏｂＣ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ１３９７、・ｃｏ ｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有するｐＸＬ３６８およびｐＸＬ５５７、および ・ｃｏｂＥ遺伝子を含有するｐＸＬ５４５およびｐＸＬ５４５Ω、・ｃｏｂＦ、 ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬおよびｃｏｂＭ 遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ３６７およびｐＸＬ２５３、 ・ｃｏｂＨおよびｃｏｂＩ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ１１４８、・ｃｏ ｂＨ遺伝子を含有するｐＸＬ１１４９、・ｃｏｂＦ遺伝子を含有するプラスミド ｐＸＬ１４９６およびｐＸＬ１５４６、 ・ｃｏｂＡ、ｃｏｂＥおよびｃｏｂＦ〜ｃｏｂＭ遺伝子を含有するｐＸＬ５２５ 、ｃｏｂＸ、ｃｏｂＳおよびｃｏｂＴ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ８４３ 、ｃｏｂＶ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ６９９、ｃｏｂＵ遺伝子を含有す るプラスミドｐＸＬ１３２４、ｃｏｂＱおよびｃｏｂＰ遺伝子を含有するプラス ミドｐＸＬ６１８およびｐＸＬ６２３、それぞれ、ｃｏｂＰおよびｃｏｂＷ遺伝 子を含有するプラスミドｐＸＬ５９３およびｃｏｂＰ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよ びｃｏｂＯ遺伝子を含有するｐＸＬ１９０９、 から選択される請求の範囲第８項記載のプラスミド。 １１、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＤＮＡ配列または請求の範囲第 ８〜１０項のいずれかに記載のプラスミドが導入されている細胞。 １２、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチド。 １３、請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のＤＮＡ配列によりエンコードさ れた請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 １４、５′−デオキシ−５′−アデノシル（Ａｄｏ）コビリン酸ａ，ｃ−ジアミ ドヘのプレコリン−３の転化に参加する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド 。 １５、第１５図、第１６図、第４０図および第４１図に表すＣＯＢＢ、ＣＯＢＦ 、ＣＯＢＧ、ＣＯＢＨ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＫ、ＣＯＢＬ、ＣＯＢＭ、ＣＯＢＮ、 ＣＯＢＯ、ＣＯＢＳおよびＣＯＢＴペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有 する請求の範囲第１４項記載のポリペプチド。 １６、プレコリン−３とコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドとの間に存在する位置Ｃ− １、Ｃ−５、Ｃ−１１、Ｃ−１７へのメチル基の転移を触媒する請求の範囲第１ ４項記載のポリペプチド。 １７、第１６図に表すＣＯＢＦ、ＣＯＢＪおよびＣＯＢＭペプチドの配列のすべ てまたは一部分を含有する請求の範囲第１６項記載のポリペプチド。 １８、コビル酸のコビンアミドヘの転化に参加する請求の範囲第１２項記載のポ リペプチド。 １９、第１５図に表すＣＯＢＣおよびＣＯＢＤペプチドの配列のすべてまたは一 部分を含有する請求の範囲第１８項記載のポリペプチド。 ２０、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラ ーゼ（ＳＰ２ＭＴ）活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 ２１、第１６図に表すＣＯＢＩペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２０項記載のポリペプチド。 ２２、コビリン酸および／またはヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンター ゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 ２３、第１５図に表すＣＯＢＢペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２２項記載のポリペプチド。 ２４、プレコリン−８ｘムターゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペ プチド。 ２５、第１６図に表すＣＯＢＨペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２４項記載のポリペプチド。 ２６、第１５図に表すＣＯＢＥペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 ２７、ニコチネートーヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシ ルトランスフェラーゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 ２８、第４１図に表すＣＯＢＵペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２７項記載のポリペプチド。 ２９、コバラミン−５′−ホスフェートシンターゼ活性を有する請求の範囲第１ ２項記載のポリペプチド。 ３０、第４１図に表すＣＯＢＶペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第２７項記載のポリペプチド。 ３１、コビル酸シンターゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド 。 ３２、第４７図に表すＣＯＢＱペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第４７項記載のポリペプチド。 ３３、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性を有する請求の範 囲第１２項記載のポリペプチド。 ３４、第４７図に表すＣＯＢＯペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第４７項記載のポリペプチド。 ３５、プレコリン−６ｘリダクターゼ活性を有する請求の範囲第１２項記載のポ リペプチド。 ３６、第１６図に表すＣＯＢＫペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第３５項記載のポリペプチド。 ３７、コビンアミドのＧＤＰ−コビンアミドヘの転化に参加する請求の範囲第１ ２項記載のポリペプチド。 ３８、コビンアミドキナーゼおよびコビンアミドホスフェートグアニルトランス フェラーゼ活性を有する請求の範囲第３７項記載のポリペプチド。 ３９、第４７図に表すＣＯＢＰペプチドの配列のすべてまたは一部分を含有する 請求の範囲第３８項記載のポリペプチド。 ４０、第４０図に表すＣＯＢＳ、ＣＯＢＴおよびＣＯＢＸペプチドの配列のすべ てまたは一部分を含有する請求の範囲第１２項記載のポリペプチド。 ４１、第１５図、第１６図、第４０図、第４１図、第４７図および第５７図に表 わされているＣＯＢＡ、ＣＯＲＡ、ＣＯＢＢ、ＣＯＢＤ、ＣＯＢＥ、ＣＯＢＦ、 ＣＯＢＧ、ＣＯＢＨ、ＣＯＢＩ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＫ、ＣＯＢＬ、ＣＯＢＭ、Ｃ ＯＢＮ、ＣＯＢＯ、ＣＯＢＰ、ＣＯＢＱ、ＣＯＢＳ、ＣＯＢＴ、ＣＯＢＵ、ＣＯ ＢＶ、ＣＯＢＷおよびＣＯＢＸのタンパク質から選択される請求の範囲第１３項 記載のポリペプチド。 ４２、・請求の範囲第１〜８項のいずれかに記載のＤＮＡ配列、またはこのよう な配列を含有する請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載のプラスミドを宿主 細胞の中に導入し、・この組み換え細胞を前記配列の発現のための条件下に培養 し、そして・産生されたポリペプチドを回収する、 請求の範囲第１２〜４１項のいずれかに記載のポリペプチドを産生する方法。 ４３、宿主細胞が原核生物、真核生物および動物または植物の細胞から選択され る請求の範囲第４２項記載の方法。 ４４、宿主細胞は古細菌（ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）または真正細菌（ ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ）である請求の範囲第４３項記載の方法。 ４５、宿主細胞が、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス・デニトリフィカ ンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、リゾビウム・ メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）、アグロバクテリウム・ツ メファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）または ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）である請求 の範囲第４４項記載の方法。 ４６、・コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドを コードする１または２以上のＤＮＡ配列を、これらの化合物を産生するか、ある いは部分的に産生する徴生物の中に導入し、・これにより得られた微生物をコバ ラミンおよび／またはコバミドの合成および前記配列の発現のための条件下に培 養し、そして・コバラミンおよび／またはコバミドまたはそれらの前駆体を回収 する、コバラミンおよび／またはコバミドまたはそれらの前駆体の産生を増加さ せる方法。 ４７、請求の範囲第４〜７項のいずれかに記載の１または２以上のＤＮＡ配列、 または請求の範囲第８〜１０項のいずれかに記載のプラスミドを徴生物の中に導 入する請求の範囲第４６項記載の方法。 ４８、微生物の中に導入されたＤＮＡ配列が、コバラミンおよび／またはコバミ ドの生合成の制限工程を触媒するポリペプチドをコードする請求の範囲第４７項 記載の方法。 ４９、微生物の中に導入されたＤＮＡ配列が、コバラミンおよび／またはコバミ ドの生合成の制限工程を触媒するポリペプチドをコードする請求の範囲第４７項 記載の方法。 ５０、徴生物が、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆ ｉｃａｎｓ）、リゾビウム・メリロチ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）およびアグロバ クテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）から選択される 請求の範囲第４６〜４９項のいずれかに記載の方法。 ５１、徴生物がシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉ ｃａｎｓ）である請求の範囲第５０項記載の方法。 ５２、徴生物がシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉ ｃａｎｓ）ＳＣ５１０　Ｒｉｆ１である請求の範囲第５１項記載の方法。 ５３、請求の範囲第１０項記載のプラスミドを微生物の中に導入する請求の範囲 第４６〜５２項のいずれかに記載の方法。 ５４、プラスミドｐＸＬ５２５をシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄ ｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０　Ｒｉｆ１の中に導入する、請求の範囲 第４６〜５３項のいずれかに記載の方法。 ５５、産生したコバラミンおよび／またはコバミドは、・可溶化、 ・シアノ型への転化、および ・精製、 により回収する請求の範囲第４６〜５４項のいずれかに記載の方法。 ５６、コバラミンが補酵素Ｂ１２である請求の範囲第４６〜５５項のいずれかに 記載の方法。 ５７、前駆体がデコバルトコリノイドおよびコリノイドから選択される請求の範 囲第４６〜５５項のいずれかに記載の方法。
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