CN109897810A

CN109897810A - 从头合成维生素b12的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

Info

Publication number: CN109897810A
Application number: CN201711296896.2A
Authority: CN
Inventors: 张大伟; 房欢
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2019-06-18
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN109897810B

Abstract

本发明提供了一种从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。具体地，本发明以大肠杆菌为出发菌株，构建了包含HBA基因模块、HBAD基因模块、CBAD基因模块和Cbi基因模块的工程菌，所述工程菌不仅高效快速生产B₁₂(产率高出现有技术至少50倍)，甚至可以以简单化合物的原料，从头合成维生素B₁₂。

Description

从头合成维生素B12的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

背景技术

维生素B₁₂又称氰基钴胺素，是工业生产应用的一种稳定的钴胺素形式。钴胺素主要包括腺苷钴胺素(脱氧腺苷钴胺素)、甲基钴胺素、羟基钴胺素和氰基钴胺素。腺苷钴胺素的化学结构包括一个中心钴啉环、上配体(腺苷基团)和下配体(5,6-dimethylbenzimidazole，DMBI)。

限于化学合成成本极高，维生素B₁₂只能通过微生物发酵来获得。维生素B₁₂从头合成途径包括好氧途径和厌氧途径两种。目前维生素B₁₂工业生产菌株主要有脱氮假单胞菌(Pseudomonas denitrifican)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)、费氏丙酸杆菌(Propionibacterium freudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)等。

大肠杆菌可以通过补救合成途径合成维生素B₁₂，遗传背景清晰，易于遗传操作，培养方法简单，生长迅速，因此可以替代传统的菌株用于生产维生素B₁₂。关于大肠杆菌合成维生素B₁₂的研究很少。

传统维生素B₁₂生产菌株生长周期长，例如，中华苜蓿根瘤菌和脱氮假单胞菌发酵周期大约十天；培养基成分复杂，有的培养基中需添加各种维生素，增加了生产成本；有的生产菌株，例如，费氏丙酸杆菌，发酵培养时会生成大量丙酸，维生素B₁₂得率低。好氧合成途径合成维生素B₁₂中部分反应是未知的。而已报道在大肠杆菌中通过好氧合成途径合成维生素B₁₂的先例都没有通过严谨的方法对维生素B₁₂做鉴定，而是通过营养缺陷型菌株检测维生素B₁₂。这种检测方法会产生假阳性。同时，现有技术中利用大肠杆菌合成维生素B₁₂的产量都不高，不能满足工业生产的需求。因此，本领域迫切需要开发适用于工业生产的从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

发明内容

本发明的目的在于提供从头合成维生素B12的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用。

在本发明的第一方面，提供了一种用于生产维生素B₁₂或其前体的工程菌，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述的基因模块包括：

(a)HBA基因模块，所述HBA基因模块表达用于生物合成HBA的基因；

较佳地，所述的用于生物合成HBA的基因包括：cobA、cobI、cobG、cobJ、cobM、cobF、cobK、cobL、cobH。

(b)HBAD基因模块，所述HBAD基因模块表达用于以HBA为原料，生物合成HBAD的基因；

较佳地，所述的用于生物合成HBAD的基因包括：cobB基因；

(c)CBAD基因模块，所述CBAD基因模块表达用于以HBAD为原料，生物合成CBAD的基因；

较佳地，所述的用于生物合成CBAD的基因包括：cobN基因、cobS基因、cobT基因、和/或cobW基因；和

(d)Cbi基因模块，所述Cbi基因模块包含：

(i)第一基因模块，所述的第一基因模块表达用于以L-苏氨酸为原料，生物合成APP的基因，

其中，所述的用于生物合成APP的基因包括：L-苏氨酸激酶编码基因、和L-苏氨酸磷酸脱羧酶编码基因；

(ii)第二基因模块，所述的第二基因模块表达用于以CBAD为原料，生物合成腺苷钴啉胺酸(adenosylcobyric acid)；和

(iii)第三基因模块，所述的第三基因模块表达用于以腺苷钴啉胺酸和APP为原料，生物合成腺苷钴啉醇酰胺磷酸(adenosylcobinamide phosphate)的基因。

在另一优选例中，所述的生物合成腺苷钴啉胺酸的基因包括：钴(II)啉酸a，c-二酰胺还原酶编码基因、钴(I)啉酸a，c-二酰胺转腺苷酶编码基因和腺苷钴啉胺酸合酶编码基因；

在另一优选例中，所述的生物合成腺苷钴啉醇酰胺磷酸的基因包括：腺苷咕啉醇酰胺磷酸合酶编码基因。

在另一优选例中，所述的编码L-苏氨酸激酶的基因包括：pduX基因、bluE基因、或其组合；

较佳地，所述的pduX基因来源于Salmonella typhimurium菌株，所述的bluE基因来源于R.capsulatus菌株。

在另一优选例中，所述的编码L-苏氨酸磷酸脱羧酶的基因包括：cobC基因、cobD基因、或其组合；

较佳地，所述的cobC基因来源于R.capsulatus菌株和S.meliloti 320菌株，所述的cobD基因来源于Salmonella typhimurium菌株。

在另一优选例中，所述的钴(II)啉酸a，c-二酰胺还原酶编码基因包括cobR基因；较佳地所述的cobR基因来源于Brucella melitensis菌株。

在另一优选例中，所述的钴(I)啉酸a，c-二酰胺转腺苷酶编码基因包括cobO基因、btuR基因、和/或cobA基因；

较佳地所述的cobO基因来源于Brucella melitensis菌株、Sinorhizobiummeliloti菌株、或Rhodobacter capsulatus菌株，所述的btuR基因来源于大肠杆菌，所述的cobA基因来源于Salmonella typhimurium菌株。

在另一优选例中，所述的腺苷钴啉胺酸合酶编码基因包括：cobQ基因和/或cbiP基因；

较佳地所述的cobQ基因来源于Brucella melitensis菌株、Sinorhizobiummeliloti 320菌株和Rhodobacter capsulatus菌株，所述的cbiP基因来源于Salmonellatyphimurium菌株。

在另一优选例中，所述的腺苷咕啉醇酰胺磷酸合酶编码基因包括：cbiB基因和/或cobD基因；

较佳地，所述的cbiB基因来源于Salmonella typhimurium菌株，所述的cobD基因来源于Sinorhizobium meliloti 320菌株。

在另一优选例中，所述的Cbi基因模块还包括修饰pduX基因表达的his序列、和/或修饰bluE基因表达的MBP序列。

在另一优选例中，所述的his序列为SEQ ID NO.:1。

在另一优选例中，所述的MBP序列为SEQ ID NO.:2。

在另一优选例中，所述的基因模块还包括：

(e)钴吸收基因模块，所述钴吸收基因模块表达用于向胞内转运钴离子的转运蛋白的编码基因；

较佳地，所述的用于向胞内转运钴离子的转运蛋白的编码基因包括cbiMNQO操纵子，所述的cbiMNQO操纵子包括：串联表达的cbiM基因、cbiN基因、cbiQ基因和cbiO基因。

在另一优选例中，所述的钴吸收基因模块还包括cbtAB操纵子，所述的cbtAB操纵子包括：串联表达的cbtA基因和cbtB基因。

在另一优选例中，所述的基因模块还包括：

(f)尿卟啉原III基因模块，所述尿卟啉原III基因模块表达用于生物合成尿卟啉原III的基因；

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、hemB基因、hemC基因、和hemD基因。

在另一优选例中，所述的尿卟啉原III基因模块整合在基因组上，较佳地整合于阿拉伯糖诱导的启动子P_BAD位点。

在另一优选例中，当所述的基因模块含有≥2个基因时，有部分或全部基因是串联表达的。

在另一优选例中，所述的HBA基因模块中的基因为串联表达的。

在另一优选例中，所述的HBAD基因模块和CBAD基因模块串联表达。

在另一优选例中，所述的各基因模块中的各个基因受组成型或诱导型启动子的驱动。

在另一优选例中，所述的各基因模块中的各个基因受诱导型启动子的驱动。

在另一优选例中，所述的启动子选自下组：T7启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、阿拉伯糖诱导型启动子。

在另一优选例中，所述的表达模块部分或全部整合在基因组上。

在另一优选例中，所述的表达模块部分或全部位于表达载体上。

在另一优选例中，所述的载体为质粒和/或核酸片段。

在另一优选例中，所述的载体还具有抗性基因元件。

在另一优选例中，所述抗性基因选自下组：四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、氯霉素抗性基因、硫酸链霉素抗性基因、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体还具有终止子元件。

在另一优选例中，所述的载体包括pET28a、pACYCduet-1、pCDFduet-1，较佳地所述的载体pACYCduet-1和pCDFduet-1为默克Novagen常规表达质粒。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌还具有以下特征：

(t1)内源基因endA被下调或缺失；

(t2)内源的血红素合成基因的表达被下调。

在另一优选例中，所述的血红素合成基因包括：hemE基因、hemF基因、hemG基因、和/或hemH基因。

在另一优选例中，所述的大肠杆菌还含有外源的T7RNA聚合酶表达盒。

在另一优选例中，所述的T7RNA聚合酶表达盒整合在基因组上，较佳地整合于lacZ位点。

在另一优选例中，所述的cbiM基因、cbiN基因、cbiQ基因和cbiO基因各自独立地来源于：R.capslutaus菌株、Salmonella typhimurium菌株、Propionibacterium.freudenreichii subsp.Shermanii菌株、Klebsiella pneumoniae菌株、Yersinia enterocolitica菌株、Bacillus stearothermophilus菌株、Listeriamonocytogenes菌株、Clostridium acetobutylicum菌株、Clostridium perfringens菌株、Clostridium botulinum菌株、Clostridium difficile菌株、Desulfitobacteriumhalfniense菌株、Streptomyces coelicolor菌株、Propionibacterium.freudenreichiisubsp.Shermanii菌株、Chlorotium tepidum菌株、Methanosarcina acetivorans菌株、Archeoglobus fuldigus菌株、Methanococcus jannaschii菌株、Methanobacteriumthermoaut菌株、或Geobacter metallireducens菌株，较佳地来源于R.capslutaus菌株、或Salmonella typhimurium菌株。

在另一优选例中，所述的cbiMNQO操纵子整合在基因组上，较佳地整合于ldhA基因位点。

在另一优选例中，所述的cbtA基因和cbtB基因各自独立地来源于：Pseudomonasdenitrificans菌株、Mesorhizobium loti菌株、Brucella melitensis菌株、Agrobacterium tumefaciens菌株、Pseudomonas putida菌株、Pseudomonas fluorescens菌株、Pseudomonas syringae菌株、Pseudomonas aeruginosa菌株。

在另一优选例中，所述HBA基因模块表达用于以尿卟啉原III为原料，生物合成HBA的基因。

在另一优选例中，所述HBA基因模块中的各个基因来源于R.capsulatus菌株、S.meliloti 320菌株、B.melitensis菌株、Pseudomonas denitrificans菌株、或Rhodobacter sphaeroides菌株，优选地来源于R.capsulatus菌株。

在另一优选例中，所述cobB基因、cobN基因、cobS基因、cobT基因和cobW基因各自独立地来源于；R.capsulatus菌株、S.meliloti 320菌株、B.melitensis菌株、Sinorhizobium meliloti菌株、Mesorhizobium loti菌株、Bradyrhizobium japonicum菌株、Agrobacterium tumefaciens菌株、Rhodopseudomonas palustris菌株；

优选地，所述的cobN基因、cobS基因、cobT基因、cobW基因来源于B.melitensis菌株；

优选地，所述的cobB基因来源于R.capsulatus菌株。

在另一优选例中，生物合成APP的基因来源于：R.capsulatus菌株、S.meliloti320菌株、Salmonella typhimurium菌株、B.melitensis菌株、Rhodobacter aestuarii菌株、Rhodobacter maris菌株、Roseinatronobacter thiooxidans菌株、Rhodobacabarguzinensis菌株、Thioclava pacifica菌株、Thioclava indica菌株、Thioclavamarina菌株、Natronohydrobacter thiooxidans菌株、Roseibaca calidilacus菌株。

在另一优选例中，所述的工程菌用于从头合成维生素B₁₂。

在另一优选例中，所述的工程菌用于好氧合成途径合成维生素B₁₂。

在另一优选例中，所述的工程菌的产量≥10μg/g细胞干重，较佳地≥30μg/g细胞干重，更佳地≥50μg/g细胞干重。

在本发明的第二方面，提供了一种生产维生素B₁₂或其前体的方法，包括步骤：

(i)培养本发明第一方面所述的工程菌，从而获得含维生素B₁₂或其前体的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出维生素B₁₂或其前体。

在本发明的第三方面，提供了一种构建本发明第一方面所述工程菌的方法，包括步骤：

(a)构建含有HBA基因模块的载体，所述HBA基因模块表达用于生物合成HBA的基因；

(b)构建含有HBAD基因模块的载体，所述HBAD基因模块表达用于以HBA为原料，生物合成HBAD的基因；

(c)构建含有CBAD基因模块的载体，所述CBAD基因模块表达用于以HBAD为原料，生物合成CBAD的基因；

(d)构建含有Cbi基因模块的载体，所述Cbi基因模块包含：

(iii)第三基因模块，所述的第三基因模块表达用于以腺苷钴啉胺酸和APP为原料，生物合成腺苷钴啉醇酰胺磷酸(adenosylcobinamide phosphate)的基因；

(e)将步骤(a)、步骤(b)、步骤(c)和步骤(d)获得的载体分别转入大肠杆菌，获得含有所述基因模块的工程菌。

在另一优选例中，所述方法还包括步骤(f)：PCR验证步骤(e)得到的重组子的基因型；和/或

步骤(g)：发酵检测步骤(e)得到的重组子的维生素B₁₂或其前体的产量。

在本发明的第四方面，提供了一种本发明第一方面所述工程菌的用途，所述工程菌被用作发酵生产维生素B₁₂或其前体的菌株。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了HBAD重组菌LC-MS验证HBAD的结果。

图2显示了CBAD重组菌LC-MS验证CBAD的结果。

图3显示了SDS-PAGE分析PduX与BluE的表达。在pduX基因前面增加了his标签后，其表达量提高；在bluE基因前面增加了MBP标签后，其表达量也提高。

图4显示了HPLC检测L-苏氨酸-O-3-磷酸，验证PduX与BluE的功能。

图5显示了HPLC检测(R)-1-氨基-2-丙醇，验证StcobD的功能。

图6显示了验证检测(R)-1-氨基-2-丙醇，SmcobC与RccobC的功能。

图7显示了LC-MS检测FH309合成的维生素B₁₂。

图8显示了LC-MS检测FH312合成的维生素B₁₂。

图9显示了FH309与FH312摇瓶发酵的生长情况与维生素B₁₂的产量。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，以大肠杆菌为出发菌株，通过对外源基因及其组合的大量筛选和测试，首次开发了能够极其高效地生产B₁₂的工程菌，所述工程菌不仅高效快速生产B₁₂(产率高出现有技术至少50倍)，甚至可以以简单化合物的原料，从头合成维生素B₁₂。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明的大肠杆菌重组菌可以在普通的培养基中培养，生长周期大约一天，能够得到维生素B₁₂。将发酵液中的腺苷钴胺素做氰基化处理后，通过LC-MS鉴定产物是维生素B₁₂。

术语

本发明中涉及的部分缩写的含义如下：

HBA：氢咕啉酸a,c-二酰胺(Hydrogenobyrinic acid)；HBAD：氢咕啉酸a,c-二酰胺(Hydrogenobyrinic acid a,c-diamide)；CBAD：钴(II)啉酸a,c-二酰胺(Cob(II)yrinicacid a,c-diamide)；LC-MS：liquid chromatography-mass spectrometry；AP：(R)-1-氨基-2-丙醇((R)-1-Amino-2-propanol)；APP：(R)-1-氨基-2-丙醇O-磷酸((R)-1-Amino-2-propanol O-2-Phosphate)

本发明涉及的基因如下表所示：

本发明的主要实验流程如下：

(a)构建pET28-HBA质粒。将所述质粒转化大肠杆菌MG1655(DE3)得到诱导型的HBA合成重组菌FH001，验证可以合成HBA。

(b)构建pCDF-RccobB质粒。将所述质粒转化FH001得到HBAD生产菌株FH109，验证可以合成HBAD。

(c)构建HBAD基因模块与CBAD基因模块表达质粒pCDF-RccobB-BmcobN-BmcobS-BmcobT质粒和钴吸收基因模块表达质粒p15ASI-cbiMNQO质粒。将pET28-HBA质粒与pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT质粒共同转化到大肠杆菌MG1655(DE3)得到FH139。将p15ASI-cbiMNQO质粒转化到FH139得到CBAD合成菌株FH164，验证可以合成CBAD。

(d)将大肠杆菌MG1655(DE3)的gldA基因敲除得到FH291，将这个菌作为出发菌验证外源的(R)-1-氨基-2-丙醇O-2-磷酸合成途径。将pACYCduet-1、pACYC-his-pduX、pACYC-his-pduX-StcobD、pACYC-MBP-bluE、pACYC-MBP-bluE-SmcobC、pACYC-MBP-bluE-RccobC质粒分别转化FH291得到FH292、FH296、FH297、FH298、FH299、FH300。验证pduX、StcobD、bluE、SmcobC、RccobC的功能。

(e)构建Cbi基因模块表达质粒pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-his-pduX-StcobD-cbiB、pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-MBP-SbluE-SmcobC-cbiB质粒。将pET28-HBA-antihemFG(来源于专利“合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用”)、pCDF-RccobBBMcobNSTW(来源于专利“合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用”)和pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-his-pduX-StcobD-cbiB质粒共同转化FH236得到从头合成维生素B₁₂的FH309菌株；将pET28-HBA-antihemFG、pCDF-RccobBBMcobNSTW和pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-MBP-SbluE-SmcobC-cbiB质粒共同转化FH236得到另一个从头合成维生素B₁₂的FH312菌株。TYG培养基发酵验证FH309、FH312可以合成维生素B₁₂。

具体地，HBAD基因模块应用于大肠杆菌合成HBAD。APP合成途径基因即L-苏氨酸激酶编码基因与L-苏氨酸磷酸脱羧酶编码基因应用于大肠杆菌合成维生素B₁₂及其前体。Cbi基因模块应用于大肠杆菌合成维生素B₁₂。FH309、FH312的应用。重组菌的发酵培养方法。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明在大肠杆菌中表达bluE与cobC基因(优选地来源于R.capsulatusSB1003)，证明好氧合成途径具有与厌氧合成途径相同的合成APP的途径，都是通过(R)-1-氨基-2-丙醇O-磷酸结合到腺苷钴啉胺酸上生成腺苷咕啉醇酰胺磷酸。

(b)本发明在大肠杆菌中实现CBAD的合成，揭示了钴螯合反应需要钴吸收转运蛋白的机理。

(c)现有技术中大肠杆菌合成维生素B₁₂的产量只有0.65±0.03μg/g细胞干重，而脱氮假单胞菌合成维生素B₁₂的产量也只有2.75±0.22μg/g细胞干重。本发明最终得到的从头合成维生素B₁₂的大肠杆菌重组菌可以在普通的培养基中培养，生长周期大约一天，FH309、FH312得到维生素B₁₂含量分别为89.44μg/g细胞干重、62.28μg/g细胞干重。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用材料和方法

材料：在实施例中，所有质粒和菌株均为常规的或可市售获得，除非特别说明。具体地，实施例中的出发菌株为大肠杆菌，其中一例是Escherichia coli MG1655，该菌株的基因组上整合表达噬菌体来源的T7RNA聚合酶，命名MG1655(DE3)。

Red重组方法敲除大肠杆菌基因见文献YU DG et al.，2000，Proceedings of theNational Academy of Sciences，97(11)：5978-5983；Golden Gate连接方法见文献EnglerC et al.，2008，PLoS ONE，3(11)：e3647；Gibson assembly方法见文献Gibson DG et al.，2009，Nature Methods，6(5):343-345；CRISPR/Cas9方法敲除大肠杆菌基因见文献Zhao Det al.，2016，Microbial Cell Factories，15:205。

实施例1

构建氢咕啉酸(Hydrogenobyrinic acid，HBA)合成重组菌

利用Red重组方法将噬菌体来源的T7RNA聚合酶整合到E.coli MG1655的lacZ位点，菌株命名MG1655(DE3)。

pET3a-AIGJMFKLH质粒上合成HBA的操纵子由组成型T7启动子控制，为了实现诱导合成HBA的目的，将pET3a-AIGJMFKLH质粒用Xba I和BamH I酶切后，把长度约8.1K的cobAIGJMFKLH片段胶回收，插入到pET28a质粒Xba I和BamH I酶切位点，得到pET28-HBA质粒。将该质粒转化大肠杆菌MG1655(DE3)得到HBA合成重组菌FH001。

实施例2

构建氢咕啉酸a,c-二酰胺(Hydrogenobyrinic acid a,c-diamide，HBAD)合成重组菌

pCDF-RccobB质粒构建：以pCDFDuet-1质粒为模板，扩增pCDFDuet-1骨架。以R.capsulatus SB1003基因组为模板，扩增RCcobB片段，与pCDFDuet-1骨架通过GoldenGate连接得到质粒pCDF-RccobB。将pCDF-RccobB质粒转化FH001得到HBAD生产菌株FH109。

实施例3

构建钴(Ⅱ)啉酸a,c-二酰胺(Cob(Ⅱ)yrinic acid a,c-diamide，CBAD)合成重组菌

pCDF-RccobB-BmcobN-BmcobS-BmcobT质粒的构建：以B.melitensis 16M基因组作模板，用BMcobS-F-Gibson、BMcobS-R-Gibson引物扩增BmcobS-Gibson片段，用BMcobT-F-Gibson、BMcobT-R-Gibson引物扩增BmcobT-Gibson片段。以pACYCDuet-1质粒作模板，用PACYC-F-Gibson、PACYC-R-Gibson引物扩增得到PACYC-Gibson片段作为质粒骨架，与BmcobS-Gibson片段通过Gibson assembly得到pACYC-BmcobS质粒。以pACYC-BmcobS质粒作模板，用pCDF-RccobB-Gibson-F、pCDF-RccobB-Gibson-R引物扩增得到质粒骨架，与BmcobT-Gibson片段片段通过Gibson assembly得到pACYC-BmcobS-BmcobT质粒。然后以pACYC-BmcobS-BmcobT质粒作模板，用T7-cobST-F、T7-cobST-R扩增得到BmcobS-BMcobT表达盒。

pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT质粒的构建：将BmcobN基因片段通过Gibson assembly克隆到pET14b质粒上得到pET14-BmcobN质粒。以pET14-BmcobN质粒作模板，分别用CobN-his-F、BMcobN-R-Gibson引物扩增得到BmcobN-his片段。以pCDF-RCcobB质粒作模板，用PCDF-RccobB-F1-Gibson、PCDF-RccobB-R1-Gibson引物扩增质粒骨架，通过Gibson assembly插入BmcobN-his片段，新质粒命名pCDF-RccobB-BmcobN-his,然后插入BmcobS-BmcobT表达盒、得到pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT质粒。

p15ASI质粒构建：为了构建一个诱导型的表达质粒，在金唯智生物科技有限公司合成一段序列SI，克隆到puc57上，质粒命名puc57-SI。SI包括相向的tac启动子、lacUV5启动子和中间的双向终止子。以puc57-SI作模板，用SI-F和SI-R引物扩增带有接头的SI片段，用于Gibson assembly。以pACYCDuet-1质粒作模板，用pACYC-SI-F和pACYC-SI-R引物扩增质粒骨架，与带有接头的SI片段通过Gibson assembly连接成新的表达质粒p15ASI。

p15ASI-cbiMNQO质粒构建：以p15ASI质粒为模板，用P15ASI-RCcbiMNQO-F-Gibson、P15ASI-RCcbiMNQO-R-Gibson引物扩增p15ASI质粒骨架；以R.capslutaus SB1003基因组为模板,用RCcbiMNQO-pl5ASI-F-Gibson、RCcbiMNQO-pl5ASI-R-Gibson引物扩增cbiMNQO操纵子片段，与p15ASI质粒骨架通过Gibson assembly连接得到p15ASI-cbiMNQO质粒。

将pET28-HBA质粒、pCDF-RccobB-BmcobN-his-BmcobS-BmcobT质粒共转化到大肠杆菌MG1655(DE3)得到FH139。将p15ASI-cbiMNQO质粒转化到FH139得到CBAD合成菌株FH164。

所用引物如下：

引物	序列	序列编号
			SI-F	atgcgactcctgcattaggTTGACAATTAATCATCGGCTC	SEQ ID NO.:3
SI-R	tcaaatgcctgaggtttcagCCCCAGGCtttacactttatg	SEQ ID NO.:4
			pACYC-SI-F	ataaagtgtaaaGCCTGGGGctgaaacctcaggcatttgag	SEQ ID NO.:5
pACYC-SI-R	AGCCGATGATTAATTGTCAAcctaatgcaggagtcgcataag	SEQ ID NO.:6
			BMcobN-R-Gibson	GATATCCAATTGAGATCTGCTCAGCCATTTATCGCCCTTTC	SEQ ID NO.:7
BMcobS-F-Gibson	TAATAAGGAGATATACCATGAACAAGGTTGAGCGGG	SEQ ID NO.:8
			BMcobS-R-Gibson	GCCGTGTACAATACGATTACTCAGGCGAGAACGATATTGG	SEQ ID NO.:9
BMcobT-F-Gibson	AAGAAGGAGATATACATATGTCAGGAATAGGCGATAATTC	SEQ ID NO.:10
			BMcobT-R-Gibson	GATATCCAATTGAGATCTGCctatcttcgaccggcacg	SEQ ID NO.:11
PACYC-F-Gibson	CATGGTATATCTCCTTATTAAAGT	SEQ ID NO.:12
			PACYC-R-Gibson	GTAATCGTATTGTACACG	SEQ ID NO.:13
T7-cobST-F	CGGGATCCTGCGACTCCTGCATTAGG	SEQ ID NO.:14
			T7-cobST-R	AGACTCGAGGGTACCGAC	SEQ ID NO.:15
CobN-his-F	AAGAAGGAGATATACATATGGGCAGCAGCCATCATC	SEQ ID NO.:16
			PCDF-RccobB-F1-Gibson	CATATGTATATCTCCTTCTTATACTTAACTAATATACTAAGATGG	SEQ ID NO.:17
PCDF-RccobB-R1-Gibson	GCAGATCTCAATTGGATATCGGC	SEQ ID NO.:18
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RCcbiMNQO-pl5ASI-R-GBS	CTAACGCCGGGTCCAGCC	SEQ ID NO.:22

实施例4

大肠杆菌合成HBAD与CBAD

1、重组菌的发酵：

从平板上挑取单菌落，在试管中过夜培养。按5％接种量接种到含有(CBAD合成重组菌的发酵时添加20mg/L CoCl₂·6H₂O)600mL 2YT培养基的3L三角瓶中，在37℃，200r·min^-1条件下培养，在OD600达到大约0.6的时候添加IPTG至终浓度0.4mM，然后温度更换为28℃培养大约24h。

2、HBAD与CBAD的分离纯化

DEAE-Sephadex A-25用于钴啉化合物(腺苷钴胺素及其合成途径的中间产物)的分离与纯化，填料首先要经过预处理。称取5g DEAE-Sephadex A-25填料，悬浮到500mL蒸馏水中，1小时后倾去上层细粒。按每g填料加0.5M NaOH 15mL的比例，将A-25浸泡于0.5MNaOH中，搅匀，静置30分钟，装入布氏漏斗(垫有2层滤纸)中抽滤，并反复用蒸馏水抽洗至pH呈中性；再以0.5M HCl同上操作过程处理，最后以0.5M NaOH再处理一次。处理完后，将A-25浸泡于离子交换层析buffer A(20mM Tris-HCl，pH7.4，100mM NaCl)中。

将发酵液在大容量冷冻离心机中5500r·min^-1离心15min，弃上清。收集的细胞重悬到离子交换层析buffer A涡旋震荡均匀。菌体经1200pa高压破碎两次，10000r·min^-1离心1h，上清过滤后转移到500mL三角瓶中。为了提高钴啉化合物的分离与纯化效果，采用静态吸附与动态吸附相结合的离子交换层析方法处理样品。首先向三角瓶中的上清添加DEAEsephadex A25凝胶，在16℃摇床中震荡1h，转速100r·min^-1。然后上清液上玻璃层析柱，待上清液流完后，加入5-10倍柱体积的离子交换层析buffer B(20mM Tris-HCl，pH 7.4，300mM NaCl)洗涤杂质，最后再用5倍柱体积的离子交换层析buffer C(20mM Tris-HCl，pH7.4，2M NaCl)洗脱。得到的钴啉化合物如有必要，再经过离心浓缩。样品用0.22μm滤膜过滤后保存到-20℃冰箱。

3、HBAD与CBAD的鉴定

HBAD、CBAD的鉴定通过LC-MS完成，具体方法如下：

分析在安装有Agilent TC C18柱(4.6×250mm)的Agilent 1200/BrukermicrOTOF-Q II设备上进行。进样量25μL。检测波长为329nm。A相为含0.1％甲酸的水，B相为含0.1％甲酸的甲醇。色谱柱温度控制在30℃，流速0.7mL/min，梯度洗脱条件如下：0-5min，维持25％B；5-15min，34％B；15-19min，100％B；19-24min，100％B；24-25min，25％B；25-35min，25％B。

质谱采用阳离模式，参数设置为：喷雾电压，4500V；喷雾压力，1.0Bar；离子源，电喷射离子化(electrospray ionization，ESI)；雾化气流速，6.0L/min；雾化气温度，180℃。扫描范围为400-2000(m/z)。

4、LC-MS鉴定结果

如图1所示，FH109胞内能检测到HBAD，其中还能检测到只有一个羧基发生氨基化的中间产物，[M+H]⁺约为880.438。这充分说明RccobB基因在胞内已经能正常发挥功能，HBAD基因模块可以用于下游菌株构建。

为了验证CBAD基因模块与钴吸收基因模块的功能，将FH139与FH164在添加20mg/LCoCl₂ 6H₂O的2YT培养基中发酵后的胞内产物经LC-MS鉴定。如图2所示，其中FH164有CBAD的生成，而FH139没有检测到CBAD的生成(图省略)，说明钴吸收转运蛋白是维生素B₁₂好氧合成途径中钴螯合反应所必须的组份。

实施例5

构建APP合成重组菌

由于APP不稳定，而且没有标准品出售，为了验证合成得到的APP，可以将其去磷酸化转化为(R)-1-氨基-2-丙醇来检测。大肠杆菌的PhoA是一种细胞周质中存在的碱性磷酸酶，它的底物专一性不强，能催化多种底物，如D-甘露醇1-磷酸、D-山梨醇6-磷酸、D-葡萄糖6-磷酸水解磷酸单酯，因而也有可能催化APP去磷酸化转化为AP。首先构建以下质粒：

pACYC-pduX和pACYC-bluE质粒的构建：分别扩增pduX和密码子优化后的bluE基因片段，分别与pACYCDuet-1骨架通过Gibson assembly得到pACYC-pduX和pACYC-bluE质粒。

pACYC-his-pduX和pACYC-MBP-bluE质粒的构建:分别以pACYC-pduX质粒为模板，用PACYC-his-pduX-F和PACYC-his-R引物通过定点突变方法在pduX基因前面增加一段序列，以提高PduX的表达。以pACYC-bluE质粒为模板，用PACYC-MBP-bluE-F和PACYC-MBP-R引物通过定点突变方法在bluE基因前面增加一段序列，以提高BluE的表达。

pACYC-his-pduX-STcobD、pACYC-MBP-bluE-SmcobC和pACYC-MBP-bluE-RccobC质粒的构建：以S.typhimurium LT2基因组为模板，用引物STcobD-pACYC-pduX-F-gibson和STcobD-pACYC-pduX-R-gibson扩增pduX基因片段后通过Gibson assembly插入到pACYC-his-pduX质粒的NdeI酶切位点。同理在pACYC-MBP-bluE质粒的NdeI酶切位点插入S.meliloti 320的cobC基因(SmcobC)和R.capsulatus的cobC基因(RccobC)后得到pACYC-MBP-bluE-SmcobC和pACYC-MBP-bluE-RccobC质粒。

如图3，SDS-PAGE分析，其中pACYC-his-pduX相比pACYC-pduX质粒，PduX表达量明显提高。pACYC-MBP-bluE质粒相比pACYC-bluE质粒，BluE表达量明显提高。所用引物如下：

大肠杆菌具有内源的(R)-1-氨基-2-丙醇合成途径，gldA编码的甘油脱氢酶能将氨基丙酮催化为(R)-1-氨基-2-丙醇。为了避免大肠杆菌内源的(R)-1-氨基-2-丙醇对外源途径合成的(R)-1-氨基-2-丙醇O-2-磷酸的检测造成干扰，首先将大肠杆菌MG1655(DE3)的gldA基因通过CRISPR/Cas9方法敲除(敲除方法参考Zhao D et al.，2016，Microbial CellFactories,15:205)，得到FH291，将这个菌作为出发菌验证外源的(R)-1-氨基-2-丙醇O-2-磷酸合成途径。将pACYCduet-1、pACYC-his-pduX、pACYC-his-pduX-StcobD、pACYC-MBP-bluE、pACYC-MBP-bluE-SmcobC、pACYC-MBP-bluE-RccobC质粒分别转化FH291得到FH292、FH296、FH297、FH298、FH299、FH300。

本部分所用菌株和质粒如下：

实施例6

L-苏氨酸和APP合成菌株发酵与产物检测

1、L-苏氨酸和APP合成菌株发酵方法：

从平板上挑取单菌落，在试管中过夜培养。取一定量菌液在10000r·min^-1离心，弃上清，用无菌的PBS清洗两遍。按初始OD600为0.1的接种量接种到含有30mL添加0.05％酵母抽提物的M9培养基的50mL三角瓶中，置于37℃，200r·min^-1的摇床中培养，在OD600达到大约0.6的时候添加IPTG至终浓度0.4mM，并添加1g/L L-苏氨酸,然后温度更换为28℃培养24h。

2、L-苏氨酸、L-苏氨酸-O-3-磷酸和(R)-1-氨基-2-丙醇的检测：

发酵样品经过14,000r·min^-1离心2min，取上清用0.22μm水相针式滤器过滤后加入样品瓶中，样品中氨基酸通过OPA柱前衍生化后通过HPLC检测分析。检测在Agilent 1260设备上进行。色谱柱为Agilent Zorbax Eclipse氨基酸分析(AAA)柱(150x 4.6mm,5μm)，进样量35.5μL，流速2mL/min，检测波长338nm。流动相有A、B相。A相：NaH₂PO4.2H₂O(称取12.436g NaH₂PO4·2H₂O于2L ddH₂O中，用NaOH调pH至7.8)。B相：甲醇：乙腈：水的体积比例为45:45:10。梯度洗脱条件如下：

0-1.9min，0％B；1.9-18.1min，57％B；18.1-18.6min，100％B；18.6-22.3min，维持100％B；22.3-23.2min，0％B；23.2-25min，维持0％B。

3、检测结果

将含有pACYCduet-1的对照菌与含有双顺反子质粒的重组菌在添加0.05％酵母抽提物的M9培养基中发酵并诱导24h后。取发酵液上清通过HPLC检测发现：如图4所示，对照菌FH292没有检测到L-苏氨酸磷酸，而表达PduX的重组菌FH296能够检测到L-苏氨酸磷酸，表达BluE的重组菌FH298也能够检测到L-苏氨酸磷酸。这充分证明了BluE与PduX功能相同，也是一种L-苏氨酸激酶。

如图5所示，HPLC检测发现FH297能合成(R)-1-氨基-2-丙醇。同时FH297在5.8min出现一个新峰，推测可能是(R)-1-氨基-2-丙醇O-2-磷酸。大肠杆菌的PhoA不能将(R)-1-氨基-2-丙醇O-2-磷酸完全转化为(R)-1-氨基-2-丙醇，因而能够通过HPLC反映出来。这充分说明S.typhimurium的CobD、S.meliloti 320与R.capsulatus来源的CobC都能在大肠杆菌中发挥L-苏氨酸磷酸脱羧酶的功能。也说明说明好氧与厌氧合成维生素B₁₂的途径都具有相同的APP合成途径。

实施例7

构建从头合成维生素B₁₂合成重组菌

为了构建表达Cbi基因模块的质粒，做以下操作：

pACYC-BmcobR质粒的构建：pACYCduet-1和BmcobR通过Gibson assembly连接将BmcobR插入多克隆位点2，得到pACYC-BmcobR质粒。

pACYC-BmcobR-StcobAcbiP质粒的构建：以S.typhimurium LT2基因组为模板，用StcobA-F、StcobA-R引物扩增cobA基因(StcobA)，用cbiP-F、cbiP-R引物扩增cbiP基因片段。用StcobA-F-Gibson、cbiP-R-Gibson引物将二者通过SOE-PCR得到的片段与pACYC-BmcobR质粒骨架通过Gibson assembly得到pACYC-BmcobR-StcobAcbiP质粒。以S.typhimurium LT2基因组为模板，用cbiP-F-BamH I和cbiP-R-HindIII引物扩增cbiP基因片段后插入pACYC-BmcobR-BtuR质粒的BamH I、HindIII酶切位点得到pACYC-BmcobR-StcobAcbiP质粒。

pACYC-cbiB质粒的构建：以pACYCduet-1质粒为模板，用PACYC-cbiB-F-Gibson、PACYC-cbiB-R-Gibson引物扩增pACYCduet-1质粒骨架。以S.typhimurium LT2基因组为模板，用cbiB-F-Gibson、cbiB-R-Gibson引物扩增cbiB片段，与pACYCduet-1质粒骨架通过Gibson assembly得到pACYC-cbiB质粒。

pACYC-his-pduX-STcobD-cbiB、pACYC-MBP-SbluE-SmcobC-cbiB质粒的构建：以pACYC-cbiB质粒为模板，用pACYC-cbiB-KPNI-F-Gibson、pACYC-cbiB-KPNI-R-Gibson引物扩增cbiB基因表达盒，分别通过Gibson assembly插入到pACYC-his-pduX-STcobD、pACYC-MBP-SbluE-SmcobC和pACYC-MBP-SbluE-RccobC质粒的KpnI酶切位点，得到pACYC-his-pduX-STcobD-cbiB、pACYC-MBP-SbluE-SmcobC-cbiB质粒。

Cbi模块质粒的构建：

以pACYC-his-pduX-StcobD-cbiB、pACYC-MBP-bluE-SmcobC-cbiB质粒为模板，用T7-ECD-F、T7-ECD-R引物扩增his-pduX-StcobD-cbiB、MBP-bluE-SmcobC-cbiB表达盒。

将扩增下来的his-pduX-StcobD-cbiB、MBP-SbluE-SmcobC-cbiB表达盒插入pACYC-BmcobR-StcobAcbiP质粒的KpnI酶切位点，得到pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-his-pduX-StcobD-cbiB、pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-MBP-SbluE-SmcobC-cbiB质粒。

本部分所用引物如下：

选择一个经过优化的高产CBAD的重组菌FH236作为底盘细胞来合成维生素B₁₂。FH236特征在于：在lacZ位点插入λ噬菌体T7RNA聚合酶编码基因，ldhA位点插入P_Tac-RccbiMNQO表达盒，endA缺失，阿拉伯糖诱导的启动子P_BAD位点插入P_Tac-RphemOBCD表达盒。接下来在这个底盘细胞中共同表达HBA基因模块、HBAD基因模块、CBAD基因模块与Cbi模块，即得到维生素B₁₂合成重组菌。

将pET28-HBA-antihemFG(来源于专利“合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用”)、pCDF-RccobBBMcobNSTW(来源于专利“合成钴(II)啉酸a，c-二酰胺的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用”)和pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-his-pduX-StcobD-cbiB质粒共同转化FH236得到FH309菌株；将pET28-HBA-antihemFG、pCDF-RccobBBMcobNSTW和pACYC-BmcobR-StcobAcbiP-MBP-SbluE-SmcobC-cbiB质粒共同转化FH236得到FH312菌株。

实施例8

维生素B₁₂合成重组菌的发酵

1、维生素B₁₂合成重组菌发酵

从平板上挑取单菌落，在试管中过夜培养。按1％接种量接种到含有50mL LB培养基的250mL三角瓶中，置于37℃，200r·min^-1的摇床中培养。取一定量菌液在10000r·min^-1离心2min，弃上清，用无菌的PBS清洗两遍。按初始OD600为0.15的接种量接种到含有600mLCM培养基的3L三角瓶中，置于37℃，200r·min^-1的摇床中培养。在OD600达到大约0.8的时候添加IPTG至终浓度0.4mM，并添加50mg/L L-苏氨酸,然后温度更换为28℃培养。

CM培养基：5g/L yeast extract、10g/L tryptone、5g/L KH2PO4、2g/L-10g/Lglucose、2g/L glycine、10g/L succinic acid、15g/L甜菜碱，20mg/L六水合氯化钴，90mg/L DMBI，用NaOH调节初始pH6.8。

2、维生素B₁₂的检测

取30mL发酵液在10000r·min^-1离心2min，弃上清，用去离子水定容到1mL，加入1滴1％氰化钠溶液，在100℃水中煮30min。在14000r·min^-1离心2min，上清用0.22μm水相针式滤器过滤后做LC-MS分析。

HPLC在安捷伦1260上进行，色谱柱为Agilent TC C18柱(4.6×250mm)，进样量25μL，检测波长为361nm。A相为含0.1％甲酸的水，B相为含0.1％甲酸的甲醇。色谱柱温度控制在35℃，流速0.8mL/min，按照30％B，持续15min。同时样品经过Bruker micrOTOF-Q II设备进行质谱分析。条件如下：质谱采用阳离模式，参数设置为：喷针电压，4500V；喷雾压力，1.0Bar；离子源，电喷射离子化(electrospray ionization，ESI)；干气速率，6.0L/min；干气温度，300℃。扫描范围为400-2000(m/z)。

3、维生素B₁₂的定量

取30mL发酵液在10000r·min^-1离心2min，弃上清，用去离子水定容到1mL，加入100μL 8％亚硝酸钠和100μL冰醋酸，混匀后，在100℃水中煮30min。在14000r·min^-1离心2min，上清用0.22μm水相针式滤器过滤后做HPLC分析。HPLC方法同实施例8中维生素B₁₂的检测方法相同。

4、发酵结果

结果显示：如图9所示，两个菌的生长情况相近，都是在21h达到最大生物量。FH309最大OD₆₀₀为6.41，FH312最大OD₆₀₀为6.74。FH309的维生素B₁₂产量在21h达到最高值89.44μg/g细胞干重。FH312的维生素B₁₂产量在18h达到最高值62.28μg/g细胞干重。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 从头合成维生素B12的大肠杆菌重组菌及其构建方法与应用

<130> P2017-2123

<160> 46

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

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<212> DNA

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ataaagtgta aagcctgggg ctgaaacctc aggcatttga g 41

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cgggctggac ccggcgttag ctgcaggaat tcggatcc 38

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<210> 36

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

cggagctcga attcggatcc tcataccggc tcctgatg 38

<210> 37

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 37

cgggatccag gaggtataat taatgacgca ggcagttatg ttg 43

<210> 38

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 38

cccaagcttt cataccggct cctgatg 27

<210> 39

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 39

aaggtaaact ggtaatcaag gagattaact gatgacgatt cttgcctggt gtatcg 56

<210> 40

<211> 56

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 40

tgattaccag tttaccttct tcgattttca tggtatatct ccttattaaa gttaaa 56

<210> 41

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 41

tcatcatcat cataaggaga ttaactgatg acgattcttg cctggtgtat cg 52

<210> 42

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 42

tccttatgat gatgatgatg gtgcatggta tatctcctta ttaaagttaa ac 52

<210> 43

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 43

gcgatcgctg acgtcggtac gccattcgat ggtgtccg 38

<210> 44

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 44

tctttaccag actcgagggt ac 22

<210> 45

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 45

gcgatcgctg acgtcggtac ggatctcgac gctctccct 39

<210> 46

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 46

tttctttacc agactcgagg gtactcaggc cacgccagat aac 43

Claims

1.一种用于生产维生素B₁₂或其前体的工程菌，其特征在于，所述工程菌为大肠杆菌，并且所述工程菌含有外源的基因模块(gene module)，所述的基因模块包括：

较佳地，所述的用于生物合成HBA的基因包括：cobA、cobI、cobG、cobJ、cobM、cobF、cobK、cobL、cobH；

较佳地，所述的用于生物合成HBAD的基因包括：cobB基因；

(d)Cbi基因模块，所述Cbi基因模块包含：

2.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的生物合成腺苷钴啉胺酸的基因包括：钴(II)啉酸a，c-二酰胺还原酶编码基因、钴(I)啉酸a，c-二酰胺转腺苷酶编码基因和腺苷钴啉胺酸合酶编码基因。

3.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的生物合成腺苷钴啉醇酰胺磷酸的基因包括：腺苷咕啉醇酰胺磷酸合酶编码基因。

4.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的编码L-苏氨酸激酶的基因包括：pduX基因、bluE基因、或其组合；

5.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的编码L-苏氨酸磷酸脱羧酶的基因包括：cobC基因、cobD基因、或其组合；

6.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的基因模块还包括：

较佳地，所述的用于向胞内转运钴离子的转运蛋白的编码基因包括cbiMNQO操纵子，所述的cbiMNQO操纵子包括：串联表达的cbiM基因、cbiN基因、cbiQ基因和cbiO基因；

更佳地，所述的钴吸收基因模块整合在基因组上，较佳地整合于ldhA基因位点。

7.如权利要求1所述的工程菌，其特征在于，所述的基因模块还包括：

较佳地，所述的用于生物合成尿卟啉原III的基因包括：hemA或hemO基因、hemB基因、hemC基因、和hemD基因；

更佳地，所述的尿卟啉原III基因模块整合在基因组上，较佳地整合于阿拉伯糖诱导的启动子P_BAD位点。

8.一种生产维生素B₁₂或其前体的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)培养权利要求1所述的工程菌，从而获得含维生素B₁₂或其前体的发酵产物；和

(ii)从所述发酵产物中分离出维生素B₁₂或其前体。

9.一种构建权利要求1所述工程菌的方法，其特征在于，包括步骤：

(d)构建含有Cbi基因模块的载体，所述Cbi基因模块包含：

10.一种权利要求1所述工程菌的用途，其特征在于，所述工程菌被用作发酵生产维生素B₁₂或其前体的菌株。