TW202407101A - 低内毒素含量的羅氏真養菌及其應用 - Google Patents

低内毒素含量的羅氏真養菌及其應用 Download PDF

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Abstract

本發明涉及微生物技術領域，具體涉及低內毒素含量的羅氏真養菌及其應用。本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量中的應用。本發明發現羅氏真養菌H16_A0228、H16_B0917蛋白的失活能夠明顯降低羅氏真養菌的內毒素含量。H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白功能缺失的工程化羅氏真養菌不僅內毒素含量顯著降低，同時其細胞乾重和PHA產量顯著提高，為PHA的工程化菌株的開發提供了新的基因和菌株資源，為降低PHA的內毒素含量提供了有效方法，對於拓展PHA在醫療材料中的應用具有重要意義。

Description

低內毒素含量的羅氏真養菌及其應用
本發明涉及微生物技術領域，具體涉及低內毒素含量的羅氏真養菌及其應用。
內毒素是多數革蘭氏陰性菌細胞外膜的一種成分，細胞外膜是一種不對稱的脂質雙層，主要由作為內層的磷脂和作為外層的脂多糖組成。脂多糖則由疏水性的脂質A（Lipid A）、親水性的非特異性核心多糖（Core polysaccharides）和長鏈的O抗原多糖（O-antigen）組成，核心多糖含有一個外己糖區域和一個內庚糖區域，分別與特異性多糖和脂質A相連，長鏈的O抗原多糖賦予菌株一種特異性表面抗原，由重複的寡糖亞基組成，脂質A則是引起內毒素毒性的關鍵成分。已有文獻報導脂質A缺陷對大多數其他革蘭氏陰性細菌是致命的（Clementz, T. Inhibition of lipopolysaccharide biosynthesis and cell growth following inactivation of the kdtA gene in Escherichia coli.[J]. Journal of Biological Chemistry, 1995, 270(46):27646.）。
聚羥基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoates，PHA）是一類由微生物合成的高分子聚合物，具有多元材料學性能，在醫療、農業、環保、化工等領域都得到了廣泛的應用，尤其在醫療材料領域，由於其具備優異的材料性能，被認為是一種具有廣闊應用前景的材料。然而生物合成的PHA不能直接和人體接觸，必須除去熱原成分（如內毒素）才是能達到醫用級的PHA 材料。
羅氏真養菌（Ralstonia eutropha，又名Cupriavidus necator），是革蘭氏陰性菌中的一種，也是可用於合成PHA的菌株之一。然而PHA材料中殘留的內毒素（endotoxin）極大地限制了PHA在醫療材料中的應用，因此純化後的PHA需要最大限度的降低內毒素的含量。目前尚未發現對羅氏真養菌進行基因改造以降低其內毒素含量的報導。
本發明的目的之一是提供在羅氏真養菌中降低內毒素的含量的方法。本發明的另一目的是提供一種降低內毒素含量的工程化羅氏真養菌。
本發明以羅氏真養菌為研究對象，開發通過基因工程改造降低其內毒素含量的方法。在研發過程中，本發明發現，羅氏真養菌的脂質A的分子量、脂肪酸鏈結構等化學結構與大腸桿菌等其他革蘭氏陰性菌存在較大差異，例如：羅氏真養菌的脂質A多出一個4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖，而且羅氏真養菌的脂肪酸鏈的一級醯基鏈為C14，且同時在2和2’位置各產生一條二級醯基鏈，二級醯基鏈也均為C14（大腸桿菌的一級醯基鏈為C14，二級醯基鏈中有一條是C12）。而目前發現的革蘭氏陰性菌脂質A的脂肪酸鏈的合成酶普遍具有底物特異性，不同長度脂肪酸鏈的合成由不同的酶催化（例如月桂醯轉移酶催化C12脂肪酸鏈的合成，豆蔻醯轉移酶催化C14脂肪酸鏈的合成）。由此推知羅氏真養菌中參與脂質A及其脂肪酸鏈的合成的酶及其合成、調控機制可能與大腸桿菌等其他革蘭氏陽性菌明顯不同，但目前尚未見關於羅氏真養菌中脂質A及其脂肪酸鏈的合成途徑和相關酶的報導。
此外，本發明在研發過程中曾嘗試在羅氏真養菌利用習知技術公開的降低大腸桿菌、百日咳桿菌等革蘭氏陰性菌的內毒素毒性或含量的方法，例如：敲除用於調控脂肪酸鏈轉移到脂質A的碳骨架上msbB和pagP基因同時過表達Francisella tularensis來源的內膜磷酸酶lpxEft以改變脂質A的結構，以及，表達來自銅綠假單胞菌來源的醯基轉移酶LpxDpa、LpxApa以使得不同位置醯基鏈長度改變，但是，上述方法均無法在羅氏真養菌中實現降低內毒素含量的目的，進一步證明了羅氏真養菌中脂質A及其脂肪酸鏈的化學結構特徵導致其合成酶及其合成、調控機制可能與大腸桿菌等其他革蘭氏陽性菌明顯不同。
經不斷嘗試，本發明意外地發現，羅氏真養菌H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的弱化或敲除能夠顯著降低其內毒素的含量，而且，還有利於PHA產量和生物量的提升。
具體地，本發明提供以下技術方案：
第一方面，本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量中的應用。
第二方面，本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在提高羅氏真養菌的PHA產量中的應用。
第三方面，本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在提高羅氏真養菌的生物量中的應用。
第四方面，本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量同時提高羅氏真養菌的PHA產量和生物量中的應用。
在本發明的一些實施方式中，本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量、提高羅氏真養菌的PHA產量和/或提高羅氏真養菌的生物量中的應用。
在本發明的一些實施方式中，本發明提供羅氏真養菌H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量、提高羅氏真養菌的PHA產量和/或提高羅氏真養菌的生物量中的應用。
在本發明的一些實施方式中，本發明提供羅氏真養菌H16_A0228蛋白和H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量、提高羅氏真養菌的PHA產量和/或提高羅氏真養菌的生物量中的應用。
上述應用中，生物量的提高可表現為細胞乾重的提高。
本發明中，H16_A0228、H16_B0917為蛋白的編碼基因在GenBank中的locus_tag，在GenBank中可獲得H16_A0228、H16_B0917蛋白及其編碼基因的序列。
具體地，H16_B0917蛋白的編碼基因序列如SEQ ID NO.3所示，H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。H16_A0228蛋白的編碼基因序列如SEQ ID NO.5所示，H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
H16_B0917蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO.4）具體如下： MKHRLQAALTIAVFKLVAALPYGVTARLGDAIGKLLYRIPSRRRRIVHTNLSLCFPDMDADTRDKLARNHFGHVLRSYLERGVQWFGSAERLGKLVELDSRIDLASCAEHPTIFMGFHFVGIEAGCMFYSMRHPVASLYTRMSSQMLEDISRTQRGRFGAEMIPRSGSGKQVVRTLRAGCPVMLASDMDFGINDSVFVPFFGVPACTLTSASRLASMTGARVVPFTTEVLPDYRGYRLRIFDPLEGFPSGSVEEDSRRMNAFLEAQIATMPEQYYWIHRRFKNRPAGMPSVY。
H16_A0228蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO.6）具體如下： MSRVFTWLGIGLLTVLGKLPYPFVARFGEALGSLLYLVPSERRRVVQANLRLCFPDRTEAEIDELSRQSFRILFRSFAERGIFWTGSEAQMRRWVQIDDQAGLVALDGTPHILVTLHLSGVEAGAIRLTIDLREHLGRSGASLYTRQKNDLFDHFLKHARGRFGANMISRNDSARDILRCLKKGEALQLIADMDFGERDSEFVPFFGVQALTLTSVSRLARLTGAKVVPIYTEMLPDYQGYVLRILPPWEDYPGASVTDDTRRMNAFFEDCIRPRVPEYYWVHKRFKHRLPGEPEIY。
上述應用中，表達和/或酶活性降低包括減弱所述蛋白的表達和/或酶活性，或者使得所述蛋白不表達或失活。
對於實現表達和/或酶活性降低的方式，本發明沒有特殊限制，例如，可採用基因工程手段對目標蛋白、其編碼基因、其調控元件和/或其調節基因或蛋白進行修飾，以使得目標蛋白的表達量和/或酶活性降低。
在本發明的一些實施方式中，H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低通過以下（1）~（3）中的任意一種或多種方式的組合實現：
（1）對蛋白的氨基酸序列進行突變以使得蛋白的表達和/或酶活性降低；
（2）對蛋白的編碼基因的核苷酸序列進行突變以使得蛋白的表達和/或酶活性降低；
（3）將蛋白的編碼基因的轉錄和/或翻譯調控元件替換為活性更弱的元件以使得蛋白的表達量降低。
以上所述的氨基酸序列的突變包括缺失、插入或替換一個或多個氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突變包括缺失、插入或替換一個或多個核苷酸。
以上所述的轉錄、翻譯調控元件包括啓動子、核糖體結合位點等。
在本發明的一些實施方式中，所述H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低通過失活所述蛋白實現。
在本發明的一些實施方式中，所述H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低通過缺失所述蛋白的編碼基因（H16_B0917基因、H16_A0228基因）實現。
第五方面，本發明提供一種工程化羅氏真養菌，所述工程化羅氏真養菌被修飾以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
在本發明的一些實施方式中，所述工程化羅氏真養菌被修飾以使得其中H16_A0228蛋白的表達和/或酶活性降低。
在本發明的一些實施方式中，所述工程化羅氏真養菌被修飾以使得其中H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
在本發明的一些實施方式中，所述工程化羅氏真養菌被修飾以使得其中H16_A0228蛋白和H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
上述表達和/或酶活性降低包括減弱所述蛋白的表達和/或酶活性，或者使得所述蛋白不表達或失活。
在本發明的一些實施方式中，H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低通過以下（1）~（3）中的任意一種或多種方式的組合實現：
（1）對蛋白的氨基酸序列進行突變以使得蛋白的表達和/或酶活性降低；
（2）對蛋白的編碼基因的核苷酸序列進行突變以使得蛋白的表達和/或酶活性降低；
（3）將蛋白的編碼基因的轉錄和/或翻譯調控元件替換為活性更弱的元件以使得蛋白的表達降低。
以上所述的氨基酸序列的突變包括缺失、插入或替換一個或多個氨基酸。
以上所述的核苷酸序列的突變包括缺失、插入或替換一個或多個核苷酸。
以上所述的轉錄、翻譯調控元件包括啓動子、核糖體結合位點等。
在本發明的一些實施方式中，所述工程化羅氏真養菌中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白失活，或者，所述工程化羅氏真養菌不表達H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
在本發明的一些實施方式中，所述工程化羅氏真養菌缺失H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的編碼基因。
第六方面，本發明提供以上所述的工程化羅氏真養菌在生物化學品的發酵生產中的應用。
以上所述的生物化學品包括但不限於聚酯類、醇類、氨基酸類、多肽類、蛋白質類、核酸類、糖類、脂類物質等。
在本發明的一些實施方式中，提供以上所述的工程化羅氏真養菌在PHA或其衍生物的發酵生產中的應用。
在本發明的一些實施方式中，利用上述工程化羅氏真養菌發酵生產PHA物以植物油（包括但不限於棕櫚油、棕櫚仁油、花生油、大豆油、亞麻油、菜籽油、棉籽油、蓖麻油、玉米油中的一種或多種的混合物）為碳源進行。
用於發酵生產的培養基中還可包含氮源（包括但不限於銨鹽）、無機鹽（包括但不限於磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀）、微量元素（包括但不限於鎂、鈣、鋅、錳、鈷、硼、銅、鎳、鉬）。
第七方面，本發明提供以上所述的工程化羅氏真養菌的構建方法，所述方法包括：修飾羅氏真養菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
第八方面，本發明提供一種降低羅氏真養菌的內毒素含量的方法，所述方法包括：修飾羅氏真養菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
在本發明的一些實施方式中，所述表達和/或酶活性降低為失活H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白，或者為使得羅氏真養菌不表達H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
本發明的有益效果在於：本發明提供的羅氏真養菌H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的失活能夠明顯降低羅氏真養菌的內毒素含量。H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白功能缺失的工程化羅氏真養菌不僅內毒素含量顯著降低，同時其細胞乾重和PHA產量顯著提高，為PHA的工程化菌株的開發提供了新的基因和菌株資源，對降低PHA的內毒素含量提供了有效方法，對於拓展PHA在醫療材料中的應用具有重要意義。
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
以下實施例所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
以下實施例所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。其中，所用酶試劑購自New England Biolabs(NEB)公司，提取質粒所用的試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司，回收DNA片段的試劑盒購自美國omega 公司，相應的操作步驟嚴格按照產品說明書進行，所有培養基如無特殊說明均用去離子水配製。
以下實施例中使用的培養基配方如下：
種子培養基：10g/L peptone，5g/L Yeast Extract，3g/L glucose。
生產培養基：1.0% 棕櫚油，9.85g/L Na 2HPO 4·12H 2O,1.5g/L KH 2PO 4，3.0g/L NH 4Cl，10mL/L微量元素溶液I和1mL/L微量元素溶液II。其中微量元素溶液I的組成為：20g/L MgSO 4，2g/L CaCl 2。微量元素溶液II的組成為：100mg/L ZnSO 4·7H 2O，30mg/L MnCl 2·4H 2O，300mg/L H 3BO 3，200mg/L CoCl 2·6H 2O，10mg/L CuSO 4·5H 2O，20mg/L NiCl 2·6H 2O，30mg/L NaMoO 4·2H 2O。上述試劑均購自國藥集團化學試劑公司。
實施例1  H16_B0917缺失突變株的構建及鑒定
本實施例以羅氏真養菌H16作為出發菌，敲除H16_B0917基因，具體包括如下步驟：
步驟一：構建基礎質粒
以羅氏真養菌H16基因組為模板，使用917H1-F和917H1-R進行PCR擴增得到H16_B0917的上游同源臂917-H1，使用917H2-F和917H2-R進行PCR擴增得到H16_B0917的下游同源臂917-H2；以修飾後的質粒pK18mob為模板，使用pK-F、pK-R為引子PCR擴增得到載體片段，將917-H1、917-H2通過Gibson Assembly方法與載體片段連接，得到重組質粒pKO-H16_B0917（序列如SEQ ID NO.1所示）。以上使用的引子如表1所示。
表1
引子名稱 引子序列（5’-3’）
pK-F （SEQ ID NO.7） ACTGATGTTTCACCGCTCGTCA
pK-R （SEQ ID NO.8） CAATCGCAGACTTGGCCGG
917H1-F （SEQ ID NO.9） CCGGCCAAGTCTGCGATTGAATCCCGCCGGTCATTATTGC
917H1-R （SEQ ID NO.10） CGCCGCCGGATAATCCGGGCGTAGATCCTAGGAGCGGCAG
917H2-F （SEQ ID NO.11） CTGCCGCTCCTAGGATCTACGCCCGGATTATCCGGCGGCG
917H2-R （SEQ ID NO.12） TGACGAGCGGTGAAACATCAGTGGTGGCCGAGGCCGGCAAGGT
步驟二：構建H16_B0917缺失突變的目標菌株
將步驟一獲得的重組質粒pKO-H16_B0917轉化至大腸桿菌S17-1中，再通過接合轉化方法轉入羅氏真養菌H16中，利用自殺質粒無法在宿主菌內複製的特性，用同時含有500μg/mL壯觀黴素、100μg/mL安普黴素的LB平板篩選出陽性克隆。該陽性克隆中帶有同源片段的重組質粒整合到基因組上的H1和H2所在的特定位置，為第一次同源重組菌。將第一次同源重組菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上劃單克隆培養，從這些單克隆中篩選出沒有壯觀黴素抗性的克隆，並使用引子917-H1FP（SEQ ID NO.19）：ATGTCGCTGACCGACGACCATGTC和917-H1RP（SEQ ID NO.20）:TTGGCACCACCAGCCTGACCAATG進行PCR鑒別H16_B0917基因敲除的重組菌株，最終獲得的重組菌為敲除H16_B0917基因的羅氏真養菌Re01。
實施例2  H16_A0228缺失突變株的構建及鑒定
本實施例以羅氏真養菌H16作為出發菌，敲除H16_A0228基因，具體包括如下步驟：
步驟一：構建基礎質粒
以羅氏真養菌H16基因組為模板，使用228H1-F和228H1-R進行PCR擴增得到H16_A0228的上游同源臂228-H1，使用228H2-F和228H2-R進行PCR擴增得到H16_A0228的下游同源臂228-H2；以修飾後的質粒pK18mob為模板，使用pK-F、pK-R為引子PCR擴增得到載體片段；將228-H1、228-H2通過Gibson Assembly方法與載體片段連接，得到重組質粒pKO-H16_A0228（序列如SEQ ID NO.2所示）。使用的引子如表2所示。
表2
引子名稱 引子序列（5’-3’）
pK-F （SEQ ID NO.13） ACTGATGTTTCACCGCTCGTCA
pK-R （SEQ ID NO.14） CAATCGCAGACTTGGCCGG
228H1-F （SEQ ID NO.15） TACCCGGCCAAGTCTGCGATTGTTGACCTCCAGGCCGTACAGCGT
228H1-R （SEQ ID NO.16） CCACTGATCGATCGATTTCGCGCGCCGGCACGTCCGGC
228H2-F （SEQ ID NO.17） CGGACGTGCCGGCGCGCGAAATCGATCGATCAGTGGCC
228H2-R （SEQ ID NO.18） TGACGAGCGGTGAAACATCAGTCCGCACCAGCCCTGGCTGC
步驟二：構建H16_A0228缺失突變的目標菌株
將步驟一獲得的重組質粒pKO-H16_A0228轉化至大腸桿菌S17-1中，再通過接合轉化方法轉入羅氏真養菌H16中，利用自殺質粒無法在宿主菌內複製的特性，用同時含有500μg/mL壯觀黴素、100μg/mL安普黴素的LB平板篩選出陽性克隆。該陽性克隆中帶有同源片段的重組質粒整合到基因組上的H1和H2所在的特定位置，為第一次同源重組菌。將第一次同源重組菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上劃單克隆培養，從這些單克隆中篩選出沒有壯觀黴素抗性的克隆，並使用引子228-H1FP（SEQ ID NO.21）: ATCGATACCACCGAGATCCATTCG和228-H1RP（SEQ ID NO.22）:AGCTGCATGGCTTTGACGACTACC進行PCR鑒別H16_A0228基因敲除的重組菌株，最終獲得的重組菌為敲除H16_A0228的羅氏真養菌Re02。
實施例3  H16_B0917和H16_A0228雙缺失突變株的構建與鑒定
本實施例以實施例2構建的羅氏真養菌Re02為出發菌，敲除H16_B0917基因，具體步驟如下：
將實施例1中獲得的重組質粒pKO-H16_B0917轉化至大腸桿菌S17-1，再通過接合轉化方法轉入實施例2構建的羅氏真養菌Re02中，利用自殺質粒無法在宿主菌內複製的特性，用同時含有500μg/mL壯觀黴素、100μg/mL安普黴素的LB平板篩選出陽性克隆。該陽性克隆中帶有同源片段的重組質粒整合到基因組上的H1和H2所在的特定位置，為第一次同源重組菌。將第一次同源重組菌在含有100mg/mL蔗糖的LB平板上劃單克隆培養，從這些單克隆中篩選出沒有壯觀黴素抗性的克隆，並使用引子917-H1FP：ATGTCGCTGACCGACGACCATGTC和917-H1RP:TTGGCACCACC AGCCTGACCAATG進行PCR鑒別H16_B0917基因敲除的重組菌株，最終獲得的重組菌為同時敲除H16_B0917和H16_A0228的羅氏真養菌Re03。
實施例4 菌株Re01，Re02，Re03的性能驗證
本實施例以羅氏真養菌H16為對照菌，對Re01，Re02，Re03進行發酵後的內毒素含量、生物量及PHB含量的測試。
步驟一：菌株Re01、Re02、Re03的發酵培養
將Re01、Re02、Re03及羅氏真養菌H16在LB平板上進行平板劃綫，得到單克隆，將單克隆接種於種子培養基（4mL）中，培養12小時。將過夜培養的菌液轉接到裝有10 mL 種子培養基的100 mL玻璃錐形瓶，接種終OD量約0.1，30℃，220 rpm，培養8h，即可進行轉接培養。PHA發酵生產的培養是將OD值在6-7之間的前培養種子液，按終OD為0.1的終接種量接種於裝有30mL生產培養基的250mL搖瓶中，30℃，220rpm發酵培養48h。每株菌設置3個平行。
步驟二：菌株Re01、Re02、Re03的內毒素含量測定
取上述步驟一發酵後的1mL新鮮菌液，13400g離心1min收集菌體，棄上清，隨後使用30%的乙醇溶液重懸菌體後離心，並棄上清，重複上述步驟兩次，洗滌菌體。最後使用去離子水將菌體稀釋至OD600為0.5，在100℃下裂解30min，然後在室溫下放置24小時使內毒素充分釋放。使用ToxinSensor顯色法LAL內毒素檢測試劑盒檢測內毒素含量。檢測結果如表3所示。相比於對照菌株羅氏真養菌H16，Re01、Re02、Re03的內毒素單位含量分別降低46倍、52倍、95倍。
上述ToxinSensor顯色法LAL內毒素檢測試劑盒購自金斯瑞生物科技股份有限公司。
表3
菌株 Endotoxin（EU/mg） 單位內毒素含量相對於羅氏真養菌H16降低倍數
羅氏真養菌H16 529618.31 ± 57017.26 —
Re01 11197.99 ± 2075.38 46
Re02 10048.35 ± 884.89 52
Re03  5497.43 ± 344.62 95
步驟三：菌株Re01、Re02、Re03的生物量測定
取上述步驟一的發酵液量使用50mL量筒量取菌液體積（記為V，單位：mL），置於已稱重的離心管中（重量記為m1，單位：g），8000rpm，室溫，離心10min，棄上清，收集菌體；隨後使用15mL 30%的乙醇溶液，重懸菌體，8000rpm，室溫，離心10min，重複兩次，洗去菌株中的油脂及培養基，最後將收集菌體的離心管置於60℃烘箱中，烘至恒重，並利用分析天平精確稱取其重量（記為m2，單位：g）。並計算其乾重。結果如表4所示。相比於對照菌株羅氏真養菌H16，Re01、Re02、Re03的生物量分別提高27.8%，17.9%，28.2%。
上述乾重計算公式為M=（m2-m1）/V*1000，單位為g/L。
表4
菌株 乾重（g/L）
羅氏真養菌H16  8.37 ± 0.89
Re01 10.70 ± 1.80
Re02  9.87 ± 1.10
Re03  10.73 ± 2.35
步驟四：菌株Re01、Re02、Re03的PHB含量測定
1、樣品處理：稱取上述步驟三烘乾後的樣品精准稱重30~40mg置於消解管中，加入2mL的酯化液和2mL氯仿，酯化管加蓋密封100℃反應4h，反應結束後靜置冷却至室溫，加入1mL去離子水，渦旋震蕩至完全混合，靜置分層後，取下層有機相進行氣相色譜法分析。
上述酯化液配置方法為取485mL無水甲醇，加入1g/L的苯甲酸，緩慢加入15mL濃硫酸，即制為500mL的酯化液。
2、標準品處理：聚[(R)-3-羥基丁酸]，用於標定3HB單元，白色粉末，稱取梯度值為15 mg、25 mg、35 mg，稱量方式及處理方式與上述樣品處理方式相同。
3、GC分析PHA組成及含量：使用島津公司的GC-2014型氣相色譜儀。色譜儀的配置為：HP-5型毛細管色譜柱，氫火焰離子化檢測器FID，SPL分流進樣口；高純氮氣作為載氣，氫氣為燃氣，空氣為助燃氣；使用AOC-20S型自動進樣器，丙酮為洗滌液。GC分析程序的設置為：進樣口溫度240℃，檢測器溫度250℃，柱溫起始溫度為80℃，維持1.5分鐘；以30℃/分鐘的速率升至140℃並維持0分鐘；以40℃/分鐘的速率升至240℃並維持2分鐘；總計時間為8分鐘。GC結果採用內標歸一法根據峰面積進行定量計算PHB含量。結果如表5所示，相比於對照菌株，RE01，RE02，RE03的PHB含量分別提高7.02%，5.42%，9.61%。
表5
菌株 PHB%
羅氏真養菌H16 70.59%
Re01 75.55%
Re02 74.42%
Re03 77.38%
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
無
無。
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Claims (10)

  1. 一種羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量中的應用。
  2. 一種羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在提高羅氏真養菌的PHA產量中的應用。
  3. 一種羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在提高羅氏真養菌的生物量中的應用。
  4. 一種羅氏真養菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低在降低羅氏真養菌的內毒素含量同時提高羅氏真養菌的PHA產量和生物量中的應用。
  5. 一種工程化羅氏真養菌，該工程化羅氏真養菌被修飾以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
  6. 如請求項5所述之工程化羅氏真養菌，其中，該工程化羅氏真養菌中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白失活，或者該工程化羅氏真養菌不表達H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
  7. 一種如請求項5或請求項6所述之工程化羅氏真養菌在生物化學品發酵生產中的應用。
  8. 一種如請求項5或請求項6所述之工程化羅氏真養菌的構建方法，其包括：修飾羅氏真養菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
  9. 一種降低羅氏真養菌的內毒素含量的方法，其包括：修飾羅氏真養菌以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表達和/或酶活性降低。
  10. 如請求項9所述之降低羅氏真養菌的內毒素含量的方法，其中，該表達和/或酶活性降低為失活H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白，或者使得羅氏真養菌不表達H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白。
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