CN102711814A - 一种嵌合h因子结合蛋白(fhbp)及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能够产生抗体的嵌合fHbp及其使用方法，所述抗体对脑膜炎奈瑟球菌的不同fHbp变体菌株具有杀菌作用。

Description

一种嵌合H因子结合蛋白(FHBP)及其使用方法
相关申请的交叉引用
本申请要求申请号为61/174,424、申请日为2009年4月30日的美国临时申请的优先权，其全部内容在此整体参考并入，用于所有目的。
关于联邦政府资助研究的声明
本发明在政府公共卫生服务基金的资助下完成，基金号R01 AI46464和C06RR16226。政府对本发明享有某些权利。
技术领域
本发明涉及疫苗，用于由脑膜炎奈瑟球菌所致的疾病。
背景
脑膜炎奈瑟球菌是一种革兰氏阴性细菌，其寄居在人的上呼吸道，导致在世界范围内零星和周期性地爆发疫情，最为人所知的是脑膜炎和败血症。致病率和发病率最高的是两岁以下儿童。与其他革兰氏阴性细菌相同，脑膜炎奈瑟球菌通常具有细胞质膜、肽聚糖层，及与荚膜多糖一起构成细菌细胞壁的外膜和突出在外环境中的菌毛。有被膜的脑膜炎奈瑟球菌菌株是在儿童和青年中导致细菌性脑膜炎和败血症的主要原因。由于侵袭性脑膜炎奈瑟球菌的感染普遍流行，且具有经济上的重要性，因此人们开始寻找有效的疫苗，以提供对不同菌株的免疫力，特别是对具有不同血清型或血清亚型的遗传多样化的B群菌株。
H因子结合蛋白(fHbp，在本领域也称为脂蛋白2086(Fletcher et al，Infect Immun2004；72：2088-2100)、基因组衍生的奈瑟菌属抗原(GNA)1870(Masignani et al.J Exp Med2003；197：789-99)或“741”)是一种脑膜炎奈瑟球菌蛋白，其在细菌中以表面暴露的脂蛋白形式表达。fHbp的一个重要功能为与人补体fH结合，其能够下调补体的激活性。通过fH与细菌表面结合这个重要机制，病原体在未经免疫的人血清或血液中存活并逃避先天性宿主防御。
在首次研究中对71个脑膜炎奈瑟球菌菌株进行了分析，在第二项研究中对200个以上的菌株进行了分析，以此作为遗传和地理分布多样性的代表，根据氨基酸序列可变性和免疫交叉反应性(Masignani et al.J Exp Med 2003；197：789-99)，将脑膜炎奈瑟球菌菌株再分为三个fHbp变体群(称为变体1(v.1)、变体2(v.2)和变体3(v.3))。其他研究人员(Fletcheret al，2004)将该蛋白分为两个亚家族，记为A(包括Masignani v.2和v.3)和B(v.1)。变体1菌株占致病性B群分离株的约60％(Masignani et al.2003，同上)。在各变体群中，氨基酸序列的保守度在约92％的量级或更高。特别地，各变体群内的保守度范围在89％至100％之间，而在变体群之间(例如，在v.1和v.2之间)，保守度可低至59％。所有已知的脑膜炎奈瑟球菌菌株均表达该蛋白。
仍需要一种单一的fHbp多肽，其能够产生的杀菌抗体应答对表达不同fHbp变体的广谱菌株均有效。
发明概述
本申请提供了一种能够产生抗体的嵌合fHbp及其使用方法，所述抗体对脑膜炎奈瑟球菌的不同fHbp变体菌株具有杀菌作用。
附图简要说明
图1A-1G为表7，其列出了69个独特的H因子结合蛋白的来源菌株和特性。
图2A-2E为表8，其列出了fHbp可变区段A至E中的独特的序列，以及在每一个所述区段ID的变体群中，独特多肽的数目。区段ID为各可变区段的编号。对不同的序列变体分配一个唯一的编号，以字母A至E开头，表示所述区段；其后为α或β，分别表示所述区段与多肽ID 1(fHbp v.1)或多肽ID 28(fHbp v.3)中相应fHbp区段具有同源性，其后为每个不同序列的编号。各区段(A至E)中某些区段ID的变体群1、2和3的数目见子表。
图3为基于69种独特的氨基酸序列的fHbp的进化树。
图4，A图为显示出接头位置的fHbp的示意图，接头在本发明中也称为不变区段(I)，其以垂直的矩形表示，与可变区段(V)相连。B图列出了各不变区段的氨基酸序列的表格。
图5为在可变区段A(残基8-73)(A图)和B(残基79-93)(B图)中的独特的fHbp氨基酸序列的进化树。
图6为在可变区段C(残基98-159)(A图)和D(残基162-180)(B图)中的独特的fHbp氨基酸序列的进化树。
图7为可变区段E(残基186-253)中的独特的fHbp氨基酸序列的进化树。
图8，A图为从进化分析中推导出的9种fHbp模块架构的示意图，包括6种较为常见的模块群类型。灰色区段代表与多肽ID 1同源的α祖源序列，而白色区段代表与多肽28同源的β祖源序列。在此分析的独特的fHbp氨基酸序列中，约有94％属于前6种模块群类型(I、II、III、IV、V和VI)之一。B图，已分析的fHbp中有四个被分类为示出的三种模块架构之一。这些架构在可变区段中含有连接点，如箭头所示。C图是一张表，列出了在可变区段中由α祖源序列转变为β或由β转变为α(J1、J2和J3)的氨基酸残基。
图9表示H因子结合蛋白的结构模型，其基于fHbp与人H因子的一个片段所形成的复合物的结构坐标(Schneider et al.(2009)Nature 458：890-3)。下面的各图中，左边的模型为fHbp面向膜的一侧；中间的模型为面向暴露面的一侧；右边的模型为fHbp底部位于膜的一侧。A图是用卡通图表示的两个结构域。B图是空间填充模型，H因子结合残基以黑色表示，不变区段的氨基酸残基以白色表示。C图是空间填充模型，不变区段的氨基酸残基与B图一样以白色表示，影响抗fHbp单抗表位的残基以黑色表示。
图10A-10I为表9，列出了在一项包括275个多肽ID的分析中使用的独特的H因子结合蛋白变体的某些特性。N末端可变序列的序列编号如下：GGGS(SEQ ID NO：7)、SGSGG(SEQ ID NO：8)、GGGSGG(SEQ ID NO：9)、GGGSGS(SEQ ID NO：10)、GSGG(SEQ IDNO：11)、GGGSGGGG(SEQ ID NO：12)、GGGSGGGSGG(SEQ ID NO：13)和GGSGG(SEQ IDNO：14)。
图11为用红外检测的免疫印迹法测得的fHbp的表达情况。A图和C图是模块群I(ID1)或VI(ID 77)的重组蛋白，或表达相应模块群的fHbp的菌株在热灭活后其细菌细胞中的重组蛋白。用小鼠的抗fHbp单抗JAR 5检测模块群I的蛋白，其能够识别模块群I和IV中的几乎所有fHbp。用抗fHbp单抗JAR 31检测模块群VI蛋白，其能够识别模块群II、III、V和VI中的几乎所有蛋白(参见实施例部分的表6)。B图和D图是如A图和C图中所示的重组蛋白的相应结合情况的标准曲线。
图12为在系统性收集的脑膜炎奈瑟球菌的B族分离株中，fHbp模块群的出现频率。数据来自于由Murphy等[16]报道的在美国(N＝432)、英国(N＝536)和法国(N＝244)收集的分离株的序列，以及从加利福尼亚州(2003-2004)、马里兰州(1995和2005)和9个州的儿童医院(2001-2005)新近获得的143个其他美国分离株的序列。
图13为用模块群I至VI的fHbp免疫小鼠所得的血清库的血清杀菌活性。黑色的柱状图表示各模块群的3至4个血清库对同源的测试菌株的平均滴度。白色的柱状图表示各个异源血清库对于测试菌株的平均滴度。+，表示各菌株中fHbp的相对表达量；带有+/-的菌株表示fHbp低表达的菌株(参见实施例部分表5中的数值)。
在描述本发明和本发明的具体示例性实施方式之前，应理解，本发明不限于所述的具体实施方式，因为它们当然可能发生变化。还应理解，本发明所用术语的仅仅是为了描述具体实施方式，并非旨在构成限制，因为本发明的范围仅受所附权利要求书的限制。
应理解，当提供了数值范围时，应理解本发明包括了该范围上下限之间的、以下限单位的十分之一为间隔的各个离散数值，以及所述范围内的任何其他提到的或离散数值，除非上下文中另有明确说明。本发明还独立地包括在这些较小范围内的上下限，除非所述范围中存在明确排除的任何界限值。当所述范围包括一个或两个界限值时，本发明还包括了排除这一个或两个被包括在内的界限值的范围。
除非另有说明，本申请中所用的所有科技术语与本发明所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。以下描述的是优选的方法和材料，虽然本发明的实施或测试也可采用任何类似于或等同于本发明所述的方法和材料。本申请中提及的所有出版物均通过引用参考并入，以公开和描述与所引用出版物相关的方法和/或材料。
必须注意，在本申请和所附权利要求书中所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”也包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此，例如，对“一个抗原”的述及也包括多个这样的抗原，对“所述蛋白”的述及也包括一个或多个蛋白，等等。
在本申请中讨论的出版物仅仅是因为其在本申请的申请日前的公开内容而被提供。本申请中的任何内容均不能被理解为承认本发明不能通过发明在先的方式而早于这样的出版物。此外，所提供的公开日期可能与实际公开日期不同，可能需要单独确认。
本发明示例性实施方案的详述
本发明公开了能够产生抗体的嵌合fHbp及其使用方法，所述抗体对脑膜炎奈瑟球菌的不同fHbp变体菌株具有杀菌作用。
定义
“H因子结合蛋白”(fHbp)，在文献中也被称为GNA1870、GNA 1870、ORF2086、LP2086(脂蛋白2086)和“741”，是指脑膜炎奈瑟球菌的一种多肽，是呈现在细菌表面的一种脂蛋白。根据氨基酸序列的可变性和免疫交叉反应性(Masignani et al.J Exp Med 2003；197：789-99)，脑膜炎奈瑟球菌菌株已被细分为三种fHbp变体群(在一些报道中(Masignaniet al.2003，同上)被称为变体1(v.1)、变体2(v.2)和变体(v.3)，在其他报道中(参见，例如Fletcher et al.2004 Infect Immun 2088-2100)被称为家族A和B)。neisseria.org对在脑膜炎奈瑟球菌中发现的每个独特的fHbp均分配了一个多肽ID，如图1A-1G(表7)和图10A-10I(表9)所示。为了清楚起见，本申请采用v.1、v.2和v.3的命名方式。因为变体2(v.2)fHbp蛋白(来自菌株8047，多肽ID 77)和变体3(v.3)fHbp蛋白(来自菌株M1239，多肽ID 28)的长度与MC58(多肽ID 1)的长度分别具有-1和+7氨基酸残基的差异，所以用来指代v.2和v.3 fHbp蛋白残基的编号不同于基于这些蛋白质的实际氨基酸序列的编号。因此，例如，v.2或v.3fHbp序列中第166位的亮氨酸残基(L)是指v.2蛋白的165位和v.3蛋白的173位残基。
术语“异源”或“嵌合”指由衍生自不同来源的结构而定义的两种组分。例如，当在嵌合多肽的上下文中使用“异源”时，所述嵌合多肽包含操作性连接的氨基酸序列，这些序列可以衍生自不同进化群组的不同多肽(例如，衍生自α祖源氨基酸序列的第一组分和衍生自β祖源氨基酸序列的第二组分)。类似地，当上下文是编码嵌合多肽的多核苷酸时，“异源”包括可衍生自不同基因的操作性连接的核酸序列(例如，衍生自编码fHbp v.1多肽的核酸的第一组分和衍生自编码fHbp v.2多肽的核酸的第二组分)。本申请中描述的这样的嵌合多肽在单一多肽中提供了通常存在于不同多肽的多个表位。其他示例性的“异源”核酸包括表达构建体，其中含有编码序列的核酸操作性连接于调控元件(例如启动子)，该调控元件的遗传来源不同于编码序列的来源(例如，以使得可以在感兴趣的宿主细胞中表达，所述宿主细胞的遗传来源可能不同于启动子、编码序列的来源或与二者的来源都不同)。例如，与编码fHbp多肽或其结构域的多核苷酸操作性连接的T7启动子被认为是异源核酸。当上下文中是重组细胞时，“异源”可以指宿主细胞中存在的核酸(或基因产物，如多肽)的遗传来源不同于宿主细胞。例如，奈瑟氏菌属某个菌株的氨基酸或核酸序列对另一个奈瑟氏菌属菌株宿主而言是异源的。
当“衍生自”的上下文是氨基酸序列或多核苷酸序列时(例如，“衍生自”v.1 fHbp氨基酸序列)，它意在表示所述多肽或核酸的序列是基于某对照多肽或核酸(例如，天然存在的fHbp蛋白或编码核酸)的序列，而不是意在限制所述蛋白质或核酸制备的来源或方法。当“衍生自”的上下文是细菌菌株时，它意在表示通过体内传代或体外培养亲本菌株而获得的菌株，和/或通过修饰亲本菌株而获得的重组细胞。
“保守性氨基酸替代”指一个氨基酸残基被另一个侧链具有类似化学和物理性质(例如，电荷、大小、疏水性/亲水性)的氨基酸所替代。“保守性取代”旨在包括在下述氨基酸残基的组内替代：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸；天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。当上下文是如本发明所述的嵌合fHBP时，可通过选择保守性氨基酸替代来保护感兴趣的表位。通过对存在感兴趣表位的多肽进行氨基酸序列的比对，可以指导此类替代。
术语“保护性免疫”指对哺乳动物给药疫苗或免疫方案以引起免疫应答，从而防止、延迟由脑膜炎奈瑟球菌引起的疾病发展、或降低所述疾病的严重程度，或减少或一并消除所述疾病的症状。保护性免疫可伴随有杀菌性抗体的产生。应注意，本领域公认，针对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌性抗体的产生可以预示疫苗在人体中具有保护作用(Goldschneider etal.，1969，J.Exp.Med.129：1307；Borrow et al.2001 Infect Immun.69：1568)。
短语“脑膜炎奈瑟球菌荚膜B族菌株所致的疾病”包括在感染了脑膜炎奈瑟球菌荚膜B族某成员的人体中存在的任何临床症状或临床症状的组合。这些症状包括但不限于：脑膜炎奈瑟球菌荚膜B族致病菌株在上呼吸道(例如，鼻咽和扁桃体的粘膜)的寄居，细菌穿透进入粘膜和粘膜下血管床，败血症、脓毒性休克、炎症、出血性皮肤病损、血纤蛋白溶解和血液凝固的激活，器官功能失调，例如肾、肺和心力衰竭，肾上腺出血和肌肉梗死，毛细血管渗漏，水肿，外周肢体缺血，呼吸窘迫综合征，心包炎和脑膜炎。
短语“广谱保护性免疫力”是指疫苗或免疫方案引发了针对至少多于一种(可以是至少两种、至少三种、至少四种、至少五种、针对至少八种或更多菌株)脑膜炎奈瑟球菌菌株的“保护性免疫力”，其中每一种所述菌株表达不同fHbp亚变体或fHbp变体。本发明尤其包括并涵盖了能抵御任何荚膜族(例如，A、B或C)成员所致疾病的疫苗或疫苗接种方案，其中特别感兴趣的是对脑膜炎奈瑟球菌荚膜B族菌株所致疾病的抵御，因为该荚膜族为导致疾病广泛流行的菌株，并且缺乏广谱有效的B族疫苗。
在抗原的上下文中(例如，多肽抗原)，短语“与某抗体特异性结合”或“发生特异性免疫反应”是指基于样品中抗原的存在和/或检验其存在的结合反应，所述样品也可以包含其他分子的异质群体。因此，在指定的条件下，所述一种或多种特异性抗体与样品中的一种或多种特定抗原结合，且不与样品中存在的其他分子大量结合。在抗原表位的上下文中(例如，多肽的表位)，术语“与某抗体特异性结合”或“发生特异性免疫反应”是指基于抗原(例如，多肽)中表位的存在和/或检验其存在的结合反应，所述抗原也可以包含其他表位的异质群体，以及抗原的异质群体。因此，在指定的条件下，所述一种或多种特定抗体能与抗原中的一个特定表位结合，而不与抗原和/或样品中存在的其他表位大量结合。
短语“用量足以引发免疫应答”表示在给予特定抗原制品前后检测到的免疫应答指示物之间存在可检测的差异。免疫应答指示物包括但不限于，通过以下试验检测到的抗体滴度或特异性：酶联免疫测定(ELISA)、杀菌试验、流式细胞术、免疫沉淀、Ouchter-Lowny免疫扩散；结合检测试验如斑点、Western印迹或抗原阵列等；细胞毒性试验等。
“表面抗原”是存在于脑膜炎奈瑟球菌的表面结构(例如，外膜、荚膜、菌毛等)中的抗原。
“分离的”指感兴趣的物质，其所在的环境与其可天然存在的环境不同。“分离的”意在包括样品中的化合物，这些样品充分富集了感兴趣的化合物和/或在其中感兴趣的化合物被部分或充分纯化。
“富集”表示对样品进行非自然操作(例如，通过实验者或临床医生)，使感兴趣的化合物的浓度大于(例如，至少大3倍、至少大4倍、至少大8倍、至少大64倍或更大)起始样品中所述化合物的浓度，起始样品例如生物样品(例如，所述天然含有化合物的样品或在给药后存在于其中的样品)或制备所述化合物的样品(例如，在细菌多肽、抗体、嵌合多肽等中的情况)。
“敲除”靶基因是改变基因序列以降低靶基因的功能，例如，使得靶基因的表达不可检测或不显著，和/或基因产物无功能或不具有显著功能。例如，“敲除”LPS合成中涉及的一个基因是指大幅降低该基因功能，使得该基因的表达不可检测或仅在不显著的水平存在，和/或与修饰前相比，基因产物的生物学活性(例如，酶活性)显著降低或无法检测。“敲除”包括条件性敲除，当靶基因在预先定义的条件下时(例如，温度、渗透压)，接触到促使靶基因改变的物质时，及类似情况下发生基因改变。“敲入”靶基因是指改变宿主细胞基因组中的遗传信息，以增加靶基因所提供的功能。
本发明所述的“非天然存在的”指通常不存在于自然界中，而是通过人工制备和/或人为修饰得到的蛋白(例如，fHbp)。非天然存在的fHbp对象可通过化学合成或重组方法获得。例如，“非天然存在的嵌合体”是指“人工嵌合体”，包括自然界中不存在的带有异源成分的fHbp。
fHbp和fHbp编码核酸
在进一步阐述本发明涉及的示例性嵌合fHbp之前，有必要先说明一下天然存在的fHbp。
为了方便和清楚起见，自行选择了脑膜炎奈瑟球菌MC58株(多肽ID 1)的v.1fHBP天然氨基酸序列，作为所有天然v.1、v.2和v.3fHbp氨基酸序列以及本发明所述嵌合fHbp的对照序列。除另有说明外，本发明所述的氨基酸残基位点也是指多肽ID 1的位点。多肽ID 1的序列如下：
CSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYG
NGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSE
HSGKMVAKRQFRIGDIAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQG
NGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGS
AEVKTVNGIRHIGLAAKQ(SEQ ID NO：1)
尽管在图1A-1G(表7)和图10A-10I(表9)中列出的序列有多种变体群且有其他归类方案，但是如下文实施例所述，对69个独特的fHbp序列进行的首次分析和对全部275个多肽ID进行第二次分析的结果显示，fHbp的氨基酸序列中有多个不同的延伸段在所有已分析的fHbp中都是保守的。如下文实施例部分展示的系统进化研究结果显示，这些保守的氨基酸序列将fHbp分隔成多个氨基酸序列的模块区段，其在进化树中聚集成簇，并定义出两个祖源序列，由此衍生得出各个可变区段。如图5-7所示，fHbp中的每个可变区段都可以被归类到两个祖源氨基酸序列之一：为方便起见将其命名为α或β。
图4的A图描述了根据模块区段来表征fHbp的命名法架构。图4的A图中的矩形表示保守序列(I)，可变区段被命名为N-末端元件、VA、VB、VC、VD或VE区段。图4的B图中列出了保守序列的氨基酸序列。
因此，天然存在的fHbp可以通过以下公式定义：
I1-Nte-I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE-I7，其中“Nte”指N-末端元件，“I”指“不变”区段，以及“V”指α或β祖源型的可变区段。
根据下文更加详细的阐述，本发明所述的非天然存在的嵌合fHbp可以通过组合多个V区段并在两侧以I区段间隔的方式而构建。用于构建此类嵌合fHbp的不变和可变区段将在下文中以从N-末端至C-末端的形式进行更加详细的阐述。这种模块归类方法也可以在Neisseria.org的网站上找到(neisseria.org/perl/agdbnet/agdbnet.pl？file＝nm_fhbp.xml)。下文所述的祖源群α和β在该网站中分别以1和2表示。例如，VAα2-VBα1-VCβ5-VDα5-VEα8将变为A1.2-B1.1-C2.5-D1.5-E1.8。
不变区段
fHbp含有在本申请分析的所有fHbp氨基酸序列中保守的那些氨基酸序列。保守性序列将衍生自α或β祖源氨基酸序列的多个可变区段间隔开来。这些保守序列在本发明中被称为“不变序列”或“不变区段”，其可以作为在天然存在的fHbp中进行重组的位点。当这些不变区段的两侧为可变区段时，所述不变区段可以被称为“接头”序列。尽管在本发明公开的fHbp中这些序列展示出相似的氨基酸序列，但是这些氨基酸序列仍可以耐受某些保守性的氨基酸替代。因此，本发明使用的术语“不变区段”不应被理解为仅限于本发明所述的特定氨基酸序列，其可能至少包含一种或多种的保守性氨基酸替代。
如图4所示，在天然存在的fHbp中，最N-末端的不变区段起始于残基1，其氨基酸序列为CSSG(SEQ ID NO：2)。紧接着首个不变区段CSSG(I1)的C-末端，是含有约1个至约6个甘氨酸或丝氨酸残基的可变N-末端元件。图1A-1G(表7)和图10A-10I(表9)列出了多种N-末端元件。第二个不变区段(I2)的氨基酸序列为GG，其位于N-末端元件的C-末端，起始于残基6、7或11，视N-末端元件的长度而定(例如，在变体3的多肽ID 28中，I2起始于残基11)。下一个不变区段I3的氨基酸序列为SRFDF(SEQ ID NO：3)，其位于残基74，即位于I2以及一个可变区段的C-末端。I4位于I3的C-末端，其氨基酸序列为GEFQ(SEQ IDNO：4)，位于残基94处。I5的氨基酸序列为DD，其位于I4的C-末端，在残基159处。I6位于I5的C-末端，其被定义为IEHLK(SEQ ID NO：5)或IEHLE(SEQ ID NO：6)，起始于残基180。最后，I7为天然存在的fHbp中最C-末端的不变区段，起始于残基252，其氨基酸序列为KQ。
上文列出的各不变区段起始点的残基位置可以有1至8个残基的位移，具体情况视N-末端元件和可变区段的氨基酸序列长度而定。如上文所述，为方便和清楚起见，本申请通篇在提到非天然存在的嵌合fHbp时，所用的残基编号都是基于MC58株的fHbp氨基酸序列(多肽ID 1)的编号，MC58株是一种变体1菌株。
根据本申请中序列分析的结果，不变区段的长度范围在约2个氨基酸残基至约5个氨基酸残基之间。
可变区段
如上文所述，可变区段(V)位于接头序列之间，接头序列在本文中也称为不变区段(I)。除可变的N-末端元件之外，在fHbp中共有5个可变区段，其按照N-末端至C-末端的顺序表示为VA、VB、VC、VD和VE，每一个的两侧都是如上所述的不变区段。如前所述，每一个可变区段可以被归类为两种祖源氨基酸序列之一：α或β。例如，VAα表示衍生自α祖源氨基酸序列的可变区段A，而VAβ指衍生自β祖源氨基酸序列的可变区段A。在一个更加具体的例子中，VAα1表示，可变区段A是图2A中如区段IDA.α.1所示的氨基酸序列(表8，区段A)，其为可变区段A的α祖源序列的一个等位基因。如下文所述，本发明提供的嵌合fHbp含有可变区段的非天然存在的组合，其中各区段可以独立地选自α和β祖源型，和/或图2A-2E表8所示的相应区段的任意等位基因的非天然存在的组合。
每个α和β祖源可变区段都具有某些特征性的氨基酸残基。此外，α祖源可变区段与变体1群(例如，多肽ID 1)的fHbp具有序列相似性，而β祖源可变区段与变体3群(例如，多肽ID 28)的fHbp具有序列相似性。下文中详细讨论α或β祖源的每个可变区段中的特征性氨基酸残基。
除了具有相应的特征性氨基酸序列以外，相同祖源型可变区段的氨基酸序列还具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％，以及可以是100％的序列相似性。当对不同祖源型的相同可变区段的氨基酸序列进行比较时，氨基酸序列的相似性降低至少10％至40％。
在序列群内及群间按区段计的氨基酸相似性参见下文实施例部分中的表4。
图2A-2E(表8)中提供了每个可变区段的多种等位基因及其序列，在下文中有详细描述。
在本申请中，最N-末端的可变区段被称为N-末端元件(Nte)(图4)。在已分析的fHbp中发现有多种N-末端元件，在图1A-1G(表7)以及图10A-10I(表9)中列出。其长度范围为1至6个甘氨酸，或甘氨酸与丝氨酸组合。
可变区段VA的起始于残基7，在I2的C-末端，终止于残基73，在I3的N-末端。α祖源的VA(VAα)含有的氨基酸序列与图2A(表8)中列出的区段ID A.α.1：VAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLD QSVRKNEKLK LAAQGAEKT YGNGDSLN TGKLKNDKV(SEQ ID NO：15)具有约89％至100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基QSV，以粗体表示，来进一步表征VAα。某些残基在不同fHbp的VAα之间可能是其他的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
β祖源的VA(VAβ)含有的氨基酸序列与图2A(表8)中列出的区段ID A.β.1：VAADIGTGLA DALTAPLDHK DKGLKSLTLE DSIPQNGTLT LSAQGAEKTFKAGDKDNSLN TGKLKNDKI(SEQ ID NO：67)具有约89％至100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基DSI和/或KDN，以粗体表示，来进一步表征VAβ。某些残基在不同fHbp的VAβ之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
可变区段VB的起始于残基79，终止于I4的N-末端，即残基93处。α祖源的VB(VBα)含有的氨基酸序列与图2B(表8)中列出的区段ID B.α.1：IRQIEVDGQL ITLES(SEQ IDNO：85)具有约80％至100％相似性。可以通过特征性氨基酸残基IRQ，以粗体表示，来进一步表征VBα。某些残基在不同fHbp的VBα之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
β祖源的VB(VBβ)含有的氨基酸序列与图2B(表8)中列出的区段ID Bβ.1：VQKIEVDGQT ITLAS(SEQ ID NO：95)具有约100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基VQK，以粗体表示，来进一步表征VBβ。
可变区段VC的起始于残基98附近，在I4的C-末端，终止于残基158，即I5的N-末端。α祖源的VC(VCα)含有的氨基酸序列与图2C(表8)中列出的区段ID C.α.1：VYKQSHSALTALQTEQVQDS EHSGKMVAKR QFRIGDIAGE HTSFDKLPEG GRATYRGTAF GS(SEQ IDNO：96)具有约85％至100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基QDS，以粗体表示，来进一步表征VCα。某些残基在不同fHbp的VCα之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
β祖源的VC(VCβ)含有的氨基酸序列与图2C(表8)中列出的区段ID C.β.1：IYKQDHSAVV ALQIEKINNP DKIDSLINQR SFLVSGLGGE HTAFNQLPG GKAEYHGKAFSS(SEQ ID NO：152)具有约93％至100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基NNP，以粗体表示，来进一步表征VCβ。所有的VCβ氨基酸序列都具有这个特征。某些残基在不同fHbp的VCβ之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
可变区段VD起始于残基161，即I5的C-末端，终止于残基179，即I6的N-末端。α祖源的VD(VDα)含有的氨基酸序列与图2D(表8)中列出的区段ID D.α.1：AGGKLTYTIDFAAKQGHGK(SEQ ID NO：174)具有约89％至100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基AG或AS，其中AG以粗体表示，来进一步表征VDα。某些残基在不同fHbp的VDα之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
β祖源的VD(VDβ)含有的氨基酸序列与图2D(表8)中列出的区段ID D.β.1：PNGRLHYSID FTKKQGYGR(SEQ ID NO：192)具有约84％至100％相似性。可以通过特征性氨基酸残基PN，以粗体表示，来进一步表征VDβ。某些残基在不同fHbp的VDβ之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
可变区段VE的起始于残基185附近，即I6的C-末端，终止于残基253，即I7的N-末端。α祖源的VE(VEα)含有的氨基酸序列与图2E(表8)中列出的区段ID E.α.1：SPELNVDLAAAYIKPDEKHH AVISGSVLYN QAEKGSYSLG IFGGKAQEVA GSAEVKTVNG IRHIGLAA(SEQ ID NO：195)具有约86％至100％的相似性。可以通过特征性氨基酸残基SLGI，以粗体表示，来进一步表征VDβ。某些残基在不同fHbp的VEα之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
β祖源的VE(VEβ)含有的氨基酸序列与图2E(表8)中列出的区段ID E.β.1：TPEQNVELAS AELKADEKSH AVILGDTRYG GEEKGTYHLA LFGDRAQEIAGSATVKIREK VHEIGIAG(SEQ ID NO：262)具有约94％至100％的相似性。通过在序列中以粗体表示的特征性氨基酸残基HLAL进一步表示VEβ的特性。某些残基可能在不同fHbp的VEβ之间发生氨基酸残基的改变或删除，以下划线表示。可以通过特征性氨基酸残基HLAL，以粗体表示，来进一步表征VEβ。某些残基在不同fHbp的VEβ之间是其他的或者缺失的氨基酸残基，这些残基以下划线表示。
如上文所述，为方便和清楚起见，本申请通篇在提到非天然存在的嵌合fHbp时，所用的残基编号都是基于MC58株的fHbp氨基酸序列(多肽ID 1)的编号。此外，上文列出的各不变区段起始点的残基位置可以有1至8个残基的位移，具体情况视N-末端元件和可变区段氨基酸序列的长度而定。
fHbp模块群
可以依据如图1A-1G(表7)和图10A-10I(表9)所示的模块架构描述天然存在的fHbp氨基酸序列，该模块架构基于两侧为不变区段的α或β祖源区段的组合。如下文实施例所述，天然存在的fHbp为模块区段的特定组合，可以将其相应地归类至图8所示的9种模块群类型，其中灰色的可变区段对应于α祖源序列，白色的区段对应于β祖源序列。
I型模块群由可变区段表征，其全部衍生自α祖源氨基酸序列。归类至I型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：I1-Nte-I2-VAα-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDα-I6-VEα-I7。属于I型模块群的一个示例的fHbp是来自MC58菌株的多肽ID 1。如上文所述，多肽ID来自于Neisseria.org的H因子结合蛋白的数据库。
II型模块群由可变区段表征，其全部衍生自β祖源氨基酸序列。归类至II型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：I1-Nte-I2-VAβ-I3-VBβ-I4-VCβ-I5-VDβ-I6-VEβ-I7。属于II型模块群的一个示例的fHbp是来自M1239菌株的多肽ID 28。在图1A-1G(表7)中，有将近60％的fHbp属于I型或II型模块群。
然而，某些fHbp同时具有α和β祖源可变区段。含有衍生自两种祖源的可变区段的一种模块群是III型，其中可变区段VA和VB衍生自α祖源，其余的可变区段来自β祖源。归类至III型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：I1-Nte-I2-VAα-I3-VBα-I4-VCβ-I5-VDβ-I6-VEβ-I7。属于III型模块群的一个示例的fHbp是来自RM1090菌株的多肽ID 22。
含有衍生自两种祖源的可变区段的另外一个模块群是IV型。IV型模块群的可变区段VA衍生自β祖源，其余的可变区段来自α祖源。归类至IV型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：I1-Nte-I2-VAβ-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDα-I6-VEα-I7。属于IV型模块群的一个示例的fHbp是来自NM452菌株的多肽ID 15。
另一个模块群为V型，其中可变区段VD衍生自α祖源，其余的可变区段来自β祖源。归类至V型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：
I1-Nte-I2-VAβ-I3-VBβ-I4-VCβ-I5-VDα-I6-VEβ-I7。属于V型模块群的一个示例的fHbp是来自S3032菌株的多肽ID79。
图8中列出的另一个模块群为VI型，其中可变区段VC和VE衍生自β祖源，其余的可变区段来自α祖源。归类至VI型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：
I1-Nte-I2-VAα-I3-VBα-I4-VCβ-I5-VDα-I6-VEβ-I7。属于VI型模块群的一个示例的fHbp是来自961-5945菌株的多肽ID 16。
图8中列出的另外一个模块群为VII型，其中可变区段VE衍生自β祖源，其余的可变区段来自α祖源。归类至VII型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：
I1-Nte-I2-VAα-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDα-I6-VEβ-I7。属于VII型模块群的一个示例的fHbp是来自0167/03菌株的多肽ID 207。
图8中列出的另一个模块群为VIII型，其中可变区段VB衍生自α祖源，其余的可变区段来自β祖源。归类至VI型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：
I1-Nte-I2-VAβ-I3-VBα-I4-VCβ-I5-VDβ-I6-VEβ-I7。属于VIII型模块群的一个示例的fHbp是来自MA-5756菌株的多肽ID 67。
图8中列出的最后一个模块群为IX型，其中可变区段VB和VD衍生自α祖源，其余的可变区段来自β祖源。归类至VI型模块群的fHbp可以通过以下公式表示：
I1-Nte-I2-VAβ-I3-VBα-I4-VCβ-I5-VDα-I6-VEβ-I7。属于IX型模块群的一个示例的fHbp是来自19498菌株的多肽ID 175。
本发明分析的独特的fHbp氨基酸序列中，有98％以上属于上文所述的前六种类型的模块群(I、II、III、IV、V和VI)之一，其示意图见图8。在图8示意图的右侧还列出了在每个模块群中独特的fHbp的数目。
有四个天然存在的fHbp与此命名法之间存在至少微小的偏差，其并非精确地符合图8、A图中列出的前六种模块群类型。这四个fHbp在如上所述的典范的可变区段内的某个残基处，由一个祖源氨基酸序列“转变”成了另一个祖源序列。因此，它们均包含一个异源可变区段，其连接点不同于上文定义的fHbp中I3、I4、I5或I6的连接点。这四个fHbp的模块架构参见图8、B图，各连接点以箭头指出。然而，这四个天然存在的fHbp的连接点仍位于可变区段内的保守残基中。参见图8、C图中的表格。
一个此类fHbp是衍生自CDC-1573菌株的天然存在的fHbp(多肽ID 55)，其中由VAβ转变成了VAα的连接点位于VA的中间。多肽ID 55的异源VA可以表示为VA(β→α)，表明可变区段A含有的β祖源氨基酸序列从N-末端起始，向C-末端转变成α祖源氨基酸序列。多肽ID 55的连接点(J1)位于序列AQGAE(SEQ ID NO：278)中，该序列在所有VA序列中都是保守的，起始于残基位点50。另有两个fHbp包含的连接点不在I3、I4、I5或I6的残基位点，它们是多肽ID 24和多肽ID 25，分别衍生自M08 240117菌株和6275菌株。由VBα转变成了VBβ的连接点(J2)位于VB的中间(残基82)，其中有一个氨基酸序列IEV在所有VB中都是保守的。多肽ID 24和25的VB可以表示为VB(α→β)。最后，来自MD1475菌株的多肽ID 82在残基A196(J3)处由VEα转变成了VEβ，该位点在所有VE中都是保守的。多肽ID 82的可变区段E可以表示为VE(α→β)。
如下文中将要详细讨论的那样，可以采用本模块架构中的不变和可变区段构建嵌合fHbp，以生产自然界中不存在的氨基酸序列。
编码fHbp区段的核酸
本发明所述嵌合fHbp的区段可以衍生自任意适宜的脑膜炎奈瑟球菌菌株的fHbp多肽及其编码核酸。本领域公知，根据与多克隆(Frasch，C.E.and Chapman，1973，J.Infect.Dis.127：149-154)或单克隆抗体相互反应的表面抗原不同，将脑膜炎奈瑟球菌菌株分为血清群(荚膜群)、血清型(PorB表型)和血清亚型(PorA表型)。以往是根据荚膜多糖的可检测的免疫学差异来进行荚膜分群，但该检测方法正在被取代为用PCR检测编码特定酶的基因，这些酶负责不同结构的荚膜多糖的生物合成。已知约有12种荚膜群(包括A、B、C、X、Y、Z、29-E和W-135)。荚膜群A、B、C、Y和W-135的菌株可导致几乎所有的脑膜炎球菌疾病。以往是用单克隆抗体来确定被称为通道蛋白B(PorB)的外膜蛋白的抗原性差异，并据此进行血清型分型。目前已知约有21种由抗体确定的血清型(Sacchi et al.，1998，Clin.Diag.Lab.Immunol.5：348)。可用抗体来确定被称为通道蛋白A(ProA)的外膜蛋白的抗原性差异，并据此进行血清亚型分型。血清型的分型和血清亚型的分型正在被取代为通过PCR和/或DNA测序来鉴定编码与mAb分别具有反应性的ProB和ProA的可变区基因(例如，Sacchi，Lemos et al.，同上；Urwin et al.，1998，Epidem.and Infect.120：257)。
尽管可以使用任意荚膜群的脑膜炎奈瑟球菌菌株，但是优选将荚膜群B型的脑膜炎奈瑟球菌菌株作为编码fHbp及其结构域的核酸衍生来源。
尽管说明书中提供了可以衍生出嵌合fHbp的示例fHbp的氨基酸序列，但这并非意在限制。例如，嵌合fHbp包含的氨基酸序列可以与天然存在的fHbp氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性。
本领域已知编码fHbp多肽的核酸，其可用于构建本发明所述的嵌合fHbp。示例的fHbp多肽请参见，例如，WO 2004/048404；Masignani et al.2003J Exp Med 197：789-799；Fletcher et al.Infect Immun 2004 2088-2100；Welsch et al.J Immunol 2004 172：5606-5615；和WO 99/57280。GenBank中也提供了fHbp变体和亚变体的核酸(及氨基酸序列)，其登录号为：NC_003112，基因ID：904318(NCBI Ref.NP_274866)，来自脑膜炎奈瑟球菌MC58菌株的多肽ID 1；AY548371(AAT01290.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌CU385菌株)；AY548370(AAT01289.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌H44/76菌株)；AY548377(AAS56920.1)，来自脑膜炎奈瑟球菌M4105菌株的多肽ID 4；AY548376(AAS56919.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌M1390菌株)；AY548375(AAS56918.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌NZ98/254菌株)；AY548374(AAS56917.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌M6190菌株)；AY548373(AAS56916.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌4243菌株)；和AY548372(AAS56915.1)(来自脑膜炎奈瑟球菌BZ83菌株)。
为找到在本发明所述的嵌合fHbp中可用的相关氨基酸序列，应注意未成熟的fHbp蛋白包括约19个残基的前导序列。此外，当提供了一个氨基酸序列时，本领域技术人员能很容易想到能够编码出具有该氨基酸序列多肽的核酸序列，并提供该多肽的表达。
除了本发明提供的特定氨基酸序列和核酸序列以外，本发明还涵盖了与所述氨基酸和核酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％相似性的多肽和核酸序列。当在两个或多个多核苷酸序列的上下文中时，或在两个或多个氨基酸序列的上下文中时，术语“相同”或百分比“相似性”是指当在指定区域范围内比较和按最大对应度比对时，两种或多种序列或子序列相同或有特定百分比的氨基酸残基或核苷酸相同(例如，在特定区域内至少80％，至少85％，至少90％或至少95％相同)，指定区域例如，在VE或长度至少约为40、45、50、55、60、65或以上的氨基酸或核苷酸中，也可以是对照氨基酸或核苷酸的全长序列(例如，全长fHbp)。本发明特别包括天然存在的多种型以及合成的氨基酸序列及其编码核酸。
在进行序列比较时，通常将一个序列作为对照序列(例如，天然存在的fHbp多肽序列)，再将待测序列与之比较。当使用序列比较算法时，将待测和对照序列输入计算机程序，如有必要，设定序列坐标，以及设定序列算法程序的参数。随后，序列比较算法将根据设定的程序参数计算待测序列与对照序列的序列相似性的百分比。
适于确定序列相似性百分比的算法例如，BLAST和BLAST 2.0算法，对其的描述分别参见Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-410和Altschul et al.(1977)Nucleic AcidsRes.25：3389-3402。公众可以从美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nlm.nih.gov)获得进行BLAST分析的软件。进一步的示例性算法包括ClustalW(Higgins D.，et al.(1994)Nucleic Acids Res 22：4673-4680)，其可以从www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html获得。
在一种实施方式中，不相同的残基部位之间的区别是保守性氨基酸替代。保守性氨基酸替代指具有相似侧链的残基的互换。例如，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族-羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有包含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱基侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；以及具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。
两个核酸之间的序列相似性也可以利用两个分子之间在严格条件下的杂交情况进行描述。杂交条件选自本领域的标准方法(参见，例如，Sambrook，et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)。严格杂交条件例如，在50℃或以上以及0.1×SSC(15mM氯化钠/1.5mM柠檬酸钠)中杂交。严格杂交条件再例如，在42℃时在下述溶液中孵育过夜：50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5×Denhardt溶液、10％葡聚糖硫酸盐以及20mg/ml变性剪切的鲑鱼精子DNA，随后在约65℃条件下使用0.1×SSC洗涤滤器。严格杂交条件是指严格程度至少与上述代表性条件相同的杂交条件，其中严格程度至少约为上述特定严格条件的80％，通常至少为90％。
下面将通过上文所述的模块架构来更加详细地描述本发明所述的嵌合fHbp。
嵌合H因子结合蛋白
本发明所述的嵌合fHbp是指非天然存在的嵌合fHbp，包括的fHbp可以用如图8(A图和B图)列出的模块架构来描述，也可以用图8(A图和B图)中未列出的模块架构描述。术语“嵌合H因子结合蛋白”或“嵌合fHbp”是指一种多肽，其包含一组5个可变区段，自N-末端至C-末端表示为VA、VB、VC、VD和VE，其中的α/β祖源区段的组合和/或等位基因的组合在自然界中不存在。本发明所述的一个示例性的嵌合fHbp可以包含至少一个或多个可变区段，其衍生自不同于嵌合fHbp中存在的至少一个其他的可变区段的祖源。换言之，嵌合fHbp包含至少一个α祖源氨基酸序列的可变区段和至少一个β祖源的可变区段，而这样的组合在自然界中不存在。在另外一个例子中，fHbp也可以是如图8的A图所示的一种模块架构(如：模块I或II，其中所有的可变区段分别是α或β)，其中每个区段都是一个等位基因，使得这样的等位基因的组合在自然界中不存在。
可变区段的两侧可以是不变区段(I2、I3、I4、I5、I6、I7)，其能够作为可变区段的接头。相应地，本发明所述的嵌合fHbp可以通过以下公式描述：
VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE
其中每个可变区段(VA、VB、VC、VD和VE)可以衍生自α或β祖源氨基酸序列。
嵌合fHbp可以任选地包括一个前导序列，例如，以提供嵌合fHbp在细菌宿主细胞的细胞表面表达。嵌合fHbp还可以包括约1、5、10或更多个残基作为N-末端元件(Nte)和/或C-末端元件(Cte)。例如，Nte可以含有1、2或6个甘氨酸残基，或约6个甘氨酸和丝氨酸残基的混合物，其位于最N-末端的不变区段(I1)之后。
此外，本发明所述的嵌合fHbp任选地包括一个N-末端元件、位于N-末端元件一侧或两侧的不变区段和/或最C-末端的不变区段(I7)。可以通过以下公式描述含有一个或多个这些任选特征的嵌合fHbp：
I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE；
Nte-I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE；
I1-Nte-I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE；
VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE-I7；
I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE-I7；
Nte-I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE-I7；和
I1-Nte-I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE-I7.
其中可变区段(VA、VB、VC、VD和VE)衍生自α或β祖源氨基酸序列。
除衍生自α或β祖源氨基酸序列的各可变区段具有多种组合之外，本发明所述的嵌合fHbp还可以包含与α和β祖源氨基酸序列异源的一个或多个可变区段。异源可变区段是指包含邻接的α和邻接的β祖源氨基酸序列的可变区段，氨基酸序列“转变”为其他祖源序列的位点在本发明中被称为“连接点”。例如，参见多肽ID 55的VA、多肽ID24和ID25的VB以及多肽ID82的VE。特别是，在上文所述的多肽ID55、24、25和82的可变区段中的一个或多个连接点(J1、J2或J3)可以用于构建具有异源可变区段的嵌合fHbp。各可变区段中作为连接点的保守性残基参见图8(C图)中的表格。
本发明所述的非天然存在的嵌合fHbp的可变区段的氨基酸序列可以与天然存在的fHbp的相应区段具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％的相似性，其氨基酸序列也可以为100％相同。
嵌合fHbp的例子包括那些含有一个或多个如下示例的可变区段。各区段可以独立地选自图2A-2E、表8所示的相应区段中的任意等位基因。在下文中将以某些等位基因作为例子对可变区段进行更加详细的描述。
VA包含一个邻接的氨基酸序列，其与图2A(表8)所示的区段ID A.α.1或A.β.1(SEQID NO：15或NO：67)具有至少85％、至少90％或至少95％的相似性，例如，与图2A(表8)所示的区段A氨基酸序列中的一个具有至少85％、至少90％或至少95％的相似性。
VB包含一个邻接的氨基酸序列，其与图2B(表8)所示的区段ID B.α.1或B.β.1(SEQID NO：85或NO：95)具有至少75％、至少80％、至少90％或至少95％的相似性，例如，与图2B(表8)所示的区段B氨基酸序列中的一个具有至少75％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性。
VC包含一个邻接的氨基酸序列，其与图2C(表8)所示的区段ID C.α.1或C.β.1(SEQID NO：96或NO：152)具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性，例如，与图2C(表8)所示的区段C氨基酸序列中的一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性。
VD包含一个邻接的氨基酸序列，其与图2D(表8)所示的区段ID D.α.1或D.β.1(SEQID NO：174或NO：192)具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性，例如，与图2D(表8)所示的区段D氨基酸序列中的一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性。
VE包含一个邻接的氨基酸序列，其与图2E(表8)所示的区段ID E.α.1或E.β.1(SEQ IDNO：195或NO：262)具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性，例如，与图2E(表8)所示的区段E氨基酸序列中的一个具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的相似性。
本发明所述嵌合fHbp中的可变区段也可以与图2A-2E(表8)中所列的相应区段具有相似的长度。例如，与图2A-2E(表8)所示的相应氨基酸序列相比，可变区段少于或多于的氨基酸残基数可以不超过约50、30、20、10、5或1。
本发明所述的嵌合fHbp具有的全长氨基酸序列是天然存在的fHbp中所不具备的。大多数天然存在的fHbp仅包含α或仅包含β祖源序列，或其组合属于以下模块群之一：I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX(参见图8)。本发明所述的非天然存在的fHbp也可以是除I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX以外的模块群。本发明所述的非天然存在的fHbp可以用新型模块群描述，其包含基于本发明所述的模块架构构建的非天然存在的氨基酸序列。本发明所述的嵌合fHbp的某些例子见下文。
嵌合fHbp举例
本发明包括的那些嵌合fHbp可以根据一个或多个特征来描述，例如，不变和可变区段及其祖源类型，存在或不存在与mAb特异性结合的表位，或者可能存在于嵌合fHbp的这些特征的任意组合。
通过在不同类型模块群的多种区段中转变入和转变出α或β区段，可以获得多个组合。α或β区段的任意等位基因也可以独立地选自如图2A-2E(表8)所示的那些基因。也可以设计模块群以保留或引入某个抗体表位。已发现某些抗体对脑膜炎奈瑟球菌的某个特定变体具有杀菌作用，而对不同的变体无此作用。如果某个模块群的嵌合fHbp含有的可变区段存在多个表位，每一个表位特异性结合的杀菌抗体针对的变体不同，则该嵌合fHbp可以用于引发对广谱脑膜炎奈瑟球菌有效的抗体或免疫应答反应。例如，如果已知JAR4、JAR3和JAR32抗体的表位，并希望将其引入fHbp，则可以制备包含VAα、VCα和VDβ的嵌合fHbp，其中分别带有JAR4、JAR3和JAR32的表位。
例如，嵌合fHbp可以具有衍生自β祖源序列的VD，而其余的可变区段仍衍生自α祖源序列。这种嵌合fHbp包含的可变区段表示为VAα、VBα、VCα、VDβ和VEα；其第一个和第二个连接点分别位于I5和I6。在另一个例子中，某fHbp属于另外的模块群，其包含的非天然存在的嵌合fHbp可以包含VAα、VBα、VCα、VDβ和VEβ；其连接点残基位于I5。在又一个例子中，模块群包含非天然存在的fHbp，其包含VAα、VBα、VCα、VDα和VEβ作为不变区段。
相应地，包括上文所述的非天然存在的嵌合fHbp的例子可以是但不限于用下述公式描述的模块群：
VAα-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDβ-I6-VEα；
VAα-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDβ-I6-VEβ；
VAα-I3-VBα-I5-VCα-I5-VDα-I6-VEβ；
VAα-I3-VBα-I4-VCβ-I5-VD-I6-VEα；
VAα-I3-VBβ-I4-VC-I5-VD-I6-VE；
VAβ-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDα-I6-VEβ；
VAβ-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDβ-I6-VEα；
VAβ-I3-VBα-I4-VCβ-I5-VD-I6-VE；
VAβ-I3-VBβ-I4-VCβ-I5-VDα-I6-VEα；或
VAβ-I3-VBβ-I4-VCβ-I5-VDβ-I6-VEα；
在上文所述的群中，可变区段(VA、VB、VC、VD或VE)的后面未带有α或β时(例如，从上数第5个模块群中的VC、VD或VE)表示该可变区段可以衍生自α或β祖源氨基酸序列。此公式还可以包括一个可变的N-末端元件，其两侧为不变序列(I1和I2)或最C-末端的不变区段(I7)，这些内容在上述公式中被省略。如上文中对本发明的fHbp所述的那样，上述公式中描述的fHbp的各可变区段可以为任意等位基因。
在另外一个例子中，本发明所述的嵌合fHbp还包括其所含区段均为α或均为β的情形，其中各区段具有适当的等位基因使得所有α或所有β等位基因区段的组合在自然界中不存在。
包含异源可变区段的嵌合fHbp
在某些情况下，本发明所述的非天然存在的fHbp可以包括一个或多个异源可变区段。这些含有异源可变区段的fHbp还可以通过不同于图8(A图)所列的模块架构来描述。因此，例如，本发明所述的非天然存在的fHbp包括：具有一个异源VA(β→α)，但VB、VC、VD和VE均不具有α祖源序列；具有一个异源VB(α→β)，但VA不具有α祖源序列且VC、VD和VE均不具有β祖源序列；以及具有一个异源VE(α→β)，但VA、VB和VC均不具有β祖源序列且VD不具有α祖源序列。非天然存在的fHbp举例参见下文中的若干例子，其均包含一个异源可变区段。然而，非天然存在的fHbp并不仅限于这些例子，例如，一个fHbp可以包含一个以上的异源可变区段。
例如，含有异源可变区段的fHbp可以包含一个异源VA，如VA(β→α)，以多肽ID 55为例，其中并非所有的VB、VC、VD和VE均为α祖源氨基酸序列。一个非天然存在的fHbp还可以包括VA(α→β)，其VB、VC、VD和VE独立地选自α和β。另外一个示例性的非天然存在的fHbp可以包括VB(α→β)，以多肽ID 24为例，其中VA为α祖源序列且并非所有的VC、VD和VE均为β祖源氨基酸序列。一个非天然存在的fHbp可以包括VB(α→β)，其中VA为β祖源序列。一个非天然存在的fHbp可以包括VB(β→α)，其VA、VC、VD和VE独立地选自α和β。此外，一个非天然存在的fHbp可以包括一个异源VE，如VE(α→β)，见多肽ID 82，以及VDα，且并非所有的VA、VB、VC均为β祖源来源。一个非天然存在的fHbp可以包括VE(α→β)及VDβ，其VA、VB和VC独立地选自α和β。另外一个包含异源可变区段的非天然存在的fHbp的例子包括VE(β→α)，其VA、VB、VC和VD独立地选自α和β。
具有修饰表位的嵌合fHbp
本发明所述的嵌合fHbp可以包含一个或多个可变区段，其中的一个或多个残基可以相对于天然存在的fHbp的氨基酸序列发生突变，以获得感兴趣的表位。此处所述的这些表位指“异源表位”，因为其相对于所处的可变区段来说是异源的。通过定点突变，可以将一个或多个感兴趣的特异性抗体的异源表位引入到天然状态下不包含此表位的可变区段中。因此，可以通过突变来插入、删除或替代一个或多个氨基酸残基，以创造本发明所述的嵌合fHbp。还可以筛选多种突变体，以获得能够有效作为疫苗或具有免疫原性可以引发杀菌性抗体的fHbp。
例如，fHbp可以包含一个与抗体JAR13结合的表位，其通常存在于具有β祖源序列而非α祖源序列的VE中。为生产包含VEα且同时含有JAR13表位的fHbp，可以在VEα序列中引入该表位。通过选择性突变，可以允许VE氨基酸序列中除JAR13表位的特定位点以外的序列衍生自α祖源型。这样，无论采用何种氨基酸序列衍生嵌合fHbp的可变区序列，均可将表位引入相应的可变区，以引入或保留希望产生抗原性的区域。
嵌合fHbp还包括含有能够引发抗体的两个或多个表位的嵌合fHbp，当抗体与其各自的表位结合时，所引发的对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌活性比仅有一个抗体结合时更强。例如，在人补体介导的实验中，JAR 4和JAR 5单克隆抗体合用时产生的对脑膜炎奈瑟球菌的杀菌活性高于其各自单独使用时产生的活性。可以设计嵌合fHbp，以确保这样的表位得以保留或者引入这种表位的组合。还可以设计嵌合fHbp，以引入引发抗体的表位，当所述抗体与fHbp结合时，可抑制其与fH结合。例如，当与单克隆抗体JAR3、JAR 5、JAR11或JAR32/35结合的表位与抗体结合时，将会抑制fHbp与fH的结合。因此，在嵌合fHbp多肽中存在的这种fH-结合表位可以产生通过这条途径促进保护的抗体。
WO 09/114485公开的抗体所结合的表位可能值得在嵌合fHbp的区段中引入或保留，其公开的内容在此整体参考并入。某些优选的抗原及其相应JAR mAb参见下表1，在图9(C图)中也有指示。
表1.抗体及其相应的表位。
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优选的其他特性
本发明所述的嵌合多肽可以包括其他的异源氨基酸序列，例如，以提供通过在细菌宿主细胞(例如，E.coli)中表达而产生的N-末端甲硫氨酸或其衍生物(例如，焦谷氨酸)和/或提供一个在其N-末端或C-末端带有融合伴侣的嵌合多肽。优选的融合伴侣包括，例如，谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、His6-标签等，以及其他蛋白特别是脂蛋白的前导多肽。融合伴侣还可提供其他特性，例如便于嵌合多肽的分离和纯化。
天然存在的fHbp通常包含N-末端半胱氨酸，其上可以共价连接脂基团。在天然存在的蛋白中，该半胱氨酸残基通常被脂化，且在本发明所述的嵌合fHbp中其可以被脂化。因此，在本发明所述的氨基酸序列中(包括各序列表中的)，当此位点为“半胱氨酸”或“C”时，其特别地包括未经修饰的半胱氨酸和脂化的半胱氨酸(例如，经翻译后修饰)这两种情况。因此，嵌合fHbp可以是被脂化的，或者是未被脂化的。在体外(参见，例如，Anderssonet al.，2001 J.Immunological Methods 255(1-2)：135-48)或体内生产脂化蛋白的方法为本领域的公知常识。例如，已利用去垢剂从E.coli蛋白的膜组分中纯化得到了脂化fHbp(Fletcher etal.，2004 Infection and Immunity72(4)：2088-100)，该方法可以适用于生产脂化的嵌合fHbp。优选这种脂化蛋白，因为它比可溶性蛋白具有更高的免疫原性(参见，例如，Fletcher et al.，2004 Infection and Immunity 72(4)：2088-100)。
编码嵌合fHBP的核酸
嵌合fHbp的制备可以采用重组技术，操纵本领域已知的不同fHbp的核酸以提供编码感兴趣的嵌合fHbp的构建子。如上文所述，编码脑膜炎奈瑟球菌的不同v.1、v.2和v.3fHbp的多种核酸在本领域均可获得，且它们的核酸序列都是已知的。
天然存在fHbp的氨基酸和核酸序列参见图2A-2E(表5)，其在本领域均可获得。可以理解，可以对编码嵌合fHbp的核苷酸序列进行修饰，以优化其采用的密码子，从而有利于其在感兴趣的宿主细胞中表达(例如，E.coli、脑膜炎奈瑟球菌和人(在基于DNA的疫苗的情况时)等)。生产密码子优化序列的方法为本领域的公知常识。
筛选方法
本发明还公开了方法，用于筛选含有嵌合fHbp的免疫原性组合物、针对细菌病原体的疫苗、抗体及其编码核酸。该方法可以包括评估特定嵌合fHbp引发杀菌性抗体和/或针对细菌性病原体提供广谱免疫性的能力。该方法可以包括，评估经本发明所述嵌合fHbp免疫所引发的抗体抑制fH与脑膜炎奈瑟球菌多种变体群的fHbp结合的能力和/或引发杀菌活性的能力。用含有本发明所述嵌合fHbp的免疫原性组合物免疫宿主动物后可以引发抗体，或者也可以利用抗体与候选嵌合fHbp的特异性亲和力在噬菌体展示文库中筛选所述抗体。在其他方面，这些方法还可以用于鉴定和/或评估具有杀菌和/或抗肿瘤活性的抗体。
在一个实施例中，提供了一种抗体与细菌细胞结合的评估方法。该方法包括：(a)使用含有本发明所述的嵌合fHbp的组合物免疫宿主动物，(b)从宿主动物中分离与嵌合fHbp具有结合亲和力的抗体，(c)用分离得到的抗体接触细菌细胞；和(d)评估抗体与细菌细胞的结合。其他步骤可以包括，评估抗体与人H因子对fHbp的竞争结合；评估当在体外与补体共同孵育时，针对细菌性病原体的杀菌活性；或评估抗体在给予动物后，所提供的对感染的被动保护。在某些实施例中，抗体处于抗体群中，该方法进一步包括：(c)从抗体群中分离一种或多种与细菌细胞结合的抗体。另一方面，涉及对细菌细胞具有杀菌作用的分离的抗体，其可以包括，例如，使人血液中的细菌活力下降的补体介导的杀菌活性和/或噬菌细胞活性。该方法还可以包括对给予了包含嵌合fHbp疫苗的宿主动物评估其对细菌性病原体的易感性。
特别优选的细菌性病原体为任意或全部fHbp变体群的，具有多种荚膜群的脑膜炎奈瑟球菌，如脑膜炎奈瑟球菌血清B群、脑膜炎奈瑟球菌血清C群、脑膜炎奈瑟球菌血清X群、脑膜炎奈瑟球菌血清群Y和脑膜炎奈瑟球菌血清W-135群等。
生产方法
可以采用任意适当的方法生产嵌合fHbp，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)。当采用重组技术生产嵌合fHbp时，该方法可以包括任意适当的构建子和任意适当的宿主细胞，其可以是原核细胞或真核细胞，常用的是细菌或酵母细胞，更加常用的是细菌细胞。将遗传物质引入宿主细胞的方法包括，例如，转化、电穿孔、偶联和磷酸钙法等。可以选择转移的方法，以使得被导入的嵌合fHbp的编码核酸得到稳定表达。可以通过可遗传的游离体元件(例如，质粒)提供嵌合fHbp的编码核酸，或将其整合至基因组。
在组合物中，用于转移嵌合fHbp的编码核酸的适宜载体可以不同。整合型载体可以是条件性复制或是自杀性的质粒、噬菌体等。构建子可以包括多种元件，包括例如，启动子、选择性基因标记物(例如，对抗生素(例如卡那霉素、红霉素、氯霉素或庆大霉素)具有抗性的基因)和复制起点(在宿主细胞，例如，细菌宿主细胞中启动复制)等。载体的选择取决于多种因素，如用于繁殖的细胞类型和繁殖目的。某些载体用于扩增和制备大量的目标DNA序列。其他载体适于在培养细胞中表达。还有其他载体适于在整体动物细胞中转移和表达。选择适宜的载体属于本领域公知的技术。很多此类载体可以购买获得。
载体可以是基于附加型质粒的表达载体，其含有可选择的药物抗性标记，以及使其能在不同宿主细胞中(例如，大肠杆菌和脑膜炎奈瑟球菌)自我复制的元件。这种“穿梭载体”的一个实例是质粒pFP10(Pagotto et al.Gene 2000 244：13-19)。
构建子的制备可以通过，例如，将感兴趣的多核苷酸插入到构建子的骨架中，一般通过采用DNA连接酶将其连接到载体中的限制性酶切位点。或者，可通过同源重组或定点重组的方法来插入所需的核苷酸序列。通常通过在所需核苷酸序列的两侧连接同源区域来完成同源重组，通过采用能促进定点重组的序列(例如，cre-lox，att位点等)来完成定点重组。含有这些序列的核酸的添加可以通过，例如连接寡核苷酸，或使用同时包含同源区域和一部分所需核苷酸序列的引物进行聚合酶链反应。
载体可在宿主细胞中保持处于染色体外，或可整合到宿主细胞基因组中。本领域技术人员公知的大量出版物中详细描述了载体，包括，例如，Short Protocols in MolecularBiology，(1999)F.Ausubel，et al.，eds.，Wiley & Sons。载体可表达编码嵌合fHBP的核酸，可扩增所述核酸对象，或二者都可以。
可采用的载体的示例包括但不限于，衍生自重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA的载体。例如，可采用质粒载体如pBR322、pUC 19/18、pUC 118、119和M13mp系列载体。pET21也是可采用的表达载体。噬菌体载体可包括λgt10、λgt11、λgt18-23、λZAP/R和EMBL系列噬菌体载体。可利用的其他载体包括但不限于，pJB8、pCV 103、pCV 107、pCV 108、pTM、pMCS、pNNL、pHSG274、COS202、COS203、pWE15、pWE16和卡隆粒9系列载体。
可采用表达框来表达感兴趣的嵌合fHbp。因此，本发明提供了含有核酸对象的重组表达载体。所述表达载体提供转录和翻译调控序列，并可提供诱导型或组成型表达，其中通过操作性连接，使编码区置于转录起始区、转录和翻译终止区的转录控制下。这些控制区可以是嵌合fHbp所衍生自的fHbp天然具有的，或者也可衍生自外源序列。通常，所述转录和翻译调控序列可包括但不限于，启动子序列、核糖体结合序列、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活物序列。启动子可以是组成型或诱导型，并可以是强组成型启动子(例如，T7等)。
表达载体通常在启动子序列附近具有便利的限制性位点，以便插入编码感兴趣蛋白质的核酸序列。载体可以带有对表达宿主可操作的选择性标记，以助于筛选含有所述载体的细胞。此外，所述表达构建体可包含其他元件。例如，所述表达载体可具有一个或两个复制系统，使其既能保持在用于表达的生物中，例如哺乳动物或昆虫细胞中，也能保持在用于克隆和扩增的原核宿主中。此外，所述表达构建子可包含选择性标记基因，以允许对转化的宿主细胞进行筛选。选择基因是本领域的公知常识，因采用的宿主细胞不同而可能不同。
应注意，本发明所述的嵌合fHbp可包含其他元件，如可检测标记，例如，放射性标记、荧光标记、生物素标记和免疫可检测标记(例如，HA标签、多组氨酸标签)等。可提供嵌合fHbp的其他元件(例如，生物素标签、免疫可检测标签)以便于通过多种方法(例如，亲和捕获等)进行分离。嵌合fHbp可以任选地通过共价或非共价连接而固定在支持物上。
可根据本领域已知的方法完成对嵌合fHbp的分离和纯化。例如，可以通过免疫亲和纯化从经遗传修饰从而表达嵌合fHbp的细胞裂解产物中或合成反应混合物中分离嵌合fHbp，其通常包括：使所述样品接触抗嵌合fHbp的抗体(例如，抗嵌合fHbp mAb，如JAR5mAb或本发明所述的其他适宜的JAR mAb)，洗涤以除去非特异性结合的材料，洗脱特异性结合的嵌合fHbp。可通过透析和其他通常用于蛋白质纯化的方法来进一步纯化分离的嵌合fHbp。在一个实施例中，可以采用金属螯合色谱法分离嵌合fHbp。
宿主细胞
多种适宜的宿主细胞均可用于生产嵌合fHbp。一般情况下，可以在原核细胞或真核细胞中采用常规技术表达本发明所述的嵌合fHbp，常用的是细菌，更加常用的是大肠杆菌或奈瑟菌属(例如，脑膜炎奈瑟球菌)。因此，本发明进一步公开了一种经过基因修饰的宿主细胞，其包含编码嵌合fHBP的核酸。可以从多种可选用的宿主细胞中选择任意一种宿主细胞用于生产(包括大规模生产)嵌合fHBP。用于表达的宿主细胞的例子包括原核或真核单细胞生物，如细菌(例如，大肠杆菌菌株)、酵母(例如，酿酒酵母、毕赤酵母等)以及可以包括来源于更高等生物如昆虫、脊椎动物，特别是哺乳动物(例如，CHO、HEK等)的宿主细胞。通常在嵌合fHbp的生产中优选细菌宿主细胞和酵母。
嵌合fHbp可以被制成基本上纯化或基本上分离的形式(即，基本上不含其他奈瑟菌属或宿主细胞多肽)或基本上分离的形式。在某些实施方式中，在组合物中，嵌合fHbp相对于组合物中可能存在的其他成分而言(例如，其他多肽或其他宿主细胞成分)更加富集。可以提供纯化的嵌合fHbp，使得在组合物中存在的所述多肽基本上不含有其他分离的多肽，例如，90％以下、通常为60％以下和更加通常为50％以下的所述组合物由其他表达的多肽组成。
用于生产囊泡的宿主细胞
当在膜囊泡中提供嵌合fHbp时(将在下文中详细讨论)，将对奈瑟菌属宿主细胞进行遗传修饰以表达嵌合fHbp。可以对多种奈瑟菌属菌株的任意一种进行修饰以产生嵌合fHbp，以及任选地，在本发明所述的方法中可以使用产生，或经修饰后产生，其他感兴趣的抗原如PorA，的奈瑟菌属菌株。
对奈瑟菌属菌株进行遗传修饰以及表达所需多肽的方法和载体均为本领域的公知常识。载体和方法的例子请参见WO 02/09746和O’Dwyer et al.Infect Immun2004；72：6511-80。优选强启动子，特别是强组成型启动子。启动子的例子包括，porA、porB、lbpB、tbpB、p110、hpuAB、lgtF、opa、p110、lst、hpuAB和rmp的启动子。
在膜囊泡生产中优选使用致病性奈瑟菌属菌株或衍生自致病性奈瑟菌属的菌株，特别是对人具有致病性的菌株或衍生自对人具有致病性或共生性的菌株。奈瑟菌属的例子包括，脑膜炎奈瑟球菌、金黄奈瑟球菌、淋病奈瑟球菌、乳酸奈瑟球菌、多糖奈瑟球菌、灰色奈瑟球菌、粘膜奈瑟球菌、浅黄奈瑟球菌、干燥奈瑟球菌和长形奈瑟球菌等。
优选对脑膜炎奈瑟球菌菌株进行遗传修饰以表达嵌合fHbp，和用于生产囊泡。可以根据所需的一系列不同特性选择用于囊泡生产的菌株。例如，可以根据以下方面选择菌株：所需PorA的类型(“血清亚型”，如上文所述)、荚膜群、血清型等；减少荚膜多糖的产生等。例如，生产菌株可以产生任意所需的PorA多肽，以及可以表达一种或多种PorA多肽(天然的或经遗传工程改造的)。示例性菌株包括，产生赋予血清亚型P1.7，16；P1.19，15；P1.7，1；P1.5，2；P1.22a，14；P1.14；P1.5，10；P1.7，4；P1.12，13的PorA多肽的菌株；以及产生这些PorA多肽变体的菌株，所述变体与在血清亚型分型中所用的常规血清学试剂具有或不具有反应性。还优选根据porA可变区(VR)分型来表征的PorA多肽(参见，例如，Russell et al.EmergingInfect Dis 2004 10：674-678；Sacchi CT，et al，Clin Diagn Lab Immunol 1998；5：845-55；Sacchi etal，J.Infect Dis 2000；182：1169-1176)。已鉴定出了多种不同的VR型，这些类型可分为VR1和VR2家族“原型”。在neisseria.org/nm/typing/pora上的网络可访问的数据库中描述了此命名法及其与以前的分型方案之间的关系。PorA VR1和VR2型比对的示例，请参见Russell etal.Emerging Infect Dis 2004 10：674-678。
另外或此外，生产菌株可以是荚膜缺陷型菌株。荚膜缺陷型菌株可以提供基于囊泡的疫苗，当该疫苗给药于对象时，能降低在该对象体内引发显著自身抗体应答的风险(例如，因为产生了能与宿主细胞表面的唾液酸交叉反应的抗体)。本申请所用的“荚膜缺陷”或“缺乏荚膜多糖”是指，细菌表面的荚膜多糖水平低于天然存在的菌株，或者当菌株是经遗传修饰时，细菌表面的荚膜多糖水平低于衍生该荚膜缺陷型菌株的亲代菌株。荚膜缺陷型菌株包括表面荚膜多糖产生降低至少10％、20％、25％、30％、40％、50％、60％、75％、80％、85％、90％或以上的菌株，也包括细菌表面检测不到荚膜多糖(例如，通过抗荚膜多糖抗体的全细胞ELISA检测)的菌株。
荚膜缺陷型菌株包括因天然存在或重组产生的遗传修饰而缺乏荚膜的那些菌株。天然存在的荚膜缺陷型菌株(参见，例如，Dolan-Livengood et al.J.Infect.Dis.(2003)187(10)：1616-28)，以及鉴定和/或产生荚膜缺陷型菌株的方法(参见，例如，Fisseha et al.(2005)Infect.Immun.73(7)：4070-4080；Stephens et al.(1991)Infect Immun 59(11)：4097-102；Frosch et al.(1990)Mol Microbiol.19904(7)：1215-1218)均为本领域的公知常识。
为降低荚膜多糖的产生而对奈瑟菌属宿主细胞进行的修饰可以包括，修饰参与荚膜合成的一个或多个基因，其中与修饰前的亲代细胞相比，所述修饰能降低荚膜多糖的水平。这种遗传修饰包括改变一个或多个荚膜生物合成基因的核苷酸和/或氨基酸序列，使得该菌株成为荚膜缺陷型(例如，因为在一个或多个荚膜生物合成基因中有一个或多个插入、缺失、替代等)。荚膜缺陷型菌株的一个或多个荚膜基因可以缺失或无功能。
优选唾液酸生物合成有缺陷的菌株。用这种菌株生产的囊泡在引发与人唾液酸抗原起交叉反应的抗-唾液酸抗体的产生方面具有更低的风险，还可进一步提高生产安全性。唾液酸生物合成有缺陷的(因天然产生的修饰或工程改造的修饰)菌株可以在唾液酸生物合成途径中的多种不同基因中的任何一种有缺陷。优选的菌株在N-乙酰葡糖胺-6-磷酸2-差向异构酶基因(称为synX AAF40537.1或siaAAAA20475)编码的基因产物中有缺陷，特别优选该基因灭活的菌株。例如，在一种实施方式中，通过破坏功能性synX基因产物的产生来获得荚膜缺陷型菌株(参见，例如，Swartley et al.(1994)J Bacteriol.176(5)：1530-4)。
也可采用非重组技术从天然存在的菌株中获得荚膜缺陷型菌株，例如用杀菌性抗-荚膜抗体来筛选荚膜多糖减少的菌株。
当本发明涉及采用两种或两种以上菌株时(例如，为产生含有来自不同菌株的嵌合fHbp囊泡的抗原性组合物)，可选择在一种或多种菌株特性上有所不同的菌株，例如，以提供使用不同嵌合fHbp(PorA等)的囊泡。
囊泡的制备
本发明所述的抗原性组合物通常包括由表达嵌合fHbp的奈瑟菌属细胞制备的囊泡。本文所述的“囊泡”包括外膜囊泡以及微囊泡(也称为细胞泡)。
抗原性组合物可以包含外膜囊泡(OMV)，其由经遗传修饰而表达嵌合fHbp的脑膜炎奈瑟球菌属培养菌株的外膜制备得到。可通过在培养液或固体培养基中培养的脑膜炎奈瑟球菌获得OMV，优选地，通过从培养基中分离细菌细胞(例如，通过过滤或低速离心来沉淀细胞等)，裂解细胞(例如，通过加入去垢剂、渗透休克、超声波处理、空腔化、匀浆等)，将外膜组分与细胞质分子分离开(例如，通过过滤；或通过差别性沉淀或使外膜和/或外膜囊泡凝聚；或通过利用能特异性识别外膜分子的配体进行亲和分离；或通过高速离心来沉淀外膜和/或外膜囊泡等)，利用外膜组分制备OMV。
抗原性组合物包含含有嵌合fHbp的微囊泡(MV)(或“细胞泡”)，其中经遗传修饰表达嵌合fHbp的脑膜炎奈瑟球菌菌株在培养期间释放出MV或细胞泡。例如，可通过以下步骤获得MV：将脑膜炎奈瑟球菌培养在液体培养基中，从液体培养基中分离完整的细胞(例如，通过过滤或低速离心从而只沉淀细胞但不沉淀较小的细胞泡等)、然后收集不含细胞的培养基中的MV(例如，通过过滤，差别性沉淀或使MV凝聚，或通过高速离心来沉淀细胞泡等)。通常可以根据培养基中产生的细胞泡含量来选择用于制备MV的菌株(例如，可培养适当数量的细菌来制备细胞泡，所述细胞泡可在本申请所述方法中用于分离和给药)。PCT公开号WO01/34642描述了能产生高水平细胞泡的示例性菌株。除了根据细胞泡产量以外，也可根据NspA产量选择用于MV制备的菌株，优选能产生较高水平NspA的菌株(具有不同NspA产量水平的脑膜炎奈瑟球菌的实例可参见，例如Moe et al.(1999Infect.Immun.67：5664)。用于生产细胞泡的其他优选的菌株包括，具有灭活的GN33基因的菌株，其中GN33基因编码细胞分离、膜结构和毒性所需的脂蛋白(参见，例如，Adu-Bobie et al.Infect Immun.2004；72：1914-1919)。
本发明所述的抗原性组合物含有来自一种菌株，或来自2、3、4、5或更多种菌株的囊泡，这些菌株彼此可以是同源性或异源性的，通常是异源性的。例如，菌株可以有同源性或异源性的PorA。也可以采用表达一种以上嵌合fHbp(例如，1、2、3或更多嵌合fHbp)的菌株制备囊泡，所述嵌合fHbp可以由不同变体(v.1、v.2或v.3)或亚变体(例如，v.1、v.2或v.3的亚变体)的fHbp氨基酸序列组成。
抗原性组合物可以包含呈现相同或不同嵌合fHbp的OMV和MV的混合物，其中嵌合fHbp可以任选地呈现不同fHbp变体和/或亚变体组合而成的表位，且其中OMV和/或MV可以来自相同或不同的菌株。来自不同菌株的囊泡可以混合给药或依次给药。抗原性组合物可以包含含有一种或多种不同嵌合fHbp的囊泡，其中囊泡和fHbp均衍生自相同的宿主细胞。也可以用衍生自不同宿主细胞的囊泡和fHbp制备组合物，将囊泡和fHbp分别纯化后再混合。
需要时(例如，当用于产生囊泡的菌株带有内毒素或特别高水平的内毒素时)，可任选地处理这种囊泡以减少内毒素，例如降低给药后的毒性。可用合适的去垢剂(例如，BRIJ-96、脱氧胆酸钠、月桂酰肌氨酸钠、EmpigenBB、TritonX-100、吐温20(聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯)、吐温80，浓度为0.1-10％，优选0.5-2％，以及ADS)进行提取来减少内毒素，但如下文所述其优选性欠佳。当使用去垢剂提取时，优选使用除脱氧胆酸盐以外的去垢剂。
可以不利用去垢剂制备抗原性组合物的囊泡，例如不使用脱氧胆酸盐。虽然可用去垢剂处理除去内毒素活性，但在囊泡产品制备期间提取可能去除天然fHbp脂蛋白和/或嵌合fHbp(包括脂化的嵌合fHbp)。因此，特别优选采用无需去垢剂的技术降低内毒素活性。一个方法是利用内毒素(脂多糖，LPS)产生较少的菌株，从而无需在用于人体前的最终制品中除去内毒素。例如，可以用奈瑟菌属突变株来制备囊泡，在这些突变株中的脂寡糖或在疫苗中可能有害的其他抗原(例如，Rmp)被减少或消除。
可以采用包含遗传修饰的脑膜炎奈瑟球菌菌株制备囊泡，以使得脂质A的毒性降低或无法检测到。例如，可对这些菌株的脂质A生物合成进行遗传修饰(Steeghs et al.InfectImmun 1999；67：4988-93；van der Ley et al.Infect Immun 2001；69：5981-90；Steeghs et al.JEndotoxin Res 2004；10：113-9；Fissha et al，Infect Immun 73：4070，.2005)。通过修饰LPS，例如下调和/或灭活分别编码lpxL1或lpxL2的酶，可以将免疫原性组合物脱毒。在lpxL1突变体中产生五-酰化脂质A，提示由lpxL1编码的酶在N连接3-OH C14中的GlcN II的2’位加入C12。在lpxL 2突变体中主要的脂质A种类为四-酰化物，提示由lpxL2编码的酶加入另一个C12，即，在N-连接3-OH C14中的GlcN I的2位加入。突变的结果是这些基因的表达降低(或不表达)(或这些基因的产物减少或无活性)，使得脂质A的毒性改变(van der Ley et al.2001；69：5981-90)。四-酰化(lpxL2突变体)和五-酰化(lpxL1突变体)脂质A的毒性低于野生型脂质A。脂质A4’-激酶编码基因(lpxK)的突变也能够降低脂质A的毒性。在囊泡的生产中，特别优选使用经遗传修饰使得功能性Lpx 1编码的蛋白减少或无法检测的脑膜炎奈瑟球菌(例如，MV或OMV)。与能够产生LPS的野生型脑膜炎奈瑟球菌菌株相比，此类囊泡的毒性降低，但仍能保持嵌合fHbp的免疫原性。
也可以通过在参与多粘菌素B耐药(这种耐药与脂质A的4’磷酸基上加入氨基阿拉伯糖有关)的基因/基因座中引入突变来改变LPS的毒性。这些基因/基因座可以是编码UDP-葡萄糖脱氢酶的pmrE，或参与氨基阿拉伯糖合成和转移的许多肠菌素共有的抗菌肽耐受基因的某区域。存在于该区域的基因pmrF编码多萜醇-磷酸酯甘露糖基转移酶(Gunn J.S.，Kheng，B.L.，Krueger J.，Kim K.，Guo L.，Hackett M.，Miller S.I.1998.Mol.Microbiol.27：1171-1182)。
PhoP-PhoQ调节系统中的突变，所述系统是磷酸中继两组分调节系统(例如，PhoP组成型表型，PhoPc)，或低Mg++环境或培养条件(该条件激活PhoP-PhoQ调节系统)，都可导致在4’磷酸上加入氨基阿拉伯糖和2-羟基肉豆蔻代替肉豆蔻(肉豆蔻羟基化)。该修饰的脂质A刺激人内皮细胞表达E-选择素和人单核细胞分泌TNF的能力降低。
多粘菌素B耐药菌株也适用于本发明，因为这些菌株被证明具有降低的LPS毒性(参见，例如，van der Ley et al.1994.In：Proceedings of the ninth international pathogenic Neisseriaconference.The Guildhall，Winchester，England)。或者，可将能模拟多粘菌素B结合活性的合成肽加入所述抗原性组合物以降低LPS毒性(参见，例如，Rustici etal.1993，Science259：361-365；Porro et al.Prog Clin Biol Res.1998；397：315-25)。
也可通过选择培养条件来减少内毒素。例如，将菌株培养在每升含0.1mg-100mg氨基阿拉伯糖的生长培养基中可降低脂质毒性(参见，例如，WO 02/097646)。
制剂
在本发明中，为方便起见，所述的“抗原组合物”、“抗原性组合物”或“免疫原性组合物”一般情况下均是指包含本发明所述嵌合fHbp的组合物，嵌合fHbp可以任选地被偶联以进一步增强免疫原性。本发明还包括用于在人体中引发抗体的组合物，特别是针对脑膜炎奈瑟球菌B群(NmB)的抗体。抗原性组合物可以包含2种或多种不同的嵌合fHbp，其中嵌合fHbp可以呈现来自不同fHbp变体和/或亚变体的组合得到的表位。
抗原性组合物一般包含免疫有效量的嵌合fHbp，如有需要其可进一步包含其他相容的成分。“免疫有效量”是指当对个体给药该剂量时，不论是以单一剂量给药，或是作为相同或不同的免疫原性组合物的连续剂量的一部分给药，都能够有效引发抗体应答反应，其可有效治疗或预防由例如奈瑟菌属感染导致的症状或疾病，该菌属优选是脑膜炎奈瑟球菌，更优选是脑膜炎奈瑟球菌B群。该用量根据待治疗个体的健康和身体状况、年龄、个体的免疫系统产生抗体的能力、所需的保护程度、疫苗制剂、主治医师对医疗状况的评估以及其他相关因素而不同。可预期，该用量可以在较宽的范围内变动，可以通过常规试验确定。
剂量方案可以是单剂量方案或者是在不同时间给予单位剂型免疫原性组合物的多剂量方案(例如，包括加强剂量)。本申请中所用的术语“单位剂型”指适合人和动物对象的单次剂量的物理上不连续的单位，各单位含有足以产生所需效果的预定含量的本发明抗原性组合物，提供的组合物可与药学上可接受的辅料(例如，药学上可接受的稀释剂、载体或溶剂)结合。该抗原性组合物可与其他免疫调节剂联合给药。
提供的抗原性组合物可以存在于药学上可接受的辅料中，其可以是溶液，如无菌水性溶液，通常是生理盐水溶液，或者粉末形式。如有必要，这种辅料可以基本上是惰性的。
抗原性组合物可以进一步包含佐剂。可用于人体的已知适宜佐剂的例子包括但不一定限于：明矾、磷酸铝、氢氧化铝、MF59(4.3％w/v角鲨烯、0.5％w/v吐温80TM、0.5％w/v司盘85)、含CpG的核酸(其中胞嘧啶未甲基化)、QS21、MPL、3DMPL、Aquilla提取物、ISCOMS、LT/CT突变体、聚(D，L-丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、QuilA、白介素等。对于实验动物，可使用弗氏佐剂、N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(1′-2′二-棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(CGP 19835A，称为MTP-PE)和用2％角鲨烯/吐温80乳液配制的RIBI，其含有提取自细菌的三种组分：单磷酰脂质A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。可通过检测针对免疫原性抗原或所述抗原表位产生的抗体量来测定佐剂的效力。
能够提高该组合物效力的佐剂的更多的例子包括，但不限于：(1)水包油乳剂(含有或不含其他特异性免疫刺激剂，例如胞壁酞酰(见下文)或细菌细胞壁组分)，例如(a)含5％角鲨烯、0.5％吐温80和0.5％司盘85(任选含有MTP-PE)的MF59TM(WO 90/14837；Chapter 10in Vaccine design：the subunit and adjuvant approach，eds.Powell & Newman，Plenum Press 1995)，利用微流仪配制成亚微米颗粒；(b)含10％角鲨烯、0.4％吐温80、5％普朗尼克嵌段聚合物L121和thr-MDP的SAF，利用微流化仪配制为亚微米乳液或旋振产生粒径较大的乳液，和(c)含2％角鲨烯、0.2％吐温80和一种或多种细菌细胞壁组分，例如单磷脂酰脂质A(MPL)、海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和细胞壁骨架(CWS)，优选MPL+CWS(DetoxTM)的RIBITM佐剂系统(RAS)，(Ribi Immunochem，Hamilton，Mont.)；(2)皂苷佐剂，例如QS21或StimulonTM(Cambridge Bioscience，Worcester，Mass.)或由其产生的颗粒，如ISCOM(免疫刺激复合物)，所述ISCOMS可不含其他去垢剂，例如WO 00/07621；(3)完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)；(4)细胞因子，例如白介素(例如，IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-12(WO99/44636)等)、干扰素(例如，γ干扰素)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)等；(5)单磷酰脂质A(MPL)或3-O-脱酰基MPL(3dMPL)，例如见GB-2220221、EP-A-0689454，当与肺炎球菌糖联用时任选地基本上不含明矾，例如WO 00/56358；(6)3dMPL与，例如QS21和/或水包油乳液的混合物，如EP-A-0835318、EP-A-0735898、EP-A-0761231；(7)含有CpG基序的寡核苷酸(Krieg Vaccine 2000，19，618-622；Krieg Curr opin Mol Ther2001 3：15-24；Roman et al.，Nat.Med，1997，3，849-854；Weiner et al.，PNAS USA，1997，94，10833-10837；Davis et al，J.Immunol，1998，160，810-876；Chu et al.，J.Exp.Med，1997，186，1623-1631；Lipford et al，Ear.J.Immunol.，1997，27，2340-2344；Moldoveami e/al.，Vaccine，1988，16，1216-1224，Krieg et al.，Nature，1995，374，546-549；Klinman et al.，PNAS USA，1996，93，2879-2883；Ballas et al，J.Immunol，1996，157，1840-1845；Cowdery et al，J.Immunol，1996，156，4570-4575；Halpern etal，Cell Immunol，1996，167，72-78；Yamamoto et al，Jpn.J.Cancer Res.，1988，79，866-873；Stacey et al，J.Immunol.，1996，157，2116-2122；Messina et al，J.Immunol，1991，147，1759-1764；Yi et al，J.Immunol，1996，157，4918-4925；Yi et al，J.Immunol，1996，157，5394-5402；Yi et al，J.Immunol，1998，160，4755-4761；和Yi et al，J.Immunol，1998，160，5898-5906；国际专利申请WO 96/02555、WO 98/16247、WO 98/18810、WO 98/40100、WO98/55495、WO 98/37919和WO 98/52581)，即含有至少一个CG二核苷酸，其中胞嘧啶未甲基化；(8)聚氧乙烯醚或聚氧乙烯酯，例如WO 99/52549；(9)聚氧乙烯山梨糖醇酯表面活性剂与辛苯聚醇的混合物(WO 01/21207)或聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性剂与至少一种其他非离子表面活性剂，例如辛苯聚醇的混合物(WO 01/21152)；(10)皂苷和免疫刺激性寡核苷酸(例如，CpG寡核苷酸)(WO 00/62800)；(11)免疫刺激剂和金属盐颗粒，例如WO 00/23105；(12)皂苷和水包油乳剂，例如WO 99/11241；(13)皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IM2(任选地+激素)，例如WO 98/57659；(14)用作免疫刺激剂来提高所述组合物效力的其他物质。胞壁酰肽包括N-乙酰基-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-25乙酰基-正胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(正-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基)-乙胺(MTP-PE)等。优选适用于对人给药的佐剂。
抗原组合物可以包含其他成分，例如药用级甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、滑石粉、纤维素、葡萄糖、蔗糖、碳酸镁等。该药物组合物可含有所需的药学上可接受的辅助物质来模拟生理条件，例如pH调节和缓冲剂、毒性调解剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。
制剂中的嵌合fHbp的浓度可以在较宽范围内变化(例如，以体重计，从小于约0.1％，通常是或至少是约2％到多达20％-50％或更高)，基本上按照所选择的具体给药方式和患者的需要，根据液体体积、粘度、和基于病人的因素等来选择。
含有嵌合fHBP的制剂可以制成溶液、混悬液、片剂、丸剂、胶囊、粉末、凝胶、乳膏、洗剂、软膏、气溶胶等。已知口服给药时需要保护组合物以免其被消化。一般通过将组合物制成耐酸解和酶解的制剂，或使用适当的抗性载体对组合物进行包衣来实现。对消化起保护作用的方法为本领域的公知常识。
还可以提供含有嵌合fHbp的制剂，使得在给约后延长嵌合fHBP在血清中半衰期。例如，当分离的嵌合fHbp被制成注射剂时，可以将嵌合fHbp制成脂质体制剂，制成胶体，或其他能够延长血清半衰期的传统制剂。多种方法可以用于制备脂质体，参见，例如Szoka etal.，Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9：467(1980)，U.S.Pat.Nos.4,235,871，4,501,728和4,837,028。制剂还可以制成控释或缓释制剂。
免疫接种
含有嵌合fHbp的抗原性组合物一般用于对具有获得奈瑟菌属疾病风险的人给药，以预防或至少部分阻止此疾病及其并发症的发展。足以实现此目的的用量定义为“治疗有效量”。用于治疗用途的有效量取决于，例如抗原性组合物、给药的方式、患者的体重和总体健康状况和处方医师的判断。根据患者所需和可能耐受的剂量和频率以及给药途径，可以给药单一剂量或多次剂量的该抗原组合物。
通常给予宿主有效量的含有嵌合fHbp的抗原性组合物，以引发免疫应答，特别是体液免疫应答。如上文所述，免疫接种的量可以发生改变，其通常用量范围约为1μg至100μg/70kg患者，更常见约5μg至50μg/70kg。口服、鼻部或局部给药时基本上可采用较高的给药剂量(例如，10mg至100mg或更高)。初次给药后可用相同或不同的含有嵌合fHbp的抗原性组合物进行加强免疫。通常疫苗接种至少包括一次加强，更常见地两次加强免疫。
一般情况下免疫接种可以采用任意适宜途径进行，包括口服、鼻部、鼻咽部、胃肠外、肠道、胃部、局部、透皮、皮下、肌肉内，以片剂、固体、粉末、液体、气溶胶形式，局部或全身性给予组合物，可以加入或不加入辅料。本领域技术人员已知或很容易知道制备可胃肠外给药的组合物的实际方法，更详细的描述见例如Remington′s PharmaceuticalScience，第15版，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1980)。
可以通过已知方法评估抗嵌合fHbp的免疫应答(例如，分别于免疫接种前后收集个体的血清，确定个体的免疫状况变化情况，例如通过免疫沉淀检测，或ELISA、或杀菌试验、或Western印迹、或流式细胞检测等)。
所述抗原性组合物可以给予未被免疫过脑膜炎奈瑟球菌的人体对象。在一个特定实施方式中，所述对象为约5岁或更小的儿童，优选约两岁或更小，所述抗原性组合物在任意的一个或多个以下时间给予：出生后两周、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个月，或1年或15、18或21个月，或在2岁、3岁、4岁或5岁时。
通常优选在出现首次疾病症状体征前，或在可能或实际接触感染或疾病(例如，接触或感染奈瑟苗属)时进行首次免疫接种。
ATCC保藏
生产JAR 4、JAR 5、JAR 11和JAR 32单克隆抗体的杂交瘤在下表中列出的日期时，依据布达佩斯条约的规定在美国模式培养物保藏中心(10801 University Blvd.，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC)保藏，为其指定的名称也列于下表。
Figure BPA00001449263000321
应注意，JAR 5mAb特异性结合的表位至少与JAR 3mAb特异性结合的表位重叠，JAR 32mAb特异性结合的表位至少与JAR 35mAb特异性结合的表位重叠。
此保藏是依据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其(布达佩斯条约)实施细则的规定进行的。这保证了自保藏之日起30年内，和保藏机构收到最近一次提供保藏样品的请求后至少5年内，维持被保藏物的活培养物。依据布达佩斯条约的条款，以及奥克兰儿童医院及研究中心(本申请的受让人)与ATCC之间的协议，该保藏物可通过ATCC获得，它保证了在有关美国专利授权后，保藏人对公众获取所保藏材料施加的所有限制将不可逆地撤消；保证了在有关美国专利授权后或者在任何美国或外国专利申请向公众公开后，以先发生者为准，公众可永久且不受限制的获得保藏培养物的后代，而且根据35U.S.C.§122及根据相关的局长条例(37C.F.R.§1.14，特别要提及886 OG 638)，保证了由美国专利和商标局局长批准的个人或单位将有资格获得保藏培养物的后代。
本申请的受让人已同意，若保藏材料的培养物在适合条件下培养时死亡、丢失或遭到破坏，则其将在接到通知后立即用同样培养物的另一份材料更换。提供保藏材料的可用性并不理解为提供了一个用于与任何政府机构根据其专利法所授予的权利相违背而实施本发明的许可。
实施例
应理解，本申请所述的实施例和实施方式只是为了说明目的，本领域技术人员鉴于这些实施例和实施方式可提出各种改进或变化，这些改进和变化应包括在本申请的构思和界限以及附加的权利要求书的范围内。本申请引用的所有出版物、专利和专利申请整体参考并入，用于所有目的。
材料和方法
以下方法和材料用于下述实施例中。
fHbp序列测定。用DNeasy组织试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备得到基因组DNA，通过聚合酶链式反应，用此前报道的引物A1和B2以及循环参数(Masignani et al.J Exp Med2003，197：789-99)扩增得到fHbp基因。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，并洗脱至30μl无菌去离子H2O中。利用商品化的测序仪，使用此前已报道过的引物A1和22(Masignani et al.，2003)对fHbp DNA进行测序。
数据来源。在第一项研究中分析的蛋白序列由69个fHbp基因编码，其来自美国(Beernink et al.J Infect Dis 2007，195：1472-9)、欧洲(Beernink and Granoff Infect Immun2008，76：2568-2575；Beernink et al.Infect Immun 2008，76：4232-4240)和非洲(Beernink et al.，J Infect Dis 2009，doi：10.1086/597806)的脑膜炎奈瑟球菌病例分离菌株。该数据集中包含的48个序列在我们此前进行的一部分研究中已确定，21个新序列在本研究中确定。用菌株MC58(变体1/亚家族B)和M1239(变体3/亚家族A)的fHbp的氨基酸序列，在Genbank(www.ncbi.nlm.nih.gov)上用翻译BLAST(tblastn)进行检索，获得另外95个fHbp的基因序列。在我们收集和从Genbank中得到的164个核苷酸序列中，包括3个基因组序列(Parkhillet al.Nature 2000，404：502-506；Peng et al.Genomics 2008，91：78-87；Tettelin et al.Science2000，287：1809-1815)，从中鉴定得到编码63个独特蛋白序列的fHbp基因。这63个加上其他6个来自Neisseria.orgfHbp多肽数据库(neisseria.org)的独特fHbp氨基酸序列，作为分析用的69个独特fHbp多肽。图1A-1G(表7)列出了各Genbank登陆号和/或多肽识别号以及来源菌株的特性。
在69个多肽中，有38个(55％)被归类至Masignani et al.2003所述的变体1群、15个(22％)归类至变体2群以及16个(23％)归类至变体3群。在69个来源菌株中，1个为荚膜A群、57个为B群、7个为C群、2个为W-135群和2个为X群。获得了58个菌株的多位点序列分析(MLST)信息，其中15个来自ST-269克隆复合物、12个来自ST-11、10个来自ST-41/44复合物、4个来自ST-162、5个来自ST-213复合物、3个来自ST-8和ST-32复合物。6个菌株来自其他克隆复合物，其序列类型为ST-4、ST-35、ST-751、ST-4821、ST-5403和ST-6874。未对无MLST信息的11个菌株进行检测。
在第二项研究中，数据集进一步包括了随后被加入Neisseria.org数据库的(http://neisseria.org/perl/agdbnet/agdbnet.pl？file＝nm_fhbp.xml)截至2009年11月的172个其他特征性序列。在描述242个独特蛋白时(图10A-10I，表9)，使用来自Neisseria.org网站多肽数据库的蛋白识别(ID)码。
将蛋白序列全长分析或部分分析的方法结合使用。使用设置为最高精确度的MUSCLE进行序列比对(EBI，v3.7，ebi.ac.uk/Tools/muscle/index.html)(Edgar RC.(2004)Nucleic Acids Res.32：1792-7；Edgar RC(2004)BMC Bioinform.5：113)。通过目测检查和JALVIEW程序(Water house AM et al.(2009)Bioinformatics 25：1189-91)确认比对的准确度。还比对了不变残基的区块之间的各模块变体序列。使用SplitsTree(4.0版)(Huson DH et al.，(2006)Mol Biol Evol 23：254-67)生成网络系统，采用默认参数。采用自举法(1000次重复)对分支支持进行统计检验。
进化树分析。在www.phylogeny.fr(Dereeper et al.Nucleic Acids Res 2008，36：W465-469)平台进行蛋白序列全长或部分分析，其包括以下步骤。使用设置为最高精确度的MUSCLE(v3.7)(Edgar Nucleic Acids Res 2004，32：1792-1797)进行序列比对。对包含最多3个插入或缺失位点的比对进行检查，并使用邻近的不变序列进行验证。用PhyML程序(v3.0aLRT)中采用最大可能性的方法重新构建进化树。通过自举法(100次自举重复)评估内部分支的可靠性。用MEGA4.0展示进化树(Tamura et al.MolBiol Evol 2007，24：1596-1599)。为保持一致性，将进化树确立在多肽1的基础上。采用ClustalW(Larkin etal.Bioinformatics 2007，23：2947-2948)确定可变区段各类型的序列内部和序列间的序列相似性百分比。
重组蛋白的克隆、表达和纯化。根据此前报道的方法(Masignani et al.(2003)J ExpMed 197：789-99)，将来自基因组DNA的fHbp基因进行PCR扩增以构建表达质粒。这些基因编码fHbp ID 1(模块群I)、28(群II)、22(群III)、15(群IV)、79(群V)和77(群VI)。在大肠杆菌BL21(DE3)中(Novagen，Madison，WI，US)表达C-末端用六组氨酸标记的重组fHbp，根据已在其他文献中描述的方法进行纯化(Beernink PT et al.(2008)Infect Immun76：2568-75)。
小鼠抗血清。几组5周龄的CD-1雌性小鼠(每组10只小鼠)购自Charles River(Wilmington，MD，US)。对小鼠通过腹腔注射途径(IP)进行三次疫苗免疫，每次间隔3周。每100l剂量中包含20g与弗氏佐剂(FA)混合的重组蛋白(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，US)。(首次免疫使用完全FA，后续免疫使用不完全FA)。末次免疫3周后收集最终的血液样本。动物实验的进行依据经奥克兰儿童医院及研究中心机构内动物管理和使用委员会批准的试验方案。
细菌菌株。表7和表9中总结了用于测定血清杀菌活性的脑膜炎奈瑟球菌菌株的特性。从模块群I至VI中每个选取两种分离株。对这5个模块群而言，每个配对中均有一个fHbp低表达的菌株，另一个为高表达菌株，按下文所述的方法测得。在模块群V中，仅鉴定出表达中等量fHbp的菌株，因此，将其用于检测。
补体依赖的血清杀菌抗体活性。根据已在其他文献中描述的方法进行杀菌检测，将处于早期对数期的细菌在加入了0.25％葡萄糖(w/v)和0.02mM胞嘧啶5’-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(Sigma-Aldrich，St，Louis，MO，US)的Mueller-Hinton液体培养基(BD Biosciences，Franklin Lakes，NJ，US)[11]中培养约2h。补体来源于具有正常溶血补体活性的未经免疫的健康成年人血清。将该血清通过蛋白G琼脂糖柱(HiTrap Protein G HP，GE Healthcare，Piscataway，NJ，US)以去除IgG抗体(Beernink PT et al.(2009)J Infect Dis 199：1360-8)。
fHbp的定量Western印迹。将脑膜炎奈瑟球菌在液体培养基中生长至早期对数期，热灭活(56℃条件下1小时)，离心收集，在PBS中重悬使其光密度为0.6。按照生产商的说明，使用4-12％NuPAGE凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，US)通过SDS-PAGE分离热灭活细胞(1-4x107CFU)中的蛋白，采用Western印迹模块(Invitrogen，Carlsbad CA，US)将其转移至PVDF膜(Immobilon-FL；Millipore，Billerica，MA，US)。在封闭缓冲液(Li-CorBiosciences，Lincoln，NE，US)中4℃封闭过夜后，使用抗fHbp抗体JAR 5检测fHbp模块群I和IV(变体群1)，或用JAR 31检测模块群II、III、V或VI(变体群2或3)(Beernink PT et la.(2008)Infect Immun 76：4243-40)。二抗为山羊抗小鼠IgG-IRDye800CW(1∶10,000，RocklandImmunochemicals，Gilbertsville，PA，US)。
为了对结合蛋白进行定量，使用红外扫描仪(Li-Cor Odyssey，Lincoln，NE，US)在800nm波长下对膜进行扫描，利用生产商提供的软件(3.0.21版)计算各条带的整合强度。对来自六个模块群之一的已纯化的重组fHbp进行检测，结果显示，当上样量在0.03至2μg范围内时，IR信号强度与上样量的log10成正比(模块群I和VI中对照蛋白的代表性数据参见图11)。代表性表达数据为模块群I中具有fHbp的两个菌株和模块群VI中两个菌株的数据(图11)。
统计分析。采用适合于Mac OSX的Prism 5(5.0a版)(GraphPad Software，La Jolla，CA，US)进行统计学计算。根据二项分布计算各国不同模块群中fHbp分离株的比例，同时给出对应的95％置信区间。采用Fisher精确检验(双侧)或卡方检验比较在各模块群中分离株比例之间的差异。
实施例概述
根据此前得到的成熟多肽序列的分析结果，将fHbp分为两个亚家族(Fletcher et al.Infect Immun 2004，72：2088-2100)或三个变体群(Masignani et al.，2003)(图3)。本发明所述的分析结果显示，脑膜炎球菌fHbp的整体架构包括有限数量的五种可变区段的特定组合，每个区段对应于两种类型之一，其被命名为α或β，其分类基于其与fHbp多肽I(变体群1)或28(变体群3)对应区段的序列相似性。如以下实施例部分和图4所述，两种直系同源淋病奈瑟球菌的氨基酸序列架构与模块群V的天然嵌合体对应(图8)。奈瑟菌属倾向于水平转移基因(Hotopp et al.Microbiology 2006，152：3733-3749)，且如本申请所述，脑膜炎球菌和淋球菌fHbp多肽具有相似的模块架构，这两者提示，在进化过程中，各祖源基因在编码不变残基的区块的保守序列处发生重组，这些序列被假设为连接点。
在69种不同的脑膜炎球菌fHbp多肽中，有65个(94％)可以被分配至六个模块群之一(图8)。接近60％的多肽属于模块群I或II，其分别仅包含α或β型区段。其余的多肽为α和β区段的天然嵌合体。模块fHbp群III、IV和V(图8)均可以由两种祖源型通过单一重组事件得到。模块fHbp群VI可以通过两次重组事件得到。相似地，实施例部分所述的四种例外序列的每一种均可以通过在编码其他保守残基的其他区块处重组而得到。对于一个包含5个区段的蛋白，各区段均可以为两种类型之一，理论上共有25＝32种独立的模块组合。我们仅鉴定到六种模块群，这提示在分子上存在功能性和结构性的限制，其选择出在普遍存在的fHbp模块群中发现的特定模块组合。
从两项最新NMR研究(Cantini et al.，J Biol Chem 2009，doi：10.1074/jbc.C800214200；Mascioni et al.J Biol Chem 2009，doi：10.1074/jbc.M808831200)以及一项对fHbp与补体调节蛋白复合物的晶体研究(Cantini et al.，2009；Mascioni et al.，2009；Schneider et al.Nature2009，doi：10.1038/nature07769)中可以获得fHbp的结构数据。在晶体结构方面，Schneider等报道，fHbp结构中有带电的氨基酸残基可模拟糖分子中已知的与fH结合的部分(Schneider et al.2009)，这些带电残基介导了与位于fH的短共有重复序列6(SCR 6)残基的结合。图9中的分析结果表明，在本研究发现的五个可变区段中，有三个具有这些与fH接触的残基。在21个fH接触的残基中，有五个在本研究中分析的69个独特fHbp多肽中保持不变，另有10个接触的残基是保守的。
带有与fH接触的残基的全部三个fHbp可变区段中还包含一些氨基酸，其影响杀菌性鼠源抗-fHbp mAb识别的表位(图9)。在氨基或羧基末端结构域中的fH接触残基位于中间部位，这影响表位表达的残基不同，它们位于外周部位。这种相反的关系提示与fH接触的fHbp结构较少引发杀菌性抗体。
fHbp作为候选疫苗的一个缺陷是抗原的多样性(Beernink & Granoff，2009；Masignaniet al.，2003)。因此，针对变体群1的重组fHbp的血清抗体主要仅对带有变体1蛋白的菌株具有杀菌作用(Beernink et al.2007；Fletcher et al.Infect Immun 2004，72；2088-2100；Masignaniet al.2003)，而针对变体群2或3的fHbp抗体主要对同源的变体2或3蛋白具有活性，而对带有变体群1fHbp的菌株没有活性。这些观察结果提示，就引发杀菌性抗体而言，fHbp的C和E区段的表位比A、B或D区段的表位更重要，因为C和E区段的表位在进化树上将变体1蛋白与变体2和3蛋白区分开(图6和7)，而变体1蛋白与变体2和/或3蛋白在A、B或D区段的表位是簇生在一起的(图5和6)。但是，除区段B外，所有这些可变区段均包含此前已鉴定出的影响杀菌性鼠源抗-fHbp mAb识别表位的残基(Beernink et al.2008；Beernink et al.MolImmunol 2009b，doi：10.1016/j.molimm.2009.02.021；Guiliani et al Infect Immun 2005，73：1151-1160)。此外，某些mAb抑制fH与细菌表面的结合(Madico et al.J Immunol 2006，177：501-510)，某些单独使用时不能杀菌的mAb在联合使用时引发协同杀菌活性(Beerninket al.2008；Beernink et al.2009b；Welsch et al.J Infect Dis 2008，197：1053-1061)。后者包括mAb JAR 4，其特异性针对可变区段A上的表位(Beernink et al.2009b)，当它与表位位于可变区段C(例如JAR 3或5)或可变区段E(例如，JAR 13或mAb502)的第二个mAb联用时，能够引发协同的杀菌活性。
为了将fHbp逃逸突变的可能性降至最低，理想的脑膜炎球菌疫苗应包括fHbp以外的抗原靶点(Giuliani et al.，2006)。但是，多成分疫苗中可以联用的重组蛋白的数量可能会有限制，因为这会增加所需的总蛋白量、降低耐受性或有损单个成分的免疫原性。为减少单个fHbp成分的数量，我们设计了嵌合fHbp分子，其包含变体1fHbp氨基末端结构域和变体2蛋白羧基末端结构域，以G136作为连接点(Beernink & Granoff，2008)。得到的嵌合蛋白表达所有三个变体群的表位，且嵌合fHbp疫苗引发的血清抗体对表达fHbp变体1、2或3的一系列遗传来源不同的菌株均具有杀菌活性。在创造重组嵌合疫苗时选择位于可变C区段中间的不变部分作为连接点，在本申请描述的任何天然fHbp嵌合蛋白中均未发现将这部分作为连接点。使用在C区段两侧的天然连接点可以得到改良的重组嵌合fHbp疫苗，比其他疫苗相比，其引发的杀菌性抗体更加广谱。还可以在一个或多个可变区段中引入氨基酸突变，以引入异源性fHbp变体的表位(Beernink & Granoff 2008；Beernink et al.2009b)。因此，当嵌合fHbp多肽中存在此类fH结合表位时，可以产生有助于对抗脑膜炎奈瑟球菌的抗体。
总而言之，本申请的分析表明，fHbp的总体架构可以被定义为由可变区段及其两侧的不变序列组合而成的有限数量的特异性模块。综上，有数据表明，脑膜炎奈瑟球菌与淋病奈瑟球菌祖源序列之间发生了重组，生成了抗原性多样化的脑膜炎球菌H因子结合蛋白家族。实施例中的数据提供了fHbp变体的进化情况，以及提供了对多肽变体归类的理论基础。需要进行群体监视研究以确定在导致携带和/或疾病的菌株中不同模块群fHbp的流行性，以及fHbp模块群与其他菌株特性如荚膜群、克隆复合物和PorA可变区之间的关系。
下文描述了产生本发现的研究细节。
实施例1：进化树分析。
对69个独特fHbp氨基酸序列进行比对，得到如图3所示的系统进化树。对每个序列显示出在neisseria.org的fHbp多肽数据库里分配的多肽识别编码，如果有已知的多位点序列分型(MLST)的克隆复合物，则显示在括号里。左下分支显示的是如Masignani et al 2003定义的变体群1(Fletcher et al 2004定义了亚家族B)；亚家族A包括两个分支，变体群2和3。变体群1、2和3中每一种的原型多肽都用箭头指出，并标注了相关基因来源的菌株的名称。依据方法中描述的多序列比对的方法构建系统进化树。底部的比例尺表示每100个残基里有5个氨基酸发生了改变。
本分析显示了两个主要分支，它们此前被命名为亚家族A和B(Fletcher et al.2004)。亚家族A包含了抗原性变体群2和3的fHbp序列，亚家族B与抗原性变体群1的fHbp序列相对应(Masignani et al.2003)。对于某些克隆复合物而言，有一些含有每个变体群的fHbp的示例性菌株(例如，ST-11，变体群1中的多肽2、3、6、9、10、11和78，变体群2中的多肽17、22、23和27，变体群3中的多肽59)。来自克隆复合物ST-32的菌株具有在两个变体群的fHbp(变体群1中的多肽1和89，变体群3中的多肽76)，克隆复合物ST-8只含有一个变体群的fHbp(变体群2中的多肽太16、58和77)。下表2显示了所有的观察到的克隆复合物中fHbp变体的分布。列出的多肽ID是根据neisseria.org的fHbp多肽数据库来指定。
表2.H因子结合蛋白变体在各克隆复合物中的分布
Figure BPA00001449263000391
实施例2：fHbp的架构是模块化的。
识别出含2到5个残基的不变区块，将蛋白质分隔成可变残基的区段。详见图4。垂直的矩形显示的是不变残基。上面的三幅图表示属于群1、2和3的三种脑膜炎奈瑟球菌fHbp变体(多肽id分别为1、16和28)的代表性架构。三个变体均有重复的氨基末端元件(N末端)，和从A到E的可变区段，在不同变体中的这些区段在某些情况下长度不同。图中显示了每个可变区段的最后一个残基的氨基酸位置。
除了氨基末端元件外，两种直系同源淋病奈瑟球菌(Genbank登记号为AE004969和CP001050)有相同的不变氨基酸序列和同源的可变区段，其总体上与脑膜炎球菌fHbp多肽79(脑膜炎球菌蛋白变体3)具有96％的氨基酸序列相似性。在第一次研究中，全部69个fHbp序列变体均有含2-5个不变残基的区块，位于5个模块可变区段的两侧(图4)。在研究2中分析的另外172个fHbp变体中，有170个中这些不变残基是保守的。一个例外是蛋白ID 33，在A和B区段之间是SHFDF而不是SRFDF。另一个例外是蛋白ID 150，在D和A区段之间是IEHLE而不是IEHLK(图4)。
不变残基的区块似乎代表了天然连接点，用于重组编码脑膜炎球菌和淋球菌蛋白的基因。对由这些连接点定义的各可变区段进行了系统进化分析。以下描述了对69个不同的脑膜炎球菌fHbp多肽变体进行的分析，其中对氨基酸残基的编号是基于由变体群1(Masignani et al.2003)的MC58中的基因编码的成熟fHbp多肽1。变体群2和3的蛋白编号与变体群1分别相差-1和+7(图4)。
实施例3：氨基末端重复元件。
对于所有的69个序列，成熟的fHbp起始于被信号肽酶II脂化的半胱氨酸残基，接下来是三个不变的氨基酸残基SSG。这个不变序列之后是一个由1至6个甘氨酸和/或丝氨酸残基组成的重复可变序列，然后是两个不变的甘氨酸残基(图4)。在69个多肽中，有34个多肽的氨基末端重复元件的可变部分由单个甘氨酸残基构成(变体群1几乎全部如此，如下表3所示)，有12个多肽为GG残基(变体群2全部如此)。其他常见的可变序列是GGGSGG(变体群1中有8个和变体群3中有7个)。
表3.氨基末端重复元件的序列和分布
Figure BPA00001449263000401
实施例4：下游可变区段。
我们将五个可变区段命名为A、B、C、D或E(图4)。根据某些特征性氨基酸残基的存在和序列相似性(表4)，将五个区段分别划分为两种类型之一。一种类型存在特征性氨基酸残基，并且与抗原变体群1的多肽具有序列相似性。另一种类型存在特征性氨基酸残基，而且与抗原变体群3的多肽具有序列相似性，其也与直系同源的淋球菌相似(见图4)。另请参见如下所示的表4。
表4.通过区段序列的组内和组间氨基酸鉴定。
Figure BPA00001449263000411
1氨基酸编号基于菌株MC58的成熟fHbp。
2每个可变区段后紧接的不变残基区块。紧靠区段A之前的不变序列是GG(见图4)。
3见图2A-2E：(表8)各可变区段的完整序列。
4每个可变区段的每种序列类型中的序列数目(N＝61个多肽)。
5在其他保守残基区块中具有例外连接点的四个fHbp序列被排除在相似性百分率分析之外(见正文)。
6与fHbp序列的羧基末端相对应。
为了归类，我们将第一组区段命名为α类型，第二组命名为β类型。在α或β类型中各区段的氨基酸相似性的范围是80％至100％(表4)。相反地，两种类型间的区段相似性范围从区段A中的69-78％，其位于分子的N-末端部分的保守区域，到区段C中的32-45％，其包含的残基98-159位于蛋白中保守性相对较低的区域(表4)。对于每个区段而言，不同的序列变体都被指定了一个以字母A至E开头代表可变区段的唯一识别编码；接下来是α或β代表存在上文所述的相应类型的残基，再之后的数字为不同序列的编码(图2A-2E(表8)中列出)。
区段A紧接着不变的CG序列之后，起始于第8个氨基酸残基并延伸至位点73(表4)。在69个fHbp变体中，区段A包含16个不同的α序列变体和9个不同的β序列变体(图5)。当多个多肽在某一区段中含有相同的序列时，这些多肽的数目在括号内显示。比例尺表示每100个残基里有5个氨基酸发生了改变。根据系统演化树，变体群1中的大多数fHbp的A区段(如图5所示)和变体群2中的A区段聚集成簇，然而变体群3中的fHbp的A区段是一个单独簇。最常见的α变体(N＝14)被命名为A.α.1，它存在于变体群1中的4fHbp多肽中和变体群2中的10fHbp多肽中。最常见的β变体被命名为A.β.1，它存在于6个多肽中，其均属于变体群3。
区段B紧接着不变序列SRFDF之后，起始于位点79且延续至位点93(表4)。在69个fHbp多肽中，区段B包含7个不同的α变体序列和单个β序列(图5)。系统进化分析的结果显示，变体群1和2中fHbp多肽的B区段聚集成簇(图5)，其与变体群3明显不同。最常见的B区段被命名为B.α.1，存在于40个fHbp多肽中(其中28个属于变体群1，12个属于变体群2)。与和A和B区段不同的是，变体群2和3中fhbp的C区段(残基98-159)和E区段(残基186-253)分别聚集成簇，并且与变体群1中fHbp的C区段和E区段相互分离(图6)。变体群1中fHbp的所有D区段(残基162-180)都是α类型的，而变体群2或3中fHbp多肽的D区段是α或β类型的(图7)。最常见的D区段(N＝39)被命名为D.α.1，其存在于21个变体群1fHbp多肽中以及存在于9个变体群2和3中的fHbp多肽中。
实施例5：利用模块群对fHbp变体归类。
基于上述对fHbp可变区段的系统进化分析，在已研究的这些不同的fHbp变体中，大部分都被分类为六个不同的fHbp模块群(I至VI)(图8)。在69个fHbp多肽中有40个多肽(58％)只包含α(N＝33)或β(N＝7)类型的区段，它们分别被命名为fHbp模块群I和II(图8)。α区段在图中以灰色表示，β区段在图中以白色表示。余下的29个多肽(42％)可以被归入四种嵌合体之一，其衍生自不同α或β区段的重组(命名为fHbp模块群III、IV、V或VI；N＝25)，或者如下所述，是其他嵌合体(N＝4)，其中五个区段之一采用了位于其他保守区块序列的例外连接点。如图6所示，每个模块群的代表性多肽用来自neisseria.org的fHbp数据库的多肽识别编码指示。每一个fHbp模块群中找到的独特序列的数目都标注在右侧。该分析排除了在其中的某个区段具有例外连接点的四个多肽序列。
虽然上文所述的氨基末端重复区段并未用于定义fHbp模块群，大多数(88％至100％)模块群I、III和IV的多肽序列具有含1或2个甘氨酸残基的氨基末端重复元件(表3)。而与之相反的是，大多数(75％至100％)模块群II、IV和V的多肽具有含3到6个甘氨酸和丝氨酸残基的氨基末端元件。这一氨基末端元件的长度可能会影响蛋白质到细菌胞膜的距离以及特定表位的表面可接近性。
在第二项研究中，在172个新fHbp变体中除了3个变体外，均可被归入6个fHbp模块群之一(I至VI，图4，A图)。这3个例外(蛋白质ID 207、67和175)具有衍生自α或β类型谱系的模块区段的特殊组合，其被归入三个新的模块群(分别是VII，VIII和IX)。
在扩展的数据库中的242个fHbp变体中，125个蛋白质只有α区段，被分在模块群I(图4)，20个蛋白质被分在模块群II(完全由β区段构成)。其余97个fHbp序列变体是α和β区段的天然嵌合体，被归入模块群III至IX(共包括所有变体的40％)。图4显示Masignani et al.(2003)J Exp Med 1997：789-99所述的各模块群的fHbp变体群。根据各蛋白全体氨基酸序列的亲缘关系分配变体群。
实施例6：在一个可变区段内包含连接点的嵌合fHbp多肽。
4个fHbp序列具有与上文所述类似的模块结构，但在两个区段之间的连接点使用了不同的不变序列。例如，fHbp多肽55与模块群IV的多肽类似(图8)，但A区段在起始于残基50的不变AQGAE处，而非在起始于残基74的SRFDF处，从β型序列转变为α型序列。这一A区段被命名为A.β.9(被命名为β是因为与α型A区段相比其与其他β型A区段具有更高的序列同源性；图5)。另外两个fHbp多肽，24和25(图2A-2E(表8))，与模块群III具有类似的结构(图8)，但B区段在起始于残基82的不变IEV处，而非起始于位点94的GEFQ处，从α型序列转变为β型序列。这种例外的B区段被命名为B.α.3，被分类为α型是因为相比β型B区段，其与α型B区段具有更高的序列同源性(图5)。第四个特殊的fHbp模块结构，多肽82(图2A-2E(表8))，与V型类似，但E区段除外，其被命名为E.β.10，其在残基A196处，而非起始于位点181的IEHLK处，从α型序列转变为β型(图6)。
实施例7：可变和不变fHbp区段的结构特性。
根据已发表的fHbp晶体结构坐标(Schneider et al.2009)，将fHbp的可变和不变区段分别在分子模型上定位(图9)。氨基末端和羧基末端分别被标记为N和C，在图A中的位置与图B和C中一致。此图是用PyMol(pymol.org)建立的。相比最左边相应的模型，A、B以及C图中间的相应模型绕Y轴旋转了180度，而位于最右边的模型相对于中间的模型绕X轴旋转了90度。
在图A的带状模型中呈现出了两个此前已经描述的fHbp的主要结构域(Cantini et al.2009；Mascioni et al.2009；Schneider et al.2009)，它们都具有独立折叠的β-结构，并通过位于可变区段C的含四个氨基酸残基的结构化的接头相连。氨基末端的结构域起始于残基8并延伸至残基136，包括了可变区段A、B以及部分C(注意成熟蛋白的前14个残基并未出现在晶体结构中)。羧基末端的结构域从残基141延伸至255，包括了可变区段C的羧基末端部分以及整个可变区段D和E。
图B为相应的“空间填充模型”。根据fHbp-fH复合体的结构，此前报导为与fH接触的氨基酸残基以黑色表示。这些残基在可变区段A、C和E中形成簇，并且在位于图B中间和最右边的模型中可见。由于已知fH与活细菌中的fHbp相结合(Madico et al.2006；Schneideret la.2006)，因而这个结合位点一定是暴露于表面的。位于5个可变区段两侧的不变残基，则位于蛋白质的反面表面，并在图B和C中以白色表示(最左侧模型)。因为包含着信号锚点的氨基末端起始于蛋白质的这一正面(模型的底面位于最右侧，图B)，所以推测不变残基均位于分子的表面并锚定在细胞壁。这些不变序列均存在在与细胞膜相连的表面，提示在细菌细胞膜上锚定和/或定位fHbp时存在结构限制，也可能是对结合蛋白的要求。
此前的研究已定位出11种杀菌性抗-fHbp mAb的表位(Beernink et al.2008；Beerninket al.2009b；Giuliani et al.2005；Scarselli et al J Mol Biol 2009，386：97-108)。在图C中(图9)，影响这些表位表达的氨基酸，以及之前定义的与fH接触的残基均以黑色表示(与图B中同样以黑色表示)。除了区段B以外，所有可变区段都包含被杀菌性mAb识别的表位。影响表位的氨基酸一般位于fHbp的氨基和羧基末端结构域的外周，然而与fH相接触的残基位于上述两个结构域的中心部位的丛簇。此前已报道，某些mAb如JAR 3、5或13的表位能够抑制fH与fHbp结合(Beernink et al.2008；Beernink et al.2009b)，这些表位涉及的氨基酸临近某些与fH相接触的残基。然而，在两组残基中，没有相互重叠的例子。
实施例8：在不同国家分离的致病株中fHbp模块群的出现频率。
上文所述的分析提供了关于fHbp模块群多样性的信息。在接下来的这组分析中，使用了由Murphy et al.(2009)J Infect Dis 200：379-89报道的，从美国和欧洲系统收集的B群分离株的fHbp序列数据。这些分离株来自美国2001年至2005年间的病例(N＝432)，以及来自2001年至2006年间的英国(N＝536)、法国(N＝244)、挪威(N＝23)和捷克(N＝27)病例。美国数据中还包括了143个其他分离株的fHbp序列，它们是在另一项研究中在美国的多个中心系统收集得到(Beernink PT et al.(2007)J Infect Dis 195：1472-9)。
在总计1405个系统收集的B群分离株中，模块群I占59.7％，群II占1.7％，群III占8.1％，群IV占10.6％，群V占6.1％和群VI占13.6％。所发现的新模块群VII，VIII以及IX，均占≤0.1％。图12列出了根据Masignani et al.(2003)J Exp Med 197：789-99制定的变体群归类得到的fHbp各模块群在各不同国家中的相应的分布结果。由于从挪威和捷克收集的分离株数量太少，难以对其各自模块群的频率进行精确的估算，因此本次分析排除了这部分数据。分别显示了在美国的两部分数据中各模块群的百分比。
Masignani的变体群1的分离株由模块群I、IV和VII组成。完全由α型区段构成的模块群I菌株是所有三个国家的主要类型(占所有分离株的54％-64％)。但是在英国，23％的分离株是模块群IV，其是α-和β-区段的天然嵌合体(图8)，而相比之下，其在美国两次收集的分离株中均为＜1％，在法国的分离株中为3％(P＜0.001，卡方检验)。由于模块群VII仅有一个分离株(在法国)，因此该模块群的频率未在图12中显示。
变体群2分离株包含了模块群III和VI，两者均是α和β区段的天然嵌合体。在美国两次收集的分离株中，模块群III或VI的比例相同，然而在来自英国和法国的变体2分离株中，模块群VI占优势。变体群3分离株包括模块群II(完全由α区段组成)和模块群V、VIII和IX，其都是嵌合体。在法国和英国，模块群V占变体3fHbp分离株的大多数，而在美国两次收集的分离株中，模块群II或V蛋白的数量大致相同。模块群VIII和IX在分离株中仅占＜0.1％的比例。由于比例太低，这些群未在图12中显示。
实施例9：与模块群和fHbp表达相关的抗-fHbp血清杀菌活性的菌株易感性。
图13显示了用代表模块群I-VI的重组fHbp疫苗免疫小鼠后得到的混合血清中人补体的杀菌滴度。柱子的高度代表用特定菌株测试时，六种抗血清中每一种的平均滴度(每个模块群有3-4个混合血清样品)。例如，左上方图显示的是来菌株H44/76的数据，其中，模块群I中fHbp的表达更高(相对表达水平以+++表示，实际数值在下面的表5中列出)。在同源的抗fHbp模块群I的抗血清中，平均杀菌滴度(黑色柱子)为～1∶6000。在五个异源的抗-fHbp模块群的抗血清中，其各自针对菌株H44/76的滴度(白色柱子)降低了1至2个log10，范围从＜1∶10(模块群II的抗血清)到～1∶200(模块群IV的抗血清)。当在具有同源的fHbp模块群II(变体群3图中的菌株SK104)或IV(在变体群1图中的NM452)的菌株上进行测试的时候，抗模块群II和IV的抗血清的对应的平均滴度为＞1∶2000。因此，当用具有相应的同源fHbp模块群的菌株进行测试时，这些以及其他异源抗血清都具有高的抗体活性。
对低表达fHbp菌株的杀菌滴度低于对高表达菌株的滴度(将图13中右侧图表中显示的低表达菌株[命名为+/-]的数据与左侧中显示的高表达菌株的数据进行比较得出)。例如，抗模块群I的抗血清对高表达fHbp模块群I的菌株H44/76的杀菌滴度为1∶6000，而对低表达fHbp模块群I的菌株03S-0408的滴度则为～1∶100。(对于模块群V而言，两个测试菌株都是中度表达，因为无法获得fHbp的高低表达的菌株对)。
一种趋向是抗-fHbp抗体对来自异源模块群的低表达fHbp菌株的杀菌活性的交叉反应性低于对高表达菌株的交叉反应性(参见，例如，数据显示，低表达菌株03S-0408(模块群I)、M01573(模块群IV)和RM1090(模块群III)仅能被同源模块群的抗血清杀死，但相比之下对各个高表达fHbp的菌株(H44/76、NM452和03S-0673；图13)则具有更加广谱的杀菌活性)。菌株NMB(fHbp模块群VI)对于抗fHbp杀菌活性具有完全抗性(滴度＜1∶10)，这显然是fHbp低表达的结果(表5)。用于制备抗模块群VI抗血清的疫苗的氨基酸序列与NMB表达的fHbp相比有单个氨基酸的不同，而得到的抗血清对fHbp模块群VI高表达的菌株(961-5945)具有杀菌作用。另外，抗PorA mAb对照在0.15μg/ml的浓度时可杀死抗性菌株NMB，该浓度与抗ProA mAb杀死对抗fHbp抗体易感的961-5945菌株所需的浓度是一样的。
表5用于检测血清杀菌活性的脑膜炎奈瑟球菌菌株特性。
Figure BPA00001449263000461
下表中列出了用来定量检测fHbp的抗体和与每个抗体对多种模块群蛋白的反应活性。
表6用于制备抗血清的重组蛋白对抗-fHbp单克隆抗体的反应性与表位位置之间的关系。
Figure BPA00001449263000462
1当与人补体组成某些组合进行测试时，所有的MAb都有杀菌作用。3不连续的表位；存在KDN抑制性表位[1]
4不连续表位需要带电残基的特定组合
5当测试浓度是1μg/ml时，若光密度大于背景结合的3SD，则标为“1”，否则标为“0”。
6UD，表位位置未确定

Claims (23)

1.一种根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其包含，从N-末端至C-末端：
VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE，
其中各VA、VB、VC、VD和VE可变区段的等位基因的组合在自然界中不存在。
2.根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其特征在于所述的各可变区段为α祖源序列。
3.根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其特征在于所述的各可变区段为β祖源序列。
4.根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其特征在于VA、VB、VC、VD和VE中至少一个为α祖源fHbp氨基酸序列以及VA、VB、VC、VD和VE中至少一个为β祖源fHbp氨基酸序列。
5.根据权利要求4所述的非天然存在的fHbp，其特征在于所述的非天然存在的fHbp不属于图8中列出的模块群类型。
6.根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其中所述的非天然存在的fHbp包含，从N-末端至C-末端：
I1-Nte-I2-VA-I3-VB-I4-VC-I5-VD-I6-VE-I7。
7.根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其中所述的非天然存在的fHbp包含，从N-末端至C-末端：
VAα-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDβ-I6-VEα或
VAα-I3-VBα-I4-VCα-I5-VDβ-I6-VEβ.
8.根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp，其特征在于所述的fHbp包含一个与表1中所列出的单克隆抗体相结合的表位。
9.一种在哺乳动物中产生抗体应答的方法，此方法包括对哺乳动物给药一种组合物，其含有如权利要求1所述的第一种非天然存在的fHbp。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述哺乳动物为人。
11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述给药产生与两种或多种fHbp结合的抗体。
12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述非天然存在的fHbp存在于包含外膜囊泡(OMV)、微囊泡(MV)或OMV与MV混合物的制剂中。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于所述囊泡由两种或多种脑膜炎奈瑟球菌菌株制备得到，这些菌株在遗传学上各不相同。
14.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述给药包括给药第二种fHbp，其中所述第二种fHbp不同于所述的第一种非天然存在的fHbp。
15.一种免疫原性组合物，包含根据权利要求1所述的第一种非天然存在的fHbp和药学上可接受的辅料。
16.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，进一步包含第二种fHbp，其特征在于所述第二种fHbp不同于所述第一种非天然存在的fHbp。
17.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于所述非天然存在的fHbp存在于囊泡制剂中，其中囊泡由奈瑟菌属细菌制备得到。
18.根据权利要求17所述的免疫原性组合物，其特征在于所述奈瑟菌属细菌经过遗传修饰以破坏内源性fHbp多肽的生成。
19.根据权利要求15所述的免疫原性组合物，其特征在于所述非天然存在的fHbp由经过遗传修饰以产生所述fHbp的奈瑟菌属细菌产生。
20.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其特征在于所述囊泡制剂来自于与产生所述非天然存在fHbp的菌株相同的脑膜炎奈瑟球菌菌株。
21.根据权利要求18所述的免疫原性组合物，其特征在于所述奈瑟菌属细菌具有荚膜多糖合成缺陷。
22.一种编码根据权利要求1所述的非天然存在的fHbp的核酸。
23.一种包含权利要求22所述核酸的宿主细胞。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107823638A (zh) * 2017-11-05 2018-03-23 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法
CN115976088A (zh) * 2022-07-21 2023-04-18 深圳蓝晶生物科技有限公司 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX339524B (es) 2001-10-11 2016-05-30 Wyeth Corp Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.
AU2011238670B2 (en) 2010-03-30 2015-04-23 Children's Hospital & Research Center Oakland Factor H binding proteins (FHBP) with altered properties and methods of use thereof
KR101594228B1 (ko) 2010-08-23 2016-02-15 와이어쓰 엘엘씨 네이세리아 메닌기티디스 ｒＬＰ２０８６ 항원의 안정한 제제
KR101584871B1 (ko) 2010-09-10 2016-01-22 와이어쓰 엘엘씨 네이세리아 메닝기티디스 orf2086 항원의 비-지질화된 변이체
MX2014008988A (es) 2012-02-02 2014-08-27 Novartis Ag Promotores para aumento de expresion de proteinas en meningococo.
MX351993B (es) * 2012-03-09 2017-11-03 Pfizer Composiciones de neisseria meningitidis y metodos de las mismas.
SA115360586B1 (ar) 2012-03-09 2017-04-12 فايزر انك تركيبات لعلاج الالتهاب السحائي البكتيري وطرق لتحضيرها
JP6446377B2 (ja) 2013-03-08 2018-12-26 ファイザー・インク 免疫原性融合ポリペプチド
US9619444B2 (en) 2013-03-15 2017-04-11 International Business Machines Corporation System and method for web content presentation management
WO2015017817A1 (en) 2013-08-02 2015-02-05 Children's Hospital & Research Center Oakland Non-naturally occurring factor h binding proteins (fhbp) and methods of use thereof
WO2015033251A2 (en) 2013-09-08 2015-03-12 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
CN112851768A (zh) 2014-07-23 2021-05-28 奥克兰儿童医院及研究中心 因子h结合蛋白变体及其使用方法
US9616114B1 (en) 2014-09-18 2017-04-11 David Gordon Bermudes Modified bacteria having improved pharmacokinetics and tumor colonization enhancing antitumor activity
WO2016132294A1 (en) 2015-02-19 2016-08-25 Pfizer Inc. Neisseria meningitidis compositions and methods thereof
US11066453B2 (en) * 2015-05-18 2021-07-20 Biomvis Srl Immunogenic compositions containing bacterial outer membrane vesicles and therapeutic uses thereof
US11129906B1 (en) 2016-12-07 2021-09-28 David Gordon Bermudes Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria
US11180535B1 (en) 2016-12-07 2021-11-23 David Gordon Bermudes Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria
KR20220011796A (ko) 2017-01-31 2022-01-28 화이자 인코포레이티드 네이세리아 메닌기티디스 조성물 및 그의 방법

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060251670A1 (en) * 2002-11-22 2006-11-09 Maurizio Comanducci Multiple variants of meningococcal protein nmb1870

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1944371B1 (en) 1998-05-01 2015-03-04 Novartis AG Neisseria meningitidis antigens and compositions
PT1656952E (pt) * 1998-10-16 2014-02-21 Biogen Idec Inc Conjugados de polietileno-glicol e interferão beta 1a e as suas utilizações
GB0121591D0 (en) * 2001-09-06 2001-10-24 Chiron Spa Hybrid and tandem expression of neisserial proteins
GB0220194D0 (en) * 2002-08-30 2002-10-09 Chiron Spa Improved vesicles
EP1590459A2 (en) 2003-01-15 2005-11-02 Wyeth Holdings Corporation Methods for increasing neisseria protein expression and compositions thereof
GB0419408D0 (en) 2004-09-01 2004-10-06 Chiron Srl 741 chimeric polypeptides
MX2007008785A (es) * 2005-01-27 2008-02-15 Childrens Hosp & Res Ct Oak Vacunas de vesicula basadas en gna1870 para proteccion de amplio espectro contra padecimientos causados por neisseria meningitidis.
GB0524066D0 (en) 2005-11-25 2006-01-04 Chiron Srl 741 ii
WO2008125985A2 (en) * 2007-04-11 2008-10-23 Novartis Ag Blocking interaction between pathogen factors and factor h to inhibit hemorrhagic syndromes
US20090035328A1 (en) 2007-08-02 2009-02-05 Dan Granoff fHbp- AND LPXL1-BASED VESICLE VACCINES FOR BROAD SPECTRUM PROTECTION AGAINST DISEASES CAUSED BY NEISSERIA MENINGITIDIS
US8476032B2 (en) 2008-08-27 2013-07-02 Children's Hospital & Research Center Oakland Complement factor H-based assays for serum bactericidal activity against Neisseria meningitidis
WO2010028096A2 (en) * 2008-09-03 2010-03-11 Children's Hospital & Research Center At Oakland Peptides presenting an epitope of an a domain of factor h binding protein and methods of use
GB0819633D0 (en) 2008-10-25 2008-12-03 Isis Innovation Composition
AU2011238670B2 (en) 2010-03-30 2015-04-23 Children's Hospital & Research Center Oakland Factor H binding proteins (FHBP) with altered properties and methods of use thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060251670A1 (en) * 2002-11-22 2006-11-09 Maurizio Comanducci Multiple variants of meningococcal protein nmb1870

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107823638A (zh) * 2017-11-05 2018-03-23 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法
CN107823638B (zh) * 2017-11-05 2020-01-03 北京智飞绿竹生物制药有限公司 一种b群脑膜炎球菌重组嵌合蛋白疫苗及其制备方法
CN115976088A (zh) * 2022-07-21 2023-04-18 深圳蓝晶生物科技有限公司 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用
CN115976088B (zh) * 2022-07-21 2023-09-19 深圳蓝晶生物科技有限公司 低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用

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