KR20020064788A - 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는형질전환체 및 신규 생합성 유전자 - Google Patents

관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는형질전환체 및 신규 생합성 유전자 Download PDF

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Abstract

이차 대사산물의 벤젠고리가 파라 위치에서 질소 원자를 갖는 관능기로 수식된 이차 대사산물을 제조하도록 수식된 형질전환체. 파라위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환되어 있지 않은 벤젠 고리 골력을 갖는 이차 대사산물을 제조하는 생물의 형질전환체에 있어서, 이 형질전환체가, 코리스미산으로부터 p-아미노페닐피루빈산으로 생합성 경로에 참여하는 유전자를 옮겨서, 파라 위치에서 질소 원자를 갖는 기능기로 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 생산할 수 있도록 형질전환된 것을 특징으로 한다. 또한, 코리스미산으로부터 p-아미노페닐피루빈산으로 생합성 경로에 참여하는 신규 유전자가 제공된다. 이들 신규 유전자는 서열번호 2,4 및 6으로 나타내는 아미노산서열 또는 이들로부터 유래된 개변서열을 수식한다.

Description

관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는 형질전환체 및 신규 생합성 유전자{TRANSFORMANT PRODUCING SECONDARY METABOLITE MODIFIED WITH FUNCTIONAL GROUP AND NOVEL BIOSYNTHESIS GENES}
생물은 생물학적 활성을 갖는 다종, 다양한 이차 대사산물을 생산하기 때문에, 이들을 의약품, 동물약, 농약 등으로 이용하려고 하는 연구가 왕성하게 행해지고 있다. 그러나, 생물 유래의 이차 대사산물이 그대로 실용화된다고 하는 것은 드물고, 그의 생물학적 활성을 최적화하기 위하여 여러 가지 관능기로 수식되는 것이 일반적이다. 그 중에서, 질소 원자를 갖는 관능기, 예를 들면, 니트로기 또는 아미노기에 의한 수식은 가장 중요한 수식 중 하나이다.
어떤 물질을 니트로기로 수식하는데는 화학적 방법이 이용 가능하다. 그러나, 화학적 방법을 사용해서, 벤젠 고리의 파라 위치에 특이적으로 니트로기를 도입하는 것은 어렵기 때문에, 그의 수율은 대단히 낮다. 또한, 니트로기로 수식하려고 하는 물질이 생물 유래의 이차 대사산물과 같이 복잡한 물질인 경우, 그 중에 함유되는 벤젠 고리의 파라 위치를 특이적으로 니트로기로 수식하는데는 한층 곤란이 따른다.
한편, 아미노기를 도입하는 방법에는, 대별해서 효소법과 화학법의 두가지의 방법이 있다. 효소법에서는, 아미노 트란스페라제(EC 2. 6. 1 군)로 불려지는 효소를 사용해서 행한다. 그러나, 아미노 트란스페라제의 기질로 될 수 있는 물질이 한정되어 있고, 벤젠 고리에 직접 아미노기를 전이하는 것이 가능한 효소는 이제까지 알려져 있지 않다. 따라서, 벤젠 고리를 아미노기로 수식하려고 하는 경우에는 화학법만이 사용 가능했었다.
그러나, 화학법의 경우, 처음에 벤젠 고리를 니트로기로 수식하고, 이 것을 환원해서 아미노기로 한다고 하는 반응이 필요하다. 제 1단계의 니트로화의 반응은 대단히 곤란한 것이므로, 화학법에 의한 벤젠 고리로의 아미노기의 도입은 대단히 곤란했었다. 따라서, 벤젠 고리의 파라 위치를 특이적으로 니트로기 또는 아미노기로 수식하는 방법의 개발이 간절히 요망되고 있다고 말할 수 있다.
본 발명은, 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는 형질전환체에 관한 것이고, 더욱 상세하기로는, 벤젠 고리의 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기로 수식된 이차 대사산물을 생산하는 형질전환체에 관한 것이다. 본 발명은, 또, 코리스미산(chorismic acid)으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 신규 유전자에도 관한 것이다.
도 1은, 스트렙토마이세스 베네수엘라(Streptomyces venezuelae)로부터 단리한 DNA단편의 제한효소 지도 및 오픈 리딩 프레임의 위치를 나타낸다.
도 2는, 플라스미드 pTrc-papA의 구축을 나타낸다.
도 3은,papA유전자 산물의 효소활성 검출에 사용한 아미노산 분석기의 크로마토그람을 나타낸다.
도 4는, 플라스미드 pTrc-papB의 구축을 나타낸다.
도 5는,papB유전자 산물의 효소활성 검출에 사용한 아미노산 분석기의 크로마토그람을 나타낸다.
도 6은, 플라스미드 pET-papC1의 구축을 나타낸다.
도 7은,papC유전자 산물의 효소활성 검출에 사용한 아미노산 분석기의 크로마토그람을 나타낸다.
도 8은, 플라스미드 pPF260-A2 및 pPF260-A3의 구축을 나타낸다.
도 9는,Abp1유전자를 함유하는 6kb의HindⅢ 단편의 제한효소 지도를 나타낸다.
도 10은, pABPd의 구성 및 제한효소 지도를 나타낸다.
도 11은, 플라스미드 pPF260-B3의 구축을 나타낸다.
도 12는, 플라스미드 pPF260-C3의 구축을 나타낸다.
도 13은, 벤젠 고리의 파라 위치가 니트로기 또는 아미노기로 수식된 PF 1022 유도체의 검출에 사용한 HPLC의 크로마토그람을 나타낸다.
본 발명은, 이차 대사산물의 벤젠 고리의 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산할 수 있도록 개변된 형질전환체, 및 수식된 이차 대사산물을 간편하게, 또한 염가로 제조하는 방법을 제공하는 것을 그의 목적으로 한다.
본 발명자들은, 벤젠 고리 골격을 갖는 PF 1022 물질을 생산하는 미생물을, 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 유전자를 함유하는 DNA에 의해서 형질전환하여, 벤젠 고리의 파라 위치가 아미노기에 의해 수식된 PF 1022 물질을 생산하는 형질전환체를 얻는 것에 성공했다.
본 발명에 의한 형질전환체는, 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환되어 있지 않은 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 생산하는 미생물의 형질전환체에 있어서, 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 유전자(이하, 간단히 「생합성유전자」라 한다)를 도입함으로써, 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 생산하도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체이다.
본 발명에 의한 제조법은, 상기 형질전환체를 배양하여, 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 채취하는 것으로 이루어지는, 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물의 제조법이다.
본 발명은, 또 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 신규 유전자를 제공하는 것도 그의 목적으로 한다.
본 발명에 의한 신규 유전자는,
서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자;
서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자; 및
서열번호 6에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자이다.
미생물의 기탁
실시예 5에 기재되는 PF 1022 균주는, 1989년 1월 24일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 기탁되었다. 수탁번호는, FERM BP-2671이다.
마이셀리아·스테릴리아(Mycelia sterilia)의 형질전환체 55-65는, 1999년 9월 17일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 기탁되었다. 수탁번호는, FERM BP-7255이다.
플라스미드 pUC118-papA로 형질전환된 대장균(대장균 JM 109)은, 1999년 9월 17일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 기탁되었다. 수탁번호는, FERM BP-7256이다.
플라스미드 pTrc-papB로 형질전환된 대장균(대장균 JM 109)은, 1999년 9월 17일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 기탁되었다. 수탁번호는, FERM BP-7257이다.
플라스미드 pET-papC로 형질전환된 대장균(대장균 JM 109)은, 1999년 9월 17일자로 통상산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소(일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쵸메 1반 3고)에 기탁되었다. 수탁번호는, FERM BP-7258이다.
형질전환되는 생물
본 발명에 이용할 수 있는 생물로서는, 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 생산하는 생물을 이용할 수가 있다. 바람직한 생물로서는, 코리스미산을 경유해서 생합성되는 이차 대사산물, 특히, 페닐피루빈산,p-히드록시페닐피루빈산, 페닐알라닌, 티로신, 및 페닐유산으로부터 되는 군에서 선택되는 적어도 1개의 빌딩 블록으로부터 합성되는 이차 대사산물을 생산하는 생물을 들 수가 있다.
바람직한 생물로서는, 또 펩티드 또는 뎁시펩티드, 특히 페닐알라닌, 티로신, 및 페닐유산으로부터 되는 군에서 선택되는 적어도 1개의 빌딩 블록으로부터 합성되는 펩티드 또는 뎁시펩티드를 이차 대사산물로서 생산하는 생물을 들 수가 있다.
이와 같은 이차 대사산물 및 그 것을 생산하는 미생물은 다음과 같다.
이들의 물질은, Dictionary of Natural Products (Chapman & Hall, 1994)에 기재되어 있다.
본 발명에 있어서 형질전환되는 「생물」로서는, 세균, 효모, 및 곰팡이와 같은 미생물이나 식물을 들 수가 있다. 식물에는 식물세포도 포함된다.
질소 원자를 갖는 관능기의 예로서는, 아미노기 및 니트로기를 들 수가 있다. 형질전환되는 생물이 하기 식으로 나타내는 PF 1022물질:
을 생산하는 미생물인 경우, 형질전환체로부터 생산되는 이차 대사산물은 하기 식으로 나타내는 아미노기로 수식된 PF 1022물질(이하, 「PF 1022물질 유도체」라 한다):
일 수 있다.
PF 1022물질[시클로(D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실-D-락틸-L-N-메틸로이실-D-3-페닐락틸-L-N-메틸로이실)]은 아고노마이세탈레스(Agonom ycetales)에 속하는 사상균, PF 1022균주 (Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 의해 생산되는 환상 뎁시펩티드이고, 동물 기생성의 선충류에 대해서 극히 높은 구충활성을 나타낸다(특개평 3-35796호, Sasaki, T. et al., J. Antibiotics, 45, 692, (1992)). 이 때문에, PF 1022물질은 동물용의 구충약으로서 유용함과 동시에, 아미노기로 수식된 그의 유도체는 고활성인 이 물질의 유도체를 합성하기 위한 원료로서 유용하다.
PF 1022물질은 4분자의 L-로이신, 2분자의 D-유산(乳酸), 및 2분자의 D-페닐유산으로부터 PF 1022물질 합성효소에 의해 합성된다. 이하의 이론에 구속될 이유는 없지만, (1) 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 유전자를 PF 1022물질 생산균에 도입함으로써,p-아미노페닐피루빈산이 형질전환체에서 생산되고, (2) 이 것에 D-페닐유산 데히드로게나제(D-PLDH)가 작용해서p-아미노-D-페닐유산이 형질전환체에서 생산되고, (3) D-페닐유산 대신에p-아미노-D-페닐유산에 대해서 PF 1022물질 합성효소가 작용하여, (4) PF 1022물질 유도체가 생산되는 것으로 생각되어진다.
생합성 유전자
코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성에 관여하는 효소로서는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 들 수가 있다(Blanc, V., et al. Mol. Microbiol. 23, 191-202 (1997). 코리스미산으로 부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로를 개략하면 하기와 같다: 코리스미산에 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소가 작용해서 4-아미노-4-데옥시코리스미산을 생성하고, 생성한 4-아미노-4-데옥시코리스미산에 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제가 작용해서 4-아미노-4-데옥시플레펜산을 생성하고, 생성한 4-아미노-4-데옥시플레펜산에 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 작용해서 p-아미노페닐피루빈산을 생성한다.
4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소는 코리스미산에 작용해서, 이 것을 4-아미노-4-데옥시코리스미산으로 변환하는 효소를 의미한다.
4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소는, 코리스미산으로부터p-아미노안식향산 생합성계의 일부로서 생물계에 넓게 존재하고 있다.p-아미노안식향산은 코리스미산으로부터 2단계의 반응으로 생성된다. 이 중, 처음의 반응을 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소가 촉매하고, 후반응을 4-아미노-4-데옥시코리스미산 리아제가 촉매한다(Green, J. M. and Nicholas, B. P., J. Biol. Chem. 266, 12971-12975 (1991)).
4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자로서는, 대장균(Kaplan, J. B. and Nichols, B. P., J. Mol. Biol. 168, 451-468(1983), Goncharoff, P. and Nichols, B. P., J. Bacteriol. 159, 57-62(1984)), 고초균(Slock, J. et al., J. Bacteriol. 172, 7211-7226(1990)), 클레브시엘라·뉴모니아에(Klebsiella pneumoniae) (Kaplan, J. B. et al., J. Mol. Biol. 183, 327-340(1985), Goncharoff, P. and Nichols, B. P., Mol. Biol. Evol. 5, 531-548(1988)), 스트렙토마이세스·프리스티나스피랄리스(Streptomyces pristinaespi ralis) (Blanc, V., et al. Mol. Microbiol. 23, 191-202(1997)), 스트렙토마이세스·베네수엘라 (Streptomyces venezuelae)(Brown, M. P. et al., Microbiology 142, 1345-1355(1996)), 사카로마이세스·세레비시에(Saccharomyces cerevisiae) (Edman, J. C. et al., Yeast 9, 669-675(1993)) 유래의 것이 보고되어 있고, 이 들을 사용하는 것이 가능하다. 이들 이외의 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자를, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소활성을 갖는 생물에서 통상의 방법에 따라서 단리해서 사용해도 좋다.
한편, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소는, 대장균, 고초균, 클레브시엘라·뉴모니아에 유래의 것과 같이 2개의 폴리펩티드로 나누어져 있는 것과, 일부의 방선균 또는 사카로마이세스·세레비시에 유래의 것과 같이, 1개의 폴리펩티드로부터 되는 것의 두개로 대별할 수가 있다. 본 발명에서는, 복수의 유전자를 숙주에 도입할 필요가 있으므로, 1개의 폴리펩티드로부터 되는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자를 이용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자의 바람직한 예로서는, 서열번호 2의 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자이고, 더욱 바람직하기는, 서열번호 1에 나타내는 DNA서열을 함유하는 유전자이다.
본 발명에 있어서, 「개변 서열」이라함은 치환, 결실, 삽입, 및 부가로부터 되는 군에서 선택되는 1이상, 예를 들면, 1~수개의 개변을 갖는 서열을 말한다.
본 발명에 있어서, 개변 아미노산 서열이 「4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소활성을 갖는다」아닌지 여부는, 그의 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 기질에 작용시켜, 반응산물을 검출함으로써 평가할 수 있고, 예를 들면, 실시예 2에 기재된 방법에 따라서 평가할 수 있다.
4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산에 작용해서 이 것을 4-아미노-4-데옥시플레펜산으로 변환하는 효소를 의미한다.
4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제는, 4-아미노-4-데옥시플레펜산에 작용해서 이 것을p-아미노페닐피루빈산으로 변환하는 효소를 의미한다.
4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산데히드로게나제를 코드하는 유전자는,p-아미노페닐피루빈산을 생합성할수 있는 생물로부터 얻을 수가 있다. 더욱 구체적으로는, 프리스티나마이신I (pristinamycinI)을 생산하는 스트렙토마이세스·프리스티나스피랄리스(Streptomyc es pristinaespiralis), 베르나마이신 B(vernamycin B)를 생산하는 스트렙토마이세스·로이덴스(Streptomyces loidens), 코리네신(corynesin)을 생산하는 노카르디아·파라피니카(Nocardia parafinnica) 및 코리네박테륨·하이드로카르보클라스터스 (Corynebacterium hydrocarboclastus), 클로람페니콜(chloramphenicol)을 생산하는 스트렙토마이세스·베네수엘라(Streptomyces venezuelae) 등을 들 수가 있다. 이 중, 스트렙토마이세스·프리스티나스피랄리스(Streptomyces pristinaespiralis)로부터는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제 및 4-아미노-4-옥시플레핀산 데히드로게나제를 코드하는 것으로 추정되는 각각의 유전자가 이미 단리되어, 그의 염기서열이 명백해져 있어(V. Blanc et al., Mol. Microbiol., 23, 191-202(1997)), 본 발명에 이용가능하다.
코리스미산 무타제 및 플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 각각의 유전자는, 세균, 효모, 식물 등에서 이미 다수 단리되고 있고, 이 것을 기초로 해서 단백질공학적방법 또는 진화공학적방법을 이용하여, 적당한 아미노산을 치환, 결실 또는 부가해서 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제활성 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제활성을 갖도록 개변하는 것은 가능하고, 개변된 유전자를 본 발명에 이용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자의 바람직한 예로서는, 서열번호 4의 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자이고, 더욱 바람직하기는, 서열번호 3의 DNA서열을 함유하는 유전자이다.
본 발명에 있어서, 개변 아미노산 서열이 「4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제 활성을 갖는다」아닌지 여부는, 그의 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 기질에 작용시켜, 반응산물을 검출함으로써 평가할 수 있고, 예를 들면, 실시예 3에 기재된 방법에 따라서 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자의 바람직한 예로서는, 서열번호 6의 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자이고, 더욱 바람직하기로는, 서열번호 5의 DNA서열을 함유하는 유전자이다.
본 발명에 있어서, 개변 아미노산 서열이 「4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제 활성을 갖는다」아닌지 여부는, 그의 아미노산 서열로부터 되는 단백질을 기질에 작용시켜, 반응산물을 검출해서 평가할 수 있으며, 예를 들면, 실시예 4에 기재된 방법에 따라서 평가할 수 있다.
본 발명에 있어서 생합성에 관여하는 효소의 아미노산 서열이 부여되면, 그 것을 코드하는 뉴클레오티드 서열은 용이하게 정해지어, 서열번호 2,4, 및 6에 기재되는 아미노산 서열을 코드하는 여러 가지의 뉴클레오티드 서열을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명에 의한 생합성 유전자라함은, 서열번호 1,3, 및 5에 기재된 DNA서열의 일부 또는 전부에 가해서, 동일한 아미노산을 코드하는 DNA서열에 있어서 축중관계에 있는 코돈을 DNA서열로서 갖는 서열을 의미하는 것으로 하고, 또한,이들에 대응하는 RNA서열도 포함된다.
형질전환체
본 발명의 형질전환체는, 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성에 관여하는 유전자를 함유해서 되는, 숙주세포내에서 복제가능하고, 또한, 동유전자가 발현가능한 상태에서 함유하는 DNA분자, 특히 발현벡터를 숙주에 도입해서 얻을 수 있다.
본 발명에 있어서는, 복수의 생합성 유전자를 숙주에 도입하는 경우, 각 유전자는 동일 또는 각각의 DNA분자에 함유되어 있어도 좋다. 또한, 숙주가 세균인 경우에는, 각 유전자를 폴리시스트론성 mRNA로서 발현시키도록 설계하여, 1개의 DNA분자로 하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 이용되는 발현 벡터는, 사용하는 숙주세포의 종류를 감안하면서, 바이러스, 플라스미드, 코스미드벡터 등으로부터 적당히 선택할 수가 있다. 예를 들면, 숙주세포가 대장균인 경우는, λ파이지계의 박테리오파아지, pBR, pUC계의 플라스미드, 고초균의 경우는 pUB계의 플라스미드, 효모의 경우는 YEp, YRp, YCp, YIp계의 플라스미드 벡터를 들 수가 있다.
또, 사용되는 플라스미드 벡터 중, 적어도 하나는, 형질전환체를 선발하기 위한 선택 마커를 함유하는 것이 바람직하고, 선택 마커로서는 약제내성 유전자, 영양요구성을 상보하는 유전자를 사용할 수 있다. 그의 바람직한 구체예로서는, 사용하는 숙주가 세균의 경우는, 암피실린 내성 유전자, 가나마이신 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 등이고, 효모의 경우는 트립토판 생합성 유전자(TRP1), 우라실 생합성 유전자(URA3), 로이신 생합성 유전자(LEU2) 등이고, 곰팡이의 경우는 하이그로마이신 내성 유전자, 비아라호스 내성 유전자, 블레오마이신 내성 유전자, 오레오바시딘 내성 유전자 등이고, 식물의 경우에는 가나마이신 내성 유전자, 비아라호스 내성 유전자 등을 들 수가 있다.
또한, 발현 벡터에 있어서는, 각 유전자의 발현에 필요한 제어서열, 예를 들면, 프로모터, 전사개시신호, 리보솜결합부위, 번역정지시그날, 전사종결신호 등의 전사조절신호, 번역조절신호 등이, 생합성 유전자에 작동가능하게 연결되어 있어도 좋다. 제어서열의 선택 및 연결은 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
프로모터로서는, 예를 들면, 대장균에 있어서는 락토오스오페론, 트립토판오페론 등의 프로모터를, 효모에서는 알콜데히드로게나제 유전자, 산성 포스파타제 유전자, 갈락토오스 자화성 유전자, 글리세로알데히도3인산 데히드로게나제 유전자 등의 프로모터를, 곰팡이에서는 α-아밀라제 유전자, 글루코아밀라제 유전자, 세로비오하이드롤라제 유전자, 글리세로알데히도3인산 데히드로게나제 유전자,Abp1유전자 등의 프로모터를, 식물에서는 CaMV 35SRNA 프로모터, CaMV 19SRNA 프로모터, 노발린 합성효소 유전자 프로모터 등을 선택할 수 있다.
생물의 형질전환에는, 칼슘이온법, 리튬이온법, 일렉트로포레이션법, PEG법, 아그로박테륨법, 파팅글간법 등과 같은 통상의 방법을 이용할 수 있고, 형질전환되는 생물에 따라서 선택할 수 있다.
본 발명에 있어서는, 형질전환체를 배양하여, 그의 배양물을 얻어서 소망의 수식된 이차 대사산물을 얻을 수가 있다. 본 발명에 의한 형질전환체의 배양도 통상의 방법에 따라서, 배지, 배양조건 등을 적당히 선택해서 행할 수 있다.
배지로서는, 본 발명의 형질전환체가 동화할 수 있는 탄소원, 자화할 수 있는 질소원, 무기염류, 각종 비타민, 글루타민산 또는 아스파라긴산 등의 각종 아미노산, 뉴클레오티드 등의 미량 영양소, 항생물질 등의 선발약제를 첨가할 수도 있다.
또, 본 발명의 형질전환체의 발육을 돕고, 목적하는 이차 대사산물의 생산을 촉진하는 유기물 및 무기물을 적당히 첨가할 수 있다. 또한, 필요에 따라서, 기타 영양물을 적당히 함유하는 합성배지 또는 천연배지를 사용할 수 있다.
배지에 사용되는 탄소원 및 질소원으로서는, 본 발명의 형질전환체의 이용가능한 것이라면 어떤 종류라도 좋다. 동화할 수 있는 탄소원으로서는, 예를 들면, 자당, 포도당, 전분, 글리세린, 글루코스, 슈크로스, 글리세롤, 프락토스, 말토스, 만니톨, 키실로스, 갈락토스, 리보스, 덱스트린, 동·식물유 등, 또는, 그의 가수분해물 등의 여러가지의 탄수화물을 이용할 수 있다. 그의 농도는, 통상, 배지에 대해서 0.1~5%가 바람직하다.
자화할 수 있는 질소원으로서는, 예를 들면, 펩톤, 육엑스, 콘·스팁·리카, 탈지 대두분 등의 동식물체 성분 또는 침출엑스류, 호박산암모늄염류, 주석산 암모늄 등의 유기산 암모늄류, 요소 기타 각종 무기산 또는 유기산의 질소함유 화합물도 사용가능하다.
또, 무기염류로서는, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 코발트, 염소, 인산, 황산 및 기타 이온을 생성할 수 있는 염류를 적당히 사용할 수 있다.
물론, 기타 성분으로서, 예를 들면, 효모 등의 미생물의 균체 또는 침출액 및 침출엑스 등, 또, 식물체의 가는 분말을 함유하는 배지에 있어서도 본 발명의 형질전환체의 생육 및 목적으로 하는 이차 대사산물의 생산축적을 방해하지 않는 한 어떤 것도 적당히 사용할 수 있다. 또, 영양요구성을 나타내는 변이체를 배양하는 경우에는, 그의 영양요구성을 만족시킬 수 있는 물질을 배지에 첨가하지만, 이 종류의 영양소는, 천연물을 함유하는 배지를 사용하는 경우는, 특히 첨가를 필요로 하지 않는 경우가 있다.
배지의 pH는, 예를 들면 pH6~pH8 정도이다. 배양법으로서는, 호기적 조건에서의 진탕배양법, 통기교반배양법 또는 심부호기배양법에 의해 행할 수가 있다. 배양에 적당한 온도는, 15~40℃이지만, 많은 경우 26~37℃ 부근에서 생육한다. 목적하는 이차 대사산물의 생산은, 배지 및 배양조건, 또는 사용한 숙주에 따라 다르지만, 어떤 배양법에 있어서도, 통상 2~25일간에서 그의 축적이 최고에 달한다. 목적하는 이차 대사산물의 양이 최고로 되었을 때에 배양을 정지하고, 배양물에서 목적물질을 단리·정제한다.
이들의 배지조성, 배지의 액성, 배양온도, 교반속도, 통기량 등의 배양조건은 사용하는 형질전환체 및 외부의 조건 등에 따라서 결과가 얻어지도록 적당히 조절, 선택되는 것은 말할 것도 없다. 액체배양에 있어서, 발포가 있을 때는, 실리콘유, 식물유, 광물유, 계면활성제 등의 소포제를 적당히 사용할 수가 있다. 이와 같이해서 얻어진 배양물에 축적되는 목적하는 이차 대사산물은, 본 발명의 형질전환체내 및 배양여액 중에 함유되므로, 배양물을 원심분리해서 배양여액과 형질전환체로 분리하여, 각각으로부터 목적하는 이차 대사산물을 채취하는 것이 가능하다.
배양여액으로부터 목적하는 이차 대사산물을 채취하는데는, 통상의 방법에 따라, 배양물질로부터 목적하는 이차 대사산물을 채취하는데 사용되는 수단을, 단독 또는 임의의 순서로 조합 또는 반복해서 사용된다. 즉, 예를 들면, 추출여과, 원심분리, 투석, 농축, 건조, 동결, 흡착, 탈착, 각종 용매에 대한 용해도의 차이를 이용하는, 예를 들면, 침전, 결정화, 재결정, 전용(轉溶), 향류분배법(向流分配法), 크로마토그라피 등의 수단이 사용된다.
또, 본 발명의 형질전환체내의 배양물에서, 목적하는 이차 대사산물을 얻을 수 있다. 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 배양물로부터 추출(마쇄처리, 가압파쇄 등), 회수(여과, 원심분리 등) 및 정제(염석법, 용매침전법) 등의 방법이 사용된다.
얻어진 조물질은, 통상의 방법에 의해, 예를 들면, 실리카겔, 알루미나 등의 담체를 사용하는 컬럼 크로마토그라피 또는 ODS담체를 사용하는 역상 크로마토그라피에 의해 정제할 수 있다. 이상과 같은 방법에 의해, 또는 이들을 적당히 조합해서, 본 발명의 형질전환체의 배양물로부터 목적하는 순수한 이차 대사산물이 얻어진다.
PF 1022물질 유도체를 생산하는 형질전환체
본 발명의 바람직한 태양에 의하면, 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 유전자(생합성 유전자)가 도입된 PF 1022물질 생산균의 형질전환체가 제공된다.
이 형질전환체는 PF 1022물질 유도체를 생산할 수가 있다. 형질전환되는 PF 1022물질 생산균은Mycelia sterilia, 바람직하기는 FERM BP-2671의 수탁번호의 것과 생명공학공업 기술연구소에 기탁된 균체일 수 있다.
생합성 유전자는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자로부터 되는 것일 수 있다. 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자는, 바람직하기는, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자일 수 있다. 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자는, 바람직하기는, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자일 수 있다. 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자는, 바람직하기는, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 유전자일 수 있다.
형질전환에 사용되는 발현 벡터로서는, PF 1022물질 생산균에서 기능하는 제어서열(프로모터, 터미네이터 등)에 생합성 유전자를 작동가능하게 연결한 발현 벡터가 바람직하고, 가장 바람직하기는 PF 1022 균주(Mycelia sterilia, FERM BP-2671)에 있어서 제어서열을 생합성 유전자에 작동가능하게 연결한 발현 벡터이다.
형질전환체는, FERM BP-7255의 수탁번호로 생명공학공업 기술연구소에 기탁된 형질전환체 55-65주일 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양에 의하면, PF 1022물질 생산균의 형질전환체를 배양하여, PF 1022물질 유도체를 채취하는 것으로 되는, PF 1022물질 유도체의 제조법이 제공된다.
이하, 실시예에 의해서 본 발명을 상술하지만, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 스트렙토마이세스·베네수엘라(Streptomyces venezuelae)로부터 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자의 단리
(1) 프로브용 DNA 단편의 취득
50㎖분의 액체 배지(2% 가용성 전분, 1% 폴리펩톤, 0.3% 육엑스, 0.05% 인산이수소칼륨, pH7.0)을 250㎖용량의 삼각 흘라스크에서 생산했다. 이 배지에, 스크렙토마이세스·베네수엘라(Streptomyces venezuelae)ISP5230주 및 140-5주를 각각 식균하여, 28℃에서 24시간 동안 배양했다. 배양 종료 후, 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 모으고, 이들의 균체로부터 Genetic Manipulation ofStreptomyces, A Laboratory Manual (D.A. Hopwood et al., The John Innes Foundation, 1985)에 기재된 방법으로 염색체 DNA를 조제했다.
다음에, 상기 스트렙토마이세스·베네수엘라(Streptomyces venezuelae)ISP 5230주의 염색체 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 7 및 서열번호 8에 기재된 올리고뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하는 PCR를 행했다. PCR는, TaKaRa LA PCRTMkit Ver. 2.1(寶酒造社제)를 사용하여, GeneAmp PCR System 2400(Perkin-Elmer사제)을 사용해서 행했다. 반응액은, 염색체 DNA를 1㎕(0.62㎍상당량), 킷트에 부착된 10배 농도 반응용 완충액을 5㎕, 2.5mM dNTP용액을 8㎕, 100pmol/㎕의 농도로 조절한 상기 프라이머를 각 0.5㎕씩, 디메틸술폭시드(和光純藥社제)를 5㎕, TaKaRa LA-Taq (2.5U)를 0.5㎕, 멸균수를 29.5㎕ 첨가해서 50㎕로 했다. 반응은, 94℃, 10분간의 전처리 후, 94℃에서 1분간, 50℃에서 1분간, 72℃에서 3분간의 배양을 25사이클 행했다. 반응 종료 후, 반응액의 일부를 아가로스겔 전기영동에 제공한 결과, 약 2kbp의 DNA 단편이 특이적으로 증폭되고 있는 것이 확인되었다. 그래서, 나머지의 반응액을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 추출하고, 에타놀침전을 행했다. 침전을 멸균수에 재용해하고, 60㎕의 스케일로 제한효소BamHI로 소화한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여, 약 2kbp의 밴드를 통상의 방법에 따라서 잘라내서 DNA단편을 회수했다.
이 DNA단편을 플라스미드 pTrcHis B(인비트로디엔사제)의BamHI부위에 클로닝했다. 얻어진 플라스미드의 삽입단편의 제한효소 지도는 브라운 등(M.P.Brown, et al., Microbiology, 142, 1345-1355(1996))에 의해서 나타내 있는pabAB유전자(U21728)의 것과 일치한 사실에서,pabAB유전자가 클로닝된 것으로 판단하여, 이 플라스미드를 pTH-PAB로 명명했다. 후술하는 염색체 DNA 라이브라리의 스크리닝에는, 플라스미드 pTH-PAB로부터 제한효소BamHI로 소화한 후, 아가로스겔전기영동으로 분리, 회수해서 얻어지는 삽입단편을 프로브로서 사용했다.
(2) 염색체 DNA 라이브라리의 스크리닝과 유전자의 단리
스트렙토마이세스·베네수엘라(Streptomyces venezuelae) 140-5주의 염색체 DNA 약 10㎍을 제한효소Sau3AI로 부분 소화한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여, 10kbp~20kbp의 DNA단편을 분리·회수했다.
이와 같이해서 회수한 10kbp~20kbp의 DNA단편 약 0.5㎍과, 미리 제한효소BamHI 및XhoI로 이중 소화해 놓은 λDASHⅡ 1㎍을 T4 DNA 리가제로 연결하여, GigapackⅢ 패케이징 엑스트랙트(스트라다진사제)를 사용해서in vitro패케이지하여, 염색체 DNA 라이브라리를 작성했다. 이 것을 대장균 XLI-Blue MRA에 감염시켜서 플라크를 형성시켰다.
(1)에서 단리한 약 2kbp의 DNA단편을 프로브로서 사용하여, ELC 다이렉트 DNA/RNA 라벨링·검출시스템(Amersham Phamacia Biotech사제)을 사용해서 플라크 하이브리다이제이션을 행하여, 약 24000개의 플라크를 스크리닝했다. 취득된 양성 클론 중 10개에 대해서 이차 스크리닝을 행하여, 양성 클론을 순화한 후, 파아지 DNA를 조제했다.
이들 파아지 DNA를 제한효소BamHI로 소화하여, 사잔해석을 행한 결과, 프로브는 약 1.8kbp 및 3.4kbp의 2종류의 DNA단편에 하이브리다이즈하는 것이 분명해졌다. 또, 파아지 DNA의 제한효소 지도의 해석에서, 이들 2종류의 DNA단편은 염색체 DNA상에서 인접하는 단편인 것이 분명해졌다.
그래서, 이들 2종류의 DNA단편의 전염기서열을 형광 DNA 시퀀서 ABI PRISM377(Perkin Elmer사제)을 사용해서 결정했다. 그리고, 오픈 리딩 프레임(ORF)을 검색한 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, ORFI~IV의 ORF를 발견할 수가 있었다. 각 ORF로부터 추정되는 아미노산 서열에 대해서, 데이타 베이스를 이용해서 기지의 아미노산 서열과의 상동성을 검색한 결과, ORFI는 p-아미노안식향산 합성효소와, ORFⅡ는 플레펜산 데히드로게나제와, ORFⅢ은 코리스미산 무타제와 각각 상동성을 나타내는 것이 명백해졌다. 그래서, ORFI, ORFⅡ 및 ORFⅢ의 유전자를 각각papA,papC 및papB로 명명했다.papA가 코드하는 아미노산 서열 및 염기서열을 각각 서열번호 2 및 서열번호 1에,papB가 코드하는 아미노산 서열 및 염기서열을 각각 서열번호 4 및 서열번호 3에,papC가 코드하는 아미노산 서열 및 염기 서열을 각각 서열번호 6 및 서열번호 5에 나타냈다.
실시예 2. 대장균에 있어서 papA 유전자의 발현
papA 유전자의 번역영역을 취득하기 위하여, 실시예 1에 나타낸 양성 클론 유래의 파아지 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 9 및 서열번호 10에 기재된 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로서 PCR를 행했다. PCR는, DNA 폴리머라제로서 KOD Dash (東洋紡績社제)를 사용하여, GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer사제)을 사용해서 행했다. 반응액은, 파아지 DNA를 1㎕(1㎍ 상당량), 효소에 부착된 10배 농도 반응용 완충액을 5㎕, 2mM dNTP용액을 5㎕, 100pmol/㎕의 농도로 조정한 상기 프라이머를 각 1㎕씩, 디메틸술폭시드(和光純藥社제)를 5㎕, KOD Dash를 1㎕, 멸균수를 31㎕ 첨가해서 50㎕로 했다. 반응은, 94℃, 5분간의 전처리 후, 94℃에서 30초간, 50℃에서 2초간, 72℃에서 30초간의 배양을 15사이클 행했다. 얻어진 반응액을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 추출하고, 에타놀침전을 행했다. 침전을 멸균수에 재용해하여, DNA 블라팅 킷트(寶酒造社제)를 이용해서 DNA단말을 평활화했다. 또한, T4 DNA키나제(和光純藥社제)를 이용해서 5'말단을 인산화한 후, 아가로스겔 전기영동에 제공하여, 약 2kbp의 DNA단편을 잘라내어, 회수한 후, 플라스미드 pUC118의SmaI부위에 클로닝하여, 플라스미드 pUC118-papA를 얻었다.
pUC118-papA의 삽입단편에 대해서, 형광 DNA 시퀀서 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer사제)를 사용해서 염기서열을 결정한 결과, 서열번호 1에 기재된 염기서열의 2043번째의 시토신이 아데닌으로 치환되어 있는 것이 명백해졌다. 이 것은, PCR에 의한 DNA단편의 증폭시의 에러로 추정되었지만, 코드되는 아미노산 서열에는 변화가 없으므로, pUC118-papA의 삽입단편을 이하의 실험에 사용하는 것으로 했다.
pUC118-papA를 대장균 JM110에 도입하여, 취득된 형질전환체로부터 통상의 방법에 의해 플라스미드를 조제했다. 이 것을 제한효소Bc1I로 소화한 후, 아가로스겔 전기영동에 제공하여, 약 2kbp의Bc1I DNA단편을 분리·회수했다.
한편, 플라스미드 pTrc99A (Amersham Pharmacia Biotech사제)를 제한효소NcoI로 소화하여, Mung Bean Nuclease(和光純藥社제)를 사용해서 DNA 말단을 평활화했다. 이 것을 또한 제한효소SmaI로 소화한 후, T4 DNA 리가제로 자기연결해서 플라스미드 pTrc101을 얻었다.
pTrc101을 제한효소BamHI로 소화하여, 알카리 포스파타제(寶酒造社제)처리를 실시한 후, 상기 2kbp의Bc1I DNA 단편과 연결했다. pTrc101에 함유되는 프로모터에 대해서,papA 유전자가 정방향으로 삽입된 플라스미드를 선택하여, pTrc-papA로 명명했다. 여기 까지의 플라스미드의 구축공정에 대해서 도 2에 나타냈다.
pTrc-papA를 보유하는 대장균 JM109주를, 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB액체배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모엑스, 0.5% 염화나트륨)중에서, 37℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 얻어진 배양액 1㎖를 100㎖의 같은 배지에 시이드하여, 30℃에서 4시간 동안 배양한 후, 1㎖의 100mM 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)를 첨가하고, 또 30℃에서 3시간 동안 배양했다. 배양 후, 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 모아서, 4㎖의 세포 파쇄용 완충액(50mM 트리스-염산 (pH8.0), 5mM EDTA, 10% 글리세롤)에 현탁한 후, 초음파처리에 의해 세포를 파쇄했다. 파쇄 후, 원심분리에 의해 상징액을 얻어, 이 것을 세포추출액으로 했다. 또, 플라스미드 pTrc 101을 보유하는 대장균 JM109주에 대해서도 동일한 처리를 행하여, 세포추출액을 조제했다.
이와 같이해서 조제한 세포추출액을 사용해서 효소활성을 측정했다. 즉, 세포추출액을 100㎕, 증류수를 400㎕, 기질용액(10mM 코리스미산 바륨염(Sigma사제), 10mM 글루타민(和光純藥社제), 10mM 염화마그네슘, 100mM MOPS(和光純藥社제), pH7.5)를 500㎕ 혼합하고, 30℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액의 일부를 전자동 아미노산 분석기 JLC-500/V(日本電子株式會社제)를 사용해서 분석했다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, pTrc-papA를 보유하는 대장균에서 조제한 세포추출액을 사용한 경우에는, 치아-유 피. 텡 등(Chia-Yu P. Teng, et al.,J. Am. Chem. Soc., 107, 5008-5009(1985))의 방법에 따라서 합성한 4-아미노-4-데옥시코리스미산 표품과 동일의 유지시간의 위치에 피크가 검출되었다. 한편, 자비처리한 세포추출액이나, pTrc101을 보유하는 대장균에서 조제한 세포추출액을 사용한 경우에는, 그의 위치에 피크는 검출되지 않았다. 이상의 결과에서papA유전자는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하고 있는 것이 나타났다.
실시예 3. 대장균에 있어서 papB 유전자의 발현
papB 유전자의 번역영역을 취득하기 위하여, 실시예 1에 나타낸 양성 클론 유래의 파아지 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 11 및 서열번호 12에 기재된 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로해서 PCR를 행했다. PCR는, DNA 폴리머라제로서 KOD Dash(東洋紡績社제)를 사용하여, GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer사제)을 사용해서 행했다. 반응액은 파아지 DNA를 1㎕(1㎍ 상당량), 효소에 부착된 10배 농도 반응용 완충액을 5㎕, 2mM dNTP용액을 5㎕, 100pmol/㎕의 농도로 조정한 상기 프라이머를 각 1㎕씩, 디메틸술폭시드(和光純藥社제)를 5㎕, KOD Dash를 1㎕, 멸균수를 31㎕ 첨가해서 50㎕로 했다. 반응은, 94℃, 5분간의 전처리 후, 94℃에서 30초간, 50℃에서 2초간, 72℃에서 30초간의 배양을 15사이클 행했다. 얻어진 반응액을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 추출하고, 에타놀침전을 행했다. 침전을 멸균수에 재용해하여, 제한효소BamHI로 소화한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여, 약 0.3kbp의 밴드를 정법(定法)에 따라서 잘라내서 DNA단편을 회수했다.
pTrc101을 제한효소BamHI로 소화하여, 알카리 포스파타제(寶酒造社제)처리를 실시한 후, 상기 0.3kbp의BamHI DNA 단편과 T4 DNA 리가제로 연결했다. pTrc101에 함유되는 프로모터에 대해서,papB 유전자가 정방향으로 삽입된 플라스미드를 선택하여, pTrc-papB로 명명했다(도 4). pTrc-papB의 삽입단편에 대해서, 형광 DNA시퀀서, ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Perkin-Elmer사제)를 이용해서 염기서열을 결정하여, 서열번호 3에 기재된 염기서열과 일치하고 있는 것을 확인했다.
pTrc-papB를 보유하는 대장균 JM109주를, 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB액체 배지(1% 박토트립톤, 0.5%효모엑스, 0.5% 염화나트륨) 중에서, 37℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 얻어진 배양액 1㎖를 100㎖의 같은 배지에 시이드하여, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1㎖의 100mM 이소프로필 티오 갈락토시드(IPTG)를 첨가하고, 또 37℃에서 5시간 동안 배양했다. 배양 후, 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 모아, 4㎖의 세포 파쇄용 완충액(50mM 트리스염산(pH8.0), 5mM EDTA, 10% 글리세롤)에 현탁한 후, 초음파처리에 의해 세포를 파쇄했다. 파쇄 후, 원심분리에 의해 상징액을 얻고, 이 것을 세포추출액으로 했다. 또, 플라스미드 pTrc 101을 보유하는 대장균 JM109주에 대해서도 동일한 처리를 행하여, 세포추출액을 조제했다.
이와 같이해서 조제한 세포추출액을 사용해서 세포활성을 측정했다. 즉, 세포추출액을 50㎕, 증류수를 200㎕, 기질용액(2㎎/㎖ 4-아미노-4-데옥시코리스미산, 10mM 염화마그네슘, 100mM MOPS(和光純藥社제), pH7.5)를 250㎕ 혼합하고, 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액의 일부를 전자동 아미노산분석기 JLC-500/V(日本電子株式會社제)를 사용해서 분석했다.
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, pTrc-papB를 보유하는 대장균에서 조제한 세포추출액을 사용한 경우에는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산의 피크가 감소하여, 4-아미노-4-데옥시플레펜산의 피크가 새로히 검출되었다. 또, 5분간 자비처리를 실시한 세포추출액을 사용한 경우에서도 동일한 결과가 얻어졌다.
한편, pTrc101을 보유하는 대장균에서 조제한 세포추출액을 사용한 경우에는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산의 피크에 변화가 없고, 4-아미노-4-데옥시플레펜산의 피크도 검출되지 않았다. 이상의 결과에서papB유전자가 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하고 있는 것, 및papB유전자에 코드되는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제는 5분간의 자비처리에서도 실활되지 않을 만큼의 내열성을 갖고 있는 것이 나타났다.
실시예 4. 대장균에 있어서 papC 유전자의 발현
papC유전자의 번역영역을 취득하기 위하여, 실시예 1에 나타낸 양성 클론 유래의 파아지 DNA를 주형으로 하여, 서열번호 13 및 서열번호 14에 기재된 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로해서 PCR를 행했다. PCR는, DNA 폴리머라제로서 KOD Dash (東洋紡績社제)를 사용하여, GeneAmp PCR System 9700(Perkin-Elmer사제)를 사용해서 행했다. 반응액은, 파아지 DNA를 1㎕(1㎍ 상당량), 효소에 부착된 10배 농도 반응용 완충액을 5㎕, 2mM dNTP용액을 5㎕, 100pmol/㎕의 농도로 조정한 상기 프라이머를 각 1㎕씩, 디메틸술폭시드(和光純藥社제)를 5㎕, KOD Dash를 1㎕, 멸균수를 3㎕ 첨가해서 50㎕로 했다. 반응은, 94℃, 5분간의 전처리 후, 94℃에서 30초간, 50℃에서 2초간, 72℃에서 30초간의 배양을 15사이클 행했다. 얻어진 반응액을 페놀:클로로포름:이소아밀알콜(25:24:1)로 추출하여, 에타놀침전을 행했다.침전을 멸균수에 재용해하여, 제한효소BamHI로 소화한 후, 아가로스겔 전기영동을 행하여, 약 1kbp의 밴드를 통상의 방법에 따라서 잘라내어 DNA단편을 회수했다.
플라스미드 pET-11c(스트라다진사제)를 제한효소BamHI로 소화하여, 알카리 포스파타제(寶酒造社제)처리를 실시한 후, 상기 1kbp의BamHI DNA 단편과 T4 DNA 리가제로 연결했다. pET-11c에 함유되는 프로모터에 대하여,papC유전자가 정방향으로 삽입된 플라스미드를 선택하여, pET-papC로 명명했다.
pET-papC의 삽입단편에 대해서, 형광 DNA시퀀서 ABI PRISM 310 Genetic Analyser (Perkin-Elmer사제)를 사용해서 염기서열을 결정하여, 서열번호 5에 기재된 염기서열과 일치하고 있는 것을 확인했다.
한편, pET-papC를 사용해서papC유전자를 발현시킨 경우, 벡타 유래의 14아미노산으로부터 되는 펩티드가papC유전자 산물의 N 말단측에 부가되기 때문에,papC유전자 산물의 성질을 정확하게 평가할 수 없는 것이 예상되었다. 그래서, pET-papC를 제한효소NdeI로 소화한 후, T4 DNA 리가제로 자기연결해서 플라스미드 pET-papC1을 얻었다. pET-papC1을 사용하는 것으로, 융합단백질로서는 아니고,papC유전자 산물 그의 것을 대장균으로 생산시키는 것이 가능해졌다. 여기 까지의 플라스미드의 구축공정에 대해서 도 6에 나타냈다.
pET-papC1을 보유하는 대장균 BL21 (DE3)주를, 100㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 LB 액체 배지(1% 박토트립톤, 0.5% 효모엑스, 0.5% 염화나트륨) 중에서, 37℃에서 하룻밤 동안 배양했다. 얻어진 배양액 1㎖를 100㎖의 같은 배지에 시이드하고, 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1㎖의 100mM 이소프로필티오갈락토시드(IPTG)을 첨가하고, 또 37℃에서 5시간 동안 배양했다. 배양 후, 원심분리에 의해 균체를 모으고, 4㎖의 세포파쇄용 완충액(50mM 트리스-염산 (pH8.0), 5mM EDTA, 10% 글리세롤)에 현탁한 후, 초음파처리에 의해 세포를 파쇄했다. 파쇄 후, 원심분리에 의해 상징액을 얻고, 이 것을 세포추출액으로 했다. 또, 플라스미드 pET-11c를 보유하는 대장균 BL21(DE3)주에 대해서도 동일한 처리를 행하여, 세포추출액을 조제했다.
이와 같이해서 조제한 세포 추출액을 사용해서 효소활성을 측정했다. 즉, 이 세포 추출액을 40㎖, 실시예 3에 기재된 pTrc-papB를 보유하는 대장균에서 조제하고, 또한 자비처리를 실시한 세포 추출액을 10㎕, 증류수를 190㎕, 10mM NAD 용액을 10㎕, 기질용액(2㎎/㎖, 4-아미노-4-데옥시코리스미산, 10mM 염화마그네슘, 100mM MOPS(和光純藥), pH7.5)를 250㎕ 혼합하고, 30℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응 종료 후, 반응액의 일부를 전자동 아미노산분석기 JLC-500/V(日本電子株式會社제)를 사용해서 분석했다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, pET-papC1을 보유하는 대장균에서 조제한 세포추출액을 사용한 경우에는, 4-아미노-4-데옥시코리스미산의 피크가 감소하고, 또papB유전자 산물에 의해서 생기는 4-아미노-4-데옥시플레펜산의 피크도 소실되었다.p-아미노페닐피루빈산은 전자동 아미노산분석기 JLC-500/V에서 검출되지 않기 때문에, 그의 생성을 직접 확인하는 것은 할 수 없었다.
그러나,p-아미노페닐알라닌의 피크가 검출되고, 이 것은papC유전자산물에 의해서 생기는p-아미노페닐피루빈산이 대장균의 아미노트란스페라제에 의해서 아미노화되어 생긴 것으로 추정되었다. 한편, 자비처리를 실시한 세포 추출액 및 pET-11c를 보유하는 대장균에서 조제한 세포 추출액을 사용한 경우에는,papB유전자 산물에 의해서 생긴 4-아미노-4-데옥시플레펜산의 피크에 변화는 없었다. 이상의 결과에서papC유전자는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하고 있는 것이 나타났다.
실시예 5. PF 1022 생산균 도입용 플라스미드 pPF260-A2 및 pPF260-A3의 구축
PF 1022 생산균 중에서papA유전자를 발현시키기 위한 플라스미드 pPF260-A2 및 pPF260-A3는 도 8에 나타낸 바와 같이해서 구축했다.
PF 1022 생산균용 발현벡터 pABPd를 구축하고, 이어서 이 것에 실시예 2에 기재된 플라스미드 pUC118-papA에서 얻어진 DNA 단편을 연결해서 발현 벡터로 했다. 구체적으로는 하기와 같이해서 발현 벡터를 구축했다.
PF 1022물질 생산균의 게놈 DNA의 단리
PF 1022물질 생산균 (FERM BP-2671)의 게놈 DNA의 단리는 (H. Horiuchi et al., J. Bacteriol., 170, 272-278 (1988))에 기재된 방법에 따랐다. 구체적으로는, 우선 PF 1022 균주(FERM BP-2671)을 종배지(가용성 전분 2.0%, 글루코스 1.0%, 폴리펩톤 0.5%, 소맥배아 0.6%, 효모엑스 0.3%, 대두박 0.2% 및 탄산칼슘 0.2%; 살균전 pH7.0; WO97/00944호 실시예 1 참조)에서 2일간 배양하고, 원심분리(3500rpm, 10분)에 의해서 고체를 회수했다. 이어서, 얻어진 균체를 동결건조 후, TE에 현탁하고, 3% SDS용액 중, 60℃에서 30분간 처리 후, TE 포화 페놀추출에 의해, 균체잔사를 제거했다. 추출액은 에타놀 침전화 후, 리보뉴클레아제 A(Sigma사제) 및 프로테이나제 K (和光純藥社제)처리하고, 또 12% 폴리메틸렌 글리콜 6000에 의해 헥산을 침전화시켰다. 이 것을 TE 포화페놀추출, 에타놀침전화를 행하고, 같은 침전을 TE에 용해아여, 이 것을 게놈 DNA로 했다.
PF 1022물질 생산균의 게놈 라이브라리의 제작
상기와 같이 조제한 PF 1022물질 생산균 유래의 게놈DNA를Sau3AI에 의해 부분 소화했다. 이 것을 파아지벡터, λEMBL3 클로닝 킷트(스트라다진사제)의BamHI 아암에 T4 리가제(寶酒造社제 라이게이션 킷트 Ver.2)를 사용해서 연결시켰다. 이 것을 에타놀 침전 후, TE에 용해했다. 연결 혼합물의 전량을 GigapackⅢ 플러스 패케이징 킷트(스트라다진사제)를 사용해서, 대장균 LE392주에 감염시켜, 파아지 플라크를 형성했다. 이 방법에 의해 얻어진 1.3 x 104개 (2.6 x 104PFU/㎖)의 파아지 라이브라리를 사용해서Abp1유전자의 클로닝을 행했다.
PF 1022물질 생산균 유래의 게놈 DNA로부터의 Abp1유전자 클로닝
프로브는Abp1유전자의 번역병역을 PCR법에 의해 증폭하여 사용했다. 상기와 같이 PF 1022물질 생산균으로부터 조제한 게놈DNA를 주형에, 8-73U 및 8-73R로 되는 합성 프라이머를 사용해서, 렛쓰고 PCR킷트(사와디 테크놀로지사제)에 따라 PCR를 행했다. PCR의 반응조건은, 94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 72℃ 90초간의 스텝을 25회 반복함으로써 증폭을 행했다. 이하에 8-73U 및 8-73R의 DNA 서열을 나타낸다.
8-73U: CTCAAACCAGGAACTCTTTC (서열번호 15)
8-73R: GACATGTGGAAACCACATTTTG (서열번호 16)
이와 같이해서 얻어진 PCR산물은 ECL 다이렉트 시스템(Amersham Phamacia Biotech사제)을 사용해서 표지화했다. 상기와 같이 제작한 파아지플라크를, 하이본드 N+나일론 트란스 퍼 멤브레인(Amersham Pharmacia Biotech사제)에 전사하고, 알카리 변성 후, 5배 농도 SSC(SSC: 15mM 구연산삼나트륨, 150mM 염화나트륨)로 세정하고, 건조시켜 DNA를 고정했다. 킷트에 기재된 방법에 따라서, 1시간의 프레하이브리다이제이션(42℃) 후, 앞서 표지화한 프로브를 첨가하고, 16시간(42℃) 하이브리다이제이션을 행했다. 프로브의 세정은 상기 킷트에 기재된 방법에 따랐다. 프로브의 세정을 행한 나일론막은, 검출용액에 1분간 침지한 후, 메디칼 X선 필름(후지샤신필름사제)에 감광시켜, 1개의 양성 클론을 얻었다. 이 클론은 사잔해석의 결과, 적어도 6kb의HindⅢ 단편이 게놈DNA의 제한효소단편 길이와 일치했다. 이HindⅢ 단편의 제한효소 지도를 도 9에 나타냈다.HindⅢ 단편은 pUC119에 서브클로닝하여(pRQHin/119), 이하의 실험에 제공했다.
발현 벡터의 구축
pRQHin/119를 주형에Abp1유전자의 프로모터 영역 및 터미네이터 영역을 PCR법을 이용해서 증폭했다. 프로모터의 증폭은 ABP-Neco 및 ABP-Nbam, 한편, 터미네이터의 증폭은 ABP-Cbam 및 ABP-Cxba로 되는 프라이머를 사용하여, PCR 스파믹스 하이피델리티(라이프테크오리엔탈사제)에 의해 PCR법을 행했다. 반응조건은, 94℃ 30초간, 50℃ 30초간, 72℃ 90초간의 스텝을 25회 반복해서 증폭을 행했다.이하에, ABP-Neco, ABP-Nbam, ABP-Cbam 및 ABP-Cxba의 DNA 서열을 나타냈다.
ABP-Neco: GGGGAATTCGTGGGTGGTGATATCATGGC (서열번호 17)
ABP-Nbam: GGGGGATCCTTGATGGGTTTTGGG (서열번호 18)
ABP-Cbam: GGGGGATCCTAAACTCCCATCTATAGC (서열번호 19)
ABP-Cxba: GGGTCTAGACGACTCATTGCAGTGAGTGG (서열번호 20)
각 PCR산물은 마이크로스핀 S-400 칼럼 (Amersham Phamacia Biotech사제)로 정제하고, 에타놀침전화 후, 프로모터는EcoRI 및BamHI, 터메네이터는BamHI 및XbaI로 소화하여, 동일한 효소로 소화한 pBluescriptⅡKS+에 순차 연결했다. 이 것을XbaI로 소화하고, pMKD01(WO98/03667호)유래 데스토마이신 내성 카세트를 삽입하여 pABPd를 구축했다(도 10). pABPd은Abp1유전자의 프로모터 및 터미네이터를 갖는다.
실시예 2에 기재된 플라스미드 pUC118-papA로부터 약 2kbp의BclI DNA 단편을 조제했다. 이 것을, PF 1022 생산균용 발현 벡터 pABPd의BamHI부위에 삽입하여, 플라스미드 pPF260-A를 얻었다.
다음에, pPF260-A를 제한효소PstI 및BanHI로 이중 소화하여, 약 1.7kbp의 DNA 단편을 조제했다. 이 것을 pUC119의PstI 및BamHI 부위에 서브 클로닝하여, 플라스미드 pUC119-A를 얻었다. pUC119-A를 주형 DNA, 서열번호 21에 기재된 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하고, Muta-Gene in vitro 뮤타디네시스킷트(Bio-Rad사제)를 사용해서 부위 특이적 변이처리를 하여, 플라스미드 pUC119-A1을 얻었다.
다음에, pUC119-A1 및 pPF260-A를 제한효소PstI 및BanHI로 이중 소화하여, 약 1.7kbp 및 약 8.6kbp의 DNA 단편을 조제한 후, 이 들을 연결해서 플라스미드 pPF260-A2를 얻었다. 또, pPF260-A2를 제한효소XbaI로 소화한 후, T4 DNA 리가제로 자기연결해서 플라스미드 pPF260-A3를 얻었다.
실시예 6. PF 1022 생산균 도입용 플라스미드 pPF260-B3의 구축
PF 1022 생산균내에서papB유전자를 발현시키기 위한 플라스미드 pPF260-B3는 도 11에 나타낸 바와 같이해서 구축했다.
실시예 3에 기재된 플라스미드 pTrc-papB로부터 약 0.3kbp의BamHI DNA 단편을 조제했다. 이 것을 발현 벡터 pABPd(실시예 5)의BamHI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pPF260-B를 얻었다. pPF260-B를 제한효소XbaI로 소화한 후, T4 DNA 리가제로 자기연결해서 플라스미드 pPF260-B1을 얻었다.
다음에, pPF260-B1을 제한효소PstI로 소화하여, 약 0.6kbp의 DNA 단편을 조제했다. 이 것을 pUC118의PstI부위에,papB유전자의 방향이lacZ유전자와 같은 방향이 되도록 서브클로닝하여, 플라스미드 pUC118-B를 얻었다. pUC118-B를 주형 DNA, 서열번호 22에 기재된 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하고, MutaGene in vitro 뮤타디에네시스 킷트(Bio-Rad사제)를 사용해서 부위특이적 변이처리를 실시하여, 플라스미드 pUC118-B1을 얻었다.
다음에, pUC118-B1 및 pPF260-B1을 제한효소PstI로 소화하여, 약 0.6kbp 및 약 8.0kbp의 DNA 단편을 각각 조제한 후, 이들을 연결해서 플라스미드 pPF260-B3를 얻었다.
실시예 7. PF 1022 생산균 도입용 플라스미드 pPF260-C3의 구축
PF 1022 생산균에서papC유전자를 발현시키기 위한 플라스미드 pPF260-C3은 도 12에 나타낸 바와 같이해서 구축했다.
실시예 4에 기재된 플라스미드 pET-papC로부터 약 1kbp의BamHI DNA 단편을 조제했다. 이 것을 발현 벡터 pABPd(실시예 5)의BamHI 부위에 삽입하여, 플라스미드 pPF260-C를 얻었다. pPF260-C를 제한효소XbaI로 소화한 후, T4 DNA 리가제로 자기연결해서 플라스미드 pPF260-C1을 얻었다.
다음에, pPF260-C1을 제한효소PstI 및SphI로 이중소화하여, 약 1.7kbp의 DNA 단편을 조제했다. 이 것을 pUC118의PstI 및SphI 부위에 서브클로닝하여, 플라스미드 pUC118-C를 얻었다. pUC118-C를 주형 DNA, 서열번호 23에 기재된 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로 하여, Muta-Gene in vitro 뮤타디에네시스 킷트(Bio-Rad사제)를 사용하여 부위특이적 변이처리를 하여, 플라스미드 pUC118-C1을 얻었다.
다음에, pUC118-C1 및 pPF260-C1을 제한효소PstI 및SphI로 이중소화하여, 약 1.7kbp 및 약 7.6kbp의 DNA 단편을 각각 조제한 후, 이들을 T4 DNA 리가제로 연결해서 pPF260-C3를 얻었다.
실시예 8. PF 1022 생산균의 형질전환
pPF260-A2, pPF260-A3, pPF260-B3 및 pPF260-C3를 각각 1㎍, 3㎍, 3㎍ 및 3㎍으로 되도록 혼합하여, 에타놀로 침전시킨 후, 10㎕의 TE완충액(10mM 트리스-염산(pH8.0), 1mM EDTA)에 재용해했다. 이와 같이해서 조제한 DNA용액을 사용해서,WO97/00944호의 실시예 1에 기재된 방법으로 PF 1022 생산균을 형질전환했다. 구체적으로는, PF 1022 생산균을 실시예 5에 기재된 종배지에서, 26℃, 48시간 배양했다. 그 후, 3000r.p.m., 10분간의 원심분리에 의해, 균사체를 집균하여, 0.5M 슈크로즈용액으로 세정했다. 얻어진 균사체를, β-글루크로니다제(Sigma사제) 3㎎/㎖, 키치나제(Sigma사제) 1㎎/㎖ 및 자이모라제(생화학공업사제) 1㎎/㎖를 함유하는 0.5M 슈크로스용액 중에서, 30℃, 2시간 진탕해서 프로토플라스트화시켰다. 얻어진 혼합물을 여과하여, 균체 잔류물을 제거했다. SUTC 완충액 (0.5M 슈크로스, 10mM 트리스염산(pH7.5), 10mM 염화칼슘)으로 2회 원심분리(2500r.p.m. 10분간, 4℃)함으로써 프로토플라스트를 세정하고, 이어서, SUTC 완충액으로 1 x 107개/㎖의 프로토플라스트 현탁액을 조제했다.
프로토플라스트 현탁액 100㎕에, 앞서 조제한 플라스미드 DNA용액을 첨가해, 얻어진 혼합물을 빙냉하에 5분간 방치했다. 그 후, 이 혼합물에, 400㎕의 폴리에틸렌 글리콜 용액(60% 폴리에틸렌 글리콜 4000(和光純藥), 10mM 트리스-염산 (pH7.5), 10mM 염화칼슘)을 첨가해, 얻어진 혼합물을 빙냉하에 20분간 방치했다.
이상과 같이 처리한 프로토플라스트를, SUTC완충액으로 세정한 후, 같은 완충액에 재현탁했다. 얻어진 현탁액을 100㎍/㎖의 하이그로마이신B 및 0.5M 슈크로스를 함유하는 포테토덱스트로스 한천배지에, 포테토덱스트로스 한천배지와 함께 중층으로 했다. 26℃에서 5일간 배양하여, 나타난 콜로니를 형질전환체로 했다.
얻어진 형질전환체로부터 염색체 DNA를 조제하여, 이들은 주형 DNA로 하여,사이클수를 25사이클로 한 것 이외는 실시예 2,3 및 4에 기재된 조건으로 PCR를 행하여,papA,papB및papC유전자의 검출을 행했다. 그 결과, 3종 전체의 유전자가 도입된 형질전환체로서 55-65주 (FERM BP-7255)를 선발했다.
실시예 9. PF 1022 생산균 형질전환체의 배양과 PF 1022 유도체의 검출
실시예 8에서 선발한 형질전환체 55-65주(FERM BP-7255) 및 친주를 WO 97/20945호에 기재되어 있는 조건에 따라서 배양했다. 즉, 실시예 5에 기재된 종배지에서, 26℃, 2일간 배양했다. 얻어진 배양액 2㎖를 50㎖의 생산배지(소맥배아 0.6%, 파마메디아 1.0%, 가용성 전분 2.6%, 물엿 6.0%, MgSO4·7H2O 0.2%, Nacl 0.2%)에 식균하고, 또 26℃, 6일간 배양했다. 배양 종료 후, 40㎖분의 배양액으로부터 원심분리에 의해 균체를 모아, 30㎖의 아세트산에틸로 추출했다. 추출액을 농축 건고한 후, 2㎖의 아세토니트릴에 재용해했다. 이 중, 10㎕를 HPLC분석에 제공했다.
HPLC분석의 조건은,
HPLC 시스템: 가부시키가이샤 히다치세이사쿠쇼(株式會社日立製作所)655A-11
컬럼: Inertsil ODS-24.6 x 250㎜
이동상: 아세토니트릴:물=70:30
유속: 1.0㎖/분
컬럼온도: 40℃
검출기: 일본분광공업주식회사 870-UV
UV 파장: 245nm
로 했다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 형질전환체 55-65주에는, PF 1022-268 (WO97/11064호 실시예 1, Cyclo[MeLeu-Lac-MeLeu-(O2N)PhLac-MeLeu-Lac-MeLeu-PhLac]) 및 PF 1022-269 (WO97/11064호 실시예 2, Cyclo[MeLeu-Lac-MeLeu-(H2N)PhLac-MeLeu-Lac-MeLeu-PhLac])와 보유시간이 일치하는 피크가 검출되었다. 한편, 이들의 피크는 친주에는 검출되지 않았다. 또, 형질전환체 유래의 추출액과 각 표준품을 혼합한 후에 HPLC분석을 행한 실험에 있어서, 이들의 피크가 표준품의 피크와 완전히 겹치는 것이 나타났다. 또, 이들의 피크에 함유되는 물질에 대해서, LC-MS (사중극형 벤티톱 LC/MS 시스템 NAVIGATOR with aQaTM(사모쿠에스트주식회사제)를 이동해서 질량스팩트럼을 측정한 결과, 표준품의 것과 일치했다.
이상의 결과로부터,papA,papB및papC유전자의 3종이 전부 도입된 형질전환체 55-65주가, 벤젠고리의 파라 위치가 니트로기 또는 아미노기로 수식된 PF 1022물질 유도체를 생산하는 것이 명백해졌다.

Claims (31)

  1. 파라 위치가 질소원자를 갖는 관능기에 의해 치환되어 있지 않는 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 생산하는 생물의 형질전환체에 있어서, 코리스미산으로부터p-아미노페닐피루빈산으로의 생합성 경로에 관여하는 유전자(생합성 유전자)를 도입함으로써, 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 생산하도록 형질전환된 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  2. 제 1항에 있어서, 형질전환되는 생물이 코리스미산을 경유해서 생합성되는 이차 대사산물을 생산하는 생물인 형질전환체.
  3. 제 2항에 있어서, 코리스미산을 경유해서 생합성되는 이차 대사산물이, 페닐피루빈산,p-히드록시페닐유산, 페닐알라닌, 티로신, 및 페닐유산으로부터 되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 빌딩 블록으로부터 합성되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  4. 제 1항에 있어서, 형질전환되는 생물이 펩티드 또는 뎁시펩티드를 이차 대사산물로서 생산하는 생물인 형질전환체.
  5. 제 4항에 있어서, 펩티드 또는 뎁시펩티드가, 페닐알라닌, 티로신, 및 페닐유산으로부터 되는 군에서 선택되는 적어도 하나의 빌딩 블록으로부터 합성되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  6. 제 1항에 있어서, 형질전환되는 생물이, 하기 식의 화합물:
    을 생산하는 미생물인 형질전환체.
  7. 제 6항에 있어서, 형질전환체로부터 생산되는 이차 대사산물이 하기 식의 화합물:
    인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  8. 제 1항 내지 7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생합성 유전자가 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자로부터 되는 형질전환체.
  9. 제 8항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자로부터 되는 생합성 유전자 중 적어도 하나가 스트렙토마이세스속, 노가르디아속, 또는 코리네박테륨속 유래의 유전자인 형질전환체.
  10. 제 8항 또는 9항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자가, 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  11. 제 8항 내지 10항 중 어느 하나의 항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자가 서열번호 1의 DNA서열로부터 되는 것을 특징으로하는 형질전환체.
  12. 제 8항 또는 9항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자가, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  13. 제 8항, 9항 또는 12항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자가 서열번호 3의 DNA서열로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  14. 제 8항 또는 9항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자가, 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  15. 제 8항, 9항 또는 14항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자가 서열번호 5의 DNA서열로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  16. 제 8항 또는 9항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자가, 각각, 서열번호 2에 기재된 아미노산서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  17. 제 8항, 9항 또는 16항에 있어서, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소를 코드하는 유전자, 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제를 코드하는 유전자, 및 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제를 코드하는 유전자가, 각각, 서열번호 1의 DNA서열, 서열번호 3의 DNA서열, 및 서열번호 5의 DNA서열로부터 되는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
  18. 제 1항 내지 17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형질전환되는 생물이 미생물인 형질전환체.
  19. 제 18항에 있어서, 미생물이Mycelia sterilia인 형질전환체.
  20. 제 19항에 있어서,Mycelia sterilia가 FERM BP-2671의 수탁번호의 것으로 생명공학공업 기술연구소에 기탁된 PF 1022 균주인 형질전환체.
  21. 제 1항 내지 20항 중 어느 하나의 항에 있어서, FERM BP-7255의 수탁번호의 것으로 생명공학공업 기술연구소에 기탁된 55-65주인 형질전환체.
  22. 제 1항 내지 17항 중 어느 하나의 항에 있어서, 형질전환되는 생물이 식물인 형질전환체.
  23. 제 1항 내지 22항 중 어느 하나의 항에 기재된 형질전환체를 배양하여, 파라 위치가 질소원자를 갖는 관능기에 의해 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물을 채취하는 것으로 이루어지는, 파라 위치가 질소 원자를 갖는 관능기에 의해 치환된 벤젠 고리 골격을 갖는 이차 대사산물의 제조법.
  24. 제 23항에 있어서, 질소 원자를 갖는 관능기가 니트로기 또는 아미노기인 제조법.
  25. 제 6항, 19항, 20항 또는 21항에 기재된 형질전환체를 하기 식으로 나타내는PF 1022물질 유도체를 채취하는 것으로 이루어지는 PF 1022물질 유도체의 제조법.
  26. 서열번호 2에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 합성효소 활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  27. 제 26항에 있어서, 서열번호 1에 기재된 DNA서열로부터 되는 폴리뉴클레오티드.
  28. 서열번호 4에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시코리스미산 무타제활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  29. 제 28항에 있어서, 서열번호 3에 기재된 DNA서열로부터 되는 폴리뉴클레오티드.
  30. 서열번호 6에 기재된 아미노산 서열 또는 4-아미노-4-데옥시플레펜산 데히드로게나제활성을 갖는 그의 개변 서열을 코드하는 폴리뉴클레오티드.
  31. 제 30항에 있어서, 서열번호 5에 기재된 DNA서열로부터 되는 폴리뉴클레오티드.
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