HU216653B - Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására - Google Patents

Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására Download PDF

Info

Publication number
HU216653B
HU216653B HU9202487A HU248792A HU216653B HU 216653 B HU216653 B HU 216653B HU 9202487 A HU9202487 A HU 9202487A HU 248792 A HU248792 A HU 248792A HU 216653 B HU216653 B HU 216653B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
protein
fragment
sequence
cobu
Prior art date
Application number
HU9202487A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT63458A (en
HU9202487D0 (en
Inventor
Francis Blanche
Beatrice Cameron
Joël Crouzet
Laurent Debussche
Sophie Levy-Schil
Denis Thibaut
Original Assignee
Rhone-Poulenc Biochimie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=9393280&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU216653(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Rhone-Poulenc Biochimie filed Critical Rhone-Poulenc Biochimie
Publication of HU9202487D0 publication Critical patent/HU9202487D0/hu
Publication of HUT63458A publication Critical patent/HUT63458A/hu
Publication of HU216653B publication Critical patent/HU216653B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D39/00—Filtering material for liquid or gaseous fluids
    • B01D39/14—Other self-supporting filtering material ; Other filtering material
    • B01D39/20—Other self-supporting filtering material ; Other filtering material of inorganic material, e.g. asbestos paper, metallic filtering material of non-woven wires
    • B01D39/2068—Other inorganic materials, e.g. ceramics
    • B01D39/2072—Other inorganic materials, e.g. ceramics the material being particulate or granular
    • B01D39/2079—Other inorganic materials, e.g. ceramics the material being particulate or granular otherwise bonded, e.g. by resins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/42—Cobalamins, i.e. vitamin B12, LLD factor
    • E—FIXED CONSTRUCTIONS
    • E21—EARTH DRILLING; MINING
    • E21B—EARTH DRILLING, e.g. DEEP DRILLING; OBTAINING OIL, GAS, WATER, SOLUBLE OR MELTABLE MATERIALS OR A SLURRY OF MINERALS FROM WELLS
    • E21B43/00—Methods or apparatus for obtaining oil, gas, water, soluble or meltable materials or a slurry of minerals from wells
    • E21B43/02—Subsoil filtering
    • E21B43/08—Screens or liners

Abstract

A találmány kőbalaminők és/vagy kőbamidők biőszintézisében részt vevőúj pőlipeptidek rekőmbináns útőn történő előállítására vőnatkőzik. Atalálmány tárgyát képezi tővábbá ezeket a pő ipeptideket kódőló DNS-szekvenciák, ezeket tartalmazó plazmidők és gazdasejtek előállításieljárása. A találmány végül a kőbalaminők és/vagy kőbamidők ésprekűrzőraik termelődését, különösen a kőenzim B12 termelését főkőzórekőmbináns eljárásra is vőnatkőzik. ŕ

Description

A jelen találmány kobalaminok és/vagy kobamidok és különösen a koenzim B12 bioszintézisében részt vevő új polipeptidek előállítására vonatkozik. Ugyancsak vonatkozik az ezen polipeptidek kifejeződéséért felelős genetikai anyag előállítását lehetővé tevő eljárásra is. Végül vonatkozik egy, a kobalaminok, különösen a koenzim B12 termelődését megsokszorozó, rekombináns DNS-technikát alkalmazó eljárásra.
A B|2 vitamin a B csoport vitaminjaihoz tartozik. Ez egy vízoldható vitamin, amelyet a vészes vérszegénységben szenvedő betegek kezelését lehetővé tevő faktorként azonosítottak. Általában a legyengült betegeknek írják elő a hematopoézist serkentő szerként, de sok más esetben is használják, mint például májproblémák, idegelégtelenség esetén vagy étvágyserkentőként, erősítőként, valamint a dermatológiában (Beck, 1982; Fraser és társai, 1983). A nem kérődző állatok ipari tenyésztésében, ahol a táplálás lényegében a növényi eredetű fehérjéken alapul, fontos, hogy a napi tápanyagadagba 10-15 mg B|2 vitamint építsenek be takarmánytonnánként (Barrere és munkatársai, 1981).
A B|2 vitamin egy kobalaminoknak nevezett molekulaosztályba tartozik, amelyek szerkezetét az 1. ábra mutatja. A kobamidok a kobalamidoktól az alsó nukleotid bázisában különböznek, amely nem 5,6-dimetilbenzimidazol, hanem egy másik bázis, például 5-hidroxi-benzimidazol aB(2 vitamin III. faktor esetén, amelyet többek között a Clostridium thermoaceticum és a Methanosarcina barkeri szintetizálnak (írón és munkatársai, 1984). Ez a szerkezeti hasonlóság rávilágít, hogy a kobalaminok és a kobamidok bioszintézisének metabolikus útvonalai nagyobb részt közösek. A kobalaminokat szinte kivétel nélkül baktériumok szintetizálják, egy komplex, még alig ismert folyamat során, amely négy lépésre bontható (2. ábra):
i) az uropirogén III (vagy urogén III) szintézise, ii) az urogén III átalakítása kobirinsawá, iii) ennek kobinamiddá alakítása, iv) az alsó nukleotidgyűrű létrehozása a különleges bázis beépítésével (5,6-dimetil-benzimidazol a kobalaminok esetén).
A koenzim B[2 esetén valószínű, hogy az 5’-dezoxi5’-adenozil-csoport addíciója nem sokkal a korrinmag szintézise után megy végbe (Huennekens és munkatársai, 1982).
A kobamidok esetén csak az alsó bázis szintézisének és beépülésének lépése különbözik.
A kobalaminok bioszintézisének első lépése nagyon jól ismert, mivel ez közös a hem, valamint a klorofillok bioszintézisének megfelelő lépésével (Battersby és munkatársai 1980). A folyamatban a következő enzimek vesznek részt egymás után: δ-amino-levulinát-szintetáz (EC 2.3.137), δ-amino-levulinát-dehidráz (EC 4.2.1.24), porfobilinogén-deamináz (EC 4.3.1.8) és urogén III koszintetáz (EC 4.2.1.75), amely a szukcinil-CoA-t és a glicint urogén ΙΙΙ-má alakítja át. Mindamellett néhány organizmusnál [például az E. coli (Avissar és munkatársai, 1989) és a metanogén baktériumok (Kanangara és munkatársai, 1989)] az első lépés a glutaminsav δ-aminolevulinsawá alakítása egy multienzimkomplex által.
Az urogén III és a kobirinsav között a mai napig a köztes termékeknek csak három származékát azonosították; az FI, FII és FIII faktorokról van szó, amelyek a három köztes termék, a prekorrin-1, a prekorrin-2 és a prekorrin-3 oxidációs termékei. Ez utóbbiak az urogén III mono-, di- és trimetilszármazékainak felelnek meg (3. ábra). Ezeket a köztes termékeket három metilcsoport egymás utáni transzferével kapjuk meg a SAM-ról (S-adenozil-metionin) az urogén ΠΙ-ra, a C2, C7 és C20 helyzetekbe. A többi reakció, amelyek végül a kobirinsavhoz vezetnek: öt másik metilcsoport-transzfer a SAM-ról a C17, C12, Cl, C15 és C5 pozícióba, a C20 helyen lévő szén eliminációja, a C12 pozíció dekarboxilációja és egy kobaltatom beépítése (4. ábra). Ezekre a bioszintézislépésekre a Propionibacterium shermanii vagy a Clostridium tetanomorphum sejtmentes kivonatain végzett in vitro kísérletekből következtettek. Ezekben a kivonatokban a kobirinsavat az urogén III átalakításával kapták meg, az anaerobiózisnál alkalmazott feltételek melletti inkubáció után (Battersby és munkatársai, 1982). Ezeknél a mikroorganizmusoknál még semmilyen, a prekorrin-3 és a kobirinsav közötti köztes terméket nem izoláltak, amelyet a kobalamintermelő baktériumok kivonataival az utóbbi inkubációval korrinoiddá lehetett volna alakítani. E köztes termékek izolálásának nehézsége a következőkön alapul:
i) nagy instabilitásuk, ii) oxigénre való érzékenységük és iii) alacsony in vivő akkumulációs szintjük.
Az útvonalnak ebben a részében csak a Pseudomonas denitrificans egy enzimét tisztították és tanulmányozták; a SAM-urogén III metiltranszferázt, amelyet SUMT-nak rövidítenek (Blanche et al., 1989).
A kobirinsav és a kobinamid között a következő reakciók mennek végbe:
i) az 5’-dezoxiadenozil-csoport addíciója (ha a koenzim B|2 a szintetizálandó vegyület), ii) a hétből hat karboxilcsoport amidálása amincsoportok hozzáadásával, iii) az utolsó karboxilcsoport (a D pirrolmag propionsav-lánca) amidálása R-l-amino-2-propanol hozzáadásával (2. ábra).
Azt még nem tisztázták, hogy valójában van-e az amidálásban sorrend (Herbert és munkatársai, 1970). Végül, az útvonal ezen részén semmilyen aktivitásmeghatározást nem írtak le, kivéve az 5’-dezoxiadenozilcsoport hozzáadását (Huennekens et al., 1982).
Egy kobalamin, például a koenzim B|2 bioszintézisének utolsó lépése négy egymás utáni fázist foglal magába, amelyeket az 5. ábra ír le (Huennekens és munkatársai, 1982). Ezek a következők:
i) a kobinamid amino-propanol maradéka hidroxilcsoportjának foszforilálása;
ii) egy guanozin-difoszfát addíciója a guanozin-5’trifoszfáttal való reakcióval; a kapott vegyület a GDPkobinamid (Friedmann, 1975), amely iii) reagál az a-ribazol 5’-foszfáttal, amely a riboflavinból szintetizálódott, és így az adenozil-kobalamin 5’-foszfát keletkezik (Friedmann és munkatársai, 1968);
HU 216 653 Β iv) ez utóbbi defoszforilációjával keletkezik a koenzim B12 (Schneider et Friedmann, 1972).
A kobalaminok termelésére képes baktériumok között a következőket említhetjük meg:
Agrobacterium tumefaciens,
Agrobacterium radiobacter,
Bacillus megaterium,
Clostridium sticklandii,
Clostridium tetanomorphum,
Clostridium thermoaceticum,
Corynebacterium XG,
Eubacterium limosum,
Methanobacterium arbophilicum,
Methanobacterium ivanovii,
Methanobacterium ruminantium,
Methanobacterium thermoautotrophicum,
Methanosarcina barkeri,
Propionobacterium shermanii,
Protaminobacter ruber,
Pseudomonas denitrificans,
Pseudomonas putida,
Rhizobium meliloti,
Rbodopseudomonas sphaeroides,
Salmonella typhimurium,
Spirulina platensis,
Streptomyces antibioticus,
Streptomyces aureofaciens,
Streptomyces griseus,
Streptomyces olivaceus.
Ipari szinten, a bioszintézis mechanizmusának nagy összetettsége miatt, a kobalaminok és különösen a B12 vitamin termelése kizárólag mikrobiológiai úton folyik. Ezt a Pseudomonas denitrificans, Propionobacterium shermanii és a Propionobacterium freudenreichii baktériumok nagy térfogatú tenyésztésével valósítják meg (Florent, 1986). Az ipari termeléshez használt törzsek vad törzsekből származnak; ezek számos véletlen mutációs cikluson, azután a kobalamintermelésre végzett klónszelekción mentek keresztül (Florent, 1986). A mutációkat mutagén ágensekkel vagy fizikai kezelésekkel, mint az ultraibolya sugárzás, végzett mutagenezissel kapják (Barrere és munkatársai, 1981). Ezzel az empirikus módszerrel véletlen mutációkat kapnak, és ezek segítik elő a kobalamintermelést. Például leírták, hogy a Pseudomonas denitrificans eredeti törzséből kiindulva, melyet Miller és Rosenblum izolált elsőként (1960, US 2 938 822 szabadalom), e mikroorganizmus termelését 10 év alatt fokozatosan 0,6 mg/l-ről 60 mg/1re emelték a fent leírt technikával (Florent, 1986). A Propionibacterium nemzetség baktériumaira [Propionibacterium shermanii ATCC 13673) és freudenreichii ATCC 6207)] ugyanezt a termelési értéket találhatjuk az irodalomban; például egy helyen 65 mg/l-es termelést írtak le (87920 európai szabadalom). Mégis, még nem írtak le semmilyen eljárást, amely lehetővé tenné akár a kobalamidot túltermelő mutánsok, akár a kobalamintermelésben javított mutánsok szelektálását vagy kimutatását.
Genetikai szinten a mai napig kevés munka jelent meg. A cob gének (a bioszintézis folyamatában szereplő enzimeket kódolják) klónozását írták le a Bacillus megateriumnál (Brey és munkatársai, 1986). Tizenegy komplementációs csoportot határoztak meg a Bacillus megaterium különböző DNS-fragmenseit hordozó plazmidok és a Bacillus megaterium mutáns cob génjei közötti komplementációval. Ezek a gének ugyanazon a lókuszon csoportosulnak, melyet egy 12 kb-os fragmens hordoz.
A Salmonella typhimurium cob génjeit szintén tanulmányozták. Anélkül, hogy leírták volna a klónozást, bemutatták, hogy a kobalamin bioszintézis majd minden génje a kromoszóma 40. és 42. perce között található (Jeter et Roth, 1987). Csak a cysG lókusz, amely az urogén III prekorrin-2-vé alakítását teszi lehetővé, nem tartozik ehhez a géncsoporthoz. Azonban az e lókusz által kódolt aktivitást, valamint biokémiai sajátságait még nem írták le.
Azonkívül a cob mutációkhoz fenotípusokat társítottak. A Salmonella typhimuriumnál és a Bacillus megateriumnál a cob mutánsok nem mutatnak növekedést minimál táptalajon etanol-aminnal, mint szénforrással vagy mint nitrogénforrással (Roof és Roth, 1988). Ez annak a ténynek köszönhető, hogy az etanol-amin katabolizmusának egy enzime, az etanol-amin-ammónialiáz (EC 4.3.1.7) kofaktora a koenzim B12; a cob mutánsok nem szintetizálják a koenzim B]2-t, így nem tudnak növekedni etanol-aminnal, mint a szén- és/vagy nitrogénforrással. A Salmonella typhimurium metE mutánsainak csak egy metil-kobalamin-fuggő homocisztein metiltranszferázuk van (EC 2.1.1.13). A Salmonella typimurium metE cob mutánsai auxotrófok metioninra (Jeter etal., 1984).
A Pseudomonas denitrificansnál és az Agrobacterium tumefaciensnél a mai napig nem írtak le a kobalaminszintézis teljes hiányához köthető fenotípust.
Végül, a Pseudomonas denitrificanson végzett kísérletek (Cameron és munkatársai, 1989) elvezettek az e baktérium cob génjeit hordozó DNS-fragmentum klónozásához. E gének egy legalább 30 kb-os DNS-fragmentumon négy komplementációs csoportba oszthatók. Legalább tizennégy komplementációs csoportot azonosítottak az Agrobacterium tumefaciens és a Pseudomonas putida mutáns cob génjeinek heterológ komplementációjával a Pseudomonas denitrificans cob génjeit hordozó DNS-fragmentumokhoz.
Mégis, mostanáig e gének egyikét sem tisztították, és egyetlen nukleotidszekvenciát sem írtak le. Éppígy egyetlen proteinazonosítást, sem egyetlen olyan katalitikus funkciót nem írtak le, amely e gének termékeinek köszönhető. Még tovább menve, nem tudtak egyetlen, a rekombináns DNS-technikát alkalmazó eljárást kidolgozni, amely a kobalamintermelést elősegíti. A Bacillus megaterium cob génjeinek amplifikációja nem okozza kobalamintermelés növekedését azoknál a törzseknél, amelyekből klónozták a géneket (Brey és munkatársai, 1986). A Salmonella typhimuriumnál fiziológiai tanulmányokat folytattak azon körülmények meghatározására, amelyeknél a tanulmányozott cob gének erős transzkripcióját figyelték meg (Escalante et Roth, 1987). Ilyen feltételekkel nem nő a kobalamintermelés, annak ellenére, hogy a bioszintézis
HU 216 653 Β útvonalának génjei erősebben kifejeződnek, mint standard körülmények között.
E találmány a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptideket kódoló DNSszekvenciák pontos azonosításának eredménye. A találmány egyik tárgya eljárás a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptideket kódoló DNS-szekvenciák előállítására. Részletesebben ezek a DNS-szekvenciák: a 15., 16., 40., 41., 47. és 52. ábrán bemutatott szekvenciával rendelkező cobA, cobB, cobC, cobD, cobE, cobF, cobG, cobH, cobl, cobJ, cobK, cobL, cobM, cobN, cobO, cobP, cobQ, cobS, cobT, cobU, cobV, cobW, cobX, és corA gének, minden olyan DNSszekvencia, amely a genetikai kód degeneráltsága eredményeként homológ ezekkel a génekkel, valamint mindazok a bármilyen eredetű (természetes, szintetikus, rekombináns) DNS-fragmentumok, amelyek szigorú körülmények között hidridizálnak [lásd például EP-A-0355202, Natúré 313, 402-4 (1985)] és/vagy amelyek szignifikáns (azaz legalább 90%-os) homológiát mutatnak ezekkel a szekvenciákkal vagy ezek fragmentumaival, és amelyek a kobalamidok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptideket kódolnak. A találmány tárgya még azoknak a géneknek az előállítása, melyek ezeket a DNS-szekvenciákat tartalmazzák, és részlegesen tisztítottak.
A jelen találmány szerinti DNS-szekvenciákat különböző törzsekből izoláltuk: egy ipari törzsből, a Pseudomonas denitrificans SC510, az MB580 törzs (US 3 018 225 szabadalom) származéka, a P. putida és az A. tumefaciens cob mutánsaival való komplementációjával; és a Methanobacterium ivanoviiből. A kapott kiónokat alaposan analizáltuk térképezéssel a Tn5 transzpozon egy származékának beépítése segítségével. Ezek a genetikai tanulmányok lehetővé tették a cob és cor gének lokalizálását a restrikciós térképen, és szekvenciájuk meghatározását. Végül egy nyílt leolvasási keret analízis lehetővé tette e DNS-fragmentumok kódoló régióinak azonosítását.
A jelen találmány tárgya még e nukleotidszekvenciák felhasználása más baktériumok cob génjeinek klónozásához.
Valóban ismert, hogy az ugyanazon működést katalizáló proteinek szekvenciái az evolúciós divergenciával szemben megőrződnek (Wein-Hsiung és munkatársai, 1985), A jelen találmány bemutatja, hogy a különböző mikroorganizmusok azon polipeptidjeinek nukleotidszekvenciái között, melyek a kobalamin és/vagy kobamid bioszintézisben részt vesznek, szignifikáns homológia van. A megmutatkozó különbségek az evolúciós degeneráció, és a genetikai kód degeneráltságának eredményei, mely utóbbi a vizsgált mikroorganizmus genomjának GC%-ával hozható kapcsolatba (WeinHsiung és munkatársai, 1985).
A jelen találmány szerint készíthetünk egy szondát a Pseudomonas denitrificans egy vagy több DNS-szekvenciájával, mégpedig vagy magukkal az említett fragmentumokkal, vagy analóg szekvenciákkal, amelyek egy bizonyos fokú specifikus degeneráltságot mutatnak a tanulmányozni kívánt baktérium kodonhasználatának és a DNS GC%-ának szintjén. Ilyen körülmények között detektálható egy specifikus hibridizációs jel a szonda és a vizsgált baktérium genomiális DNS-e között; ez a specifikus hibridizációs szignál megfelel a szonda hibridizációjának a baktérium azonos funkciójú cob génjeivel. Ezután a cob gének, valamint ezek termékei izolálhatok, tisztíthatok, jellemezhetők. A találmány így egy módszert nyújt, amely hibridizáció útján lehetővé teszi, hogy eljussunk bármely mikroorganizmus olyan nukleotidszekvenciáihoz és polipeptidjeihez, amelyek a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében vesznek részt.
A jelen találmány tárgya még egy rekombináns DNS, amely legalább egy, a kobalaminok bioszintézisében részt vevő polipeptidet kódoló DNS-szekvenciát tartalmaz, és nevezetesen egy olyan rekombináns DNS, amelyen a fent említett szekvenciák egy expressziós szignál kontrollja alatt állnak.
Ebben a tekintetben a DNS-szekvencia 5’-végére egy promoterrégiót helyezhetünk el. Ez a régió lehet homológ vagy heterológ a DNS-szekvenciával. Különösen használhatók az erős bakteriális promoterek, mint az E. coli triptofán operonja, Ptrp, vagy laktóz operonja, Piac, a lambda bakteriofág bal vagy jobb promotere, baktériumok, mint a Corinebacteriumok fágjainak erős promoterei, a gram-negatív baktériumok funkcionális promoterei, mint az E. coli Ptac promotere, a TOL plazmid xilén katabolizmusa génjeinek PxylS promotere, a Bacillus subtilis amilázának promotere, Pamy. Megemlíthetjük még az élesztők glikolitikus génjeiből származó promotereket, mint a foszfoglicerát-kinázt, a glicerinaldehid-3-foszfátdehidrogenázt, a laktázt vagy az enolázt kódoló gének promotereit, amelyeket akkor használhatunk, ha a rekombináns DNS-t egy eukarióta gazdába vezetjük be. Egy riboszómakötőhelyet is elhelyezünk a DNS-szekvencia 5’-végén, amely homológ vagy heterológ lehet, mint a lambda bakteriofág cll génjének riboszóma-kötőhelye.
A transzkripció befejezéséhez szükséges jelek a DNS-szekvencia 3’-végén helyezkedhetnek el.
A rekombináns DNS jelen találmány szerint ezután bevezethető közvetlenül egy, a választott expressziós szignáloknak megfelelő gazdasejtbe, vagy klónozható egy plazmid-vektorba, amely lehetővé teszi a kérdéses DNS-szekvencia stabil módon történő bevezetését a gazdasejtbe.
A találmány egy további tárgya tehát olyan plazmidok előállítása, amelyek egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bio szintézisében részt vevő polipeptideket kódoló DNS-szekvenciát tartalmaznak. Pontosabban ezek a plazmidok tartalmaznak még egy funkcionális replikációs rendszert és egy szelekciós markert is.
A találmány tárgyát képezi még azoknak a gazdasejteknek az előállítására, amelyekbe bevezettünk egy vagy több, előzőleg definiált DNS-szekvenciát vagy egy, az előbb meghatározott plazmidot.
A találmány egy másik tárgya egy eljárás olyan polipeptidek termelésére, amelyek részt vesznek a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében. Az eljárás szerint egy gazdasejtbe bevezetünk egy, az előzőekben leírt DNS-szekvenciát, ezt a rekombináns sejtet az emlí4
HU 216 653 Β tett szekvencia expressziójának megfelelő körülmények között tenyésztjük, majd a termelt polipeptidet kinyerjük.
Az e célból használt gazdasejtek ugyanúgy lehetnek prokarióták, mint eukarióták, állati vagy növényi sejtek is. Előnyösen a baktériumok, különösen az E. coli, P. denitrificans, A. tumefaciens vagy R. meliloti fajok közül választandók.
A jelen találmány szerinti DNS-szekvenciák egy másik felhasználása egy rekombináns DNS-techníkát alkalmazó eljárás a kobalaminok és/vagy kobamidok vagy ezek bioszintézisének prekurzorai termelésének amplifikálására. Valóban, ha a kobalaminok és/vagy kobamidok vagy ezek prekurzorainak bioszintézisében a metabolikus áramlás korlátozása a bioszintézisút egy enzimének limitált aktivitásának köszönhető, ezen aktivitás növekedése az enzim expressziójának rekombináns DNStechnikákkal (génamplifikáció, az átírási-fordítási jelek helyettesítése hatásosabb jelekkel...) történő megnövelésével a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisének megnövekedéséhez vezet. Az is lehetséges, hogy a kobalaminok és/vagy kobamidok termelődésének korlátozása biokémiai reguláció eredménye. Ebben az esetben a reguláit enzimnek megfelelő cob gén vagy gének in vitro specifikusan mutáltathatók, hogy olyan mutáns géneket kapjunk, amelyek termékei elveszítették regulálhatóságukat, amely eddig a termelés növekedése ellen hatott.
A jelen találmány szerinti eljárás a következőkből áll: egy fentebb definiált DNS-szekvencia bevezetése egy kobalaminokat és/vagy kobamidokat termelő vagy ezeket potenciálisan termelő (azaz a bioszintézis egy vagy több lépésében hiányos képességű) mikroorganizmusba, ezen mikroorganizmus tenyésztése az említett szekvencia kifejeződéséhez és a kobalaminok és/vagy kobamidok szintéziséhez megfelelő körülmények között, végül a termelt kobalaminok és/vagy kobamidok kinyerése. Egy ilyen eljárás különösen az 5. oldalon felsorolt mikroorganizmusok bármelyikére, különösen a P. denitrificans, Rhizobium meliloti, vagy Agrobacterium tumefaciens fajok mikroorganizmusaira alkalmazható. Egy előnyös megvalósítási módban a mikroorganizmus a P. denitrificans, és különösen az SC510 törzs. A potenciálisan termelő mikroorganizmusok esetén a használt DNS-szekvenciák azok, amelyek megfelelnek annak a bioszintézislépésnek, amelyet a mikroorganizmus nem tud megvalósítani.
A jelen találmány segítségével és a fent ismertetett különböző stratégiákkal minden kobalaminokat és/vagy kobamidokat termelő vagy potenciálisan termelő mikroorganizmus esetén elérhető a kobalaminok és/vagy kobamidok vagy ezek prekurzorainak termelődésének javulása. Elég ezeket a rekombináns mikroorganizmusokat a kobalaminok termeléséhez és a bevezetett DNSszekvenciák kifejeződéséhez megfelelő körülmények között tenyészteni. A tenyésztés történhet szakaszosan vagy folyamatosan, és a kobalaminok tisztítása az eddig is már ipari szinten alkalmazott eljárásokkal történhet (Florent, 1986). Ezek az eljárások magukba foglalják többek között:
i) a kobalaminok szolubilizációját és ciano formába történő átalakításukat (például a fermentlét magas hőmérsékleten cianiddal és káliummal kezelve nitrit és nátrium jelenlétében), majd ii) a cianokobalaminok tisztítását különböző lépésekkel, amelyek például lehetnek:
a) különböző szubsztrátokon, mint Amberlit IRG50, Dowex 1x2 vagy Amberlit XAD 2, történő adszorpció, melyet víz-alkohol vagy víz-fenol eleggyel történő elúció követ, majd
b) egy szerves oldószerrel történő extrakció és végül
c) a szerves fázisból történő kicsapás vagy kikristályosítás vagy reagensek hozzáadásával, illetve megfelelő oldószerben való hígítással vagy lepárlással.
A jelen találmány ráadásul bemutatja, hogy rekombináns DNS-technikákkal lehetséges egy kobalaminokat termelő baktérium kobalamintermelését a növekedés kumulálásával megjavítani. Ez egyenlő azzal, hogy egy első növekedést kapunk, mint azt fentebb leírtuk, majd ezt a növekedést tovább javítjuk szintén rekombináns DNS-technikák segítségével, azaz például a kobalaminok bioszintézisének génjeit amplifikálva.
A jelen találmány egy másik tárgyát a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek előállítása képezi. A találmány szerinti eljárás azoknak a polipeptideknek vagy ezen polipeptidek származékainak vagy fragmentumainak előállítására vonatkozik, melyeket az előzőekben leírt DNS-szekvenciák kódolnak, és amelyek részt vesznek a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisének útvonalában. E polipeptidek aminosavszekvenciáját, valamint egyes fizikai-kémiai tulajdonságukat leírtuk. Minden ilyen polipeptidhez társítottunk egy enzimatikus aktivitást vagy specifikus sajátságot.
Ebben a tekintetben a találmány tárgya a prekorrin3 kobirinsav-a,c-diamiddá alakításában részt vevő polipeptid és különösen egy-egy metilcsoportnak a SAM-ról aCl,C5,Cll,C15ésC17 helyzetbe történő transzferében részt vevő polipeptid előállítása.
A találmánynak tárgyai még: a kobirinsav kobinamiddá alakításában részt vevő, vagy a kobirinsav és/vagy hidrogenobirinsav-a,c-diamid szintetáz aktivitást mutató, a prekorrin-8x mutáz aktivitást mutató, vagy nikotinsav-nukleotid: dimetil-benzimidazol foszforibozil transzferáz aktivitást mutató, vagy a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz aktivitást mutató, vagy a kobirsav szintetáz aktivitást mutató, vagy a kob(I)alamin adenozil-transzferáz aktivitást mutató, a prekorrin-6x reduktáz aktivitást mutató, vagy a hidrogenobirinsav-a,c-diamid kobirinsav-a,c-diamiddá alakításában részt vevő polipeptidek előállítása.
Előnyösen a következő proteinek közül választott polipeptidet: COBB, COBC, COBD, COBE, COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBP, COBQ, COBS, COBT, COBU, COBV, COBW, COBX és CORA, melyeket a 15., 16., 40., 41. és 47. ábrák mutatnak be, állítjuk elő.
HU 216 653 Β
Ráadásul az előzőleg leírt hibridizációs szondák alkalmazása lehetővé teszi egy másik mikroorganizmusból izolált génekből kiindulva más mikroorganizmusok azonos funkciójú polipeptidjeinek jellemzését és izolálását. Ezen a módon a jelen találmány megmutatja, hogy a Pseudomonas denitrificans egy COB proteinjének szekvenciája szignifikánsan homológ más mikroorganizmusok azonos aktivitást mutató proteinjeinek szekvenciájával. Ezen COB proteinek között, melyek különböző mikroorganizmusoknál ugyanazt a reakciót katalizálják, csak az evolúciós távolság vezetett variációhoz (WeinHsiung és munkatársai, 1985).
Egy sajátos enzimaktivitás odaítélése egy analízis eredménye, amely különböző stratégiák szerint valósítható meg. Különösen a SAM-mal (S-adenozil-metionin) szembeni in vitro affinitásvizsgálatok lehetővé teszik, hogy egy, a SAM-t kötni képes proteinnek metiltranszferáz-aktivitást és így az urogén ΙΠ és a kobirinsav között történő metilcsoport-transzferek egy lépésében való részvételt tulajdonítsunk. Egy más módszer e polipeptidek aktivitásának megállapítására abból áll, hogy mérjük a kobalaminok bioszintézisének intermediereit, amelyek az ezen polipeptidek kifejezésére képtelen mutánsoknál (ez komplementációs kísérletekkel azonosítható) akkumulálódtak. Ezek a vizsgálatok lehetővé teszik, hogy következtessünk arra, hogy a kérdéses polipeptid szubsztrátja a felhalmozódott köztes termék, és ez lehetővé teszi e polipeptidek elhelyezését és aktivitásuk meghatározását a bioszintézis folyamán. A jelen találmány leír egy, a bioszintézis enzimaktivitásainak mérésére vonatkozó eljárást is, amely bármely kobalaminokat és/vagy kobamidokat termelő törzsnél alkalmazható. Ezek a mérések lehetővé teszik, hogy minden, e vegyületeket termelő törzsből tisztítsuk a meghatározott enzimaktivitást. Ebből a tisztított aktivitásból a kérdéses COB protein vagy alegységei NH2-terminális szekvenciája meghatározható, és ez lehetővé teszi, hogy azonosítsuk azt a gént vagy géneket, amely(ek) a kérdéses aktivitást kódolják.
A Pseudomonas denitrificans esetén a bioszintézisút aktivitásait kódoló géneket azonosítottuk, és minden NH2-terminális szekvenciára azt találtuk, hogy a COB protein azonos NH2-terminális szekvenciával rendelkezik.
A jelen találmány leír egy eljárást is, amely lehetővé teszi a kobalamidtermelő vagy nem termelő mutáns törzseknél a kobalaminok vagy más korrinoidok bioszintézis-útvonalának intermediereinek azonosítását és mérését. Ezek a köztes termékek ugyanúgy mérhetők a fermentlében, mint magukban a sejtekben. A mérhető intermedierek az összes, a bioszintézisben található korrinoid a kobirinsav után, azaz a kobirinsavon kívül, a kobirinsav-monoamid, a kobirinsav-diamid, a kobirinsav-triamid, a kobirinsav-tetraamid, a kobirinsav-pentaamid, a kobirsav, a kobinamid, a kobinamid-foszfát, a GDP-kobinamid, a koenzim B12-foszfát és a koenzim Bl2. Ezzel a technikával e termékek ciano- és koenzim formái mérhetők.
A jelen találmány más tárgyai és előnyei a példák olvasása során és a következő ábrákból tűnnek elő, melyek illusztrációként veendők figyelembe, és nem korlátozóak.
A használt kifejezések és rövidítések definíciója
ACDAS: kobirinsav-a,c-diamid szintetáz. rekombináns DNS: azon technikák összessége, amelyek lehetővé teszik, hogy egy mikroorganizmusba olyan DNS-szekvenciákat építsünk be, amelyek nincsenek ott a természetben, vagy hogy egy DNS-fragmentumot specifikusan mutáltassunk.
ATP: adenozin 5’-trifoszfát.
BSA: szarvasmarhaszérum-albumin.
HPLC: magas nyomású folyadékkromatográfia. cluster: gének csoportja.
Cob: a kobalamin termelés redukált szintjének (legalább 10-szer kevesebb a kontrolinál) fenotípusának felel meg.
Stop kodon: a transzláció végén jelző kodon.
Korrinoidok: kobirinsav-származékok, melyek korrin maggal rendelkeznek.
dGTP: 2 ’ -dezoxiguanozin-5 ’ -trifoszfát.
DMBI: dimetil-benzimidazol.
dNTP: 2’-dezoxiribonukleozid-5’-trifoszfát.
DTT: ditiotreitol.
cob gén: a kobinamidok bioszintézisében részt vevő gén az urogén III-tól kezdődően.
cor gén: a korrinoidok bioszintézisében részt vevő gén az urogén III-tól kezdődően.
kb: kilobázis.
NN: DMBIPRT:
ORF: nyílt leolvasási keret, bp: bázispár.
COB protein: olyan protein, amely vagy mint katalizátor vesz részt a kobalaminok bioszintézisében, vagy mint regulátor a cob gének regulációs hálójában, vagy mindkettő.
COR protein: olyan protein, amely vagy mint katalizátor vesz részt a korrinoidok bioszintézisében, vagy mint regulátor a cor gének regulációs hálójában, vagy mindkettő.
SAM: S-adenozil-L-metionin.
SDS: nátrium-dodecil-szulfát.
SP2MT: SAM-L-metionin :prekorrin-2 metiltranszferáz.
SUMT: SAM:urogén III metil-transzferáz. urogén III: uroporfirinogén III.
Az ábrák magyarázata:
1. ábra:
A koenzim B12 szerkezete; a metil-kobalaminnál az 5’dezoxiadenozil-csoport egy CH3 csoporttal van helyettesítve, a cianokobalaminnál egy cianocsoporttal, a hidroxi-kobalaminnál egy hidroxilcsoporttal.
2. ábra:
A kobalaminok bioszintézise és a bioszintézis különböző lépései az irodalmat követve. X. a kobalt axiális liganduma; az a helyen lévő ligandum különbözhet a b helyen levőtől. R: a kobalt a helyen levő liganduma, amely meghatározza a kobalamin típusát (lásd 1. ábra).
3. ábra:
Az urogén III, a prekorrin-1, a prekorrin-2 és a prekorrin-3 szerkezete.
HU 216 653 Β
4. ábra:
Az urogén III és akobirinsav kifejtett képlete. Az irodalom alapján az urogén II és a kobirinsav között 8 egymást követő SAM-függő metiltranszfer megy végbe a C2, C7, C17, C12, Cl, C15 és C5 helyen, egy dekarboxilizáció a C12 helyen, a C20 szén eliminációja és a kobaltatom beépülése.
X: a kobalt axiális ligandumai; az a helyen lévő ligandum különbözhet a b helyen levőtől.
5. ábra:
A kobalaminok bioszintézisének utolsó lépése. A korrin mag részleteit elhagytuk, hogy a rajz világos legyen. Az öt enzimatikus lépést mutatjuk be: 1, kobinamid kináz; 2, kobanimid-foszfát guanililtranszferáz; 3, kobalamin5’-foszfát szintetáz; 4, kobalamin-5’-foszfát foszfohidroláz; 5, nikotinsav-nukleotid: DMBI foszforiboziltranszferáz.
6. ábra:
Az 5,4 kb-os Clal-HindlII-HindlII-HindlII, a 8,7 kb-os EcoRI, a 4748 bp-os Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI és a 3855 bp-os Sstl-Sstl-BamHI fragmentumok restrikciós térképei. Csak azt a 20 restrikciós enzimet ábrázoltuk, amelyek a leggyakrabban hasítják a DNS-t. Az enzimek restrikciós helyeit egy függőleges vonal jelöli.
7. ábra:
A Pseudomonas denitrificans 5378 bp-os Clal-HindlIIHindlII-HindlII fragmentumának kétszálas nukleotidszekvenciája. A felső lánc 5’—>3’ leolvasási irányú balról jobbra, ami a 6. ábrán bemutatott restrikciós térkép fragmentuma bal—>jobb orientációjának felel meg. A Clal hely a 23-as pozícióban (restrikciós hely kezdete) található, mert ezen a szekvencián PstI, Sáli és Xbal restrikciós helyek is találhatók, melyek a szekvenálás céljából a multiklónozóhelyekre történő klónozás során eltűntek. így a Clal-HindlII-HindlIIHindlII fragmentum szekvenciája a 23. pozícióban kezdődik.
8. ábra:
A Pseudomonas denitrificans 8753 bp-os EcoRI fragmentumának kétszálas nukleotidszekvenciája. A felső lánc 5’—>3’ leolvasási irányú balról jobbra, ami a 6. ábrán bemutatott restrikciós térkép fragmentuma bal—/jobb orientációjának felel meg.
9. ábra:
A kódoló fázisok kodonhasználat szerinti valószínűségi analízise Staden és MacLachlan (1982) programját használva az 5378 bp-os Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum szekvenciájának 6 leolvasási fázisán. Az ugyanazon kódolószálhoz tartozó fázisok közül az a legvalószínűbb, amely fázis valószínűségi vonala alatt egy stop kodonnal nem megszakított pontozott vonal helyezkedik el.
1. Az 1. nukleotidtól az 1200. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően az 1. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez az 549. helyzetben lévő ATG-nél kezdődik, és az 1011. helyzetű TGA-nál fejeződik be.
2. Az 1000. nukleotidtól a 2200. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 2. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez az 1141. helyzetű
ATG-nél kezdődik, és az 1981. helyzetű TGA-nál fejeződik be.
3. Az 1800. nukleotidtól a 3400. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 3. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez az 1980 helyzetű ATG-nél kezdődik, és a 3282 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
4. A 3000. nukleotidtól a 4500. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 4. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 3281 helyzetű ATG-nél kezdődik, és a 4280 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
5. A 3800. nukleotidtól az 5378. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően az 5. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 4284 helyzetű GTG-nél kezdődik, és az 5253 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
10. ábra:
A kódolófázisok kodonhasználat szerinti valószínűségi analízise Staden és MacLachlan (1982) programját használva a 8753 bp-os EcoRI fragmentum szekvenciájának 6 leolvasási fázisán. Az ugyanazon kódolószálhoz tartozó fázisok közül az a legvalószínűbb, amely fázis valószínűségi vonala alatt egy stop kodonnal nem megszakított pontozott vonal helyezkedik el.
1. A 650. nukleotidtól az 1650. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 6. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 736 helyzetben lévő ATG-nél kezdődik, és az 1519 helyzetű TAG-nál fejeződik be.
2. Az 1400. nukleotidtól a 3100. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 7. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez az 1620 helyzetű ATG-nél kezdődik, és a 2997 helyzetű TAG-nál fejeződik be.
3. A 2700. nukleotidtól a 3700. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 8. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 3002 helyzetű ATG-nél kezdődik, és a 3632 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
4. A 3500. nukleotidtól a 4100. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 9. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 3631 helyzetű GTG-nél kezdődik, és a 4366 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
5. A 4150. nukleotidtól az 5150. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 10. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 4365 helyzetű ATG-nél kezdődik, és az 5127 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
6. Az 5000. nukleotidtól a 6000. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően all. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez az 5893 helyzetű ATG-nél kezdődik, és az 5110 helyzetű TAG-nál fejeződik be.
7. Az 5700. nukleotidtól a 7200. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 12. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez az 5862 helyzetű ATG-nél kezdődik, és a 7101 helyzetű TAA-nál fejeződik be.
HU 216 653 Β
8. A 7000. nukleotidtól a 8000. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízisnek köszönhetően a 13. nyílt leolvasási keretet meghatároztuk. Ez a 7172 helyzetű ATG-nél kezdődik, és a 7931 helyzetű TTG-nél fejeződik be.
11. ábra
A pXL556, a pXL545 és a pXL723 plazmidok konstrukciója. Az 5,4 kb-os fragmentumból kivágtunk egy, a cobA és cobE géneket tartalmazó 2,4 kb Clal-EcoRV fragmentumot, és tisztítottuk. Az EcoRV helyre egy EcoRI linkért kötöttünk, majd a fragmentumot a pXL59be, a Clal-EcoRI helyekre építettük be. Az így létrehozott plazmidot pXL556-nak nevezzük. A pXL545 konstrukciója hasonló: az 5,4 kb fragmentumból kivágtunk egy 1,9 kb Clal-HindlII-HindlII fragmentumot, majd tisztítottuk. Ez a fragmentum egyedül a cobE gént tartalmazza. A HindlII helyre egy EcoRI linkért kapcsoltunk, majd a fragmentumot a pXL59-be építettük be a ClalEcoRI helyekre.
A pXL723-at a következőképpen alkottuk meg: az 5,4 kb fragmentumból egy 2,3 kb EcoRI-HindlII fragmentumot vágtunk ki, tisztítottuk, majd a végeket E. coli DNS-polimeráz I nagy fragmentumával betöltöttük. Ezt a fragmentumot az előzőleg EcoRI-gyel hasított, majd a végek betöltése végett az E. coli DNSpolimeráz I nagy fragmentumával kezelt pRK290-be (Ditta et al., 1981) klónoztuk. A zárójelben ábrázolt restrikciós helyek megfelelnek azoknak a helyeknek, melyek az E. coli DNS-polimeráz I nagy fragmentumával történt kezelés hatására eltűntek.
1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai, 1978) PstlSatl fragmentuma; 2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai 1981) Pstl-BamHI fragmentuma; 3, BamHISstl fragmentum, ami az E. coli laktóz operonját tartalmazza promotere, operátora, transzlációs iniciációs helye és első nyolc kodonja nélkül, melyek nem esszenciálisak a lacZ számára (Casadaban és munkatársai, 1983); 4, a Pseudomonas putida K.T2440 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) Sau3AI fragmentuma; őri, replikációs origó; nic, relaxációs hely; mob, a mobilizációhoz esszenciális lókusz; Kmr, kanamicin rezisztencia gén (Bagdasarian és munkatársai, 1981); B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; H, HinddlII; P, PstI; S, SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal.
12. ábra
A Tn5Spr és a Tn5 transzpozonok beépülésének vizsgálata az 5378 bp fragmentumba. A Tn5 transzpozon beépülései úgy vannak ábrázolva, mint a 14. ábrán. A Tn5Spr beépülései az SBL27 Rifr törzs kromoszómájában be vannak keretezve. A kanamicinrezisztencia génjét hordozó kazetta (1630 és 1631) beépüléseit az SC510 Rifr törzs kromoszómájába úgy ábrázoltuk, hogy a beépülés száma alatt egy nyíl van, melynek iránya megegyezik a kanamicinrezisztencia génjének transzkripciós irányával. Az ábrán ábrázolva vannak a nyílt leolvasási keretek, melyeket a szekvenciából következtettünk ki (a cobA-tól a cobE-ig); + vagy - jelek találhatók minden transzpozon vagy rezisztenciakazetta beépülési helye alatt, melyek azt jelzik, hogy a beépülés inaktiváló (-) vagy nem (+) akár a különböző mutánsok komplementációjára (a Tn5 transzpozon beépüléseinek esete), vagy hogy a beépülés megszünteti a kobalaminok termelését abban a törzsben, amelyben megvolt. A komplementáció hiánya áll fenn, ha a rekombináns mutáns kevesebb, mint háromszor kevesebb kobalamint szintetizál, mint annak a törzsnek a szintézisének szintje, amelyből a mutáns származik. A pXL545G, pXL1500, pXL1397 és pXL302 plazmidok inszertumait a végeiken található restrikciós helyekkel ábrázoltuk. Ezek az inszertumok a széles gazdaspektrumú pXL435 és pXL59 plazmidokba vannak klónozva (Cameron és munkatársai, 1989). A pXL545Q plazmid all. ábrán leírt pXL545 plazmidnak felel meg, azzal a többlettel, hogy a pXL545 BamHI helyére a ρΗΡ45Ω (Prentki et Krisch) 2 kb BamHI fragmentuma van beépítve, amely egy streptomicinrezisztencia-gént tartalmaz.
A pXL1500 megfelel az ezen az ábrán bemutatott
4.2 kb BglII-Satl fragmentumnak, amely a 30. ábrán bemutatott pKT230 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) BamHI és Satl helyére van klónozva; a pXL1397 megfelel az ábrán jelzett 2,4 kb HindlII-SstI fragmentumnak, amely a 30. ábrán leírt pXL435 (Cameron et al., 1989) multiklónozó helyének HindlII és SstI helyei közé van beépítve; a pXL302 plazmid megfelel az ábrán leírt
2.3 kb EcoRI-HindlII fragmentumnak, amely a 30. ábrán leírt pXL59 (Cameron és munkatársai, 1989) EcoRI és HindlII helyei közé van beépítve, ahol a használt HindlII hely az volt, amely a pXL59 multiklónozó helyében található; a pXL723 all. ábrán van leírva, teljesen, mint a pXL545.
Az egyes inszertumok felett ábrázolt + vagy - jelek azt jelzik, hogy van-e komplementáció a kérdéses plazmid és a fent ábrázolt kromoszomális inszerció között. C, Clal; E, EcoRI; H, HindlII; RV, EcoRV; Sau, Sau3AI; S, SstI.
13. ábra
A pXL253 és a pXL367 plazmidok megalkotása. A pXL151 plazmidból kivágtuk, majd tisztítottuk a
8,7 kb EcoRI fragmentumot. Ezt a pKT230 EcoRI helyére klónoztuk, hogy a pXL253-at kapjuk. Ugyanezt a fragmentumot beépítettük a pRK290 (Ditta et al., 1981) EcoRI helyére, hogy a pXL367-et kapjuk. 1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai 1978) Pstl-SstI fragmentuma; 2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) PstI-BamHI fragmentuma; őri, replikációs origó; nic, relaxációs hely; mob, a mobilizáció számára esszenciális lókusz (Bagdasarian és munkatársai, 1981); B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; H, HindlII; P, PstI; S, SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal; tetr, tetraciklin rezisztencia gén; Kmr, kanamicinrezisztencia-gén.
14. ábra
A Tn31acZ és a Tn5 transzpozonok beépülésének vizsgálatai a pRK290-be (Ditta és munkatársai, 1980) klónozott 8,7 kb EcoRI fragmentumba. A Tn31acZ transzpozonok beépülései a Tn5 transzpozonokéval ellentétben alá vannak húzva. Az ábrán jelen vannak a szekvenciából kikövetkeztetett nyílt leolvasási keretek (cobF-től cobM-ig) és a nyolc inaktiváló beépülési csoport (1-től 8-ig számozva vannak ábrázolva; a minden transzpozon-beépülés alatt jelenlevő + vagy - jelek azt jelzik, hogy a beépülés inaktiváló (-) vagy nem (+) a
HU 216 653 Β különböző mutánsok komplementációjára). A komplementáció hiánya áll fenn, ha a rekombináns mutáns kevesebb, mint háromszor kevesebb B,2 vitamint szintetizál, mint annak a törzsnek a szintézisének szintje, amelyből a mutáns származik. Az inaktiváló beépülési csoportok a következő mutánsoknak felelnek meg: 1, G615; 2, G614 és G616; 3, G613 és G164; 4, G620; 5, G638; 6, G610 és G609; 7, G612; 8, G611. Ezek a mutánsok az Agrobacterium tumefaciens már leírt cob mutánsai (Cameron et al., 1989). Az ábra alján a 8,7 kb fragmentum restrikciós térképe található.
15. ábra:
Az 5,4 kb fragmentum cobA-cobE génjeit kódoló szekvenciák. A szekvenciák által kódolt COBA-COBE proteinek szekvenciái a megfelelő kódolószekvenciák alatt vannak ábrázolva, cobA-tól cobE-ig. Fel van tüntetve minden protein aminosav-összetétele, számban és százalékban, COBA-tól COBE-ig, valamint a molekulatömeg, a polaritásindex, az izoelektromos pont, a tisztított protein 1 mg/ml oldatának optikai denzitása 260 nm-nél és 280 nm-nél. A proteinek hidrofilitási profilja szintén fel van tüntetve COBA-tól COBE-ig; ez Hopp és Woods (1981) programja alapján van kiszámolva. A pozitív értékek olyan proteinrégióknak felelnek meg, amelyek hidrofilok. Az abszcisszán az aminosavak helyzete van jelölve, míg az ordinátán a hidrofilitási index értéke van ábrázolva; amikor ez az érték pozitív, ez azt jelenti, hogy a proteinrégió hidrofil.
16. ábra:
A 8,7 kb fragmentum cobF-cobM génjeit kódoló szekvenciák. A szekvenciák által kódolt COBF-COBM proteinek szekvenciái a megfelelő kódoló szekvenciák alatt vannak ábrázolva. A magyarázat azonos a 15. ábráéval. Megjegyzendő, hogy a COBF proteint a 736. helyen lévő ATG-nél kezdtük; lehetséges, hogy e protein valódi kezdőkodonja a 751. helyzetben lévő ATG.
17. ábra:
A kobirinsav-a,c-diamid szintetáz által katalizált reakció. Az ACDAS a kobirinsav (hidrogenobirinsav) a és c periferikus acetát láncai karboxilcsoportjainak amidálását katalizálja, mely reakció a kobirinsav-diamidot (hidrogenobirinsav-diamidot) adja; az enzimatikus tesztekben használt amincsoportdonor az L-glutamin; deaminációjával az L-glutaminsav keletkezik. X a kobalt axiális ligandumjainak felel meg, az egyik különbözhet a másiktól.
18. ábra:
Az SP2MT által katalizált reakció. Az SP2MT egy metilcsoport transzferét katalizálja a SAM-ról a dihidrozirohidroklorinra vagy prekorrin-2-re, amely így a prekorrin-3-at adja. A metilcsoport a porfirinmag C20 pozíciójára kerül.
19. ábra:
A hidrogenobirinsav és a hidrogenobirinsav-a,c-diamid szerkezete.
20. ábra:
A COBA és COBF proteinek affinitása a SAM-hoz. A görbék a TSK-125 oszlopról felfogott radioaktivitást ábrázolják önkényes egységekben minden, az oszlopra felvitt protein esetén. A retenciós idők percben vannak megadva, és a radioaktivitás csúcsa, amely a szabad SAM-nak felel meg, a 10 perc 30 másodperces időpontban volt megfigyelhető.
21. ábra:
A COBA és a COBI szekvenciák összehasonlítása. Csak az erősen homológ 1., 2. és 3. régiók vannak jelölve. Az egyedi maradékok közé = jelek, a homológ maradékok (Η K R, LIV M, A G S T, Y F W, D E Q N Β Z, P, C) közé - jelek vannak téve.
22. ábra:
A Pseudomonas denitrificans COBA proteinje és az E. coli CYSG proteinje primer szekvenciájának összehasonlítása. Az összehasonlítást Kanehisa programja szerint végeztük. Az egyedi maradékok közé = jelek, a homológ maradékok (Η K R, L IV M, A G S T, Y F W, D E Q N Β Z, P, C) közé — jelek vannak téve. Az 1., 2., 3. régiók a proteinek közötti erősen homológ régióknak felelnek meg.
23. ábra:
Az E coli CYSG szekvenciájának összehasonlítása a Pseudomonas denitrificans COB proteinjeivel (COBA, COBF, COBI, COBJ, COBL és COBM). Az összehasonlítás a CYSG, a COBA és a COBI között meglévő erősen homológ 1., 2. és 3. régiókban történt. A homológiát mutató régiók helyét megjelöltük a proteinszekvencián. A következő homológ maradékokat vettük figyelembe: Η K R, L I V M, AG S T, Y F W, D E QNB Z, P, C. Azokat az aminosavakat, ahol ugyanazon a helyen legalább 3 homológ maradék található, bekereteztük.
24. ábra:
A pXL1148 és a pXL1149 plazmidok megalkotása. A pXLl 148-t a következők szerint alkottuk meg: a 8,7 kb fragmentum 1,9 kb BamHI-BamHI-Sstl-SstI fragmentumát, mely a cobH és cobl géneket tartalmazza, tisztítottuk, és a BamHI végre Xbal, az SstI végre EcoRI linkért kapcsoltunk. Ezt a fragmentumot a széles gazdaspektrumú pXL59 (Cameron és munkatársai, 1989) plazmid Xbal és EcoRI helyei közé építettük be, hogy így a pXLl 148 plazmidot kapjuk. A pXLl 149 plazmidot úgy alkottuk meg, mint a pXLl 148-at, azzal a különbséggel, hogy a kezdetben tisztított fragmentum az 1,5 kb BamHIBamHI-Sstl fragmentum a pXLl 148-hoz használt, plusz még egy 400 bp kis SstI fragmentumot tartalmazó helyett. A fragmentumot ezután ugyanannak az enzimatikus kezelésnek vetettük alá, és ugyanúgy klónoztuk a pXL59ben. 1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai, 1978) PstlSstl fragmentuma; 2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) Pstl-BamHI fragmentuma; 3, BamHI-SstI fragmentum, ami az E. coli laktóz operonját tartalmazza, promotere, operátora, transzlációs iniciációs helye és első nyolc kodonja nélkül, melyek nem esszenciálisak a lacZ számára (Casadaban és munkatársai, 1983); 4, a Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) Sau3AI fragmentuma; őri, replikációs origó; nic, relaxációs hely; Kmr, kanamicin rezisztencia gén; mob, a mobilizációhoz esszenciális lókusz (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; H, HinddlII; P, PstI; S SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal.
25. ábra:
Az SC510 Rifr, SC510 Rifi pKT230, SC510 RiP pXL1148, SC510 RiPpXLl 149 törzsek összes proteinje
HU 216 653 Β
10%-os SDS-PAGE-sel analizálva, ahogy azt már leírták. A baktériumokat 4 napig PS4 közegben tenyésztettük, majd az összprotein lizátumait hoztuk létre.
1. sáv, SC510 RiP; 2. sáv, SC510 Rítt pXLl 149; 3. sáv, SC510 RiP pXLl 148; 4. sáv, SC510 RiP pKT230. A molekulatömeg markerek molekulatömegeit feltüntettük. Azokat a helyeket, ahova a COBI és COBH proteinek elmozdultak, jelöltük.
26. ábra:
A pXL1496 és a pXL1546 plazmidok megalkotása. A pXL1496 plazmid lehetővé teszi a COBF protein nagyfokú kifejeződését E. colinál, és a pXL1546 lehetővé teszi a COBF protein nagyfokú kifejeződését Pseudomonas denitrificansnál. A 8,7 kb fragmentumból kivágtuk és tisztítottuk a 2,2 kb EcoRI-XhoI fragmentumot. Ezt az M13mpl9 fág EcoRI helyére klónoztuk, és így a pXL1405 plazmidot kaptuk. Ezután irányított mutagenezissel egy Ndel helyet vezettünk be a fragmentum 733. helyzetébe, ahogy azt korábban leírták; így egy Ndel hely található pont a cobF gén feltételezett iniciációs kodonja felett. Az így kapott új plazmidot pXL1406-nak neveztük. A megfelelő enzimekkel végzett részleges emésztés és a pXL694 plazmid megfelelő fragmentumaival (E. coli kifejeződési jeleket tartalmazó 120 bp EcoRI-Ndel fragmentum - lásd a szöveget -, és az ampicillinrezisztencia-gént, plazmid replikációs funkciókat, valamint az E. coli rmB operonjának terminátorait tartalmazó 3,1 kb EcoRI-Sphl fragmentum, amint az a szövegben le van írva) történő ligálás után egy, a cobF gént a feltételezett iniciációs kodontól tartalmazó 1,5 kb Ndel-SphI-Sphl fragmentumot tisztítottunk. Az így megalkotott plazmidot pXL 1496-nak neveztük el. A pXL1546-ot a következőképpen alkottuk meg: a pXL14963 kb EcoRI-BamHI-BamHI fragmentumát a megfelelő enzimekkel végzett részleges emésztés után tisztítottuk; ez a fragmentum tartalmazza az E. coli expressziós jeleket, utána a cobF gént, majd a cobG gén 5’ részét, amelyet az E. coli rmB operonjának terminátorai követnek, amint az a szövegben le van írva; ezt a fragmentumot a 30. ábrán leírt sokgazdás pKT230 plazmidba (Bagdasarian és munkatársai, 1981) klónoztuk. B, BamHI; C, Clal; E. EcoRI; H, HinddIII; P, PstI; S SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal; Kmr, kanamicinrezisztencia-gén; Amp, ampicillinrezisztencia-gén.
27. ábra:
Az SC510 RiP, SC510 RiP pKT230, SC510 RiP pXL1546 törzsek összproteinjének 10%-os SDS-PAGE analízise, amint azt már leírták. A baktériumokat 4 napig PS4 közegben tenyésztettük, majd az összprotein lizátumait hoztuk létre.
1. sáv, SC510 RiP; 2. sáv, SC510 RiP pKT230; 3. sáv, SC510 RiP pXL1546. A molekulatömeg markerek molekulatömegeit feltüntettük. Azt a helyet, ahova a COBF protein elmozdult, jelöltük.
28. ábra:
Az E. coli B és az E. coli B pXL1496 törzsek összproteinjének 10%-os SDS-PAGE analízise, amint azt már leírták. 1. sáv, E. coli pXL1496 triptofán nélkül tenyésztve; 2. sáv, E. coli pXL1496 ugyanolyan körülmények között, de triptofán jelenlétében tenyésztve; 3.
sáv, E. coli triptofán hiányában tenyésztve; 4. sáv, E. coli ugyanolyan körülmények között, de triptofán jelenlétében tenyésztve. A molekulatömeg markerek molekulatömegeit feltüntettük. Azt a helyet, ahova a COBF protein elmozdult, jelöltük.
29. ábra:
A pXL525 és a pXL368 plazmidok megalkotása. A pXL368-at a következőképpen alkottuk meg: a 2,4 kb EcoRV-Clal fragmentumot (amely a cobA és cobE géneket tartalmazza) tisztítottuk a pXL556 plazmidból (B. Cameron et al., 1989), amely lehetővé teszi, hogy a fragmentumot úgy kapjuk meg, hogy egy BamHI és egy Xbal hely van a két végén; ezt a fragmentumot a pXL203 plazmid BamHI és Xbal helyei közé klónoztuk. A pXL525 megalkotásához a 8,7 kb EcoRI fragmentum jobb végén elhelyezkedő EcoRI helyhez egy Xbal linkért kapcsoltunk; ezt a 8,7 kb EcoRI-Xbal fragmentumot összeklónoztuk a pXL556-ból származó, a cobA és cobE géneket tartalmazó 2,4 kb EcoRI-Xbal fragmentummal. A zárójelben ábrázolt restrikciós helyek megfelelnek azoknak a helyeknek, melyek az E. coli DNS-polimeráz I nagy fragmentumával történt kezelés hatására eltűntek.
1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai, 1978) Pstl-SstI fragmentuma; 2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) Pstl-BamHI fragmentuma; őri, replikációs origó; nic, relaxációs hely; mob, a mobilizációhoz esszenciális lókusz; (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; H, HindlII; P, PstI; S, SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal, tét, tetraciklinrezisztencia-gén, Ampr és Amp, ampicillinrezisztencia-gén.
30. ábra:
A Q inkompatibilitási csoport a gram-negatív baktériumokra nézve széles gazdaspecifitású plazmidjai. Ezeket a plazmidokat egy korábbi publikációban leírták (Cameron és munkatársai, 1989), és a jelen találmányban felhasználjuk őket.
1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai, 1978) PstlSstl fragmentuma;
2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) Pstl-BamHI fragmentuma;
3, BamHI-SstI fragmentum, ami az E. coli laktóz operonját tartalmazza promotere, operátora, transzlációs iniciációs helye és első nyolc kodonja nélkül, melyek nem esszenciálisak a lacZ számára (Casadaban és munkatársai, 1983);
4, a Pseudomonas putida KT2440 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) Sau3AI fragmentuma; őri, replikációs origó; nic. relaxációs hely; Kmr, kanamicinrezisztencia-gén; Smr, streptomicinrezisztencia-gén; mob, a mobilizációhoz esszenciális lókusz (Bagdasarian et al., 1981); B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; H, HindHI; P, PstI; S, SstI; Sa, Sáli; X, Xhol, Xb, Xbal.
31. ábra:
Különböző korrinoid etalonok (1 mg/etalon) retenciós ideje a 9. példában leírt szeparációs rendszeren. A használt oszlop egy Nucleosil C-18 oszlop (MachereyNagel). Minden abszorbancia csúcs mellett egy szám található, amely megfelel az itt lent leírt korrinoidoknak. A vízszintes tengelyen a retenciós idő, a függőleges tengelyen a 371 nm-nél mért abszorbancia található.
HU 216 653 Β
1, kobirinsav; 2, kobirinsav-a-amid; 3, kobirinsav-gamid; 4, kobirinsav-a,g-diamid; 5, kobirinsav-c-amid; 6, kobirinsav-c,g-diamid; 7, kobirinsav-a,c-diamid; 8, kobirinsav-triamid; 9, kobirinsav-tetraamid; 10, kobirinsav-pentaamid; 11, kobirinsav; 12, GDP-kobinamid; 13, kobinamid-foszfát; 14, kobinamid; 15, cianokobalamin-5’-foszfát; 16, cianokobalamin.
32. ábra:
A Pseudomonas denitrificans 4748 bp-os Sall-SallSalI-SalI-SalI-BglI fragmentuma két láncának nukleotidszekvenciája. A fölül elhelyezkedő lánc az 5’—>3’ irányú értelmes szál balról jobbra, ami a 6. ábrán bemutatott restrikciós térkép fragmentuma balról jobbra irányának felel meg.
33. ábra:
A Pseudomonas denitrificans 3855 bp-os Sstl-SstlBamHI fragmentuma két szálának nukleotidszekvenciája. A fölül elhelyezkedő lánc az 5’—>3’ irányú értelmes szál balról jobbra, ami a 6. ábrán bemutatott restrikciós térkép fragmentuma bakói jobbra irányának felel meg.
34. ábra:
A kódolófázisok kodonhasználat szerinti valószínűségi analízise Staden és MacLachlan (1982) programját használva a 4748 bp-os Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentum hat leolvasási fázisán. Az ugyanazon kódolószálhoz tartozó fázisok közül az a legvalószínűbb, amely fázis valószínűségi vonala alatt egy stop kodonnal nem megszakított pontozott vonal helyezkedik el. 4a. A 200-800. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 14. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 660. helyzetben levő ATG-nál kezdődik, és a 379. helyzetben levő TGA-nál fejeződik be. 4b. A 800-1500. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 15. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 925. helyzetben levő GTG-nál kezdődik, és a 1440. helyzetben levő TAA-nál fejeződik be. 4c. A 1450-2600. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 16. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez az 1512. helyzetben levő ATG-nál kezdődik, és a 2510. helyzetben levő TGA-nál fejeződik be. 4d. A 2500-4650. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 17. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 2616. helyzetben levő GTG-nál kezdődik, és a 4511. helyzetben levő TGA-nál fejeződik be.
35. ábra:
A kódolófázisok kodonhasználat szerinti valószínűségi analízise Staden és MacLachlan (1982) programját használva a 3855 bp-os Sstl-Sstl-BamHI fragmentum hat leolvasási fázisán. Az ugyanazon kódolószálhoz tartozó fázisok közül az a legvalószínűbb, amely fázis valószínűségi vonala alatt egy stop kodonnal nem megszakított pontozott vonal helyezkedik el. 5a. Az 1 -905. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 18. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 809. helyzetben levő ATG-nál kezdődik, és a 108. helyzetben levő TGA-nál fejeződik be. 5b. A 955-2105. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 19. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez az 1971. helyzetben levő
ATG-nál kezdődik, és az 1063. helyzetben levő TGAnál fejeződik be. 5c. A 2000-3300. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 20. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 2099. helyzetben levő ATG-nál kezdődik, és a 3115. helyzetben levő TAG-nál fejeződik be. 5d. A 3250-3855. nukleotidoknak megfelelő szekvencia analízise. Ez az analízis lehetővé tette a 21. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 3344. helyzetben levő ATG-nál kezdődik, és a 3757. helyzetben levő TGA-nál fejeződik be.
36. ábra:
A pXL233, pXL843 és a pXL1558 plazmidok konstrukciója a pXL 154-ből kiindulva. A plazmidokat a következő módon alkottuk meg. A pXLl 54-ből kivágtuk a csonkolt cobS gént és a felette levő szekvenciákat tartalmazó 3,5 kb EcoRI fragmentumot, majd tisztítottuk, és a pKT230 EcoRI helyére klónoztuk. Az így megalkotott plazmidot pXL233-nak neveztük. A pXL154-ből részleges emésztéssel kivágtuk, majd tisztítottuk a cobT gént és az alatta levő szekvenciákat tartalmazó 3,5 kb EcoRIXhol-Xhol fragmentumot. A pXL 154-ből kivágtuk és tisztítottuk a cobS gént és a felette levő szekvenciát tartalmazó 4,3 kb EcoRI-EcoRI-EcoRI fragmentumot, majd az előző 3,5 kb fragmentummal ligáltuk. Az így kapott körülbelül 8 kb EcoRI-XhoI fragmentumot a pXL59 EcoRI és Sáli helyeire klónoztuk, hogy a pXL843 plazmidot kapjuk. A pXL1558 plazmidot a következőképpen alkottuk meg: a pXL 154-ből kivágtuk és tisztítottuk a 12 kb HindlII-HindlII fragmentumot, majd a végeit az E. coli DNS-polimeráz nagy fragmentumával betöltöttük. Ezt az inszertet az EcoRI-gyel emésztett, majd a tompa végek kialakítására az E. coli DNS-polimeráz nagy fragmentumával kezelt pRK290-be (Ditta és munkatársai, 1981) klónoztuk. A zárójelben feltüntetett restrikciós helyek azoknak a helyeknek felelnek meg, amelyek a klónozás során eltűntek. 1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai, 1978) Pstl-SstI fragmentuma; 2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) PstlBamHI fragmentuma; B, BamHI;C, Clal; E, EcoRI; H, HinddIII; P, PstI; S SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal; Tét, tetraciklin rezisztencia gén; Kmr, kanamicinrezisztencia-gén; Smr, streptomicinrezisztencia-gén.
37. ábra:
A Tn5Sp transzpozon beépülésének vizsgálata a pXL15412 kb HindlII-HindlII inszertumába. A transzpozon beépülését a pXL1558-ba klónozott 12 kb HindlIIHindlII inszertumon térképeztük. Az SC510 Rifr törzsbe történt kromoszomális beépüléseket bekereteztük, ami nem ilyen, azt bevezettük az SBL27 Rif törzsbe. Minden inszerció alatt egy plusz vagy mínuszjel található, amely az ezt az inszerciót tartalmazó törzs Cob fenotípusát jelzi. A G2035 törzs pXL1558: :Tn5Sp plazmidokkal történt komplementációjának hiányát (illetve a komplementációt) mínusz (illetve plusz) jelek jelzik minden inszerció alatt. A 36. ábrán leírt plazmidok inszertumai fel vannak tüntetve. Az ezeken a plazmidokon, a transzpozon inszerciójával egy vonalban található plusz (vagy mínusz) jelek a transzpozonban mutált törzs plazmiddal történő komplementációját (vagy annak hiányát) mutatják. Az ábrán jelen vannak a szekvenciából kikövetkeztetett nyílt
HU 216 653 Β leolvasási keretek (ORF14-17), valamint a megfelelő cob gének (cobS és cobT) is. E: EcoRI; H: HindlII; X: Xhol.
38. ábra:
A pXL1286, pXL1303, pXL1324, pXL1490B és a pXL1557 plazmidok megalkotása a pXL519-ből kiindulva. A szekventált fragmentum helyzete az ábra felső részén, a restrikciós térképek csoportja felett van bemutatva; egy 3,9 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentumról van szó. A plazmidokat a következő módon alkottuk meg. A pXL519-ből kivágtuk a cobU gént és az alatta levő szekvenciákat tartalmazó 2 kb BglII-EcoRI fragmentumot, majd tisztítottuk, és a pKT230 BamHI és EcoRI helye közé klónoztuk, hogy a pXL1286 plazmidot kapjuk. A pXL519-ből kivágtuk a csonkolt cobV gént, a cobU gént és az alatta levő szekvenciát tartalmazó,
2,7 kb Sstl-EcoRI fragmentumot, majd tisztítottuk, és a pKT230 SstI és EcoRI helye közé klónoztuk, hogy a pXL1324 plazmidot kapjuk. A pXL519-ből kivágtuk a csonkolt cobV gént és a felette levő szekvenciát tartalmazó 1,6 kb Sstl-SstI fragmentumot, majd tisztítottuk, és a pKT230 SstI helyei közé klónoztuk, hogy a pXL13O3 plazmidot kapjuk. A pXL519 BamHI-gyel történő teljes emésztése és Sstl-gyel történő részleges emésztése után a 3,85 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentumot tisztítottuk. Ezt a fragmentumot a pKT230 BamHI és SstI helyeire klónoztuk, hogy a pXL1490B plazmidot kapjuk. A pXL1557 plazmidot a következő módon alkottuk meg: a pXL519-ből kivágtuk a 9 kb HindlII-BamHI fragmentumot, tisztítottuk, majd a végeit az E. coli DNS-polimeráz I vagy fragmentumával betöltöttük. Ezt az inszertumot az EcoRI-gyel emésztett, majd a tompa végek kialakítására az E. coli DNSpolimeráz nagy fragmentumával kezelt pRK290-be (Ditta és munkatársai, 1981) klónoztuk. A zárójelben feltüntetett restrikciós helyek azoknak a helyeknek felelnek meg, amelyek a klónozás során eltűntek.
1, az RSF1010 (De Graff és munkatársai, 1978) PstlSstl fragmentuma;
2, a pACYC177 (Bagdasarian és munkatársai 1981) Pstl-BamHI fragmentuma; B, BamHI; C, Clal; E, EcoRI; H, HinddIII; P, PstI; S, SstI; Sa, Sáli; X, Xhol; Xb, Xbal; Tetr, tetraciklinrezisztencia-gén; Kmr, kanamicinrezisztencia-gén; Smr, streptomicinrezisztencia-gén.
39. ábra:
A Tn5Sp transzpozon beépülésének vizsgálata a pXL5199 kb HindlII-BamHI inszertumába. A transzpozon beépülését a pXL 1557-be klónozott 9 kb HindlIIBamHI inszertumon térképeztük. Az SC510 Rifr törzsbe történt kromoszomális beépüléseket bekereteztük, ami nem ilyen, azt bevezetettük az SBL27 Rir törzsbe. Minden inszerció alatt egy plusz vagy mínusz jel található, amely az ezt az inszerciót tartalmazó törzs Cob fenotípusát jelzi. A G2040 törzs pXL1557: :Tn5Sp plazmidokkal történt komplementációjának hiányát (illetve a komplementációt) mínusz (illetve plusz) jelek jelzik minden inszerció alatt. A 6. ábrán leírt plazmidok inszertumai fel vannak tüntetve. Az ezeken a plazmidokon, a transzpozon inszerciójával egy vonalban található plusz (vagy mínusz) jelek a transzpozonban mutált törzs plazmiddal történő komplementációját (vagy annak hiányát) mutatják. Az ábrán jelen vannak a szekvenciából kikövetkeztetett nyílt leolvasási keretek (ORF18-21), valamint a megfelelő cob gének (cobU és cobV) is.
40. ábra:
A 4,8 kb fragmentum összes génjének, úgymint a cobX, cobS és cobT géneknek a kódolószekvenciáját mutatjuk be. A cobX, cobS és cobT kódolószekvenciák alatt az e szekvenciák által kódolt COBX; COBS és COBT proteinek szekvenciáit ábrázoltuk. A jelmagyarázat azonos a 15. ábráéval.
41. ábra:
A 3,9 kb fragmentum összes génjének, úgymint a cobU és cobV géneknek a kódolószekvenciáját mutatjuk be. A cobU és cobV kódolószekvenciák alatt az e szekvenciák által kódolt COBU és COBV proteinek szekvenciáit ábrázoltuk. A jelmagyarázat azonos a 15. ábráéval.
42. ábra:
A. Az E. coli BL21 pLysS pET3b, E. coli BL21 pLysS pXL1937 törzsek összes proteinje 10%-os SDS-PAGE-n analizálva. 1 sáv, BL21 pLysSpET3b; 2 sáv, E. coli BL21 pLysS pXL1937.
B. Az E. coli BL21, E. coli BL21 pXL1874 és E. coli BL21 pXL1875 törzsek összes proteinje 10%-os SDS-PAGE-n analizálva. 1 sáv, E. coli BL21; 2 sáv, E. coli BL21 pXL1874; 3 sáv, E. coli BL21 pXL1875.
A markerek molekulatömegeit feltüntettük. A túltermelődött proteinnek megfelelő sávot nyíl jelzi.
43. ábra:
A Pseudomonas denitrificans 13144 bp Sstl-Sstl-SstlSstl-BglII-BglII fragmentuma két láncának nukleotidszekvenciája. A fölül elhelyezkedő lánc az 5’—>3’ irányú értelmes szál balról jobbra, ami a 46. ábrán bemutatott restrikciós térkép fragmentuma balról jobbra irányának felel meg.
44. ábra:
A Pseudomonas denitrificans 13144 bp Sstl-Sstl-SstlSstl-BglII-Sstl-BglII fragmentumának restrikciós térképe. Az aktuális restrikciós helyek pozíciója vagy pozíciói a hasítási helyek számának növekvő sorrendjében vannak jelölve a szekvenált fragmentumon; a helyzetek megfelelnek a 43. ábrán bemutatott szekvenciának.
45. ábra:
A kódolófázisok kodonhasználat szerinti valószínűségi analízise Staden és MacLachlan (1982) programját használva az 13144 bp-os Sstl-Sstl-Sstl-Sstl-BglII-Sstl-BglII fragmentum hat leolvasási fázisán. Az ugyanazon kódolószálhoz tartozó fázisok közül az a legvalószínűbb, amely fázis valószínűségi vonala alatt egy stop kodonnal nem megszakított pontozott vonal helyezkedik el.
1. Az 1. nukleotidtól a 2266. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízis lehetővé tette a 22. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 429 helyzetben lévő ATG-nél kezdődik, és az 1884 helyzetű TAG-nál fejeződik be.
2. A 2266. nukleotidtól a 4000. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízis lehetővé tette a 23. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 3364 helyzetben lévő ATG-nél kezdődik, és a 3886 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
3. A 3800. nukleotidtól az 5000. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízis lehetővé tette a 24. nyílt leolva12
HU 216 653 Β sási keret azonosítását. Ez a 3892 helyzetben lévő ATGnél kezdődik, és a 4954 helyzetű TAG-nál fejeződik be.
4. Az 5000. nukieotidtól a 9000. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízis lehetővé tette a 25. nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez az 5060 helyzetben lévő ATGnél kezdődik, és a 8885 helyzetű TAG-nál fejeződik be.
5. A 9000. nukieotidtól a 9700. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízis lehetővé tette a 26 nyílt leolvasási keret azonosítását. Ez a 9034 helyzetben lévő ATGnél kezdődik, és a 9676 helyzetű TGA-nál fejeződik be.
6. A 9600. nukieotidtól az 13144. nukleotidig tartó szekvencia. Ezen analízis lehetővé tette a 27., 28., 29. és 30. nyílt leolvasási keretek azonosítását. Ezek egyenként a 9678, 10895, 11656 és 13059 helyzetekben lévő ATG-knél kezdődnek, és az 10101, 10304, 12181 és 12366 helyzetekben lévő stop kodonoknál fejeződnek be. A 28. és 30. nyílt leolvasási keretek az összes többi nyílt leolvasási keretnek megfelelő kódoló szál komplementer szálán találhatók.
46. ábra:
A 13,4 kb EcoRI-BglII-EcoRI-BglII fragmentum, a Tn5Sp transzpozonok beépüléseinek helyzete a 9,1 kb EcoRI fragmentumon, a Tn5 transzpozonok beépüléseinek helyzete a pXL189 plazmid inszertumján, valamint különböző, az SC510 Rifr::Tn5Sp törzs komplementációs kísérletei során használt plazmidok inszertumjain. A mutáns SC510 Rifr: :Tn5Sp komplementációit a plazmidokkal jelöltük: (+) - a szülőtöizs, az SC510 Rifrszintjének 5%-a és 100%-a között, (.) - részleges komplementáció, az SC510 Riü-szintjének 0,5 és 5%-a között, vagy (-) - a komplementáció hiánya, azaz kevesebb, mint ezerszer kevesebb, mint az SC510 Rifr-, pont a plazmidok inszertumait jelölő vonalak felett és egy vonalban a megfelelő mutánsok inszerciós helyével. A Tn5 transzpozonok pXL189 plazmidba történt inszerciója alatt be van mutatva ezen mutáns plazmidok komplementációja (+) vagy a komplementáció hiánya (-) az Agrobacterium tumefaciens G632 és G633 mutánsaival. Az ábra jobb oldalán egy táblázat található, amely bemutatja a G622, G623 és G630 (Cameron et al., 1989) mutánsok komplementációját különböző plazmidokkal; (+) - teljes komplementáció, a szülőtörzs, a C58C9 Rifr-szintjének 100%-a, (.) - részleges komplementáció, az C589 Rifr-szintjének 10 és 50%-a között vagy (-) - a komplementáció hiánya. A különböző plazmidokat, amelyek inszertumait bemutatjuk, a következőképpen alkottuk meg (a fragmentumokat vagy a pXL 156-ból, vagy a pXL 157-ből vágtuk ki):
pXL618 megfelel a 2,5 kb EcoRI-BamHI fragmentumnak a pKT230 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) azonos helyei közé klónozva;
pXL539 megegyezik a pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) BamHI helyeire klónozott 3,1 kb BamHI fragmentummal;
pXL623 megfelel a pXL59 (Cameron et al., 1989) BamHI-Sall helyeire klónozott 1,9 kb BamHI-Sall fragmentumnak;
pXL1909 megfelel a pKT23O (Bagdasarian et al., 1981) BamHI helyei közé klónozott 8,4 kb BamHIBamHI-BamHI fragmentumnak;
a pXL221 megfelel az 1,6 kb EcoRI-Clal fragmentumnak a pXL59 azonos helyeire klónozva (a Clal hely, ahova a fragmentumot klónoztuk, a pXL59 (Cameron és munkatársai, 1989) multiklónozó helyének Clal helye);
a pXL1908 és 1938 megfelelnek ugyanannak az inszertumnak, a 6,5 kb XhoI-BamHI-BamHI fragmentumnak, amelyhez Xbal linkereket kapcsoltunk; ezt az inszertumot mindkét orientációban klónoztuk a pXL435 (Cameron és munkatársai, 1989) Xbal helyeire; az ábrán egy nyíl jelöli a kanamicinrezisztencia-génjének helyzetét a két plazmid inszertumának végeihez viszonyítva;
pXL208 megfelel a pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) BamHI helyére klónozott 5,2 kb BamHI fragmentumnak;
pXL297 megfelel a pKT230 (Bagdasarian et al., 1981) EcoRI helyére klónozott 9,1 kb EcoRI fragmentumnak.
A fragmentum szekvenciájából meghatározott nyílt leolvasási kereteket (PO 22-től PO 30-ig), valamint a megfelelő cob géneket az ábrán bemutatjuk; a transzkripció irányát egy nyíl mutatja. E, EcoRI; B, BamHI; Bg, BglIII; Cl, Clal; Sau, Sau3AI; X, Xhol.
47. ábra:
A 13,4 kb fragmentum összes génjének, így a cobQ, cobP és cobW, cobN és cobO gének kódolószekvenciáját jelöltük. A cobQ, cobP, cobW, cobN és cobO kódoló szekvenciák alatt az e szekvenciák által kódolt COBQ, COBP, COBW, COBN és COBO proteinek szekvenciáit ábrázoltuk. A jelmagyarázat azonos a 15. ábráéval.
48. ábra:
A - a M. ivanovii SUMT-ánakNH2-terminális szekvenciája, és a 923, 946, 947 oligonukleotidok szekvenciája; -jelöli, hogy ezen a helyen nem tudtuk meghatározni a maradékot; az antiszensz oligonukleotidoknál a szekvencia felett jelölt aminosavak a bemutatott antikodonoknak felelnek meg. B - a M. ivanovii SUMT struktúrgén egy belső fragmentumának a 946 és 947 oligonukleotidokkal történő enzimatikus amplifikációjának bemutatása.
49. ábra:
A rekombináns pGIO replikádv formájának előállítása. Az amplifikációval kapott 615 bp fragmentumot HindlII-mal és EcoRI-gyel emésztettük, majd tisztítottuk, amint az le van írva. Ezt a fragmentumot azután az ugyanazokkal az enzimekkel emésztett M13mpl9 fág replikatív formájával ligái tűk. A rekombináns kiónt a szövegben leírt módon találtuk meg.
50. ábra:
Egy korábban leírt módon különböző enzimekkel emésztett, agarózgélen elektroforézissel elválasztott, majd Nylon membránra átvitt M. ivanovii genomiális DNS-blot autoradiográfiája. A membránt a pGIO szondával hibridizáltattuk, amint azt előzőleg leírtuk. 1, HindlII-BglII; 2, KpnI-BglII; 3, EcoRI-BglII; 4, BglIIPstl. A szondával hibridizáló különböző fragmentumok mérete kb-ban van megadva.
51. ábra:
A M. ivanovii 955 bp fragmentuma két szálának nukleotid-szekvenciája. A fölül elhelyezkedő lánc az 5’-től 3’-irányú értelmes szál balról jobbra.
HU 216 653 Β
52. ábra:
A M. ivanovii corA génjének kódoló szekvenciája, amelyet a 955 bp szekvenciából kaptunk. A CORA protein elsődleges szekvenciája is be van mutatva. Az aminosavak a kodonjuk felett vannak feltüntetve, és a stop kodon egy csillaggal van ábrázolva. A M. ivanovii CORA proteinjének fő fizikai jellemzői, tudniillik az aminosavösszetétel, számban és százalékban, a molekulatömeg, a polaritásindex, az izoelektromos pont, az 1 mg tisztított protein/ml töménységű oldat 280 nm-nél mért optikai denzitása. A M. ivanovii CORA proteinjének hidrofobitási profilja; ezt a profilt Hopp és Woods (1981) programja alapján hoztuk létre. A pozitív értékek a protein hidrofil régióinak felelnek meg. A vízszintes tengelyen az aminosavak helyzete, a függőleges tengelyen a hidrofilitási index értéke van feltüntetve; ha ez az érték pozitív, az azt jelenti, hogy a protein e régiója hidrofil.
53. ábra:
A Pseudomonas denitrificans COBA proteinje, és a M. ivanovii CORA proteinje elsődleges szekvenciájának összehasonlítása. A proteineket Kanehisa (1984) programja szerint vetettük össze. =, egyedi aminosavak; -, a korábban meghatározott kritériumok szerint homológ aminosavak (lásd a 22. és 23. ábrát).
54. ábra:
A pXL1832 és a pXL1841 plazmidok megalkotása. Az ábrán szereplő leírás lehetővé teszi a konstrukció követelését.
Általános klónozási, molekuláris biológiai és biokémiai technikák.
A klasszikus molekuláris biológiai eljárások, mint a plazmid-DNS etidium-bromid - cézium-klorid gradienscentrifugálása, a restrikciós enzimekkel való emésztés, a gélelektroforézis, a DNS-fragmensek agarózgélből való elúciója, az E. coliba való transzformáció stb. az irodalomban le vannak írva (Maniatis és munkatársai, 1982; Ausubel és munkatársai, 1987). A restrikciós enzimeket a New-Englands Biolabs (Biolabs), a Bethesda Research Laboratories (BRL) vagy az Amersham Ltd (Amersham) szolgáltatta. Az oligonukleotid linkereket a Biolabs szolgáltatta. A ligálásokhoz a DNS-ffagmentumokat 0,7%-os agaróz- vagy 8%-os akrilamid gélen méret szerint elválasztottuk, elektroelúcióval tisztítottuk, fenollal extraháltuk, etanollal kicsaptuk, majd 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 2 mM ATP pufferban inkubáltuk T4 DNS-ligáz (Biolabs) jelenlétében. Ha szükséges, a túlnyúló 5’-végeket tartalmazó DNS-fragmentumokat defoszforiláltuk borjúbél alkálikus foszfatázzal (CIP, Pharmacia) végzett kezeléssel 37 °C-on 30 percig a következő pufferban: 100 mM glicin, 1 mMMgCl2, 1 mM ZnCl2, pH 10,5. A túlnyúló vagy szabad 3’ végek defoszforilálásához ugyanezt a technikát alkalmaztuk, de a kezelés 37 °C-on 15 percig, majd 56 °C-on 15 percig tartott. Az enzimet a reakcióelegy 68 °C-ra való melegítésével inaktiváltuk 15 percig, 1% SDS és 100 mM NaCl jelenlétében, majd fenol-kloroformmal extraháltuk, és etanollal kicsaptuk. A túlnyúló 5’ végek betöltését az E. coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmentumával (Biolabs) végeztük. A reakciót szobahőmérsékleten percen át végeztük 50 mM Tris-HCl (pH 7,2), 0,4 mM dNTP-k, 10 mM MgSO4, 0,1 mM DTT, 50 mg/ml BSA pufferban. A túlnyúló 3’-végek betöltését a T4 fág DNSpolimeráz (Biolabs) jelenlétében végeztük a gyártó előírásai szerint. A túlnyúló végek emésztését Sl nukleázos (BRL) limitált kezeléssel végeztük a gyártó előírásai szerint. Az oligonukleotid linkereket a DNS-fragmentumok végeire a már leírt módon (Maniatis és munkatársai, 1982) kapcsoltuk. Az oligonukleotidokkal történő in vitro mutagenezist Taylor et al., 1985 által kifejlesztett módszerrel végeztük, az Amersham által forgalmazott készletet használva. A ligáit DNS-eket használtuk a kompetenssé tett törzsek, az E. coli MC1060 [A(lacIOPZYA)X74, galU, galK, strAr, hsdR], a plazmidok esetén, vagy E. coli TG1 [A(lac proA,B), supE, thi, hasdD5/ F’ traD36, proA+, B + , lsdclq, lacZAM15] az M13 bakteriofágból származó fágok replikatív formái esetén, transzformálására. A plazmid DNS-t Bimbóim és Doly (1979) technikája szerint tisztítottuk. A plazmid DNS mini preparációját Klein és munkatársai (1980) előírásait követve végeztük. A gram-negatív baktériumok kromoszomális DNS-ének preparációját a már leírt módon végeztük (Cameron és munkatársai, 1989). A radioaktív szondákat a hasítások transzlációjával készítettük a már részletezett eljárást követve (Rigby et al., 1977). A DNS-szekvenciák hibridizációja, valamint a nukleinsavak nitro-cellulóz-membránokhoz kötése a már leírt módon történt (Cameron és munkatársai, 1989). Azon klónozások alkalmával, ahol kicsi volt a valószínűsége, hogy a keresett rekombináns kiónt megtaláljuk, azt szűrőre történt hibridizáció után találtuk meg, amint azt már leírták (Maniatis et al., 1982). A DNS-fragmentumok nukleotid-szekvenciáját a láncterminációs módszerrel határoztuk meg (Sanger és munkatársai 1977). A reakciókeverékben a dGTP-t a 7-dezaza-dGTP-vel helyettesítettük, hogy elkerüljük az akrilamidgél-elektroforézis során a DNS magas GC százaléka miatti sávszűrősödést. A bakteriológiai lépésekben használt kultúrközegeket már bemutatták (Maniatis és munkatársai, 1982). A PS4 közegen történő tenyésztést a már leírt módon valósítottuk meg (Cameron és munkatársai, 1989); a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr és G2 Riri törzseket PS4 közegben a következők szerint tenyésztettük: 25 ml PS4 közeget, és ha szükséges, a törzs által hordozott plazmid számára szelektív antibiotikumot tartalmazó 250 ml-es Erlenmeyer-lombikokat beoltottunk az L tápközegben (Miller, 1972), amely, ha szükséges, a törzs által hordozott plazmid számára szükséges antibiotikumot tartalmazott, telített prekultúra 1/100-os oldatával; ezeket a kultúrákat 6 napon át 30 °C-on inkubáltuk, majd a tény észlét analizáltuk kobalamin titerükre vagy az útvonal bizonyos enzimeinek enzimatikus aktivitására. Az Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida és Rhizobium meliloti törzseket 30 °C-on tenyésztettük; megjelölés hiányában a tenyésztés L tápközegben történt. A bakteriális konjugációt a már leírt módon végeztük (Cameron és munkatársai, 1989). Az összprotein kivonatait a már leírt módon hoztuk létre (Ausubel és munkatársai, 1987). A proteinek denaturálókörülmények közötti akrilamidgél-elektroforézises (SDS-PAGE)
HU 216 653 Β analízisét a már leírt módon végeztük (Ausubel és munkatársai, 1987). Laemli diszkontinuus pufferrendszerét (Laemli, 1970) használva PhastSystem berendezést (Pharmacia) alkalmaztunk; a proteinek molekulatömegének, valamint tisztaságának analizálására különböző géleket használtunk a molekulatömegtől és a tisztaságtól függően: 8-25 gradiens PhastGel, 12,5 homogén PhastGel. A festést vagy Coomassie kékkel, PhastGel Blue R (Pharmacia) segítségével vagy ezüst-nitráttal, PhastGel silver Kitet (Pharmacia) alkalmazva végeztük a gyártók előírásaihoz alkalmazkodva. A proteinek NH2-terminális szekvenciáját Edman-lebontással, egy automata szekvenátort (Applied Biosystems 407A modell) használva határoztuk meg, amelyhez a fenil-tiohidantoin-származékok azonosítására egy HPLC készüléket kapcsoltunk.
1. példa
A Pseudomonas denitrificans Cob géneket tartalmazó DNS-fragmentumainak izolálása Ez a példa a Pseudomonas denitrificans Cob géneket hordozó DNS-fragmentumainak izolálását írja le. Ezek a fragmentumok az A. tumefaciens és a P. putida Cob mutánsainak komplementációs kísérleteivel (Cameron és munkatársai, 1989) kerültek a figyelem középpontjába. Ezeket a Cob mutánsokat N-metil-N’-nitro-Nnitrozo-guanidinnel történt mutagenezissel kaptuk Miller technikája szerint (Miller és munkatársai, 1972) vagy a tn5 transzpozon beépüléseivel. Ezen a módon olyan törzseket találtunk, amelyek képtelenek a kobalaminokat szintetizálni, ilyen különösen a P. putida cob G572 mutánsa és az A. tumefaciens G159, G161, G164, G169, G171, G258, G609, G610, G611, G612, G613, G615, G616, G620, G622, G623, G630, G632, G633, G634, G638, G642, G643, G2034, G2035, G2037, G2O38, G2039, G2040, G2041, G2042 és G2043 Cob mutánsai.
Párhuzamosan megalkottuk a P. denitrificans egy genomiális DNS-bankját egy széles gazdaspektrumú mobilizálható vektorban, a pXL59-ben, 5 pg DNS restrikciós enzimek jelenlétében történő emésztésével (Cameron és munkatársai, 1989).
Komplementációval több olyan plazmidot tudtunk izolálni, amely lehetővé teszi a komplementációt a P. putida és az A. tumefaciens cob mutánsaival. Ezek között különösen megjegyezzük a pXL151, pXL156, pXL157 és pXL519 plazmidokat.
Ezeket a plazmidokat izoláltuk, és a DNS-fragmentumokat kivágtuk, tisztítottuk és restrikcióval analizáltuk. Ezeket a fragmentumokat a 6. és 44. ábrán mutatjuk be: egy 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum, egy 8,7 kb EcoRI-EcoRI fragmentum, egy
4.8 kb Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentum, egy
3.9 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentum és egy 13,4 kb EcoRI-BglII-EcoRI-BglII fragmentum.
2. példa
Az izolált DNS-fragmentumok szekvenálása
Ez a példa a Pseudomonas denitrificans SC510 cob géneket hordozó DNS-fragmentumainak szekvenálását mutatja be.
2.1. Egy 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum szekvenálása
Ezt a fragmentumot az 1. példában leírt pXL157 plazmid tartalmazza. Hasítás után az 5,4 kb fragmentum alfragmentumait az M13mpl8 vagy az M13mpl9 (Norrander és munkatársai, 1983) vagy az M13tgl3O vagy az M13tgl31 (Kieny és munkatársai, 1983) fágokba klónoztuk mindkét orientációban. Ezután Henikoff (1987) eljárása szerint in vitro deléciókat hoztunk létre. Ezeket a deléciókat azután szekvenáltuk, a láncterminációs reakciók szintézisének kiindulásaként „univerzális prímért” használva. E különböző deléciók közötti átfedés lehetővé tette az 5,4 kb fragmentum mindkét láncán a teljes szekvencia megállapítását (7. ábra). Ez a fragmentum 5378 bp-t tartalmaz. A 7. ábrán leírt szekvencián a Clal hely előtt három restrikciós hely (PstI, Sáli és Xbal) található, melyek a kérdéses fragmentum klónozása során a szekvenálás szempontjából eltűntek a multiklónozóhelyekben. Amikor a következőkben a jelen találmányban a Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum szekvenciájára hivatkozunk, az a hivatkozás a
7. ábra szekvenciájára vonatkozik, ahol az első 22 bázis nem felel meg a Pseudomonas denitrificans DNS-ének (így minden restrikciós hely vagy nyílt leolvasási keret kezdetének pozíciója a 7. ábrán bemutatott szekvenciára utal).
2.2 Egy 8,7 kb EcoRI-EcoRI fragmentum nukleotid-szekvenciája
Ezt a fragmentumot az 1. példában leírt pXL151 plazmid hordozza. Az EcoRI hely, valamint a fragmentumtól jobbra elhelyezkedő 70 szomszédos bázispár a pXL59-ből származik, ami egy vektor, amely a pXL151 megalkotására szolgál a Pseudomonas denitrificans SC510 egy Sau3AI fragmentumának klónozásán keresztül. A hasítás után a 8,7 kb fragmentum alfragmentumait az M13mpl8 vagy az M13mpl9 (Norrander és munkatársai, 1983) vagy az M13tgl30 vagy az M13tgl31 (Kieny és munkatársai, 1983) fágokba klónoztuk mindkét orientációban. Ezután Henikoff (1987) eljárása szerint in vitro deléciókat hoztunk létre. Ezeket a deléciókat azután szekvenáltuk, a láncterminációs reakciók szintézisének kiindulásaként „univerzális prímért” használva. E különböző deléciók közötti átfedés lehetővé tette a 8,7 kb fragmentum mindkét láncán a teljes szekvencia megállapítását (7. ábra). Ez a fragmentum 8753 bp-t tartalmaz.
2.3 Egy 4,8 kb Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentum szekvenálása
Ezt a fragmentumot az 1. példában leírt pXL154 plazmid tartalmazza. Az előírások a 2.2 példában leírtakkal megegyeznek. A 4,8 kb fragmentum mindkét szálának teljes szekvenciáját a 32. ábrán mutatjuk be. Ez a fragmentum 4749 bp-t tartalmaz.
2.4 Egy 3,9 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentum nukleotidszekvenciája
Ezt a fragmentumot az 1. példában leírt pXL519 plazmid tartalmazza. Az előírások a 2.2 példában megadottakkal megegyeznek. A 3,9 kb fragmentum két szálának teljes szekvenciáját a 33. ábrán mutatjuk be. Ez a fragmentum 3855 bp-t tartalmaz.
HU 216 653 Β
2.5 Egy 13,4 kb EcoRI-BglII-EcoRI-BglII fragmentum nukleotidszekvenciája Ezt a fragmentumot az 1. példában leírt pXL156 és pXL157 plazmidok tartalmazzák. A használt előírások megegyeznek a 2.2 példában leírtakkal. A 13,15 kb fragmentum két szálának szekvenciáját a 43. ábrán mutatjuk be. Az ábra a 13,4 kb fragmentum teljes szekvenciájának felel meg, kivéve egy EcoRI-SstI fragmentumnak megfelelő 250 bp, amely az előző fragmentum bal oldalán található.
E nukleotidszekvenciákról restrikciós térképet készítettünk a legritkábban hasító enzimekkel (6. és 44. ábra). A Pseudomonas denitrificans SC510 DNSben a GC bázisok aránya viszonylag magas (65%), és ez a szekvenáló géleken sűrűsödéshez vezet. E probléma elkerülésére két megoldás adódik:
i) a szekvenálóreakclókban a dGTP helyett a Ίdeaza-dGTP használata, hogy csökkentsük a másodlagos szerkezeteket, amelyek az elektroforézis során a szekvenálógélben alakulnak ki, és ii) a két szál szekvenálása.
3. példa
E nukleotidszekvenciák analízise: a nyílt leolvasási keretek meghatározása
Az 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum (7. ábra), a 8,7 kb EcoRI-EcoRI fragmentum (8. ábra), a 4,8 kb Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentum (32. ábra), a 3,9 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentum (33. ábra) és a
13,4 kb EcoRI-BglII-EcoRI-BglII fragmentum (43. ábra) lehetővé tette, hogy meghatározzuk a nyílt leolvasási kereteket. Mivel magas GC arányú DNS-ről van szó, számos nyílt leolvasási keret van, annak ellenére, hogy a transzlációs stop kodonok gyakorisága kicsi. A kódoló fázisok kodonhasználat szerinti valószínűségét Staden és MacLachlan (1982) eljárását használva tanulmányoztuk. Ez a módszer azokat a nyílt leolvasási kereteket határozza meg, amelyeknél, ugyanannak a DNS-szálnak más fázisaihoz viszonyítva, a legnagyobb a valószínűsége annak, hogy kódolnak. Ez a valószínűség a Pseudomonas nemzetségből származó, már szekvenált gének kodonhasználatán alapul. Ennek alapján:
3.1 Az 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-Hindin fragmentum 5 nyílt leolvasási keretét határoztuk meg. Ezeket az 1 -5. nyílt leolvasási kereteknek neveztük el, és az 5,4 kb fragmentumon való elhelyezkedésük a következő (az 5’—>3’ szekvencián a Clal helytől a Hindül hely felé):
I. táblázat
Az 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum valószínű nyílt leolvasási keretei. A szekvencián való helyzetek megfelelnek a 7. ábrán leírt szekvencián való helyzeteknek: a kódolószál az 5’—+3’ szál, amely ezen az ábrán a felső szálnak felel meg.
A nyílt leolvasási keret száma Transzlációs kezdő- kodon Stop kodon A kódolt protein molekulatömege kilodaltonban
1 549 1011 15,5
2 1141 1981 29,2
A nyílt leolvasási keret száma Transzlációs kezdő- kodon Stop kodon A kódolt protein molekulatömege kilodaltonban
3 1980 3282 45,7
4 3281 4280 35,0
5 4284 5253 34,1
A 9. ábrán annak a valószínűségét mutatjuk be, hogy ezek a nyílt leolvasási keretek kódolófázisok, párhuzamosan a többi fázison (összesen 5) megfigyelt valószínűséggel. Ezt az öt fázist ugyanaz a lánc kódolja. Közülük négy (az 1 -4. nyílt leolvasási keretek) a kódolófázisok jellemzőit mutatja a transzlációs kapcsolódásban (Normák és munkatársai, 1983), tudniillik, hogy az x+1 fázis transzlációs kezdőkodonja átfedi az x fázis transzlációs terminációs kodonját, vagy hogy ezek egymáshoz nagyon közel vannak.
3.2 A 8,7 kb EcoRI-EcoRI fragmentumon nyolc fázist jellemeztünk. Ezeket a 6-13. nyílt leolvasási kereteknek neveztük el, és a 8,7 kb fragmentumon való elhelyezkedésüket az alábbi táblázat mutatja.
II táblázat
A 8,7 kb EcoRI fragmentum valószínű nyílt leolvasási keretei. A szekvencián megadott pozíciók megfelelnek a 8. ábrán leírt szekvencia megfelelő pozícióinak; ezen az ábrán a kódolószál a felső szál, kivéve all. nyílt leolvasási keretet.
Transzlációs fázis száma Kezdő- kodon Stop kodon A kódolt protein molekulatömege kilodaltonban
6 736 1519 28,9
7 1620 2997 46,7
8 3002 3632 22,0
9 3631 4366 25,8
10 4365 5127 27,1
11 5893 5110 28,0
12 5862 7101 42,9
13 7172 7931 26,8
A 10. ábrán e nyílt leolvasási keretek valószínűségét mutatjuk be, párhuzamosan a többi fázison (összesen 6) megfigyelt valószínűséggel. All. fázis kivételével ezeket a nyílt leolvasási kereteket ugyanaz a lánc kódolja. Közülük négy (a 7-től a 10-ig) a kódoló fázisok jellemzőit mutatja a transzlációs kapcsolódásban (Normák és munkatársai, 1983), tudniillik, hogy az x+1 fázis transzlációs kezdőkodonja átfedi az x fázis transzlációs terminációs kodonját, vagy hogy ezek egymáshoz nagyon közel vannak.
3.3 A 4,8 kb Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentumon négy nyílt leolvasási keretet jellemeztünk. Ezeket a 14-17. nyílt leolvasási kereteknek neveztük el, és helyzetük a 4,8 kb fragmentum szekvenciáján a következő (az 5’—>3’ szekvencián a Sáli helytől a BglI hely felé):
HU 216 653 Β
III. táblázat
A 4,8 kb Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentum valószínű nyílt leolvasási keretei. A szekvencián való pozíció megfelel a 32. ábrán leírt pozícióknak, ahol a felső szál 5’—>3’ orientációban van megadva. A 15., 16. és
17. leolvasási kereteket a felső szál kódolja, ellentétben a 14. leolvasási kerettel.
A leolvasási keret száma Transzlációs kezdő- kodon Stop kodon A kódolt protein molekulatömege kilodaltonban
14 660 379 10286
15 925 1440 18941
16 1512 2510 36983
17 2616 4511 70335
A 34. ábrán annak a valószínűségét mutatjuk be, hogy ezek a nyílt leolvasási keretek kódolófázisok, párhuzamosan a többi fázison (összesen 4) megfigyelt valószínűséggel. A 15., 16. és 17. leolvasási kereteket ugyanaz a lánc kódolja, a 14-t a komplementer szál.
3.4 A 3,9 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentumon négy nyílt leolvasási keretet jellemeztünk. Ezeket a 18-21. nyílt leolvasási kereteknek neveztük el, és helyzetüket a
3,9 kb fragmentum szekvenciáján az alábbi táblázat mutatja.
IV. táblázat
A 3,9 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentum valószínű nyílt leolvasási keretei. A szekvencián való pozíció megfelel a 33. ábrán leírt pozícióknak, ahol a felső szál polaritása 5’—>3’ irányú. A 18. és 19. leolvasási kereteket az alsó szál kódolja, ellentétben a 20. és 21. leolvasási kerettel.
A leolvasási keret száma Transzlációs kezdőkodon Stop kodon A kódolt protein molekulatömege kilodaltonban
18 809 108 25148
19 1971 1063 30662
20 2099 3115 34682
21 3344 3757 14802
A 35. ábrán annak a valószínűségét mutatjuk be, hogy ezek a nyílt leolvasási keretek kódolófázisok, párhuzamosan a többi fázison (összesen 4) megfigyelt valószínűséggel. A 19. és 20. leolvasási keretek eltérő módon íródnak át.
3.5 A 13,4 kb EcoRI-BglII-EcoRI-BglII fragmentumon kilenc leolvasási keretet jellemeztünk. Ezeket 22-30. nyílt leolvasási kereteknek neveztük el, és helyzetük a
13,1 kb fragmentum szekvenciáján a következő (az 5’—>3’ szekvencián az EcoRI helytől a BglII hely felé):
V. táblázat
A 13,4 kb EcoRI-BglII-EcoRI-BglII fragmentum valószínű nyílt leolvasási keretei. A szekvencián való pozíciók megfelelnek a 43. ábrán leírt pozícióknak, ahol a felső szál 5’-3’ orientációban van megadva. A 22., 23., 24., 25., 26., 27. és 29. leolvasási kereteket a felső szál kódolja, ellentétben a 28. és 30. leolvasási kerettel.
Transzlációs fázis száma Kezdő- kodon Stop kodon A kódolt protein molekulatömege kilodaltonban
22 429 1884 51982
23 3364 3886 19442
24 3892 4954 38121
25 5060 8885 138055
26 9034 9676 24027
27 9678 10101 14990
28 10835 10306 21057
29 11656 12181 19183
30 13059 12368 24321
A 45. ábrán annak a valószínűségét mutatjuk be, hogy a 22., 23., 24., 25. és 26. nyílt leolvasási keretek kódolófázisok, párhuzamosan a többi fázison (összesen
5) megfigyelt valószínűséggel. Ezt az öt fázist ugyanaz a lánc kódolja.
4. példa
A cob géneket hordozó DNS-fragmentumok genetikai vizsgálata
Ez a példa a korábban meghatározott különböző nyílt leolvasási keretek és a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő, ugyanazon fragmentumokon található gének közötti kapcsolatot mutatja be. Ezeket a géneket egy genetikai vizsgálattal azonosítottuk, amint azt az alábbiakban leírjuk.
4.1 - Az 5,4 kb fragmentum genetikai vizsgálata
A pXL723 plazmid a tanulmányozott fragmentum jobb oldali részének megfelelő 2264 bp EcoRI-HindlII fragmentumot tartalmazó pRK290 plazmid (Ditta és munkatársai, 1980), ahol a fragmentum a pRK290 EcoRI helyeire van klónozva (11. ábra). Az ebben a vizsgálatban használt más plazmidok (pXL1302, pX1397, pXL545, pXL545Q, pXL556 és pXL1500) megalkotása a 11. és 12. ábrák magyarázatában van leírva.
Bruijn és Lupski (1984) technikáját alkalmazva a pXL723 plazmidban inszerciókat hoztunk létre. A Tn5 transzpozonok pXL723 plazmidba történt inszercióit szelektáltuk, majd térképeztük az 5,4 kb fragmentumon (12. ábra). A pXL723 komplementálja a Pseudomonas putida Cob G572 mutánsát és az Agrobacterium tumefaciens Cob G634 mutánsát. Ezek az inszerciók az inaktiváló inszerciók két csoportjába tartoznak: vagy azokba, amelyek nem teszik többet lehetővé a Cob G572 mutáns komplementációját, vagy azokba, amelyek megszüntetik a Cob G634 mutáns komplementációját (12. ábra). Azokat az inszerciókat, amelyek inaktiválják a G572 mutáns komplementációját, a 4. nyílt leolvasási keretre térképeztük (a 15., 27., 68., 81. és 97. inszerciókról van szó); tehát a 4. nyílt leolvasási keret egy cob génnek felel meg. Ezt cobC-nek neveztük el. Azokat az
HU 216 653 Β inszerciókat, amelyek inaktiválják a G634 mutáns komplementációját, az 5. leolvasási keretre térképeztük (ezek a 66. és 107. inszerciók, 12. ábra); tehát az 5. nyílt leolvasási keret egy cob génnek felel meg. Ezt cobD-nek neveztük el. Egy másik úton egy Tn5Spr transzpozonnal történt inszerciókat hoztunk létre. A TnSSp1 transzpozont laboratóriumban hozták létre úgy, hogy a Tn5 transzpozon BamHI helyére a ρΗΡ45Ω plazmidból (Prentki et Krisch, 1984) származó, a streptomicinrezisztencia-gént tartalmazó BamHI kazettát klónoztak (Jorgensen és munkatársai, 1979). Ezeket az inszerciókat a Pseudomonas denitrificans SBL27 Rifr törzs kromoszómáján hoztuk létre. Az SBL27 törzs a Pseudomonas denitrificans egy olyan törzse, amelyből az SC510 származik több mutagenezissel. Az SBL2710-szer kevesebb kobalamint termel PS4 tápközegen, mint az SC510. Az SBL27 Rifr törzs 10000 kiónjából, amelyek mindegyike hordozta a transzpozon egy inszercióját, több mint 30 elvesztette a kobalamin-szintetizáló kapacitását. Ezen kiónok némelyike az ínszerciót az ebben a példában vizsgált fragmentumban tartalmazta. Ezeket az inszerciókat restrikciós analízissel, Southern módszere szerint (Southern, 1975) térképeztük. E különböző mutánsoknál a transzpozon inszerciójának helyét a 12. ábra mutatja be. E beépülések közül egy, a 2639. számú, a cobC génen található; ez az inszerció komplementálható a pXL302 plazmiddal, amely egy, a cobC gént tartalmazó fragmentumot hordoz (12. ábra). Két inszerció, a 2636. és a 2638. számúak, a 3. nyílt leolvasási keretben találhatók. Ezeknél a mutánsoknál gátolt a kobalaminok bioszintézise, és komplementálhatók a pXL1397 plazmiddal, amely csak a 3. nyílt leolvasási keretet tartalmazza, de nem komplementálhatók a pXL302 plazmiddal, amely a cobC és a cobD géneket tartalmazza (12. ábra). Ez a két inszerció tehát egy másik génben van. A 3. nyílt leolvasási kerethez mi a cobB gént kapcsoltuk. A 2933. inszerció a 2. nyílt leolvasási keretben helyezkedik el; ez komplementálható a pXL1500 plazmiddal, amely a 2. nyílt leolvasási keretet tartalmazza; ez az inszerció nem komplementálható a pXL1397 plazmiddal, amely a cobB gént tartalmazza, és amely komplementálja a cobB génben található két ínszerciót. Itt tehát egy másik génben található inszercióról van szó; a 2. nyílt leolvasási kerethez a cobA-nak nevezett gént társítottuk.
Egy pUC8 plazmidba (Viera et Messing, 1982) klónozott Clal (0. pozíció a szekvencián)-RsaI (1686. pozíció a szekvencián) fragmentum NotI helyeire egy, a pUC4K plazmidból (Bárány és munkatársai, 1985) származó kanamicin rezisztencia kazettát vezettünk be; az 1. leolvasási keret 771. helyén elhelyezkedő NotI helyről van szó (lásd a szekvenciát a 7. ábrán); két ínszerciót tartottunk meg, amelyek mindegyike a rezisztenciakazetta egy-egy különböző orientációjának felelt meg. Ezeket a fragmentumokat, amelyek mindegyike a rezisztencia kazetta egy inszercióját hordozza, a pRK404 plazmidba (Ditta et al.) klónoztuk, hogy a pXL1630 és a pXL1631 plazmidokat kapjuk. Ezeket a plazmidokat konjugációval bevezettük a Pseudomonas denitrificans SC510 Rif törzsébe, majd a kultúrából egy hígítási sort hoztunk létre a plazmid számára szelektív antibiotikum (tetraciklin) hiányában, és ezzel megtaláltuk a dupla rekombinánsokat, amelyek a plazmid eredetű fragmentumot kicserélték a kromoszomálissal, és amelyek elvesztették a plazmidot. így két törzset jellemeztünk:
i) az egyiket SC510:1631 Rifr-nek neveztük el, ebben a törzsben a kanamicinrezisztencia-kazetta beépült a kromoszómába, a NotI helyekre (amelyek az 1. leolvasási keretben találhatók); a kanamicinrezisztenciagén átírásának iránya ellentétes az 1. leolvasási keret átírási irányával, ii) a másik ínszerciót SC510:1630 Rifr-nek neveztük el; a rezisztenciakazetta ugyanazokra a helyekre épült be, de a rezisztenciagén átírásának iránya megegyezik az 1. leolvasási keret átírásának irányával.
Ebben a két törzsben a kobalamin szintézis aránya legalább 100-szor kisebb mint az SC510-ben.
A pXL545Q plazmid a pXL545 plazmidnak felel meg, amelybe a BamHI helyre a ρΗΡ45Ω plazmidból származó streptomicinrezisztencia-kazettát építettünk be. Ez a plazmid (12. ábra), amely tartalmazza a 814 bp Clal-HindlII fragmentumot (ahol csak az 1. nyílt leolvasási keret teljes), csak az SC510:1630 Rifr mutánst komplementálja. Ez elég ahhoz, hogy egy új gént határozzunk meg, mivel ezt a mutánst komplementálja egy plazmid, amely csak az 1. nyílt leolvasási keretet tartalmazza egészében. Az 1. nyílt leolvasási keret a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézise útvonalának egy génjének felel meg. Ezt a gént cobE-nek neveztük el. Az, hogy a ρΧί545Ω plazmid nem komplementálja az SC510-1631 Rif mutánst, valószínűleg annak a ténynek köszönhető, hogy a cobA, cobB, cobC, cobD és cobE, vagy ezek egy része ugyanahhoz az operonhoz tartozik, és hogy a cobE génben levő inszerció, és hogy a cobE-ben lévő inszerció, amely a transzkripciót az operon transzkripciója értelmében őrzi meg, csak a cobE gén transz-helyzetű expressziójával komplementálható. Az 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentum tehát a cobA, cobB, cobC, cobD és cobE-nek nevezett öt gént tartalmazza.
4.2 - A 8,7 kb fragmentum genetikai vizsgálata
A pXL367 plazmid az EcoRI helyre klónozott 8,7 kb EcoRI fragmentumot tartalmazó pRK290 (Ditta és munkatársai, 1980) (13. ábra). A Tn5 transzpozon pXL367 plazmidba történt inszercióit a már leírt technikát alkalmazva szelektáltuk (de Bruijn és Lupski, 1984). Ugyanazon a módon a Tn31acZ transzpozon inszercióit is megkaptuk a már leírt eljárás szerint (Stacsel és munkatársai, 1985), és térképeztük. így a Tn5 transzpozon 29 inszercióját, és a Tn31acZ transzpozon 13 inszercióját térképeztük. Ezen inszerciók pontos elhelyezkedését a 8,7 kb fragmentumon a 14. ábra mutatja. A plazmidokat, amelyek mindegyike egyetlen ínszerciót hordozott a 8,7 kb fragmentumban, konjugatív transzferrel bevezettük az Agrobacterium tumefaciens G164, G609, G610, G611, G612, G613, G614, G615, G616, G620, G638 Cob mutánsokba. Ezek a mutánsok mind komplementálhatók a pXL367 plazmiddal. Visszakerestük azokat az inszerciókat, amelyek a különböző mutánsok komplementációját nem tették lehetővé. Ezek egy olyan inszerciónak felelnek meg, amely a megfelelő mutáns komplemen18
HU 216 653 Β tációért felelős génjében van. A különböző mutánsok komplementációjának eredményeit kobalamin-termelő jellegükre vonatkozóan (Cob fenotípus) a 14. ábra mutatja be. Ha a rekombináns mutáns kevesebb, mint háromszor kevesebb kobalamint termel, mint ugyanaz a mutáns a pXL367 plazmiddal, akkor úgy vettük, hogy nincs komplementáció. A vizsgált mutánsokon, G164, G609, G610, G611, G612, G613, G614, G615, G616, G620, G638, a transzpozonok inaktiváló beépüléseinek 8 különböző osztályát figyeltük meg, amelyek egy-egy mutáns fenotípushoz vezetnek. Ezek az osztályok azzal jellemzik az inszerciókat, hogy az ugyanezeket az inszerciókat tartalmazó pXL367 plazmid nem komplementál egy vagy több mutánst. Tehát minden osztály egy mutáns génnek felel meg. Megfigyeltük, hogy az ugyanahhoz az osztályhoz tartozó inszerciók egymás mellett helyezkednek el. így nyolc inszerciót figyeltünk meg, ami lehetővé teszi nyolc gén meghatározását. Az inszerciók minden osztálya meghatároz egy minimális fragmentumot, amelyet a megfelelő génnek tartalmaznia kell. A 14. ábra a restrikciós térkép szintjén az osztályok által körülhatárolt régiók, és az itt leírt nyílt leolvasási keretek közötti teljes egyeztetést mutatja be (3. példa). Valóban megállapítottuk, hogy minden inszerciós osztálynál a transzpozonok mindig a 8,7 kb fragmentum egy olyan részébe épültek be, amely részt egyetlen nyílt leolvasási keret tartalmazta. Tehát minden inszerciós osztályhoz kapcsolható egy nyílt leolvasási keret, és csak egyetlen egy. Az itt jelölt nyílt leolvasási keretek mindegyike tehát egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő proteint kódol. A nyílt leolvasási keretek mindegyike megfelel egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő génnek. Ezeket a nyílt leolvasási kereteket a következőképpen neveztük el: cobF, cobG, cobH, cobl, cobJ, cobK, cobL és cobM a 6. leolvasási kerettől a 13-ig. Ezen gének helyzetét a restrikciós térképen a 14. ábra mutatja be.
4.3 - A 4,8 kb fragmentum genetikai vizsgálata
A pXL1558 plazmid a pRK290 plazmid (Ditta és munkatársai, 1980), amely tartalmazza a pXL 154-ből származó 12 kb HindlII-HindlII fragmentumot, a pRK290 EcoRI helyére klónozva (36. ábra). A többi, ebben a példában használt plazmid (pXL233 és pXL843) megalkotása a 36. ábra magyarázatában van leírva.
A pXL1558 plazmidban megkaptuk a Tn5Sp inszercióit. Legelőször meglakottunk egy Tn5Sp transzpozont tartalmazó törzset; ezt a C2110 törzs (Stachel és munkatársai, 1985) transzformálásával végeztük, a pRK2013Tn5Sp plazmid (Blanche és munkatársai, 1989) segítségével; a pRK2013Tn5Sp plazmid, mivel ColEl replikációs origója van, nem replikálódik a C2110 törzsben, amely palA-. A transzformáció után kapott kolóniák közül a spektinomicin rezisztensek tartalmazzák kromoszómájukban a Tn5Sp transzpozont; egy kolóniát izoláltunk, majd a transzpozon inszercióját a Pl fág segítségével transzdukáltuk az MCI060 törzsbe, amint azt már korábban leírták (Miller, 1972). Az MCI060 törzset transzformáltuk a pXL1558 plazmiddal; ezután a pXL1558 plazmidot konjugációval, a pRK2013 plazmid segítségével átvittük a C600 Rifr törzsbe. Ezután szelektáltuk a tetraciklinre (a pXL1558 plazmid számára szelektív) és a spektinomicinre (a transzpozon számára szelektív) rezisztens konjugánsokat; az ilyen konjugánsoknak tartalmazniuk kell a pXL1558 plazmidot, amelybe beépült a Tn5Sp transzpozon. Ezután restrikciós emésztéssel térképeztük a pXL1558 plazmidban, pontosabban a 12 kb fragmentumban hordozott inszerciókat; így 23 inszerciót kaptunk és térképeztünk a 12 kb fragmentumon; e különböző inszerciók helyzetét a fragmentumon a 37. ábra mutatja be. Ezt a 23 inszerciót a pXL1558: :Tn5Sp plazmid konjugatív transzferé, majd a pR751 plazmid bevezetése után bevezettük az SC510 Rifr törzs kormoszómájába. A pR751 plazmid egy trimetoprimre rezisztens plazmid, amely ugyanabba az inkompatibilitási csoportba tartozik, mint a pXL1558 (incP, Thomas és Smith, 1987). A pXL1558 számára nem szelektív (tetraciklin hiánya), de a pR751 és a transzpozon számára szelektív (trimetoprim és spektinomicin jelenléte) tenyésztéssel megkaptuk a pXL1558: :Tn5Sp által hordozott mutáció kicserélődését a kromoszómával, valamint a pXL1558 szegregációját, a kettős homológ rekombináció általi markercsere módszerét alkalmazva, amint azt már leírták (Schell és munkatársai, 1988). Az így szelektált törzsek a transzpozont a kromoszómájukban hordozzák. A kettős homológ rekombinációt Southern technikájával ellenőriztük (Southern, 1975). Ezen a módon 23 SC510 Rifr: :Tn5Sp törzset azonosítottunk.
Másrészt egy másik Tn5Sp inszerciót, amelyet a Tn5Sp transzpozon véletlen mutagenezisével kaptunk az SBL27 Rifr törzsben (Blanche és munkatársai, 1989), restrikciós analízissel térképeztünk a 12 kb fragmentumon, Southern eljárása szerint (Southern, 1975), lásd a 37. ábrát; ezt a törzset SBL27 Rifr: :Tn5Sp 1480nak neveztük el.
Meghatároztuk e 24 törzs kobalamin termelésének szintjét, PS4 tápközegben tenyésztve, a már leírt módszer szerint (Cameron és társai, 1989), és Cob-fenotípust annak a törzsnek tulajdonítottunk, amely legalább 1000-szer (illetve 100-szor) kevesebb B12 vitamint termelt, mint az SC510 Rifr (illetve SBL27 Rifr) szülőtörzs, 37. ábra. így megfigyeltük, hogy e kromoszomális inszerciók közül 6 Cob-fenotípushoz vezet a Pseudomonas denitrificansnál; a 31.1., 41.3, 45., 55.,
22.1. és az 1480. inszerciókról van szó.
Három plazmidot, a pXL233-at, a pXL837-et (Cameron et al.) és a pXL843-at konjugatív transzferrel bevezettünk három Cob-fenotípust mutató törzsbe, az SC510 Rifr: :Tn5Sp 31.1-be, az SC510 Rifr: :Tn5Sp 45-be és az SBL27 RiP::Tn5Sp 1480-ba. E három törzsnek a kobalaminok bioszintézisére nézve különböző komplementációs profilja volt. Valóban, az SBL27 Rifr:: Tn5Sp 1480 komplementálható a pXL837-tel és a pXL843-mal, de nem a pXL233-mal; az SC510 Rifr: :Tn5Sp 45 mutáns csak a pXL843-mal komplementálható; az SC510 Rifr: :Tn5Sp 31.1 mutáns komplementálható a pXL843-mal, valamint a pXL233mal (lásd a 37. ábrát). A bemutatott adatok tehát lehetővé tették a három mutáns komplementációs vizsgálatainak eredményei után, hogy megállapítsuk, hogy a há19
HU 216 653 Β rom mutáns különböző, és hogy a Tn5Sp transzpozon mindhármuknál egy-egy különböző cob génbe épült be. Másrészt a pXL::Tn5Sp 41.3, a pXL1558: :Tn5Sp 45 és apXL1558: :Tn5Sp 22.1 plazmidokat konjugatív transzferrel bevezettük a G2035 törzsbe (Cameron és munkatársai, 1989), és azt nem komplementálták, a pXL1558 plazmid, a pXL1558: :Tn5Sp 31.1 plazmiddal ellentétben komplementálja ezt a mutánst.
A fenotípus és a komplementációs adatok lehetővé tették, hogy 3 inszerciós osztályt határozzunk meg; ez inszerciós osztályokat a következő inszerciók reprezentálják: 31.1, 1. osztály; 45, 43.3, 55 és 22.1, 2. osztály; 1480, 3. osztály.
Minden inszerciós osztálynál a transzpozonok mindig a 4,8 kb fragmentum egy olyan részébe épülnek be, amelyet egyetlen nyílt leolvasási keret tartalmaz (ORF14, ORF16 és ORF17, amint azt a 3. példában meghatároztuk). Minden inszerciós osztályhoz egy nyílt leolvasási keretet rendeltünk. Az itt jelölt nyílt leolvasási keretek tehát egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő proteint kódolnak. Ezeket a nyílt leolvasási kereteket cobX-nek, cobS-nek és cobTnek neveztük el a 14., 16. és 17. leolvasási keretek esetében. E gének helyzetét a restrikciós térképen a 37. ábra mutatja be. A 15. nyílt leolvasási keret nem a koenzim Bl2 bioszintézisében részt vevő gén.
4.4 - A 3,9 kb fragmentum genetikai vizsgálata
A pXL1557 plazmid a pRK290 plazmid (Ditta és munkatársai, 1980), amely tartalmazza a pXL5199kb HindlII-BamHI fragmentumát a pRK290 EcoRI helyére klónozva (38. ábra). Az ebben a vizsgálatban használt más plazmidok (pXL1286, pXL1303, pXL1324) megalkotását a 38. ábra magyarázatában írtuk le. Másfelől, a pXL519 plazmid 2 kb BglII-XhoI fragmentumát (a 33. ábrán bemutatott szekvencián helyzete 251-2234.) a pXL435 plazmid (Cameron és munkatársai, 1989) BamHISall helyeire klónoztuk, hogy a pXL699 plazmidot kapjuk. A pXL1557 plazmidban Tn5Sp inszerciókat kaptunk a 4.3 példában leírt technika szerint. Szelektáltuk a Tn5Sp transzpozon inszercióit tartalmazó pXL1557 plazmidokat, amelyeket így pXL1557: :Tn5Sp-nek neveztünk el. Azokat, amelyeket a 9 kb fragmentumon térképeztünk (39. ábra), a pXL1557: :Tn5Sp konjugatív transzferé, és a markerek kettős homológ rekombináció általi kicserélődése után bevezettük az SC510 Rifr törzs kromoszómájába, amint ezt a 4.3 példában leírtuk.
A kettős homológ rekombinációt Southern módszerével ellenőriztük (Southern, 1975). Ezen a módon 20 SC510 Rifr: :Tn5Sp törzset azonosítottunk.
Másrészt két másik Tn5Sp ínszerciót, amelyeket a Tn5Sp transzpozon véletlen mutagenezisével kaptunk az SBL27 Rifr törzsben (Blanche és munkatársai, 1989), restrikciós analízissel térképeztünk a 9 kb fragmentumon, Southern eljárása szerint (Southern, 1975), lásd a 39. ábrán az 1003. és 1147. inszerciókat.
E 22 törzsnél meghatároztuk a kobalaminok szintézisének szintjét PS4 tápközegben tenyésztve a már leírt eljárás szerint (Cameron és munkatársai, 1989), és Cob fenotípust rendeltünk ahhoz a törzshöz, amely 1000-szer (illetve 100-szor) kevesebb B12 vitamint termelt, mint az
SC510 Rifr (illetve az SBL27 RiP) szülőtörzs, 39. ábra. A Pseudomonas denitrificansnál csak az 1., 1003., 23. és 1147. inszerció fordítódik le Cob-fenotípussá.
Négy plazmidot, a pXL699-et, a pXL1286-ot, a pXL1303-at és a pXL1324-et konjugatív transzferrel bevezettük a négy Cob- fenotípust mutató törzsbe, az SC510 RiP: :Tn5Sp 1-be, az SBL27 RiP: :Tn5Sp 1003ba,azSC510RiP: :Tn5Sp23-baésazSBL27RiP: :Tn5Sp 1147-be. A pXL669 plazmid komplementálja az első két mutánst (SC510 RiP: :Tn5Sp 1, SBL27 RiP::Tn5Sp 1003), de a pXL1303 plazmid ezeket nem komplementálja; a pXL1324 plazmid komplementálja a két másik mutánst (SC510 Rifr: :Tn5Sp 23 és SBL27 RiP: :Tn5Sp 1147), de a pXL1286 ezeket nem komplementálja.
Másrészt a pXL1557: :Tn5Sp 1 plazmidot konjugatív transzferrel bevezettük a G2040 törzsbe, és nem komplementálta azt, pedig a pXL1557, pXL1557: :Tn5Sp 6A, pXL1557: :Tn5Sp 54, pXL1557: :Tn5Sp 48, pXL1557: :Tn5Sp 21, pXL1557: :Tn5Sp 8, pXL1557: :Tn5Sp 23 plazmidok, melyeket szintén konjugatív transzferrel vezettünk be, komplementálták azt (lásd a 39. ábrát).
A fenotípus és a komplementációs adatok lehetővé teszik, hogy 2 inszerciós osztályt határozzunk meg. Minden inszerciós osztálynál a transzpozonok mindig a
3,9 kb fragmentum egy olyan részébe épültek be, amelyet egyetlen nyílt beolvasási keret tartalmaz (ORF 19 és ORF 20, amint a 3. példában definiáltuk).
Minden inszerciós osztályhoz egy nyílt leolvasási keretet rendeltünk. Az itt jelölt nyílt leolvasási keretek egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő proteint kódolnak. Ezeket a nyílt leolvasási kereteket CobV-nek és CobU-nak neveztük el a
19. és 20. leolvasási keret esetén. A 18. és 21. leolvasási keretek nem a koenzim B]2 bioszintézisében részt vevő gének. E gének helyzetét a restrikciós térképen a 39. ábrán mutatjuk be. A 48., 21. és 8. inszerciókat a cobU és cobV gének közé térképeztük.
4.5 - A 13,4 kb fragmentum genetikai vizsgálata
4.5.1 Vizsgálatok a 4327 bp EcoRI-BglII fragmentumon
A pXL189 plazmid (Cameron és munkatársai, 1989), amely legalább egy cob gént tartalmaz, hordoz egy 3,1 kb inszertumot, amely 300 bp kivételével megfelel egy 4,26 kb EcoRI-Clal fragmentumnak (lásd a 45. ábrát). A pXL189 plazmidot mutagenezisnek vetettük alá a Tn5 transzpozonban, amint azt korábban leírták (De Bruijn és Lupski, 1984). így 13 inszertumot térképeztünk a pXL189 inszertumában, amint azt a 46. ábrán bemutatjuk. Ezt a 13 mutáns plazmidot, valamint a pXL189-et konjugáltuk az A. tumefaciens két mutánsával, a G632-vel és a G633-mal, amelyek a pXL189 által komplementálható mutánsok (Cameron és munkatársai, 1989). Csak az 58. inszerció bizonyult inaktiváló inszerciónak. Ez az eredmény megmutatja, hogy a G632 és a G633 mutánsok ugyanabban a génben lévő mutációnak felelnek meg, és hogy másrészről a Pseudomonas denitrificans egyetlen génje, amely felelős lehet ezek komplementációjáért, a 26. nyílt leolvasási keretnek felel meg (lásd a 46. ábrát), mivel az 58. ínszerciót ebbe a
HU 216 653 Β nyílt leolvasási keretbe térképeztük; ráadásul az egyetlen olyan inszercióról van szó a 13 közül, amelyet ebbe a nyílt leolvasási keretbe térképeztünk. Tehát a 26. nyílt leolvasási kerethez egy cob gént rendeltünk, amelyet cobO-nak neveztünk el.
Hogy megtudjuk, hogy a másik négy, ezen a fragmentumon azonosított nyílt leolvasási keret (27-30. nyílt leolvasási keretek) megfelel-e cob géneknek, egy, a ρΗΡ45Ω plazmidból (Prentki és Krisch, 1984) származó spektinomicinrezisztencia-kazettát specifikusan beépítettünk ezekbe a génekbe, majd homológ rekombinációval bevezettük a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr kromoszómájába olyan módon, hogy e nyílt leolvasási keretek mindegyikében az inszerciók mutációját kapjuk. Ehhez az EcoRI-Clal fragmentumot (a 43. ábrán bemutatott szekvencián a 8818 és a 13082 helyzetek) használtuk. Ezt a fragmentumot, amely a 27-30. nyílt leolvasási kereteket hordozza, apXLl 57 plazmidból (Cameron és munkatársai, 1989) tisztítottuk; azután, hogy a Clal véget az E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával betöltöttük, és egy EcoRI linkért kapcsoltunk hozzá. Ezt a fragmentumot azután a pUC13 plazmid (Viera és munkatársai, 1982) EcoRI helyére klónoztuk. Az így megalkotott plazmidot pXL332-nek neveztük el. Ezeket az inszerciókat külön-külön a Smal (9868 helyzet, 27. nyílt leolvasási keret), BamHI (10664 helyzet, 28. nyílt leolvasási keret), a Clal (11687 helyzet, 29. nyílt leolvasási keret) és a Ncol (12474 helyzet, 30. nyílt leolvasási keret) helyeken hoztuk létre a pXL332 megfelelő enzimekkel végzett teljes vagy részleges hasításával, majd ha ez szükséges volt, a véget E. coli DNS-polimeráz Klenow-fragmentumával történt betöltésével, majd a ρΗΡ45Ω (Prentki et Krisch, 1984) 2 kb Smal fragmentumával való ligálással, amely egy spektinomicinrezisztencia-kazettát tartalmaz; ezeket az inszerciókat Ω2-ηε^ Ω 1-nek, Ω3μ^ és Ω4nek neveztük el, amint a 46. ábrán bemutatjuk. Ezután az ezeket a különböző inszerciókat hordozó EcoRI fragmentumokat a pRK404 (Ditta és munkatársai, 1985) egyik EcoRI helyére klónoztuk a kettő közül. Az ezeket a különböző inszerciókat hordozó plazmidokat azután konjugációval bevezettük az SC510 Rifr törzsbe, amint azt korábban már leírták. A pR751 plazmidot (Thomas et Smith, 1987) azután bevezettük a transzkonjugánsokba. A 4 különböző pRK404 származék által hordozott mutáció kicserélődését az SC510 Rifr kromoszómája és a plazmidok között a korábban leírt módon tudtuk szelektálni (lásd a 4.3. példát). így négy törzset kaptunk. Ezek a törzsek a rezisztenciakazetta egy-egy inszercióját hordozták a 27-30. nyílt leolvasási keretek egyikében. Ezeket az inszerciókat a genomiális DNS Southern biot analízisével ellenőriztük (Southern, 1975). Megvizsgáltuk e különböző törzsek kobalamin termelését. PS4 tápközegben tenyésztve mindegyik törzs cob-ι- fenotípust mutatott. Ez az eredmény azt jelzi, hogy ezek a nyílt leolvasási keretek nem vesznek részt a koenzim Bl2 bioszintézisében. Mégis lehetséges, hogy e leolvasási keretek közül egy vagy több olyan proteineket kódol, amelyek például a koenzim B,2 metil-kobalaminná alakításában vesznek részt, azaz egy másik kobalamin, egy másik korrinold szintézisében.
4.5.2 A 9,1 kb EcoRI-EcoRI fragmentum vizsgálata
Ebben a vizsgálatban különböző plazmidokat használtunk; a pXL1560 plazmid a pRK290 plazmid (Ditta és munkatársai, 1980), amely tartalmazza a pXL 156-ból származó (1. példa) 9,1 kb EcoRI-EcoRI fragmentumot a pRK290 EcoRI helyére klónozva (lásd a 46. ábrát). A többi ebben a vizsgálatban használt plazmid (pXL618, pXL593, pXL623, pXL1909, pXL1938, pXL1908, pXL221, pXL208, pXL297) megalkotását a 45. ábra magyarázatában írtuk le. A pXL1560 plazmidban Tn5Sp inszerciókat kaptunk. A pXL1560 plazmiddal transzformált MCI060 Tn5Sp törzs szolgált arra, hogy megkapjuk a Tn5Sp transzpozon inszercióit a pXL1560 fragmentumban; így 27 inszerciót kaptunk, és ezeket térképeztük a 9,1 kb fragmentumon; e különböző inszerciók elhelyezkedését a fragmentumon a 4. ábra mutatja. Ezt a 27 inszerciót a pXL1560: :Tn5Sp konjugatív transzferé, majd a pR751 plazmid bevezetése után bevezettük az SC510 Rifr törzs kormoszómájába. A pR751 plazmid egy trimetoprimre rezisztens plazmid, amely ugyanabba az inkompatibilitási csoportba tartozik, mint a pXL1560 (incP, Thomas és Smith, 1987). A pXL1560 számára nem szelektív (tetraciklin hiánya), de a pR751 és a transzpozon számára szelektív (trimetoprim és spektinomicin jelenléte) tenyésztéssel megkaptuk a pXL1560: :Tn5Sp által hordozott mutáció kicserélődését a kromoszómával, valamint a pXL1560 szegregációját; ez a kettős homológ rekombinációval történő markerkicserélődési technika ekvivalens azzal, amit Schell és munkatársai írtak le korábban (1988). Az így szelektált törzsek a transzpozont kromoszómájukban hordozzák.
A kettős homológ rekombinációt Southern eljárásával ellenőriztük (Southern, 1975). Ezen a módon 27 SC510 Rifr: :Tn5Sp törzset azonosítottunk, amelyek mindegyike a Tn5Sp transzpozon egy-egy különböző inszerciójával rendelkezett a 9,1 kb fragmentumban.
E 27 törzsnél meghatároztuk a kobalaminok szintézisének szintjét PS4 tápközegben tenyésztve, és Cobfenotípust rendeltünk azokhoz a törzsekhez, amelyek legalább 1000-szer kevesebb B12 vitamint termeltek, mint az SC510 Rifr szülőtörzs, 46. ábra. így megfigyeltük, hogy 27 kromoszomális inszerció közül 18 vezetett Cob- fenotípushoz a Pseudomonas denitrificansnál, amint a 46. ábra mutatja.
A 19., 32., 24., 27., 37., 39., 26., 11. és 14. inszerciókat a 22. nyílt leolvasási keretbe térképeztük (lásd a 46. ábrát). Ezen inszerciók mindegyike komplementálható a pXL618 plazmiddal, amely csak a 22. nyílt leolvasási keretet tartalmazza. Ebből arra következtettünk, hogy a 22. nyílt leolvasási keret egy cob génnek felel meg, amelyet cobQ-nak neveztünk el. A 23. nyílt leolvasási keretben egyetlen inszerciót sem kaptunk; mégis a pXL623 plazmid, amely csak ezt a nyílt leolvasási keretet tartalmazza, komplementálja az Agrobacterium tumefaciens két Cob mutánsát, a G642-t és a G2043-at (Cameron és munkatársai, 1989). Tehát a 23. nyílt leolvasási keret egy cob génnek felel meg, amelyet cobP-nek neveztünk el. A 23., 13., 12., 30., 22., 40., 35., 10. és 17. inszerciók, amelyeket a 24. és 25. nyílt leolvasási keretbe térképeztünk, Cob- fenotípust okoz21
HU 216 653 Β nak az SC510 Rifr-nél. Úgy tűnik tehát, hogy két olyan nyílt leolvasási keretről van szó, amelyeknek a terméke részt vesz a kobalaminok bioszintézisében. Mégsem zárhatjuk ki, hogy ezeknek az inszercióknak poláris hatásuk van a 3’ irányban elhelyezkedő génekre, mint a cobQ. Jó lenne tehát e mutánsok komplementációját megvizsgálni, hogy meglássuk, hogy Cob- fenotípusuk nem egy poláris hatás eredménye-e.
Megvizsgáltuk a pXL156-tal komplementálható Agrobacterium tumefaciens G622, G623 és G630 Cob mutánsokat. Ezeket a mutánsokat a pXL189 plazmid (Cameron és munkatársai, 1989), amely egyetlen cob génként a cobO-t tartalmazza, nem komplementálja. Ezzel ellentétben ezek a mutánsok komplementálhatók a pXL1908 plazmiddal, amely a 27-30. nyílt leolvasási kereteken kívül a cobO-t, és a 25. nyílt leolvasási keretet tartalmazza (lásd a 45. ábrát). Ezek az utóbbiak nem lehetnek felelősek ezen mutánsok komplementációjáért, mivel azok a proteinek, amelyeket kódolnak, nem vesznek részt a koenzim B,2 bioszintézisének útvonalában. Tehát a megfigyelt komplementációk csak a 25. nyílt leolvasási keret eredményei lehetnek. Ráadásul az ebbe a nyílt leolvasási keretbe térképezett SC510 Rifr Tn5Sp mutánsok (a 22., 40., 35., 10. és 17. mutánsokról van szó) komplementálhatók a pXL1908 plazmiddal (amely hordozza a cobO-t és a 25. leolvasási keretet), lásd a 46. ábrát, miközben legalább kettő közülük nem komplementálható a pXL189-cel, amely cob génként csak a cobO-t tartalmazza. Ezek az eredmények tisztán megmutatják, hogy a 25. nyílt leolvasási keret egy cob gén; ezt a cob gént cobN-nek neveztük el. Az SC510 Rif Tn5Sp 23., 13. és 12. mutánsokat, amelyek Cob- fenotípusúak, a 24. nyílt leolvasási keretbe térképeztük. Ezeket a mutánsokat nem komplementálja a pXL623 plazmid, amely csak a cobP gént tartalmazza. Ezzel ellentétben ezeket a mutánsokat komplementálja a pXL593 plazmid, amely a cobP gént és a 24. nyílt leolvasási keretet tartalmazza, és ez azt jelzi, hogy a 24. nyílt leolvasási keret felelős a mutánsok komplementációjáért. A 24. nyílt leolvasási keret tehát egy cob gén, amelyet cobW-nek neveztünk el.
5. példa
Gének és proteinek
5.1 - Az 5,4 kb fragmentum
Az 5,4 kb Clal-HindlII-HindlII-HindlII fragmentumon tehát öt gént (cobA, cobB, cobC, cobD és cobE) határoztunk meg. Ezek a gének a következő proteineket kódolják: COBA, COBB, COBC, COBD, COBE. A gének (cobA-cobE) kódolórégióit, valamint a COBA-COBE proteinek szekvenciáit a 15. ábrán írtuk le. E proteinek jellemzőit (aminosav-összetétel, izoelektromos pont, polaritási index és hidrofilitási profil) szintén bemutatjuk.
5.2 - A 8,7 kb fragmentum
A 8,7 kb fragmentumon tehát nyolc gént határoztunk meg. Ezek a gének cobF-től cobM-ig a következő COB proteineket kódolják: COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM. A gének (cobF-cobM) kódoló régióit, valamint a COBF-COBM proteinek szekvenciáit aló. ábrán írtuk le. Ezen proteinek jellemzőit (aminosav-összetétel, izoelektromos pont, polaritási index és hidrofilitási profil) szintén bemutatjuk.
5.3 - A 4,8 kb fragmentum
A 4,8 kb Sall-Sall-Sall-Sall-Sall-BglI fragmentumon tehát három gént (cobX, cobS, cobT) határoztunk meg. Ezek a gének a következő proteineket kódolják: COBX, COBS és COBT. Ezen gének kódolórégióit, valamint a COBA-COBE proteinek szekvenciáit a 40. ábrán írtuk le. A cobS gén iniciációs kodonjaként önkényesen inkább az 1512 pozíciójú ATG-t választottuk, mint az 1485 helyzetűt (lásd 32. ábra). E proteinek jellemzőit (aminosav-összetétel, izoelektromos pont, polaritási index és hidrofilitási profil) szintén bemutatjuk. A COBT protein egy hidrofil zsebbel rendelkezik, amely a 214-305 aminosavaknak felel meg.
5.4 - A 3,9 kb fragmentum
A 3,9 kb Sstl-SstI-BamHI fragmentumon két gént (cobU és cobV) határoztunk meg. Ezek a következő proteineket kódolják: COBU és COBV. Ezen gének kódolórégióit, valamint a COBU-COBV proteinek szekvenciáit a 41. ábrán írtuk le. Ezen proteinek jellemzőit (aminosav-összetétel, izoelektromos pont, polaritási index és hidrofilitási profil) szintén bemutatjuk.
5.5 - A 13,4 kb fragmentum
A 13,4 kb fragmentumon öt gént (cobQ, cobP, cobW, cobN és cobO) határoztunk meg. Ezek a gének a következő proteineket kódolják: COBQ, COBP, COBW, COBN, COBO. E gének (cobQ, cobP, cobW, cobN és cobO) kódoló régióit, valamint a COBQ, COBP, COBW, COBN, COBO proteinek szekvenciáit a 46. ábrán írtuk le. E proteinek jellemzőit (aminosavösszetétel, izoelektromos pont, polaritási index és hidrofilitási profil) szintén bemutatjuk.
A hidrofilitási profil alapján, amelyet Hopp és Woods programja alapján hoztunk létre, a COBV kivételével minden COB fehérje valószínűleg oldható fehérje, ellentétben a membránfehéq ékkel, mivel a nagy hidrofób doménok hiányát állapítottuk meg. A COBV vagy egy membránprotein, mivel 4 hosszú hidrofób dómén jelenlétét állapítottuk meg (lásd a 41. ábrát), vagy egy citoplazmatikus protein, amelynek funkcionális hidrofób doménjei vannak.
Minden COB protein aminosav szekvenciájában az első aminosav az NH2-terminálison egy metionin. Tudjuk, hogy ez in vivő lehasadhat (Ben Bassat et Bauer, 1984). Tudjuk, hogy javasoltak egy megoldást az NH2terminális metionin metionin aminopeptidáz általi in vivő lehasítása vonatkozásában (Hírei és munkatársai, 1989). Másfelől ezeket a proteinszekvenciákat összehasonlítottuk a Genpro proteinjeivel, ami a Genbank egy proteinextraktuma (59. változat), ahol a feltételezett kódolórégíókat felül 200 aminosavval megnöveltük Kanehisa programja szerint (1984). Nem tudtunk semmilyen szignifikáns homológiát találni a használt paraméterekkel a Genbank 59. változatával, kivéve a COBT proteint. Valójában a COBT proteinnek van egy „savas aminosavakból álló magja” a 224. és a 293. pozíció (aminosavakban) között (lásd a 40. ábrát); a proteinnek ebben a részében kettőből több mint egy aminosav egy
HU 216 653 Β glutaminsav vagy aszparaginsav maradék; ez a savas aminosavakból álló mag teszi, hogy Kanehisa programját (1984) követve a protein ebben a régióban homológ más olyan proteinekkel, amelyek szintén rendelkeznek egy ilyen savas maggal. A legnagyobb mértékben homológ proteinek voltak: a Plasmodium falciparum GARP proteinje (Triglia és munkatársai, 1988), a patkányszív torponin T-je (Jin et Lin, 1989), a humán és a patkányprotimozin (Eschenfeld et Berger, 1986), egy androgénfüggő, a sperminhez kapcsolódó patkány protein (Chang és munkatársai, 1987), a humán, a patkány és a csirke „mid-size neurofilament subunit” (közepes neurofilament alegység; Myers és munkatársai, 1987; Levy és társai, 1987; Zopf és munkatársai, 1987). E savas maradékokban gazdag magok funkciója nem ismert; mégis e savas magok lehetővé tehetik fém kationok, mint a Co+ + megkötését, és ez arra utal, hogy a COBT proteinnek kobalttal kapcsolódó metallotionein szerepe van, vagy lehetővé teszi más proteinekkel a kölcsönhatást.
6. példa
Enzimatikus vizsgálatok
6.1 - A COB proteinek és génjeik azonosítása az enzimaktivitásból kiindulva
Ez a példa leírja, hogy egy tisztított fehérjéből kiindulva, az NH2-terminális szekvencia meghatározása után hogyan lehetséges megtalálni a megfelelő struktúrgént a szekvenált cob gének között.
6.1.1 A cobA gén által kódolt COBA protein azonosítása
A Pseudomonas denitrificans SUMT-ának tisztítását már leírták (F. Blanche és munkatársai, 1989). Az így tisztított protein NH2-terminális szekvenciáját a már leírt technikával határozhattuk meg. Az első tíz aminosavat azonosítottuk:
1234 56789 10
Met Ile Asp Asp Leu Phe Alá Gly Leu Pro
A COBA protein NH2-terminális szekvenciája (15. ábra) pontosan megfelel ennek a szekvenciának. A tisztított SUMT 12,5%-os SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 30000. A COBA protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 29234 (15. ábra). Az NH2-terminális szekvenciák és a molekulatömegek közötti megfelelés tisztán jelzi, hogy a COBA protein a SUMT-nak felel meg. A cobA gén a SUMT struktúrgénje.
6.1.2 A CobB gén által kódolt COBB protein azonosítása
a) A kobirinsav-a,c-diamid szintetáz aktivitás meghatározása
Ez a példa a korrinoidok bioszintézis útvonalának egy olyan aktivitásának meghatározását mutatja be, amelyet még nem írtak le. A kobirinsav-a,c-diamid szintetázról (ACDAS) van szó, ami a korringyűrű vagy deszkobaltkorrin két karboxilcsoportjának amidálását katalizálja az a és a c helyzetekben (17. ábra). Az NH2-csoport donor az L-glutamin, és a reakció 1 ATP molekulát fogyaszt mindegyik karboxilcsoport amidálására. A meghatározás, amit itt leírunk, alkalmazható a kobirinsav kettős amidálására is; néhány módosítással (HPLC detekció
330 nm-nél) alkalmazható a hidrogenobirinsav kettős amidálására is.
Az inkubációs keveréket (250 μΐ 0,1 M tris-HCl, pH 7,6), amely ATP-t (1 mM), MgCl2-t (2,5 mM), glutamint (1 mM), kobirinsavat (25 μΜ) vagy hidrogenobirinsavat (5 μΜ), kobirinsav-a,c-diamid szintetázt (körülbelül 1 aktivitási egység) tartalmaz, 1 órán át 30 °Con inkubáltuk. Az inkubáció végén az elegyhez hozzáadtunk a KCN vizes oldatából (2,6 g/1) 125 μΐ-t, és 125 μΐ 0,2 M HCl-t, azután 80 °C-ra melegítettük 10 percen át, majd 5 percig centrifugáltuk 5000 g-nél. 50 μΐ felülúszót HPLC-n analizáltunk. Egy 25 cm-es Nucleosil 5-Ci8 oszlopra injektáltuk, és 30 perc alatt a B puffer A-ban előállított 0-100% gradiensével eluáljuk; A puffer: 0,1 M kálium-foszfát pH 6,5, 10 mM KCN; B puffer: 0,1 M kálium-foszfát pH 8, 10 mM KCN/acetonitril (1/1). A korrinoidokat 371 nm UV abszorpciójuk alapján detektáltuk. Az enzimaktivitási egységet úgy definiáltuk, mint 1 nmol amidcsoport 1 óra alatti szintéziséhez szükséges enzimmennyiség a leírt körülmények között.
b) A Pseudomonas denitrificans kobirinsav-a,c-diamid szintetáz aktivitásának tisztítása
Ez a példa bemutatja, hogyan lehet tisztítani a Pseudomonas denitrificans egy, a kobalaminok bioszintézisében részt vevő proteinjét.
A 6. 1.2 a) példában leírt meghatározásból kiindulva megvalósítottuk a Pseudomonas denitrificans kobirinsav-a,c-diamid szintetázának tisztítását, amint itt leírjuk.
Egy tipikus tisztítási eljárásban az SC510 Rifr törzs, amelybe bevezettük a pXL1500 plazmidot (a pXL1500 plazmid leírását lásd a 4.1. példában, valamint a 12. ábrán) nedves sejtjeinek 7 g-ját 30 ml 0,1 M pH 7,7 TrisHCl-ben szuszpendáltuk, majd 4 °C-on 15 percig ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután lórán át 50 000 g-vel való centrifúgálással gyűjtöttük össze, majd az extraktum 10 ml-ét egy ugyanazzal a pufferrel kiegyenlített Mono Q HR 10/10 oszlopra injektáltuk. A proteineket KC1 lineáris gradiensével (0-0,5 M) eluáltuk. Az enzimaktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és 2,5 ml-re koncentráltuk be. 1 ml 25 mM pH 7,7 Tris-HCl-lel történő oldás után a proteineket egy Mono Q HR 5/5 oszlopon, az előzőekben is használt KC1 gradienst (0-0,5 M) alkalmazva frakcionáltuk. Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, a mintához hozzáadtunk 1 ml 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl-t, amely 1,7 M ammónium-szulfátot tartalmazott, majd Phenil-Superose oszlopon (Pharmacia) kromatografáltuk ammónium-szulfát csökkenő gradiensével (1,0 M-0 M). A keresett aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és egy Bio-Gel HPHT (Bio-Rad) oszlopon kromatografáltuk káliumfoszfát gradiensével (0-0,35 M).
Ezután a lépés után az enzim 95%-osnál tisztább. SDS-PAGE-n nem mutatott semmilyen protein szennyeződést. A protein tisztaságát NH2-terminális szekvenciájának egységessége is megerősítette. Ezzel a technikával a protein molekulatömege 45 000. Az ACDAS tisztításának különböző lépéseit a tisztítási faktorokkal és a hatásfokkal a következő táblázat tartalmazza.
HU 216 653 Β
VI. táblázat Az ACDAS tisztítása
Tisztítási lépés Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (egység/mg protein) Hatásfok Tisztítási faktor (1)
Nyers kivonat 10 200 8,5 - -
Mono Q 10/10 12 15,5 108 96 12,7
Mono Q 5/5 3 3,75 272 60 32
Phenil-Superose 1 0,865 850 43 100
Bio-Gel HPHT 2 0,451 1320 35 155
(1) ezt a faktort a frakciók specifikus aktivitásának a tisztítás során való növekdese alapján számoltuk
c) A Pseudomonas denitrificans kobirinsav-a,c-diamid szintetázának NH2-terminális szekvenciája, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitást kódoló struktúrgénjének azonosítása
Ez a példa bemutatja, hogyan teszi lehetővé egy, a kobalaminok bioszintézisében részt vevő protein NH215 terminális szekvenciája az ezt a proteint kódoló struktúrgén azonosítását.
A Pseudomonas denitrificans a 6.1.2 b) példában leírt módon tisztított kobirinsav-a,c-diamid szintetázának NH2-terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. 15 maradékot azonosítottunk:
2 3 4 5 6 7
Ser Gly Leu Leu Ile Alá Alá
10 11 12 13 14 15
Pro Alá Ser Gly Ser Gly Lys Thr
A COBB protein NH2-terminális szekvenciája (15. ábra) pontosan megfelel ennek a szekvenciának, azzal a kivétellel, hogy a 15. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenciálással meghatározott proteinszekvenciát. Ez abból következik, hogy az aminoterminális metionin biztosan lehasad in vivő a metionin aminopeptidáz által (Ben Bassat és Bauer, 1987). A tisztított ACDAS 12,5%-os SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 45000. A COBB protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 45 676 (15. ábra). Az NH2-terminális szekvenciák és a molekulatömegek közötti egyezés tisztán jelzi, hogy a COBB protein megfelel az ACDAS-nak. A cobB gén az ACDAS struktúrgénje.
6.1.3 A CobI gén által kódolt COBI protein azonosítása
a) Az S-adenozil-L-metionin:prekorrin-2 metiltranszferáz aktivitás meghatározása
Ez a példa a korrinoidok bioszintézisének egy olyan enzimaktivitásának meghatározását mutatja be, amelyet még nem írtak le. Az S-adenozil-metionin :prekorrin2 metiltranszferázról (SP2MT) van szó, amely egy metilcsoport transzferét katalizálja az S-adenozil-metioninról (SAM) a prekorrin-2-re, és így a prekorrin-3 jön létre (18. ábra). AII. faktort és a III. faktort, a prekorrin-2 és a prekorrin-3 oxidációs termékeit már tisztították a Propionibacterium shermanii sejtkivonatából (Battersby és MacDonald, 1982; Scott és munkatársai, 1984); a prekorrin-2-t és a prekorrin-3-at úgy ismerik, mint a koenzim B|2 bioszintézisének feltételezett köztes termékei, de sohasem tisztították azokat. Ezért a megfelelő enzimaktivitásokat sem határozták meg, és nem is tisztították előzőleg. Az enzimreakció szubsztrátja, a prekorrin2 egy nagyon labilis molekula, amit lehetetlen megőrizni, mivel spontán oxidálódik, ha oxigén van jelen akár nyomokban is (Battersby et MacDonald, 1982). Tehát ennek az enzimatikus tesztnek az alapja azon a lehetőségen nyugszik, hogy az SC510 Rifi törzs, amelybe bevezettük a pXL1500 plazmidot, enzimatikus kivonata segítségével azonnal felhasználható módon előállítsuk a prekorrin-2-t a SAM-ból és a δ-aminolevulinsavból kiindulva. Az inkubációt szigorúan anaerob körülmények között kell végezni.
Az SP2MT-t tartalmazó frakciókat 3 órán át 30 °Con 1 ml 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl-ben inkubáltuk, 5 mM DTT, 5 Mm EDTA, 100 μΜ [metil 3H]-SAM (1 pCi), 0,8 mM δ-aminolevulinsav és 6 mg Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr törzs nyers enzimkivonata jelenlétében. Az SC510 Rifr pXL1500 törzs erős SUMT aktivitást tartalmaz (F. Blanche és munkatársai, 1989). Az inkubáció alatt termelődő tetrapirrolvegyületeket egy DEAE-Sephadex anioncserélő oszlopon fixáltuk, és oxigén hiányában metanolban 5 %-os kénsavval észteresítettük. Az urogén III dimetil- és trimetilszármazékait azután kromatográfiával elválasztottuk vékony szilíciumrétegen, eluáló rendszerként diklór-metán/metanolt (98,3/1,7) használva (F. Blanche és munkatársai, 1989). Az SP2MT aktivitását az összes (di- és tri-) termelődött metilszármazékból a kapott trimetilszármazékok fehérjemennyiségre vonatkoztatott arányával fejeztük ki. A tesztben használt SC510 Rifr pXL 1500 törzs nem mutat detektálható SP2MT aktivitást a meghatározás körülményei között (a prekorrin-2-ből a teszt során termelődött prekorrin-3 aránya 0,05-nél kisebb).
b) A Pseudomonas denitrificans S-adenozil-L-metionin : prekorrin-2 metiltranszferázának tisztítása
Ez a példa bemutatja, hogyan lehet a Pseudomonas denitrificans egy, a kobalaminok bioszintézisében részt vevő proteinjét tisztítani, amikor a kérdéses aktivitás meghatározására már létezik módszer.
A proteint a pXL253 plazmidot tartalmazó SC510Rifr sejtjeiből tisztítottuk. A fenti plazmid a
HU 216 653 Β pKT230 plazmid, amelybe a 8,7 kb EcoRI fragmentumot beépítettük (13. ábra). Egy tipikus tisztítási eljárásban az SC510 Rifr törzs, amelybe a pXL253 plazmidot bevezettük, nedves sejtjeinek 5 g-ját 5 mM DTT-t tartalmazó 250 ml 0,1 M pH 7,7 kálium-foszfátban szuszpendáltuk, és 15 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. 50 000 g-n, 1 órán át tartó centrifugálás után a felülúszót egy DEAE-Sephadex oszlopon (10 ml a gélből) engedtük át, hogy a tetrapirrolvegyületeket eltávolítsuk. Az így kapott nyers extraktum pH-ját 0,1 M KOH-val pH 7,7-re állítottuk be. A 33-45% közötti telítettségű ammónium-szulfátban kicsapódott proteineket összegyűjtöttük, és 40 ml 0,1 M (pH 7,7) Tris-HCl, 5 mM DTTben feloldottuk. Ezt az oldatot egy Sephadex G-25 oszlopon engedtük át, és 10 mM pH 7,7 Tris-Hcl, 5 mM DTT-vel eluáltuk, majd az összegyűjtött fehérjéket egy DEAE-Trisacryl-M oszlopra injektáltuk. A proteineket 0-0,25 M KC1 lineáris gradiensével eluáltuk, és az SP2MT aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és másodszor is átengedtük egy Sephadex G-25 oszlopon, mint fent. A proteint tartalmazó frakciókat egy 10 mM pH 7,7 Tris-HCl, 5 mM DTT-vel kiegyensúlyozott Ultrogel HA (IBF) oszlopra injektáltuk. A proteineket 5 mM DTT-t tartalmazó 0-50 mM pH 7,8 káliumfoszfát lineáris gradiensével eluáltuk. A keresett aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és egy 50 mM pH 7,7 Tris-HCl, 5 mM DTT-vel kiegyensúlyozott Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) oszlopra injektáltuk. Az SP2MT-t KC1 lineáris gradiensével (0-0,25 M) eluáltuk. A Mono Q szakasz végén az SDS-PAGE elektroforézis (12,5%) ezüstsó festéssel kimutatta, hogy
2 3 4 5 6 7 8
Ser Gly Val Gly Val Gly Arg Leu
A COBI protein NH2-terminális szekvenciája (16. ábra) pontosan megfelel ennek a szekvenciának, azzal az eltéréssel, hogy a 16. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a nukleotidszekvenciából következtetett peptidszekvenciát. Ebből következik, hogy az aminoterminális metionin biztosan lehasad in vivő a metionin aminopeptidáz által (Ben Bassat és Bauer, 1987). A tisztított SP2MT 12,5%-os SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 26500. A COBI protein aminosavszekvenciájából következtetett molekulatömege 25 878 (16. ábra). Az NH2-terminális szekvencia és a molekulatömegek közötti megfelelés tisztán jelzi, hogy a COBI protein megfelel az SP2MT-nek. A cobl gén az SP2MT struktúrgénje.
6.1.4 A cobH gén által kódolt COBH protein azonosítása
a) A prekorrin-8x mutáz aktivitásának meghatározása
Ez a példa a kobalaminok bioszintézisének egy olyan enzimatikus aktivitását mutatja be, amelyet eddig még nem írtak le. A prekorrin-8x mutázról van szó. Ez az enzim a C-l 1 helyzetű metilcsoport transzferét katalizálja a C-l2 helyre, miközben a prekorrin-8x-et hidrogenobirinsawá alakítja át (a szénatomok nómenklatúráját lásd a 19. ábrán; 68. ábralap). Általánosabban, ez az enzim egy metilcsoport transzferét katalizálja a C-Π helyaz enzim több mint 99%-os tisztaságú. Ezt a protein NH2-terminális szekvenciájának egységessége is alátámasztotta. A denaturálókörülmények közötti (12,5% SDS-PAGE) elektroforézis alapján számolt molekulatömeg 26500. Az SP2MT tisztításának lépéseit, ezek hatásfokát az alábbi táblázat hja le.
VII. táblázat Az SP2MT tisztítása
Tisztítási lépés Térfogat (ml) Proteinek (mg) Tisztítási faktor(1)
Nyers kivonat 300 6000 -
Kicsapás (33-45%) 40 1530 3,9
DEAE-Trisacryl-M 57 355 16,9
Ultrogel HA 30 71 85
Mono Q HR 5/5 12 33,5 179
(1) ezt a faktort a proteinhozam alapján számoltuk
c) Az SP2MT NH2-terminális szekvenciája, és az ezt az aktivitást kódoló struktúrgén azonosítása
Ez a példa bemutatja, hogy egy olyan protein NH2terminális szekvenciája, amely bioszintézisben vesz részt, hogyan teszi lehetővé az ezt a proteint kódoló struktúrgén azonosítását. A jelen példában az SP2MT struktúrgénjéről van szó.
A tisztított protein NH2-terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. Az első 15 aminosavat azonosítottuk:
11 12 13 14 15
Gly Val Gly Thr Gly Pro ről a C-12-re, amely reakció így a korrinmaghoz vezet. Az enzimet itt mutáznak hívjuk, annak ellenére, hogy még nem bizonyították be, hogy a metilcsoport transzferé intramolekuláris, még ha ez igen valószínű is.
Az enzimaktivitást a prekorrin-8x (5 μΜ) enzimatikus faktorok jelenlétében, 0,1 M (pH 7,7) Tris-HCl, 1 mM EDTA-ban 30 °C-on 1 órán át tartó inkubálás folyamán történő hidrogenobirinsawá alakításával mutattuk ki. Az inkubáció végén a reakciót 10 perces 80 °C-ra melegítéssel állítottuk le, majd 3000 x g-vel 10 percig centrifugáltuk, majd a felülúszóban jelen lévő képződött hidrogenobirinsavat HPLC-vei analizáltuk (v.ö. 6.1.2.a példa).
b) A prekorrin-8x mutáz tisztítása
A Pseudomonas denitrificans prekorrin-8x mutázának tisztítását az itt leírt módon végeztük.
E tisztítás során minden pufferoldatot pH 7,7-re állítottunk be.
Egy tipikus tisztítási eljárásban a pXL253 plazmidot (a pKT230 plazmid, amelynek EcoRI helyére a 8,7 kb fragmentumot klónoztuk, 13. ábra) hordozó SC510 Rifr törzs sejtjeinek 50 g-ját, melyet PS4 tápközegben tenyésztve kaptunk, 200 ml 0,1 M kálium-foszfát-pufferban szuszpendáltunk, majd 12 percig ultrahanggal roncsoltuk. 50000 x g-nél végzett, 1 órán át tartó centrifugálás után a felülúszót egy DEAE-Sephadex oszlopon
HU 216 653 Β (10 ml gél) engedtük át, hogy a tetrapirrolvegyületeket eltávolítsuk. Az oldat pH-ját azonnal 7,7-re állítottuk 1 M KOH-oldattal. A 40 és 60% telítettségű ammónium-szulfátban kicsapódott proteinfrakciót centrifugálással összegyűjtöttük, és 50 ml 0,1 M Tris-HCl-ben feloldottuk. Ezt a mintát azután egy Ultrogel AcA 54 oszlopra (IBF, Franciaország) (1000 ml géltérfogat) injektáltuk, és a proteineket 60 ml/h átfolyási sebességgel, 50 mM Tris-HCl-lel eluáltuk. Az aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és egy 50 mM TrisHCl-lel kiegyensúlyozott DEAE-Trisacryl M (IBF, Franciaország) oszlopra injektáltuk. A proteineket KC1 0-0,2 M gradiensével eluáltuk. A tisztítandó fehérjét tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és egy 10 mM Tris-HCl-lel kiegyensúlyozott Sephadex G25 oszlopon engedtük át. A proteinfrakciót egy 10 mM Tris-HCl-lel kiegyensúlyozott Ultrogel HA (IBF, Franciaország) oszlopra injektáltuk, és a fehérjéket kálium-foszfát 0-0,1 M gradiensével eluáltuk, majd az aktív frakciót egy Phenyl-Sepharose CL 4B (Pharmacia) oszlopon kromatografáltuk 10 mM kálium-foszfátban, az eluálást ammónium-szulfát 0,65-0 M gradiensével végeztük. Az aktív frakciókat összegyűjtöttük. Az így kapott protein több mint 95%-os tisztaságú (12,5% SDS-PAGE elektroforézis és ezüstsó festés után). A protein tisztaságát az NH2-terminális szekvencia egységessége is
2 3 4 5 6 7 8
Pro Glu Tyr Asp Tyr Ile Arg Asp
A COBH protein NH2-terminális szekvenciája (16. ábra) pontosan megegyezik ezzel a szekvenciával, azzal a kivétellel, hogy a 16. ábrán bemutatott szekvenciában egy metionin előzi meg az itt leírt szekvenciával meghatározott peptidszekvenciát. Ebből az következik, hogy az aminoterminális metionint biztosan lehasítja in vivő a metionin aminopeptidáz (Ben Bassat és Bauer, 1987). Mivel a második gyök egy prolin, ez a hasítás egyezik a már ismert megoldásokkal (Hírei és munkatársai, 1989). A tisztított prekorrin-8x mutáz 12,5% SDSPAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 22 000. A COBH protein szekvenciájából számolt molekulatömege 22050 (16. ábra). Az NH2-terminális szekvencia és a molekulatömegek közötti egyezés világosan jelzi, hogy a COBH protein megfelel a prekorrin-8x mutáznak. A cobH a prekorrin-8x mutáz struktúrgénje.
d) A prekorrin-8x előállítása, izolálása és azonosítása
A prekorrin-8x egy tipikus előállítási eljárásában az SC510Rifr pXL253 törzs egy nyers enzimkivonatát (1000 mg protein) 20 órán át 30 °C-on, anaerob körülmények között inkubáljuk 100 ml 0,1 M pH 7,7 TrisHCl pufferben 1000 nmol korábban már leírt módon előállított trimetil-izobakterioklorin (Battersby és munkatársai, 1982), EDTA (1 mM), ATP (100 pmol), MgCl2 (250 μιηοΐ), NADH (50 μιηοΐ), NADPH (50 pmol), SAM (50 pmol) és hidrogenobirinsav (20 μπιοί) jelenlétében. Az inkubáció végén a többségben képződött tetrapirrol termék a prekorrin-8x. Ezt HPLC-vel izoláltuk és tisztítottuk egy pBondapak C18 (Waters) oszlopon, eluálószerként acetonitril 0-50% lineáris gradiensét alalátámasztja. A protein e technikával számolt molekulatömege 22 000. A prekorrin-8x mutáz tisztításának lépéseit, a tisztítási hozamot az alábbi táblázatban írtuk le.
Vili. táblázat
A prekorrin-8x mutáz tisztítása
Tisztítási lépés Térfogat (ml) Proteinek (mg) Tisztítási faktor(1)
Nyers kivonat 250 6000 -
Kicsapás (40-60%) 50 2350 2,6
Ultrogel ACA 54 70 655 9,2
DEAE-Trisacryl M 30 271 22
Ultrogel HA 22 93 65
Phenyl Sepharose 12 31 194
(1) ezt a faktort a protcinhozam alapján számoltuk
c) A prekorrin-8x mutáz NH2-terminális szekvenciája, és struktúrgénjének azonosítása
Ez a példa bemutatja, hogyan teszi lehetővé egy bioszintézisben részt vevő protein NH2-terminális szekvenciájának ismerete az ezt a proteint kódoló struktúrgén azonosítását.
E protein NH2-szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. 15 gyököt azonosítottunk:
11 12 13 14 15
Asn Ala Ile Tyr Glu Arg kalmazva pH 5,8 kálium-foszfát pufferban. A prekorrin8x tömege (m/z=880) és metilészter-származékának tömege (m/z=978) jelzi, hogy egy olyan vegyületről van szó, amelynek a hidrogenobirinsavval azonos a nyers képlete. Az UV/látható és fluoreszcens karakterisztikák nagyon különböznek a hidrogenobirinsavétól, és jelzik, hogy a molekulának két elkülönült kromofóija van. Mivel az egyetlen enzimatikus izomerizációs reakció a prekorrin-6x (Thibaut és munkatársai, 1990) és a hidrogenobirinsav között a C-ll metilcsoport migrációja a C12 helyre, a prekorrin-8x az utolsó intermedier a hidrogenobirinsav előtt, és a megfelelő reakció a C-l 1 metilmigrációja a C-l2 helyre, amelyet a prekorrin-8x mutáz katalizál.
6.1.5 A cobU gén által kódolt COBU protein azonosítása
a) A nikotinsav-nukleotid:dimetil-benzimidazol foszforibozil transzferáz aktivitás meghatározása (5. ábra, 5. reakció).
Ez a példa egy, a kobalaminok bioszintézisével közvetlen kapcsolatban álló enzimatikus aktivitás meghatározását mutatja be. A nikotinsav-nukleotid:dimetilbenzimidazol foszforibozil transzferázról (NN:DMBI PRT) van szó (EC 2.4.2.21). Az NN:DMBI PRT aktivitást tartalmazó frakciókat (körülbelül 5 egység) 30 °Con 8 percig inkubáltuk 500 μΐ 0,1 M pH 9,7 glicin :NaOH pufferben, 1 mM NaMN (nikotinsav-mononukleotid) és 10 μΜ DMBI jelenlétében. A reakciót azután 10 percen át tartó 80 °C-ra melegítéssel állítottuk le, a reakciókeveréket 4 térfogat vízzel hígítottuk, és eb26
HU 216 653 Β bői az oldatból 100 μ,Ι-t egy 15 cm-es HPLC Nucleosil 5-CB oszlopra injektáltunk, amelyet 0,1 M (pH 2,9) kálium-foszfát: acetonitril (93:7) keverékkel eluáltunk 1 ml/perc átfolyási sebességgel. Az cx-ribazol-5’-foszfátot fluorimetriával detektáltuk, és mennyiségét meghatároztuk (gerjesztés: 260 nm; emisszió >370 nm). Az enzimaktivitási egységet úgy határoztuk meg, mint 1 nmol a-ribazol-5’-foszfát 1 óra alatti keletkezéséhez szükséges enzimmennyiség a fenti körülmények között.
b) A Pseudomonas denitrificans NN: DMBIPRT aktivitásának tisztítása.
Ez a példa bemutatja, hogyan tisztítható a Pseudomonas denitrificans egy, a kobalaminok bioszintézisében részt vevő proteinje. A 6.1.5.a) példában leírt meghatározásból kiindulva az itt leírt módon valósítottuk meg a Pseudomonas denitrificans NN: DMBI PRTának tisztítását. Egy tipikus tisztítási kísérletben az SC510 Rifr törzs sejtjeinek, amelybe a pXL140B plazmidot a korábban leírt módon bevezettük, 10 mg-ját használtuk. A pXL140B plazmidot a 38. ábra írja le; ezt a plazmidot a pXL5193,85 kb BamHI-Sstl-SstI fragmentumának klónozásával kaptuk (lásd a 38. ábrát). Ez a plazmid tehát a Pseudomonas denitrificans cobU és cobV génjeit hordozza. A lividomicinnel kiegészített PS4 tápközegben a korábban leírt módon tenyésztett sejteket 96 óra tenyésztési idő múlva összegyűjtöttük. A sejteket 25 ml 0,1 M pH 7,2 Tris-HCl pufferben újra szuszpendáltuk, és 15 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután 1 órás 50 000 g-nél történő centrifugálással összegyűjtöttük, majd egy DEAE-Trisacryl M (IBF, Franciaország) oszlopon en5 gedtük át, amelyet ugyanazzal az oldattal egyensúlyoztunk ki. Az eluátum 10%-át (120 mg protein) Mono Q HR 10/10 oszlopon frakcionáltuk, KC1 gradienst (0-0,6 M) alkalmazva. Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, és 2 ml-re koncentráltuk ultraszűréssel, majd egy térfogat 30 mM (pH 7,2) Tris-HCl-lel való hígítás után a mintát másodszor is frakcionáltuk egy Mono Q HR 5/5 oszlopon, mint előzőleg. Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, és a mintát ammónium-szulfát segítségével 1 M koncentrációjúra állítottuk, és egy Phenyl-Supe15 rose HR 5/5 oszlopon kromatografáltuk, ammóniumszulfát csökkenő gradiensével (1 M-0 M). A keresett aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, ultraszűréssel koncentráltuk, és egy Bio-Sil 250 gélpermeációs oszlopon kromatografáltuk, 20 mM nátrium20 foszfát-50 mM nátrium-szulfát pH 6,8 eleggyel eluálva. Ezután a lépés után az enzim több mint 95%-os tisztaságú. SDS-PAGE-n nem mutat semmilyen proteinszennyeződést. Ezt a tisztaságot az NH2-terminális szekvencia egységessége is alátámasztja. A fehéqe moleku25 latömege ezzel a technikával 35 000. A NN: DMBI PRT tisztításának különböző lépéseit a következő ábra mutatja be.
IX. táblázat
A Pseudomonas denitrificans NN: DMBI PRT-ának tisztítása.
Tisztítási icpcs Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (cgység/mg protein) Hatásfok Tisztítási faktor (1)
Nyers kivonat 6,0 120 2650 - -
MonoQ 10/10 6,0 12,07 13 515 51,3 5,1
Mono Q 5/5 3,0 6,19 20 140 39,2 7,6
Phenil-Superose L5 2,60 35 510 29,0 13,4
Bio-Sil 250 1,2 1,92 39 750 24,0 15,0
c) A Pseudomonas denitrificans NN:DMBI PRTának NH2-terminális szekvenciája, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitást kódoló struktúrgénjének azonosítása
A 6.1.5 b) példában leírt módon tisztított Pseudomonas denitrificans NN:DMBI PRT NH2-terminális szekvenciáját a már leírt technika szerint határoztuk meg. Az első 15 maradékot azonosítottuk:
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Ser Alá Ser Gly Leu Pro Phe Asp Asp Phe Arg Glu Leu Leu Arg
A COBU protein NH2-terminális szekvenciája (41. ábra) megfelel ennek a szekvenciának, azzal a kivétellel, hogy a 41. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenciálással meghatározott peptidszekvencia első aminosavát. Ebből következik, hogy az aminoterminális metionint bizonyosan lehasítja in vivő a metionin aminopeptidáz (Ben Bassat és Bauer, 1987). A tisztított N-transzglikozidáz 12,5%os SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 35 000. A COBU protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 34642 (41. ábra). Az NH2-ter50 minális szekvenciák és a molekulatömegek közötti egyezés világosan jelzi, hogy a COBU protein megfelel az NN:DMBI PRT-nak. A cobU az NN:DMBI PRT struktúrgénje.
d) Az NN: DMBI PRT specifitása a DBI-re
Ez a példa bemutatja, hogy a Pseudomonas denitrificans NN:DMBI PRT specifitási vizsgálata hogyan teszi lehetővé a Pseudomonas denitrificans különböző kobamidjainak bioszintézisét a Pseudomonas denitrificans NN:DMBI PRT-ának katalitikus sajátságait fel60 használva a kérdéses nukleotidbázis szintézisére.
HU 216 653 Β
Az enzim szubsztrátja a kobalaminok szintézisekor az 5,6-dimetil-benzimidazol. Amikor a reakciók szubsztrátjai a benzimidazol és az 5-metil-benzimidazol, a reakciók reakciósebessége 157% és 92% a természetes szubsztráthoz (5,6-dimetil-benzimidazol) viszonyítva, ha a NaMN koncentrációját 2 mM-re fixáljuk. A Pseudomonas denitrificans NN:DMBI PRT-ának specifitása tehát gyenge a benzimidazol magvú szubsztrátokhoz. Tehát a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr törzset (Cameron et al., 1989) felhasználhatjuk arra, hogy Coa-(benzimidazolil)-CoB-cianokobamidot, illetve Coa(5-metil-benzimidazolil)-CoP-cianokobamidot szintetizáltassunk vele PS4 tápközegben tenyésztve, ahol az 5,6-dimetil-benzimidazolt benzimidazollal, illetve 5-metil-benzimidazollal helyettesítjük. Bizonyos, hogy ezen a módon más kobamidokat is szintetizálni tudnánk.
6.1.6 A cobV gén által kódolt COBV protein azonosítása
Ez a példa bemutatja, hogyan teszi lehetővé a Pseudomonas denitrificansnál a koenzim B[2 bioszintézis egy aktivitásának meghatározása, majd ennek az aktivitásnak a részleges tisztítása a Pseudomonas denitrificans ezen enzimének struktúrgénj ének azonosítását.
a) A GDP-kobinamid :a-ribazol-(5’-foszfát) kobinamid-fiszfotranszferáz [vagy kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz] aktivitásának meghatározása
Ez a példa bemutatja egy, a kobalaminok bioszintéziséhez közvetlenül kapcsolt aktivitás meghatározását. A kobalamin-(5’-foszfát) szintetázról van szó. Az aktivitást tartalmazó frakciókat (körülbelül 10 egység) sötétségben, 30 °C-on, 500 μΐ 0,3 M (pH 9,0) Tris-HCl pufferben inkubáltuk 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl2, 50 μΜ a-ribazol-5’-foszfát és 20 μΜ GDP-kobinamid [5’-dezoxi-5’-adenozil (Adó) vagy koenzim formában] jelenlétében. 15 perc inkubáció után 500 μΐ 20 mM kálium-cianidot adtunk hozzá, és az oldatot 10 percig 80 °C-ra melegítettük. A kicsapódott anyagok eltávolítására szolgáló centrifugálás után a felülúszóban jelen lévő B,2 vitamin-5’-foszfátot a 9. példában leírt módon határoztuk meg. A kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz egy egységét úgy határoztuk meg, mint az az enzimmennyiség, ami óránként 1 nmol kobalamin-5’foszfát előállításához szükséges a fent leírt körülmények között.
Az Ado-GDP-kobinamidot az Ado-kobinamid-foszfát (Blanche és al., 1989) az SC510 Rifr pXL623 törzzsel történt, a kobinamid-foszfát guanililtranszferáz meghatározásához használt körülmények közötti inkubációjával (lásd a 6.1.11 .b példát) kaptuk meg. Az α-ribazolt és az a-ribazol-5’-foszfátot az SC510 Rifr tenyészetéből izoláltuk, és HPLC-vel, a 6.1.5a példában leírt meghatározás körülményei között tisztítottuk.
b) A kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz részleges tisztítása
Ez a példa bemutatja, hogyan tisztítható részlegesen egy, a Pseudomonas denitrificansnak a kobalaminok bioszintézisében részt vevő enzimatikus aktivitása. A fent leírt meghatározásból kiindulva valósítottuk meg a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz tisztítását. Hogy ezt elérjük, egy tipikus tisztítási kísérletben a pXL1490B plazmiddal a korábban leírt módon transzformált SC510 Rifr törzs nedves sejtjeinek 10 g-ját. A pXL1490B plazmidot a 38. ábrán írtuk le; ez a plazmid megfelel a pKT230-ba klónozott 3,85 kb Sstl-Sstl-BamHI fragmentumnak. Ez a plazmid a Pseudomonas denitrificans cobU és cobV gén20 jeit hordozza. A plazmid jelenléte a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr törzsben a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz aktivitás körülbelül egy 100-as faktorral való növekedéséhez vezet; valószínű tehát, hogy a pXL1490B plazmid által hordozott inszertum tartalmazza ennek az enzimnek a struktúrgénj ét; ez a gén tehát csak a cobU vagy a cobV gén lehet. Az SC510 RifrpXL1490B sejtjeit lividomicinnel kiegészített PS4 tápközegben tenyésztve kaptuk meg, amint azt fentebb leírtuk. A sejteket centrifugáltuk, majd 25 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 8,3)-1 mM
EDTA pufferben (A puffer) újra szuszpendáltuk, és 15 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután 1 órás 50000 g-n történt centrifugálással összegyűjtöttük, és egy A pufferrel kiegyensúlyozott Sephadex G-25 oszlopon engedtük át. A proteinfrakciót összegyűjtöttük, és 300 ml-es frakciónként (7,5 mg protein) egy Superose 12 HR 10/30 oszlopra injektáltuk, amit A pufferrel eluáltunk. A kizárt frakciót összegyűjtöttük, azonos térfogat A puffer-1,0 M ammónium-szulfáttal hígítottuk, majd egy Phenyl-Superose HR 5/5 osz40 lopon kromatografáltuk. A proteineket ammónium-szulfát A pufferben előállított csökkenő gradiensével (0,5 M-0 M) eluáltuk, az eluálás végén az oszlopot A pufferrel átmostuk, hogy eluáljuk a kobalamin-(5’foszfát) szintetáz aktivitást. Az enzim részleges tisztítását az alábbi táblázat írja le, 75 mg a tisztítási folyamatba bevezetett proteinből kiindulva.
X. táblázat
A Pseudomonas denitrificans kobalamin-(5’-foszfát) szintetázának részleges tisztítása
Tisztítási lépés Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (cgység/mg protein) Hatásfok Tisztítási faktor 0)
Nyers kivonat 3,0 75 325 - -
Superose 12 HR 50,0 2,9 6810 81 21
Phenyl-Superose 4,5 0,35 17 850 26 55
c) A kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz specificitása Az (Ado)GDP-kobinamidra vonatkozó Km 0,9 μΜ.
Mégis, az enzim ugyanazt az affinitást mutatja, és a reakciósebesség is gyakorlatilag azonos a szubsztrát különböző formáinál (CN, aq). Az enzim Km-je az a60 ribazol-5’-foszfát esetén körülbelül 2,7. Ráadásul a ko28
HU 216 653 Β balamin-(5’-foszfát) szintetáz legtisztább előállított preparátumai katalizálják az Ado-GDP-kobinamid reakcióját az α-ribazollal, amely úton koenzim B]2 keletkezik, és ilyen feltételek között nem figyelték meg a kobalamin-5’-foszfát felhalmozódását. Az enzim aribazolra vonatkozó Km-je 7,8 μΜ. Az SC510 Rifr törzsnél PS4 tápközegben, a 6.1 5a) példában leírt tenyésztési feltételek között tenyésztve, a kobalamin termelése folyamán az a-ribazol-5'-foszfát és az a-ribazol intracelluláris koncentrációjára 30 és 700 μΜ-t mértek HPLC-vel. Ez azt mutatja, hogy a koenzim B)2 közvetlenül az Ado-GDP-kobinamidból is keletkezhet a kobalamin-(5’ -foszfát) szintetáz működése során, a kobalamin-5’-foszfát részvétele nélkül.
A Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr tenyészeteiben a kobalamin-5’-foszfát felhalmozódásának hiánya, illetve az, hogy csak nyomokban van jelen, megerősíti azt, hogy a koenzim B,2 in vivő az Ado-GDPkobinamid α-ribazollal történő direkt reakciója útján keletkezik.
Ezt a reakciót in vitro már megfigyelték és leírták a Propionibacterium shermaniinál (Ronzio et al., 1967; Renz, 1968). Mivel a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz struktúrgénje csak a cobU vagy a cobV gén lehet, hiszen a Pseudomonas denitrificansnál egy, ezt a két gént tartalmazó fragmentum amplifikációja a kobalamin-(5'-foszfát) szintetáz aktivitás 100-as faktorral való megnövekedéséhez vezetett, és mivel a cobU gén az NN: DMBI PRT struktúrgénje, így a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz struktúrgénje a cobV gén.
6.1.7 A cobK. gén által kódolt COBK protein azonosítása
a) A prekorrin-6x reduktáz aktivitásának meghatározása
Ez a példa bemutatja egy, a kobalaminok bioszintéziséhez közvetlenül kapcsolódó új enzimaktivitás meghatározását. A prekorrin-6x reduktázról van szó. A prekorrin-6x reduktáz aktivitást (körülbelül 0,05 egység) tartalmazó frakciókat 30 °C-on 60 percig inkubáltuk 250 μΐ 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl pufferben, 1 mM EDTA, 500 μΜ NADPH, 25 μΜ [metil-3H]SAM (80 μΟ/μιηοΙ), 4μΜ prekorrin-6x (Thibaut és munkatársai, 1990), és 0,5 egység részlegesen tisztított dihidroprekorrin-6x metiláz (lásd a lentebb leírt preparációt) jelenlétében. Azután a reakciót 5 perces 80 °C-ra melegítéssel állítottuk le, majd 50000 g-nél centrifugáltuk 5 percig, és a felülúszót egy (200 μΐ gélt tartalmazó) DEAE-Sephadex oszlopra injektáltuk. Az oszlopot extenzíven mostuk Tris-HCl pufferrel, és a megkötött vegyületeket 4 ml 1 M HCl-lel eluáltuk. Az eluátum radioaktivitását szcintillációs oldatban mértük. Az enzimatikus aktivitást úgy definiáltuk, mint az az enzimmennyiség, amely 1 nmol prekorrin-6x 1 óra alatti redukálásához szükséges a fenti körülmények között.
A dihidroprekorrin-6x metilázt az SC510 Rifr pXL253 nyers kivonatából részlegesen tisztítottuk, egy Mono Q HR 5/5 (Pharmacia) anioncserélő oszlopon. Az oszlopot KC1 0-0,4 M lineáris gradiensével eluáltuk 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl pufferben. Az enzimaktivitás 0,35 M KCl-nél eluálódott. Az aktivitás detektálását és mennyiségének meghatározását a fent meghatározott prekorrin-6x reduktáz aktivitási teszt segítségével végeztük (0,5 egység prekorrin-6x reduktázzal az inkubációs elegyben). A Mono Q lépés után a dihidroprekorrin6x metiláz aktivitást tartalmazó frakciók teljesen mentesek voltak a prekorrin-6x reduktáz aktivitástól. A metiláz aktivitás egy egységét úgy definiáltuk, mint az az enzimmennyiség, ami 1 óra alatt 1 nmol metilcsoport dihidroprekorrin-6x-re való transzferéhez szükséges a fenti körülmények között.
b) A prekorrin-6x reduktáz aktivitás tisztítása
A fenti meghatározásból kiindulva megvalósítottuk a Pseudomonas denitrificans prekorrin-6x reduktázának tisztítását, amint itt leírjuk.
Egy tipikus tisztítási kísérletben a pXL253 plazmiddal (a pK230 plazmid, amelynek EcoRI helyére klónoztuk a 8,7 kb fragmentumot, 13. ábra) transzformáit SC510 Rifr törzs nedves sejtjeinek 100 g-ját 200 ml 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl-1 mM EDTA pufferben (A puffer) szuszpendáltuk, és 15 percen át 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután 1 órás 50000 x g-vel végzett centrifugálással összegyűjtöttük, és háromszor átengedtük egy A pufferrel kiegyenlített Sephadex G 25 oszlopon. A három gélből kizárt frakciót összegyűjtöttük, és A pufferrel 1 1-re egészítettük ki. A 25 és 40% telítettségű ammóniumszulfátban kicsapódott proteineket centrifugálással összegyűjtöttük és 50 ml A pufferben újra szuszpendáltuk, és ezt az oldatot egy B pufferrel (25 mM Tris-HCl-500 μΜ DTT-15% glicerol) kiegyenlített Sephadex G 25 oszlopon átengedve sótalanítottuk. A proteinoldatot azután 2,5 ml/perc átfolyási sebességgel egy Q Sepharose Fást Flow (Pharmacia) oszlopra injektáltuk, amelyet B pufferrel egyenlítettünk ki, és a proteineket B puffer-0,2 M KC1 eleggyel eluáltuk. Ezt a frakciót sótalanítottuk egy C pufferrel (50 mM TrisHCl-500 μΜ DTT-15% glicerol) kiegyenlített Sephadex G 25 oszlopon. A proteinoldatot azután egy Mono Q HR 10/10 (Pharmacia) oszlopon frakcionáltuk (100 mg protein minden kromatografálásnál) KC1 C pufferben előállított 0-0,4 M gradiensével, majd az aktivitást tartalmazó frakciókat egy Phenyl-Superose HR 10/10 oszlopon kromatografáltuk ammóniumszulfát csökkenő lineáris gradiensében (1-től 0 M-ig). Az aktív frakciót sótalanítottuk, és a prekorrin-6x reduktázt tisztítottuk egy Mono Q HR 5/5 oszlopon. Az enzimet 50 mM pH 8,1 Tris-HCl-500 μΜ DTT-15% glicerol pufferben eluáltuk, KC1 0-0,2 M gradiensével. A tisztítás befejezésére végül a proteint egy Bio-Sil 250 (Bio-Rad) oszlopon kromatografáltuk, 20 mM kálium-foszfát-50 mM nátrium-foszfát, pH 6,8-500 μΜ DTT-15% glicerololdattal eluálva. Ezután a lépés után az enzim több mint 95%-os tisztaságú. SDS-PAGE-sel nem mutat proteinszennyeződést, ha a proteineket ezüst-nitráttal hívjuk elő. A tisztaságot az NH2-terminális szekvencia egységessége is alátámasztja. Az enzim molekulatömege ezzel a technikával 31 000. A prekorrin-6x reduktáz tisztításának különböző lépéseit, a tisztítási faktorral és a hatásfokkal az alábbi táblázat mutatja be.
HU 216 653 Β
XI. táblázat
A prekorrin-6x reduktáz tisztítása
Tisztítási lcpcs Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (cgyscg'mg protein) Hatásfok Tisztítási faktor (1)
Nyers kivonat 270 9600 0,535 - -
Ammónium-szulfát, 25-40% 100 4160 1,14 92 2,1
Q Sepharose 150 1044 3,64 74 6,8
Mono Q 10/10 55 67 24,5 32 46
Phenyl-Superose 10 2,2 325 14 607
Mono Q 5/5 2,5 0,082 5750 9,2 10 750
Bio-Sil 250 1,0 0,055 7650 8,2 14 300
c) A Pseudomonas denitrificans prekorrin-6x reduktázának NH2-terminális szekvenciája, részleges belső szekvenciái, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitást kódoló génjének azonosítása.
A fenti módon tisztított prekorrin-6x reduktáz NH2terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. Hat gyököt azonosítottunk:
Asp-Gly- Ser-Leu-Phe-Asp
Tripszines hasítás és a fragmentumok HPLC-n, egy fordított fázisú C-18 oszlopon való elválasztása után három belső szekvenciát kaptunk:
Ile-Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Ala-Asp-Gly-Leu
Arg-Pro-Glu-T rp-V al-Pro-Leu-Pro-Gly-Asp-Arg
Val-Phe-Leu-Ala-Ile-Gly
A COBK protein NH2-terminális szekvenciája (16. ábra) pontosan megfelel a prekorrin-6x NH2-terminális szekvenciájának, azzal a kivétellel, hogy a 16. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenálással megállapított szekvenciát. Ebből 35 az következik, hogy a metionin aminopeptidáz bizonyosan lehasítja in vivő az aminoterminális metionint (Ben Bassat és Bauer, 1987). A három belső szekvencia a COBK protein 60-69, 112-122 és 143-148 helyzetű szekvenciáinak felel meg. A tisztított prekorrin-6x 40 reduktáz SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 31000. A COBK protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 28000 (16. ábra). Az NH2terminális, a belső szekvenciák, és a molekulatömegek közötti megfelelés világosan jelzi, hogy a COBK protein 45 a prekorrin-6x reduktáznak felel meg. A cobK gén a prekorrin-6x reduktáz struktúrgénje.
d) A prekorrin-6x reduktáz által katalizált reakció
A prekorrin-6x enzimatikus redukciója szigorúan NADPH függő a Pseudomonas denitrificansnál. 50 A NADPH-t nem helyettesítheti a NADH. Amikor a tisztított enzimet (vagy a tisztítás egy közbeeső aktív frakcióját, esetleg nyers enzimkivonatot) az aktivitásmeghatározás körülményei között inkubáltuk, de SAM és dihidroprekorrin-6x metiláz hiányában, a reak- 55 cióterméket HPLC-n, a prekorrin-6x tisztításánál leírt rendszerben tisztíthattuk (v.ö. 6.1.4.d példa). A sótalanítás és az észteresítés után (metil-szulfát, 4%-os, °C, 24 óra, argonatmoszféra) a megfelelő észter tömege, m/z=1008. Tehát a prekorrin-6x reduktáz által 60 katalizált reakció terméke a dihidroprekorrin-6x, amit prekorrin-6y-nak is neveznek.
6.1.8 A CobQ gén által kódolt COBQ protein azo20 nosítása
a) A kobirsav szintetáz aktivitásának meghatározása. Ez a példa bemutatja egy olyan, a kobalaminok bioszintézisében részt vevő enzimatikus aktivitás meghatározását, amelyet még nem írtak le. A kobirsav szintetáz25 ról van szó. Ez az enzim a korringyűrű periferikus, b, d, e és g helyzetű karboxilcsoportjainak amidálását katalizálja (lásd a 19. ábrát, 68. ábraoldal). Az NH2-csoport donorja az L-glutamin, és minden amidálási reakciót 1 molekula ATP fogyasztása kísér.
A meghatározandó frakciót sötétben, 30 °C-on 60 percig inkubáltuk 250 pl 0,1 M pH 7,5 Tris-HCl pufferben, ami 1 mM DTT-t, 1 mM EDTA-t, 1 mM ATP-t, 2,5 mM MgCl2-t, 1 mM glutamint, 10 pM Ado-kobirinsav di- vagy pentaamidot tartalmazott. A reakciót kálium-cianid 0,1 M vizes oldatának 25 pl-ének hozzáadásával állítottuk le. 10 perces 80 °C-ra melegítés és 10 perces 3000 x g-nél történt centrifugálás után a felülúszóban jelen lévő kialakult vegyületeket HPLC-n analizáltuk. Az aktivitási egységet úgy definiáltuk, mint az az enzimmennyiség, ami 1 nmol amidcsoport 1 óra alatti kialakításához szükséges a fenti körülmények között.
Az 5’-dezoxi-5’-adenozil(Ado)-kobirinsav diamidot és pentaamidot az SC510 törzsből izoláltuk PS4 tápközegben, azt az eljárást használva, amelynek lényegét a 9. példában írjuk le.
b) A kobirsav szintetáz tisztítása A 6.1.8 a) példában leírt meghatározásból kiindulva az itt leírt módon megvalósítottuk a Pseudomonas denitrificans kobirsav szintetázának tisztítását.
Egy tipikus tisztítási kísérletben a pXL618 plazmiddal (lásd a 4.5.2 példát) transzformált SC510 Rifr nedves sejtjeinek 6 g-ját 15 ml 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA összetételű pufferben ultrahanggal roncsoltuk. Centrifugálás után (50 000 x g 1 órán át) a kivonatot 20%-os (térfZtérf) glicerolba vittük át. 8,5 ml nyers kivonathoz (203,5 mg protein) 24 ml 10 mM TrisHCl, 1 mM DTT, 20% glicerol összetételű puffért adtunk. Az oldatot 2 ml/perc átfolyási sebességgel Mono Q HR 10/10 oszlopra injektáltuk, amelyet 50 mM pH 7,7 Tris-HCl, 1 mM DTT, 20% glicerolpufferrel egyen30
HU 216 653 Β lítettünk ki. A proteineket 0,5 M NaCl lineáris gradiensével eluáltuk, és az összegyűjtött aktív frakciókat 1 mM EDTA-ba vittük át. Az oldatot 0,85 M ammónium-szulfátba vittük át, és egy Phenyl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) oszlopra injektáltuk, amelyet pH 7,7 Tris-HCl, 1 mM DTT, 0,85 M ammónium-szulfát pufferrel egyenlítettünk ki, és a proteineket ammónium-szulfát 0,85-0 M csökkenő lineáris gradiensével eluáltuk. A frakciókat azonnal 20%-os glicerolba vittük át. Az aktív frakciókat ultraszűréssel 2,5 ml-re koncentráltuk, és egy PD 10 (Pharmacia) oszlopon kromatografáltuk, amelyet 50 mM pH 8,3 Tris-HCl, 1 mM DTT, 20% glicerol (térf/térf) pufferrel egyenlítettünk ki és eluáltunk. A proteinfrakciókat összegyűjtöttük, és egy, ugyanazzal a pufferrel kiegyenlített Mono Q HR 5/5 oszlopra injektáltuk, és a proteineket 0,5 M NaCl lineáris gradiensével eluáltuk. Végül a Bio-Sil 250 (Bio-Rad) gélen, 50 mM pH
7,5 Tris-HCl, 1 mM DTT, 20% glicerol, 0,1 M NaCl pufferben végzett permeációs kromatográfia lehetővé tette, hogy több mint 97%-os tisztaságú proteineket kapjunk. A fehérje semmilyen proteinszennyeződést nem mutat SDS-PAGE-sel. A tisztaságot alátámasztja az
NH2-terminális szekvencia egységessége is. A protein molekulatömege ezzel a technikával 57 000. A kobirsav szintetáz tisztításának különböző lépéseit, a tisztítási faktorokat és a hatásfokot az alábbi táblázat tartalmazza.
XII. táblázat
A kobirsav szintetáz tisztítása
Tisztítási lépes Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (egység/mg protein) Hatásfok Tisztítási faktor (a)
A“ Bb
Nyers kivonat 8,5 203 114 118 - -
Mono Q 10/10 8,0 35,5 388 425 60 3,4
Phenyl-Superose 8,0 3,23 1988 2021 28 17
Mono Q 5/5 1,0 1,20 4549 4085 24 40
Bio-Sil 250 0,75 0,88 4992 N. D. 19 44
a) Ado-kobirinsav-a,c-diamiddal mint szubsztráttal
b) Ado-kobirinsav-pcntaamiddal mint szubsztráttal
N. D.=ncm határoztuk meg
A tisztított protein nagy fokú tisztasága, valamint a kobirinsav diamid- és pentaamid-amidálási aktivitásának állandó aránya a protein egész tisztítási folyamata során (lásd a fenti táblázatot) egyértelműen azt jelzi, hogy ugyanaz az egyetlen protein felelős a korringyűrű b, d, e és g helyzetű négy amidálási aktivitásáért.
c) A Pseudomonas denitrificans kobirsav szintetázának NH2-terminális szekvenciája, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitást kódoló struktúrgénjének azonosítása
A Pseudomonas denitrificans kobirsav szintetázának NH2-terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. Tizenhat aminosavmaradékot azonosítottunk:
Thr-Arg-Arg-Ile-Met-Leu-Gln-Gly-Thr-Gly-Ser-AspVal-Gly-Lys-Ser
A COBQ protein NH2-terminális szekvenciája (47. ábra) pontosan megfelel ennek a szekvenciának, azzal a kivétellel, hogy a 47. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenálással megállapított szekvenciát. Ebből az következik, hogy a metionin aminopeptidáz bizonyosan lehasítja in vivő az aminoterminális metionint (Ben Bassat et Bauer, 1987). A tisztított kobirsav szintetáz SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 57000. A COBQ protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 52000 (47. ábra). Az NH2-terminális szekvenciák és a molekulatömegek közötti megfelelés világosan jelzi, hogy a
COBQ protein a kobirsav szintetáznak felel meg. A cobQ gén a kobirsav szintetáz struktúrgénje.
6.1.9 A cobO gén által kódolt COBO protein azonosítása
a) A cob(I)alamin adenozil transzferáz (EC 2.5.1.17) aktivitásának meghatározása
Ez a példa bemutatja egy, a kobalaminok bioszintéziséhez közvetlenül kapcsolt enzimatikus aktivitás meghatározását. A cob(I)alamin adenozil transzferázról (EC 2.5.1.17) van szó. Ezt az enzimet baktérium (Ohta és munkatársai, 1976; Brady és munkatársai, 1962) és állati (Fenton és munkatársai, 1978) sejteknél ismerték meg. Clostridium tetanomorphumból tisztították (Vitols és munkatársai, 1966). A cob(I)alamin adenozil transzferáz aktivitást tartalmazó frakciókat (körülbelül 20 egység) anaerob módon 30 °C-on 15 percig inkubáltuk fénytől védve 1 ml 0,2 M pH 8,0 Tris-HCl pufferben, 5 mM DTT, 400 μΜ [8-14C]ATP (2,5 pCi/pmol), 800 μΜ MnCl2, 50 μΜ hidroxokobalamin vagy diakvakobinamid és 3 mg KBH4 jelenlétében. A reakciót 10 perces 80 °C-ra melegítéssel állítottuk le, és 5 perces 15 000 x g-nél végzett centrifugálás után 200 μΐ felülúszót HPLC-vel analizáltunk (Gimsing és munkatársai, 1986; Jacobsen és munkatársai, 1986).
Az enzimaktivitási egységet úgy határoztuk meg, mint az az enzimmennyiség, ami percenként 1 nmol adenozilkorrinoid a fenti feltételek közötti előállításához szükséges.
b) A cob(l)alamin adenozil transzferáz aktivitás tisztítása A 6.1.9 a) példában leírt meghatározásból kiindul60 va megvalósítottuk a Pseudomonas denitrificans cob31
HU 216 653 Β (I)alamin adenozil transzferázának tisztítását, amint azt itt leírjuk. Egy tipikus tisztítási kísérletben az SC510 Rifr törzs, amelyben a cobO gént amplifikáltuk, nedves sejtjeinek 10 g-ját 20 ml 0,2 M pH 8,0 TrisHC1 pufferben szuszpendáltuk, és 40 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután 1 órás 50000 x g-vel történt centrifugálással összegyűjtöttük, és sótalanítottuk egy 50 mM pH 8,0 TrisHC1, 5 mM DTT (A puffer) pufferrel kiegyenlített PD10 (Pharmacia) oszlopon. A proteinoldatot ezután frakcionáltuk (280 mg proteint minden kromatográfiánál) egy Mono Q HR 10/10 (Pharmacia) oszlopon KC1 0-0,5 M gradiensének segítségével, A pufferben, majd az aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, ultraszűréssel koncentráltuk, és egy Phenyl-Superose HR 10/10 (Pharmacia) oszlopon kromatografáltuk ammónium-szulfát csökkenő lineáris gradiensében (1,7-0 M), az oszlopot előzőleg 0,1 M pH 8,0 TrisHC1, 5 mM DTT pufferrel egyenlítettük ki. A tisztítás befejezésére a proteineket végül ultrafiltrációs koncentrálás után, egy Bio-Sil 250 (Bio-Rad) oszlopon kromatografáltuk, 50 mM pH 7,5 Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 5 mM DTT oldattal eluálva.
Ezután a lépés után az enzim több mint 95%-os tisztaságú. SDS-PAGE-vel nem mutatható ki proteinszennyeződés. Az enzim molekulatömege ezzel a technikával 28 000. A tisztaságot az NH2-terminális szekvencia egységessége is alátámasztotta. A cob(I)alamin adenozil transzferáz tisztításának különböző lépéseit, a tisztítási faktorokat és a hatásfokot az alábbi táblázat tartalmazza a következő két szubsztrátra: diakvakobinamid (a) és hidroxokobalamin (b). Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az enzim a korrinoid szubsztrát természetére nézve nem specifikus. Másrészt, a bioszin15 tézis minden korrinoidját a kobirinsav diamid és a B12 között izolálták (Blanche és munkatársai nem publikált eredmények) natív formájukban, és azt találták, hogy ez a koenzim forma. Ez azt mutatja, hogy a cob(I)alamin adenozil transzferáz természetes szubsztrátja a kobirin20 sav a,c-diamid.
XIII. táblázat
A cob(I)alamin adenozil transzferáz tisztítása
Tisztítási lcpcs Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (egység/mg protein) Hatásfok* Tisztítási faktor (a)
Α» Bb
Nyers kivonat? 100 1400 5,4 3,4 - -
MonoQ 10/10 90 140 34,9 14,1 65 6,5
Phenyl-Superose 30 15,9 84,5 49,5 18 16
Bio-Sil 250 6,5 2,9 182,4 88,7 7,0 34
c) a PDlO-cn történt sótalanítás után
c) A Pseudomonas denitrificans cob(I)alamin adenozil transzferázának NH2-terminális szekvenciája, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitását kódoló génjének azonosítása.
A Pseudomonas denitrificans a 6.1.9 b) példában leírt módon tisztított cob(I)alamin adenozil transzferázának NH2-terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. 13 aminosavmaradékot azonosítottunk:
Ser-Asp-Glu-Thr-?-Val-Gly-Gly-Glu-Ala-Pro-Ala
-Lys-Lys
A COBO protein NH2-terminális szekvenciája (47. ábra) pontosan megfelel a cob(I)alamin adenozil transzferáz NH2-terminális szekvenciájának, azzal a kivétellel, hogy a 47. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenálással megállapított szekvenciát. Ebből az következik, hogy a metionin aminopeptidáz bizonyosan lehasítja in vivő az aminoterminális metionint (Ben Bassat és Bauer, 1987). A tisztított cob(I)alamin adenozil transzferáz SDSPAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 28000. A COBO protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 24000 (47. ábra). Az NH2-terminális szekvenciák és a molekulatömegek közötti megfelelés világosan jelzi, hogy a COBO protein a cob(I)alamin adenozil transzferáznak felel meg. A cobO gén a cob(I)alamin adenozil transzferáz struktúrgénje.
6.1.10 A cobN gén által kódolt COBN protein azonosítása
a) A hidrogenobirinsav a,c-diamidot kobirinsav a,cdiamiddá alakító aktivitás létezésének kimutatása
Ez a példa bemutatja egy, a kobalaminok bioszinté45 ziséhez közvetlenül kapcsolódó enzimaktivitás meglétének kimutatását, amelyet mind a mai napig nem írtak még le. A hidrogenobirinsav-a,c-diamidot kobirinsav a,c-diamiddá alakító aktivitásról van szó.
Ezt az aktivitást többek között a következő tipikus kísérlettel határoztuk meg. Az SC510 Rifr törzs nyers kivonatát 10 g nedves sejt 20 ml 0,2 M pH 8,0 Tris-HCl pufferben történő ultrahanggal roncsolásával, majd a sejttörmelék 1 órás, 50000 x g-nél történt centrifugálásával való eltávolításával kaptuk meg. E kivonat 1000 mg proteinjét 1 órán át 30 °C-on inkubáltuk szén 14-gyel jelzett hidrogenobirinsav diamiddal (32 nmol; 50 μΟ/μιηοΙ) 40 ml 0,2 M pH 8,0 Tris-HCl pufferben, amely 7 mM ATP-t, 200 μΜ CoCl2-t tartalmazott. A reakciót 7,5 ml 1 M KH2PO4 és 6 ml 0,3 M KCN hoz60 záadásával állítottuk le, amit 10 perces 80 °C-ra melegí32
HU 216 653 Β tés követett. 15 000 x g-nél 15 percig végzett centrifugálás után a felülúszó HPLC-analizise megmutatta: (1) az inkubálás során kialakult 19,2 nmol kobirinsav a,cdiamid specifikus radioaktivitása megegyezett a kiindulási hidrogenobirinsav a,c-diamidéval, és (2) ez utóbbi egy adott mennyisége eltűnt. Hogy megerősítsük, hogy valóban kobirinsav a,c-diamidról van szó, a terméket HPLC-vel tisztítottuk, majd 5% kénsavat tartalmazó metanolban észteresítettük (18 óra, 20 °C). A kobirinsav a,c-diamid pentametilészter valódiságát TLC-vel (egy referenciamintára vonatkoztatva) és tömegspektrometriával bizonyítottuk. Megjegyezzük, hogy hasonló inkubációs körülmények között, ahol a radioaktív markert nem a hidrogenobirinsav a,c-diamidba vezettük be, hanem a kobaltba (kobalt 57-et használva), kobalt 57-tel jelzett kobirinsav a,c-diamid szintetizálódott, és ebből ugyanazokat a következtetéseket lehetett levonni. A szén 14-gyel jelzett hidrogenobirinsav a,c-diamidot a következő módon kaptuk: in vitro szintetizáltunk hidrogenobirinsavat [metil- 14C]SAM-ot használva, majd átalakítottuk hidrogenobirinsav a,c-diamiddá, és a 6.1.2 példában leírt módon HPLC-n tisztítottuk.
Ez a vizsgálat megmutatta, hogy a kobalt beépülése a Pseudomonas denitrificansnál a hidrogenobirinsav a,cdiamid szintjén történik. A leírt feltételek között nem a hidrogenobirinsav a kobalttal történő enzimatikus kelátképzés szubsztrátja.
b) Az SC510 Rifr törzs egy, a hidrogenobirinsav a,cdiamid kobirinsav a,c-diamiddá alakításában részt vevő proteinjének tisztítása és meghatározása
A meghatározandó frakciót (0,5-2 egység) 60 percig 30 °C-on inkubáltuk az SC510 Rifr törzs fenti módon kapott nyers kivonatával, 7 mM ATP-vel, 200 μΜ CoCl2-dal, 7 μΜ C14 jelzett hidrogenobirinsav a,cdiamiddal (50 pCi/pmol) 400 μΐ 0,1 M pH 8,0 Tris-HCl pufferben. A reakciót 75 μΐ 1 M KH2PO4 és 60 μΐ 0,3 M KCN hozzáadásával, majd 10 perces 80 °C-ra melegítéssel állítottuk le. 15 000 x g-vel 15 percen át tartó centrifugálás után a felülúszót HPLC-vel analizáltuk, hogy meghatározzuk a kialakult kobirinsav a,c-diamid mennyiségét (v.ö. 9. példa). Az enzimaktivitás egységét úgy definiáltuk, mint az az enzimmennyiség, ami 1 nmol kobirinsav a,c-diamid kialakításához szükséges óránként a fenti körülmények között. Ilyen körülmények között úgy tűnt, hogy a pXL1909 plazmiddal transzformált (lásd 4.5.2 példa) SC510 Rifr törzs kivonata 20-50-szer magasabb aktivitást mutat, mint az SC510 Rifr törzs kivonata. Ezen az alapon tisztítottunk egy fehérjét, amely egyedül felelős ezért az aktivitásnövekedésért.
Egy tipikus tisztítási kísérletben a pXL1909 plazmiddal transzformált SC510 Rifr törzs nedves sejtjeinek 10 g-ját 20 ml 0,2 M pH 8,0 Tris-HCl pufferben szuszpendáltuk, és 30 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután 1 órás 50 000 x g-n végzett centrifúgálással összegyűjtöttük, és egy 0,1 M pH 8,0 Tris-HCl pufferrel (A puffer) kiegyenlített PD10 oszlopon (Pharmacia) sótalanítottuk. A proteinoldatot azután frakcionáltuk (213 mg protein minden kromatográfiában) egy Mono Q HR 10/10 oszlopon (Pharmacia) KC1 A pufferben kialakított 0-0,5 M gradiensével, majd az aktivitást tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, ultraszűréssel koncentráltuk, egy 0,1 M pH
7,2 Tris-HCl pufferrel (B puffer) kiegyenlített PD10 oszlopon (Pharmacia) sótalanítottuk, és egy Mono Q HR 5/5 oszlopon (Pharmacia) KC1 B pufferben előállított 0-0,5 M gradiensének segítségével kromatografáltuk. A tisztítás befejezéséül a proteint végül egy Bio-Sil 250 (Bio-Rad) oszlopon kromatografáltuk, 20 mM kálium-foszfát—50 mM nátrium-szulfát, pH 6,8 oldattal eluálva. Ezután a lépés után az enzim több mint 95%-os tisztaságú. SDS-PAGE-sel nem mutatható ki semmilyen proteinszennyeződés. Az enzim molekulatömege ezzel a technikával 135 000. Ezt a tisztaságot az NH2terminális szekvencia egységessége is alátámasztotta. Az SC510 Rifr törzs hidrogenobirinsav a,c-diamidot kobirinsav a,c-diamiddá alakításában részt vevő proteinje tisztításának különböző lépeseit, a tisztítási faktorokat és a hatásfokot az alábbi táblázat tartalmazza.
XIV. táblázat
Az SC510 Rifr törzs hidrogenobirinsav a,c-diamidot kobirinsav a,c-diamiddá alakításában részt vevő proteinjének tisztítása
Tisztítási lépés Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (egység/mg protein) Hatásfok Tisztítási faktor (1)
Nyers kivonat 31,5 1278 0,23 - -
MonoQ 10/10 44 79,2 2,4 64 10
Mono Q 10/10 21 33,6 6,8 78 30
Mono Q 5/5 3 6,6 16,0 36 70
Bio-Sil 250 L8 5,9 16,3 33 71
c) A Pseudomonas denitrificans hidrogenobirinsav a,c-diamidot kobirinsav a-c-diamiddá alakításában részt vevő proteinjének NH2-terminális szekvenciája, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitást kódoló struktúrgénjének azonosítása
A 6.1.10 b) példában leírt módon tisztított protein NH2-terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. Hat aminosavmaradékot azonosítottunk:
His-Leu-Leu-Leu-Ala-Gln
HU 216 653 Β
A COBN protein NH2-terminális szekvenciája (47. ábra) pontosan megfelel a tisztított protein NH2-terminális szekvenciájának, azzal a kivétellel, hogy a 47. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenálással megállapított szekvenciát. Ebből az következik, hogy a metionin aminopeptidáz bizonyosan lehasítja in vivő az aminoterminális metionint (Ben Bassat et Bauer, 1987). A tisztított protein SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 135 000. A COBN protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 138000 (47. ábra). Az NH2-terminális szekvenciák és a molekulatömegek közötti megfelelés világosan jelzi, hogy a COBN protein a hidrogenobirinsav a,c-diamidot kobirinsav a,c-diamiddá alakításában részt vevő proteinnek felel meg. A cobN gén ennek a proteinnek a struktúrgénje.
6.1.11 A CobP gén által kódolt COBP protein azonosítása
a) a kobinamid kináz aktivitás meghatározása.
Ez a példa bemutatja a kobalaminok bioszintézisének egy aktivitásának meghatározását, amelyet eddig még nem vizsgáltak. A kobinamid kináz aktivitásról van szó. Ez az aktivitás az Ado-kobinamid (R)-l-amino-2propanol maradékának hidroxilcsoportjának ATP-függő foszforilálását katalizálja, és így a kobinamid-foszfát keletkezik.
A meghatározandó frakciót sötétben, 30 °C-on 60 percig inkubáltuk 500 μΐ 0,1 M pH 8,8 Tris-HCl pufferben, ami 1 mM EDTA-t, 1 mM ATP-t, 2,5 mM MgCl2-t és 16 μΜ Ado-kobinamidot (Blanche et al., 1989) tartalmazott. A reakciót kálium-cianid 20 mM vizes oldatának 500 μΐ-ének hozzáadásával állítottuk le. 10 perces 80 °C-ra melegítés, és 10 perces 5000 x g-vel történő centrifügálás után a keletkezett kobinamid foszfátot, amely a felülúszóban volt jelen, HPLC-vel határoztuk meg (v. ö. 9. példa), a következő egyszerűsített lineáris gradienst alkalmazva: 25-30% B az A-ban 15 perc alatt, majd 30-100% B 12 perc alatt, és 3 perc 100%aB-ből.
Az aktivitási egységet úgy határoztuk meg, mint az az enzimmennyiség, ami 1 nmol kobinamid-foszfát kobinamidból való kialakításához szükséges 1 óra alatt a fenti körülmények között.
b) A kobinamid-foszfát guanililtranszferáz aktivitás meghatározása.
Ez a példa bemutatja a kobalaminok bioszintézisének egy aktivitásának meghatározását, amit a mai napig még nem vizsgáltak. A kobinamid-foszfát guanililtranszferáz aktivitásról van szó. Ez egy GTP molekula GMP részének addícióját katalizálja az Ado-kobinamid-foszfátra, és így egy molekula GDP-kobinamid keletkezik, és egy foszfátmolekula szabadul fel.
Ezt az aktivitást ugyanolyan körülmények között határoztuk meg, mint a kobinamid kinázt, azzal a kivétellel, hogy az Ado-kobinamidot és az ATP-t az Adokobinamid-foszfát (16 μΜ) (Blanche és munkatársai, 1989) és a GTP (2 mM) helyettesítette az inkubáció folyamán.
Az enzimaktivitás egységét úgy határoztuk meg, mint az az enzimmennyiség, ami 1 nmol GDP-kobinamid kobinamid-foszfátból történő előállításához szükséges óránként a fenti körülmények között.
c) A kobinamid kináz tisztítása
A 6.1.11 a) példában leírt meghatározásból kiindulva megvalósítottuk a Pseudomonas denitrificans kobinamid kinázának tisztítását, amint azt itt leírjuk.
Egy tipikus tisztítási kísérletben a pXL623 plazmiddal (lásd a 4.5.2 példát) transzformált SC510 Rifr törzs nedves sejtjeinek 5 g-ját 20 ml 0,1 M pH 7,6 Tris pufferben (A puffer) ultrahanggal roncsoltuk. Centrifügálás (50000 x g, 1 órán át) és 4 óra A pufferrel szembeni dializálás után 4,5 ml visszamaradt anyagot egy A pufferrel kiegyenlített Mono Q HR 10/10 oszlopra injektáltunk. A proteineket 0,4 M NaCl lineáris gradiensével eluáltuk, és az aktív frakciókat összegyűjtöttük, és egy 30 mM Tris-HCl-5 mM kálium-foszfát-5 μΜ kálciumklorid pH 7,6 pufferrel (B puffer) kiegyenlített PD10 (Pharmacia) oszlopon engedtük át. A proteinoldatot egy B pufferrel kiegyenlített Bio-Gel HPHT (Bio-Rad) oszlopon frakcionáltuk, 5-35-1 mM kálium-foszfáttal eluálva. Az aktív frakciókat összegyűjtöttük, és 500 mM ammónium-szulfátba vittük át, majd egy Phenyl-Superose HR 5/5 (Pharmacia) oszlopon frakcionáltuk, ammónium-szulfát csökkenő gradiensével eluálva.
Az aktivitást tartalmazó frakciót végül egy Mono Q HR 5/5 oszlopon újra tisztítottuk Tris-HCl-ben, pH 7,3-nál. Ezután a lépés után a protein több mint 97%os tisztaságú. Az SDS-PAGE nem mutat semmilyen fehéijeszennyeződést. Ezt a tisztaságot az NH2-terminális szekvencia egységessége is alátámasztotta. Az enzim molekulatömege ezzel a technikával 20000. A kobinamid kináz tisztításának különböző lépéseit, a tisztítási faktorokat és a hatásfokot az alábbi táblázat tartalmazza.
XV. táblázat
A Pseudomonas denitrificans kobinamid kináz-kobinamid-foszfát guanililtranszferázának tisztítása
Tisztítási lépés Térfogat (ml) Protein (mg) Kobinamid kináz Kobinamid-foszfát guanililtranszferáz specifikus aktivitás (egység/mg protein) Specifikus aktivitás aránya 2/1
Specifikus aktivitás (egység/mg protein) Hatásfok (%) Tisztítási faktor
Nyers kivonat* 4,5 120 16 - - 214 13
Mono Q HR 10/10 9,0 8,98 188 88 12 - -
Hidroxil-apatit 2,0 4,55 325 77 20 3640 11
HU 216 653 Β
XV. táblázat (folytatás)
Tisztítási lépes Térfogat (ml) Protein (mg) Kobinamid kináz Kobinamid-foszfát guanililtranszferáz specifikus aktivitás (egységzmg protein) Specifikus aktivitás aránya 2/1
Specifikus aktivitás (egység/mg protein) Hatásfok (%) Tisztítási faktor
Phenyl-Superose 2,0 1,51 560 44 35 - -
Mono Q HR 5/5 3,0 0,90 786 37 49 11282 14
Kobalt nélküli PS4 tápközegben tenyésztett (Cameron és munkatársai, 1989) SC510 pXL622 nedves sejtjeinek 1 g-jából kiindulva
A kobinamid kináz aktivitást tartalmazó frakciók kobinamid-foszfát guaniziltranszferáz aktivitást is mutatnak. Másrészt, amint azt a fenti táblázatban lévő eredmények is mutatják, e két aktivitás aránya konstans marad a frakciókban az egész tisztítás során. Végül, a tisztított protein tisztasága nagyon magas fokú, meghaladja a 97%-ot. Ezen eredmények kétségkívül azt jelzik, hogy egy és ugyanaz a protein felelős a két egymás utáni aktivitásért, amelyek a kobalaminok bioszintézisének kobinamid kináz és kobinamid-foszfát guaniziltranszferáz aktivitásai a Pseudomonas denitrificansnál.
d) A Pseudomonas denitrificans kobinamid kináz-kobinamid-foszfát guaniziltranszferázának NH2terminális szekvenciája, és a Pseudomonas denitrificans ezt az aktivitást kódoló struktúrgénjének azonosítása
A Pseudomonas denitrificans kobinamid kináz-kobinamid-foszfát guaniziltranszferázának NH2terminális szekvenciáját a korábban leírt módon határoztuk meg. Tíz aminosavmaradékot azonosítottunk:
Ser-Ser-Leu-Ser-Ala-Gly-Pro-Val-Leu-Val
A COBP protein NH2-terminális szekvenciája (47. ábra) pontosan megfelel a tisztított protein NH2-terminális szekvenciájának, azzal a kivétellel, hogy a 47. ábrán bemutatott szekvencián egy metionin előzi meg a direkt szekvenálással megállapított szekvenciát. Ebből az következik, hogy a metionin aminopeptidáz bizonyosan lehasítja in vivő az aminoterminális metionint (Ben Bassat et Bauer, 1987). A tisztított kobinamid kináz-kobinamid-foszfát guaniziltranszferáz SDS-PAGE elektroforézissel becsült molekulatömege 20000. A COBP protein szekvenciájából következtetett molekulatömege 19500 (47. ábra). Az NH2-terminális szekvenciák és a molekulatömegek közötti megfelelés világosan jelzi, hogy a COBP protein a kobinamid kináz-kobinamid foszfát guaniziltranszferáznak felel meg. A cobP gén a kobinamid kináz-kobinamid-foszfát guaniziltranszferáz struktúrgénje.
6.2 - A COB proteinek tulajdonságainak meghatározása a bioszintézis köztes termékeinek felhalmozódásának mérésével
Ez a példa bemutatja, hogyan lehetséges a Pseudomonas denitrificans egy COB proteinjének egy enzimaktivitást tulajdonítani. Ezt az aktivitást a kérdéses lépésben gátolt Cob mutánsnál vagy mutánsoknál a bioszintézis köztes termékeinek felhalmozódására vonatkozólag kapott adatok alapján tulajdonítottuk az adott proteinnek. Valóban, ha egy mutáns falhalmoz egy bioszintézis köztes terméket, nagyon valószínű, hogy ez a mutáns gátolt abban a lépésben, amelynek szubsztrátja a kérdéses köztes termék.
6.2.1 A COBC és COBD proteinek jellemzői A Cob G643 (Agrobacterium tumefaciens) és
G572 (Pseudomonas putida) mutánsok, amelyeket az 1. és a 4. példában már leírtunk, a COBC proteinnek megfelelő lépésben blokkoltak. Valóban e két mutáns nem komplementálható a Tn5 transzpozon cobC génben található inaktiváló inszercióval. A két mutáns törzset G643 és G572 - valamint a nem mutált szülőtörzseket [C58-C9 Rifr és KT 2440 RiP (Cameron et al., 1989)] az Agrobacterium tumefaciens esetében PS4’ tápközegben, a P. putida esetén PS4” tápközegben tenyésztettük (PS4’ és PS4” olyan PS4 tápközegek, amelyek 100szor, illetve 1000-szer kevesebb kobaltot tartalmaznak, mint a korábban leírt PS4) 3 napig, amint fentebb leírtuk. A kultúrákhoz 57CoCl2-ot adtunk (2,5 pCi/0,1 pm 25 ml tenyészethez). Az intracelluláris korrinoidokat natív formában izoláltuk, és HPLC-n azonosítottuk. A szülőtörzsek a koenzim B,2-n kívül nem halmoznak fel korrinoidot. A két mutáns, a G643 és a G572, adenozilált kobirinsavat halmoz fel 11% és 6% arányban. Ezt a %-os arányt a szülőtörzsben szintetizált koenzim B)2 szintjéhez viszonyítva számoltuk. A kobirinsavon kívül a G643 mutáns kobirinsav pentaamidot is felhalmoz 2% arányban; a kobirinsav pentaamid a kobirinsavat megelőző köztes termék. E mutánsok vizsgálata kimutatta, hogy a mutánsok a kobirinsav után gátoltak. Ezek a mutánsok vagy az urogén III és kobinamid, vagy a kobinamid és a kobalaminok között gátoltak. A G643 és G572 mutánsok az urogén III és a kobinamid között gátoltak. Márpedig ha ezek a mutánsok a kobinamid előtt gátoltak, és mindkettő kobirinsavat halmoz fel, akkor a kódolt proteinek csak abban az enzimreakcióban vehetnek részt, amely egy amino-propanol-maradék segítségével a kobirinsav amidálását katalizálja (ezt kobinamid szintetáznak nevezik), és így a kobinamid keletkezik; esetleg a reakció azon szubsztrátjának szintézisében is részt vehetnek, amely az aminopropanolt szállítja, ha ez nem maga az aminopropanol. A cobC gén egy olyan proteint kódol, amely vagy a kobinamid szintetáz, vagy annak egy alegysége. Az Agrobacterium tumefaciens G634 Cob mutánsát, amely a cobD génnek megfelelő lépésben gátolt, ugyanezen a módon analizáltuk. Ezt a mutánst nem komplementálják a cobD génben lévő inaktiváló inszerciók (4.1 példa). Az egyetlen intracelluláris korrinoid, amit ezeknél a mutánsoknál találtunk, az adenozilált kobirinsav. Mint az előző esetben is, ezek a mutánsok egy olyan proteint kódolnak, amely a kobi35
HU 216 653 Β rinsav kobinamiddá alakításában vesz részt, vagy esetleg a reakció egy másik szubsztrátjának szintézisében.
Ez a két különböző gén (cobC és cobD) két olyan proteint kódol, amelyek ugyanabban a lépésben vesznek részt.
6.2.2 A COBF-COBM proteinek jellemzői
Azokat a már leírt Agrobacterium tumefaciens mutánsokat vizsgáltuk, amelyekről a 4.2 példában leírt vizsgálatok alapján tudjuk, hogy melyik génben gátoltak. Ezek a mutánsok: Gól2 (cobF), Gól5 (cobG), Gól6 (cobH), G613 (cobl), G611 (cobJ), G620 (cobK), G638 (cobL) és G609 (cobM); zárójelben azokat a Pseudomonas denitrificans géneket adtuk meg, amelyek e mutánsok komplementációjáért felelősek (5. példa), amelyek tehát a mutánsok mutált génjeinek felelnek meg. Ezeket a mutánsokat a korábban leírt módon PS4 tápközegben tenyésztettük, jelölt kobaltot használva. Négynapos inkubáció után a mutánsokat analizáltuk korrinoid és deszkobaltkorrinoid természetű intracellu10 láris tartalmukra vonatkozóan (v.ö. 6.1.2 és 9. példa).
XVI. táblázat
A Pseudomonas denitrificans 8,7 kb fragmentumának génjeiben gátolt Agrobacterium tumefaciens mutánsok felhalmozódott köztes termékei
Szülőtörzs Intracelluláris deszkobaltkorrinoid %-ban1 Intracelluláris korrinoid a kobalaminok %-ában Mutáns gén
HAB HABM HABD
C58-C9* 100 100 100 koenzim B|2 -
G6I2 <5 <5 64 kobinamid 2,2 koenzim B)2 34 cobF
G615 <5 <5 84 koenzim B[2 17 cobG
G616 35 <10 <10 koenzim B12 13 cobH
G613 <5 <5 57 koenzim B|2 <1 cobl
G611 <5 <5 65 koenzim B]2 <1 cobJ
G620 12 <5 <10 koenzim B)2 < 1 cobK
G638 <5 <5 47 koenzim Bi2 < 1 cobL
G609 <5 <5 33 koenzim B|2 <1 cobM
HAB: hidrogenobirinsav
HABM: hidrogenobirinsav-monoamid
HABD: hidrogenobirinsav-diamid *a már leírt C58-C9 RiP Nalr törzsről van szó (Cameron és munkatársai, 1989) 'az értekek a nem mutált C58-C9 RiP Nalr szülőtörzs azonos köztes termékének %-ában vannak megadva
Ezek az eredmények azt mutatják, hogy egyik mutáns sem halmoz fel egy korrinoidot sem (a cobF génben inaktivált Gól2 mutánst kivéve, amely kobinamidot halmoz fel, de a nem mutáns törzs által szintetizált kobalaminok 2,2%-ának megfelelő nagyon alacsony szinten), mégis bizonyos mutánsok (G612, Gól 5 és Gól6) kobalaminszintje magasabb, mint a szülőtörzs kobalaminszintjének 10%-a. Lehetséges, hogy ezek a mutánsok a kobirinsav diamid előtt vannak gátolva. Mindezek a mutánsok magasabb szinten halmoznak fel hidrogenobirinsavat és hidrogenobirinsav diamidot, mint a nem mutált szülőtörzs; valószínűleg ezek a hidrogenobirinsav előtt gátoltak. Azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a cobF-cobM gének mindegyike olyan proteineket kódol, amelyek a hidrogenobirinsav előtt vesznek részt a bioszintézisben. Tudjuk, hogy a Gól3 mutáns a cobl génben mutált, ami az SP2MT-t kódolja, amely valóban a hidrogenobirinsav előtt van. E mutánsnál a jelen példa az köztes termékek felhalmozódására vonatkozó eredményei tökéletes összhangban vannak az e mutánsnál inaktivált lépéssel, tudniillik ez a mutáns a hidrogenobirinsav után nem halmoz fel semmilyen intermediert a szülőtörzsnél megfigyeltnél magasabb szinten. Az ered40 mények a cobF, cobJ, cobL és cobM gének esetén összefüggenek a 6.4 példa eredményeivel, ahol feltételeztük, hogy ezek a gének olyan proteineket kódolnak, amelyek a metil SAM-fiiggő transzferét katalizálják, és így a hidrogenobirinsav előtti reakciókban vesznek részt. A cobl kivételével, ami az SP2MT struktúrgénje, ezek a gének a prekorrin-3 után vesznek részt a bioszintézisben. Valóban, mivel ezek nem a SUMT, és nem az SP2MT struktúrgénjei, jóval később, azaz a prekorrin-3 után fordulnak elő (műiden a jelen találmányban leírt cob gén az urogén III és a kobalaminok között vesz részt a bioszintézisben). Ezek a gének, cobF-től cobH-ig és cobJ-től cobM-ig olyan enzimeket kódolnak, amelyek a prekorrin-3 és a hidrogenobirinsav között találhatók.
6.2.3 A COBS és a CBI proteinek jellemzői
Az 1. és a 4.3 példában leírt G2035 mutáns a COBS proteinnek megfelelő lépésnél gátolt. Az 1. példában leírt G2037 mutáns a COBT proteinnek megfelelő lépésnél gátolt. Ezeket a törzseket, valamint a szülőtörzseket (Agrobacterium tumefaciens C58C9Rifr) PS4’ tápközegben (olyan PS4 tápközegről van szó, ahol a
HU 216 653 Β kobalt-klorid koncentrációja 100-szor kisebb, mint a PS4 tápközegben) tenyésztettük radioaktív 57CoC12 jelenlétében 3 napig, intracelluláris deszkobaltkorrinoid, valamint korrinoidtartalmukat analizáltuk, amint azt fentebb leírtuk (v.ö. 6.2.2 példa). A G2035 és a G2037 törzsek nem halmoznak fel korrinoidokat, és a hidrogenobirinsav és a hidrogenobirinsav mono- és diamid magas koncentrációban (nagyobb, mint a szülőtörzsnél megfigyelt) csak a G2035 törzsnél volt jelen. Ez a mutáns valószínűleg a hidrogenobirinsav diamid után és a kobirinsav diamid előtt elhelyezkedő lépésnél gátolt. Ebből következően a cobS gén egy, a hidrogenobirinsav diamidot kobirinsav diamiddá átalakító enzimet kódolna; ez a protein tehát vagy a kobalt beépítésében, vagy a nem adenozilált kobirinsav a,c-diamid kobaltjának redukciójában vehet részt. Ezzel ellentétben, a G2037 mutáns egy, a hidrogenobirinsav felett elhelyezkedő lépésben gátolt. A cobT gén egy, a hidrogenobirinsav feletti, és a prekorrin-3 alatti enzimatikus lépésben részt vevő proteint kódolna (más, a prekorrin alatt részt vevő enzimeket már azonosítottunk). Egy másik lehetőség a COBT protein esetén, hogy, amint azt az 5. példában feltételeztük, kobaltkötő proteinként és/vagy más protein(ekkel) savas részén keresztül kapcsolatot teremtő proteinként működik.
6.2.4 A COBV protein jellemzői
Az 1. és a 4.4 példában leírt G2039 és G2040 mutánsok a COBV proteinnek megfelelő lépésnél gátoltak. Ezeket a törzseket, valamint a szülőtörzset PS4’ tápközegben 3 napig tenyésztettük radioaktív 57CoC12 jelenlétében, majd intracelluláris deszkobaltkorrinoid-tartalmukat analizáltuk, és korrinoidtartalmukat meghatároztuk, amint azt a 9. példában leírjuk. A G2039 és a G2040 törzsek kobirinsavat, kobinamidot, kobinamidfoszfátot és GDP-kobinamidot halmoznak fel. Ezek a mutánsok valószínűleg egy, a GDP-kobinamid alatti enzimatikus lépésben gátoltak. A cobV gén egy, a GDPkobinamid kobalaminná alakításában részt vevő enzimet kódolna, lásd az 5. ábrát. Ez az eredmény tökéletes összhangban van azzal, hogy a COBV proteinnek szubsztrátként Ado-GDP-kobinamidot használó kobalamin (5’-foszfát) szintetáz aktivitása van.
6.3 A COB proteinek aktivitásának meghatározása a SAM-hoz való affinitási vizsgálatokkal
Ez a példa bemutatja, hogyan lehetséges a Pseudomonas denitrificans tisztított COB proteinjeiből kiindulva in vitro meghatározni egy SAM-kötő aktivitást. Ha egy COB protein rendelkezik ilyen aktivitással, ez azt jelzi, hogy ez a COB protein a bioszintézis egyik metiltranszferáza, és hogy a nyolc metilcsoporttranszfer egyikében vesz részt, ami az urogén III és a kobirinsav között végbemegy.
6.3.1 Egy tisztított protein SAM-hoz való affinitásának tesztelése
A teszt azon az alapgondolaton nyugszik, hogy a kobalaminok bioszintézisének metiltranszferázai bizonyosan rendelkeznek egy SAM-kötő hellyel. A hely létezését az valószínűsítheti, hogy a SAM-hoz való affinitás sokkal magasabb, mint azon proteineké, amelyek nem kötik a SAM-ot specifikusan. A vizsgált protein feleslegben lévő radioaktív SAM jelenlétében inkubálása után a proteint egy gélpermeációs kromatográfiával elválasztottuk a szabad SAM-tól. A protein molekulatömegének frakciójában talált radioaktivitás az inkubáció alatt megkötött SAM-nak felel meg. A kromatográfiát 2 °C-on végeztük, hogy maximálisan csökkentsük a szeparáció alatt a SAM felszabadulását.
A proteint (körülbelül 10 pg) 10 percig 30 °C-on 200 pl 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl-ben inkubáltuk 5 nmol [metil-3H]-SAM-mal (1 pCi). Az inkubáció után 100 pl elegyet azonnal egy TSK-125 oszlopra (Bio-Rad) injektáltunk, és 1 ml/perc átfolyási sebességgel az oszlopot forgalmazók által ajánlott 50 mM nátrium-szulfát/20 mM nátrium-dihidrogén-foszfát pH 6,8 eleggyel eluáltuk. 0,5 ml-es frakciókat gyűjtöttünk, és szcintillációs folyadékban mértük azokat. A protein és a SAM retenciós idejét az eluátum 280 nm-nél mért abszorbeanciája alapján kaptuk meg.
6.3.2 A SAM kötődésének in vitro vizsgálata a Pseudomonas denitrificans COBA és COBF proteinjeinél
a) A COBF és a COBA proteinek tisztítása
A Pseudomonas denitrificans COBF proteinjét az itt következőkben leírtak szerint tisztítottuk. Egy tipikus tisztítási kísérletben a pXL1546 plazmiddal (lásd a 7.3 példát) transzformált SC510 RiP törzs nedves sejtjeinek 5 g-ját, amelyet PS4 tápközegben tenyésztve kaptunk, 30 ml 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl oldatban szuszpendáltunk, és 15 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk. A nyers kivonatot azután 1 órás 50000 g-vel történt centrifügálással összegyűjtöttük, és a felülúszót egy DEAESephadex oszlopon (1 ml gél) engedtük át, hogy a jelen lévő tetrapirrolvegyületeket eltávolítsuk. Ebből a kivonatból 10 mg proteint azután egy ugyanazzal a pufferrel kiegyenlített Mono Q HR 5/5 oszlopra injektáltunk. A proteineket KC1 lineáris gradiensével (0-0,25 M) eluáltuk. A COBF protein 0,20 M KCl-dal eluálódott. Ezt a proteint kétszer hígítottuk 0,1 M pH 7,7 Tris-HCl-lel, és másodszor is egy Mono Q HR 5/5 oszlopon tisztítottuk. A protein láthatóvá tételére SDS-PAGE elektroforézist és Comassie kék előhívást alkalmaztunk. Ez a technika másrészt megmutatja, hogy a COBF körülbelül 95%-os tisztaságú ezután a tisztítási lépés után. A protein NH2terminális szekvenciáját a korábban leirt módon határoztuk meg. Minden degradációs ciklusban két NH2-terminális szekvencia látszott ugyanabban az időben; ezek a következő szekvenciák voltak, az arányt is jelölve:
1. szekvencia (34% mennyiségben)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Alá Glu Alá Gly Met Arg Lys Ile Leu Ile Ile
2. szekvencia (66% mennyiségben)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Met Arg Lys Ile Leu Ile Ile Gly Ile Gly Ser
Az 1. szekvencia a COBF protein NH2-terminális szekvenciájának felel meg, amit a 16. ábrán adtunk meg, azzal a kivétellel, hogy a már ismert megoldások szerint az aminoterminális metionin lehasadt (Hírei et al., 1989) a metionin aminopeptidáz működése következtében (Ben Bassat et Bauer, 1989). A 2. szekvencia, amelynek mennyisége jelentősebb, ugyanannak a proteinnek felel meg, de itt a transzláció nem annál az ATG37
HU 216 653 Β nél kezdődött, amit mi feltételeztünk, hanem a kódoló fázison 5 kodonnal lejjebb elhelyezkedőnél (16. ábra). Valóban, e szekvencia aminosavai pontosan megegyeznek azzal, amit a COBF protein szekvenciájában találtunk e szekvencia második metioninjától (6. számú aminosav) kezdődően (16. ábra). Ebben az esetben az aminoterminális metionin nem hasadt le, ez megerősíti a korábbi megoldásokat (Hírei és munkatársai, 1989). A pXL1546 plazmidot hordozó SC510 Rifr törzsnél két transzlációs kezdőhely van, egyrészt az, amelyik megfelel a mi konstrukciónkban a Shine-Dalgamo szekvenciától megfelelő távolságban levő metioninnak, a másik az, amelyik a második metionin a 16. ábrán bemutatott cobF gén szekvenciáján. Ebből az következik, hogy valószínűleg a COBF protein nem a 16. ábrán jelölt metioninnál kezdődik, hanem az 5 aminosawal távolabb elhelyezkedőnél.
Mindenképpen ezek az eredmények azt mutatják, hogy valóban a COBF protein fejeződik ki, és hogy ez a protein 4 aminosawal meghosszabbított formában fejeződik ki. A tisztítás során a protein két formáját tisztítottuk. Ebben a példában tisztított COBF proteinnek nevezzük e két protein keverékét.
A Pseudomonas denitrificans COBA proteinjét a korábban leírt módon tisztítottuk (Blanche és munkatársai, 1989).
b) A SAM kötődése
A SAM kötődését e két proteinhez a 6.3.1. a) példában már leírt módon vizsgáltuk. Negatív kontrollként szarvasmarhaszérum-albumint és a COBH proteint használtuk. A COBA és a COBF protein esetén egy radioaktív csúcsot figyeltünk meg a TSK-125 oszlop kimenetén e két protein ideje alatt (20. ábra). Ebben a tesztben a COBI protein ugyanolyan SAM-kötődési jellemzőket mutat. Ezzel ellentétben nincs radioaktív csúcs a BSA-val és a COBH proteinnel. Ez a teszt a SAM in vitro kötődését valósítja meg a COBA, COBI és COBF proteinekhez. Ezek az eredmények megmutatják, hogy a COBA, COBI és COBF proteinek SAM-metiltranszferázok. Ez az eredmény teljesen összhangban van a COBA és a COBI aktivitásával, mivel ezekben az esetekben a Pseudomonas denitrificans SUMT-áról és az SP2MT-áról van szó. A COBF protein tehát valószínűleg a kobalaminok bioszintézisének egy SAM-metiltranszferáza. Ez a teszt alátámasztotta, hogy a COBF egy metiltranszferáz.
6.4 - A COB proteinek aktivitásának meghatározása szekvenciahomológia-vizsgálatokkal
Ez a példa bemutatja, hogy a Pseudomonas denitrificans különböző COB proteinjeinek szekvenciájának összehasonlításával hogyan lehetséges azokat a COB proteineket megtalálni, amelyek a kobalaminok bioszintézisének S AM-metiltranszferázai.
A COBI és a COBA proteinek mindegyike a bioszintézis SAM-metiltranszferáza. Ezt a két proteint Kanehisa programja szerint (1984) összehasonlítottuk. Ez az összehasonlítás három erősen homológ régiót emel ki (21. ábra). E régiók mindegyikében több mint 45%-os a szorosan vett homológia a két protein között. A COBA és a CYSG között szintén három homológ régiót mutatunk be (22. ábra); Ezek a COBA ugyanazon régiói, amelyek a COBI-vel erős homológiát mutatnak. A COBA, CYSG és COBI ezen erősen homológ régiói homológiát mutatnak más COB proteinekkel is. A COBF, COBJ, COBL és COBM proteinekről van szó (23. ábra). Ami az 1. régiót illeti, a COBF, COBL és COBM proteinek Kanehisa programja szerint (1984) szignifikáns homológiát mutatnak a Genpro minden proteinjéhez viszonyítva, amely a Genbank egy proteinkivonata (59. változat), ahol a valószínű felső kódolórégiók 200 aminosawal meg vannak hosszabbítva. Ami a 2. régiót illeti, a COBJ, COBL és COBM proteinek szignifikáns homológiát mutatnak a Genpro (59. változat) összes proteinjéhez viszonyítva. Ami a harmadik homológ régiót illeti, a COBJ, COBL és COBM szignifikáns homológiát mutatnak a Genpro (59. változat) összes proteinjéhez viszonyítva. A szekvenciák összehasonlítása tehát lehetővé tette, hogy megállapítsuk, hogy négy protein, a COBF, COBJ, COBL és COBM szignifikáns homológiát mutatnak a metil-transzferáz három típusának, a COBA, COBI és COBF proteinek szekvenciájának konzervatív régióival. A COBG, COBH és COBK proteinek nem mutatnak szignifikáns homológiát a metilázok konzervatív régióival. A COBF protein az 1. régióban mutat szignifikáns homológiát a többi proteinnel. Ezek a homológiák valószínűleg annak a ténynek felelnek meg, hogy ezek a proteinek mind metiltranszferázok. Ez az eredmény egybevág azzal a COBF-re leírt biokémiai adattal, hogy ez a protein rendelkezik in vitro SAM-kÖtő kapacitással (6.3 példa). Ezek a homológiák egyrészt lehetővé teszik annak megerősítését, hogy a COBF kobalaminok bioszintézisének egy metiltranszferáza, másrészt rávilágítanak, hogy a COBJ, COBL és COBM a kobalaminok bioszintézisének metiltranszferázai lehetnek. Ezek az eredmények rámutatnak a Pseudomonas denitrificans COB proteinjei és más mikroorganizmusok azonos funkciójú proteinjei között fennálló homológiára.
6(B). példa - A Metanobacterium ivanovii SUMTának struktúrgénjének tisztítása és klónozása
Ez a példa bemutatja, hogyan lehetséges más mikroorganizmusok esetében a Pseudomonas denitrificansnál azonosítottaknak megfelelő COB enzimeket és cob géneket megkapni.
6(B).l A Metanobacterium ivanovii SUMT-ának tisztítása
Ez a példa a Metanobacterium ivanovii SUMT-ának tisztítását és katalitikus sajátságainak vizsgálatát írja le.
A Metanobacterium ivanovii DSM2611 törzset a már leírt módon tenyésztettük (Souillard és munkatársai, 1988). 12 g nedves sejtet kaptunk. Ezt 80 ml 0,1 M pH 7,6 Tris-HCl pufferben szuszpendáltuk, ami 5 mM DTT-t és 1 mM EDTA-t tartalmazott, és 1 óra 30 percig 4 °C-on ultrahanggal roncsoltuk, majd 1 órán át 50000 g-vel centrifugáltuk. A kivonatot azután ugyanabban a pufferben egy kis DEAE-Sephadex A25 oszlopra vittük fel, hogy megszabadítsuk a szabad tetrapirrolvegyületektől. Az 55 és 75% közötti telítettségű ammónium-szulfátban kicsapódott proteineket egy 0,1 M pH 7,5 Tris-HCl, 0,5 mM DTT, 1,7 M ammó38
HU 216 653 Β nium-szulfát pufferben feloldottuk, és egy PhenylSuperose HR 10/10 oszlopra injektáltuk, amit ammónium-szulfát csökkenő gradiensével (1,7 M-0 M) eluáltunk. Az aktív frakciókat egy 0,1 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,5 mM DTT, 25% glicerol (A puffer) pufferrel kiegyenlített Sephadex G-25 oszlopon engedtük át, majd egy A pufferrel kiegyenlített Mono Q HR 5/5 (Pharmacia Franciaország SA) oszlopra injektáltuk, amit K.C1 0-0,3 M gradiensével eluáltunk; ezt a lépést másodszor is megismételtük ugyanilyen körülmények között. Az előző lépés aktív frakciójának gélpermeációs kromatográfiája Bio-Sil TSK-250-en (BioRad Franciaország SA) lehetővé tette, hogy SDS-PAGE-n és fordított fázisú HPLC-n (C-18 pBondapak) homogén proteint kapjunk. A tisztítás különböző lépéseit, a hatásfokot és a tisztítási faktort az alábbi táblázatban írtuk le.
Amint ez a táblázat mutatja, a teljes tisztítási faktor nagyobb mint 4500. A tiszta enzim jellemzőit a már leírt eljárások szerint vizsgáltuk (Blanche és munkatársai, 1989). Ez az enzim valóban SUMT aktivitással rendelkezik, azaz valóban két metilcsoport SAM-fuggő transzferét katalizálja az urogén III C-2-re és C-7-re. Az enzim gélpermeációval becsült molekulatömege 60000 +/- 1500, míg SDS-PAGE-sel ez 29000, ez világosan mutatja, hogy egy homodimer enzimről van szó. A már leírt feltételek között (Blanche és munkatársai, 1989) az enzim Km-je az urogén ΠΙ-ra vonatkozóan 52 +/- 8 nM. Ráadásul ezt az enzimet 20 μΜ-nál kisebb koncentrációban nem gátolja a saját szubsztrátja, annak ellenére, hogy a Pseudomonas denitrificans
SUMT-át az urogén III 2 μΜ-nál magasabb koncentrációban gátolja (Blanche és munkatársai, 1989).
XVII. táblázat
A M. ivanovii SUMT-ának tisztítása
Tisztítási lcpcs Térfogat (ml) Proteinek (mg) Specifikus aktivitás (egységárig protein) Hatásfok Tisztítási faktor (1)
Nyers kivonat 92 731 0,337 - -
55-75% ammóniumszulfát 7,1 153 1,215 76 3,6
Phenyl-Superose 9,5 8,34 15,35 52 46
Mono Q 5/5 1,0 0,252 422 43 1252
Bio-Sil TSK 1,0 0,061 1537 38 4561
A M. ivanovii SUMT-ának Vmax-t meghatároztuk. Ez 1537 egység/mg protein. Ez az érték nagyobb, mint az, amit a Pseudomonas denitrificans SUMT-ára találtunk, melyet a reakció optimális körülményei között 489 egység/mg proteinnek határoztak meg (figyelembevéve az urogén III gátlását) (Blanche és munkatársai, 1989).
6(B).2 A M. ivanovii SUMT-ának struktúrgénjének klónozása E. colinál.
6(B).2.1 A M. ivanovii SUMT-ának struktúrgénjének egy belső fragmentumának klónozása. Ehhez a következő módon jártunk el: az NH2-terminális szekvenálásához 200 pikomol M. ivanovii SUMT-t használtunk, a szekvenálást a már korábban leírt módon végeztük. Másrészt egy, a protein tripszines emésztésével kapott fragmentumot szintén NH2-terminális szekvenálásnak vetettünk alá. A kapott szekvenciákat a 48. ábrán mutatjuk be. Az értelmes és értelmetlen 946, 923 és 947 oligonukleotidokat a korábban már leírt módon szintetizáltuk (lásd a 48. ábrát); ezek az oligonukleotidok 5’ végükön egy restrikciós helyet tartalmaznak, ami vagy EcoRI az értelmes oligonukleotidoknál, vagy HindlII az értelmetleneknél. Ezeket az oligonukleotidokat egy enzimatikus DNS-amplifikációs kísérletben használtuk (Saiki és munkatársai, 1988), amint a 48.B. ábrán ábrázoltuk.
A M. ivanovii genomiális DNS-ét a következő módon állítottuk elő: a M. ivanovii (DSM 2611) sejtjeinek 0,4 g-ját 0,15 M NaCl-oldattal mostuk. A sejteket azután 25% szacharóz, 50 mM pH 8 Tris-HCl, 40 mg lizozimoldat 4 ml-ében, 40 mg proteináz K és 5 ml 0,2% SDS, 0,1 M pH 8 EDTA-oldat hozzáadása után 2-3 órán át 50 °C-on inkubáltuk. A DNS-t ezután kétszer fenol-kloroformmal (50-50%), majd kétszer kloroformmal extraháltuk, azután izopropanollal kicsaptuk, és 3 ml TNE-ben (10 mM pH 8 Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl) felvettük.
A M. ivanovii DNS-ének enzimatikus amplifikációját Saiki és munkatársai, 1988 módszerét követve végeztük, 0,1 ml-es térfogatban, 600 ng M. ivanovii DNSsel, a 946. és 947. (1. reakció), vagy a 923. és a 947. (2. reakció) printereket alkalmazva. A reakcióban használt puffer a következő: 1 mM MgCl2, 50 mM KC1, 0,001% zselatin és minden dNTP 0,2 mM koncentrációban; minden amplifikációs reakcióhoz 10 mg-ot használtunk minden oligonukleotidból, valamint 2,5 egység Taq DNS polimerázt (Cetus Corporation). Az amplifikációt 30 ciklusban, a Perkin-Elmer Cetus DNS amplifikációs rendszerben végeztük; minden ciklusban a DNS-t 1 percig 95 °C-on denaturáltuk, az oligonukleotid printereket az egyszálú DNS-hez hibridizáltattuk 2 percig 38 °C-on, és az új szálakat 3 percig 72 °C-on polimerizáltuk. Az amplifikáció termékeit azután kloroformmal extraháltuk, majd egy etanolos kicsapásnak vetettük alá; ezután akrilamid gélelektroforézis és restrikciós enzimes, például EcoRI és HindlII emésztés után láthatóvá tehetők. Az 1. reakció esetén két fragmentumot figyeltünk meg: 615, valamint 240 bp-nál. Ami a 2. reakciót illeti, szin39
HU 216 653 Β tén két fragmentumot figyeltünk meg: 630 és 170 bpnál. Az enzimatikus amplifikációs reakció összes, a 946 és a 947 oligonukleotidok közötti termékét akrilamid gélen való mozgásuk alapján elválasztottuk; a 615 bp fragmentumot a korábban leírtak szerint tisztítottuk. Azután ezt a fragmentumot EcoRI és HindlII enzimekkel emésztettük, hogy végeit kohézívvá tegyük. Ezután a fragmentumot az M13mpl9 fág replikatív formájának DNS-ével ligáltuk. A ligátumot E. coli TGl-be transzformáltuk. Hat rekombináns kiónt, amelyek tartalmaznak egy 615 bp inszertumot, a -20 univerzális príménél (Pharmacia SA, Franciaország) szekvenáltunk. Amint a 49. ábrán bemutatjuk, amikor a rekombináns fág egyszálú DNS-ét szekvenáltuk, meg kellett figyelnünk az EcoRI hely alatt egy nem degenerált, a 946 oligonukleotidnak megfelelő szekvenciát, amit ugyanabban a fázisban egy, a LITKLKAVNVLK7ADWL aminosavakat kódoló szekvencia követ (? azt jelenti, hogy ezen a helyen nem tudtuk meghatározni a maradékot); ez a szekvencia megfelel annak, amely a SUMT NH2-terminális szekvenciájában a 946 oligonukleotidnak megfelelő aminosavakat követi (lásd 48. ábra). Két klón esetén valóban megfigyeltünk az EcoRI hely után egy olyan szekvenciát, amely a Metanobacterium ivanovii SUMTának NH2-terminális szekvenciáját kódolhatja, és amely a Pro-Gly-Asp-Pro-Glu-Leu lánccal kezdődik, amely aminosavakat a 946 oligonukleotidot tartalmazó szekvencia kódolja. Ez a megfigyelés mutatja, hogy ez a két rekombináns replikatív forma egy inszertumot tartalmaz, amely a Metanobacterium ivanovii SUMT struktúrgénjének egy belső fragmentumának felel meg. Azt a replikatív formát, amely a M. ivanovii struktúrgénjének ezt a belső fragmentumát tartalmazza, pG 10-nek neveztük el.
6(B). 2.2 A Metanobacterium ivanovii SUMT struktúrgénjének klónozása
A Metanobacterium ivanovii genomiális DNS-ét több restrikciós enzimmel emésztettük (egyszerű vagy kettős emésztés). Az emésztés után a fragmentumokat agaróz gélen elektroforézissel választottuk el, majd egy nejlonmembránra vittük át azokat, amint azt már leírták. Az így átvitt fragmentumok denaturációja és előhibridizációja után azokat a pGIO replikatív formájával, mint 32P jelzett szondával hibridizáltattuk, a már leírt módon, így azt találtuk, hogy a Methanobacterium ivanovii egy EcoRI-BamHI emésztésből eredő 3,2 kb fragmentuma hibridizált a szondával (lásd az 50. ábrát). Ezután a M. ivanovii 40 pg genomiális DNS-ét EcoRI-gyel és BamHI-gyel emésztettük, majd agarózgélen való mozgásuk alapján elválasztottuk a fragmentumokat. A 3 és
3,5 kb közötti méretű fragmentumokat elektroeluáltuk, amint azt korábban leírták. Az így tisztított fragmentumokat a BamHI-EcoRI emésztett pBKS+ vektorral (Stratagene Clonink Systems, La Jolla) ligáltuk. A ligátumot E. coli DH5a (Gibco BRL) törzsbe transzformáltuk. A transzformánsokat ampicillinnel és X-gallal kiegészített LB tápközegben szelektáltuk. 800 fehér telepet szűrőre oltottunk át; a baktériumok növesztése, majd lizálása után Grünstein et Hogness (1975) technikája szerint telephibridizációt hajtottunk végre. Az alkalmazott szonda a 32P jelzett pGIO replikatív forma. Ezután a hibridizációs teszt után egyetlen pozitív kiónt találtunk. E klón plazmid DNS-ét pXL 1809-nek neveztük el (lásd az 56. ábrát). E DNS EcoRI-Xbal emésztése lehetővé teszi, hogy láthatóvá tegyünk, amint az várható, egy
3,2 kb inszertumot. A pXL1809 plazmid két szálát Chen és Seeburg módszerével (1985) szekvenáltuk. Egy 955 bázisos szekvenciát kaptunk (51. ábra). Egy nyílt leolvasási keretekre végzett analízis elvezetett egy, a 34. bázistól (ATG) a 729. bázisig (TGA) tartó nyílt leolvasási keret azonosításához. Ez a nyílt leolvasási keret egy, az 52. ábrán bemutatott szekvenciájú proteint kódol. E protein molekulatömege 24900 (lásd az 53. ábrát), és ez a M. ivanovii-ból tisztított proteinéhez közeli. A protein NH2-terminális szekvenciája pontosan megegyezik a M. ivanovii tisztított SUMT-ára meghatározottal (lásd a 48. és az 52. ábrát). Ezek a megfigyelések egyértelműen bizonyítják, hogy a klónozott és szekvenált gén valóban a M. ivanovii SUMT struktúrgénje. Mivel feltételeztük, hogy ez az aktivitás minden baktériumnál a korrinoidok bioszintézisében vesz részt, ezt a gént corA-val, a gén által kódolt proteint CORA-val jelöltük. A M. ivanovii CORA proteinjének hidrofilitási profilja, amelyet Hopp és Wonda programja (1981) alapján határoztunk meg, azt mutatja, hogy amint az várható volt, hidrofil proteinről van szó, amint az 54. ábrán bemutatjuk. A M. ivanovii CORA proteinje több mint 40%-os szigorú homológiát mutat a Pseudomonas denitrificans COBA proteinjével (53. ábra). Ez a homológia a két protein majdnem teljes egészére kiterjed, mivel a M. ivanovii CORA proteinjének 3-227 aminosavmaradékaira, és a Pseudomonas denitrificans COBA proteinjének 17-251 aminosavmaradékaira vonatkozik. Ez a homológia két, ugyanazt a reakciót katalizáló protein között meglevő strukturális homológiát tükröz. A CORA és a Pseudomonas denitrificans COBA proteinje között ugyanazok a legkonzervatívabb régiók, mint a Pseudomonas denitrificans COBA és az E. coli CYSG proteinjei között (22. ábra).
7. példa
A COB proteinek expressziója
7.1 - Expresszió a Pseudomonas denitrificansnál
Ez a példa bemutatja, hogy a Pseudomonas denitrificans egy COB proteinjének struktúrgénjének amplifikációja a COB protein aktivitásának amplifikációjához vezet a Pseudomonas denitrificansnál.
7.1.1 - A COBA protein kifejezése
A pXL557 plazmid megfelel a pXL59 plazmidnak, amelybe az 5,4 kb fragmentum 2,4 kb BglII-EcoRV (80. és 2394. pozíciók a 7. ábra szekvenciáján) fragmentumát klónoztuk. Ez a fragmentum a cobA és cobE géneket tartalmazza.
A pXL545 plazmid csak a cobE gént tartalmazza. Előállítását a 4.1 példában írtuk le.
Ezt a két plazmidot konjugatív transzferrel bevezettük az SC510 Rifr törzsbe. Az SC510 Rifr, az SC510 Rifr pXL59, az SC510 Rifr pXL557 és az SC510 Rifi pXL545 törzseket PS4 tápközegben tenyésztettük. 4 nap múlva a tenyésztést befejeztük, és a már leírt standard
HU 216 653 Β eljárás szerint (F. Blanche et al, 1989) a SUMT aktivitást meghatároztuk. Az aktivitásokat az alábbi táblázat tartalmazza:
XVIII. táblázat
Az SC510 Rifr törzs és néhány származékának SUMT aktivitása
Törzs SUMT aktivitás nmol/h/mg protein
SC5l0Rifr 0,05
SC510Rifr pXL59 0,04
SC510 Rifr pXL557 2,10
SC510 Rifr pXL545 0,05
Ezekből az eredményekből tisztán látszik, hogy csak a pXL557 plazmid okozta az SC510 Rifr-nél a SUMT aktivitás nettó növekedését (egy 50-es faktorral). Ez a növekedés a cobA amplifikációjának az eredménye, és nem a cobE-é, mivel a pXL545 plazmid esetén, amely csak a cobE gén amplifikációját teszi lehetővé, nem nőtt meg a SUMT aktivitás. Ez az eredmény alátámasztja, hogy a Pseudomonas denitrificansnál a cobA gén a SUMT sktruktúrgénje. Ez az eredmény megmutatja, hogy a Pseudomonas denitrificans SUMT struktúrgénjének amplifikációjával megkaphatjuk a SUMT aktivitás amplifikációját a Pseudomonas denitrificansnál.
7.1.2 - A COBI protein kifejezése
Egy, a 8,7 kb DNS-fragmentumból származó, az SP2MT struktúrgénjét (cobl) tartalmazó fragmentumot a gram-negatív baktériumok egyik széles gazdaspecifitású plazmidjába klónoztuk, majd ezt a plazmidot konjugációval bevezettük a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr törzsbe. Azután mértük a törzs S-adenozil-L-metionin:prekorrin-2 metiltranszferáz aktivitását, a vektort hordozó törzshöz viszonyítva.
A 8,7 kb fragmentumból tisztítottuk az 1,9 kb BamHI-BamHI-Sstl-SstI fragmentumot, amely a cobH és a cobl géneket tartalmazza. A BamHI és az SstI végeket T4 bakteriofág DNS-polimerázzal betöltöttük, és a BamHI véghez Xbal, az SstI véghez EcoRI linkért kapcsoltunk. A fragmentumot azután a széles gazdaspecifitású pXL59 plazmid Xbal és EcoRI helyei közé építettük be. A plazmid hordozza a kanamicinrezisztenciagént. Az így kapott plazmidot pXLl 148-nak neveztük el (24. ábra).
Másrészt egy szomszéd plazmidot is készítettünk: a 8,7 kb fragmentumból tisztítottuk a cobH gént és a cobl gén 5’ részét tartalmazó 1,5 kb BamHI-BamHI-SstI fragmentumot. A végek T4 bakteriofág DNS-polimerázzal való betöltése után a BamHI véghez Xbal, az SstI véghez EcoRI linkért kapcsoltunk. Ezt a fragmentumot a pXL59 EcoRI és Xbal helyei közé építettük be, és így a pXLl 149 plazmidot kaptuk. A pXLl 148 és a pXLl 149 csak abban különböznek, hogy a pXL 1148 tartalmazza a cobl gén 3’ végét tartalmazó 0,3 kb Sstl-SstI fragmentumot is. A pXLl 148, a pXL1149-cel ellentétben, tartalmazza az egész cobl gént. A cobH gént mindkét plazmid tartalmazza.
Ezt a két plazmidot konjugációval bevezettük az SC510 Rifr-be. A SC510 Rifr, SC510 Rifr pXL59, SC510 Rifr pXL 1148 és SC510 Rifr pXL 1149 törzseket PS4 tápközegben tenyésztettük. 4 nap tenyésztés után a sejteket összegyűjtöttük, és az SP2MT aktivitást a
6.1.3 a) példában leírt módon mértük.
A mérések eredményét az alábbi táblázat tartalmazza, az SP2MT aktivitás definíciója a 6.1.3 a) példában megadott.
XIX. táblázat
Különböző, a Pseudomonas denitrificansból származó törzsek SP2MT aktivitása
Törzs SP2MT aktivitás1 %-ban
SC510Rifr <5
SC510Rifr pXL59 <5
SC510 Rifr pXLl 148 75
SC510Rifr pXL1149 <5
500 μg nyers kivonatra
Az aktivitást %-ban fejeztük ki, amint azt a 6.1.3 a) példában definiáltuk.
Csak a pXL1148 plazmid növelte meg jelentősen az SP2MT aktivitást. Ezzel ellentétben a pXL1149 plazmid nem mutatott eltérő eredményeket a kontroll SC510Rifr és SC510 Rifr pXL59 törzseknél megfigyelttől. A pXL1148 az egyetlen plazmid, amely tartalmazza a cobl gént, és ez az egyetlen, amely megsokszorozta a SP2MT aktivitást; ez az eredmény megerősíti, hogy a Pseudomonas denitrificans SP2MT struktúrgénje a cobl gén. Ráadásul ha denaturáló körülmények között elektroforézissel (SDS-PAGE 10%-os akrilamidon) elválasztottuk e különböző törzsek proteinjeit, kizárólag a pXL1148-nál figyelhettük meg egy sáv jelenlétét, amely egy körülbelül 25 000 molekulatömegű proteinnek felel meg (25. ábra). E protein molekulatömege megfelel a COBI proteinének. A pXLl 148 plazmid lehetővé tette, hogy a Pseudomonas denitrificansnál a COBI protein túltermelődését érjük el.
7.1.3 - A COBF kifejezése
Az expressziót úgy valósítottuk meg, hogy a cobF gén felett elhelyeztük az E. coli Ptrp promoterét és a lambda bakteriofág cll génjének riboszómakötőhelyét. Az így kapott expresszió jóval magasabb szintű, mint az ugyanazon plazmid több kópiájának köszönhető egyszerű amplifikáció esetén megfigyelt.
A pXL1496 plazmid (7.2.1 példa) körülbelül 2 kb EcoRI-BamHI-BamHI fragmentumát tisztítottuk (26. ábra). Ez a plazmid a cobF gén felett tartalmazza az E. coli Ptrp promoterét és a lambda bakteriofág cll génjének riboszóma-kötőhelyét. A cobF gén alatt az E. coli rmB operonjának terminátora található. Ezt a fragmentumot a pKT230 plazmid EcoRI-BamHI helyeire klónoztuk, és így a pXL1546 plazmidot kaptuk (26. ábra). A pKT230 egy, a Q inkompatibilitási csoportba tartozó plazmid, amely szinte minden gram-ne41
HU 216 653 Β gatív baktériumban replikálódik (Bagdasarian és munkatársai, 1981); ez a plazmid hordozza a kanamicin rezisztenciát. A pXL1546 és a pKT230 plazmidokat konjugációval bevezettük az SC510 Rifr-be. Az SC510Rifr, SC510 RiP pKT230 és az SC510 RiP pXL1546 törzseket PS4 tápközegben tenyésztettük, amint az már le van írva. Négy nap tenyésztés után a különböző törzsek összproteinjét 10%-os SDS-PAGE-n analizáltuk. Amint a 27. ábrán mutatjuk, az SC510 Rifr pXL1546 kivonatában megfigyeltünk egy körülbelül 32 000 molekulatömegű proteint, amely túltermelődött; ez a protein együtt mozog azzal a proteinnel, amelyet az E. coli B pXL1496 (7.2.1 példa) termel túl. Ráadásul ezt a proteint kizárólag a pXL 1546-t tartalmazó SC510 RiP törzs fejezi ki, ahol legalább 20%-át teszi ki az összproteinnek. Ezzel ellentétben az SC510 RiP és az SC510 RiP pKT23O törzsek összproteinjei között nem figyeltük meg ezt a proteint. Ez a túltermelt protein tehát a COBF protein.
7.1.4 - A COBH kifejezése
Ez a példa a Pseudomonas denitrificans egy, a cobH gént tartalmazó DNS-fragmentumának amplifikációját írja le. Az e gén által kódolt proteint tisztítottuk; a COBH proteinről van szó. A pXLl 149 plazmid, amelyet a
7.1.2 példában írtunk le, a 8,7 kb fragmentumból származó inszertumán csak a cobH gént tartalmazza teljes egészében. Az SC510 RiP-nél ez a plazmid, ellentétben a vektorral, egy 22000 molekulatömegű protein túltermelődését okozza (25. ábra).
7.1.5 - A COBV kifejezése
Ez a példa a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz aktivitás amplifikációját írja le egy olyan plazmiddal, amely csak a cobV gént hordozza (pXL699, lásd a 38. ábrát). Az SC510 RiP-nál a pXL699 plazmid egy 50-es faktorral megnöveli a kobalamin-(5’-foszfát) szintetáz aktivitást a PXL435, pXL1303, pXL1324 vagy a pKT230 vektorokat tartalmazó SC510 RiP törzshöz viszonyítva. Ez a plazmid inszertumán csak a cobV gént tartalmazza egészében, és az ORF 18 és a cobU 5’ terminális részeit. Bizonyos, hogy egy adott törzsben (SC510 RiP pXL699) a COBV protein túltermelődött; ez a túltermelődés körülbelül 50-szeres az SC510 Rifr törzs expreszsziójához képest.
7.1.6 - A CORA protein kifejezése
A pXL1832 (lásd a 7.2.4 példát) 1,5 kb EcoRI BamHI-BamHI fragmentumát, amely tartalmazza a Ptrp promotert, majd a λ fág cll riboszóma-kötőhelyét, a M. ivanovii SUMT-ának struktúrgénjét és az E. coli rmB operonjának terminátor régióit, a pKT230 (Bagdasarian és munkatársai, 1981) EcoRI-BamHI helyeire klónoztuk. Ezen a módon a pXL1841 plazmidot kaptuk (lásd az 56. ábrát). Ezt a plazmidot a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr-ban mobilizáltuk, amint azt korábban már leírták. Egy transzkonjugánst részletesebben is tanulmányoztunk. Ezt a törzset PS4 tápközegben tenyésztettük, és a baktériumkivonat SUMT aktivitását, a kontroll SC510 RiP pXL435 (Cameron és munkatársai, 1989) törzsével együtt meghatároztuk. E törzsek aktivitását az alábbiakban mutatjuk be:
törzs specifikus SUMT aktivitás pmol/h/mg protein
SC510RifrpXL435 50-100
SC510 RiP pXL 1481 1700
Ez az eredmény világosan megmutatja, hogy a pXL1841 plazmid segítségével a Pseudomonas denitrificansnál megvalósítottuk a M. ivanovii SUMT aktivitás kifejezését, mivel az SC510 RiP pXL1481 törzs SUMT aktivitása határozottan nagyobb az SC510 RiP pXL435-énál.
7.2 - Expresszió E. colinál
Ez a példa azt mutatja be, hogy a Pseudomonas denitrificans egy COB proteinje hogyan termelődhet túl
E. coliban.
7.2.1 - A COBF kifejezése
A túltermelődést úgy értük el, hogy a cob gén felett elhelyeztük az E. coli Ptrp promoterét és a lambda bakteriofág cll génjének riboszómakötőhelyét. A 8,7 kb EcoRI fragmentum 2250 bp EcoRI-XhoI fragmentumát (a 8. ábrán bemutatott szekvencián a 0. és a 2250. helyzet) az M13mpl9 fágba (Norrander és munkatársai, 1983), az EcoRI és a Sáli helyekre klónoztuk. Az így kialakult plazmidot pXL 1405-nek neveztük el. Irányított mutagenezissel úgy vezettünk be egy Ndel helyet, hogy a restrikciós hely utolsó három bázisa (ATG) a cobF gén transzlációs iniciációs kodonját alakítsa ki. Ez azonos azzal, hogy a cobF ATG-jét megelőző három bázist, GAA-t (a G a 733. pozícióban van a 8. ábrán bemutatott szekvencián) CAT-re módosítottuk. A cobF gént tartalmazó Ndel-SphI-Sphl fragmentumot (26. ábra) ezután tisztítottuk; ezt az 1,5 kb fragmentumot azután a pXL694 plazmid (Denefle és munkatársai, 1987) Ndel-Sphl helyei közé klónoztuk. Az így kialakított plazmidot pXL1496-nak neveztük el (26. ábra). A cobF gént megelőző 120 bp EcoRI-Ndel fragmentumon (amely a pXL694-ből származik) jelen vannak az E. coli genetikai expressziós regulációs szignáljai. Ezeket a jeleket az E. coli Ptrp promoter [-40+1] régiója, majd a λ bakteriofág cll génjének riboszómakötőhelyét tartalmazó 73 bp (Denefle és munkatársai, 1987) alkotja. A cobF gén alatt az E. coli rmB operonjának terminátorai találhatók (egy HindlII-BamHI fragmentumon). A pXL1496 plazmidot transzformációval bevezettük az E. coli törzsbe (Monod et Wollman, 1947). A cobF gén kifejeződését a már leírt módon vizsgáltuk (Denefle és munkatársai, 1987) olyan körülmények között, ahol a Ptrp promoter vagy gátolva van (triptofán jelenléte), vagy nincs gátolva (triptofán hiánya). Az expresszió megvalósításához használt tápközeg az M9 minimum tápközeg (Miller, 1972), 0,4% glükózzal, 0,4% kazaminosavakkal, 10 mM tiaminnal és ott, ahol a Ptrp promotert gátolni akartuk, 40 pg/ml triptofánnal kiegészítve. Az E. coli B pXL1496 törzset 37 °C-on a fenti körülmények között tenyésztettük 100 pg ampicillinnel. Amint a 28. ábra mutatja, a triptofán hiánya egy 32000 molekulatömegű protein expressziójához vezet. Valóban, az E. coli B pXL1496 törzs összprotein kivonatában SDS-PAGE-sel analizálva (28. ábra) világosan megfigyeltünk egy 32 000 molekulatömegű proteint, amely az összprotein 1 -4%-át adta. Ez a protein az ugyanolyan körülmények között, de
HU 216 653 Β triptofán hiányában tenyésztett E. coli B pXL1496 törzs összprotein kivonatában jóval kevésbé jelentős mennyiségben volt jelen. Az ilyen feltételekkel kifejeződött protein molekulatömege közeli a COBF protein aminosavszekvenciájából következtetett molekulatömegéhez, ami 28927 (16. ábra). Az E. colinál így kifejezett protein a COBF protein.
7.2.2 - A COBT kifejezése
A túltermelést a cob gén 5’ végének az E. coli lac promoterével és a lacZ első három kodonjával való fúziójával kaptuk meg. A 4,8 kb fragmentum 32. ábrán bemutatott szekvenciájának 2624 helyzetű EcoRI helye tartalmazza a cobl gén negyedik kodonját. A pXL837 3,5 kb EcoRI-Xbal fragmentumát (lásd a 36. ábrát) a pTZ18R vagy a pTZ19R (Pharmacia) EcoRI és Xbal helyeire klónoztuk, így a pXL1874 vagy a pXL1875 plazmidokat kaptuk; ez a két plazmid az E. coli laktóz operonjával (Piac) szemben csonkolt cobT gén orientációjában különbözik. A Piac a pXL 1874-ben a cobT gén felett van, míg a pXL 1875-ben ellenkezőleg. A pXL837 EcoRI-Xbal fragmentumának klónozása pTZ18R EcoRI-Xbal helyeire lehetővé teszi egy proteinfnzió megvalósítását az E. coli B-galaktozidáz első négy aminosava és a cobT gén 4. kodon utáni része között. E lacZ” cobT gén expressziója a lacZ expreszsziós szignáljainak kontrollja alatt áll. A pXL1874, pXL1875 és pTZ18R plazmidokat transzformációval bevezettük az E. coli BL21 törzsbe. A cobT gén expresszióját a már leírt módon vizsgáltuk (Maniatis és munkatársai, 1989).
Amint azt a 42B ábra mutatja, a pXLl 874 esetén, és csak ott, egy 72 000 mokekulatömegű protein fejeződött ki, és a BL21 pXL1874 összprotein kivonatában SDS-PAGE analízissel 1-4%-át képviseli az összes proteinnek. Az ilyen feltételek mellett kifejeződő protein molekulatömege közeli a COBT protein aminosavszekvenciájából következtetett molekulatömegéhez, ami 70 335 a 40. ábrán. Ez a kísérlet világosan megmu10 tatja, hogy a cobl gén negyedik kodonjánál elhelyezkedő EcoRI helytől kezdődő nyílt leolvasási keretet, amely kompatíbilis a cobT gén leolvasási keretével, ki lehet fejezni.
7.2.3 - Egy csonkolt COBS protein kifejezése
A COBS génjének 45. kodonjánál egy BamHI hely helyezkedik el. A pXL843-ból kivágtuk a cobS gén 3 ’ részét és az alatta levő szekvenciákat tartalmazó 1,2 kb BamHI-BamHI fragmentumot, hogy a pET-3b plazmid (Rosenberg és munkatársai, 1987) BamHI helyére klónozzuk. A fragmentumot úgy orientáltuk, hogy a cobS gén csonkolt vége fázisban fuzionáljon a T7 fág nagyobb kapszidfehérjéjének vagy 10. génjének első 12 kodonjával (Rosenberg és munkatársai, 1987). Ez a hibrid gén a T7 bakteriofág φ 10 promoterének kontrollja alatt áll. A pXL1937 plazmidot, valamint a pET-3b-t transzformációval bevezettük az E. coli BL21 pLysS-be (W. Studier, személyes közlés). Szelektív közegben végzett izolálás után a két törzset folyékony L tápközegben tenyésztettük OD 610 nm=l-ig; ebben a stádiumban a tápközeget 1 mM IPTG (izopropil Bgalaktozid) koncentrációra állítottuk be, hogy indukáljuk a T7 bakteriofág polimerázának expresszióját (Rosenberg és munkatársai, 1987). Ezután a kultúrát 37 °C-on 3 órán át inkubáltuk, majd baktériumlizátumot állítottunk elő. Az így tenyésztett baktériumok összproteinjét denaturáló PAGE-sel választottuk el. Amint a 42A ábrán láthatjuk, specifikus túltermelés található egy 33 000 mulekulatömegű proteinből a BL21 pLysS pXL1937 törzsnél. Ez a molekulatömeg teljesen azonos a fúziós protein várt molekulatömegével (33 kD). Ez a kísérlet világosan megmutatja, hogy a cobS 45. helyénél található EcoRI helytől kezdődő nyílt leolvasási keret, amely kompatíbilis a cobS gén leolvasási keretével, kifejezhető.
7.2.4 - A CORA protein kifejezése
A következő oligonukleotidokat szintetizáltuk a már leírt módon:
1277. oligonukleotid
5’ GGC CGA ATT CAT ATG GTA GTT Έ
-------1 2 3
EcoRI--------Ndel
1278, oligonukleotid
5’ GGC CGA GCT CTA TTA CAT AAT T
ΓΤΤΑ3’
5 (1-5, a M. ivanovii SUMT első 5 kodonja)
SstI (= az 51. ábrán ábrázolt szekvencia, 926-915. helyek a kódoló szál komplementer láncán)
Az 1277. oligonukleotid az EcoRI és a Ndel restrikciós enzimek felismerőhelyeinek szekvenciájával rendelkezik. Az Ndel hely utolsó három bázisát (ATG), amely egy transzlációs iniciációs kodonnak felel meg, közvetlenül követik a M. ivanovii SUMT struktúrgénjének 2-5. kodonjai, amint az 52. ábrán bemutattuk azokat. Az 1278. oligonukleotid az SstI felismerőhelyét tartalmazza, amit közvetlenül követ a TATTACATAATT szekvencia, amely megfelel egy, a corA gént tartalmazó 955 bp fragmentumon, amelyet az 51. ábra mutat be, jelen levő szekvenciának; ez a szekvencia a 926-915. helyen található (lásd az 51. ábrát) a CORA protein kódolószálával komplementer láncon. Az 1277. és 1278. oligonukleotidok tehát 3’ végükön tartalmazzák a corA kódolószálának, és az e gén alatti komplementer láncnak megfelelő szekvenciákat. Ezt a két oligonukleotidot használhatjuk egy enzimatikus amplifikációs reakcióban, ahol a pXL1809 plazmid a minta. Ezzel a kísérlettel egy olyan, a M. ivanovii corA génjét tartalmazó 910 bp fragmentumot kaphatunk,
HU 216 653 Β amely rendelkezik egy Ndel hellyel a corA gén ATGjénél, és egy SstI hellyel a fragmentum másik végén, a corA gén vége után. Az enzimatikus amplifikációt a M. ivanovii genomiális DNS-ének enzimatikus amplifikációjánál már leírtak szerint végezzük, azzal a kivétellel, hogy a minta 10 ng pXL1809 plazmidból áll; a használt hőmérsékletek ugyanazok, de csak 20 amplifikációs ciklust valósítottunk meg. Amint azt korábban leírtuk, az amplifikáció termékeit Ndel-gyel és Sstl-gyel emésztettük az agarózgélen mozgásuk alapján való elválasztás előtt. Amint vártuk, egy 910 bp méretű fragmentumot tettünk láthatóvá. Ezt a fragmentumot a már leírt módon tisztítottuk. Ezt a fragmentumot a pXL694 (Denefle és munkatársai, 1987) Ndel és SstI helyeire klónoztuk. A kapott pXL1832 plazmid az 56. ábrán van leírva. Ezen a plazmidon ugyanazon a módon, ahogy a
7.2 példában le van írva, a M. ivanovii SUMT struktúrgénjét megelőzi a λ bakteriofág cll génjének riboszóma-kötőhelye. E felett a riboszóma-kötőhely felett a Ptrp promoter található. A pXL1832 plazmidot transzformációval bevezettük az E. coli B5548 törzsbe, amely egy olyan E. coli törzs, amely hordozza a cysG44 mutációt (Cossart et Sanzey, 1982). Az E. coli B5548 pUC13 és az E. coli B5548 pXL1832 törzsek SUMT aktivitását az amplicillinnel kiegészített LB tápközegben tenyésztett sejtekből kapott kivonatban mértük. A SUMT aktivitás mérését a már leírt módon valósítottuk meg (Blanche és munkatársai, 1989). A mérés eredményeit alább adjuk meg.
törzs specifikus SUMT aktivitás pmol/h/mg protein
E. coli B5548 pUC13 5,9
E. coli B5548 pXL1832 310
A fenti táblázatban bemutatott adatok világosan mutatják, hogy az E. coli B55498 törzsnél jelen van a SUMT aktivitás expressziója, ha ez egy pXL1832 plazmidot tartalmaz, ami a M. ivanovii SUMT-át fejezi ki. Tehát a M. ivanovii SUMT-át ki lehet fejezni E. coliban.
8. példa
A kobalaminok termelésének amplifikációja rekombináns DNS-technikákkal
8.1 - Amplifikáció a Pseudomonas denitrificansnál
Ez a példa bemutatja, hogyan kaptuk meg a Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr-nél a kobalamintermelés növekedését a Pseudomonas denitrificans SC510 cob génjeinek amplifikációjával.
8.1.1 A kobalaminok termelésének növelése a Pseudomonas denitrificansnál a kobalaminok bioszintézisének egy limitálólépésének kiküszöbölésével
Ez a példa bemutatja, hogyan lehet megnövelni a Pseudomonas denitrificans egy törzsének kobalamintermelődését a Pseudomonas denitrificans cob génjeinek amplifikációjával. Ez a növekedés a bioszintézis egy limitálólépésének kiküszöbölésének eredménye. A pXL367 plazmidot a 4.2 példában írtuk le (13. ábra). Ez a plazmid megfelel a pRK290-nek (Ditta és munkatársai, 1981), amelybe a 8,7 kb EcoRI fragmentumot építettük be. Ez a pXL367 plazmid az SC510 Rifr törzsnél a kobalaminok bioszintézisének növekedését okozza. Az SC510 Rifr, SC510 Rifr pRK290 és az SC510Rifr pXL367 törzseket Erlenmeyer-lombikban PS4 tápközegben tenyésztettük, a kísérleti előírásokban leírt feltételeket követve. A termelődés arányának megnövekedését figyeltük meg, ami a pXL367 plazmid jelenlétének köszönhető. Valóban az SC510 Rifr pXL367 törzs 30%-kal több kobalamint termel, mint az SC510 Rifr és az SC510 Rifr pRK290 törzsek. Ezt a növekedést nem a Pseudomonas denitrificans bármely génjének amplifikációja, hanem specifikusan a 8,7 kb EcoRI fragmentumon hordozott gének amplifikációja okozza. Valóban, a pXL723 plazmid, amelyet a 11. ábrán írtunk le, nem okoz semmilyen növekedést, és az ezzel a plazmiddal megfigyelt termelés aránya ugyanakkora, mint az SC510 Rifr és az SC510 Rifr pRK290 törzsekkel.
8.1.2 A koenzim B12 termelésének növekedése a Pseudomonas denitrificansnál a kobalaminok bioszintézisének két limitálólépésének kiküszöbölésével
Ez a példa bemutatja, hogyan növelhető a Pseudomonas denitrificans törzsek kobalamintermelése a Pseudomonas denitrificans cob génjeinek amplifikációjával. Ez a növekedés a bioszintézis két limitálólépésének kiküszöbölésének eredménye.
A 2,4 kb Clal-EcoRV fragmentum az 5,4 kb (amely a cobA és a cobE géneket tartalmazza) fragmentumból származik. Ezt a fragmentumot a 8,7 kb EcoRI fragmentummal koklónoztuk a széles gazdaspecifitású pXL203 plazmidba. Az így kapott plazmidot pXL525-nek neveztük (29. ábra). Ezt a plazmidot konjugációval bevezettük az SC510 Rifr-be. Az SC510Rifr pXL525 törzs 20%-kal több kobalamint termel, mint az SC510 Rifr pXL367. A cobA és cobE gének amplifikációja lehetővé tette a kobalaminok bioszintézisében egy újabb limitálólépés kiküszöbölését az SC510 Rifr-nél. A Pseudomonas denitrificans SC510 Rifr törzset úgy javítottuk meg ebben a példában, hogy két limitálólépést egymás után kiküszöböltünk. Ez a példa bemutatja, hogy a kobalaminok bioszintézisében két limitálólépés kiküszöbölése a termelés javulásához vezethet.
8.2 - A kobalaminok termelődésének javítása Agrobacterium tamefaciensnél
Ez a példa bemutatja egy kobalamintermelő törzs kobalamintermelésének javítását a Pseudomonas denitrificans SC510 törzs cob génjeinek amplifikációjával.
Az alkalmazott törzs egy gram-negatív baktériumtörzs; egy Agrobacterium tumefaciens törzsről van szó.
A 4.2 és a 8.1 példában leírt pXL367 és pXL525 plazmidokat, valamint a pRK290 vektort (Ditta és munkatársai, 1981) és a pXL368 plazmidot (29. ábra) konjugatív transzferrel bevezettük az Agrobacterium tumefaciens C58-C9 Rifr törzsbe (Cameron és munkatársai, 1989). A C58-C9 Rifi , C58-C9 Rif pRK290, C58-C9 RiP pXL367, C58-C9 Rifr pXL368 és a C58-C9 RiP pXL525 törzseket 30 °C-on PS4 tápközegben tenyésztettük, amint az korábban le van írva. A termelődött kobalaminokat a korábban leírt módon mértük. A termelődés arányát az alábbi táblázat tartalmazza.
HU 216 653 Β
XX. táblázat
Különböző rekombináns Agrobacterium tumefaciens törzsek által termelt B12 vitamin mennyisége
Törzs B|j vitamin mg/l-ben
C58-C9 RiP 0,4
C58-C9 RiP pRK290 0,4
C58-C9 RiPpXL367 0,8
C58-C9 RifrpXL368 0,8
C58-C9 RifrpXL525 1,2
Amint a fenti táblázatból világosan látszik, az alkalmazott Agrobacterium tumefaciens törzsnél megnőtt a kobalamintermelés. A felhasznált Agrobacterium tumefaciens törzs kobalamintermelését két különböző plazmid növeli meg. a pXL367 és a pXL368. Ez a két plazmid a 8,7 kb EcoRI fragmentumot (cobF-cobM gének), illetve a 2,4 kb CLal-EcoRV fragmentumot (cobE és cobA gének) tartalmazza. Ezek külön-külön egy kettes faktorral növelik meg az Agrobacterium tumefaciens C58-C9 Rifr törzs kobalamintermelését; ez az eredmény azt mutatja, hogy meg lehet javítani egy Agrobacterium tumefaciens törzs kobalamintermelését a Pseudomonas denitrificans cob génjeit tartalmazó fragmentumok amplifikálásával. A jelen esetben heterológ javításról beszélhetünk, azaz egy törzs kobalamintermelésének javítása egy másik törzs cob génjeinek amplifikációjával.
A Pseudomonas denitrificans cob géneket tartalmazó különböző fragmentumai által okozott kobalamintermelés növekedés kumulálható, azaz ha két olyan fragmentumot teszünk ugyanabba a plazmidba, amelyet külön-külön a pXL367-ben és a pXL368-ban klónoztunk, a növekedés addícióját figyelhetjük meg. A pXL525 az Agrobacterium tumefaciens C58-C9 Rifr-nél nagyobb termelésnövekedést okoz, mint az, amit az ugyanabba a vektorba külön-külön klónozott fragmentumok okoznak.
8.3 - A kobalamintermelés növelése a Rhizobium melilotinál
Ez a példa egy másik kobalamintermelő törzs kobalamintermelésének növelését írja le.
A 8. 2 példában leírt pXL368 plazmidot, valamint a pRK290 vektort (Ditta és munkatársai, 1981) konjugatív transzferrel bevezettük a Rhizobium meliloti 102F34 Rifr törzsbe (Leong és munkatársai, 1982). A transzkonjugánsokat: 102F34 Rifr, 102F34 RiP pRK290 és 102F34 RiP pXL368 30 °C-on PS4 tápközegben a már leírt módon tenyésztettük. A keletkező kobalaminokat meghatároztuk, amint azt korábban leírtuk. A termelődés arányát az alábbi táblázat tartalmazza.
XXI. táblázat
Különböző rekombináns Rhizobium meliloti törzsek által termelt kobalaminok mennyisége
Törzs B[2 vitamin mg/l-ben
102F34RÍP 0,4
Törzs B12 vitamin mg/l-ben
102F34 RifrpRK290 0,4
102F34 RiP pXL368 0,8
Amint a fenti táblázatból világosan látszik, a használt Rhizobium meliloti törzsnél megnőtt a kobalamintermelés. A pXL368 plazmid megnöveli az alkalmazott Rhizobium meliloti törzs kobalamintermelését. Ez a plazmid a 2,4 kb Clal-EcoRV fragmentumot (cobA és cobE gének) tartalmazza; a Rhizobium meliloti 102F34 Rifr-nál a kobalamintermelést egy kettes faktorral növeli meg. Ez az eredmény azt mutatja, hogy a Rhizobium meliloti egy törzsének kobalamintermelése megnövelhető a Pseudomonas denitrificans cob génjeit tartalmazó fragmentumok amplifikációjával. A jelen esetben heterológ javításról beszélhetünk, azaz egy törzs kobalamintermelésének növeléséről egy másik törzs cob génjeinek amplifikációjával.
9. példa
A korrinoidok és a deszkobaltkorrinoidok meghatározása korrinoidtermelő törzsek fermentlevében és sejtjeiben
Ez a példa bemutatja, hogyan lehetséges azonosítani és meghatározni a különböző kobalamintermelő törzsek által termeit különböző korrinoidokat és deszkobaltkorrinoidokat. Ez a meghatározás lehetővé teszi többek között a koenzim B12 meghatározását is.
A fermentlevet (vagy csak a sejteket) ciánoztuk, amint azt már leírták (Renz, 1971). Centrifugáció után a felülúszó egy alikvotját egy DEAE-Sephadex oszlopon engedtük át, amelyet azután extenzíven mostunk 1 M kálium-dihidrogén-foszfáttal. A begyűjtött frakciókat összegyűjtöttük, és egy Sep-Pák C-18 tölteten (Waters) sótalanítottuk. Bepárlás és vízben való reszuszpendálás (100 μΐ 1 ml-ben, a jelen levő korrinoidok mennyiségét követve) után a korrinoidokat HPLC-vel, egy Nucleosil C-18 oszlopon (MachereyNagel) azonosítottuk és határoztuk meg. Az oszlopot 1 ml/perc átfolyási sebességgel acetonitril 10 nM KCNt tartalmazó 0,1 M kálium-foszfát pufferben előállított gradiensével (0-100%) eluáltuk.
A korrinoidokat UV fényben 371 nm-nél, és/vagy 57Co-ra specifikus detektálással (ha a tenyésztést 57CoC12 jelenlétében végeztük) Berthold LB 505 detektor segítségével tettük láthatóvá. Azonosításuk tehát retenciós idejük etalonokkal való összehasonlításával történt. Ugyanúgy, a deszkobaltkorrinoidokat (hidrogenobirinsav, hidrogenobirinsav monoamid és hidrogenobirinsav diamid) UV fényben, 330 nm-nél tettük láthatóvá. Ezzel a technikával a különböző köztes termékeket választottuk el: kobirinsav, kobirinsav monoamid, kobirinsav diamid, kobirinsav triamid, kobirinsav tetraamid, kobirinsav pentaamid, kobirsav, kobinamid, kobinamidfoszfát, GDP-kobinamid, B12 vitamin-foszfát és B,2 vitamin. E termékek adenozilált formáit szintén elválasztottuk és meghatároztuk ezzel a technikával. Hogy ezt tegyük, a kezdő ciánozási lépést elhagytuk, és a HPLC45
HU 216 653 Β oszlopot KCN nélküli pufferrel eluáltuk. A 31. ábrán megadjuk a különböző, ebben a rendszerben elválasztott, és az oszlop kimeneténél UV abszorbancia alapján azonosított etalonok retenciós idejét.
Az SC510 Rifr törzs egy mintáját 1990. január 30-án letétbe helyeztük a Centraal Bureau voor Shimmelcultures a Baamnál (Hollandia), ahol azt CBS 103.90 számon vették nyilvántartásba.
Irodalmi hivatkozások
Ausubel F. M., Brent R., Kinston R. E., Moore D.
D., Smith J. A., Seidman J. G. and K. Struhl. 1987. Current protocols in molecular biology 1987-1988. John Willey and Sons, New York.
Bagdasarian, M., R. Lurz, B. Rückert, F. C. Franklin, Μ. M. Bagdasarian, J. Frey, and K. Timmis. 1981. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad hőst rangé, high copy number, RSFlOlO-derived vectors, and a hőst vector system fór gene cloning in Pseudomonas. Gene 16:237-247.
Barrére G, Geneste B., Sabastier A., 1981. Fabrication de la vitaminé B12: 1’amélioration d’un procédé. Pour la Science, 49, 56-64.
Battersby A. R., Fookes C. J. R., Matcham G. W. J., MacDonald E., 1980. Biosynthesis of the pigments of life: formation of the macrocycle. Natúré, 285, 17-21.
Battersby, A. R., and E. MacDonald. 1982. Biosynthesis of the corrin macrocycle. p. 107-144. In D. Dolphin (ed.), B12, vol. 1. John Willey & Sons, Inc., New York.
Beck., W. S. 1982. Biological and medical aspects of vitamin B12. p 1-30., In D. Dolphin (ed.), B12, vol.
I. John Willey & Sons, Inc., New York.
Ben Bassat A., and K. Bauer. 1987. Amino-terminal Processing ofproteins. Natúré, 326:315.
Blanche F., L. Debussche, D. Thibaut, J. Crouzet and B. Cameron, 1989. Purification and Characterisation of S-Adenosyl-L-Methionine: Uroporphyrinogen III methyltransferase from Pseudomonas denitrificans.
J. Bacteriol., 171:4222-4231.
Brey R. N., Banner C. D. B., Wolf J. B., 1986. Cloning of Multiple Genes Involved with Cobalamin (Vitamin B12) Biosynthesis in Bacillus megaterium. J. Bacteriol., 167, 623-630.
Cameron Β;, K. Briggs, S; Pridmore, G. Brefort and J. Crouzet, 1989. Cloning and analysis of genes involved in coenzyme B12 biosynthesis in Pseudomonas denitrificans. J. Bacteriol, 171, 547-557.
Casadaban, M. J., A. Martinez-Arias, S. T. Shapira and J. Chou. 1983. β-galactosidase gene fusion fór analysing gene expression in Escherichia coli and Yeast. Methods Enzymol. 100, 293-308.
De Bruijn F. J. and J. R. Lupski. 1984. The use of transposon Tn5 mutagenesis in the rapid generation of correlated physical and genetic maps of DNA segments cloned intő multicopy plasmids - a review. Gene, 27, 131-149.
De Graff, J., J.H. Crosa, F. Heffron, and S. Falkow.
1978. Replication of the nonconjugative plasmid RSF1010 in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 146, 117-122.
Denéfle P., S. Kovarik, J-D. Guiton, T. Cartwright and J-F. Mayaux. 1987. Chamical synthesis of a gene coding fór humán angiogenin, its expression in Escherichia coli and conversion of the product intő its active form. Gene, 56, 61-70.
Ditta G., Schmidhauser T., Yakobson E., Lu P., Liang X-W., Finlay D. R., Guiney D. and D. R. Helinski. 1985. Plasmids related to the broad hőst rangé vector pRK290, useful fór gene cloning and fór monitoring gene expression. Plasmid, 13, 149-154.
Ditta, G., S. Stanfield, D. Corbin, and D. R. Helinski. 1980. Broad hőst rangé DNA cloning system fór Gramnegative bacteria: Construction of a gene library of Rhizobium melitoti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347-7351.
Escalante-Semerena J. C. and J. R. Roth. 1987. Regulation of the cobalamin biosynthetic operons in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol, 169, 225-2258.
Florent, J. 1986. Vitamins. pl 15-158. In H-J. Rehm and G. Reed (ed.), Biotechnology, vol. 4, VCH Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim.
Friedmann H. C. and L. M. Cagen. 1970. Microbial biosynthesis of B12-like compounds. Ann. Rév. Microbiol., 14, 159-208.
Friedmann H. C., 1968. Vitamin B12 biosynthesis. J. Bioi. Chem., 243, 2065-2075.
Friedmann H. C., 1975. Biosynthesis of corrinoids. In Babior Β. M., Cobalamin, 75-110, John Wiley and Sons, New York.
Henikoff S. 1984. Unidirectional digestion with exonuclease III creates targeted breakpoints fór DNA sequencing. Gene, 28, 351 -359.
Hírei Ph-H, J-M. Schmitter, P. Dessen and S. Blanquet. 1989. Extent of N-terminal methionine excision within E. coli proteins is govemed by the side chain of the penultimate aminoacids. Proc. Natl. Acad. USA, sous préssé.
Hopp T. P. and K. R. Woods. 1981. Prediction of protein antigenic determinants from amino acids sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78-3824-3828.
Huennekens F. M., Vitols K. S., Fujii K.., Jacobsen D. W., 1982. Biosynthesis of cobalamin coenzyme. In Dolphin D., B12, vol. 1,145-167, John Willey & Sons, New York.
Irion R., Ljungdahl L. G., 1965. Isolation of factor Ilim coenzyme and cobyric acid coenzyme plus other B12 factors from Clostridium thermoaceticum. Biochemistry, 4, 2780-2790.
Jeter R. M., Olivera Β. M., Roth J. R., 1984. Salmonella typhimurium synthetises cobalamin (vitamin B12) de novo under anaerobic growth conditions. J. Bacteriol., 159, 206-213.
Jeter, R. M. and J. R. Roth. 1987. Cobalamin (Vitamin B12) Biosynthetic Genes of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 169, 3189-3198.
Jorgensen R. A., Rothstein S. J., Reznikoff W. R.,
1979. A restriction enzyme cleavage map of Tn5 and location of a region encoding neomycin resistance. Molec. Gén. Génét., 177,65-62.
HU 216 653 Β
Kanangara C. G., S. P. Gough, P. Bruyant, J. K. Hoober, A. Kahn and D. von Wettstein. 1988. tRNAGlu as a cofactor in d-aminolevulinate biosynthesis: steps that regulate chlorphyll synthesis. Trends in Biochem. Sci., 139-143.
Kanehisa M. 1984. Use of statistical criteria fór screening potential homologies in nucleic acids sequences. Nucleic Acids Rés., 12:203-215.
Kieny Μ. P., R. Lathe and J. P. Lecocq. 1983. New versatile cloning vectors based on bacteriophage M13. Gene, 26,91-99.
Krzycki J. and J. G. Zeikus. Quantification of corrinoids in methanogenic bacteria. 1980. Curr. Microbiol., 3, 243-245.
L. Skatrud, A. J. Tietz, T. D. Ingolia, C. A. Cantwell, D. L. Fisher, J. L. Chapman and S. W. Queener. 1989. Use of recombinant DNA to improve production of cephalosporin C by Cephalosporium acremonium. Bio/Technology, 1989, 7, 477-485.
Laemli U. K., 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Natúré, 227, 680-685.
Leong S. A., Ditta G. S., Helinski D. R., 1982. Heme Biosynthesis in Rhizobium. Identification of a cloned gene coding fór d-aminolevulinic acid synthetase írom Rhizobium melitoti. J. Bioi. Chem., 257, 8724-8730.
Macdonald H. and J. Colé. Molecular cloning and fuctional analysis of the cysG and nirB genes of E. coli K12, Two closely-linked genes required fór NADHdependant reductase activity. Submitted to publication.
Maniatis, T., E. F. Fritsch, and J. Sambrook. 1982. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Mazumder T. K., N. Nishio, M. Hayashi and S. Nagai. 1987. Production of corrinoids including vitamin by Methanosarcina barkeri. 1986. Biotechnoi. Letters, 12,843:848.
Mazumder T. K., N. Nishio, S. Fukuzaki and S. Nagai. 1987. Production of extracellular vitamin B12 compounds from methanol by Methanosarcina barkeri. Appl. Microbiol. Biotechnoi., 26, 511-516.
Miller, J. H. 1972. Experiment in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York.
Monod J. and E. Wollman. 1947. Inhibition de la croissance et de l’adaptation enzymatiqe chez les bactéries infectées pár le bactériophage. Ann. Inst Pasteur, 73, 937-956.
Murphy M. J., Siegel L. M, Kamin H., Rosenthal D., 1973. Identification of a new eláss of heme prosthetic group: an irontetrahydroporphyrin (isobacteriochlorin type) with eigth carboxilic acid groups. J. Bioi. Chem., 248,2801-2814.
Murphy M. J., Siegel L. M., 1973. The basis fór a new type of porphyrin-related prosthetic group common to both assimilatory and dissimilatory sulfite reductases. J. Bioi. Chem., 248, 6911-6919.
Nexo E., Ölesen H., 1982. Intrinsic factor, transcobalamin and haptocorrin. In Dolphin D., B12,57-85, John Willey & Sons, New York.
Normark S., S. Bergtröm, T. Edlund, T. Grunström, B. Jaurin, F. Lindberg and O. Olsson. 1983. Overlapping genes. Ann. Rév. Génét., 17, 499-525.
Norrander J., T. Kempe and J. Messing. 1983. Construction of improved Ml3 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene 26, 101-106.
Noyes R., 1970. Vitamin B12 manufacture, 145-182, Noyes developpement S. A., Park Ridge, N. J., USA.
Prentki P. and Η. M. Krisch. 1984. In vitro insertional mutagenesis cith a selectable DNA fragment. Gene, 29,303-313.
Renz P. 1970. Somé intermediates in the biosynthesis of vitamin B12. Methods in Enzymol., 18, 82-92.
Rigby P. W. J., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P., 1977. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I. J. Mól. Bioi., 113, 237.
Roof D. M. and J. R. Roth. 1988. Ethanolamine utilization in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol., 170,3855-3863.
Sanger F., S. Nicklen and A. R. Coulson. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci., 74, 5463-5468.
Sanders G., Tuite M. F., Holt G., 1986. Fungal cloning vectors. Trends Biotechnoi., 4, 93-98.
Scherer P., Höllriegel V., Krug C., Bokel M., Renz P., 1984. On the biosynthesis of 5-hydroxybenziumidazolylcobamide (vitamin B12-factor III) in Methanosarcina barkeri. Arch. Microbiol., 138, 354-359.
Schneider Z., Friedmann H., 1972. Studies on enzymatic dephosphorylation of vitamin B125’-phosphate. Arch. Biochem. Biophys., 152, 488-495.
Scott A. I., N. E. Mackenzie, P. J. Santander, P. E. Fagemess, G. Müller, E. Scneider, R. Seldmeier, and G. Womer. 1984. Biosynthesis of vitamin B12-Timing of the methylation steps between uro’gen III and cobyrinic acid. Bioorg. Chem. 12:356-352.
Southern E., 1975. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gél electrophoresis. J. Mól. Bioi., 98, 503-517.
Stachel S. E., G. An, C. Flores and E. W. Nester. 1985. A TnJ/ucZ transposon fór the random generation of b-galactosidase gene fusions: application to the analysis of gene expression in Agrobacterium. Embo J., 4, 891-898.
Staden R. and A. D. McLachlan. 1982. Codon preference and its use in identifying protein coding regions in long DNA sequences. Nucleic Acid Rés., 10, 141-156.
Stupperich E., I. Steiner and H. J. Eisinger. 1987. Substitution of Coa-(5-Hydroxybenzimidazolyl)Cobamide (Factor III) by bitamin B12 in Methanobacterium thermoautotrophicum. J. Bacteriol., 169:3076-3081.
Taylor J. W., J. Ott and F. Eckstein. 1985. The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high ffequency using phophorothioate-modified DNA. Nucl. Acid. Rés., 13, 8764-8765.
Viera J., Messing J., 1982. The pUC plasmids, an M13mp7-derived system fór insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene, 19, 259-268.
HU 216 653 Β
Wein-Hsiung L., L. Chi-Cheng and W. Chung-I. 1985. Evolution of DNA sequences. p 1-94. In R. J. Maclntyre (ed.), Molecular Evolutionary genetics. Plenum Press, New York and London.
Latta, Μ., M. Philit, I. Maury, F. Soubrier, P. Denéfle and J-F. Mayaux. 1990. Tryptophan promoter derivatives on multicopy plasmids: a comparative analysis of the expression potentials in Escherichia coli. DNA Cell Bioi., 9, 129-137.
Mayaux, J-F., E. Cerbelaud, F. Soubrier, D. Faucher and D. Pétré. 1990. Purification, cloning and primary structure of an enantioselective amidase from Brevibacterium sp. R312. Structural evidence fór a genetic coupling with nitrile-hydratase. 1990. J. Bacteriol., 172,6764-6773.
Belyaev, S. S., R. Wolkin, W. R. Kenealy, M. J. De Niro, M. J. Epstein and J. G. Zeikus. 1983. Methanogenic bacteria from Bondyuzhskoe oil field: generál characterization and analysis of stable-carbon isotopic fractionation. Appl. Environ. Microbiol., 45, 691-697.
Saiki, R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. A. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, 487-491.
Souillard, N., M. Margót, O. Possot and L. Sibold. 1988. Nucleotide sequence of regions homologous to NifH (nitrogenase Fe protein) from the nitrogén fixing archeabacteria Methanococcus thermolithotrophicum and Methanobacterium ivanovi: evolutionary implications. J. Mól. Evői., 2, 65-76.
Chen, E. L. and P. H. Seeburg. 1985. Supercoil sequencing: a fást and simple method fór sequencing plasmid DNA. DNA, 4, 165-170.
Saiki R. K., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis and H. Erlich. 1988. Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science, 239, 487-491.
Grunstein M., Hogness D., 1975. Colony hybridisation: a method fór the isolation of cloned DNAs that contains a specific gene. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72,3961-3971.
Cossart, P. and B. Gicquel-Sanzey. 1982. Cloning and sequence of the crp gene of Escherichia coli K 12. Nucleic Accid Rés., 10, 1363-1378.
Viera, J. and J. Messing. 1987. Production of single stranded plasmid DNA. Meth. Enzymol., 153, 3-11.
Barbieri P. G., Boretti A., Di Marco A., Migliacci A., and Spalla C. 1962. Further observations on the biosynthesis of vitamin B12 in Nocardia rugósa. Biochim. Biophys. Acta., 57, 599-600.
Renz P. 1968. Reaktionfolge dér enzymatischen synthese von vitamin B12 aus cobinamid bei Propionibacterium shermanii. Z. Physiol. Chem., 349, 979-981.
Ronzio R. A., and Barker H. A. 1967. Enzimic synthesis of guanosine diphosphate cobinamide by extracts of propionic acid bacteria. Biochemistry, 6, 2344-2354.
Thibaut D., Debussche L., and Blanche F. 1990. Biosynthesis of vitamin B12: Isolation of precorrin-6x, a metal-free precursor of the corrin macrocycle retaining five S-adenosylmethionine-derived peripheral methyl groups. Proc. Natl. Acad. Sci., 87, 8795-8799.
Ohta H., and Beck W. S. 1976. Studies of the ribosome-associated vitamin B12s adenosylating enzyme of Lactobacillus leichmannii. Arch. Biochem. Biophys., 174,713-725.
Brady R. O., Castanera E. G., and Barker H. A. 1962. The enzymatic synthesis of cobamide coenzymes. J. Bioi. Chem., 237, 2325-2332.
Fenton W. A., and Rosenberg L. E. 1978. Mitochondrial metabolism of hydroxocobalamin: synthesis of adenosylcobalamin by intact rat liver mitochondria. Arch. Biochem. Biophys., 189,441-447.
Vitols E., Walker G. A., and Huennekens F. M. 1966. Enzymatic conversion of vitamin B12s to a cobamide coenzyme, a-(5,6-dimethyl-benzimidazolyl)deoxyadenosylcobamide (Adenosyl-B12). J. Bioi. Chem., 241, 1455-1461.
Gimsing P., and Beck W. S. 1986. Determination of cobalamins in biological matériái. Methods Enzymol., 123,3-14.
Jacobsen W. J., Green R., and Brown K. L. 1986. Analysis of cobalamin coenzymes and others corrinoids by high-performance liquid chromatography. Methods Enzymol., 123, 14-22.

Claims (51)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidet vagy funkcionális fragmensét kódoló DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy
    - a 15., 16., 40., 41., 47. és 52. ábrákon bemutatott szekvenciával rendelkező cobA, cobF, cobC, cobD, cobE, cobF, cobG, cobH, cobl, cobl, cobF, cobF, cobM, cobN, cobO, cobF, cobQ, cobS, cobF, cobG, cobN, cobW, cobX és corA gének,
    - e szekvenciáknak a genetikai kód degeneráltságából eredő homológjai, vagy
    - ezek bármelyikével szigorú körülmények között hibridizáló és/vagy szignifikáns homológiát mutató természetes eredetű, szintetikus vagy rekombináns DNSszekvenciák vagy fragmenseik egyikét izoláljuk, vagy szintetikus vagy rekombináns DNSmódszerekkel előállítjuk.
  2. 2. Eljárás rekombináns DNS-szekvencia előállítására, azzal jellemezve, hogy legalább egy 1. igénypont szerint előállított DNS-szekvenciát egyéb DNS-szekvenciákkal működőképesen összeépítünk.
  3. 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett DNS-szekvenciá(ka)t expressziós szignálok kontrollja alá helyezzük.
  4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett expressziós szignálok a DNS-szekvenciával homológok vagy heterológok.
  5. 5. A 2-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns DNS-t egy expressziós plazmid részeként állítjuk elő.
    HU 216 653 Β
  6. 6. Eljárás expressziós plazmid előállítására, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, az 1. igénypont szerint előállított DNS-szekvenciát ennek expresszióját biztosító szekvenciákkal együtt egy alkalmas plazmidba működőképesen beépítünk.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy, a 2-4. igénypontok bármelyike szerint előállított rekombináns DNS-t építjük be egy replikációs rendszert és legalább egy szelekciós markert hordozó plazmidba.
  8. 8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az alábbi plazmidok egyikét állítjuk elő:
    - pXL1500 plazmid, amely tartalmazza a cobA, cobU, cobC és cobU géneket hordozó inszertet (12. ábra);
    - pXL723 plazmid, amely a cobC és cobD géneket tartalmazza (11. ábra);
    - pXL3O2 plazmid, amely tartalmazza a cobC és coóD géneket hordozó inszertet (12. ábra);
    - pXL1397 plazmid, amely tartalmazza cobU és cobC géneket hordozó inszertet (12. ábra);
    - pXL368 plazmid, amely a cobA és cobU géneket tartalmazza (29. ábra);
    - pXL545 plazmid, amely a cobU gént tartalmazza (11. ábra);
    - pXL545Q plazmid, amely olyan pXL545 plazmid, amelybe egy spektinomicinrezisztencia-gént beépítettünk;
    - pXL253 plazmid, amely tartalmazza a cobU, cobG, cobU, cobi, cobí, cobK, cobU és coóM géneket (13. ábra);
    - pXL367 plazmid, amely tartalmazza a cobU, cobG, cobU, cobl, cobl, cobK, cobU és coóM géneket (13. ábra);
    - pXLl 148 plazmid, amely a cobU és cobl géneket tartalmazza (24. ábra);
    - pXLl 149 plazmid, amely a cobU gént tartalmazza (24. ábra);
    - pXL1496 és pXL1546 plazmidok, amelyek a cobU gént tartalmazzák (26. ábra);
    - pXL525 plazmid, amely a cobA, cobU és cobUtől a coóM-ig felsorolt géneket tartalmazza (29. ábra);
    - pXL843 plazmid, amely a cobK, cobS és cobU géneket tartalmazza (36. ábra);
    - pXL699 plazmid, amely a 33. ábrán megadott szekvencia 251-2234 pozíciói által meghatározott, a cobN gént hordozó, BglII-XhoI fragmenst tartalmazza;
    - pXL1324 plazmid, amely a cobU gént tartalmazza (38. ábra);
    - pXL618 plazmid, amely a cobQ gént hordozó inszertet tartalmazza (46. ábra);
    - pXL623 plazmid, amely a cobU gént hordozó inszertet tartalmazza (46. ábra);
    - pXL593 plazmid, amely a cobU és cobN géneket tartalmazza; vagy
    - pXL1909 plazmid, amely a cobU, cobW, cobU és cobO géneket tartalmazza (46. ábra).
  9. 9. Eljárás gazdasejt előállítására, azzal jellemezve, hogy egy alkalmas sejtbe az 1 -5. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-szekvenciát vagy a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot bevezetjük.
  10. 10. Eljárás egy, a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptid előállítására, azzal jellemezve, hogy (i) egy alkalmas gazdasejtbe bevezetünk egy, az 1-5. igénypontok bármelyike szerint előállított DNSszekvenciát vagy egy, a 6-8. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot, (ii) ezt a rekombináns sejtet a DNS-szekvencia kifejeződését biztosító körülmények között tenyésztjük, és (iii) a kifejeződött polipeptidet kinyerjük.
  11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt egy prokarióta, eukarióta, állati vagy növényi sejt.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt egy Archebacterium vagy Eubacterium.
  13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a gazdasejt E. coli, Pseudomonas denitrificans, Rhizobium meliloti, Agrobacterium tumefaciens vagy Salmonella typhimurium.
  14. 14. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a precorrin-3 5’-dezoxi-5’-adenozil(Ado)kobirinsav-a,c-diamiddá való átalakításában részt vevő polipeptidet állítunk elő.
  15. 15. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15., 16., 40. és 41. ábrákon megadott COBB, COBF, COBG, COBH, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBS és COBT peptidek teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  16. 16. A 14. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekorrin-3 és a koribinsav-a,c-diamid transzferében egy metilcsoportnak a C-l, C-5, C-ll vagy C 17 pozícióba történő átvitelét katalizáló polipeptidet állítunk elő.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16. ábrán megadott COBF, COBJ, COBL és COBM peptidek teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  18. 18. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kobirsavnak kobinamiddá való átalakításában részt vevő polipeptidet állítunk elő.
  19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. ábrán megadott COBC és COBD peptidek teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  20. 20. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy S-adenozil-L-metionin: prekorrin-2 metiltranszferáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16. ábrán megadott COBI peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítunk elő.
  22. 22. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kobirin- és/vagy hidrogenokobirinsav-a,cdiamid szintetáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  23. 23. A 22. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. ábrán megadott COBB peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
    HU 216 653 Β
  24. 24. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prekorrin-8x mutáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 16. ábrán megadott COBH peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  26. 26. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15. ábrán megadott COBE peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  27. 27. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy nikotinsav-nukleotid: dimetil-benzimidazol foszforiboziltranszferáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 41. ábrán megadott COBU peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  29. 29. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kobalamin-5’-foszfát szintetáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  30. 30. A 29. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 41. ábrán megadott COBV peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  31. 31. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kobirsav szintetáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 47. ábrán megadott COBQ peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  33. 33. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy prekorrin-6x reduktáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  34. 34. A 33. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy aló. ábrán megadott COBK peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  35. 35. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kobamid GDP-kobamiddá való átalakításában részt vevő polipeptidet állítjuk elő.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy kobamin kináz és kobamid-foszfát guanililtranszferáz aktivitással rendelkező polipeptidet állítunk elő.
  37. 37. A 36. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 47. ábrán megadott COBP peptid teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  38. 38. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 40. ábrán megadott COBS, COBT és COBX peptidek teljes vagy részleges szekvenciáját tartalmazó polipeptidet állítjuk elő.
  39. 39. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 15., 16., 40., 41. és 52. ábrán megadott
    COBA, COBB, COBC, COBD, COBE, COBF, COBG, COBH, COBI, COBJ, COBK, COBL, COBM, COBN, COBP, COBQ, COBS, COBT, COBU, COBV, COBW és COBX fehérjéket állítjuk elő.
  40. 40. Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok vagy prekurzoraik termelésének fokozására, azzal jellemezve, hogy (i) ezeket a vegyületeket termelő vagy potenciálisan termelő mikroorganizmusba bevezetünk egy vagy több 1. igénypont szerint előállított DNS-szekvenciát, (ii) az így kapott mikroorganizmust a kobalaminok és/vagy kobamidok szintézisét és az említett DNSszekvenciák kifejeződését biztosító körülmények között tenyésztjük, és (iii) a termelődött kobalaminokat és/vagy kobamidokat vagy prekurzoraikat kinyerjük.
  41. 41. A 40. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy egy vagy több, a 3-6. igénypontok bármelyike szerint előállított DNS-szekvenciát, vagy ezeket a szekvenciákat tartalmazó, 7-9. igénypontok bármelyike szerint előállított plazmidot vezetjük be a mikroorganizmusba.
  42. 42. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusba bevezetett DNS-szekvencia a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisének egy limítálólépését katalizáló polipeptidet kódol.
  43. 43. A 41. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusba bevezetett DNS-szekvenciák a kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisének limitálólépéseit katalizáló polipeptideket kódolnak.
  44. 44. A 40-43. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus P. denitrificans, R. meliloti vagy A. tumefaciens.
  45. 45. A 44. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus P. denitrificans.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmus P. denitrificans SC510RifR.
  47. 47. A 40-46. igénypont bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a mikroorganizmusba egy 8. igénypont szerint előállított plazmidot vezetünk be.
  48. 48. A 40-47. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a P. denitrificans SC510 RifR törzsébe a cobA, cobE és cobE-tő\ a cobM-ig megnevezett géneket tartalmazó plazmidot (29. ábra) vezetjük be.
  49. 49. A 40-48. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a termelődött kobalaminokat és/vagy kobamidokat
    - szolubilizációval,
    - ciano formába alakítással és
    - tisztítással nyerjük ki.
  50. 50. A 40-49. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kobalamin a koenzim B12.
  51. 51. A 40-50. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a prekurzor a dekobaltkorrinoidok vagy korrinoidok egyike.
HU9202487A 1990-01-31 1991-01-30 Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására HU216653B (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9001137A FR2657622B1 (fr) 1990-01-31 1990-01-31 Polypeptides impliques dans la biosynthese des cobalamines et/ou des cobamides, sequences d'adn codant pour ces polypeptides, procede de preparation, et leur utilisation.

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9202487D0 HU9202487D0 (en) 1992-10-28
HUT63458A HUT63458A (en) 1993-08-30
HU216653B true HU216653B (hu) 1999-07-28

Family

ID=9393280

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9202487A HU216653B (hu) 1990-01-31 1991-01-30 Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására

Country Status (13)

Country Link
US (2) US6656709B1 (hu)
EP (1) EP0516647B1 (hu)
JP (2) JP3452316B2 (hu)
CN (1) CN1065916C (hu)
AT (1) ATE175237T1 (hu)
CA (1) CA2072023C (hu)
DE (1) DE69130704T2 (hu)
DK (1) DK0516647T3 (hu)
ES (1) ES2128317T3 (hu)
FR (1) FR2657622B1 (hu)
HU (1) HU216653B (hu)
RU (1) RU2136753C1 (hu)
WO (1) WO1991011518A1 (hu)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2657622B1 (fr) * 1990-01-31 1994-11-25 Rhone Poulenc Sante Polypeptides impliques dans la biosynthese des cobalamines et/ou des cobamides, sequences d'adn codant pour ces polypeptides, procede de preparation, et leur utilisation.
FR2698879B1 (fr) 1992-12-09 1995-01-13 Rhone Poulenc Biochimie gellules modifiées au niveau du catabolisme de la bétaïne, préparation et utilisations, notamment pour la production de métabolites ou d'enzymes.
EP0647717A1 (en) * 1993-10-06 1995-04-12 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method of producing vitamin B12
FR2748492B1 (fr) * 1996-05-13 1998-06-19 Rhone Poulenc Rorer Sa Procede de biosynthese permettant la preparation de cobalamines
US7074608B1 (en) 1998-05-12 2006-07-11 E. I. Du Pont De Nemours And Company Method for the production of 1,3-propanediol by recombinant organisms comprising genes for coenzyme B12 synthesis
TWI328612B (en) * 2002-07-25 2010-08-11 Dsm Ip Assets Bv Genes and their encoded polypeptides involved in the biosynthetic pathway of vitamin b12, vectors and host cells comprising the genes, and process for producing vitamin b12
CA2623215A1 (en) * 2004-09-23 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Assay for vitamin b12 absorption and method of making labeled vitamin b12
EP2522735A3 (en) * 2006-10-20 2013-02-13 Arizona Board Of Regents For And On Behalf Arizona State University Modified cyanobacteria
AU2007254595B2 (en) * 2007-12-20 2011-04-07 Canon Kabushiki Kaisha Constellation detection
CN104865324A (zh) * 2015-06-02 2015-08-26 宁夏泰瑞制药股份有限公司 一种5,6-二甲基苯并咪唑含量检测方法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3018225A (en) * 1959-03-09 1962-01-23 Merck & Co Inc Production of vitamin b12
NZ217336A (en) * 1985-08-26 1988-06-30 Amgen Production of biotin from microorganisms
FR2657622B1 (fr) * 1990-01-31 1994-11-25 Rhone Poulenc Sante Polypeptides impliques dans la biosynthese des cobalamines et/ou des cobamides, sequences d'adn codant pour ces polypeptides, procede de preparation, et leur utilisation.

Also Published As

Publication number Publication date
CA2072023A1 (fr) 1991-08-01
JP3452316B2 (ja) 2003-09-29
FR2657622A1 (fr) 1991-08-02
FR2657622B1 (fr) 1994-11-25
ES2128317T3 (es) 1999-05-16
ATE175237T1 (de) 1999-01-15
JP3734466B2 (ja) 2006-01-11
US6656709B1 (en) 2003-12-02
CN1054799A (zh) 1991-09-25
CA2072023C (fr) 2005-03-29
DE69130704T2 (de) 1999-05-27
JP2003230389A (ja) 2003-08-19
EP0516647A1 (fr) 1992-12-09
US20060019352A1 (en) 2006-01-26
EP0516647B1 (fr) 1998-12-30
JPH05506570A (ja) 1993-09-30
DE69130704D1 (de) 1999-02-11
CN1065916C (zh) 2001-05-16
HUT63458A (en) 1993-08-30
HU9202487D0 (en) 1992-10-28
RU2136753C1 (ru) 1999-09-10
DK0516647T3 (da) 1999-05-25
WO1991011518A1 (fr) 1991-08-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8187840B2 (en) Microorganism producing inosine and method of producing inosine using the same
Blanche et al. Purification, characterization, and molecular cloning of S-adenosyl-L-methionine: uroporphyrinogen III methyltransferase from Methanobacterium ivanovii
EP2264144A1 (en) Process for production of 5&#39;-guanylic acid
KR100200542B1 (ko) 바이오틴의 생물공학적 제조방법
HU216653B (hu) Eljárás kobalaminok és/vagy kobamidok bioszintézisében részt vevő polipeptidek rekombináns úton történő előállítására
JPH01174385A (ja) Ｄｎａおよびその用途
Miyagawa et al. Cloning of the Bacillus subtilis IMP dehydrogenase gene and its application to increased production of guanosine
JP3822006B2 (ja) シチジン５’−ジリン酸コリンの製造法
KR100679759B1 (ko) 관능기에 의해 수식된 이차 대사산물을 생산하는형질전환체 및 신규 생합성 유전자
US6890739B1 (en) Use of uridine diphosphate glucose 4-epimerase
EP1190064B1 (en) Vectors, cells and processes for pyrimidine deoxyribonucleosides production
KR101758446B1 (ko) 퀴놀린산 생산능을 가지는 미생물 및 이를 이용하여 퀴놀린산을 생산하는 방법
US20050227325A1 (en) Recombinant polynucleotide
KR100434108B1 (ko) L-트립토판의유전공학적제조방법
RU2177998C2 (ru) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ УРИДИН-ФОСФОРИЛАЗЫ, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pERURPHO1 И ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL 21(ДЕ3)/pERURPHO1 ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ
JP3830015B2 (ja) ウリジン５’−ジリン酸ガラクトースの製造法
JP2948265B2 (ja) ヌクレオシド・ホスホリラーゼをコードするｄｎａ断片
JPH10262683A (ja) 組換え耐熱性マルトースホスホリラーゼをコードする 遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター及び該ベクタ ーを含む形質転換体とその産生物
KR970005914B1 (ko) 유전자 재조합 미생물에 의한 5&#39;-구아닐산의 제조방법
KR960007743B1 (ko) 유전자 재조합 미생물에 의한 5&#39;-구아닐산의 제조방법
JPH03219881A (ja) 新規な組み換え体ｄｎａ及び生理活性物質の製造法
JP2003159075A (ja) 蛋白質、それをコードするｄｎａ、及び宿主細胞
JP2001169797A (ja) Ｓ―アデノシル−ｌ−メチオニンの酵素的製造法
Marie from Methanobacterium ivanovii
JPH05207886A (ja) 発酵法によるｌ−スレオニンの製造法

Legal Events

Date Code Title Description
BFD9 Temporary protection cancelled due to non-payment of fee