JP3734466B2 - コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関与するポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするｄｎａ配列、それらの調製および使用 - Google Patents

コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関与するポリペプチド、それらのポリペプチドをコードするｄｎａ配列、それらの調製および使用 Download PDF

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Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、コバラミンおよび／またはコバミド、ことに補酵素Ｂ12の生合成に関係する新規なポリペプチドに関する。本発明は、また、これらのポリペプチドの発現の原因となる遺伝子物質、ならびに遺伝子物質が調製することができる方法に関する。最後に、本発明は、組み換えＤＮＡ技術による、コバラミン、よりことに補酵素Ｂ12の産生を増幅する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術および課題】
ビタミンＢ１２はビタミンのＢ群に属する。それは水溶性ビタミンであり、悪性貧血に悩む患者の処理を可能とする因子として同定された。それは疲労した被検体において造血素を刺激するように一般に処方されるが、また、肝臓の疾患および神経欠損からなる多数の他の場合において、あるいは食欲刺激剤または強壮活性をもつ活性成分として、ならびに皮膚科学において使用される（Ｂｅｒｃｋ、１９８２、Ｆｒａｓｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３）。非反すう動物を飼う産業において、飼料は植物由来のタンパク質に基づき、飼料の１日量の中に飼料の１トン当たり１０〜１５ｍｇのビタミンＢ12を混入することが必要である（Ｂａｒｒｅｒｅ ｅｔ ａｌ．、１９８１）。
【０００３】
ビタミンＢ12はコバラミン（ｃｏｂａｌａｍｉｎｓ）として知られている分子のクラスに属し、その構造は第１図に表されている。コバミドは低級ヌクレオチドの塩基においてコバラミンと異なり、このコバミドの塩基は５，６−ジメチルベンズイミダゾールではなく、他の塩基、例えば、なかでもクロストリジウム・テルモアセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）およびメタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）により合成されるビタミンＢ12−因子ＩＩＩについて５−ヒドロキシベンズイミダゾールである（Ｉｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８４）。これらの構造の類似性は、コバラミンおよびコバミドの生合成の代謝経路が、大部分について、共有されているという事実を説明する。
【０００４】
コバラミンは、ほとんどもっぱらバクテリアにより、複雑であり、まだよく理解されていないプロセスに従い合成され、そのプロセスは４つの段階に分割することができる（第２図）：
ｉ）ウロポルフィリノゲンＩＩＩ（またはウロ’ゲンＩＩＩ）の合成、次いで
ｉｉ）ウロ’ゲンＩＩＩのコビリン酸への転化、次いで
ＩＩＩ）コビリン酸のコビンアミドへの転化、および
ｉｖ）特定の塩基を組み込んだ低級ループの構成（コバラミンの場合において５，６−ジメチルベンズイミダゾール）。
【０００５】
補酵素Ｂ12について、５’−デオキシアデノシル基の付加は、コリン環系の合成後、短時間に起こるであろう（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２）。
【０００６】
コバミドの場合において、低級塩基の合成および組み込みの工程のみが異なる。
【０００７】
コバラミンの生合成の最初の部分は非常によく知られている。なぜなら、それはヘムの生合成ならびにクロロフィルの生合成に共通するからである（Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ ｅｔ ａｌ．、１９８０）。それは、順次に、δ−アミノレブリネートシンターゼ（ＥＣ２．３．１３７）、δ−アミノレブリネートデヒドラーゼ（ＥＣ４．２．１．２４）およびウロ’ゲンＩＩＩコシンターゼ（ＥＣ４．２．１．７５）、これはスクシニル−ＣｏＡおよびグリシンをウロ’ゲンＩＩＩに転化する、を包含する。しかしながら、第１工程はある有機体［例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ａｖｉｓｓａｒ ｅｔ ａｌ．、１９８９）およびメタノジェニック（ｍｅｔｈａｎｏｇｅｎｉｃ）バクテリア（Ｋａｎｎａｎｇａｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８９）、例えば］において、マルチ酵素複合体によるグルタミン酸のδ−アミノレブリン酸への転化により起こる。
【０００８】
ウロ’ゲンＩＩＩとコビリン酸との間において、わずかに３つの中間誘導体が今日までに精製された；それらは因子ＦＩ、ＦＩＩおよびＦＩＩＩであり、これらは、それぞれ、３つの中間体プレコリン−１、プレコリン−２およびプレコリン−３の酸化産生物であり、これらはウロ’ゲンＩＩＩのモノ−、ジ−およびトリメチル化誘導体に相当する（第３図）；これらの中間体はメチル基のＳＡＭ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）からウロ’ゲンＩＩＩへの位置Ｃ−２、Ｃ−７およびＣ−２０における連続的転移である。コビリン酸を産生する他の反応は、ＳＡＭからＣ−１７、Ｃ−１２、Ｃ−１５およびＣ−５におけるメチル基の５つのそれ以上の転移を別として、Ｃ−２０における炭素の排除、Ｃ−１２における脱カルボキシル反応およびコバルト原子の挿入である（第４図）。これらの生合成の工程は、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）またはクロストリジウム・テタノモルフム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）の細胞を含まない抽出物について試験管内で実施した実験から推定されてきている。これらの抽出物において、コビリン酸は、適当な嫌気性条件下にインキュベーション後、ウロ’ゲンＩＩＩの転化により得られる（Ｂａｔｔｅｒｂｙ ｅｔ ａｌ．、１９８２）。コバラミン産生バクテリアの抽出物との引き続くインキュベーションによりコリノイドに転化することができるプレコリン−３とコビリン酸との間の中間体は、今日まで分離されてきていない。これらの中間体を分離および同定する困難は、
ｉ）それらのより大きい不安定性、
ｉｉ）酸素に対するそれらの感受性、および
ｉｉｉ）それらの生体内蓄積の低いレベル、
のためであると思われる。この経路のこの部分において、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のただ１つの酵素が精製されそして研究されてきている；それはＳＡＭ：ウロ’ゲンＩＩＩメチルトランスフェラーゼ（Ｂａｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）であり、これはＳＵＭＴと呼ばれる。
【０００９】
コビリン酸とコビンアミドとの間において、次の反応を実施する：
ｉ）５’−デオキシアデノシル基の付加（補酵素Ｂ12が合成すべき化合物である場合）、
ｉｉ）アミン基の付加による７つのカルボキシル官能性の６つのアミド化、および
ｉｉｉ）（Ｒ）−１−アミノ−２−プロパノールの付加による最後のカルボキシル官能性（ピロール環Ｄのプロピオン鎖）のアミド化（第２図）。
【００１０】
アミド化のある順序が実際に存在するかどうかは説明されなかった（Ｈｅｒｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．、１９７０）。最後に、経路のこの部分における活性のアッセイは、５’−デオキシアデノシル基の付加に関するものを除外して、記載されなかった（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２）。
【００１１】
コバラミン、例えば、補酵素Ｂ12の生合成の最後の工程は、第５図に記載する４つの連続的相からなる（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２）、すなわち：
ｉ）コビナミドのアミノプロパノール残基のヒドロキシル基のコビナミドホスフェートへのリン酸化、次いで
ｉｉ）グアノシン５’−トリホスフェートとの反応によりグアノシンジホスフェートの付加；得られた化合物はＧＤＰ−コビナミドであり（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ、１９７５）、これを
ｉｉｉ）リボフラビンからそれ自体合成した、５，６−ジメチルベンズイミダゾールと反応させて、アデノシルコバラミン５’−ホスフェートを産生する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．、１９６８）、これは
ｉｖ）脱リン酸化すると、補酵素Ｂ12に導く（ＳｃｈｎｅｉｄｅｒおよびＦｒｉｅｄｍａｎｎ、１９７２）。
【００１２】
コバラミンを産生することができるバクテリアのうちで、次のものをとくに述べることができる：
アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）
アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）
巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）
クロストリジウム・スチックランジイ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｓｔｉｃｋｌａｎｄｉｉ）
クロストリジウム・テタノモルフム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）
クロストリジウム・テルモアセチクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｈｅｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）
コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＸＧ
フバクテリウム・リモスム（Ｆｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｉｍｏｓｕｍ）
メタノバクテリウム・アルボフィリクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｒｂｏｐｈｉｌｉｃｕｍ）
メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖ ａｎｏｖｉｉ）
メタノバクテリウム・ルミナンチウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ）
メタノバクテリウム・テルモアウトトロフィクム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ）
メタノサルシナ・バルケリ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ ｂａｒｋｅｒｉ）
プロピオノバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）
プロタミノバクテル・ルベル（Ｐｒｏｔａｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ ｒｕｂｅｒ）
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）
シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｎａ） リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）
ロドシュードモナス・シャエロイデス（Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ）
ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ） スピルリナ・プラテンシス（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ ｐａｌｔｅｎｓｉｓ）
ストレプトミセス・アンチビチクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｕｓ）
ストレプトミセス・アウレオファシエンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）
ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）
ストレプトミセス・オリバセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｏｌｉｖａｃｅｕｓ）
工業的レベルにおいて、生合成のメカニズムの複雑さが大きい結果、コバラミン、ことにビタミンＢ12の産生はもっぱら微生物学的である。それはバクテリアシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）およびプロピオニバクテリウム・フレウデンレイチイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）の大きい体積の培養により実施される（Ｆｌｉｒｅｎｔ、１９８６）。
工業的産生に使用する菌株は野生型菌株から誘導される；それらはランダム突然変異の多数のサイクルおよびコバラミン産生のために改良されたクローンの多数の選択を実施することができる（Ｆｌｏｒｅｎｔ、１９８６）。突然変異は、突然変異誘発因子との突然変異誘発によるか、あるいは物理的処理、例えば、紫外線による処理により得られる（Ｂａｒｒｅｒｅ ｅｔ ａｌ．、１９８１）。この実験的方法により、ランダム突然変異は得られ、そしてコバラミンの産生を改良する。例えば、ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）およびロウゼンハイム（Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ）（１９６０、米国特許第２，９３８，８２２号）により最初に分離されたシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のもとの菌株から、この微生物の産生は１０年の間に、前述の技術により、０．６ｍｇ／ｌから６０ｍｇ／ｌに徐々に増加したことが記載されている（Ｆｌｏｒｅｎｔ、１９８６）。プロピオニバクテリウム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｒｉｕｍ）属［プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）（ＡＴＣＣ １３６７３）およびおよびフレウデンレイチイ（ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）（ＡＴＣＣ６２０７）］のバクテリアについて、同一の産生値が文献に記載されているように思われる；例えば、６５ｍｇ／ｌの産生は記載された（欧州特許第８７，９２０号）。しかしながら、コバラミンを過度に産生する突然変異またはコバラミンのそれらの産生を顕著に改良する突然変異の容易な選択または同一を可能とするスクリーンはまだ記載されていない。
【００１３】
遺伝子のレベルで、研究は今日までほとんど実施されてきていない。ｃｏｂ遺伝子（生合成プロセスに関係する酵素をコードする）のクローニングは巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において記載された（Ｂｒｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９８６）。１１の相補的基は、巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のＤＮＡの異なる断片を有するプラスミドをもつ巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のｃｏｂ突然変異の化合物により同定された。これらの遺伝子は、１２ｋｂの断片により支持される同一位置にグループをなす。 研究は、また、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｃｏｂ遺伝子について実施された。これらのクローニングは記載されてきていないが、コバラミン生合成のためのほとんどすべての遺伝子は染色体のマイニュート遺伝子の間で一緒にグループなっていることが示された（ＪｅｔｅｒおよびＲｏｔｈ、１９８７）。ウロ’ゲンＩＩＩのプレコリン−２への転化を可能としなくてはならない、ｃｙｓＧ位置のみは、遺伝子のこの群の一部分を形成しない。しかしながら、この位置によりエンコードされる活性およびまたそに生化学的性質は記載されてきていない。
【００１４】
さらに、いくつかの表現型はｃｏｂ突然変異に関連づけられた。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）および巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）において、ｃｏｂ突然変異は炭素源としてまたは窒素源としてエタノールアミンを有する最小培地上で成長をもはや示さない（ＲｏｏｆおよびＲｏｔｈ、１９８８）。これはエタノールアミンの異化の酵素、すなわち、エタノールアミンアンモニア−リアーゼ（ＥＣ４．３．１．７）はコファクターとして補酵素Ｂ12を有する；ｃｏｂ突然変異は補酵素Ｂ12をもはや合成せず、そして炭素源としておよび／または窒素源としてエタノールアミンでもはや成長することができる。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）のｍｅｔＥ突然変異は、メチルコバラミン依存性ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．１．１．１３）のみを保持する。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ｍｅｔＥのｃｏｂ突然変異はメチオニンについて栄養要求変異種である（Ｊｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８４）。
【００１５】
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔ ｒｉｆｉｃａｎｓ）およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）において、コバラミンの合成の完全な欠如に関連する表現型は今日まで記載されてきていない。
【００１６】
最後に、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）についての研究（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）は、このバクテリアのｃｏｂ遺伝子を有するＤＮＡ断片のクローニングに導いた。これらは少なくとも３０ｋｂのＤＮＡが有する４つの相補性の群に分布している。少なくとも１４の相補性の群が、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｃｏｂ突然変異、およびｃｏｂ遺伝子を有するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡ断片をもつシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｄａ）の異種相補性により同定された。
【００１７】
しかしながら、従来、これらの遺伝子のいずれも精製されず、そしてヌクレオチド配列は記載されてきていない。同様に、タンパク質の同定およびこれらの遺伝子に起因する触媒機能は記載されてきていない。組み換えＤＮＡ技術によるコバラミンの産生は改良することができなかった。巨大菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）のｃｏｂ遺伝子の増幅は、それらをクローニングした菌株において、コバラミンの産生の改良を生じない（Ｂｒｅｙ ｅｔ ａｌ．、１９８６）。ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）において、研究したｃｏｂ遺伝子の強い転写が観察される条件を決定するために、生理学的研究が実施されてきている。これらの条件下に、コバラミンの産生は存在しないが、生合成経路の遺伝子は標準の条件下より多く発現される。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
本発明は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の正確な同定から生ずる。それゆえ、本発明の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に関する。よりことに、本発明の主題は、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ、ｃｏｂＤ、ｃｏｂＥ、ｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬ、ｃｏｂＭ、ｃｏｂＮ、ｃｏｂＯ、ｃｏｂＱ、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ、ｃｏｂＵ、ｃｏｂＶ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＸおよびｃｏｒＡ遺伝子、遺伝暗号の同義性から生ずるこれらの遺伝子と相同性、およびまたこれらのＤＮＡ配列またはこれらのＤＮＡ配列の断片とハイブリダイゼーションしおよび／またはそれらと有意の相同性を示し、そしてコバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードする、ＤＮＡ配列（自然、合成または組み換え）。本発明の主題は、また、これらのＤＮＡ配列を含有する遺伝子である。
【００１９】
本発明によるＤＮＡ配列は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｄａ）のｃｏｂ突然変異の相補性；およびメタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）の相補性により誘導された、工業的菌株、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０から分離された。得られたクローンは、正確に、とくにトランスボゾンＴｎ５の誘導体の挿入を使用するマッピングにより分析することができた。これらの遺伝子研究は、ｃｏｂまたはｃｏｒ遺伝子を制限地図上の局在化を可能としそしてこれらの配列決定の実施を可能とした。次いで、オープンリーディングフレームの分析は、これらのＤＮＡ断片の解読領域の実証を可能とした。
【００２０】
本発明の主題は、また、他のバクテリアのｃｏｂ遺伝子をクローニングするためのこれらのヌクレオチド配列の使用である。事実、同一の活性を触媒するタンパク質について、配列は保存され、発散は発展する発散である（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｉｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８５）。本発明において、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードする異なる微生物のヌクレオチド配列の間の相同性が存在することが示された。見られる差は発展する同義性から、および研究する微生物のゲノムの中のＧＣの百分率に連鎖した遺伝暗号の同義性から生ずる（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｉｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８５）。
【００２１】
本発明によれば、とくにシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１または２以上のＤＮＡ配列、またはこれらの断片を使用するか、あるいはコドンの使用および研究しようとするバクテリアのＤＮＡの中のＧＣの百分率に関して特定の程度の同義性を表す同様な配列を使用して、プローブを作ることができる。これらの条件下に、プローブと研究するゲノムのＤＮＡの断片との間の特定のハイブリダイゼーションシグナルを検出することができる；この特定のハイブリダイゼーションシグナルはプローブとバクテリアの等しい機能のｃｏｂ遺伝子とのハイブリダイゼーションに相当する。次いで、ｃｏｂ遺伝子ならびにそれらの産生物を分離し、精製し、そして特性決定することができる。こうして、本発明は、ハイブリダイゼーションにより、微生物のコバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するヌクレオチド配列およびポリペプチドへのアクセスを得ることのできる手段を提供する。
【００２２】
本発明の主題は、また、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードする少なくとも１つのＤＮＡ配列を含有する組み換えＤＮＡ、およびとくに前記１または２以上の配列が発現シグナルのコントロール下に配置されている組み換えＤＮＡである。
【００２３】
これに関して、プロモーターの領域は、とくに、ＤＮＡ配列の５’末端に位置する。強いバクテリアのプロモーター、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのトリプトファンのオペロンＰｔｒｐまたはラクトースのオペロンＰｌａｃのプロモーター、バクテリオファージラムダの左または右のプロモーター、バクテリア、例えば、コリネバクテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）のファージの強いプロモーター、グラム陰性バクテリアの機能的プロモーター、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｔａｃプロモーター、ＴＯＬプラスミドのキシレン異化遺伝子のＰｘｙｌＳプロモーターおよび枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）Ｐａｍｙのアミラーゼのプロモーターを使用するすることができる。酵母のグリコール分解遺伝子から誘導されるプロモーターを、また、述べることができ、それらの例は次の通りである：ホスホグリセレートキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ラクターゼまたはエノラーゼをコードする遺伝子のプロモーター、これらは、組み換えＤＮＡを真核生物の宿主の中に導入するとき、使用することができる。リボソーム結合部位は、また、ＤＮＡ配列の５’末端に位置し、そして相同性または異種であることができ、例えば、バクテリオファージラムダのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位である。
【００２４】
転写停止に必要なシグナルはＤＮＡ配列の３’末端に位置することができる。
【００２５】
次いで、本発明による組み換えＤＮＡを選択した発現シグナルと適合性の宿主細胞の中に直接導入するか、あるいは問題のＤＮＡ配列を安定な方法で宿主細胞の中に導入することができるプラスミドベクターの中にクローニングすることができる。
【００２６】
本発明の他の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を含有する、これにより得られたプラスミドに関する。さらに詳しくは、これらのプラスミドは、また、機能的複製系および選択可能なマーカーを含有する。
【００２７】
本発明の主題は、また、上に定義した１または２以上のＤＮＡ配列、または前に定義したプラスミドが導入された宿主細胞である。
【００２８】
本発明の他の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドを産生する方法に関する。この方法に従い、宿主細胞を前述のＤＮＡ配列で形質転換し、この形質転換された細胞を前記配列の発現のための条件下に培養し、次いで産生されたポリペプチドを回収する。
【００２９】
この目的に使用できる宿主細胞は、原核生物または真核生物、動物の細胞または植物の細胞である。好ましくは、それらはバクテリア、ことに属大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）またはリゾビウム・メリロチ（Ｒ．ｍｅｌｉｌｏｔｉ）のバクテリアから選択されるであろう。
【００３０】
本発明によるＤＮＡ配列の他の使用は、組み換えＤＮＡ技術による、コバラミンおよび／またはコバミドの産生の増幅法である。実際には、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成の代謝フラックスの制限が生合成経路の活性の制限のためである場合、組み換えＤＮＡ技術（遺伝子の増幅、転写／翻訳シグナルとより有効なシグナルとの置換など）を使用してこの同一の酵素の発現を増加することによるこの活性の増加は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成の増加に導くであろう。この場合において、調節された酵素に相当する１または２以上のｃｏｂ遺伝子を特別に試験管内で突然変異誘発して、その産生物が産生の改良を妨害する調節メカニズムを失った、突然変異された遺伝子を産生することができる。
【００３１】
本発明による方法は、コバラミンおよび／またはコバミドを産生するか、あるいはこれらの化合物を部分的に産生する（すなわち、生合成の１または２以上の工程を欠く）微生物を、上に定義したＤＮＡ配列で形質転換し、次いでこの微生物を前記配列の発現およびコバラミンおよび／またはコバミドの合成のための条件下に培養し、そして最後に産生されたコバラミンおよび／またはコバミドを回収することにある。このような方法は、とくに、５および６ページに述べたすべての産生的微生物、さらに詳しくは、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ、またはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ属の微生物に適用可能である。好ましい実施態様において、微生物はＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、ことに菌株ＳＣ５１０である。潜在的に産生的な微生物に関すると、使用する配列はその微生物が実施することができない生合成の工程に相当するものである。
【００３２】
本発明を使用して、そして前述の種々の方法により、コバラミンおよび／またはコバミドの産生の改良はコバラミンおよび／またはコバミドを産生するか、あるいは部分的に産生する微生物について得ることができる。この微生物をコバラミンの産生および導入したＤＮＡ配列の発現に適当な条件下に培養することで十分であろう。この培養はバッチ式で、あるいは連続的方法で実施することができ、そしてコバラミンの精製は工業的に既に使用されている方法により実施することができる（Ｆｌｏｒｅｎｔ、１９８６）。これらの方法は、なかでも、次の工程からなる：
ｉ）コバラミンの可溶化およびそれらのシアノ型への転化（例えば、発酵マスト（ｍｕｓｔ）を亜硝酸ナトリウムの存在下にシアン化カリウムとともに熱処理する），次いで
ｉｉ）種々の工程におけるシアノコバラミンの精製、種々の工程の例は次のものであることができる：
ａ）異なる基質、例えば、アンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ）ＩＲＣ−５０、ドウウェクス（Ｄｏｗｅｘ）１×２またはアンバーライトＸＡＤ−２上の吸着、引き続く水／アルコールまたは水／フェノール混合物を使用する溶離、次いでｂ）有機溶媒の中の抽出、および最後に
ｃ）試薬の添加または適当な溶媒の中の希釈によるか、あるいは発現ベクターによる、有機相からの沈澱または結晶化。
【００３３】
本発明は、さらに、コバラミンを産生するバクテリアのコバラミンの産生を累積改良により改良することが、組み換えＤＮＡ技術により、可能であることを示す。これは、まず前述したように最初の改良を獲得し、次いでなお組み換えＤＮＡ技術を使用して、すなわち、例えば、コバラミン生合成のための遺伝子を増幅することによって、この改良を改良することである。
【００３４】
本発明の他の主題は、コバラミンおよび／またはコバミドの生合成に関係するポリペプチドポリペプチドに関する。とくに、本発明の主題は、前述のＤＮＡ配列によりエンコードされ、そしてコバラミンおよび／またはコバミドの生合成経路に関係する、すべてのポリペプチド、またはこれらのポリペプチドの誘導体または断片である。これらのポリペプチドのアミノ酸配列、ならびにそれらの物理化学的のいくつかを記載する。酵素の活性または特定した性質は、また、それらの各々に関連する。
【００３５】
これに関して、本発明の主題は、プレコリン−３のコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化に参加する、よりことにメチル基のＳＡＭから位置Ｃ−１、Ｃ−５、Ｃ−１１、Ｃ−１５およびＣ−１７への転移に参加するポリペプチドである。
【００３６】
本発明の主題は、また、
・コビリン酸のコビナミドへの転化に参加するか、あるいは
・Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラーゼ（ＳＰ2ＭＴ）活性を有するか、あるいは
・コビリン酸および／またはヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ活性を有するか、あるいは
・プレコリン−８ｘムターゼ活性を有するか、あるいは
・ニコチネート−ヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有するか、あるいは
・コバラミン−５’−ホスフェートシンターゼ活性を有するか、あるいは
・コビリン酸配列特異的活性を有するか、あるいは
・コブ（Ｉ）アラミンアデノシル−トランスフェラーゼ活性を有するか、あるいは
・プレコリン−６ｘリダクターゼ活性を有するか、あるいはヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化に参加する、
ポリペプチドである。
【００３７】
有利には、本発明の主題は、第１５図、第１６図、第４０図、第４１図および第４７図に表わされているＣＯＢＡ、ＣＯＲＡ、ＣＯＢＢ、ＣＯＢＤ、ＣＯＢＥ、ＣＯＢＦ、ＣＯＢＧ、ＣＯＢＨ、ＣＯＢＩ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＫ、ＣＯＢＬ、ＣＯＢＭ、ＣＯＢＮ、ＣＯＢＯ、ＣＯＢＰ、ＣＯＢＱ、ＣＯＢＳ、ＣＯＢＴ、ＣＯＢＵ、ＣＯＢＶ、ＣＯＢＷ、ＣＯＢＸおよびＣＯＲＡのタンパク質から選択されるポリペプチドである。
【００３８】
さらに、前述のハイブリダイゼーションプローブの使用は、他の微生物において分離された遺伝子から、他の微生物の等しい機能的ポリペプチドを特性決定および分離することを可能とする。このようにして、本発明は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質の配列が同一の型の活性を表す他の微生物のタンパク質配列と有意に相同性であることを示す。異なる微生物において同一反応を触媒するこれらのＣＯＢタンパク質の間において、他の進化する距離のみは導入された変異型を有する（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｌｉｕｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８５）。本発明の主題は、また、これらの等機能のポリペプチドである。
【００３９】
特定の酵素活性の帰属は、種々の方法に従い実施することができる分析の結果である。とくに、ＳＡＭ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン）に関する試験管内親和性の研究は、メチルトランスフェラーゼ活性をＳＡＭに結合できるタンパク質への帰属、それゆえウロ’ゲンＩＩＩとコビリン酸との間に存在するメチル基の転移の工程の１つへのその関係の帰属を可能とする。これらのポリペプチドの活性を評価する他の手段は、これらのポリペプチド（相補的実験により同定された）を発現することができない突然変異の中に蓄積するコバラミンの生合成経路における中間体をアッセイすることにある。これらの分析により、問題のポリペプチドがその基質として蓄積された中間体を有し、これにより生合成経路の中にその活性を位置させかつ定めることができることを推定することができる。本発明は、また、コバラミンおよび／またはコバミドを産生する菌株に適用できる、生合成経路の酵素活性をアッセイする方法を記載する。これらのアッセイにより、これらの化合物を産生する菌株からアッセイした酵素活性を精製することができる。この精製された活性から、問題のＣＯＢタンパク質のＮＨ2末端配列、あるいはこのタンパク質のサブユニットのそれを決定することができ、これにより問題の活性をコードする１または２以上の構造遺伝子を同定することができる。シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）について、生合成経路の活性をコードする構造遺伝子は、各ＮＨ2末端配列について、同一のＮＨ2末端配列を有するＣＯＢタンパク質を見いだすことによって同定される。
【００４０】
本発明は、また、コバラミンまたは他のコリノイドの生合成経路における中間体を同定し、そしてコバラミンを産生する菌株においてアッセイする方法を記載する。これらの中間体は培養マストおよび細胞それら自体の両者においてアッセイすることができる。アッセイできる中間体は、生合成経路においてコビリン酸の後に存在するすべてのコリノイド、すなわち、コビリン酸を別として、コビリン酸モノアミド、コビリン酸ジアミド、コビリン酸トリアミド、コビリン酸テトラアミド、コビリン酸ペンタアミド、コビル酸、コビナミド、コビナミドホスフェート、ＣＤＧ−コビナミド、補酵素Ｂ12ホスフェートおよび補酵素Ｂ12である。これらの産生物の非アデノシル化形態は、また、この技術によりアッセイすることができる。
【００４１】
本発明の他の主題および利点は、以下の実施例および図面を読むと明らかにとなるであろう。これらの実施例および図面は例示であるかつ非限定的であると考慮すべきである。
Figure 0003734466
Figure 0003734466
クローニング、分子生物学および生化学の一般技術
分子生物学の古典的方法、例えば、塩化カルシウム／臭化エチジウムの勾配のプラスミドＤＮＡの遠心、制限酵素による消化、ゲル電気泳動、アガロースゲルからのＤＮＡ断片の電気溶離、Ｅ．ｃｏｌｉなどの中の形質転換は文献に記載されている（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２、Ａｕｓｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。
【００４２】
制限酵素はニュー−イングランド・バイオラブス（Ｎｅｗ−Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｂｉｏｌａｂｓ）、ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｉｅｓ）（ＢＲＬ）またはアマーシャム・リミテッド（Ａｍｅｒｓｈａｍ）から供給された。リンカーのオリゴヌクレオチドはＢｉｏｌａｂｓから供給された。
【００４３】
結合のために、ＤＮＡ断片をそれらの大きさに従い０．７％のアガロースまたは８％のアクルアミドゲル上で分割し、電気溶離により精製し、フェノールで抽出し、エタノールで沈澱させ、次いで５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．４、１０ミリモルのＭｇＣｌ2、１０ミリモルのＤＴＴ、２ミリモルのＡＴＰ中で、ファージＴ４ＤＮＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下にインキュベーションする。
【００４４】
必要に応じて、突出した５’末端を有するＤＮＡ断片を次の緩衝液の中で３７℃において３０分間子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼ（ＣＩＰ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で処理することによって脱リン酸する：１００ミリモルのグリシン、１ミリモルのＭｇＣｌ2、１ミリモルのＺｎＣｌ2、ｐＨ１０．５。同一技術を突出または平滑３’末端の脱リン酸のために使用するが、処理を３７℃において１５分間、次いで５６℃において１５分間実施する。酵素は反応混合物を１％のＳＤＳおよび１００ミリモルのＮａＣｌの存在下に６８℃に１５分間加熱することによって不活性化し、次いでフェノール／クロロホルムで抽出し、そしてエタノール沈澱する。
【００４５】
突出５’末端のフィルインをＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片（Ｂｉｏｌａｂｓ）で実施する。この反応は室温において５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．２、０．４ミリモルのｄＮＴＰｓ、１０ミリモルのＭｇＳＯ４、０．１ミリモルのＤＴＴ、５０ｍｇ／ｍｌのＢＳＡの中の３０分間実施する。突出３’末端のフィルインをファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下に製造業者の推奨に従い実施する。突出末端の消化をＳ１ヌクレアーゼ（ＢＲＬ）を使用する制限処理により製造業者の推奨に従い実施する。リンカーのオリゴヌクレオチドを既に記載されているようにＤＮＡ断片の末端上に付加する（Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８２）。
【００４６】
オリゴデオキシヌクレオチドを使用する試験管内突然変異誘発は、タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、１９８５により開発された方法に従い、アマーシャムから入手されるキットを使用して実施する。
【００４７】
結合したＤＮＡを受容性とした菌株を形質転換する：プラスミドについてＥ．ｃｏｌｉ ＭＣ１０６０［Ｄ（ｌａｃＩＯＰＺＹＡ）Ｘ７４、ｇａｌＵ、ｇａｌＫ、ｓｔｒＡr，ｈｓｄＲ］またはバクテリオファージＭ１３から誘導されたファージの複製形態についてＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１［Ｄ（ｌａｃ ｐｒｏＡ，Ｂ）、ｓｕｐＥ、ｔｈｉ、ｈｓｄＤ５／Ｆ’ｔｒａＤ３６、ｐｒｏＡ+、Ｂ+、ｌａｃＩq、ｌａｃＺＤＭ１５］。
【００４８】
プラスミドＤＮＡは、バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）およびドリイ（Ｄｏｌｙ）、１９７９の技術に従い精製する。プラスミドＤＮＡのミニ調製物はクレイン（Ｋｌｅｉｎ）ら、１９８０のプロトコルに従いつくる。グラム陰性バクテリアの染色体ＤＮＡの調製物は既に記載されているようにして生成する(Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９)。
【００４９】
放射性プローブは既に詳述されている方法に従いニック翻訳により調製する（Ｒｉｇｂｙ ｅｔ ａｌ．、１９７７）。ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションならびにニトロセルロース膜上のニコチン酸の固定化は既に記載されているようにして実施する（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。所望の組み換えクローンの小さい確率が存在するクローニングにおいて、組み換えクローンは既に記載されているようにフィルター上のハイブリダイゼーション後に見いだされる（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２）。
【００５０】
ＤＮＡ断片のヌクレオチド配列は連鎖停止法により決定する（Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９７７）。反応混合物において、ｄＧＴＰを７−デアザ−ｄＧＴＰで置換して、ＤＮＡの中のＧＣの高い百分率により引き起こされるアガロースゲルの電気泳動の間のバンドの抑制を回避する。
【００５１】
細菌学的部分のために使用する培地は既に発表された（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８２）。ＰＳ４培地の中の培養は既に記載されているように実施する(Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ.、１９８９）；シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrおよびＧ２Ｒｉｆrを次のようにして培養する：ＰＳ４培地（２５ｍｌ）および、必要に応じて、各菌株がをもつプラスミドのための選択的抗生物質を含有する２５０ｍｌのエルレマイヤーを、Ｌ培地（Ｍｉｌｌｅｒ １９７２）の中の飽和予備培養物の１／１００希釈物および、必要に応じて、各菌株がをもつプラスミドのための選択的抗生物質で接種する；これらの培養物を３０℃において６日間インキュベーションし、次いでマスト（ｍｕｓｔ）をコバラミンについて分析するか、あるいは経路のある酵素の酵素的活性について分析する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｄａ）およびリゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）を３０℃において培養する；ただし特記しない限り、それらはＬ培地中で培養する。
【００５２】
バクテリアの接合は既に記載されているように実施する（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【００５３】
全体のタンパク質の抽出物を既に記載されているように生成する（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。
【００５４】
変性条件下にアクリルアミドゲル中のタンパク質の分析的電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は、既に記載されているように実施する（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。ファストシステム（ＰｈａｓｔＳｙｓｔｅｍ）装置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）をラエンリ（Ｌａｅｍｌｉ）の不連続的緩衝液系（Ｌａｅｍｌｉ、１９７０）を、また、使用する；異なるゲルを分析すべきタンパク質の分子量ならびにそれらの精製に従い使用する：
ファストゲル（ＰｈａｓｔＧｅｌ）の勾配８−２５
ファストゲル・ホモゲネアス（ＰｈａｓｔＧｅｌ Ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ）１２．５
染色はクーマッシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｉｅ ｂｌｕｅ）を使用してファストゲル・ブルーＲ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の助けにより、あるいはファストゲル銀キット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を使用して製造業者のインストラクションに従い実施する。
【００５５】
タンパク質のＮＨ2末端配列は、エドマン（Ｅｄｍａｎ）劣化技術により、自動化配列決定装置（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４０７Ａ型）およびこれにカップリングしたフェニルチオヒダントイン誘導体の同定のためのＨＰＬＣ装置を使用して決定する。
【００５６】
【実施例】
実施例１−Ｃｏｂ遺伝子を含有するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡ断片の分離
この実施例は、Ｃｏｂ遺伝子を有するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡ断片の分離を記載する。それらの断片は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびシュードモナス・プチダ（Ｐ．ｐｕｔｄａ）のＣｏｂ突然変異のための相補性実験により実証した（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【００５７】
これらのＣｏｂ突然変異は、ミラーの技術（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９７２）に従いＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジンを使用する突然変異誘発によるか、あるいはトランスボゾンＴｎ５の挿入により得た。この方法において、コバラミンを合成することができない菌株が実証され、そしてことにＰ．ｐｕｔｄａのＣｏｂ突然変異Ｇ５７２およびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＣｏｂ突然変異Ｇ１５９、Ｇ１６１、Ｇ１６４、Ｇ１６９、Ｇ１７１、Ｇ２５８、Ｇ６０９、Ｇ６１０、Ｇ６１１、Ｇ６１２、Ｇ６１３、Ｇ６１４、Ｇ６１５、Ｇ６１６、Ｇ６２０、Ｇ６２２、Ｇ６２３、Ｇ６３０、Ｇ６３２、Ｇ６３３、Ｇ６３４、Ｇ６３８、Ｇ６４２、Ｇ６４３、Ｇ２０３４、Ｇ２０３５、Ｇ２０３７、Ｇ２０３８、Ｇ２０３９、Ｇ２０４０、Ｇ２０４１、Ｇ２０４２およびＧ２０４３が実証された。
【００５８】
同時に、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのゲノムのＤＮＡのライブラリーを移動可能な広い宿主範囲のベクターｐＸＬ５９の中で、制限酵素の存在下に５μｇのＤＮＡの消化により産生する（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【００５９】
相補性により、いくつかのプラスミドを分離し、Ｐ．ｐｕｔｄａおよびＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＣｏｂ突然変異を相補性とすることができる。これらのうちで、プラスミドｐＸＬ１５１、ｐＸＬ１５４、ｐＸＬ５５６、ｐＸＬ１５７およびｐＸＬ５１９がことに指摘されるであろう。
【００６０】
これらのプラスミドを分離し、そしてＤＮＡ断片を切除し、精製し、そして制限により分析することができた。これらの断片は第６図および第４４図に表す：５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片、４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片、３．９ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片および１３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片。
実施例２−分離のＤＮＡ断片の配列決定
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０のｃｏｂ遺伝子を有するＤＮＡ断片の配列決定を例示する。
【００６１】
２．１、５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列決定
この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ１５７の中に含有されている。切除後、５．４ｋｂの断片の下位断片をファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３）あるいはＭ１３ｔｇ１３１またはＭ１３ｔｇ１３０（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９８３）の中に両方の向きでクローニングした。次いで、ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９８７）の方法により、欠失を試験管内で生成した。次いで、これらの欠失を連鎖停止反応の合成プライマーとして「汎用プライマー」を使用して配列決定した。これらの異なる欠失の間のオーバーラップは、両者の鎖にわたって、５．４ｋｂの断片の全体の配列の確立を可能とした（第７図）。この断片は５３７８ｂｐからなる。第７図に記載する配列において、ＣｌａＩ部位前に、３つの制限部位（ＰｓｔＩ、ＳａｌＩおよびＸｂａＩ）が見られ、これらのクローニングマルチ部位における配列決定を目的として問題のの断片のクローニングの間に現れた。本発明において、このＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列について言及するとき、これは第７図に表されている配列であり、ここで最初の２２塩基はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡに相当しない（こうして、制限部位またはオープンリーディングフレームの開始の位置のすべては第７図に表す配列である）。
【００６２】
２．２、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片のヌクレオチド配列
この断片は実施例１に記載するｐＸＬ１５１が有する。ＥｃｏＲＩ部位ならびにこの断片の右に位置する隣接する７０ｂｐはｐＸＬ５９から由来し、ｐＸＬ５９はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０のＳａｕ３ＡＩ断片をクローニングすることによってｐＸＬ１５１を構成するために使用するベクターである。切除後、８．７ｋｂの断片の下位断片をファージＭ１３ｍｐ１８またはＭ１３ｍｐ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３）あるいはＭ１３ｔｇ１３０またはＭ１３ｔｇ１３１（Ｋｉｅｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９８３）の中に両方の向きでクローニングした。次いで、欠失をヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）（１９８７）の方法により生成した。次いで、これらの欠失を連鎖停止反応の合成プライマーとして「汎用プライマー」で配列決定した。これらの異なる欠失の間のオーバーラップは、８．７ｋｂの断片の全体の配列を、両者の鎖にわたって、確立することを可能とする。この断片は８７５３ｂｐからなる。
【００６３】
２．３、４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片の配列決定
この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ１５４の中に含有される。このプロトコルは実施例２．２において使用するものと同一である。４．８ｋｂの断片の両者の鎖上の全体の配列を第３２図に表す。この断片は４７４９ｂｐを含有する。
【００６４】
２．４、３．９ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片のヌクレオチド配列
この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ５１９の中に含まれる。このプロトコルは実施例２．２において使用するものと同一である。３．９ｋｂの断片の両者の鎖上の全体の配列を第３３図に表す。この断片は３８５５ｂｐを含有する。
【００６５】
２．５、１３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片のヌクレオチド配列
この断片は実施例１に記載するプラスミドｐＸＬ５５６およびｐＸＬ１５７の中に含有される。使用するプロトコルは実施例２．２のそれと同一である。１３．１５ｋｂの断片の両者の鎖上の配列は第４３図に表わす。それは１３．４ｋｂの断片の全体の配列に相当し、ただしＥｃｏＲＩ−ＳｓｔＩ断片に相当し、この断片の左端に存在する２５０ｂｐを除外する。
【００６６】
これらのヌクレオチド配列から、最も少ない頻度で切断する酵素について制限地図を得た（第６図および第４４図）。シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ１５０のＤＮＡ中のＧＣ塩基の百分率は比較的高く（６５．５％）そして配列決定ゲル上の圧縮においてそれ自体現れる。これらの問題を回避するために、２つのアプローチを適合させる：
ｉ）配列決定反応においてｄＧＴＰの代わりに７−デアザ−ｄＧＴＰを使用して、配列決定ゲル中の電気泳動の間に形成する二次構造を減少する、および
ｉｉ）両者の鎖の配列決定。
実施例３−これらのヌクレオチド配列の分析：オープンリーディングフレームの決定
５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ（第７図）、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ（第８図）、４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ（第３２図）、３．９ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ（第３３図）および１３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ（第４３図）断片はオープンリーディングフレームの定義を可能とする。問題のＤＮＡは高い百分率のＧＣを含有するので、オープンリーディングフレームは翻訳停止コドンの低い頻度にかんがみて多数である。ステイデン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）を使用するコドンの優先性に基づく解読フレームの確率の標準を実施する。それはオープンリーディングフレームを特性決定し、このフレームは同一ＤＮＡ鎖の他のフレームに関して解読である最大の確率を有し、この確率はシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）のバクテリアから由来する既に配列決定した遺伝子のコドンの優先性に依存する。このようにして：３．１、５つのオープンリーディングフレームを５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片について特性決定する。それらはフレーム１〜５と表示し、そして５．４ｋｂの断片の配列におけるそれらの位置は次の通りである（ＣｌａＩ部位からＨｉｎｄＩＩＩ部位への５’→３’配列）：
表：５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の確からしいオープンリーディングフレーム。配列中の位置は第７図に記載する配列中の位置に相当する；解読鎖はこの図面において上の鎖に相当する５’→３’鎖である。
【００６７】
【表１】
Figure 0003734466
【００６８】
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計５）について観測されるものとともに、第９図に記載する。これらの５つのフレームは同一鎖によりエンコードされる。それらのうちで４つ（オープンリーディングフレーム１〜４）は翻訳カップリングにおいて解読フレームの特性を表す（Ｎｏｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、１９８３）、すなわち、フレームｘ＋１の翻訳開始コドンはフレームｘの翻訳停止コドンとオーバーラップするか、あるいはこれらのコドンは非常に密接する。
【００６９】
３．２、８つのフレームを８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片について特性決定する。それらは６〜１３と表示し、そして８．７ｋｂの配列中のそれらの位置を下表に記載する。
【００７０】
表：８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の確からしいオープンリーディングフレーム。配列中の位置は第８図に記載する配列中の位置に相当する；この図面において、解読鎖は上の鎖に相当する。
【００７１】
【表２】
Figure 0003734466
【００７２】
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計６フレーム）について観測されるものとともに、第１０図に記載する。フレーム１１を除外して、これらの８つのフレームは同一鎖によりエンコードされる。それらのうちで４つ（７〜１０）は翻訳カップリングにおいて解読フレームの特性を表す（Ｎｏｒｍａｋ ｅｔ ａｌ．、１９８３）、すなわち、フレームｘ＋１の翻訳開始コドンはフレームｘの翻訳停止コドンとオーバーラップするか、あるいはこれらのコドンは非常に密接する。
【００７３】
３．３、４つのオープンリーディングフレームを４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片について特性決定する。それらは相１４〜１７と表示し、そして４．８ｋｂの断片の配列中のそれらの位置は次の通りである（ＳｓｔＩ部位からＢｇｌＩＩ部位へ５’→３’配列において）：
表：４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片の確からしいオープンリーディングフレーム。配列中の位置は第３２図に記載する配列中の位置に相当し、ここで上の鎖はその５’→３’の向きで記載する。フレーム１５、１６および１７は、フレーム１４と対照的に、上の鎖によりエンコードされる。
【００７４】
【表３】
Figure 0003734466
【００７５】
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計４）について観測されるものとともに、第３４図に記載する。フレーム１５、１６および１７は同一鎖により、フレーム１４は相補性鎖によりエンコードされる。
【００７６】
３．４、４つのフレームを３．９ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片について特性決定される。それらを１８〜２１と表示し、そして３．９ｋｂの断片の配列中のそれらの位置を下表に記載する。
表：３．９ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片の確からしいオープンリーディングフレーム。配列中の位置は第３３図に記載する配列中の位置に相当し、ここで上の鎖の極性はその５’→３’である。フレーム１８および１９は、フレーム２０および２１と対照的に、下の鎖によりエンコードされる。
【００７７】
【表４】
Figure 0003734466
【００７８】
これらのオープンリーディングフレームが解読フレームである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計４）について観測されるものとともに、第３５図に記載する。フレーム１９および２０は異なる方法で転写される。
【００７９】
３．５、９つのオープンリーディングフレームを１３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片について特性決定する。それらをフレーム２２〜３０と表示し、そして１３．１ｋｂの断片の配列中のそれらの位置は次の通りである（ＥｃｏＲＩからＢｇｌＩＩへ５’→３’配列）：
表：１３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片の確からしいオープンリーディングフレーム。配列中の位置は第４３図に記載する配列中の位置に相当し、ここで上の鎖はその５’→３’の向きである。フレーム２２、２３．２４、２５、２６、２７および２９は、フレーム２８および３０と対照的に、上の鎖によりエンコードされる。
【００８０】
【表５】
Figure 0003734466
【００８１】
オープンリーディングフレーム２２、２３．２４、２５および２６が解読フレームである確率の表示を、並列の他のフレーム（合計５）について観測されるものとともに、第４５図に記載する。これらの５フレームは同一鎖によりエンコードされる。
【００８２】
実施例４−ｃｏｂ遺伝子を有するＤＮＡ断片について遺伝学的研究
この実施例は、上で同定した異なるオープンリーディングフレームおよびこれらの断片が有するコバラミンおよび／またはコビナミドの生合成に関係する遺伝子の間に存在する関係を示す。これらの遺伝子は後述するように遺伝学的研究により同定される。
【００８３】
４．１、５．４ｋｂの遺伝学的研究
ｐＸＬ７２３は、研究し、ｐＲＫ２９０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングした断片の右の部分に相当する２２６４ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８０）である（第１１図）。この研究において使用した他のプラスミドの構成（ｐＸＬ３０２、ｐＸＬ１３９７、ｐＸＬ５４５、ｐＸＬ５４５Ω、ｐＸＬ５５６およびｐＸＬ１５００）を第１１図および第１２図に対する凡例に記載する。
【００８４】
挿入はプラスミドｐＸＬ７２３においてブルイジン（Ｂｒｕｉｊｎ）およびルプスキ（Ｌｕｐｓｋｉ）、１９８４の技術を使用して得た。プラスミドｐＸＬ７２３の中へのトランスボゾンＴｎ５の挿入お選択し、次いで５．４ｋｂの断片においてマッピングした（第１２図）。ｐＸＬ７２３は、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）のＣｏｂ突然変異Ｇ５７２およびアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣｏｂ突然変異Ｇ６３４と相補性である。これらの挿入を不活性化挿入の２つの群に分類される：Ｃｏｂ突然変異Ｇ５７２の相補性をもはや可能しない群、またはＣｏｂ突然変異Ｇ６３４の相補性を壊滅する群。突然変異Ｇ５７２の相補性を不活性化する挿入はオープンリーディングフレーム４においてマッピングされる（これらは挿入１５、２７、６８、８１および９７）；オープンリーディングフレーム４はそれゆえｃｏｂ遺伝子に相当する。後者をｃｏｂＣと表示する。突然変異Ｇ６３４の相補性を不活性化する挿入はオープンリーディングフレーム５においてマッピングされる（これらは挿入６６および１０７、第１２図）；オープンリーディングフレーム４はそれゆえｃｏｂ遺伝子に相当する。後者をｃｏｂＤと表示する。そのうえ、トランスボゾンＴｎ５Ｓｐrをもつ挿入が産生された。トランスボゾンＴｎ５Ｓｐrは、実験室において、プラスミドｐＨＰ４５Ω（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒｉｓｃｈ、１９８４）から由来するストレプトマイシン抵抗性遺伝子を含有するＢａｍＨＩカッセットをＴｎ５のＢａｍＨＩ部位クローニングすることによって構成した（Ｊｏｒｇｅｎｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９７９）。これらの挿入はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）撹拌ＳＢＬ２７Ｒｉｆrの染色体中で作った。菌株ＳＢＬ２７は、ＳＣ１５０をいくつかの突然変異誘発により誘導する、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の菌株である。ＳＢＬ２７はＰＳ４培地上でＳＣ１５０より１０倍すくないコバラミンを産生する。各々がトランスボゾンの挿入を有する菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆrの１０，０００クローンのうちで、３０より多くはコバラミンを合成する能力を損失した。これらのクローンのいくつかは、この実施例において研究した断片の中に挿入を有する。これらの挿入はサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）に従う制限分析によりマッピングした。これらの異なる突然変異におけるトランスボゾンの挿入部位を第１２図に記載する。これらの挿入のうちで、番号２６３９はｃｏｂＣ遺伝子の中に存在する；この挿入はプラスミドｐＸＬ３０２と相補性をもち、ｐＸＬ３０２はｃｏｂＣ遺伝子を含有する断片を有する（第１２図）。２つの挿入を２６３６および２６３８と表示し、これらはオープンリーディングフレーム３の中に存在する。これらの突然変異をコバラミンの生合成においてブロッキングされ、そしてそれらはプラスミドｐＸＬ１３９７と相補性をもち、ｐＸＬ１３９７はオープンリーディングフレーム３のみを含有するが、ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ３０２と非相補性である（第１２図）。これらの挿入の両者はそれゆえ他の遺伝子の中に存在する。オープンリーディングフレーム３と、われわれはｃｏｂＢ遺伝子を関係づける。挿入２９３３をオープンリーディングフレーム２の中に配置する；それはオープンリーディングフレーム２を含有するプラスミドｐＸＬ１５００と相補性をもつ；この挿入はプラスミドｐＸＬ１３９７と相補性をもち、ｐＸＬ１３９７はｃｏｂＢを含有し、そしてｃｏｂＢ中の２つの挿入と相補性である。この場合において、挿入はそれゆえ他の遺伝子の中に存在する；オープンリーディングフレーム２と、われわれはｃｏｂＡと表示する遺伝子に関係づける。
【００８５】
プラスミドｐＵＣ４Ｋから由来するカナマイシン抵抗性カッセット（Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．、１９８５）は、プラスミドｐＵＣ８（ＶｉｅｒａおよびＭｅｓｓｉｎｇ、１９８２）の中にクローニングしたＣｌａＩ（配列中の位置０）−ＲｓａＩ（配列中の位置１６８６）断片のＮｏｔＩ部位に導入する；問題のＮｏｔＩ部位はフレーム１中の位置１７７に位置する（参照、第７図における配列）；２つの挿入を適合させ、各々は抵抗性カッセットの異なる向きに相当した。これらの断片は、各々抵抗性カッセットの挿入を有し、プラスミドｐＲＫ４０４（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．）の中にクローニングして、プラスミドｐＸＬ１６３０および１６３１を生成した。これらのプラスミドを接合的転移によりシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に導入し、次いで、プラスミドのための選択的抗生物質（テトラサイクリン）の不存在下に１系列の培養／希釈により、二重組み換え体が見いだされ、これらの組み換え体はプラスミドの断片を染色体の断片と交換しており、そしてプラスミドを損失していた。２つの菌株はこれにより特性決定された：
ｉ）カナマイシン抵抗性カッセットは染色体のＮｏｔＩ部位（フレーム１の中に存在する）に挿入する；カナマイシン抵抗性遺伝子の転写の極性およびオープンフレーム１のそれは反対である、
ｉｉ）他方の挿入をＳＣ１５０：１６３０Ｒｉｆr；抵抗性カッセットを同一部位に挿入するが、抵抗性遺伝子の転写は完全なオープンリーディングフレーム１の極性と同一の極性を有する。
【００８６】
これらの２つの菌株は、ＳＣ１５０のそれより少なくとも１０倍低いコバラミンの合成速度を有する。
【００８７】
プラスミドｐＸＬ５４５Ωは、プラスミドｐＨＰ４５Ωのスペクチノマイシン抵抗性カッセットがＢａｍＨＩ部位に挿入されたプラスミドｐＸＬ５４５である。このプラスミド（第１２図）は、８１４ｂｐのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片（ここでオープンリーディングフレーム１のみは完全である）を含有し、突然変異ＳＣ５１０：１６３０Ｒｉｆrのみと相補性である。これは新しい遺伝子を定義するために十分である。なぜなら、この突然変異は完全なオープンリーディングフレーム１のみを含有するプラスミドと相補性であるからである。オープンリーディングフレーム１はコバラミンおよび／またはコビナミドの生合成の経路の遺伝子に相当する。この遺伝子をｃｏｂＥと表示する。プラスミドｐＸＬ５４５Ωによる突然変異ＳＣ５１０：１６３１Ｒｉｆrの相補性の不存在は、多分ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ、ｃｏｂＤおよびｃｏｂＥ遺伝子、あるいはそれらの一部分が同一のオペロンに属するという事実、およびオペロンの転写方向の転写を保存するｃｏｂＥ中の挿入がｃｏｂＥ遺伝子のトランス発現によってのみ相補性であることができるという事実のためである。対照的に、突然変異ＳＣ５１０：１６３１Ｒｉｆrは、その一部分について、ｃｏｂＡのｃｏｂＥ遺伝子へのトランス発現を可能とするプラスミドとのみ相補性であることができる。
【００８８】
それゆえ、５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ、ｃｏｂＤおよびｃｏｂＥと表示する５つのｃｏｂ遺伝子を含有する。
【００８９】
４．２、８．７ｋｂの断片の遺伝学的研究
プラスミドｐＸＬ３６７は、ＥｃｏＲＩ部位（第１３図）においてクローニングした８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を含有するｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔａｌ．、１９８０）である。
【００９０】
プラスミドｐＸＬ３６７中のトランスボゾンＴｎ５の挿入は、既に記載された技術を使用して選択した（ｄｅ ＢｒｕｉｊｎおよびＬｕｐｓｉ、１９８４）を使用して選択した。８．７ｋｂの断片中の挿入をマッピングした。同様な方法において、トランスボゾンＴｎ５の挿入は既に記載された方法（Ｓｔａｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８５）に従い生成し、そしてマッピングした。トランスボゾンＴｎ５の２９の挿入およびトランスボゾンＴｎ３ｌａｃＺの１３の挿入がこうしてマッピングされた。８．７ｋｂの断片中のこれらの挿入の正確な位置を第１４図に記載する。各々が８．７ｋｂの断片の中に単一の断片を有するプラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のｃｏｂ突然変異、Ｇ１６４、Ｇ６０９、Ｇ６１０、Ｇ６１１、Ｇ６１２、Ｇ６１３、Ｇ６１４、Ｇ６１５、Ｇ６１６、Ｇ６２０およびＧ６３８の中に導入した。これらの突然変異はｐＸＬ３６７と相補性である。異なる突然変異の相補性を可能としない挿入を探した。それらは対応する突然変異の相補性の原因となる遺伝子の中の挿入に相当する。コバラミンの産生の特徴を示す異なる突然変異の相補性の結果（Ｃｏｂ表現型）を第１４図に記載する。組み換え突然変異がプラスミドｐＸＬ３６７をもつ同一の突然変異により産生されるより３倍少ないコバラミンを産生する場合、それは非相補性と考慮する。研究した突然変異、Ｇ１６４、Ｇ６０９、Ｇ６１０、Ｇ６１１、Ｇ６１２、Ｇ６１３、Ｇ６１４、Ｇ６１５、Ｇ６１６、Ｇ６２０およびＧ６３８のうちで、突然変異した表現型に導くトランスボゾンの不活性化挿入の８つの異なるクラスが観察される。これらのクラスは、これらの同一挿入をもつプラスミドｐＸＬ３６７により１または２以上の突然変異の相補性の不存在により挿入を特性決定する。それゆえ、各クラスは突然変異した遺伝子に相当する。同一クラスに属する挿入は互いの側面に位置することが観察される。挿入の８つのクラスがこうして観察され、これらは８つの遺伝子を明らかにする。挿入の各クラスは、対応する遺伝子の中に含有されなくてはならない最小の断片を定める。第１４図は、制限地図、および前述（実施例３）のオープンリーディングフレームに関して、各クラスにより境界された領域の間の完全な相関関係を実証する。事実、挿入の各クラスについて、トランスボゾンは単一のオープンリーディングフレームの中に含有される８．７ｋｂの断片の一部分の中に常に挿入されることが発見された。それゆえ、挿入の各クラスは１つ、およびただ１つのオープンリーディングフレームと関連する。それゆえ、上に示したオープンリーディングフレームの各々は、コバラミンおよび／またはコビナミドの生合成経路に関係するタンパク質をコードする。オープンリーディングフレームの各々はコバラミンおよび／またはコビナミドの生合成に関係する遺伝子に相当する。これらのオープンリーディングフレームを、それぞれ、フレーム６〜１３のためのｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬおよびｃｏｂＭについて言及する。制限地図に関するこれらの遺伝子の位置を第１４図に示す。
【００９１】
４．３−４．８ｋｂの断片の遺伝学的研究
プラスミドｐＸＬ１５５８は、ｐＲＫ２９０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングしたｐＸＬ１５４（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）の１２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を含有するプラスミドｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８０）である（第３６図）。この研究において使用した他のプラスミド（ｐＸＬ２３３およびｐＸＬ８４３）の構成を第３６図に対する凡例に記載する。
【００９２】
Ｔｎ５Ｓｐ挿入はプラスミドｐＸＬ１５５８において得た。まず、トランスボゾンＴｎ５Ｓｐを含有する菌株を構成した；これは菌株Ｃ２１１０（Ｓｔａｃｈｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８５）をプラスミドｐＲＫ２０１３Ｔｎ５Ｓｐ（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８５）で形質転換することによって実施した；それは複製のＣｏｌＥ１由来を有するので、プラスミドｐＲＫ２０１３Ｔｎ５ＳｐはｐｏｌＡ−である菌株Ｃ２１１０中で複製しない。形質転換後に得られるコロニーは、スペクトマイシンに対して抵抗性であり、それゆえそれらの染色体の中にトランスボゾンＴｎ５Ｓｐを有する；次いでコロニーを再分離し、次いでトランスボゾンの挿入を従来記載されているように菌株ＭＣ１０６０中でファージＰ１で形質導入する（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）。菌株ＭＣ１０６０ Ｔｎ５ＳｐをプラスミドｐＸＬ１５５８で形質転換する；次いでプラスミドｐＸＬ１５５８を接合によりＣ６００Ｒｉｆr中のｐＸＬ２０１３を使用して移動化する。次いで、テトラサイクリン（プラスミドｐＸＬ１５５８について）およびスペクトマイシン（トランスボゾンについて）に対して抵抗性である接合体を選択する。このような接合体は、トランスボゾンＴｎ５Ｓｐが挿入されているプラスミドｐＸＬ１５５８を含有しなくてはならない。次いで、プラスミドｐＸＬ１５５８の中に、より正確には１２ｋｂの断片の中に支持される挿入を制限消化によりマッピングする；これにより、２３の挿入が得られ、そして１２ｋｂのの断片上にマッピングされる；この断片の中のこれらの異なる挿入の位置を第３７図に表す。これらの２３の挿入を、ｐ−Ｘｌ１５８８：：Ｔｎ５Ｓｐの接合的転移後、菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの染色体の中に導入し、次いでプラスミドｐＲ７５１を導入する。プラスミドｐＲ７５１はｐＸＬ１５５８（ｉｎｃｐ、ＴｈｏｍａｓおよびＳｍｉｔｈ、１９８７）と同一の不適合性群のトリメトプリム抵抗性プラスミドである。ｐＸＬ１５５８について非選択的（テトラサイクリンの不存在）であるが、ｐＲ７５１およびトランスボゾンについて選択的（トリメトプリムおよびスペクトマイシンの存在）に培養することによって、ｐＸＬ１５５８：：Ｔｎ５Ｓｐが支持する突然変異と染色体との交換およびまたｐＸＬ１５５８の分離は、既に記載されているように（Ｓｃｈｅｌｌ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、マーカー交換技術により、二重相同性組み換えにより得られる。これにより選択される菌株はそれらの染色体の中にトランスボゾンを有する。二重相同性組み換えはサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）により評価される。このようにして、１２ｋｂの断片中の２３のＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ菌株が同定された。
【００９３】
さらに、菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆr（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）中のトランスボゾンＴｎ５Ｓｐのランダム突然変異誘発により得られる他のＴｎ５Ｓｐ挿入を、サザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）に従い制限分析により１２ｋｂの断片上でマッピングした、参照、第３７図；この菌株をＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１４８０と表示する。
【００９４】
コバラミンの合成レベルを、既に記載されているプロトコル（Ｃａｍｅｒｏｎｅｔ ａｌ．、１９８９）に従いＰＳ４培地中で培養した、これらの２４の菌株について決定し、そしてＣｏｂ−表現型を親のＳＣ５１０Ｒｉｆr（ＳＢＬ２７Ｒｉｆr）より少なくとも１０００（または１００）倍少ないビタミンＢ12を産生する菌株に帰属させる、第３７図。こうして、これらの染色体の挿入のうちで６はＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおけるＣｏｂ−表現型に導く；それらは挿入３１．１、４１．３、４５、５５、２２．１および１４８０である。
【００９５】
３つのプラスミドｐＸＬ２３３、ｐＸＬ８３７（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）およびｐＸＬ８４３を、接合的転移により、Ｃｏｂ−表現型を有する３つの菌株、すなわち、ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ３１．１、ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ４５およびＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１４８０の中に導入する。これらの３つの突然変異の各々は、コバラミン合成について異なる相補的プロフィルを有する。事実、ＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１４８０はｐＸＬ８３７およびｐＸＬ８４３と相補性であるが、ｐＸＬ２３３と相補性ではない；突然変異ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ４５はｐＸＬ８４３と相補性である；突然変異ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ３１．１はプラスミドｐＸＬ８４３およびまたｐＸＬ８４３ｐＸＬ２３３と相補性である（参照、第３７図）。それゆえ、表わされるデータから、３つの突然変異の相補性の結果に基づいて、３つの突然変異は異なること、そして、それらの各々について、トランスボゾンＴｎ５Ｓｐは異なるｃｏｂ遺伝子の中に挿入されていることが結論される。
【００９６】
さらに、プラスミドｐＸＬ１５５８：：Ｔｎ５Ｓｐ４１．３、ｐＸＬ１５５８：：Ｔｎ５Ｓｐ４５およびｐＸＬ１５５８：Ｔｎ５Ｓｐ２２．１を、接合的転移により、菌株Ｇ２０３５（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）の中に導入し、そしてそれらはそれと相補的ではない。プラスミドｐＸＬ１５５８は、プラスミドｐＸＬ１５５８：：Ｔｎ５Ｓｐ３１．１対照的に、この突然変異と相補性である。
【００９７】
表現型および相補性のデータにより、挿入の３つのクラスを定めることができる；これらのクラスの各々は次の挿入により表される：３１．１、クラス１；４５、４１．３、５５および２２．１、クラス２；１４８０；クラス３。
【００９８】
挿入の各クラスについて、トランスボゾンは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１４、ＯＲＦ１６およびＯＲＦ１７、実施例３において定義した）の中に含有される４．８ｋｂの断片の部分の中に常に挿入される。挿入の各クラスは単一のオープンリーディングフレームに関連する。それゆえ、上に示すオープンリーディングフレームは、コバラミンおよび／またはコビナミドの生合成経路に関係するタンパク質をコードする。これらのオープンリーディングフレームをフレーム１４、１６および１７についてｃｏｂＸ、ｃｏｂＳおよびｃｏｂＴと呼ぶ。制限地図に関するこれらの遺伝子の位置を第３７図に示す。オープンリーディングフレーム１５は、補酵素Ｂ12の生合成に関係する遺伝子ではない。
【００９９】
４．４−３．９ｋｂの断片の遺伝学的研究
ｐＸＬ１５５７は，ｐＲＫ２９０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングされたｐＸＬ５１９の９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片を含有するプラスミドｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８０）である（第３８図）。この研究において使用する他のプラスミドの構成（ｐＸＬ１２８６、ｐＸＬ１３０３、ｐＸＬ１３２４）は第３８図に対する凡例に記載されている。そのうえ、ｐＸＬ５１９の２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ断片（この配列中の位置は第３３図に表されている：２５１および２２３４）を、プラスミドｐＸＬ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．）のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位においてクローニングしてｐＸＬ６９９を発生させる。
【０１００】
Ｔｎ５Ｓｐの挿入はｐＸＬ１５５７において実施例４．１に記載する技術に従い得られた。プラスミドｐＸＬ１５５７の中にトランスボゾンＴｎ５Ｓｐの挿入、次いでｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐと表示する、を選択した。９ｋｂの断片においてマッピングされるもの（第３９図）を、４．３に記載されているように、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐの接合的転移および二重相同性組み換えによるマーカー交換後、撹拌ＳＣ５１０Ｒｉｆrの染色体の中に導入した。
【０１０１】
二重相同性組み換えをサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）により評価した。このようにして、２０のＳＣ５１０Ｒｉｆr菌株を同定した。
【０１０２】
さらに、菌株ＳＢＬ２７ＲｉｆrにおけるトランスボゾンＴｎ５Ｓｐのランダム突然変異により得られた２つの他のＴｎ５挿入（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）を、サザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）に従う制限分析により９ｋｂの断片上でマッピングした、参照、第３９図における挿入１００３および１１４７。
【０１０３】
コバラミンの合成レベルを、既に記載されているプロトコル（Ｃａｍｅｒｏｎｅｔ ａｌ．、１９８９）に従いＰＳ４培地中で培養した、これらの２２の菌株について決定し、そしてＣｏｂ−表現型を親のＳＣ５１０Ｒｉｆr（ＳＢＬ２７Ｒｉｆr）より少なくとも１０００（または１００）倍少ないビタミンＢ12を産生する菌株に帰属させる、第３９図。わずかに４つの挿入１、１００３、２３および１１４７は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおいてＣｏｂ−表現型を生ずる。
【０１０４】
４つのプラスミドｐＸＬ６９９、ｐＸＬ１２８６、ｐＸＬ１３０３およびｐＸＬ１３２４を、接合的転移により、Ｃｏｂ−表現型を有する４つの菌株、すなわち、ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１、ＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１００３、ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ２３およびＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１１４７の中に導入する。プラスミドｐＸＬ６９９は最初の２つの突然変異（ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１、ＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１００３）と相補性であるが、プラスミドｐＸＬ１３０３はそれらと相補性ではなく、プラスミドｐＸＬ１３２４は他の２つの突然変異（ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ２３およびＳＢＬ２７Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ１１４７）と相補性であるが、プラスミドｐＸＬ１２８６はそれらと相補性ではない。
【０１０５】
さらに、プラスミドプラスミドｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ１を、接合的転移により、菌株Ｇ２０３５の中に導入し、そしてそれはそれと相補的ではないが、これに対してプラスミドｐＸＬ１５５７、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ６Ａ、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ５４、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ４８、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ２１、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ８、ｐＸＬ１５５７：：Ｔｎ５Ｓｐ２３を、また、接合的転移により、導入し、これらはそれと相補性である（参照、第３９図）。
【０１０６】
表現型および相補性のデータにより、挿入の２つのクラスを定めることができる。これらのクラスの各々について、トランスボゾンは、単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ１９およびＯＲＦ２０、実施例３において定義した）の中に含有される３．９ｋｂの断片の部分の中に常に挿入される。
【０１０７】
挿入の各クラスは単一のオープンリーディングフレームに関連する。上に示すオープンリーディングフレームは、コバラミンおよび／またはコビナミドの生合成経路に関係するタンパク質をコードする。これらのオープンリーディングフレームをフレーム１９および２０についてｃｏｂＶおよびｃｏｂＵと呼ぶ。フレーム１８および２１は補酵素Ｂ12の生合成経路に関係する遺伝子ではない。制限地図に関するこれらの遺伝子の位置は第３９図に示す。挿入４８、２１および８はｃｏｂＵとｃｏｂＶ遺伝子との間にマッピングされる。
【０１０８】
４．５−１３．４ｋｂの断片の遺伝学的研究
４．５．１、４３２７ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片についての研究
プラスミドｐＸＬ１８９（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）は、少なくとも１つのｃｏｂ遺伝子を含有し、３．１ｋｂのインサートを有し、これは、３００ｂｐを除外して、４．２６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片に相当する（参照、第４５図）。ｐＸＬ１８９を、従来記載されたように（Ｄｅ ＢｒｕｉｊｎおよびＬｕｐｓｋｉ（１９８４））、Ｔｎ５で突然変異誘発させた。これにより、１３の挿入が、第４６図に示すように、ｐＸＬ１８９の挿入の中にマッピングされた。これらの１３の突然変異のプラスミド、ならびにｐＸＬ１８９を、ｐＸＬ１８９（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）と相補性である突然変異である２つのＡ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの突然変異、Ｇ６３２およびＧ６３３、中で接合した。挿入５８のみは不活性化突然変異であることが証明された。この結果が示すように、２つの突然変異Ｇ６３２およびＧ６３３は同一遺伝子における突然変異に相当し、そして、そのうえ、それらの相補性の原因となりうるＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓの遺伝子のみはオープンリーディングフレーム２６に相当する（参照、第４６図）。なぜなら、挿入５８はこのオープンリーディングフレームにおいてマッピングされるからである；さらに、このオープンリーディングフレームにおいてマッピングされるのはこの１３の挿入のみである。それゆえ、ｃｏｂ遺伝子はオープンリーディングフレーム２６に関連する。
この断片の中で同定された４つのオープンリーディングフレーム（オープンリーディングフレーム２７〜３０）がｃｏｂ遺伝子に相当するかどうかを知るために、プラスミドｐＨＰ４５Ω（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒｉｓｃｈ、１９８４）からのスペクチノマイシン抵抗性カッセットをこれらの遺伝子の各々の中に特別に挿入し、次いでＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＳＣ５１０Ｒｉｆrの染色体の中に相同性組み換えにより導入して、これらのオープンリーディングフレームの各々の中に挿入の突然変異を得た。この目的で、ＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片（第４３図に表す配列においてそれぞれの位置８８１８および１３０８）を使用した。この断片は、オープンリーディングフレーム２７〜３０を有し、ｐＸＬ１５７（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）から精製した；ＣｌａＩ末端をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片断片でフィルインした後、ＥｃｏＲＩリンカーをＣｌａＩ末端に付加した。次いで、この断片をプラスミドｐＵＣ１３（Ｖｉｅｒａ ｅｔ ａｌ．、１９８２）の中にＥｃｏＲＩ部位においてクローニングした。この構成されたプラスミドをｐＸＬ３３２と呼ぶ。ｐＨＰ４５Ω（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒｉｓｃｈ、１９８４）からのスペクチノマイシン抵抗性カッセットｎｏ挿入をｐＸＬ３３２について実施した。これらの挿入は、別々に、ＳｍａＩ（位置１０６６４、オープンリーディングフレーム２８）、ＣｌａＩ（位置１１６７８、オープンリーディングフレーム２９）およびＮｃｏＩ（位置１２４７４、オープンリーディングフレーム３０）部位において、ｐＸＬ３３２を対応する酵素で完全にまたは部分的に消化し、次いで、必要に応じて、これらの末端をＥ．ｃｏｌｉ ＤＮＡポリメラーゼのクレノー断片断片でフィルインし、次いでスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含有するｐＨＰ４５Ω（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒｉｓｃｈ、１９８４）の２ｋｂのＳｍａＩ断片と結合することによって実施した；これらの挿入は、第４６図に示すように、それぞれ、Ω２、Ω１、Ω３およびΩ４と表示する。次いで、これらの異なる挿入を有するＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ４０４（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８５）の中に２つのＥｃｏＲＩ部位においてクローニングした。次いで、これらの異なる挿入を有する４つのプラスミドを、前述したように、ＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に接合により導入する。次いで、プラスミドｐＲ７５１（ＴｈｏｍａｓおよびＳｍｉｔｈ、１９８７）をこのトランス接合体の中に導入した。ｐＲＫ４０４の４つの異なる誘導体およびＳＣ５１０Ｒｉｆrの染色体が有する突然変異の交換を記載したように選択することができた（参照、実施例４．３）。これにより４つの菌株が得られた。これらの菌株の各々は、４つのオープンリーディングフレーム２７〜３０の１つの中に抵抗性カッセットの挿入を有する。これらの挿入はサザンブロッティング（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）によるゲノムのＤＮＡの分析により評価した。これらの異なる菌株のコバラミン産生を研究した。それらのすべてはＰＳ４培地中の培養でＣｏｂ＋表現型を示した。この結果が示すように、４つのオープンリーディングフレームは補酵素Ｂ12の生合成に関係しない。しかしながら、これらのフレームの１または２以上は、例えば、補酵素Ｂ12のメチルコバラミンへの転化、すなわち、他のコバラミンまたはなお他のコリノイドの合成に参加するタンパク質をコードすることができる。
【０１０９】
４．５．２、９．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片の研究
種々のプラスミドをこの研究において使用する；プラスミドｐＸＬ１５６０は、ｐＲＫ２９０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングされたｐＸＬ１５６の９．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片（実施例１）を含有するプラスミドｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８０）である（参照、第４６図）。この研究において使用した他のプラスミドの構成（ｐＸＬ６１８、ｐＸＬ５９３、ｐＸＬ６２３、ｐＸＬ１９０９、ｐＸＬ１９３８、ｐＸＬ１９０８、ｐＸＬ２２１、ｐＸＬ２０８、ｐＸＬ２９７）を第４５図に対する凡例に記載する。
【０１１０】
Ｔｎ５Ｓｐの挿入はプラスミドｐＸＬ１５６０において得た。プラスミドｐＸＬ１５６０で形質転換した菌株ＭＣ１０６０ Ｔｎ５Ｓｐを使用して、ｐＸＬ１５６０断片のの中へのトランスボゾンＴｎ５Ｓｐの挿入を得た；これにより２７の挿入が得られ、そして９．１ｋｂの断片上にマッピングされた；この断片中のこれらの異なる挿入の位置を第４図に表す。これらの２７の挿入を、ｐＸＬ１５６０：：Ｔｎ５Ｓｐの接合的転移および引き続くプラスミドｐＲ７５１の挿入後、菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの染色体の中に導入した。プラスミドｐＲ７５１はｐＸＬ１５６０と同一の不適合性群のトリメトプリム抵抗性プラスミドである（ｉｎｃＰ、ＴｈｏｍａｓおよびＳｍｉｔｈ、１９８７）。ｐＸＬ１５６０について非選択的（テトラサイクリンの不存在）であるが、ｐＲ７５１およびトランスボゾンについて選択的（トリメトプリムおよびスペクチノマイシンの存在）に培養することによって、ｐＸＬ１５６０：：Ｔｎ５Ｓｐが有する突然変異とｐＸＬ１５６０の染色体およびまた分離との交換を得た；二重相同性組み換えによるマーカーの交換のこの技術は、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）ら、１９８８が既に記載する技術に等しい。こうして選択された菌株はそれらの染色体の中にトランスボゾンを有する。
【０１１１】
二重相同性組み換えはサザン法（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ、１９７５）により評価する。このようにして、各々が９．１ｋｂの断片の中にトランスボゾンＴｎ５Ｓｐの異なる挿入を有する２７のＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐ菌株が同定された。
【０１１２】
コバラミン合成のレベルをＰＳ４培地中で培養したこれらの２７の菌株について決定し、そしてＣｏｂ−表現型を親の菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrより少なくとも１００倍少ないビタミンＢ12を産生する菌株に帰属させる、第４６図。こうして、これらの染色体の挿入の２７のうちで１８は、第４６図に示すように、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおけるＣｏｂ−表現型に導くことが観察される。
【０１１３】
挿入１９、３２、２４、２７、３７、３９、２６、１１および１４はオープンリーディングフレーム２２においてマッピングされる（参照、第４６図）。すべてのこれらの挿入は、オープンリーディングフレーム２２のみを含有するプラスミドｐＸＬ６１８と相補性である。われわれはこれから、オープンリーディングフレーム２２は、われわれがｃｏｂＯと呼ぶ、ｃｏｂ遺伝子に相当すると推定する。オープンリーディングフレーム２３において挿入は得られなかった；しかしながら、プラスミドｐＸＬ６２３は、このオープンリーディングフレームのみを含有し（参照、第４６図）、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の２つのｃｏｂ突然変異、Ｇ６４２およびＧ２０４３（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）と相補性である。それゆえ、オープンリーディングフレーム２３はｃｏｂＰと表示するｃｏｂ遺伝子に相当する。オープンリーディングフレーム２４および２５においてマッピングされる挿入２３、１３、１２、３０、２２、４０、３５、１０および１７は、ＳＣ５１０ＲｉｆrにおけるＣｏｂ−表現型に導く。それゆえ、その産生物がコバラミンの生合成に関係する、２つのオープンリーディングフレームが存在するように思われる。しかしながら、これらの挿入が３’側に位置する遺伝子、例えば、ｃｏｂＯに極性作用を有することを除外することができない。それゆえ、これらの突然変異の相補性を研究して、Ｃｏｂ−表現型が極性作用から生じないことを決定することは適当である。
【０１１４】
ｐＸＬ５５６と相補性である、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣｏｂ突然変異、Ｇ６２２、Ｇ６２３およびＧ６３０を研究した。これらの突然変異は、唯一のｃｏｂ遺伝子としてｃｏｂＯを含有するプラスミドｐＸＬ１８９（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔａｌ．、１９８９）と相補性ではない。対照的に、それらはプラスミドｐＸＬ１９０８と相補性であり、このｐＸＬ１９０８は、オープンリーディングフレーム２７〜３０に加えて、ｃｏｂＯおよびオープンリーディングフレーム２５を含有する（参照、第４５図）。オープンリーディングフレーム２７〜３０はこれらの突然変異の相補性の原因となることができない。なぜなら、それらがをコードするタンパク質は補酵素Ｂ12の経路に参加しないからである。それゆえ、観察される相補性はオープンリーディングフレーム２５のみを生ずることができる。さらに、この同一のオープンリーディングフレームにおいてマッピングされるＳＣ５１０ＲｉｆrＴｎ５Ｓｐ突然変異（これらは突然変異２２、４０、３５、１０および１７である）はプラスミドｐＸＬ１９０８と相補性である、参照、第４６図、（ｃｏｂＯおよびフレーム２５を有する）が、これらのうちの少なくとも２つはｃｏｂ遺伝子としてｃｏｂＯのみを含有するｐＸＬ１８９と相補性ではない。これらの結果が明瞭に示すように、オープンリーディングフレーム２５はｃｏｂ遺伝子である；このｃｏｂ遺伝子をｃｏｂＮと表示する。
【０１１５】
Ｃｏｂ−表現型を有する、ＳＣ５１０ＲｉｆrＴｎ５Ｓｐの突然変異２３、１３および１２はオープンリーディングフレーム２４においてマッピングされる。これらの突然変異は、ｃｏｂＰ遺伝子のみを含有するプラスミドｐＸＬ６２３と相補性ではない。対照的に、これらの突然変異はｃｏｂＰおよびオープンリーディングフレーム２４を含有するプラスミドｐＸＬ５９３と相補性であり、これによりオープンリーディングフレーム２４はそれらの相補性の原因となることが示される。それゆえ、オープンリーディングフレーム２４はｃｏｂ遺伝子であり、これをｃｏｂＷと表示する。
実施例５−遺伝子およびタンパク質
５．１〜５．４ｋｂの断片
それゆえ、５つの遺伝子（ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ、ｃｏｂＤおよびｃｏｂＥ）が５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片上に定められる。それらは、それぞれ、次のＣＯＢタンパク質をコードする：ＣＯＢＡ、ＣＯＢＢ、ＣＯＢＣ、ＣＯＢＤおよびＣＯＢＥ。遺伝子（ｃｏｂＡ〜ｃｏｂＥ）の解読部分、ならびにＣＯＢＡ〜ＣＯＢＥタンパク質の配列は第１５図に記載されている。これらのタンパク質の各々の性質は、また、表されている（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性のプロフィル）。
【０１１６】
５．２〜８．７ｋｂの断片
それゆえ、８つの遺伝子が８．７ｋｂの断片上に定められる。これらのｃｏｂＦ〜ｃｏｂＭ遺伝子は、それぞれ、次のＣＯＢタンパク質をコードする：ＣＯＢＦ、ＣＯＢＧ、ＣＯＢＨ、ＣＯＢＩ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＫ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭ。遺伝子（ｃｏｂＦ〜ｃｏｂＭ）の解読部分、ならびにＣＯＢＦ〜ＣＯＢＭタンパク質の配列は、第１６図に記載されている。これらのタンパク質の各々の性質をまた表す（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性のプロフィル）。
【０１１７】
５．３〜４．８ｋｂの断片
３つの遺伝子（ｃｏｂＸ、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ）が４．８ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片上に定められる。それらは、それぞれ、次のタンパク質をコードする：ＣＯＢＸ、ＣＯＢＳおよびＣＯＢＴ。これらの遺伝子の解読部分、ならびにＣＯＢＸ、ＣＯＢＳおよびＣＯＢＴタンパク質の配列を第４０図に表す。任意に、ｃｏｂＳの位置１５１２におけるＡＴＧを、位置１４８５に位置するものよりむしろ、開始コドンとして選択した（参照、第３２図）。これらのタンパク質の各々の性質をまた示す（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性のプロフィル）。
ＣＯＢＴはアミノ酸２１４〜３０５に相当する親水性ポケットを有する。
【０１１８】
５．４〜３．９ｋｂの断片
２つの遺伝子（ｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ）が３．９ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片上に定められる。それらは、それぞれ、次のタンパク質をコードする：ＣＯＢＵおよびＣＯＢＶ。これらの遺伝子の解読部分、ならびにＣＯＢＵおよびＣＯＢＶタンパク質の配列を第４１図に記載する。これらのタンパク質の各々の性質をまた示す（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性のプロフィル）。
【０１１９】
５．５〜１３．４ｋｂの断片
５つのｃｏｂ遺伝子が１３．４ｋｂの断片上に定められる（ｃｏｂＱ、ｃｏｂＰ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂＯおよびｃｏｂＶ）。それらは、それぞれ、次のタンパク質をコードする：ＣＯＢＱ、ＣＯＢＰ、ＣＯＢＷ、ＣＯＢＮおよびＣＯＢＯ。これらの遺伝子（ｃｏｂＱ、ｃｏｂＰ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂＯ）の解読部分、ならびにＣＯＢＱ、ＣＯＢＰ、ＣＯＢＷ、ＣＯＢＮおよびＣＯＢＯタンパク質の配列を第４６図に記載する。これらのタンパク質の各々の性質をまた示す（アミノ酸組成、等電点、極性の指数および親水性のプロフィル）。
【０１２０】
ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッヅ（Ｗｏｏｄｓ）（１９８１）のプログラムに従い生成した、親水性プロフィルから、ＣＯＢＶを除外したすべてのＣＯＢタンパク質は、膜タンパク質と反対に、多分可溶性タンパク質である。なぜなら、疎水性の大きいドメインの不存在が認められるからである。ＣＯＢＶは、４つの長い疎水性ドメインが認められるので（参照、第４１図）、膜タンパク質であるか、あるいは大きい疎水性ドメインを有する細胞質タンパク質である。
【０１２１】
ＣＯＢタンパク質のすべてのアミノ酸配列について、メチオニンはＮＨ2末端位置における最初のアミノ酸として示されている。このメチオニンは生体内で切除されることがあることが理解される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８４）。メチオニンアミノペプチターゼによるＮＨ2末端のメチオニンの生体内切除に関するルールは提案されていることが知られている（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【０１２２】
そのうえ、これらのタンパク質の配列をゲンプロ（Ｇｅｎｐｒｏ）タンパク質、Ｇｅｎｐｒｏは２００アミノ酸より大きい推定上の解読部分により増大されるゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）タンパク質の抽出（バージョン５９）である、と、カネヒサ（ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムに従い比較した。ＣＯＢＴを除外して、ゲンバンクのバージョン５９について使用したパラメーターで有意な相同性を実証することができなかった。事実、ＣＯＢＴタンパク質は（アミノ酸）位置２２４と２９３との間に「酸性アミノ酸のコア」を有する（参照、第４０図）；このタンパク質のこの部分において、２のうちで１より多いアミノ酸はグルタミン酸またはアスパラギン酸の残基である；この酸性アミノ酸のコアは、カネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムに従い、この領域にわたってタンパク質を、また、このような酸性コアを有する他のタンパク質と相同性とする。最も相同性のタンパク質は次の通りである：プラスモジウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）のＧＡＲＰタンパク質（Ｔｒｉｇｌｉａ ｅｔ ａｌ．、１９８８）、ラットの心臓のトロポニンＴ（ＪｉｎおよびＬｉｎ、１９８９）、ヒトおよびラットのプロチモシン（ＥｓｃｈｅｎｆｅｌｄおよびＢｅｒｇｅｒ、１９８６）、スペルミンに結合するアンドロゲン依存性のラットのタンパク質（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８７）、およびヒト、ラットおよびニワトリの「中程度の大きさの神経フィラメントのサブユニット」、タンパク質（Ｍｙｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、１９８７、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．、１９８７、Ｚｏｐｆ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。酸性残基に富んだこれらのコアの機能は未知である；しかしながら、この酸性コアは金属カチオン、例えば、Ｃｏ++の結合を可能とすべきであり、金属カチオンはＣＯＢＴタンパク質にコバルトメタロチオネインの役割を与えか、あるいは金属カチオンは他のタンパク質との相互作用を可能とすべきである。
実施例６−酵素の研究
６．１−精製した酵素活性からのＣＯＢタンパク質およびそれらの遺伝子の同定
この実施例は、精製したタンパク質から、そのＮＨ2末端配列が確立された後、配列決定したｃｏｂ遺伝子の中から対応する構造遺伝子を発見することができる方法を記載する。
【０１２３】
６．１．１、ｃｏｂＡ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＡタンパク質の同定
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＵＭＴの精製は記載された（Ｆ．Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。この精製されたタンパク質のＮＨ2末端配列は、前述の技術に従い決定することができた。最初の１０のアミノ酸を同定した：
Figure 0003734466
ＣＯＢＡタンパク質のＮＨ2末端配列（第１５図）はこの配列に正確に相当する。精製したＳＵＭＴの分子量は、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定すると、３０，０００である。ＣＯＢＡタンパク質は、２９，２２３のその配列から推定された分子量を有する（第１５図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応は、ＣＯＢＡタンパク質がＳＵＭＴに相当することを明瞭に示す。ｃｏｂＡ遺伝子はＳＵＭＴの構造遺伝子である。
【０１２４】
６．１．２、ｃｏｂＢ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＢタンパク質の同定。
【０１２５】
ａ）コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ活性のアッセイ
この実施例は、まだ決して記載されてきていないコリノイドの生合成経路の活性のアッセイを例示する。問題の酵素はコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ（ＣＡＤＡＳ）であり、これは位置ａおよびｃにおけるコリンまたはデコバルト−コリン環系の２つのカルボン酸官能性のアミド化を触媒する（第１７図）。ＮＨ2基のドナーはＬ−グルタミンであり、そしてこの反応は各カルボン酸官能性のアミド化当たり１個のＡＴＰ分子を消費する。下に記載するアッセイはコビリン酸のジアミド化反応に適用される；わずかの変更（とくに３３０ｎｍにおいてＨＰＬＣにおける検出）を加えると、それはヒドロゲノビリン酸のジアミド化反応に適用される。
【０１２６】
ＡＴＰ（１ミリモル）、ＭｇＣｌ2（２．５ミリモル）、グルタミン（１００μモル）、コビリン酸（５０μモル）またはヒドロゲノビリン酸（５０μモル）およびコビリンａ，ｃ−ジアミドシンターゼ（ほぼ１ユニットの活性）を含有するインキュベーション混合物（０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８（２５０μｌ）を３０℃において１時間インキュベーションする。このインキュベーションの終わりにおいて、ＫＣＮ（２．６ｇ／ｌ）および０．２モルのＨＣｌ（１２５μｌ）の水溶液（１２５μｌ）をこの混合物に添加し、次いでこれを８０℃に１０分間加熱し、その後５，０００ｇで５分間遠心する。遠心した上澄み液のアリコート（５０μｌ）をＨＰＬＣにおいて分析する。それを２５ｃｍのヌクレオシル５−Ｃ18カラム上の注入し、そして緩衝液Ａ中の０〜１００％の緩衝液で３０分かけて溶離する；緩衝液Ａ：０．１モルのリン酸カリウムｐＨ６．５、１０ミリモルのＫＣＮ；緩衝液Ｂ：０．１モルのリン酸カリウムｐＨ８、１０ミリモルのＫＣＮ／アセトニトリル（１：１）。コリノイドを３７１ｎｍにおける紫外線吸収により検出する。酵素活性の単位は、記載条件下に１ナノモルのアミド基／時間を合成するために必要な酵素の量として定義される。
【０１２７】
ｂ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ活性の精製
この実験は、コバラミンの生合成経路に参加するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）タンパク質を精製できる方法を例示する。
【０１２８】
実施例６．１．２ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ活性の精製を後述するように実施する。
【０１２９】
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ１５００（参照、ｐＸＬ１５００の記載について実施例４．１、ならびに第１２図）が導入されている菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（７ｇ）を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７（３０ｍｌ）の中に懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波処理する。次いで粗製の抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心することによって回収し、そしてこの抽出物の一部分（１０ｍｌ）を同一緩衝液で平衡化したモノ（Ｍｏｎｏ）Ｑ ＨＲ１０／１０カラム上に注入する。タンパク質を直線のＫＣｌの勾配（０〜０．５モル）で溶離する。酵素活性を含有する分画（実施例６．２ｂ）に記載する試験により実証される）を一緒にし、そして２．５ｍｌに濃縮する。２５ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７（１ｍｌ）で希釈した後、タンパク質をモノＱ ＨＲ５／５で分画し、上のＫＣｌの勾配（０〜０．５モル）を使用する。活性の分画を一緒にし、そして１．７モルの硫酸アンモニウムを含有する０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７（１ｍｌ）を試料に添加し、次いでこれをフェニル−スペロース（Ｐｈｅｎｙｌ−Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、減少する硫酸アンモニウムの勾配（１．０〜０モル）で溶離する。所望の活性を含有する分画を一緒にし、そしてバイオ−ゲル（Ｂｉｏ−Ｇｅｌ）ＨＰＨＴ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、リン酸カリウムの勾配（０〜０．３５モル）で溶離する。
【０１３０】
この工程後、この酵素は９５％より高い純度を有する。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さない。このタンパク質の純度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。この技術におけるその分子量は４５，０００である。ＣＡＤＡＳの精製の異なる工程を、それらの精製ファクターおよびそれらの収率とともに、下表に記載する。
【０１３１】
【表６】
Figure 0003734466
【０１３２】
ｃ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼのＮＨ2末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
この実施例は、コバラミンの生合成経路に参加するタンパク質のＮＨ2末端配列により、このタンパク質をコードする構造遺伝子を同定する方法を例示する。
【０１３３】
実施例６．１．２ｂ）に記載されているように精製した、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼのＮＨ2末端配列を前述したように決定した。１５の残基を同定した：
Figure 0003734466
ＣＯＢＡタンパク質のＮＨ2末端配列（第１５図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第１５図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定したペプチド配列に先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したＣＡＤＡＳの分子量は、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定して、４５，０００である。ＣＯＢＢタンパク質は、４５，６７６のその配列から推定される分子量を有する（第１５図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＢタンパク質はＣＡＤＡＳに相当する。ｃｏｂＢ遺伝子はＣＡＤＡＳの構造遺伝子である。
【０１３４】
６．１．３、ｃｏｂＩ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＩタンパク質の同定。
【０１３５】
ａ）Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラーゼ活性のアッセイ
この実施例は、まだ決して記載されてきていないコリノイドの生合成経路の活性のアッセイを例示する。問題の酵素はＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラーゼ（ＳＰ2ＭＴ）であり、これはメチル基のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）からプレコリン−２に転移してプレコリン−３を生成することを触媒する（第１８図）。因子ＩＩおよびＩＩＩは、それぞれ、プレコリン−２およびプレコリン−３の酸化生成物であり、プロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）（ＢａｔｔｅｒｓｂｙおよびＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８２、Ｓｃｏｔｔ ｅｔ ａｌ．１９８４）の細胞抽出物から既に精製された；プレコリン−２およびプレコリン−３は補酵素Ｂ12生合成の仮定した中間体として認識されているが、それらはそれ自体決して精製されてきていない。この理由で、対応する活性は決して前以てアッセイまたは精製されてきていない。酵素反応の基質、プレコリン−２、は、非常に不安定な分子であり、これは無限に微量の酸素の存在下に自発的に酸化するので、貯蔵することができない（ＢａｔｔｅｒｓｂｙおよびＭａｃＤｏｎａｌｄ、１９８２）。それゆえ、この酵素試験の原理は、プラスミドｐＸＬ１５００が導入されている菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの酵素抽出物を使用して、要求される瞬間に、ＳＡＭおよびδ−アミノレブリン酸からプレコリン−２を発生する可能性にある。インキュベーションは厳格に嫌気性条件下に実施することができる。
【０１３６】
ＳＰ2ＭＴを含有する分画は、０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７（１ｍｌ）中で、５ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＥＤＴＡ、１００μモルの［メチル−3Ｈ］ＳＡＭ（１μＣｉ）、０．８ミリモルのδ−アミノレブリン酸およびシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrのｐＸＬ１５００の粗製の酵素抽出物（６ｍｇ）の存在下に３０℃において３時間インキュベーションする。菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrのｐＸＬ１５００は強いＳＵＭＴ活性を含有する（Ｆ．Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。インキュベーションの間に生成したテトラピロール化合物を、ＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）アニオン交換カラムに結合し、そして５％の硫酸を含有するメタノール中で酸素の不存在下にエステル化する。次いで、ウロ’ゲンＩＩＩのジメチル化およびトリメチル化誘導体をシリカゲルの薄層クロマトグラフィーにより分割し、溶離系としてジクロロメタン／メタノール（９８．３：１．７）を使用する（Ｆ．Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。ＳＰ2ＭＴ活性は、得られたトリメチル化誘導体／生成した（ジおよびトリ）メチル化誘導の量の比として表し、タンパク質の量を呼ぶ。この試験において導入されたＳＣ５１０ＲｉｆrのｐＸＬ１５００抽出物は、アッセイの条件下に検出可能なＳＰ2ＭＴ活性を示さない（試験の間に生成したプレコリン−３／生成したプレコリン−２の比は０．０５より小さい）。
【０１３７】
ｂ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラーゼの精製
この実験は、問題の活性についてのアッセイが存在するとき、コバラミンの生合成経路に参加するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）タンパク質を精製できる方法を例示する。
【０１３８】
タンパク質をプラスミドｐＸＬ２５３を含有するＳＣ５１０Ｒｉｆr細胞から精製する。これは、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が挿入されているプラスミドｐＫＴ２３０である（第１３図）。典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ２５３が導入されている菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（５０ｇ）を０．１モルのリン酸カリウムｐＨ７．７、５ミリモルのＤＴＴ（２５０ｍｌ）の中に懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波処理する。５０，０００ｇで１時間遠心した後、上澄み液をＤＥＡＥ−セファデックスのカラム（１０ｍｌのゲル）に通過させて、テトラピロール化合物を除去する。これにより得られた粗製抽出物のｐＨを０．１モルのＫＯＨでｐＨ７．７に調節する。硫酸アンモニウム飽和の３３％および４５％の間で沈澱するタンパク質を集め、そして０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、５ミリモルのＤＴＴ（４０ｍｌ）の中に溶解する。この溶液をセファデックスＧ−２５のカラムに通過させ、１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、５ミリモルのＤＴＴで溶離し、そして集めたタンパク質をＤＥＡＥ−トリサクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）−Ｍカラム上に注入する。タンパク質を０〜０．２５モルのＫＣｌの直線の勾配で溶離し、そしてＳＰ2ＭＴ活性を含有する分画を一緒にし、そして上のようにしてセファデックスＧ−２５のカラムに第２回目に通過させる。タンパク質の分画を１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、５ミリモルのＤＴＴ中で平衡化したウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＨＡ（ＩＢＦ）上に注入する。タンパク質を５ミリモルのＤＴＴを含有する０〜５０ミリモルのリン酸カリウムｐＨ７．８の直線の勾配で溶離する。所望の活性を含有する分画を一緒にし、そして５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、５ミリモルのＤＴＴ中で平衡化したモノＱ ＨＲ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム上に注入する。ＳＰ2ＭＴをＫＣｌの直線の勾配（０〜２．５モル）で溶離する。モノＱ工程から出るとき、銀塩で染色した１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動はこの酵素の純度が９９％より大きいことを明らかにする。これはタンパク質のＮＨ2末端配列の独特性により確証される。変性条件下に電気泳動から計算した分子量（１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）は２６，５００である。ＳＰ2ＭＴの精製工程およびそれらの収率を下表に記載する。
【０１３９】
【表７】
Figure 0003734466
【０１４０】
ｃ）ＳＰ2ＭＴのＮＨ2末端配列およびこの活性をコードする構造遺伝子の同定この実施例は、コバラミンの生合成経路に参加するタンパク質のＮＨ2末端配列により、このタンパク質をコードする構造遺伝子を同定する方法を例示する。この実施例において、問題の構造遺伝子はＳＰ2ＭＴ
についてのそれである。
【０１４１】
精製したタンパク質のＮＨ2末端配列を前述したように決定した。最初の１５の残基を同定した：
Figure 0003734466
ＣＯＢＩタンパク質のＮＨ2末端配列（第１６図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第１６図に表す配列において、メチオニンはヌクレオチド配列から推定するペプチド配列に先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したＳＰ2ＭＴの分子量は、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定して、２６，５００である。ＣＯＢＩタンパク質は、２５，８７８のその配列から推定される分子量を有する（第１６図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＩタンパク質はＳＰ2ＭＴに相当する。ｃｏｂＩ遺伝子はＳＰ2ＭＴの構造遺伝子である。
【０１４２】
６．１．４、ｃｏｂＨ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＨタンパク質の同定。
【０１４３】
ａ）プレコリン−８ｘムターゼ活性のアッセイ
この実施例は、まだ決して記載されてきていないコリノイドの生合成経路の活性のアッセイを例示する。問題の酵素はプレコリン−８ｘムターゼであり、これはプレコリン−８ｘのヒドロゲノビリン酸への転化の間のメチル基の位置Ｃ−１１から位置Ｃ−１２に転移することを触媒する（参照、第１９図における炭素原子の名称；ＰＬ６８）。より一般に、それはメチル基Ｃ−１１のＣ−１２への転移を触媒し、これによりコリン環系に導く触媒である。この酵素はここでムターゼと呼ぶが、メチル基の転移が分子内であるが、これは非常に確からしいことは正式に実証されてきていない。
【０１４４】
酵素活性は、酵素分画の存在下に０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１ミリモルのＥＤＴＡ中で３０℃において１時間インキュベーションする間における、プレコリン−８ｘ（５μモル）のヒドロゲノビリン酸への転化により実証される。インキュベーションの終わりにおいて、この反応を８０℃に１０分間加熱することによって停止しそして、３０００×ｇで１０分間遠心後、上澄み液の中に存在する、形成したヒドロゲノビリン酸をＨＰＬＣにより分析する（参照、実施例６．１．２．ａ）。
【０１４５】
ｂ）プレコリン−８ｘムターゼの精製
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレコリン−８ｘムターゼの精製は次のようにして実施する。
【０１４６】
この精製の間に、すべての緩衝液をｐＨ７．７に調節する。
【０１４７】
典型的な精製実験において、ｐＸＬ２５３（８．７ｋｂの断片がＥｃｏＲＩ部位においてクローニングされたｐＫＴ２３０、第１３図）を有しそしてＰＳ４培地中で培養後得られた、菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの細胞（５０ｇ）を０．１モルのリン酸カリウム（２００ｍｌ）の中に再懸濁させ、そして１２分間超音波処理する。５０，０００ｇで１時間遠心した後、上澄み液をＤＥＡＥ−セファデックスのカラム（１０ｍｌのゲル）に通過させて、テトラピロール化合物を除去する。これにより得られた粗製抽出物のｐＨを０．１モルのＫＯＨで７．７に調節する。硫酸アンモニウム飽和の４０％および６０％の間で沈澱するタンパク質を集め、そして０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（５０ｍｌ）の中に溶解する。次いで、この試料をウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＡｃＡ（ＩＢＦ、フランス国）カラム（ゲル体積１，０００ｍｌ）上に注入し、そしてタンパク質を６０ｍｌ／時間の流速で５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌで溶離する。活性を含有する分画をプールし、そして５０ｍｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌと平衡化したＤＥＡＥ−トリサクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ）−Ｍ（ＩＢＦ、フランス国）カラム上に注入し、そしてタンパク質を０〜０．２モルのＫＣｌの勾配で溶離する。精製すべきタンパク質を含有する分画をプールし、そして１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌと平衡化したセファデックスＧ−２５のカラムに通過させる。タンパク質の分画を１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌで平衡化したウルトロゲル（Ｕｌｔｒｏｇｅｌ）ＨＡ（ＩＢＦ、フランス国）上に注入し、タンパク質を０〜０．１モルのリン酸カリウムの勾配で溶離し、次いで活性の分画を１０ミリモルのリン酸カリウム中でフェニル−セファロースＣＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）４Ｂカラムのクロマトグラフィーにかけ、このカラムを０．６５〜０モルの硫酸アンモニウムの勾配で溶離する。これにより得られたタンパク質はタンパク質の純度は９５％より大きい（１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および銀塩による染色の結果に従う）。タンパク質の純度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。この技術を使用して計算したその分子量は２２，０００である。プレコリン−８ｘムターゼの精製工程およびそれらの精製収率を下表に記載する。
【０１４８】
【表８】
Figure 0003734466
【０１４９】
ｃ）プレコリン−８ｘムターゼのＮＨ2末端配列およびその構造遺伝子の同定この実施例は、コバラミンの生合成経路に参加するタンパク質のＮＨ2末端配列により、このタンパク質をコードする構造遺伝子を同定する方法を例示する。
【０１５０】
このタンパク質のＮＨ2末端配列を前述したように決定した。１５の残基を同定した：
Figure 0003734466
ＣＯＢＨタンパク質のＮＨ2末端配列（第１６図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第１６図に表す配列において、メチオニンは前述の配列決定により決定されたペプチド配列に先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。第２残基はプロリンであるので、この切除は既に述べたルールと一致する（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。精製したプレコリン−８ｘムターゼの分子量は、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定して、２２，０００である。ＣＯＢＨタンパク質は、２２，０５０のその配列から推定される分子量を有する（第１６図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＨタンパク質はプレコリン−８ｘムターゼに相当する。ｃｏｂＨ遺伝子はプレコリン−８ｘムターゼの構造遺伝子である。
【０１５１】
ｄ）プレコリン−８ｘみら調製、分離および同定
プレコリン−８ｘの典型的な実験において、菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrのｐＸＬ２５３の粗製酵素抽出物（１０００ｍｇのタンパク質）を、０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．７（１００ｍｌ）中で、従来記載されたように（Ｂａｔｔｅｒｓｂｙ ｅｔ ａｌ．、１９８２）調製したトリメトルイソバクテリオコリン（１０００ナノモル）、ＥＤＴＡ（１ミリモル）、ＡＴＰ（１００μモル）、ＭｇＣｌ2（２５０μモル）、ＮＡＤＨ（５０μモル）、ＳＡＭ（５０μモル）およびヒドロゲノビリン酸（２０μモル）とともに嫌気的に３０℃において２０時間インキュベーションする。インキュベーションの終わりにおいて、プレコリン−８ｘは形成した優勢のテトラピロール生成物である。それを分離し、そしてμＢｏｎｄａｐａｋ Ｃ１８（Ｗａｔｅｒｓ）カラムのＨＰＬＣにより精製し、リン酸カリウム緩衝液ｐＨ５．８中の０〜５０％のアセトニトリルの直線の溶離勾配を使用する。プレコリン−８ｘの質量（ｍ／ｚ＝８８０）およびそのメチルエステル誘導体（ｍ／ｚ＝９７８）の質量が示すように、それはヒドロゲノビリン酸と同一の実験式を有する化合物である。紫外線／可視光線および蛍光の特性はヒドロゲノビリン酸のそれらと非常に異なり、そしてその分子が２つの別々の発色団を有することを示す。プレコリン−８ｘ（Ｔｈｉｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．、１９９０）とヒドロゲノビリン酸との間の酵素異性化反応のみはメチルのＣ−１１からＣ−１２への移動であるので、プレコリン−８ｘはヒドロゲノビリン酸の前の最後の中間体であり、そして対応する反応は、プレコリン−８ｘムターゼにより触媒される、メチルのＣ−１１からＣ−１２への移動である。
【０１５２】
６．１．５、ｃｏｂＵ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＵタンパク質の同定
ａ）ニコチネート−ヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ活性（第５図、反応５）。
【０１５３】
この実施例は、コバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例示する。問題の酵素はニコチネート−ヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴ）（ＥＣ２．４．２．２１）である。ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴ活性（ほぼ５単位）を含有する分画を、１ミリモルのＮａＭＮ（ニコチン酸モノヌクレオチド）および１０μモルのＤＭＢＩの存在下に０．１モルのグリシン−ＮａＯＨ緩衝液ｐＨ９．７（５００μｌ）中の３０℃において８分間インキュベーションする。次いで反応を８０℃に１０分間加熱することによって停止し、反応混合物を水（４体積）で希釈し、そしてこの溶液（１００μｌ）を１５ｃｍのヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）５−Ｃ８ＨＰＬＣカラム上に注入し、０．１モルのリン酸カリウムｐＨ２．９／アセトニトリル（９３：７）混合物で１ｍｌ／分の流速で溶離する。α−リバゾール５’−ホスフェートをフルオリメトリー（励起：２６０ｎｍ；放射＞３７０ｎｍ）により検出および定量する。酵素活性の単位はこれらの条件下に１ナノモルのα−リバゾール５’−ホスフェート／時間を発生するために必要な酵素の量として定義される。
【０１５４】
ｂ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴ活性の精製。
【０１５５】
この実験は、コバラミンの生合成経路に参加するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）タンパク質を精製する方法を例示する。実施例６．１．５．ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴの精製は後述するように実施する。典型的な精製実験において、ｐＸＬ１４９０Ｂが前述したように導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（１０ｇ）を使用する。プラスミドｐＸＬ１４９０Ｂは第３８図に記載されている；このプラスミドはｐＸＬ５１９の３．８５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片をクローニングすることによって得た（参照、第３８図）。それゆえ、このプラスミドはＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ遺伝子を有する。細胞を、従来記載されたように、リビドマイシンを補充したＰＳ４培地中で培養し、ＰＳ４培地中で９６時間培養した後、収穫する。それらを０．モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．２の（２５０ｍｌ）の中に再再懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波処理する。粗製の抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心することによって回収し、その後同一と平衡化したＤＥＡＥ−トリスアクリルＭ（ＩＢＦ、フランス国）カラムに通過させる。溶離液の１０％（１２０ｍｇのタンパク質）をモノＱ ＨＲ１０／１０カラムで分画し、ＫＣｌの勾配（０〜０．６モル）を使用する。活性の分画をプールし、そして超遠心により２ｍｌに濃縮し、次いで、３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．２（１体積）と混合した後、試料を前述のようにモノＱ ＨＲ５／５カラムで第２回の分画を実施する。活性分画をプールし、次いで試料を硫酸アンモニウムを使用して１モルのモル濃度にし、そしてフェニル−スペロースＨＲ５／５カラムのクロマトグラフィーにかけ、減少する硫酸アンモニウム勾配（１〜０モル）で溶離する。所望の活性を含有する分画をプールし、超遠心により濃縮し、そしてＢｉｏ−Ｓｉｌ２５０ゲル透過カラムのクロマトグラフィーにかけ、２０ミリモルのリン酸ナトリウム／５０ミリモルの硫酸ナトリウムｐＨ６．８で溶離する。
【０１５６】
この工程後、酵素の純度は９５％より大きい。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染するタンパク質を示さない。この純度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。この技術におけるその分子量は３５，０００である。ＮＮ：ＤＭＢＩＰＲＴの精製工程を下表に記載する。
【０１５７】
【表９】
Figure 0003734466
【０１５８】
ｃ）Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴのＮＨ2末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴのＮＨ2末端配列を、実施例６．１．５ｂ）に記載するように精製し、前述の技術に従い実施した。最初の１５の残基を同定した：
Figure 0003734466
ＣＯＢＵタンパク質のＮＨ2末端配列（第４１図）はこの配列に正確に相当するが、ただし、第４１図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定されたペプチド配列に先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したＮ−トランスグリコシダーゼの分子量は、１２．５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により推定して、３５，０００である。ＣＯＢＵタンパク質は、３４，６４２のその配列から推定される分子量を有する（第４１図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＵタンパク質はＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴに相当する。ｃｏｂＵ遺伝子はＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴの構造遺伝子である。
【０１５９】
ｄ）ＤＢＩに対するＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴの特異性
この実施例は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴの特異性の研究により、問題のヌクレオチド塩基の合成を実施するＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴの触媒性質を使用して、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓが種々のコバミドを生合成する方法を例示する。
【０１６０】
コバラミンを合成する酵素基質は５，６−ジメチルベンズイミダゾールである。ベンズイミダゾールおよび５−メチルベンズイミダゾールは、それぞれ、自然の基質（５，６−ジメチルベンズイミダゾール）と比較して、それぞれ、１５７％および９２％の反応速度の反応のための基質であり、ＮａＭＮの濃度は２ミリモルに固定する。それゆえ、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＮＮ：ＤＭＢＩＰＲＴの特異性は、ベンズイミダゾールの環系を含有する基質について低い。それゆえ、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）を使用すること、および５，６−ジメチルベンズイミダゾールを、それぞれ、ベンズイミダゾールまたは５−ジメチルベンズイミダゾールで置換したＰＳ４培地中でそれを培養して、このバクテリアが、それぞれ、Ｃｐα−（ベンズイミダゾリル）−Ｃｏβ−シアノコバミドまたはＣｐα−（５−メチルベンズイミダゾリル）−Ｃｏβ−シアノコバミドを合成するようにすることができる。他のコバミドをこの方法で合成できることは疑いない。
【０１６１】
６．１．６、ｃｏｂＶ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＶタンパク質の同定
この実施例は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中の補酵素Ｂ12の生合成経路の活性、次いでこの活性の部分的精製により、この酵素の構造遺伝子をＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中で同定できる方法を例示する。
【０１６２】
ａ）ＧＤＰ−コビンアミド：α−リバゾール−５’−ホスフェートコビンアミドホスホトランスフェラーゼ（またはコビンアミド−５’−ホスフェートシンターゼ）活性のアッセイ
この実施例はコバラミンの生合成経路に直接関係する活性のアッセイを例示する。問題の酵素はコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼである。この活性（ほぼ５〜１０単位）を含有する分画を、暗所で３０℃において０．３Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ９．０（５００μｌ）中で、１ミリモルのＥＤＴＡ、１２．５ミリモルのＭｇＣｌ2、５０ミリモルのα−リバゾール５’−ホスフェートおよび２０μモルのＧＤＰ−コビンアミド［５’−デオキシ−５’−アデオノシル（Ａｄｏ）または補酵素の形態］とともにインキュベーションする。１５分のインキュベーション後、２０ミリモルのシアン化カリウム（５００μｌ）を添加し、そしてこの溶液を８０℃に１０分間加熱する。遠心して沈澱した物質を除去した後、上澄み液の中に存在するビタミンＢ12５’−ホスフェートを実施例９に記載されているようにアッセイする。１単位のコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼの１単位を、前述の条件下に１ナノモルのコバラミン５’−ホスフェートシンターゼを発生するために必要な酵素の量として定義する。
【０１６３】
Ａｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドは、Ａｄｏ−コビンアミドホスフェート（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）をｓ０ｒ ｐＸＬ６２３抽出物と、コビンアミドデホスフェートグアニルトランスフェラーゼのアッセイの条件下にインキュベーションすることによって得られる（参照、６．１．１１．ｂ）。α−リバゾールおよびα−リバゾール５’−ホスフェートをＳＣ５１０Ｒｉｆr培養物から分離し、そして実施例６．１．５ａ）に記載するアッセイ条件下にＨＰＬＣにより精製する。
【０１６４】
ｂ）コバラミン−５’−ホスフェートの部分的精製
この実験は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのコバラミンの生合成経路に参加するＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓｗｚａを部分的に精製する方法を例示する。前述のアッセイを使用して、コバラミン５’−ホスフェートシンターゼの精製を実施する。この目的で、典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ１４９０Ｂが前述したように導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（１０ｇ）を使用する。プラスミドｐＸＬ１４９０Ｂは第３８図に記載されている；このプラスミドはｐＫＴ２３０の中にクローニングされたｐＸＬ５１９の３．８５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片に相当する。このプラスミドはＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ遺伝子を有する。ｐｄｆＳＣ５１０Ｒｉｆr中のこのプラスミドの存在は、ほぼ１００のファクターでコバラミン−５ｐシンターゼの活性を増幅させる；それゆえ、ｐＸＬ１４９０Ｂが有するインサートはこの酵素の構造遺伝子を含有するであろう；それゆえ、この遺伝子はｃｏｂＵまたはｃｏｂＶのみであることができる。ＳＣ５１０Ｒｉｆr細胞は、前述したように、リビドマイシンを補充したＰＳ４培地中で培養することによって得られる。細胞を遠心し、次いで０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）／１ミリモルのＥＤＴＡ（緩衝液Ａ）（２５ｍｌ）の中に再懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波処理する。次いで、粗製の抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心し、そして緩衝液Ａと平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに通過させる。タンパク質の分画を回収し、そして３００μｌの分画（７．５ｍｇのタンパク質）でスペロース１２ＨＲ１０／３０カラム上に注入し、緩衝液Ａで溶離する。排除した分画を回収し、等しい体積の緩衝液Ａ／１．０モルの硫酸アンモニウムと混合し、そしてフェニル−スペロースＨＲ５／５カラムのクロマトグラフィーにかける。タンパク質を緩衝液Ａ中の減少する硫酸アンモニウム勾配（０．５〜０モル）で溶離し、次いでコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼ活性を溶離する目的で０モルの硫酸アンモニウムでプラトーにする。この酵素の部分的精製を下表に、精製プロセスにおいて開始のとき導入した７５ｍｇのタンパク質に基づいて、記載する。
【０１６５】
【表１０】
Figure 0003734466
【０１６６】
ｃ）コバラミン−５’−ホスフェートシンターゼの特異性
（Ａｄｏ）ＧＤＰ−コビンアミドについてのＫｍは０．９μモルである。しかしながら、この酵素は（ＣＮ、ａｑ）形態の基質について同一の親和性および事実上同一の反応速度を有する。α−リバゾール５’−ホスフェートについてのこの酵素のＫｍはほぼ２．７μモルである。さらに、コバラミン−５’−ホスフェートシンターゼの最も純粋な調製物はＡｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドとα−リバゾールとの補酵素Ｂ12を生成する反応を触媒しそして、これらの条件下に、コバラミン５’−ホスフェートの蓄積は観測されない。それぞれ、３０および７００μモルの細胞内のα−リバゾール５’−ホスフェートおよびα−リバゾールの濃度は、実施例６．１．５ａ）に記載する培養条件下にＰＳ４培地中のＳＣ５１０Ｒｉｆrによるコバラミンの産生の間に、ＨＰＬＣにより測定された。これが示すように、補酵素Ｂ12は直接Ａｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドからコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼにより、コバラミン５’−ホスフェートの参加なしで、発生させることができる。
【０１６７】
Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｓｏｒ培養物中のコバラミン５’−ホスフェートの蓄積の不存在または微量の存在は、補酵素Ｂ12がＡｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドとα−リバゾールとの直接の生体内の反応により産生されることを確証する。
【０１６８】
この直接の反応は、試験管内でプロピオニバクテリウム・シェルマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）（Ｒｏｎｚｉｏ ｅｔａｌ．、１９６７；Ｒｅｎｚ、１９６８）において既に観察されそして記載された。コバラミン−５’−ホスフェートシンターゼの構造遺伝子はｃｏｂＵおよびｃｏｂＶのみであるので、これらの２つのＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのｃｏｂ遺伝子を有する断片のＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中の増幅は１００のファクターでコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼ活性を増加するので、そしてｃｏｂＵ遺伝子はＮＮ：ＤＭＢＩ ＰＲＴの構造遺伝子であるので、ｃｏｂＶはそれゆえコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼの構造遺伝子である。
【０１６９】
６．１．７、ｃｏｂＫ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＫタンパク質の同定
ａ）プレコリン−６ｘリダクターゼ活性のアッセイ
この実施例は、コバラミンの生合成経路に直接関係する新規な酵素活性を例示する。問題の酵素はプレコリン−６ｘリダクターゼである。
【０１７０】
プレコリン−６ｘリダクターゼ活性を含有する分画（ほぼ０．０５単位、Ｕ）を３０℃において０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．７（２５０μｌ）中で１ミリモルのＥＤＴＡ、５００ミリモルのＮＡＤＰＨ、２５ミリモルの［メチル−3Ｈ］ＳＡＭ（８０μＣｉ／μモル）、４μモルのプレコリン−６ｘ（Ｔｈｉｂａｕｔ ｅｔ ａｌ．、１９９０）および部分的に精製したジヒドロプレコリン−６ｘメチラーゼ（０．５Ｕ）（参照、下の調製）の存在下に６０分間インキュベーションする。次いでこの反応を８０℃に５分間加熱することによって停止させそして、５０００×ｇにおいて５分間遠心した後、上澄み液をＤＥＡＥ−セファデックスカラム（２００μｌのゲルを含有する）上に注入する。次いでこのカラムをＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液で広範に洗浄し、そして結合した化合物を１モルのＨＣｌ（４ｍｌ）で溶離する。この溶離液中の放射能の活性を液体シンチレーションカウンターにより計数する。酵素活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのプレコリン−６ｘ／時間を還元するために必要な酵素の量として定義する。
【０１７１】
ジヒドロプレコリン−６ｘメチラーゼを、ＳＣ５１０ＲｉｆrのｐＸＬ２５３の粗製の抽出物から、モノＱ ＨＲ５／５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）アニオン交換カラムで部分的に精製する。このカラムは０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．７中の０〜０．４モルのＫＣｌの直線の勾配で溶離する。酵素活性を０．３５モルのＫＣｌにおいて溶離する。この活性は上で定義したプレコリン−６ｘリダクターゼにより検出および定量する（インキュベーション媒質中のプレコリン−６ｘリダクターゼ（０．５Ｕ）の存在下に）。モノＱ工程後、ジヒドロプレコリン−６ｘメチラーゼ活性を含有する分画はプレコリン−６ｘリダクターゼ活性を完全に欠く。メチラーゼ活性の単位は前述の条件下に１ナノモルのメチル基がジヒドロプレコリン−６ｘ／時間に転移するために必要な酵素の量として定義する。
【０１７２】
ｂ）プレコリン−６ｘリダクターゼ活性の精製
前述のアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレコリン−６ｘの精製は後述するように実施する。
【０１７３】
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ２５３（８．７ｋｂの断片がＥｃｏＲＩにおいてクローニングされたプラスミドｐＫＴ２３０、第１３図）が前述したように導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（１００ｇ）を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７／１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液（緩衝液Ａ）（２００ｍｌ）の中に懸濁させ、そして４℃において１５分間超音波処理する。次いで、粗製の抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心し、そして緩衝液Ａと平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに３つの部分で通過させる。ゲルから排除された３つの部分をプールし、そして緩衝液Ａで１リットルに調節する。２５および４０％の硫酸アンモニウムの飽和の間で沈澱するタンパク質を遠心により集め、そして緩衝液Ａ（５０ｍｌ）の中に再懸濁させ、そしてこの溶液を緩衝液Ｂ（２５ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロール）と平衡化したセファデックスＧ−２５カラムを通して脱塩する。次いでタンパク質溶液を緩衝液Ｂで平衡化したＱセファロース・ファースト・フロー（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ）（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラム上に２．５ｍｌ／分で注入し、そして緩衝液Ｂ／０．２モルのＫＣｌ混合物で溶離する。この分画を緩衝液Ｃ（５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロール）で平衡化したセファデックスＧ−２５カラムで脱塩する。次いでタンパク質溶液をモノＱ ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで分画し（各クロマトグラフィーの実験において１００ｍｇのタンパク質）緩衝液Ｃ中の０〜０．４モルのＫＣｌの勾配を使用し、その後活性を含有する分画を減少する硫酸アンモニウムの勾配（１〜０モル）でフェニル−スペロースＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかける。活性の分画を脱塩し、そしてプレコリン−６ｘリダクターゼをモノＱ ＨＲ５／５カラムで再び精製する。それを５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．１／５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロール緩衝液中で０〜０．２モルのＫＣｌの勾配で溶離する。精製を完結するために、タンパク質をＢｉｏ−Ｓｉｌ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、２０ミリモルのリン酸カリウム／５０ミリモルの硫酸ナトリウムｐＨ６．８／５００ミリモルのＤＴＴ／１５％のグリセロールで溶離する。この工程において、この酵素の純度は９５％より大きい。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さず、タンパク質を硝酸銀で可視化する。この純度の程度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。この技術におけるその分子量は３１，０００である。プレコリン−６ｘリダクターゼの精製の異なる工程、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を下表に記載する。
【０１７４】
【表１１】
Figure 0003734466
【０１７５】
ｃ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレコリン−６ｘリダクターゼのＮＨ2末端配列および部分的内部の配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
前述したように精製したシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレコリン−６ｘリダクターゼのＮＨ2末端配列を、前述したように決定した。６つの残基が同定された：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ
同様に、トリプシンの消化および断片をＣ−１８逆相カラムのＨＰＬＣにより分割した後、３つの内部の配列が得られた：
Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ
ＣＯＢＫタンパク質のＮＨ2末端配列（第１６図）はプレコリン−６ｘリダクターゼのＮＨ2末端配列に正確に相当するが、ただし、第１６図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。同様に、３つの内部の配列はＣＯＢＫタンパク質の３つの配列６０〜６９、１１２〜１２２および１４３〜１４８に相当する。精製したプレコリン−６ｘリダクターゼの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により３１，０００と推定される。ＣＯＢＫタンパク質は、２８，０００のその配列から推定される分子量を有する（第１６図）。内部のＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＫタンパク質はプレコリン−６ｘリダクターゼに相当する。ｃｏｂＫ遺伝子はプレコリン−６ｘリダクターゼの構造遺伝子である。
【０１７６】
ｄ）プレコリン−６ｘリダクターゼにより触媒される反応
プレコリン−６ｘの還元の酵素反応はＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおいて厳格にＮＡＤＰＨ依存性である。ＮＡＤＰＨはＮＡＤＨと置換することができない。精製した酵素（または精製の間の活性分画、またはなお粗製の酵素抽出物）を活性のアッセイの条件下に、しかしＳＡＭおよびジヒドロプレコリン−６ｘメチラーゼの不存在下にインキュベーションするとき、この反応の生成物を次いでプレコリン−６ｘの精製について記載した系においてＨＰＬＣにより精製することができる（参照、実施例６．１．４．ｄ）。脱塩およびエステル化（４％のメタノール性硫酸、２０℃、２時間、アルゴン雰囲気）後、対応するエステルは質量ｍ／ｚ＝１００８を有する。それゆえ、プレコリン−６ｘリダクターゼにより触媒される反応の生成物はジヒドロプレコリン−６ｘ、また、プレコリン−６ｙとして知られている、である。
【０１７７】
６．１．８、ｃｏｂＱ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＱタンパク質の同定
ａ）プレコリン−６ｘリダクターゼ活性のアッセイ
この実施例は、従来決して記載されてきていないコバラミンの生合成経路の酵素活性のアッセイを例示する。問題の酵素はコビル酸シンターゼである。この酵素のシンターゼはコリン環系上の位置ｂ、ｄ、ｅおよびｇにおける周辺カルボン酸官能性のアミド化を触媒する（参照、第１９図；ＰＬ、６８）。ＮＨ2基のドナーはＬ−グルタミンであり、そして毎にアミド化は１つのＡＴＰ分子の消費を伴う。
【０１７８】
アッセイすべき分画を暗所で３０℃において０．１モルのＴｒｉｓ塩酸塩緩衝液ｐＨ７．５（２５０μｌ）中で１ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのＡＴＰ、２．５ミリモルのＭｇＣｌ2、１ミリモルのグルタミンおよび１０ミリモルのＡｄｏ−コビリン酸ジ−またはペンタアミドとともに６０分間インキュベーションする。この反応を０．１モルの水性シアン化カリウム溶液（２５μｌ）の添加により停止する。８０℃に１０分間加熱しそして５０００×ｇにおいて５分間遠心した後、上澄み液の中に存在する形成した化合物をＨＰＬＣにより分析する。活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのアミド官能性／時間を発生するために必要な酵素の量として定義する。
【０１７９】
５’−デオキシ−５’−アデノシル（Ａｄｏ）−コビリン酸ジアミドおよびペンタアミドを、ＰＳ４培地中の撹拌ＳＣ１５０の培養物から、実施例９に記載する方法および原理を使用して分離する。
【０１８０】
ｂ）コビル酸シンターゼの精製
実施例６、１、８ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のプレコリン−６ｘの精製は後述するように実施する。
【０１８１】
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ６１８（参照、実施例４．５．２）導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（６ｇ）を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１ミリモルのＤＴＴ、１ミリモルのＥＤＴＡ緩衝液（１５ｍｌ）の中で超音波処理する。遠心（５０，０００×ｇ、１時間）後、抽出物を２０％のグリセロール（ｖ／ｖ）にする。１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１ミリモルのＤＴＴ、２０％のグリセロール緩衝液（２４ｍｌ）を粗製の抽出物（８．５ｍｌ；２０３．５ｍｇのタンパク質）に添加する。この溶液をモノＱ ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）上に注入し、５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１ミリモルのＤＴＴ、２０％のグリセロール緩衝液と平衡化する。タンパク質を０．５モルのＮａＣｌの直線の勾配で溶離し、そして活性タンパク質をプールし、そして１ミリモルのＥＤＴＡにする。この溶液を硫酸アンモニウムに関して０．８５モルにし、そしてＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７、１ミリモルのＤＴＴ、０．８５モルの硫酸アンモニウム緩衝液と平衡化したフェニル−スペロースＨＲ５／５（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラム上に注入し、そしてタンパク質を０．０８５〜０モルの硫酸アンモニウムの直線の減少する勾配で溶離する。分画を直ちに２０％のグリセロールにする。活性分画を超遠心により２．５ｍｌに濃縮しそして平衡化したＰＤ１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、そして５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．３、１ミリモルのＤＴＴ、２０％のグリセロール（ｖ／ｖ）で溶離する。タンパク質の分画を集め、そして同一緩衝液で平衡化したモノＱ ＨＲ５／５カラム上に注入し、そしてタンパク質を０．５モルのＮａＣｌの直線の勾配で溶離する。最後に５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、１ミリモルのＤＴＴ、２０％のグリセロール、０．１モルのＮａＣｌ緩衝媒質中のＢｉｏ−Ｓｉｌ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）のゲル透過クロマトグラフィーにより、純度が９７％より高いタンパク質を得ることができる。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さない。この純度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。この技術におけるその分子量は５７，０００である。コビル酸シンターゼの精製の異なる工程、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を下表に記載する。
【０１８２】
【表１２】
Figure 0003734466
【０１８３】
タンパク質の精製プロセスを通して、精製したタンパク質の純度の非常に高い程度、ならびにコビリン酸ジアミドおよびペンタアミドの活性の比の不変性（参照、上の表）が明瞭に示すように、１つのかつ同一のタンパク質が位置ｂ、ｄ、ｅおよびｇにおけるコリン環系のアミド化の４つの活性の原因となる。
【０１８４】
ｃ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビル酸シンターゼのＮＨ2末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビル酸シンターゼのＮＨ2末端配列を、前述したように決定した。１６の残基が同定された：
Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｉｌｅ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ
ＣＯＢＱタンパク質のＮＨ2末端配列（第４７図）はプレコリン−６ｘリダクターゼのＮＨ2末端配列に正確に相当するが、ただし、第４７図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したコビル酸シンターゼの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により５７，０００と推定される。ＣＯＢＱタンパク質は、５２，０００のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＱタンパク質はコビル酸シンターゼに相当する。ｃｏｂＱ遺伝子はコビル酸シンターゼの構造遺伝子である。
【０１８５】
６．１．９、ｃｏｂＯ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＯタンパク質の同定
ａ）コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１７）活性のアッセイ
この実施例は、コバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例示する。問題の酵素はコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．５．１．１７）である。この酵素はバクテリアの細胞（Ｏｈｔａ ｅｔ ａｌ．、１９７６、Ｂｒａｙ ｅｔ ａｌ．、１９６２）および動物細胞（Ｆｅｎｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９７８）において実証された。それはクロストリジウム・テタノモルフム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｏｍｏｒｐｈｕｍ）から精製された（Ｖｉｔｏｌｓ ｅｔ ａｌ．、１９６６）。
【０１８６】
コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼ活性（ほぼ２０単位）を含有する分画を３０℃において０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０（１ｍｌ）中で５ミリモルのＤＴＴ、４００ミリモルの［８−14Ｃ］−ＡＴＰ（２．５μＣｉ／μモル）、８００μモルのヒドロキソコバラミンまたはジアクアコビナミドおよびＫＢＨ4（３ｍｇ）の存在下に嫌気的に光から保護して３０分間インキュベーションする。次いで、この反応を８０℃に１０分間加熱することによって停止しそして、５０００×ｇにおいて５分間遠心した後、上澄み液（２００μｌ）をＨＰＬＣにより分析する（Ｇｉｍｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８６、Ｊａｃｏｂｓｅｎ ｅｔ ａｌ．、１９８６）。
【０１８７】
酵素活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのアデノシルコリノイド／分を発生するために必要な酵素の量として定義する。
【０１８８】
ｂ）コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの精製
実施例６、１、９ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの精製は後述するように実施する。
【０１８９】
典型的な精製実験において、ｃｏｂＯ遺伝子が増幅された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（１０ｇ）を０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０の中に懸濁させ、そして４℃において４０分間超音波処理する。次いで、粗製抽出物を５０，０００×ｇで１時間遠心することによって回収し、そして５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、０．５ミリモルのＤＴＴ緩衝液遠心（緩衝液Ａ）と平衡化したＰＤ１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）で脱塩する。次いでタンパク質溶液をモノＱ ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで分画し（各クロマトグラフィーの展開において２８０ｍｇのタンパク質）緩衝液Ａ中の０〜０．５モルのＫＣｌの勾配を使用し、次いで活性を含有する分画をプールし、超遠心により濃縮し、そして直線の減少する硫酸アンモニウムお勾配（１．７〜０モル）においてフェニル−スペロースＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、カラムを０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０、５ミリモルのＤＴＴ緩衝液で平衡化する。精製を完結するために、タンパク質を、超遠心により濃縮後、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムの親和的にクロマトグラフィーにかけ、５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．１モルのＮａＣｌ、５ミリモルのＤＴＴ緩衝液で溶離する。
【０１９０】
この工程後、この酵素の純度は９５％より大きい。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さない。この技術におけるその分子量は２８，０００である。この純度の程度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの精製の異なる工程、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を、次の２つの基質について、下表に記載する：ジアクアコビンアミド（ａ）およびヒドロキソコバラミン（ｂ）。これらの結果は、コリノイド基質の性質に対するこの酵素の特異性の不存在を実証する。そのうえ、コビリン酸ジアミドとＢ12との間の生合成経路のすべてのコリノイドがそれらの自然の形態で分離され（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、発表されない結果）、そして補酵素の形態であることが証明された。これが実証するように、コブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの自然の基質はコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドジアミドである。
【０１９１】
【表１３】
Figure 0003734466
【０１９２】
ｃ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼのＮＨ2末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼのＮＨ2末端配列を、実施例６．１．９ ｂ）に記載するように精製し、前述したように決定した。１３の残基が同定された：
Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−？−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
ＣＯＢＯタンパク質のＮＨ2末端配列（第４７図）はコブ（Ｉ）アラミンアデノシトランスフェラトランスフェラーゼのＮＨ2末端配列に正確に相当するが、ただし、第４７図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダトランスフェラーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により２８，０００と推定される。ＣＯＢＯタンパク質は、２４，０００のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＯタンパク質はコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼに相当する。ｃｏｂＫ遺伝子はコブ（Ｉ）アラミンアデノシルトランスフェラーゼの構造遺伝子である。
【０１９３】
６．１．１０、ｃｏｂＮ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＮタンパク質の同定
ａ）ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化の活性の実証
この実施例は、従来決して記載されてきていないコバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性の実証を例示する。問題の活性はヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化の活性である。
【０１９４】
この活性は、なかでも、次の典型的な実験により実証される。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（１０ｇ）を０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０（２０ｍｌ）中で超音波処理し、次いで５０，０００×ｇで１時間遠心することによって細胞の破片を除去することによって、菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの粗製の抽出物を得る。この抽出物のタンパク質（１０００ｍｇ）を、７ミリモルのＡＴＰおよび２００ミリモルのＣｏＣｌ2を含有する０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０（４０ｍｌ）中で、炭素−１４標識したヒドロゲノビリン酸ジアミド（３２ナノモル；５０μＣｉ／μモル）と３０℃において１時間インキュベーションする。この反応を１モルのＫＨ2ＰＯ4（７．５ｍｌ）および０．３モルのＫＣＮ（６ｍｌ）を添加することによって停止させ、次いで８０℃に１０分間加熱する。１５０００×ｇにおいて５０分間遠心した後、ＨＰＬＣ分析は次のことを示す：（１）出発ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドと同一の比放射能を有するコビリン酸ａ，ｃ−ジアミド（１９．２ナノモル）のインキュベーションの間の形成、および（２）ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドの対応する量の消失。この産生物が事実コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドであることを確証するために、産生物をＨＰＬＣにより精製し、次いで５％の硫酸を含有するメタノール中でエステル化する（１８時間、２０℃）。産生するコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドペンタメチルエステルの真偽はＴＬＣ（参照試料に関する）および質量スペクトルにより実証される。放射性標識つけを、ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドの中ではなく、コバルトの中に導入する（コバルト−５７を使用する）同様なインキュベーション下に、コバルト−５７標識したコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドを生合成し、そして同一の結論を引き出すことができるであろう。
【０１９５】
炭素−１４標識したヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドは次の方法で得られる：ヒドロゲノビリン酸を試験管内で［メチル−14Ｃ］ＳＡＭを使用して生合成し、次いでヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドに転化し、そして実施例６．１．２に記載されているようにＨＰＬＣにより精製する。
【０１９６】
この研究は、コバルトの挿入がＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中でヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのレベルにおいて起こることを実証する。記載する条件下に、ヒドロゲノビリン酸はコバルトによる酵素的キレート化のための基質ではない。
【０１９７】
ｂ）ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化に関係する菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの調製のアッセイおよび精製
アッセイすべき分画（０．５〜２単位）を、３０℃において、前述したように得られた菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの粗製の抽出物（５０μｌ）、７ミリモルのＡＴＰ、２００ミリモルのＣｏＣｌ2および７ミリモルの炭素−１４標識したヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミド（５０μＣｉ／μモル）とともに０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．０（４００μｌ）中で６０分間インキュベーションする。この反応を１モルのＫＨ2ＰＯ4（７５μｌ）および０．３モルのＫＣＮ（６０μｌ）を添加することによって停止させ、次いで８０℃に１０分間加熱する。１５０００×ｇにおいて５０分間遠心した後、上澄み液をＨＰＬＣにより分析して、形成したコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドを定量する（参照、実施例９）。酵素活性の単位は、これらの条件下に１ナノモルのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミド／時間を発生させるために必要な酵素の量として定義される。これらの条件下に、明らかなように、プラスミドｐＸＬ１９０９が導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr（参照、実施例４．５．２）の抽出物はＳＣ５１０Ｒｉｆrの抽出物の２０〜５０倍の活性を有する。この基準に基づいて、単独でこの活性の増幅の原因となるタンパク質を精製する。
【０１９８】
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ１９０９が導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（１０ｇ）を０．２モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０の中に懸濁させ、そして４℃において３０分間超音波処理する。次いで、粗製抽出物を５０，０００×ｇで１時間遠心することによって回収し、そして０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０（緩衝液Ａ）と平衡化したＰＤ１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）で脱塩する。タンパク質溶液をモノＱ ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで分画し（各クロマトグラフィーの展開において２１３ｍｇのタンパク質）緩衝液Ａ中の０〜０．５モルのＫＣｌの勾配を使用し、次いで活性を含有する分画をプールし、超遠心により濃縮し、そして０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．２（緩衝液Ｂ）で平衡化したＰＤ１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで脱塩し、そしてモノＱ ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、緩衝液Ｂ中の０〜０．５モルのＫＣｌの勾配を使用する。活性を含有する分画をプールし、超遠心により濃縮し、そして緩衝液Ｂで平衡化したＰＤ１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで脱塩し、そしてモノＱ ＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムのクロマトグラフィーにかけ、緩衝液Ｂ中の０〜０．５モルのＫＣｌの勾配を使用する。精製を完結するために、タンパク質を、超遠心により濃縮後、Ｂｉｏ−Ｓｉｌ２５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムの親和的にクロマトグラフィーにかけ、２０ミリモルのリン酸カリウム／５０ミリモルの硫酸ナトリウムｐＨ６．８で溶離する。
【０１９９】
この段階後、この酵素の純度は９５％より大きい。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さない。この技術におけるその分子量は１３５，０００である。この純度の程度はＮＨ2末端配列の独特性により確証される。ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化に関係する菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの精製の異なる段階、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を、下表に記載する。
【０２００】
【表１４】
Figure 0003734466
【０２０１】
ｃ）ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化に関係するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ)のタンパク質のＮＨ2末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
実施例６．１．１０ｂ)に記載するように精製したタンパク質のＮＨ2末端配列を、前述したように決定した。６つの残基が同定された：
Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｎ
ＣＯＢＮタンパク質のＮＨ2末端配列（第４７図）は精製したタンパク質のＮＨ2末端配列に正確に相当するが、ただし、第４７図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したタンパク質の分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により１３５，０００と推定される。ＣＯＢＮタンパク質は、１３８，０００のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＮタンパク質はヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転化に関係するタンパク質に相当する。それゆえ、ｃｏｂＮ遺伝子はこのタンパク質の構造遺伝子である。
【０２０２】
６．１．１１、ｃｏｂＰ遺伝子によりエンコードされるＣＯＢＰタンパク質の同定
ａ）コビンアミドキナーゼ活性のアッセイ
この実施例は、従来決して研究されてきていないコバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例示する。問題の活性はコビンアミドキナーゼの活性である。それはコビンアミドホスフェートを発生するＡｄｏ−コビンアミドの（Ｒ）−１−アミノ−２−プロパノール残基のヒドロキシル基のＡＴＰ−依存性リン酸化反応を触媒する。
【０２０３】
アッセイすべき分画を、暗所で３０℃において、１ミリモルのＥＤＴＡ、１ミリモルのＡＴＰ、２．５ミリモルのＭｇＣｌ2、１６ミリモルのＡｄｏ−コビンアミド（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）を含有する０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ８．８（５００μｌ）中で６０分間インキュベーションする。この反応を２０ミリモルの水性シアン化カリウム溶液（５００ｍｌ）の添加により停止させる。８０℃に１０分間加熱し、そして１５０００×ｇにおいて５０分間遠心した後、上澄み液の中に存在する形成したコビンアミドをＨＰＬＣ（参照、実施例９）により次の簡素化した直線の勾配を使用してアッセイする：１５分かけてＡ中の２５〜３０％のＢ、次いで１２分かけて３０〜１００％のＢ、そして３分１００％のＢ。
【０２０４】
活性の単位は、これらの条件下にコビンアミドから１ナノモルのコビンアミドホスフェート／時間を発生させるために必要な酵素の量として定義される。
【０２０５】
ｂ）コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼ活性のアッセイ
この実施例は、従来決して研究されてきていないコバラミンの生合成経路に直接関係する酵素活性のアッセイを例示する。問題の活性はコビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼの活性である。それはＡｄｏ−コビンアミドホスフェートへのＧＴＰ分子のＧＭＰ部分の付加を触媒し、これにより１分子のＧＤＰ−コビンアミドを発生し、そして１分子のピロホスフェートを遊離する。
【０２０６】
この活性はコビンアミドキナーゼと同一条件下にアッセイするが、ただしインキュベーションの間にＡｄｏ−コビンアミドホスフェート（１６ミリモル）（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）およびＧＴＰ（２ミリモル）を、それぞれ、Ａｄｏ−コビンアミドおよびＡＴＰの代わりに使用する。
【０２０７】
活性の単位は、これらの条件下にコビンアミドホスフェートから１ナノモルのＧＤＰ−コビンアミド／時間を発生させるために必要な酵素の量として定義される。
【０２０８】
ｂ）コビンアミドキナーゼの精製
実施例６．１．１１ａ）に記載するアッセイを使用して、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の精製を次のようにして実施する。
【０２０９】
典型的な精製実験において、プラスミドｐＸＬ６２３（参照、実施例４．５．２）が導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの湿潤細胞（５ｇ）を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．６（緩衝液Ａ）（２０ｍｌ）中で超音波処理する。超遠心（５０，０００×ｇ、１時間）および緩衝液Ａに対して４時間の透析後、保持された物質（４．５ｍｌ）を緩衝液Ａと平衡化したモノＱ ＨＲ１０／１０（（Ｐｈａｍａｃｉａ）上に注入する。タンパク質を０．４モルのＮａＣｌの直線の勾配で溶離し、そしてプールした活性分画を３０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ／５ミリモルのリン酸カリウム／５ミリモルの塩化カルシウムｐＨ７．６（緩衝液Ｂ）中で平衡化したＰＤ−１０（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムに通過させる。このタンパク質溶液を緩衝液Ｂ中で平衡化したＢｉｏ−Ｇｅｌ ＨＰＨＴ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラムで分画し、そして５〜３５０ミリモルのリン酸カリウムの勾配で溶離する。活性分画をプールし、そしてリン酸カリウムに関して５００ミリモルにし、次いでフェニル−スペロースＨＲ５／５（Ｐｈａｍａｃｉａ）カラムで分画し、減少する硫酸アンモニウムの勾配で溶離する。活性を含有する分画を最終的にＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．３中でモノＱ ＨＲ５／５カラムで再び精製する。この段階後、このタンパク質の純度は９７％より大きい。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて汚染タンパク質を示さない。この技術におけるその分子量は２０，０００である。コビンアミドキナーゼの精製の異なる段階、ならびにそれらの精製ファクターおよびそれらの収率を、表Ａに記載する。
【０２１０】
コビンアミドキナーゼ活性を含有する分画は、また、コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼ活性を有する。そのうえ、上の表に表す結果により示されるように、これらの２つの活性の比は精製を通じて分画において一定に止まる。最後に、精製したタンパク質は非常に高い純度、９７％を越える純度を有する。それゆえ、これらの結果が総合的に示すように、１つのかつ同一のタンパク質はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）におけるコバラミンの生合成経路の両者の連続的活性、すなわち、コビンアミドキナーゼおよびコビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼの原因となる。
【０２１１】
ｄ）シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼのＮＨ2末端配列およびこの活性をコードするシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の構造遺伝子の同定
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼのＮＨ2末端配列を、前述したように決定した。１０の残基が同定された：
Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ
ＣＯＢＰタンパク質のＮＨ2末端配列（第４７図）はこの配列のＮＨ2末端配列に正確に相当するが、ただし、第４７図に表す配列において、メチオニンは直接の配列決定により決定してペプチド配列より先行する。これから理解されるように、アミノ末端のメチオニンは生体内でメチオニンアミノペプチダーゼにより明確に切除される（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）。精製したコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼの分子量はＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により２０，０００と推定される。ＣＯＢＰタンパク質は、１９，０００のその配列から推定される分子量を有する（第４７図）。ＮＨ2末端配列と分子量との間の対応が明瞭に示すように、ＣＯＢＰタンパク質はコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼに相当する。ｃｏｂＰ遺伝子はコビンアミドキナーゼ／コビンアミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼの構造遺伝子である。
【０２１２】
６．２−蓄積した生合成の中間体によるＣＯＢタンパク質の決定
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質に酵素活性を帰属させることができる方法を例示する。この活性は、問題の段階においてブロックされたＣｏｂの１または２以上の突然変異における蓄積された生合成中間体に関して得られたデータにに基づいて帰属される。事実、ある突然変異が生合成中間体を蓄積する場合、この突然変異がその基質として問題の中間体をを有する段階においてブロックされる可能性が非常にある。
【０２１３】
６．２．１、ＣＯＢＣおよびＣＯＢＤタンパク質の性質
実施例１および４に既に記載したＣｏｂ突然変異Ｇ６４３（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）およびＧ５７２（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）は、ｃｏｂＣタンパク質に相当する段階においてブロックされる。事実、これらの２つの突然変異は、ｃｏｂＣ遺伝子の中に存在するトランスボゾンＴｎ５の不活性化挿入と相補性ではない。２つの菌株Ｇ６４３およびＧ５７２、ならびに突然変異しない親の菌株［Ｃ５８−Ｃ９ＲｉｆrおよびＫＴ２４４０Ｒｉｆr（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）］を、Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓについてＰＳ４’培地およびＰ．ｐｕｔｉｄａについてＰＳ４”培地（ＰＳ４’およびＰＳ４”は、前述のＰＳ４より、それぞれ、１００倍および１０００倍少ないコバルトを含有するＰＳ４培地に相当する）中で前述したように３日間培養した。57ＣｏＣｌ2を培養物に添加した（２５ｍｌの培養物について２．５μＣｉ／０．１μモル）。細胞内コリノイドをそれらの自然の形態で分離し、そしてそれらのＨＰＬＣ挙動により同定した。親の菌株は補酵素Ｂ12以外のコリノイドを蓄積しない。２つの突然変異Ｇ６４３およびＧ５７２はアデノシル化コビル酸をそれぞれ１１％および６％の比率で蓄積する。これらの％比率は親の菌株により合成された補酵素Ｂ12のレベルに関して計算する。コビル酸を別として、突然変異Ｇ６４３はコビリン酸ペンタアミドを２％の比率で蓄積する；コビリン酸ペンタアミドはコビル酸に先行する中間体である。これらの突然変異の研究により、これらの突然変異はコビル酸後にブロックされることがわかる。すべてのこれらのＣｏｂ突然変異は、ウロ’ゲンＩＩＩとコビンアミドとの間に、あるいはコビンアミドとコバラミンとの間においてブロックされる。突然変異Ｇ６４３およびＧ５７２はウロ’ゲンＩＩＩとコビンアミドとの間にブロックされる。ここで、これらの突然変異がコビンアミドの前にブロックされ、そして両者がコビル酸を蓄積する場合、それらがコードするタンパク質がアミノプロパノール残基でコビル酸をアミド化してコビンアミドを生成する反応を触媒する酵素的段階（コビンアミドシンターゼと呼ぶ）にのみ参加することができる；それらは、また、アミノプロパノールそれ自体でないはない場合でも、アミノプロパノールを提供する反応の基質の合成に多分参加することができる。ｃｏｂＣ遺伝子は、コビンアミドシンターゼまたはそのサブユニットの１つであるタンパク質をコードする。
【０２１４】
ｃｏｂＤ遺伝子に相当する段階においてブロックされるアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣｏｂ突然変異Ｇ６３４を同一の方法で分析した。この突然変異はｃｏｂＢ遺伝子における不活性化挿入と相補性ではない(実施例４．１）。この突然変異の中に見いだされる唯一の細胞内コリノイドはアデノシル化コビル酸である。上の突然変異ど同様に、この突然変異はコビル酸のコビンアミドへの転化に参加するか、あるいは多分この反応の他の基質の合成に参加するタンパク質をコードする。
【０２１５】
これらの２つの異なる遺伝子（ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ）は、同一段階に参加する２つのタンパク質をコードする。
【０２１６】
６．２．２、ＣＯＢＦ〜ＣＯＢＭタンパク質の性質
既に記載したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の突然変異を研究し、実施例４．２に記載する研究はこれらの突然変異の各々がブロックされることを示した。それらは次の突然変異である：Ｇ６１２（ｃｏｂＦ）、Ｇ６１５（ｃｏｂＧ）、Ｇ６１６（ｃｏｂＨ）、Ｇ６１３（ｃｏｂＩ）、Ｇ６１１（ｃｏｂＪ）、Ｇ６２０（ｃｏｂＫ）、Ｇ６３８（ｃｏｂＬ）およびＧ６０６（コバミド）；われわれは括弧内にこれらの突然変異の相補性の原因となるシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の遺伝子（実施例５）を示す、それゆえこの遺伝子はこの突然変異において突然変異される遺伝子に相当する。これらの突然変異は前述したように標識したコバルトを有するＰＳ４培地中で培養した。４日のインキュベーション後、突然変異をコリノイドおよびデコバルトコリノイドの細胞内含量について分析した（参照、実施例６．１．２および９）。
【０２１７】
【表１５】
Figure 0003734466
【０２１８】
これらの結果が示すように、突然変異のいずれもコリノイドを蓄積しない（ｃｏｂＦ遺伝子において不活性化される突然変異、Ｇ６１２、を除外する、これは、その一部分について、コビンアミドを蓄積するが、そのレベルは突然変異しない菌株が合成するコバラミンの２．２％に等しい）。しかしながら、いくつかの突然変異（Ｇ６１２、Ｇ６１５およびＧ６１６）は、親の菌株のコバラミンのレベルの１０％より多くを表すコバラミンのレベルを有する。すべてのこれらの突然変異は多分少なくともコビリン酸ジアミドの前にブロックされる。すべての突然変異は、突然変異しない菌株より小さい量でヒドロゲノビリン酸およびヒドロゲノビリン酸ジアミドを蓄積する；それゆえ、それらはヒドロゲノビリン酸の前にブロックされる可能性が非常に多い。すべてのｃｏｂＦ〜ｃｏｂＧ遺伝子はヒドロゲノビリン酸の前に参加するタンパク質をコードすると結論することができる。突然変異Ｇ６１３は、とくにヒドロゲノビリン酸の前に参加する、ＳＰ2ＭＴをコードするｃｏｂＩ遺伝子の中で突然変異される。この突然変異について、中間体の蓄積に関する本発明の実施例の結果は、この突然変異において不活性化される段階と完全に一致する、すなわち、この突然変異はヒドロゲノビリン酸後の中間体を突然変異しない菌株で観測されるより高いレベルで蓄積しない。この結果は、ｃｏｂＦ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＬおよびｃｏｂＭ遺伝子についてであり、実施例４．６の結果と一致し、ここでこれらの遺伝子はメチルのＳＡＭ依存性転移を触媒し、それゆえヒドロゲノビリン酸の前に参加するタンパク質をコードする。ＳＰ2ＭＴの構造遺伝子であるｃｏｂＩを除外して、これらの遺伝子はプレコリン−３後に参加する。事実、それらはＳＵＭＴまたはＳＰ2ＭＴの構造遺伝子ではないので、それらは後に、すなわち、プレコリン−３の後に必ず参加する（本発明において記載するすべてのｃｏｂ遺伝子はウロ’ゲンＩＩＩとコバラミンとの間に参加する）。これらのｃｏｂＦ〜ｃｏｂＨおよびｃｏｂＪ〜ｃｏｂＭの遺伝子は、プレコリン−３とヒドロゲノビリン酸との間に参加する酵素をコードする。
【０２１９】
６．２．３、ＣＯＢＳおよびＣＯＢＴタンパク質の性質
実施例１および４．３に記載する突然変異Ｇ２０３５は、ＣＯＢＳタンパク質に相当する段階においてブロックされる。実施例１に記載する突然変異Ｇ２０３７は、ＣＯＢＴタンパク質に相当する段階においてブロックされる。これらの菌株、ならびに親の菌株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓＣ５８Ｃ９Ｒｉｆr）を、ＰＳ４’培地（これは塩化コバルト濃度がＰＳ４培地より１００倍低いＰＳ４培地である）中で放射性コバルト57ＣｏＣｌ2の存在下に３日間培養し、そしてデコバルトコリノイドの細胞内含量、ならびにコリノイド含量を、既に前述したように分析する（参照、実施例６．２．２）。菌株Ｇ２０３５およびＧ２０３７はコリノイドを蓄積せず、そして大きい濃度（親の菌株で観測される濃度より大きい）のヒドロゲノビリン酸およびヒドロゲノビリン酸モノアミドおよびジアミドは菌株Ｇ２０３５でのみ存在する。この突然変異は、多分、ヒドロゲノビリン酸ジアミドの後にかつコビリン酸ジアミドの前に位置する段階においてブロックされる。結局、ｃｏｂＳ遺伝子はヒドロゲノビリン酸ジアミドのコビリン酸ジアミドへの転化に関係する酵素の１つをコードすると考えられる；それゆえ、このタンパク質はコバルトの挿入に、あるいは非アデノシル化コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコバルトの還元に参加するすることができる。対照的に、突然変異Ｇ２０３７はヒドロゲノビリン酸の上流に位置する段階においてブロックされると考えられる。ｃｏｂＴ遺伝子はヒドロゲノビリン酸の上流およびプレコリン−３の下流の酵素的段階に関係するタンパク質をコードすると考えられる（プレコリン−３の下流に関係する酵素をコードする他の構造遺伝子は既に同定された）。ｃｏｂＴタンパク質についての他の可能性は、それが、実施例５において提案されているように、コバルト結合性タンパク質としておよび／または他の１または２以上のタンパク質とその酸性部分を経て相互作用するタンパク質として参加することである。
【０２２０】
６．２．４、ＣＯＢＶタンパク質の性質
実施例１および４．４に記載する突然変異Ｇ２０３９およびＧ２０４０は、ＣＯＢＶタンパク質に相当する段階においてブロックされる。これらの菌株、ならびに親の菌株をＰＳ４’培地中で放射性コバルト57ＣｏＣｌ2の存在下に３日間培養し、次いでデコバルトコリノイドの細胞内含量を実施例９に記載するように分析する。菌株Ｇ２０３９およびＧ２０４０はコビル酸、コビンアミド、コビンアミドホスフェートおよびＧＤＰ−コビンアミドを蓄積する。これらの突然変異は、多分、ＧＤＰ−コビンアミドの下流の酵素的段階においてブロックされる。ｃｏｂＶ遺伝子はＧＤＰ−コビンアミドのコバラミンへの転化に関係する酵素をコードする、参照、実施例５。この結果は、基質としてＡｄｏ−ＧＤＰ−コビンアミドを有するＣＯＢＶタンパク質のコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼ活性と完全に一致する。
【０２２１】
６．３、ＳＡＭに対する親和性の研究によるＣＯＢタンパク質の決定 この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）から精製したＣＯＢタンパク質を使用して、ＳＡＭ結合活性を試験管内で実証する方法を例示する。ＣＯＢタンパク質がこのような活性を有する場合、それはこのＣＯＢタンパク質が経路のメチルトランスフェラーゼであること、およびそれがウロ’ゲンＩＩＩとコビリン酸との間で起こる８つのメチル基の転移の１つに参加することを意味する。
【０２２２】
６．３．１、精製したタンパク質に対するＳＡＭの親和性の試験
この試験は、コバラミンの生合成経路のメチルトランスフェラーゼが明確にＳＡＭ結合部位を有するという原理に基づく。この部位は、ＳＡＭに特異的に結合しないタンパク質についてより高いＳＡＭの親和性により実証されなくてはならない。研究するタンパク質を過剰の放射性ＳＡＭの存在下にインキュベーションした後、タンパク質をゲル透過クロマトグラフィーにより遊離ＳＡＭから分離する。このタンパク質の分子量を有する分画の中に現れる放射能はインキュベーションの間に結合したＳＡＭに相当する。クロマトグラフィーを２℃において実施して、分離の間に結合したＳＡＭの解放を最大に制限する。
【０２２３】
タンパク質（ほぼ１０μｇ）を３０℃において０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．７（２００μｌ）中で［メチル−3Ｈ］ＳＡＭ（５ナノモル；１μＣｉ）とともに１０分間インキュベーションする。インキュベーション後、この混合物の一部分（１００μｌ）を直ちにＴＳＫ−１２５（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）カラム上に注入し、このカラムの分配会社により推奨されるように、５０ミリモルの硫酸ナトリウム／２０ミリモルのリン酸二水素ナトリウム混合物で１ｍｌ／分で溶離する。０.５mｌの分画を集め、そして液体シンチレーションカウンターで計数する。タンパク質およびＳＡＭの保持時間は２８０ｎｍにおける溶離液の吸収の記録から直接得られる。
【０２２４】
６．３．２、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢＡおよびＣＯＢＦへのＳＡＭの結合の試験管内研究
ａ）ＣＯＢＦおよびＣＯＢＡタンパク質の精製
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ｃｏｂＦタンパク質を後述するように精製する。典型的な実験において、ＰＳ４培地中の培養後に得られた、プラスミドｐＸＬ１５４６が導入された菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr（参照、実施例７．３）の湿潤細胞（１０ｇ）を、０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７（３０ｍｌ）の中に再懸濁し、そして４℃において１５分間超音波処理する。次いで、粗製の抽出物を５０，０００ｇで１時間遠心機することによって回収し、そして上澄み液をＤＥＡＥ−セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラム（１ｍｌのゲル）に通過させて存在するテトラピロール化合物を除去する。次いで、この抽出物のタンパク質（１０ｍｇ；０．７ｍｌ）を同一緩衝液と平衡化したモノＱ ＨＲ５／５カラム上に注入する。タンパク質を直線のＫＣｌ勾配（０〜０．２５モル）で溶離する。ＣＯＢＦタンパク質を０．２０モルのＫＣｌで溶離する。それは０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．７で２倍に希釈し、そして２回目にモノＱ ＨＲ５／５で精製する。ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマッシーブルーの可視化を使用してタンパク質を明らかにする。そのうえ、この技術はＣＯＢＦはこの精製工程後ほぼ９５％の純度である。精製したタンパク質のＮＨ2末端配列を前述したように決定する。２つのＮＨ2末端配列は各劣化サイクルにおいて同時に現れる；それらは次の順序で、示す比率で存在する：
Figure 0003734466
配列１は第１６図に記載するＣＯＢＦタンパク質のＮＨ2末端配列に相当するが、ただしアミノ末端のメチオニンはメチオニンアミノペプチダーゼ（Ｂｅｎ ＢａｓｓａｔおよびＢａｕｅｒ、１９８７）により既に述べられたルール（Ｈｉｒｅｌ ｅｔ ａｌ．、１９８９）に従い切除される。配列２は、より大きい量で存在し、同一タンパク質に相当するが、このタンパク質はわれわれが仮定した翻訳開始ＡＴＧコドンにおいて実施されない翻訳開始を有し、そこに解読フレーム上の下流の５つのコドンが位置する（第１６図）。事実、この配列のアミノ酸は、正確には、この配列の第２メチオニン（アミノ酸Ｎｏ．６）から出発するＣＯＢＦタンパク質の配列の中に見いだされるものである。この場合において、アミノ末端のメチオニンは切除されず、これは既に述べられたルール（Ｈｉｒｅｌｅｔ ａｌ．、１９８９）を確証する。プラスミドｐＸＬ１５４６を有する菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrにおいて、２つの翻訳開始が存在し、それらは、一方において、われわれの構成において、シャイン−ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｎｏ）配列から正しい距離に位置するメチオニンのコドンに相当し、そして一方において第１６図に表すｃｏｂＦ遺伝子の配列の中に存在する第２のメチオニンのコドンにおいて実施される。これから理解されるように、ＣＯＢＦタンパク質は多分第１６図に示すメチオニンにおいて開始されず、５アミノ酸以後に存在するメチオニンにおいて開始される。
【０２２５】
すべての場合において、この結果が示すように、ＣＯＢＦタンパク質は、事実、発現され、そして後者は４アミノ酸だけ伸長した形態で発現される。精製の間に、両者のタンパク質は精製される。この実施例において、これらの２つの精製されたタンパク質の混合物をわれわれは精製したタンパク質と呼ぶ。
【０２２６】
シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢＡを、前述したように精製する（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【０２２７】
ｂ）ＳＡＭの結合
これらの２つのタンパク質へのＳＡＭの結合を、実施例６．３ａ）において前述したように研究する。ウシ血清アルブミンおよび精製したＣＯＢＨタンパク質を陰性の対照として使用する。ＣＯＢＡおよびＣＯＢＦタンパク質について、放射能のピークはＴＳＫ−１２５カラムからこれらのタンパク質の出現時間において出現するとき観測される（第２０図）。この試験において、ＣＯＢＩタンパク質は同一のＳＡＭの結合性質を示す。対照的に、ＢＳＡおよびＣＯＢＨタンパク質ではこのような放射能のピークは存在しない。この試験はＣＯＢＡ、ＣＯＢＩおよびＣＯＢＦタンパク質へのＳＡＭの試験管内を実証する。これらの結果が示すように、ＣＯＢＡ、ＣＯＢＩおよびＣＯＢＦはＳＡＭメチルトランスフェラーゼである。この結果はＣＯＢＡおよびＣＯＢＩの活性と完全に一致する。なぜなら、それらはシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の、それぞれ、ＳＵＭＴおよびＳＰ2ＭＴであるからである。それゆえ、ＣＯＢＦタンパク質は多分コバラミンの生合成経路のＳＡＭメチルトランスフェラーゼである。この試験はＣＯＢＦがメチルトランスフェラーゼであることを実証する。
【０２２８】
６．４−配列の相同性の研究による活性の決定
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の種々のＣＯＢタンパク質の配列を比較することによって、コバラミンの生合成経路のＳＡＭトランスフェラーゼであるＣＯＢタンパク質を発見することができる方法を例示する。
【０２２９】
ＣＯＢＩおよびＣＯＢＡタンパク質は、生合成経路の両者メチルトランスフェラーゼである。これらの２つのタンパク質をカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）、１９８４のプログラムに従い比較する。この比較は強い相同性の３つの領域を生ずる（第２１図）。これらの領域の各々において、２つのタンパク質の間に４５％より大きい厳格な相同性が存在する。ＣＯＢＡおよびＣＹＧＳの間の強い相同性の２つの領域が、また、表される（第２２図）；それらはＣＯＢＩと強い相同性を表すＣＯＢＡの同一領域である。ＣＯＢＡ、ＣＹＧＳおよびＣＯＢＩの強い相同性のこれらの領域は他のＣＯＢタンパク質との相同性を表す。問題のタンパク質はＣＯＢＦ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭである（第２３図）。領域１に関すると、ＣＯＢＦ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭタンパク質はすべてのゲンプロ（Ｇｅｎｐｒｏ）タンパク質に関して有意な相同性を表し、Ｇｅｎｐｒｏは、カネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムに従い、２００より大きいアミノ酸の推定上の解読部分により増大されたゲンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）（バージョン９）タンパク質抽出である。領域２に関すると、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭタンパク質は、すべてのゲンプロ（バージョン５９）タンパク質に関して有意な相同性を示す。相同性の第３領域に関すると、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭはすべてのゲンプロ（バージョン５９）タンパク質に関して有意な相同性を示す。それゆえ、配列を比較すると、４つのタンパク質、ＣＯＢＦ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭは、メチルトランスフェラーゼの３つの型、ＣＯＢＡ、ＣＯＢＩおよびＣＯＢＦの配列の保存された領域と有意の相同性を示す。ＣＯＢＧ、ＣＯＢＨおよびＣＯＢＫタンパク質は、メチラーゼの保存された領域と有意の相同性を示さない。ＣＯＢＦタンパク質は領域１においてのみ他のタンパク質と有意の相同性を示す。これらの相同性は、多分、すべてのこれらのタンパク質がメチルトランスフェラーゼであるという事実に相当するに違いない。この結果は、試験管内のＳＡＭへの結合についてこのタンパク質が有する能力に関して、ＣＯＢＦについて記載した生物学的データと合致する（実施例６．３）。これらの相同性は、一方において、ＣＯＦがコバラミンの生合成経路のＳＡＭメチルトランスフェラーゼであることを確証し、そして、他方において、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭがコバラミンの生合成経路のＳＡＭメチルトランスフェラーゼでありうることを実証する。これらの結果が、また、示すように、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣＯＢタンパク質と他の微生物の等しい機能のタンパク質との間に相同性が存在する。
【０２３０】
実施例６（Ｂ）−メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの構造遺伝子の精製およびクローニング
この実施例は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓにおいて同定されたものに属するＣＯＢ酵素およびｃｏｂ遺伝子を、他の微生物において、得る方法を例示する。
【０２３１】
６（Ｂ）．１、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの精製
この実施例は、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの精製およびその触媒の性質を記載する。
【０２３２】
メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）菌株ＤＳＭ２６１１を記載したように培養する（Ｓｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．、１９８８）。湿潤細胞（１２ｇ）を得る。後者を５ミリモルのＤＴＴおよび１ミリモルのＥＤＴＡを含有する０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液ｐＨ７．６（８０ｍｌ）の中に再懸濁し、そして４℃において１時間３０分間超音波処理し、次いで５０，０００ｇで１時間遠心する。次いで、同一緩衝液中で構成した小さいＤＥＡＥ−セファデックスＡ２５カラムを通過させて、遊離テトラピロール化合物を抽出物から除去する。５５〜７５％の硫酸アンモニウム飽和において沈澱するタンパク質を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５ミリモルのＤＴＴ、１．７モルの硫酸アンモニウム緩衝液中で可溶化し、そしてフェニル−スペロースＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ、フランス国／ＳＡ）カラム上に注入し、減少する勾配（硫酸アンモニウムに関して１．７〜０モル）で溶離する。活性分画を０．１モルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ７．５、０．５ミリモルのＤＴＴ、２５％のグリセロール緩衝液（緩衝液Ａ）と平衡化したセファデックスＧ−２５カラムに通過させ、次いで緩衝液Ａと平衡化したフェニル−スペロースＨＲ１０／１０（Ｐｈａｍａｃｉａ、フランス国ＳＡ）カラム上に注入し、そして０〜０．３モルのＫＣｌの勾配で溶離する；この工程を同一条件下に第２回目を反復する。Ｂｉｏ−Ｓｉｌ ＴＳＫ−２５０（ＢｉｏＲａｄ フランス国ＳＡ）の先行する工程の活性分画のゲル透過クロマトグラフィーによりタンパク質が得られ、このタンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｃ−１８μＢｏｎｄａｐａｋ）において相同性である。精製の異なる工程、それらの収率、ならびにそれらの精製ファクターを下表に記載する。
【０２３３】
この表に示すように、合計の精製ファクターは４，５００より大きい。純粋な酵素のいくつかの性質を既に記載されている方法に従い研究した（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。この酵素は、事実、ＳＵＭＴ活性を有する、すなわち、それはウロ’ゲンＩＩＩのＣ−２およびＣ−７における２つのメチル基のＳＡＭ依存性転移を触媒する。ゲル透過により推定されるこの酵素の分子量は６０，０００＋／−１，５００であるが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによると、それは２９，０００であり、これはそれがホモ二量体の酵素であることを示す。既に記載されている条件（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）下に、この酵素はウロ’ゲンＩＩＩについて５２＋／−ｎｏウロ’ゲンＩＩＩのＫｍを有する。さらに、この酵素は２０μモル以下の濃度において基質による阻害を示さないが、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＵＭＴは２μモル以上の濃度においてウロ’ゲンＩＩＩによる阻害を示す（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【０２３４】
【表１６】
Figure 0003734466
【０２３５】
Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴのＶｍａｘを決定した。この値は、この反応の最適な条件下に既に決定された、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓについて見いだされた値（ウロ’ゲンＩＩＩによるその阻害を考慮する)、４８９Ｕ／ｍｇのタンパク質(Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ.、１９８９）より大きい／
６（Ｂ）．２、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴの構造遺伝子のクローニング
６（Ｂ）．２．１、Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴの構造遺伝子のクローニング。
【０２３６】
この目的で、この手順は次の通りである：２００ピコモルのＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴを前述したようにタンパク質のＮＨ2末端配列のために使用する。さらに、このタンパク質のトリプシンの消化により得られるペプチド断片を同様にそのＮＨ2末端配列の配列決定に付す。得られる配列を第４８図に表す。それぞれ、センスおよびアンチセンスのオリゴヌクレオチド９４６、９２３および９４７を前述したように合成する；これらのオリゴヌクレオチドはそれらの５’末端に制限部位を含有し、制限部位はセンスオリゴヌクレオチドについてＥｃｏＲＩであるか、あるいはアンチセンスオリゴヌクレオチドについてＨｉｎｄＩＩＩである。これらのオリゴヌクレオチドは、第４８Ｂ図に線図的に示すように、酵素のＤＮＡ増幅実験のために使用する（Ｓａｉｋ ｅｔ ａｌ．、１９８８）。
【０２３７】
Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉゲノムＤＮＡを次の方法で調製する：Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ（ＤＳＭ２６１１）細胞（０．４ｇ）を０．１５モルのＮａＣｌ溶液で洗浄する。次いで、細胞を２５％のスクロース、５０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、リゾチーム（４０ｍｇ）の溶液（４ｍｌ）中でインキュベーションし、その後プロイテイナーゼＫ（４０ｍｇ）および０．２％のＳＤＳ、０．１モルのＥＤＴＡ ｐＨ８の溶液
（８ｍｌ）の添加後、５０℃において２〜３時間インキュベーションする。次いでＤＮＡをフェノール／クロロホルム（５０％／５０％）で２回、次いでクロロホルムで２回抽出し、その後イソプロパノールで沈澱させ、そしてＴＮＥ（１０ミリモルのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８、１ミリモルのＥＤＴＡ、１００ミリモルのＮａＣｌ）（３ｍｌ）の中に取る。
【０２３８】
Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＤＮＡの酵素的増幅をサイキ（Ｓａｉｋｉ） ｅｔ ａｌ．、１９８８のプロトコルに従い、０．１ｍｌの体積でＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉのゲノムＤＮＡ（６００ｎｇ）およびプライマー９４６および９４７（反応１）調製９２３および９４７（反応２）を使用して実施する。この反応に使用する緩衝液は１ミリモルのＭｇＣｌ2、５０ミリモルのＫＣｌ、０．００１％のゼラチンおよび各０．２ミリモルの濃度のｄＮＴＰである；各増幅反応について、１０ｍｇの各オリゴヌクレオチド、ならびにＴａｇ ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位）（Ｃｅｔｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用する。増幅は３０サイクルにわたってパーキン−エルマー・セツス（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）ＤＮＡ増幅系で実施する；各サイクルの間に、ＤＮＡを９５℃において１分間変性し、オリゴヌクレオチドのプライマーを一本鎖ＤＮＡと３８℃において２分間ハイブリダイゼーションし、そして新しく形成した鎖を７２℃において３分間重合させる。次いで増幅産生物をクロロホルムで抽出し、その後エタノール沈澱させる；次いで、それらをアクリルアミドゲル上で移動後可視化し、その後制限酵素、例えば、ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化することができる。
【０２３９】
反応１の場合において、２つの断片が観察される：６１５ｂｐならびに２４０ｂｐにおいて。反応２に関して、２つの断片がまた観察される：６３０ｂｐならびに１７０ｂｐにおいて。オリゴヌクレオチド９４６〜９４７の間の酵素増幅反応の産生物の全体をアクリルアミドゲル上の移動により分離する；６１５ｂｐの断片を前述したように精製する。次いで、この断片ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、断片の粘着末端をつくる。次いで断片をファージＭ１３ｍｐ１９の複製の形態のＤＮＡと結合する。結合体をＥ．ｃｏｌｉ ＴＧ１の中に形質転換する。６１５ｂｐのインサートを含有する６つの組み換えクローンを汎用プライマー−２０（Ｐｈａｍａｃｉａ ＳＡ、フランス国）で配列決定することによって分析する。第４９図に示すように、６１５ｂｐのインサートを含有する組み換えファージの一本鎖ＤＮＡを配列決定するとき、ＥｃｏＲＩ部位の下流において、オリゴヌクレオチド９４６のそれに相当する非同義性配列および、同一フレームにおける、引き続くアミノ酸ＬＩＴＬＫＡＶＮＶＬＫ？ＡＤＶＶＬ（？は、この位置において、残基を決定することができないこと意味する）をコードする配列が観測されなくてはならない；この配列は、ＳＵＭＴのＮＨ2末端配列において、オリゴヌクレオチド９４６に相当するアミノ酸に引き続く配列に相当する（参照、第４８図）。２つのクローンについて、実際に、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴのＮＨ2末端領域をコードすることができる配列が観察され、この配列はオリゴヌクレオチド９４６を含有する配列によりエンコードされるアミノ酸である配置Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕで開始する。この観察が示すように、これらの２つの複製形態はメタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの構造遺伝子に対して内部の断片に相当するインサートを含有する。Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉの構造遺伝子に対して内部のこの断片を有する複製形態をｐＧ１０と呼ぶ。
【０２４０】
６（Ｂ）．２．２、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）ＳＵＭＴの構造遺伝子のクローニング
メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）のゲノムＤＮＡをいくつかの酵素で消化する（一本鎖または二本鎖）。消化後、断片をアガロースゲルの電気泳動により分離し、次いで前述したようにナイロン膜上に転移する。こうして転移された断片の変性および予備ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイゼーションを複製形態のｐＧ１０を32Ｐ標識したプローブとしてを使用して前述したように実施する。こうして、メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｖａｎｏｖｉｉ）のＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ消化から発生する３．２ｋｂの断片をプローブとハイブリダイゼーションすることが発見された（参照、第５０図）。次いで、ゲノムのＤＮＡ（４０μｇ）のＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉをＥｃｏＲＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、その後アクリルアミドゲル上の移動により分割する。３〜３．５ｋｂの大きさを有する断片を前述したように電気溶離する。こうして精製した断片を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化したベクターｐＢＫＳ＋（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ、ラジョラ）と結合する。結合体をＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）の中に形質転換する。形質転換体をアンピシリンおよびＸ−ｇａｌを補充したＬＢ培地上で選択する。８００の白色のコロニーをフィルター上で二次培養物する；バクテリアの成長および引き続く溶菌後、コロニーのハイブリダイゼーションをグリュンステイン（Ｇｒｕｅｎｓｔｅｉｎ）およびホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）（１９７５）の技術に従い実施する。使用するプローブは32Ｐで標識した複製形態のｐＧ１０である。このプローブを使用するハイブリダイゼーション試験後、単一の陽性のクローンが発見された。このクローンのプラスミドＤＮＡをｐＸＬ１８０９と呼ぶ（参照、第５６図）。このＤＮＡをＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩで消化すると、期待するように、３．２ｋｂの挿入を可視化することができる。ｐＸＬ１８０９を両者鎖上でチェン（Ｃｈｅｎ）およびシーバーグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）（１９８５）の技術により配列決定する。９５５塩基の配列が得られる（第５１図）。オープンリーディングフレームを分析すると、塩基３４（ＡＴＧ）から塩基７２９（ＴＧＡ）のオープンリーディングフレームが同定される。このオープンリーディングフレームは、その配列が第５２図に示されているタンパク質をコードする。このタンパク質は２４，９００の分子量を有し（参照、第５３図）、この分子量はＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉから精製したタンパク質の分子量に近い。このタンパク質のＮＨ2末端配列は、正確に、精製したＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴについて決定された配列である（参照、第４８図および第５２図）。これらの観察は、クローニングしそして配列決定した遺伝子が事実Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴの構造遺伝子であることを明瞭に確立する。この活性はすべてのバクテリアにおけるコリノイドの生合成に参加すると仮定されるので、この遺伝子はｃｏｒＡ遺伝子と表示し、そしてこの同一遺伝子のＣＯＲＡタンパク質によりエンコードされる。Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉのＣＯＲＡタンパク質の親水性プロフィルを、ホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッヅ（Ｗｏｏｄｓ）（１９８１）のプログラムから生成し、これが示すように、それは、期待するように、第５４図に示すように、親水性タンパク質である。Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉのＣＯＲＡタンパク質は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣＯＢＡに関して４０％より多い厳格な相同性の程度を示す（第５７図）。この相同性は両者のタンパク質の事実上全体にわたって存在する。なぜなら、それはＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉのＣＯＲＡの残基３〜２２７およびＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣＯＢＡの残基１７〜２５１に関するからである。この相同性は同一の反応を触媒する２つの反応の間に存在する構造の相同性を反映する。Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣＯＲＡおよびＣＯＢＡの間で最も高度に保存される領域は、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓのＣＯＢＡとＥ．ｃｏｌｉのＣＹＳＧとの間に保存されるものと同一である（第２２図）。
【０２４１】
実施例７−ＣＯＢタンパク質の発現
７．１−シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の発現
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中のシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質の構造遺伝子の増幅がＣＯＢタンパク質の活性の増幅に導くことを例示する。
【０２４２】
７．１．１−ＣＯＢＡタンパク質の発現
プラスミドｐＸＬ５５７は、５．４ｋｂの断片の２．４ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＶ断片（第７図の配列中の、それぞれ、位置８０および２３９４において）がクローニングされているプラスミドｐＸＬ５９に相当する。この断片はｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有する。
【０２４３】
ｐＸＬ５４５はｃｏｂＥ遺伝子のみを含有する。その構成は実施例４．１に記載した。
【０２４４】
これらの２つのプラスミドは接合的転移によりＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に導入した。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr、ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ５９、ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ５５７およびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ５４５をＰＳ４培地中で培養した。第４日に、培養を停止し、そしてＳＵＭＴ活性を既に記載されている標準のプロトコルに従いアッセイした（Ｆ．Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。活性を下に記載する。
【０２４５】
【表１７】
Figure 0003734466
【０２４６】
これらの結果から明らかなように、プラスミドｐＸＬ５５７のみはＳＣ５１０ＲｉｆrにおけるＳＵＭＴの活性を顕著に増加する（５０のファクター）。この増加はｃｏｂＥではなくｃｏｂＡの増幅から生ずる。なぜなら、ｃｏｂＥのみの増幅を可能とするプラスミドｐＸＬ５４５はＳＵＭＴの活性を増加しないからである。この結果はｃｏｂＡがシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳＵＭＴの構造遺伝子であることを確証する。この結果が示すように、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳＵＭＴの構造遺伝子の増幅により、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中でＳＵＭＴ活性を増幅することができる。
【０２４７】
７．１．２−ＣＯＢＩタンパク質の発現
ＳＰ2ＭＴの構造遺伝子（ｃｏｂＩ）を含有する８．７ｋｂのＤＮＡ断片から由来する断片をグラム陰性バクテリアにおける広い宿主範囲を有するプラスミドの中にクローニングし、次いでこのプラスミドを接合によりシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に導入する。次いで、この菌株のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラーゼ活性をこのベクターを有する菌株のそれに関して測定する。
【０２４８】
ｃｏｂＨおよびｃｏｂＩ遺伝子を含有する１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片を８．９ｋｂの断片から精製する。ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩリンカーを、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ末端に、後者がバクテリオファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼでフィルインされた後、位置する。次いで、この断片を広い宿主範囲のプラスミドｐＸＬ５９のＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に挿入する。これにより得られたプラスミドをｐＸＬ１１４８と表示する（第２４図）。 別々に、関係するプラスミドを構成する：ｃｏｂＨ遺伝子全体およびｃｏｂＩ遺伝子の５’部分のみを含有する１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片を、８．７ｋｂの断片から精製した。ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩリンカーを、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩに、後者がファージＴ４ＤＮＡポリメラーゼでフィルインまたは消化された後、付加した。次いで、この断片をｐＸＬ５９のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位の間に挿入してプラスミドｐＸＬ１１４９を生成した。プラスミドｐＸＬ１１４８およびｐＸＬ１１４９は、ｃｏｂＩ遺伝子の３’末端を含有する０．３ｋｂのＳｓｔＩおよびＳｓｔＩ断片のｐＸＬ１１４８中の存在においてのみ異なる。ｐＸＬ１１４８は、ｐＸＬ１１４９と対照的に、ｃｏｂＩの全構造遺伝子を有する。
【０２４９】
これらの２つのプラスミドは接合によりＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に導入した。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr、ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ５９、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１１４８およびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ１１４９をＰＳ４培地中で培養する。４日間の培養後、細胞を収穫し、そしてＳＰ2ＭＴ活性を実施例６．１．３ａ）に記載するようにアッセイする。
【０２５０】
これらのアッセイの結果を、実施例６．１．３ａ）におけるように定義したＳＰ2ＭＴ活性とともに下に記載する。
【０２５１】
【表１８】
Figure 0003734466
【０２５２】
活性は実施例６．１．３ａ）において定義したように％で表す。
【０２５３】
プラスミドｐＸＬ１１４８のみはＳＰ2ＭＴ活性の実質的な増加を生ずる。対照的に、プラスミドｐＸＬ１１４９は対照のＳＣ５１０ＲｉｆrおよびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ５９で観測されたのと異なる結果を与えない。ｐＸＬ１１４８はｃｏｂＩ遺伝子を含有する唯一のプラスミドであり、そしてそれはＳＰ2ＭＴ活性を増幅するただ１つである；この結果はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＳＰ2ＭＴの構造遺伝子がｃｏｂＩ遺伝子であることを確証する。さらに、これらの異なる菌株の合計のタンパク質を変性条件下に電気泳動により分割する（１０％のアクリルアミドゲルを使用してＳＤＳ−ＰＡＧＥ）場合、２５，０００の分子量を有するタンパク質に相当するバンドの存在はｐＸＬ１１４８の場合において特別に観察される（第２５図）。このタンパク質の分子量はＣＯＢＩタンパク質のそれに相当する。プラスミドｐＸＬ１１４８はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中でＣＯＢＩタンパク質の過剰産生を得ることを可能とする。
【０２５４】
７．１．３−ＣＯＢＦの発現
この発現は、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｔｒｐプロモーターおよびバクテリオファージラムダのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位をｃｏｂＦ遺伝子の上流に配置することによって得られる。これにより得られた発現は、同一のマルチコピーのプラスミドを使用する簡単な遺伝子の増幅により観察されるものより非常に高い。
【０２５５】
ｐＸＬ１４９６（下の実施例７．２．１）の２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩを精製する（第２６図）。この断片は、ｃｏｂＦ遺伝子の上流に、Ｅ．ｃｏｌｉのＰｔｒｐプロモーターおよびバクテリオファージラムダのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位を含有する。ｃｏｂＦ遺伝子の下流に、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネーターが存在する。この断片をプラスミドｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位においてクローニングしてｐＸＬ１５４６を生成した（第２６図］。ｐＫＴ２３０はほとんどすべてのグラム陰性バクテリアの中で複製する不適合性群Ｑのプラスミドである（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎｅｔ ａｌ．、１９８１）；このプラスミドはカナマイシン抵抗性である。プラスミドｐＸＬ１５４６およびｐＫＴ２３０を接合によりＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に導入する。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr、ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＫＴ２３０およびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ１５４６を前述したようにＰＳ４培地の中で培養する。４日間の培養後、異なる菌株の合計のタンパク質を１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。第２７図に示すように、過度に発現される分子量３２，０００のタンパク質がＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ１５４６の抽出物の中に観測される；このタンパク質はＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ｐＸＬ１４９６により過度に発現されるタンパク質と同時に移動する（下の実施例７．２．１）。さらに、このタンパク質はｐＸＬ１５４６を含有する菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの中で特別に発現され、ここでそれは合計のタンパク質の少なくとも２０％を表す。対照的に、このタンパク質は菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrおよびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＫＴ２３０の合計のタンパク質において観察されない。それゆえ、この過度に発現されるタンパク質はＣＯＢＦタンパク質である。
【０２５６】
７．１．４−ＣＯＢＨの発現
この実施例は、ｃｏｂＨ遺伝子を含有するシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＤＮＡ断片の増幅を記載する。この遺伝子によりエンコードされるタンパク質を精製する；それはＣＯＢＨタンパク質である。実施例７．１．２に記載するプラスミドｐＸＬ１１４９は、８．７ｋｂの断片から由来するＤＮＡインサートの中に全ｃｏｂＨ遺伝子のみを含有する。ＳＣ５１０Ｒｉｆrにおいて、このプラスミドは、このベクターと対照的に、分子量２２，０００のタンパク質の過度の発現を生ずる（第２５図）。
【０２５７】
７．１．５−ＣＯＢＶの発現
この実施例は、ｃｏｂＶのみを含有するプラスミドによるコバラミン−５’−ホスフェートシンターゼの増幅を記載する（ｐＸＬ６９９、参照、第３８図）。コバラミン−５’−ホスフェートシンターゼ活性は、ＳＣ８７７Ｒｉｆrにおいて、ベクターｐＸＬ４３５、ｐＸＬ１３０３、ｐＸＬ１３２４またはｐＫＴ２３０をもつ同一菌株に関して、プラスミドｐＸＬ６９９により５０のファクターで増幅される。このプラスミドは、そのインサートの中に、ｃｏｂＶの全体＋ＯＲＦ１８およびｃｏｂＶの５’末端部分のみを含有する。このような菌株(ＳＣ８７７Ｒｉｆr ｐＸＬ６９９）において、ＣＯＢＶタンパク質は明確に過度に発現される；この過度の発現は菌株ＳＣ８７７Ｒｉｆrの発現に関して５０のファクターである。
【０２５８】
７．１．６−ＣＯＲＡタンパク質の発現
Ｐｔｒｐプロモーターおよび次いでバクテリオファージλのＲＢＳ ｃＩＩ、Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴ構造遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネーター領域を含有するｐＸＬ１８３２の１．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片（参照、実施例７．２．４）を、ｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部位においてクローニングする。（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）。この方法において、プラスミドｐＸＬ１８４１が得られる（参照、第５６図）。このプラスミドを前述したようにＰ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＳＣ５１０Ｒｉｆrの中で移動化する。トランス接合体をより詳細に研究する。この菌株をＰＳ４培地中で培養し、そしてバクテリアの抽出物のＳＵＭＴ活性を対照の菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）のそれと同時にアッセイする。これらの菌株の活性を下に記載する。
Figure 0003734466
この結果が明瞭に示すように、菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ１８４１のＳＵＭＴ活性はＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ４３５のそれより顕著に大きいので、プラスミドｐＸＬ１８４１の結果、Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中のＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉのＳＵＭＴ活性の発現が存在する。
【０２５９】
７．２−Ｅ．ｃｏｌｉ中の発現
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質をＥ．ｃｏｌｉの中で過度に発現することができる方法を例示する。
【０２６０】
７．２．１−ＣＯＢＦの発現
８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の２２５０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片（第８図に表す配列におけるそれぞれの位置０および２２５０において）を、ファージＭ１３ｍｐ１９（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．、１９８３）の中にＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の間にクローニングした。これにより構成されたプラスミドをｐＸＬ１４０５と表示する。ＮｄｅＩ部位を特異的突然変異誘発により導入し、こうしてこの制限部位の最後の３つの塩基（ＡＴＧ）がｃｏｂＦ遺伝子の翻訳開始部位を構成するようにする。これはｃｏｂＦ遺伝子のＡＴＧに先行する３塩基、ＧＡＡ（Ｇは第８図に表す配列において位置７３３に存在する）をＣＡＴに修飾する。次いで、ｃｏｂＦ遺伝子を含有するＮｄｅＩ−ＳｐｈＩ−ＳｐｈＩ断片（第２６図）を、プラスミドｐＸＬ６９４（Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７）のＮｄｅＩ−ＳｐｈＩ部位の間にクローニングする。これにより構成されるプラスミドはｐＸＬ１４９６と表示する（第２６図）。Ｅ．ｃｏｌｉ中の遺伝子の発現の調節のためのシグナルは、ｃｏｂＦ遺伝子に先行する１２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片（これはｐＸＬ６９４から由来する）。これらのシグナルはＥ．ｃｏｌｉのＰｔｒｐプロモーターの［＝４０＋１］領域、次いでバクテリオファージλのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位を含有する７３ｂｐから成る（Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。ｃｏｂＦ遺伝子の下流に、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネーターが存在する（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片の中に）。プラスミドｐＸＬ１４９６をＥ．ｃｏｌｉ菌株の中に形質転換により導入する（ＭｏｎｏｄおよびＷｏｌｌｍａｎ、１９４７）。ｃｏｂＦ遺伝子の発現を既に記載されているように（Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７）Ｐｔｒｐプロモーターが抑制される（トリプトファンの存在下に）か、あるいは抑制されない（トリプトファンの不存在下に）条件下に研究した。この発現を実施する培地は、０．４％のグルコース、０．４％のカサミノ酸、１０ミリモルのチアミンおよびＰｔｒｐプロモーターを抑制しようとする場合４０μｇ／ｍｌのトリプトファンを補充したＭ９最小培地（Ｍｉｌｌｅｒ、１９７２）中で実施した。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＢのｐＸＬ１４９６を３７℃において前述の培地中でアンピシリン（１００μｇ）とともに培養した。第２８図に示すように、トリプトファンの不存在は分子量３２，０００のタンパク質の発現を生ずる。事実、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ｐＸＬ１４９６の合計のタンパク質の抽出物において、合計のタンパク質の１〜４％を表す分子量３２，０００のタンパク質が明瞭に観察される。このタンパク質は、同一の条件下であるが、トリプトファンの存在下に培養したＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ｐＸＬ１４９６の合計の抽出物の中に顕著により少ない量で存在する。これらの条件下に発現されるタンパク質の分子量は、このタンパク質のアミノ酸配列から推定されるＣＯＢＦの分子量、すなわち、２８，９２７に近い（第１６図）。こうしてＥ．ｃｏｌｉの中で発現されるタンパク質はＣＯＢＦタンパク質である。
【０２６１】
７．２．２−ＣＯＢＴの発現
Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃプロモーターおよびｌａｃＺの最初の３つのコドンをｃｏｂ遺伝子の５’末端に融合することによって、過度の産生が得られる。
【０２６２】
４．８ｋｂの断片の第３２図に表す配列中の位置２６２４に位置するＥｃｏＲＩ部位は、ｃｏｂＴ遺伝子の第４コドンを含有する。ｐＸＬ８３７の３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を、ｐＴＺ１８ＲまたはｐＴＺ１９Ｒ（Ｐｈａｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩ部位においてクローニングして、それぞれ、ｐＸＬ１８７４またはｐＸＬ１８７５を発生させる；これらの２つのプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ（Ｐｌａｃ）のラクトースオペロンのプロモーターに関して、切頭ｃｏｂＴ遺伝子の向きにおいて異なる。ＰｌａｃはｐＸＬ１８７４中のｃｏｂＴの上流に存在するが、その反対はｐＸＬ１８７５において真実である。ｐＴＺ１８ＲのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位においてｐＸＬ８３７のＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片をクローニングすると、タンパク質の融合を、Ｅ．ｃｏｌｉのβ−ガラクトシダーゼの最初の４アミノ酸とその第４のコドンからのｃｏｂＴ遺伝子との間で実施することができる。ｌａｃＺ’’ｃｏｂＴ遺伝子の発現はｌａｃＺの発現シグナルのコントロール下にある。プラスミドｐＸＬ１８７４、ｐＸＬ１８７５およびｐＴＺ１８ＲｗｏＥ．ｃｏｌｉ菌株ＢＬ２１の中に形質転換により導入する。ｃｏｂＴ遺伝子の発現は既に記載されているように研究する（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
【０２６３】
第４２Ｂ図に示すように、分子量７２，０００のタンパク質をｐＸＬ１８７４のみで発現させ、そしてこのタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析したＢＬ２１、ｐＸＬ１８７４の合計のタンパク質の抽出物において、合計のタンパク質の１〜４％を表す。これらの条件下に発現されるタンパク質の分子量は、第４０図においてアミノ酸配列から推定されるＣＯＢＴタンパク質の分子量、すなわち、７０，３３５に近い。この実験が明瞭に示すように、ｃｏｂＴ遺伝子の第４コドンに位置するＥｃｏＲＩ部位から、ｃｏｂＴ遺伝子について見いだされるもと適合性のオープンリーディングフレームを発現することができる。
【０２６４】
７．２．３−切頭ＣＯＢＳタンパク質の発現
ＢａｍＨＩ部位はＣＯＢＳ遺伝子の第４５コドンに位置する。ｃｏｂＳ遺伝子の３’部分およびこの遺伝子より下流の配列を含有する１．２ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＸＬ８４３から切除し、そしてプラスミドｐＥＴ−３ｂ（Ｒｏｓｅｎｇｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８７）のＢａｍＨＩにおいてクローニングしてｐＸＬ１９３７を発生させる。このＢａｍＨＩ断片は、ｃｏｂＳ遺伝子の切頭部分が、フレーム中で、バクテリオファージＴ７または遺伝子１０（Ｒｏｓｅｎｇｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８７）の主要なキャプシドタンパク質の最初の１２コドンと融合する方法で、向いている。このハイブリッド遺伝子はファージＴ７のφプロモーターのコントロール下にある。プラスミドｐＸＬ１９３７およびまたｐＥＴ−３ｂを形質転換によりＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ（Ｗ．Ｓｔｕｄｉｅｒ、個人的通信）の中に導入する。選択培地上の再分離後、両者の菌株をＬ液体培地の中で６１０ｎｍにおいて１のＯＤに培養する；この段階において、この培地をｉミリモルのＩＰＴＧ（イソプロピルβーチオガラクトシド）濃度に調節して、バクテリオファージＴ７のポリメラーゼの発現を誘発する（（Ｒｏｓｅｎｇｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、１９８７）。次いで、培養物を３７℃において２時間インキュベーションし、その後バクテリアのリゼイトを調製する。こうして培養したバクテリアの合計のタンパク質をＰＡＧＥにより変性条件下に分割する。第４２Ａ図において見られるように、培養物ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ ｐＸＬ１９３７で３３，０００のタンパク質の特別な過度の産生が存在する。この分子量は融合タンパク質について期待される分子量（３３ｋＤ）と完全に適合性である。この実験が明瞭に示すように、ｃｏｂＳ遺伝子の第４５コドンに位置するＢａｍＨＩ部位から、ｃｏｂＳ遺伝子について見いだされるものと適合性のオープンリーディングフレームを過度に発現することができる。
【０２６５】
Figure 0003734466
（＝第５１図に現れる配列、位置９２６−９１５、解読鎖に対して相補性の鎖において）
オリゴヌクレオチド１２７７は制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＮｄｅＩのために認識配列を有する。ＮｄｅＩ部位の最後の３塩基（ＡＴＧ）は翻訳開始コドンに相当し、その直ぐ後に、第５２図に表す配列において現れるように、Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴの構造遺伝子のコドン２−５が存在する。オリゴヌクレオチド１２７８はＳｓｔＩのための認識配列を含有し、それに直ぐに引き続いて、配列ＴＡＴＴＡＣＡＴＡＡＴＴが存在し、これは第５１図に表すｃｏｒＡ遺伝子を含有する９５５ｂｐの断片の中に存在する配列に相当する；この配列はＣＯＲＡタンパク質を解読する鎖に対して相補性の鎖中の位置９２６−９１５（参照、第５１図）に存在する。それゆえ、２つのオリゴヌクレオチド１２７７および１２７８は、それぞれ、ｃｏｒＡ遺伝子の解読鎖およびこの遺伝子より下流の相補性鎖に相当する、それらの３’部分の中に配列を含有する。これらの２つのオリゴヌクレオチドを使用して、鋳型としてプラスミドｐＸＬ１８０９を使用する酵素増幅実験を実施することができる。この実験により、ｃｏｒＡ遺伝子のＡＴＧにおけるＮｄｅＩ部位、およびｃｏｒＡ遺伝子の末端の後の断片の他方の末端におけるＳｓｔＩ部位を有するＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉのｃｏｒＡ遺伝子を含有する９１０ｂｐの断片を得ることができる。酵素的増幅はＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉのゲノムＤＮＡについて実施した酵素的増幅について前述したように実施するが、ただし鋳型はプラスミドｐＸＬ１８０９のＤＮＡ（１０ｎｇ）から成る；使用する温度は同一であるが、２０のみの増幅サイクルを実施する。前述したように、増幅産生物をＮｄｅＩおよびＳｓｔＩで消化した後、アクリルアミドゲル上の移動により分割する。期待するように、９１０ｂｐの大きさの断片が事実可視化される。この断片を既に記載したように精製する。この断片をｐＸＬ６９４（Ｄｅｎｅｆｌｅ ｅｔ ａｌ．、１９８７）のＮｄｅＩおよびＳｓｔＩ部位においてクローニングする。生ずるプラスミドをｐＸＬ１８３２と表示し、第５６図に記載する。このプラスミドにおいて、実施例７．２に記載するのと同一の方法で、バクテリオファージλのｃＩＩ遺伝子のリボソーム結合部位の後にＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴの構造遺伝子は存在する。このＲＢＳの上流に、Ｐｔｒｐプロモーターが存在する。プラスミドｐＸＬ８３２を、突然変異ｃｙｓＧ４４を有するＥ．ｃｏｌｉ菌株であるＥ．ｃｏｌｉ Ｂ５５４８（ＣｏｓｓａｒｔおよびＳａｎｚｅｙ、１９８２）の中に形質転換により導入する。菌株Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ５５４８ ｐＵＣ１３およびＥ．ｃｏｌｉ Ｂ５５４８ ｐＸＬ１８３２のＳＵＭＴ活性を、アンピシリンを補充したＬＢ培地中で培養した細胞から得た抽出物についてアッセイする。ＳＵＭＴ活性のアッセイは既に記載されているように実施する（Ｂｌａｎｃｈｅ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。このアッセイの結果を下に記載する。
Figure 0003734466
上の表に表す結果が明瞭に示すように、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｂ５５４８あＭ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴを発現するプラスミドｐＸＬ１８３２を含有するとき、Ｅ．ｃｏｌｉ菌株Ｂ５５４８の中でＳＵＭＴ活性が発現される。それゆえ、Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ ＳＵＭＴはＥ．ｃｏｌｉの中で発現されることができる。
【０２６６】
実施例８−組み換えＤＮＡ技術によるコバラミンの産生の増幅
８．１−Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ中の増幅
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ５１０Ｒｉｆrにおいて、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ１５０のｃｏｂ遺伝子の増幅により、コバラミンの産生を改良する方法を例示する。
【０２６７】
８．１．１ コバラミンの生合成における制限段階の除去によるシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）におけるコバラミンの産生の改良
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中のコバラミンの産生性をシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子の増幅により改良できる方法を例示する。この改良は生合成経路の制限段階の除去から生ずる。
【０２６８】
プラスミドｐＸＬ３６７は実施例４．２（第１３図）に記載されている。このプラスミドは、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が挿入されているｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）に相当する。このプラスミドｐＸＬ３６７は菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr中のコバラミンの生合成を改良する。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr、ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＲＫ２９０およびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ３６７をエルレンマイヤー内でＰＳ４培地の中で実験のプロトコルに記載する条件に従い培養する。プラスミドｐＸＬ３６７の存在のための産生力価の改良が観測される。事実、菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ３６７は菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrおよびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＲＫ２９０より３０％多いコバラミンを産生する。この改良はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の非特定遺伝子の増幅のためではなく、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片が有する遺伝子の特異的増幅のためである。事実、第１１図に記載するプラスミドｐＸＬ７２３は改良を生成せず、そして同一の産生力価はこのプラスミドならびに菌株ＳＣ５１０ＲｉｆrおよびＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＲＫ２９０で観測される。
【０２６９】
８．１．２ コバラミンの生合成における２つの制限段階の除去によるシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）中の補酵素Ｂ12の産生の改良
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株中のコバラミンの産生性をシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子の増幅により改良できる方法を例示する。この改良は生合成経路の２つの制限段階の除去から生ずる。
【０２７０】
５．４ｋｂの断片から誘導体された２．４ｋｂのＣｌａＩ−ｅ７断片（ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有する）を、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片とともに、広い宿主範囲のプラスミドｐＸＬ２０３の中に共クローニングする。これにより構成されるプラスミドをｐＸＬ５２５と呼ぶ（第２９図）。このプラスミドをＳＣ５１０Ｒｉｆrの中に接合により導入する。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ５２５はＳＣ５１０Ｒｉｆr ｐＸＬ３６７より２０％多いコバラミンを産生する。ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子の増幅は、コバラミンの生合成におけるＳＣ５１０Ｒｉｆrにおけるそれ以上の制限段階の除去を可能とする。シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrは、２つの制限段階の連続的除去により、この実施例において改良される。この実施例が示すように、コバラミンの生合成における２つの制限段階の除去は産生をさらに改良する。
【０２７１】
８．２−アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）中のコバラミンの産生の改良
この実施例は、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）ＳＣ１５０のｃｏｂ遺伝子の増幅によるコバラミンの菌株の産生におけるコバラミンの産生の改良を例示する。
【０２７２】
使用する菌株はグラム陰性バクテリアの菌株である；それはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の菌株である。
【０２７３】
実施例４．２および８．１に記載するプラスミド、ｐＸＬ３６７およびｐＸＬ５２５、ならびにベクターｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）およびプラスミドｐＸＬ３６８（第２９図）を、接合的転移により、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆr（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）の中に導入する。菌株Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆr、Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆr ｐＲＫ２９０、Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆr ｐＸＬ３６７、Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆr ｐＸＬ３６８およびＣ５８−Ｃ９ＲｉｆrｐＸＬ５２５を、前述したように、３０℃においてＰＳ４培地中で培養する。産生されるコバラミンを前述したようにアッセイする。産生力価を下表に記載する。
【０２７４】
【表１９】
Figure 0003734466
【０２７５】
上の表から明瞭に明らかなように、コバラミンの産生は使用したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株において改良される。２つの異なるプラスミドは使用したアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株中のコバラミンの産生を改良する：ｐＸＬ３６７およびｐＸＬ３６８。これらのプラスミドは、それぞれ、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片（ｃｏｂＦ−ｃｏｂＭ遺伝子）および２．４ｋｂの断片（ｃｏｂＥ−ｃｏｂＡ遺伝子）を含有する。別々に、それらはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆrによるコバラミンの産生を２のファクターで改良する；この結果が示すように、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子を有する断片を増幅することによって、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）によるコバラミンの産生を改良することができる。この場合において、異種の改良、すなわち、１つの菌株によるコバラミンの産生を他の菌株のｃｏｂ遺伝子の増幅により改良すること、を述べることができる。
【０２７６】
ｃｏｂ遺伝子を含有する異なるシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の断片により提供されるコバラミンの産生の改良は、累積することができ、すなわち、同一プラスミドの中に、別々にｐＸＬ３６７およびｐＸＬ３６８の中にクローニングされた２つの断片を入れることによって、付加的改良が観察され、この意味において、プラスミドｐＸＬ５２５はアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）Ｃ５８−Ｃ９Ｒｉｆrにおいて、同一ベクターの中に別々にクローニングされた断片の各々により提供されるより大きい産生の改良を提供する。
【０２７７】
８．３−リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の産生の改良
この実施例は、コバラミンを産生する他の菌株によるコバラミンの産生の改良を例示する。
【０２７８】
実施例８．２に記載するプラスミド、ｐＸＬ３６８、ならびにベクターｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）を、接合的転移により、リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）菌株１０２Ｆ３４Ｒｉｆr（Ｌｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．、１９８２)の中に導入する。トランス接合体、すなわち、１０２Ｆ３４Ｒｉｆr、１０２Ｆ３４Ｒｉｆr ｐＲＫ２９０および１０２Ｆ３４Ｒｉｆr ｐＸＬ３６８を前述したように３０℃においてＰＳ４培地中で培養する。産生するコバラミンを前述したようにアッセイする。産生力価を下表に記載する。
【０２７９】
【表２０】
Figure 0003734466
【０２８０】
上の表において明瞭に明らかなように、コバラミンの産生は使用したリゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）菌株において改良される。プラスミドｐＸＬ３６８は使用したリゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）菌株によるコバラミンの産生を改良する。このプラスミドは２．４ｋｂのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶ断片（ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子）を含有する；それはリゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２Ｆ３４Ｒｉｆrによるコバラミンの産生を２のファクターで改良する。この結果が示すように、シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のｃｏｂ遺伝子を有する断片を増幅することによって、リゾビウム・メリロチ（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｍｅｌｉｌｏｔｉ）の菌株によるコバラミンの産生を改良することができる。この場合において、異種の改良、すなわち、１つの菌株によるコバラミンの産生を他の菌株のｃｏｂ遺伝子の増幅により改良すること、を述べることができる。
【０２８１】
実施例９−コリノイドを産生する菌株のマストおよび細胞中のコリノイドおよびデコバルトコリノイドのアッセイ
この実施例は、コリノイドを産生する異なる菌株により産生された異なるコリノイドおよびデコバルトコリノイドの同定およびアッセイの方法を例示する。このアッセイは、なかでも、補酵素Ｂ12のアッセイを可能とする。
【０２８２】
マスト（または細胞単独）を既に記載されているようにシアニド処理する（Ｒｅｎｚ、１９７１）。遠心後、上澄み液のアリコートをＤＥＡＥ−セファデックス細胞に通過させ、次いでこれを０．１モルのリン酸塩緩衝液で洗浄する。集めた分画を一緒にし、そしてＳｅｐ−ｐａｋ Ｃ−１８（Ｗａｔｅｒｓ）遠心機で脱塩する。蒸発および水中の再懸濁（存在するコリノイドに依存して１００μｌ〜１ｍｌ）後、コリノイドをＮｕｃｌｅｏｓｉｌ Ｃ−１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）のＨＰＬＣにより同定およびアッセイする。このカラムを１ｍｌ／分で１０ミリモルのＫＣＮを含有する０．１モルのリン酸カリウム緩衝液中のアセトニトリルの勾配（０％〜１００％）で溶離する。
【０２８３】
コリノイドを３７１ｎｍにおける紫外線検出によりおよび／または57Ｃｏの特別の検出（培養は57ＣｏＣｌ2の存在下に実施した）によりベーソルド（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ）ＬＢ５０５検出器を使用して可視化する。それゆえ、それらはそれらの保持時間を標準と比較することによって同定される。同様に、「金属不含コリノイド」（ヒドロゲノビリン酸、ヒドロゲノビリン酸モノアミドおよびヒドロゲノビリン酸ジアミド）は３３０ｎｍにおける紫外線の検出により可視化する。この技術により、次の中間体が分割される：コビリン酸、コビリン酸モノアミド、コビリン酸ジアミド、コビリン酸トリアミド、コビリン酸テトラアミド、コビリン酸ペンタアミド、コビル酸、コビンアミド、コビンアミドホスフェート、ＧＤＰ−コビンアミド、Ｂ12ホスフェートおよびビタミンＢ12。これらの産生物のアデノシル化された形態を、また、この技術により、分割し、そしてアッセイする。この目的で、シアニド処理の初期工程を実施し、そしてＨＰＬＣカラムをＫＣＮ不含の緩衝液で溶離する。第３１図は、この系により分割し、そして紫外線の吸収によりこのカラムを出るとき同定した、異なる標準の保持時間を記載する。
【０２８４】
菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの試料は、１９９０年１月３０日に、セントラール・ビューロウ・ブーア・シンメルカルツレン（Ｃｅｎｔｒａａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｒｅｎ）（オランダ国）に寄託し、ここでそれは参照ＣＢＳ１０３．９０で登録された。
参考文献
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【０２８５】
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【０２９５】
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【０２９６】
ディッタ（Ｄｉｔｔａ）Ｇ．、シュミドハウサー（Ｓｃｈｍｉｄｈａｕｓｅｒ）Ｔ．、ヤコブソン（Ｙａｋｏｂｓｏｎ）Ｅ．、ル(Ｌｕ)Ｐ．、リアング（Ｌｉａｎｇ）Ｘ．−Ｗ．、フィンレイ（Ｆｉｎｌａｙ）Ｄ．Ｒ．、グイネイ（Ｇｕｉｎｅｙ）Ｄ．およびＤ．Ｒ．ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）、１９８５。遺伝子のクローニングおよび遺伝子の発現のモニターのために有用な、広い範囲の宿主範囲のベクターｐＲＫ２９０に関するプラスミド。プラスミド（Ｐｌａｓｍｉｄ）、１３、１４９−１５４。
【０２９７】
ディッタ（Ｄｉｔｔａ）Ｇ．、Ｓ．スタンフィールド（Ｓｔａｎｆｉｅｌｄ）、Ｄ．コービン（Ｃｏｒｂｉｎ）およびＤ．Ｒ．ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）、１９８０。グラム陰性バクテリアのための広い宿主範囲のＤＮＡのクローニング系：リゾビウム・メリロチの遺伝子ライブラリーの構成。プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７７、７３４７−７３５１。
【０２９８】
エスカランテ−セメレナ（Ｅｓｃａｌａｎｔｅ−Ｓｅｍｅｒｅｎａ）Ｊ．Ｃ．およびＪ．Ｒ．ロス（Ｒｏｔｈ）、１９８７。ネズミチフス菌の中のコバラミンの生合成オペロンの調節。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１６９、２２５−２２５８。 フロレント（Ｆｌｏｒｅｎｔ）、Ｊ．１９８６。ビタミン類（Ｖｉｔａｍｉｎｓ）、ｐ．１１５−１５８。Ｈ．−Ｊ．レーム（Ｒｅｈｍ）およびＧ．リード（Ｒｅｅｄ）編、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｖｏｌ．４、ＶＣＨ Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ ｍｂＨ、ワインハイム。
【０２９９】
フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）Ｈ．Ｃ．およびＬ．Ｍ．ケイゲン（Ｃａｇｅｎ）、１９７０。Ｂ１２様化合物の微生物の生合成。アナルス・オブ・リビュード・マイクロバイオロジー（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、２４、１５９−２０８。
【０３００】
フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）Ｈ．Ｃ．、１９６８。ビタミンＢ１２の生合成。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４３、２０６５−２０７５。
【０３０１】
フリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）Ｈ．Ｃ．、１９７５。コリノイドの生合成。バビオール（ｂａｂｉｏｒ）Ｂ．Ｍ．、コバラミン（Ｃｏｂａｌａｍｉｎ）、７５−１１０、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク。
【０３０２】
ヘニコッフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）Ｓ．１９８４。エキソヌクレアーゼＩＩＩを使用する単一の方向の消化はＤＮＡの配列決定について標的した破壊点をつくる。遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２８、３５１−３５９。
【０３０３】
ヒレル（Ｈｉｒｅｌ）Ｐｈ−Ｈ、Ｊ．−Ｍ．シュミッター（Ｓｃｈｍｉｔｔｅｒ）、Ｐ．デッセン（Ｄｅｓｓｅｎ）およびＳ．ブラクエット（Ｂｌａｎｑｕｅｔ）、１９８９。大腸菌のタンパク質内のＮ末端のメチオニンの切除の程度は終わりから２番目のアミノ酸の側鎖により支配される。プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、印刷中。
【０３０４】
ホップ（Ｈｏｐｐ）Ｔ．Ｐ．およびＫ．Ｒ．ウッズ（Ｗｏｏｄｓ）、１９８１。アミノ酸配列からのタンパク質の抗原決定基の予測。プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７８、３８２４−３８２８。
【０３０５】
フエンネケンス（Ｈｕｅｎｎｅｋｅｎｓ）Ｆ．Ｍ．、ヴィトルス（Ｖｉｔｏｌｓ）Ｋ．Ｓ．、フジイ（Ｆｕｊｉｉ）Ｋ．およびジャコブセン（Ｊａｃｏｂｓｅｎ）Ｄ．Ｗ．、１９８２。コバラミン補酵素の生合成。ドルフィン（Ｄｏｌｐｈｉｎ）Ｄ．、Ｂ１２、Ｖｏｌ．１、１４５−１６７、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク。
【０３０６】
イリオン（Ｉｒｉｏｎ）Ｒ．およびルジュングダール（Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ）Ｌ．Ｇ．、１９６５。クロストリジウム・テルモアセチクムからの因子ＩＩＩｍ補酵素およびコビル酸補酵素＋他のＢ１２因子の分離。バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、４、２７８０−２７９０。
【０３０７】
ジェター（Ｊｅｔｅｒ）Ｒ．Ｍ．、オリベラ（Ｏｌｉｖｅｒａ）Ｂ．Ｍ．およびロス（Ｒｏｔｈ）Ｊ．Ｒ．、１９８４。ネズミチフス菌は嫌気性成長条件下にコバラミン（ビタミンＢ１２）を新たに合成する。ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１５９、２０６−２１３。
【０３０８】
ジェター（Ｊｅｔｅｒ）Ｒ．Ｍ．およびＪ．Ｒ．ロス（Ｒｏｔｈ）、１９８７。チフス菌のコバラミン（ビタミンＢ１２）の生合成遺伝子。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１６９、３１８９−３１９８。
【０３０９】
ジョルゲンセン（Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ（Ｒ．Ａ．、ロスステイン（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）Ｓ．Ｊ．およびレズニコフ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ）Ｗ．Ｒ．、１９７９。Ｔｎ５の制限酵素の切断地図およびネオマイシン抵抗性をエンコードする領域の位置。モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．）、１７７、６５−６２。
【０３１０】
カナンガラ（Ｋａｎａｎｇａｒａ）Ｃ．Ｇ．、Ｓ．Ｐ．ブルヤント（Ｂｒｕｙａｎｔ）、Ｊ．Ｋ．フーバー（Ｈｏｏｂｅｒ）、Ａ．カ−ン（Ｋａｈｎ）およびＤ．ヴォン・ウェッツテイン（ｖｏｎ Ｗｅｔｔｓｔｅｉｎ）、１９８８。ｄ−アミノレブリネートの生合成におけるコファクターとしてのｔＲＮＡGlu：クロロフィルの合成を調節する工程。トレンズ・イン・バイオケミカル・ソサイアティ（Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．）、１３９−１４３。
【０３１１】
ケネヒサ（Ｋｅｎｅｈｉｓａ）Ｍ．１９８４。核酸配列における潜在的相同性をスクリーニングするための統計学的基準の使用。核酸の研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１２：２０３−２１５。
【０３１２】
キエニイ（Ｋｉｅｎｙ）Ｍ．Ｐ．、Ｒ．レイズ（Ｌａｔｈｅ）およびＪ．Ｐ．レコクク（Ｌｅｃｏｃｑ）、１９８３。バクテリオファージＭ１３に基づく新規な融通性のあるクローニングベクター。遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２６、９１−９９。
【０３１３】
クルジキ（Ｋｒｚｙｃｋｉ）Ｊ．およびＪ．Ｇ．ゼイクス（Ｚｅｉｋｕｓ）、メタノジェニックバクテリアにおけるコリノイドの定性。１９８０。Ｃｕｒｒ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、３、２４３−２４５。
【０３１４】
Ｌ．スカトラド（Ｓｋａｔｒｕｄ）、Ａ．Ｊ．チエツズ(Ｔｉｅｔｚ)、Ｔ．Ｄ．インゴリア（Ｉｎｇｏｌｉａ）、Ｃ．Ａ．カントウェル（Ｃａｎｔｗｅｌｌ）、Ｄ．Ｌ．フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）、Ｊ．Ｌ．チャプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）およびＳ．Ｗ．クイーナー(Ｑｕｅｅｎｅｒ)、１９８９。セファロスポリウム・アクレモニウムによりセファロスポリンＣの産生を改良する組み換えＤＮＡの使用。バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、１９８９、７、４７７−４８５。
【０３１５】
ラエムリ（Ｌａｅｍｌｉ）Ｕ．Ｋ．、１９７０。バクテリオファージＴ４のヘッドのアセンブリーの間の構造タンパク質の切断。ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２２７、６８０−６８５。
【０３１６】
レオング（Ｌｅｏｎｇ）Ｓ．Ａ．、ディッタ（Ｄｉｔｔａ）Ｇ．Ｓ．、ヘリンスキ（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ）Ｄ．Ｒ．、１９８２。リゾビウムにおけるヘムの生合成。リゾビウム・メリロチからのｄ−アミノレブリン酸シンセターゼをコードするクローニングした遺伝子の同定。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２５７、８７２４−８７３０。
【０３１７】
マクドナルド（Ｍａｃｄｏｎａｌｄ）Ｈ．およびＪ．コール（Ｃｏｌｅ）。大腸菌Ｋ１２のｃｙｓＧおよびｎｉｒＢ遺伝子のモレキュラークローニングおよび機能的分析、ＮＡＤＨ依存性レダクターゼ活性に要求される２つの密接に連鎖した遺伝子。発行に付した。
【０３１８】
マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）Ｔ．、Ｅ．Ｆ．フリトシュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＪ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、１９８２。分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク。
【０３１９】
マズンダー（Ｍａｚｕｍｄｅｒ）Ｔ．Ｋ．、Ｎ．ニシオ（Ｎｉｓｈｉｏ）、Ｍ．ハヤシ（Ｈａｙａｓｈｉ）およびＳ．ナガイ（Ｎａｇａｉ）、１９８７。メタノサルキナ・バルケリによるビタミンを包含するコロニドの産生。１９８６。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ、１２、８４３：８４８。 マズンダー（Ｍａｚｕｍｄｅｒ）Ｔ．Ｋ．、Ｎ．ニシオ（Ｎｉｓｈｉｏ）、Ｓ．フカザキ（Ｆｕｋａｚａｋｉ）およびＳ．ナガイ（Ｎａｇａｉ）、１９８７。メタノサルキナ・バルケリによるメタノールからの細胞外ビタミンＢ１２化合物の産生。Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６、２１１−５１６。
【０３２０】
ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）Ｊ．Ｈ．１９７２。分子遺伝学における実験。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク。
【０３２１】
モノド（Ｍｏｎｏｄ）Ｊ．およびＥ．ウォールマン（Ｗｏｌｌｍａｎ）、１９４７。バクテリオファージで感染したバクテリアにおける成長の阻害および酵素的適合。Ａｎｎ．Ｉｎｓｔ．Ｐａｓｔｅｕｒ、７３、９３７−９５６。
【０３２２】
マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）Ｍ．Ｊ．、シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）Ｌ．Ｍ．、カミン（Ｋａｍｉｎ）Ｈ．およびロウゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）Ｄ．、１９７３。ヘムのプロテーゼの群の新しいクラス：８つのカルボン酸基をもつ鉄−テトラヒドロポルフィリン（イソバクテリオコリン型）の同定。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４８、２８０１−２８１４。
【０３２３】
マーフィー（Ｍｕｒｐｈｙ）Ｍ．Ｊ．、シーゲル（Ｓｉｅｇｅｌ）Ｌ．Ｍ．、１９７３。同化および異化のサルファイトリダクターゼの両者に共通するポルフィリン関係プロテーゼ基の新しい型のための基準。ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）、２４８、６９１１−６９１９。
【０３２４】
ネクソ（Ｎｅｘｏ）Ｅ．およびオレセン（Ｏｌｅｓｅｎ）。固有の因子、トランスコバラミンおよびハプトコリン。ドルフィン（Ｄｏｌｐｈｉｎ）Ｄ．、Ｂ１２、５７−８５、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｅｌｙ ＆ Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク。
【０３２５】
ノーマーク（Ｎｏｒｍａｒｋ）Ｓ．、Ｓ．ベルグトレム（Ｂｅｒｇｔｒｏｅｍ）、Ｂ．ジャウリン（Ｊａｕｒｉｎ）、Ｆ．リンドバーグ（Ｌｉｎｄｂｅｒｇ）およびＯ．オルソン（Ｏｌｓｓｏｎ）、１９８３。オーバーラッピングする遺伝子。Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．、１７、４９９−５２５。
【０３２６】
ノランダー（Ｎｏｒｒａｎｄｅｒ）Ｊ．、Ｔ．ケンペ（Ｋｅｍｐｅ）およびＪ．メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８３。オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発を使用する改良されたＭ１３ベクターの構成。遺伝子（Ｇｅｎｅ）２６、１０１−１０６。
【０３２７】
ノイエス（Ｎｏｙｅｓ）Ｒ．、１９７０、ビタミンＢ１２の調製、１４５−１８２、ノイエス・ディベロップメント（Ｎｏｙｅｓ Ｄｅｖｅｌｏｐｐｍｅｎｔ）Ｓ．Ａ．、米国ニュージャージイ州パークリッジ。 プレントキ（Ｐｒｅｎｔｋｉ）Ｐ．およびＨ．Ｍ．クリシュ（Ｋｒｉｓｃｈ）、１９８４。選択可能なＤＮＡ断片を使用する試験管内挿入の突然変異誘発。遺伝子（Ｇｅｎｅ）、２９、３０３−３１３。
【０３２８】
レンズ（Ｒｅｎｚ）Ｐ．、１９７０。ビタミンＢ12の生合成におけるいくつかの中間体。メソッズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、１８、８２−９２。
【０３２９】
リグビー（Ｒｉｇｂｙ）Ｐ．Ｗ．Ｊ．、ディークマン（Ｄｉｅｃｋｍａｎｎ）Ｍ．、ロウデス（Ｒｈｏｄｅｓ）Ｃ．、バーグ（Ｂｅｒｇ）Ｐ．、１９７７。ＤＮＡポリメラーゼＩを使用するニック翻訳による高い特異性の活性に対するデオキシリボ核酸の標識つけ。ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、１１３、２３７。
【０３３０】
ルーフ（Ｒｏｏｆ）Ｄ．Ｍ．およびＪ．Ｒ．ロス（Ｒｏｔｈ）、１９８８。チフス菌の中のエタノールアミンの利用。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１７０、３８５５−３８６３。
【０３３１】
サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）Ｆ．、Ｓ．ニックレン（Ｎｉｃｋｌｅｎ）およびＡ．Ｒ．コウルソン（Ｃｏｕｌｓｏｎ）、１９７７。連鎖停止阻害因子を使用するＤＮＡ配列決定。プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）、７４、５４６３−５４６８。
【０３３２】
サウンダース（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）Ｇ．、ツアイト（Ｔｕｉｔｅ）Ｍ．Ｆ．およびホルト（Ｈｏｌｔ）Ｇ．、１９８６。菌のクローニングベクター。Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、４、９３−９８。
【０３３３】
シェーレル（Ｓｃｈｅｒｅｒ）Ｐ．、ヘルリーゲル（Ｈｏｅｌｌｒｉｅｇｅｌ）Ｖ．、クルグ（Ｋｕｒｇ）Ｃ．、ボウケル（Ｂｏｋｅｌ）Ｍ．およびレンズ（Ｒｅｎｚ）Ｐ．、１９８４。メタノサルシナ・バルケリの中の５−ヒドロキシベンズイミダゾリルコバミド（ビタミンＢ１２−因子ＩＩＩ）の生合成について。アーチーブス・マイクロバイオロジー（Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）、１３８、３５４−３５９。
【０３３４】
シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）Ｚ．およびフリードマン（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ）Ｈ．、１９７２。ビタミンＢ１２５’−ホスフェートの酵素的脱リン酸反応についての研究。アーチーブス・オブ・バイオケミストリー・アンド・バイオフィジックス（Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄＢｉｏｐｈｙｓｉｃｓ、１５２、４８８−４９５。
【０３３５】
スコット（Ｓｃｏｔｔ）Ａ．Ｉ．、Ｎ．Ｅ．マッケンジー（Ｍａｃｋｅｎｚｉｅ）、Ｐ．Ｊ．サンタンダー（Ｓａｎｔａｎｄｅｒ）、Ｐ．Ｅ．フェイガーネス（Ｆａｇｅｒｎｅｓｓ）、Ｇ．ムラー（Ｍｕｌｌｅｒ）、Ｅ．シュナイダー（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ）、Ｒ．セルドメイアー（Ｓｅｌｄｍｅｉｅｒ）およびＧ．ウォーナー（Ｗｏｒｎｅｒ）、１９８４。ウロゲンＩＩＩおよびコビリン酸の間のメチル化工程のビタミンＢ１２タイミングの生合成。Ｂｉｏｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１２：３５６−３５２。
【０３３６】
サウザーン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）Ｅ．、１９７５。ゲル電気泳動により分離されたＤＮＡ断片の間の特定の配列の検出。ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．）、９８、５０３−５１７。
【０３３７】
ステイチェル（Ｓｔａｃｈｅｌ）Ｓ．Ｅ．、Ｇ．アン（アン）、Ｃ．フロウアス（Ｆｌｏｒｅｓ）およびＥ．Ｗ．ネスター（Ｎｅｓｔｅｒ）、１９８５。β−ガラクトシダーゼ遺伝子の融合のランダム発生のためのＴｎ３１ａｃＺトランスボゾン：アグロバクテリウムの中の遺伝子の発現の分析への応用。ＥＭＢＯ Ｊ．，４、８９１−８９８。
【０３３８】
ステイデン（Ｓｔａｄｅｎ）Ｒ．およびＡ．Ｄ．マクラチラン（ＭｃＬａｃｈｌａｎ）、１９８２。長いＤＮＡ配列の中のタンパク質解読領域の同定におけるコドンの優越性およびその使用。核酸の研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１０、１４１−１５６。
【０３３９】
スツッパリッチ（Ｓｔｕｐｐｅｒｉｃｈ）Ｅ．、Ｉ．ステイナー（Ｓｔｅｉｎｅｒ）およびＨ．Ｊ．エイシンガー（Ｅｉｓｉｎｇｅｒ）、１９８７。メタノバクテリウム・ターモアウトトロフィクムの中のビタミンＢ１２によりＣｏａ−（５−ヒドロキシベンズイミダゾリル）コバミドの置換。ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、１６９：３０７６−３０８１。
【０３４０】
タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）Ｊ．Ｗ．、Ｊ．オット（Ｏｔｔ）およびＦ．エクステイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）、１９８５。ホスホロチオエート修飾ＤＮＡを使用する高い頻度におけるオリゴヌクレオチド特異的突然変異の急速な発生。核酸の研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１３、８７６４−８７６５。
【０３４１】
ビエラ（Ｖｏｅｒａ）Ｊ．およびメッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）Ｊ．、１９８２。突然変異原を挿入しそして合成汎用プライマーを使用する配列決定のためのｐＵＣプラスミド、Ｍ１３ｍｐ誘導系。遺伝子（Ｇｅｎｅ）、１９、２５９−２６８。
【０３４２】
ウェイ−シウング（Ｗｅｉｎ−Ｈｓｉｕｎｇ）Ｌ．、Ｌ．チ−チェング（Ｃｈｉ−Ｃｈｅｎｇ）およびＷ．チュング（ｃｈｕｎｇ）−Ｉ、１９８５。ＤＮＡ配列の発生、ｐ１−９４。Ｒ．Ｊ．マクインタイア（Ｒ．Ｊ．ＭｃＩｎｔｙｒｅ）編、モレキュラー・エボルーショナリー・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨークおよびロンドン。
【０３４３】
ラッタ（Ｌａｔｔａ）、Ｍ．、Ｍ．フィリット(Ｐｈｉｌｉｔ)、Ｉ．、マウリイ（Ｍａｕｒｙ）、Ｆ．ソルブリール（Ｓｏｕｌｂｒｉｅｌ）、Ｐ．デネフレ（Ｄｅｎｅｆｌｅ）およびＪ．−Ｆ．マヤウクス（Ｍａｙａｕｘ）、１９９０。マルチコピーのプラスミド上のトリプトファンプロモーターの誘導体：大腸菌の中の発現潜在性の比較分析。ＤＮＡ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、９、１２９−１３７。
【０３４４】
マヤウクス（Ｍａｙａｕｘ）、Ｊ．−Ｆ．、Ｅ．セルベラウド（Ｃｅｒｂｅｌａｕｄ）、Ｆ．ソウブリーア（Ｓｏｕｂｒｉｅｒ）、Ｄ．ファウチャー（Ｆａｕｃｈｅｒ）およびＤ．ペトレ（Ｐｅｔｒｅ）、１９９０。ブレビバクテリウムｓｐ．Ｒ３１２からの対称選択的アミダーゼの精製、クローニングおよび一次構造。ニトリル−ヒドラーゼとの遺伝的カップリングについての構造的証拠。１９９０。ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊ．Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１７２、６７６４−６７７３。
【０３４５】
ベルヤエブ（Ｂｅｌｙａｅｖ）、Ｓ．Ｓ．、Ｒ．ウォルキン（Ｗｏｌｋｉｎ）、Ｗ．Ｒ．ケネアリイ（Ｋｅｎｅａｌｙ）、Ｍ．Ｊ．デ・ニロ（Ｄｅ Ｎｉｒｏ）、Ｍ．Ｊ．エプステイン（Ｅｐｓｔｅｉｎ）およびＪ．Ｇ．ゼイクス（Ｚｅｉｋｕｓ）、１９８３。ボンジウズスケ油田からのメタノジェニックバクテリア：安定な炭素のアイソトーピック分画の一般の特性決定および分析。Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４５、６９１−６９７。
【０３４６】
サイキ（Ｓａｉｋｉ）、Ｒ．Ｋ．、Ｄ．Ｈ．ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）、Ｓ．スッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）、Ｓ．シャーフ（Ｓｃｈａｒｆ）、Ｒ．ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、Ｇ．Ｔ．ホーン(Ｈｏｒｎ)、Ｋ．Ｂ．ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）およびＨ．Ａ．エーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）。１９８８。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡのプライマー特異的酵素的増幅。サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３９、４８７−４９１。
【０３４７】
ソウラード（Ｓｏｕｌｌａｒｄ）Ｎ．、Ｍ．マゴット（Ｍａｇｏｔ）、Ｏ．ポッソト（Ｐｏｓｓｏｔ）およびＬ．シボルト（Ｓｉｂｏｌｄ）、１９８８。アーチェバクテリアのメタノコッカス・サーモリトロフィクムおよびメタノバクテリウム・イバノビを固定する窒素からのＮｉｆＨ（ニトロゲナーゼＦｅタンパク質）に対して相同性の領域のヌクレオチド配列：進化的関係。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．、２、６５−７９。
【０３４８】
チェン（Ｃｈｅｎ）、Ｅ．Ｌ．およびＰ．Ｈ．シーバーグ（Ｓｅｅｂｕｒｇ）、１９８５。スーパーコイルの配列決定：プラスミドのＤＮＡを配列決定するための迅速なかつ簡単な方法。ＤＮＡ、４、１６５−１７０。
【０３４９】
サイキ（Ｓａｉｋｉ）Ｒ．Ｋ．、Ｄ．Ｈ．ゲルファンド（Ｇｅｌｆａｎｄ）、Ｓ．ストッフェル（Ｓｔｏｆｆｅｌ）、Ｓ．Ｊ．シャーフ（Ｓｃｈａｒｆ）、Ｒ．ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）、Ｇ．Ｔ．ホーン（Ｈｏｒｎ）、Ｋ．Ｂ．ムリス（Ｍｕｌｌｉｓ）およびＨ．エーリッヒ（Ｅｒｌｉｃｈ）、１９８８。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用するＤＮＡのプライマー特異的酵素の増幅。サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）、２３９、４８７−４９１。
【０３５０】
グルンステイン（Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ）Ｍ．、ホグネス（Ｈｏｇｎｅｓｓ）Ｄ．、１９７５。コロニーのハイブリダイゼーション：特異的遺伝子を含有するクローニングしたＤＮＡの分離の方法。プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、７２、３９６１−３９７１。 コッサート（Ｃｏｓｓａｒｔ）Ｐ．およびＢ．ギククエル−サンゼイ（Ｇｉｃｑｕｅｌ−Ｓａｎｚｅｙ）、１９８２。大腸菌Ｋ１２のｃｒｐ遺伝子のクローニングおよび配列。核酸の研究（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．）、１０、１３６３−１３７８。
【０３５１】
ビエラ（Ｖｉｅｒａ）Ｊ．およびＪ．メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）、１９８７。一本鎖ＤＮＡの産生。エンジモロジー（Ｅｎｚｙｍｏｌ．）、１５３、３−１１。
【０３５２】
バルビエリ（Ｂａｒｉｂｉｅｒｉ）Ｐ．Ｇ．、ボレッチ（Ｂｏｒｅｔｔｉ）Ａ．、ジ・マルコ（Ｄｉ Ｍａｒｃｏ）Ａ．、ミグリアッシ（Ｍｉｇｌｉａｃｃｉ）Ａ．およびスパラ（Ｓｐａｌｌａ）Ｃ、１９６２。ノルカルジア・ルゴサ（Ｎｏｒｃａｒｄｉａ ｒｕｇａｓａ）におけるビタミンＢ１２の生合成についてのそれ以上の観察。バイオヒミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）、５７、５９９−６００。
【０３５３】
レンズ（Ｒｅｎｚ）Ｐ．１９６８。プロピオオニバクテリウムによるコビナミドからのビタミンＢ１２の酵素的合成の反応法。Ｚ．Ｐｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、３４９、９７９−９８１。
【０３５４】
ロンジオ（Ｒｏｎｚｉｏ）Ｒ．Ａ．およびバーカー（Ｂａｒｋｅｒ）Ｈ．Ａ．、１９６７。プロピオン酸のバクテリアの抽出によるグアノシンジホスフェートコビナミドの酵素的合成。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、６、２２４４−２３５４。
【０３５５】
チバウト（Ｔｈｉｂａｕｔ）Ｄ．、デブッシェ（Ｄｅｂｕｓｓｃｈｅ）Ｌ．およびブランチェ（Ｂｌａｎｃｈｅ）Ｆ．１９９０。ビタミンＢ１２の生合成：５つのアデノシルメチオニン誘導周辺メチル基を保持するコリンのマクロサイクルの金属不含前駆体のプレコリン−６ｘの分離。プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．）ＵＳＡ、８７、８７９５−８７９９。
【０３５６】
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【図面の簡単な説明】
【図１】補酵素Ｂ12の構造：５’−デオキシアデノシル基がメチルコバラミンについてＣＨ3により、シアノコバラミンについてシアノ基により、ヒドロキソコバラミンについてヒドロキシル基により置換されている。
【図２】コバラミンの生合成およびこの生合成の種々の工程。Ｘ：コバルトの軸方向のリガンド；ａにおけるリガンドはｂにおけるリガンドと異なることがある。Ｒ：コバラミン型を定めるコバルトのａにおけるリガンド（図１参照）。
【図３】ウロ’ゲンＩＩＩ、プレコリン−１、プレコリン−２およびプレコリン−３の構造。
【図４】ウロ’ゲンＩＩＩおよびコビリン酸の構造式。ウロ’ゲンＩＩＩとコビリン酸との間に、Ｃ−２、Ｃ−７、Ｃ−２０、Ｃ−１７、Ｃ−１２、Ｃ−１、Ｃ−１５およびＣ−５における連続的な８つのＳＡＭ依存性メチルの転移、Ｃ−１２において脱カルボキシル反応、Ｃ−２０における炭素の排除およびコバルト原子の挿入が存在する。Ｘ：コバルトの軸方向のリガンド；ａにおけるリガンドはｂにおけるリガンドを異なることがある。
【図５】コバラミンの生合成の最終工程。線図を明瞭にするために、コリン環系の詳細は省略されている。５つの酵素工程が表されている：１．コビナミドキナーゼ；２．コビナミドホスフェートグアニルトランスフェラーゼ；３．コバラミン−５’−ホスフェートシンターゼ；４．コバラミン５’−ホスフェートホスホヒドラーゼ；５．ニコチネートヌクレオチド：ＤＭＢＩホスホリボシルトランスフェラーゼ。
【図６】５．４ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ、８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ、４７４８ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−Ｓａ ｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩおよび３８５５ｂｐのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩの断片の制限地図。ＤＮＡの切断の頻度が最も少ない２０の制限酵素を示す。各酵素の切断部位は垂直線で示す。
【図７】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の５３７８ｂｐのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は５’から３’に左から右の方向に読まれるべきであり、これは図６に表す配列決定した断片の左から右の向きに相当する。ＣｌａＩ部位は位置２３（切断部位の開始）に存在する。なぜなら、この配列において、配列決定を満て多数の部位におけるクローニングの間に現れたＰｓｔＩ、ＳａｌＩおよびＸｂａＩの制限部位が存在するからである。それゆえ、ＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の配列は位置２３において開始する。
【図８】図７の続き。
【図９】図７の続き。
【図１０】図７の続き。
【図１１】図７の続き。
【図１２】図７の続き。
【図１３】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の８７５３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は５’から３’に左から右の方向に読まれるべきであり、これは図６に表す配列決定した断片の左から右の向きに相当する。
【図１４】図１３の続き。
【図１５】図１３の続き。
【図１６】図１３の続き。
【図１７】図１３の続き。
【図１８】図１３の続き。
【図１９】図１３の続き。
【図２０】図１３の続き。
【図２１】図１３の続き。
【図２２】図１３の続き。
【図２３】５３７８ｂｐのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片の６つのリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。
１．ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１２００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム１が同定される。それは位置５４９におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１０１１におけるＴＧＡにおいて終わる。
２．ヌクレオチド１０００〜ヌクレオチド２２００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２が同定される。それは位置１１４１におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１９８１におけるＴＧＡにおいて終わる。
３．ヌクレオチド１８００〜ヌクレオチド３４００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム３が同定される。それは位置１９８０におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３２８２におけるＴＧＡにおいて終わる。
４．ヌクレオチド３０００〜ヌクレオチド４５００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム４が同定される。それは位置３２８１におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置４２８０におけるＴＧＡにおいて終わる。
５．ヌクレオチド３８００〜ヌクレオチド５３７８に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム５が同定される。それは位置４２８４におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置５２５３におけるＴＧＡにおいて終わる。
【図２４】図２３の続き。
【図２５】図２３の続き。
【図２６】図２３の続き。
【図２７】図２３の続き。
【図２８】８７５３ｂｐのＥｃｏＲＩ断片の６つのリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。
１．ヌクレオチド６５０〜ヌクレオチド１６５０に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム６が同定される。それは位置７３６におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１５１９におけるＴＧＡにおいて終わる。
２．ヌクレオチド１４００〜ヌクレオチド３１００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム７が同定される。それは位置１６２０におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置２９９７におけるＴＧＡにおいて終わる。
３．ヌクレオチド２７００〜ヌクレオチド３７００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム８が同定される。それは位置３００２におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３６３２におけるＴＧＡにおいて終わる。
４．ヌクレオチド３５００〜ヌクレオチド４１００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム９が同定される。それは位置３６３１におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置４３６６におけるＴＧＡにおいて終わる。
５．ヌクレオチド４１５０〜ヌクレオチド５１５０に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム１０が同定される。それは位置４３６５におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置５１２７におけるＴＧＡにおいて終わる。
６．ヌクレオチド５０００〜ヌクレオチド６０００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム１１が同定される。それは位置５８９３におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置５１１０におけるＴＧＡにおいて終わる。
７．ヌクレオチド５７００〜ヌクレオチド７２００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム１２が同定される。それは位置５８６２におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置７１０１におけるＴＧＡにおいて終わる。
８．ヌクレオチド７０００〜ヌクレオチド８０００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム１３が同定される。それは位置７１７２におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置７９３１におけるＴＧＡにおいて終わる。
【図２９】図２８の続き。
【図３０】図２８の続き。
【図３１】図２８の続き。
【図３２】図２８の続き。
【図３３】図２８の続き。
【図３４】図２８の続き。
【図３５】図２８の続き。
【図３６】プラスミドｐＸＬ５５６、ｐＸＬ５４５およびｐＸＬ６２３の構成。ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥを含有する２．４ｋｂのＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶを５．４ｋｂの断片から切除し、次いで精製する。ＥｃｏＲＩリンカーをＥｃｏＲＶ部位に付加し、次いでこの断片をＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ部位の間のｐＸＬ５９の中に挿入する。これにより構成されたプラスミドをｐＸＬ５５６と表示する。
この構成体はｐＸＬ５４５に匹敵する：１．９ｋｂのＣｌａＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を５．４ｋｂの断片から切除し、次いで精製する。ＥｃｏＲＩリンカーをＨｉｎｄＩＩＩ部位に付加し、次いでこの断片をＣｌａＩ−ＥｃｏＲＩ部位の間のｐＸＬ５９の中に挿入する。
ｐＸＬ６２３は次のようにして構成する：２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を５．４ｋｂの断片から切除し、次いで精製し、次いで末端をＥ．ｃ ｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片でフィルインする。この断片をＥｃｏＲＩで消化したｐＰＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）の中にクローニングし、次いでＥｃｏＲＩリンカーをＨｉｎｄＩＩＩ部位に付加し、次いでＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で処理して、末端をフィルインする。
括弧内に示す制限部位は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で処理後消失した部位に相当する。
１．ＲＳＦ１０１０のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片（Ｄｅ Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８）；２．ｐＡＣＹＣ１７７のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；３．そのプロモーターをもたないＥ．ｃｏｌｉのラクトースオペロン、ｌａｃＺｎｏオペレーター、翻訳開始部位および最初の８つの非必須コドンを含有するＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８３）；４．シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｄａ）ＫＴ２４４０のＳａｕ３ＡＩ断片（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；ｏｒｉ、複製起源；ｎｉｃ、緩和部位；ｍｏｂ、移動に必須の位置；Ｋｍr、カナマイシン抵抗性遺伝子（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓａ、ＳｓｔＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ。
【図３７】トランスボゾンＴｎ５ＳｐrおよびＴｎ５の５３７８ｂｐの断片の中への挿入の研究。プラスミドｐＸＬ６２３の中のトランスボゾンＴｎ５の挿入は図３９に示されている；菌株Ｇ２Ｒｉｆrの染色体の中のトランスボゾンＴｎ５Ｓｐrの挿入はボックスで囲まれている；カナマイシン抵抗性遺伝子（１６３０および１６３１）を有するカッセトのＳＣ５１０Ｒｉｆrの染色体の中の挿入は、カナマイシン抵抗性遺伝子の転写の向きに従い、矢印で挿入番号の下に示す。配列から推定されたオープンリーディングフレームはこの図面に記載されている（ｃｏｂＡからｃｏｂＥに）；＋または−のしるしは、トランスボゾンまたは抵抗性カッセットの各挿入の下に、挿入が不活性化（−）またはそうでない、すなわち、異なる突然変異の相補性について（トランスボゾンＴｎ５の挿入の場合）、こと、あるいは挿入がコバラミンの産生が起こる菌株のその産生を壊滅することを示すために示されている。組み換えの突然変異がその突然変異を産生する菌株の合成レベルより３倍すくないコバラミンを合成するとき、相補性は存在しない。プラスミドｐＸＬ５４５、ｐＸＬ１５００、ｐＸＬ１３９７およびｐＸＬ３０２のインサートは、それらの末端に存在する制限部位で示されている。これらのインサートを広い宿主範囲のプラスミド、ｐＸＬ４３５およびｐＸＬ５９の中にクローニングする（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）。
ｐＸＬ５４５は図３６に記載するプラスミドｐＸＬ５４５に相当し、さらに、ｐＸＬ５４５のＢａｍＨＩ部位においてクローニングされたスペクチノマイシン抵抗性遺伝子を含有するｐＨＰ４５の２ｋｂのＢａｍＨＩ断片（ＰｒｅｎｔｋｉおよびＫｒｉｓｃｈ）を有する；
プラスミドｐＸＬ１５００は、この断片に表されている４．２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＳｓｔＩ断片に相当し、図７９に表されているｐＫＴ２３０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）のＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ部位においてクローニングされている；
プラスミドｐＸＬ１３９７はこの図面に示す２．４ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＳｓｔＩに相当し、図７９に記載するｐＸＬ４３５（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）のマルチ部位のＨｉｎｄＩＩＩおよびＳｓｔＩの間に挿入されている；プラスミドｐＸＬ３０２はこの図面に記載する２．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片に相当し、図７９に記載するｐＸＬ５９（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位の間に挿入されている、使用するＨｉｎｄＩＩＩ部位はｐＸＬ５９のクローニングマルチ部位の中に存在する；
ｐＸＬ７２３は、ｐＸＬ５４５ど同様に、図３６に記載されている。
＋または−は、これらのインサートの各々の上に、下に示す染色体の挿入の問題のプラスミドによる相補性が存在するかどうかを示す。Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；ＲＶ、ＥｃｏＲＶ；Ｓａｕ、Ｓａｕ３ＡＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ。
【図３８】プラスミドｐＸＬ２５３およびｐＸＬ３６７の構成。８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を切除し、次いでプラスミドｐＸＬ１５１から精製する。それをｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングしてｐＸＬ２５３を生成する。この同一断片をｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）のＥｃｏＲＩ部位に挿入してｐＸＬ３６７を生成する。１、ＲＳＦ１０１０のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩＤＮＡ断片（Ｄｅ Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８）；２、ｐＡＣＹＣ１７７のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片（Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；ｏｒｉ、複製起源；ｎｉｃ、緩和部位；ｍｏｂ、移動化に必須な位置（Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；ｔｅｔ’、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝子。
【図３９】ｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８０）の中にクローニングした８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の中へのトランスボゾンＴｎ３ｌａｃＺおよびＴｎ５の挿入の研究。トランスボゾンＴｎ３ｌａｃＺの挿入は、トランスボゾンＴｎ５の挿入と対照的に、下線を引いてある。配列から推定されたオープンリーディングフレーム（ｃｏｂＦ−ｃｏｂＭ）はこの図面に記載されており、そして不活性化挿入の８つの群（１〜３の番号）が表されている；＋または−のしるしは各トランスボゾンの挿入の下に示されており、挿入が異なる突然変異の相補性について不活性化（−）またはそうでなければ（＋）であることを示す。組み換えの突然変異がその突然変異を産生する菌株の合成レベルより３倍すくないコバラミンを合成するとき、相補性は存在しない。不活性化挿入のこれらの群は次の突然変異に相当する：１、Ｇ６１５；２、Ｇ６１４およびＧ６１６；３、Ｇ６１３およびＧ６１４；４、Ｇ６２０；５、Ｇ６３８；６、Ｇ６１０およびＧ６０９；７、Ｇ６１２；８、Ｇ６１１。これらの突然変異は既に記載されているアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＣｏｂ突然変異である。８．７ｋｂの断片の制限地図はこの図面の下部に記載されている。
【図４０】それぞれ、５．４ｋｂの断片、ｃｏｂＡ−ｃｏｂＥ、の遺伝子の各の解読配列が示されている。これらの配列によりエンコードされるタンパク質ＣＯＢＡ−ＣＯＢＢの配列は、それぞれの解読配列、ｃｏｂＡ−ｃｏｂＥの下に見える。ＣＯＢＡ−ＣＯＢＥの、それぞれ、番号および百分率の、各タンパク質のアミノ酸組成、ならびに分子量、極性指数、等電点および１ｍｇ／ｍｌの精製したタンパク質を含有する溶液の２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおける光学密度が表されている。それぞれ、各ＣＯＢＡ−ＣＯＢＥタンパク質の親水性プロフィルが示されている；それはホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッヅ（Ｗｏｏｄｓ）（１９８１）のプログラムに基づいて計算された。正の値は親水性であるタンパク質の領域に相当する。アミノ酸の位置は横座標として示されており、親水性指数の値は縦座標として示されている；この値が正であるとき、これはタンパク質の領域が親水性であることを示す。
【図４１】図４０の続き。
【図４２】図４０の続き。
【図４３】図４０の続き。
【図４４】図４０の続き。
【図４５】図４０の続き。
【図４６】図４０の続き。
【図４７】図４０の続き。
【図４８】図４０の続き。
【図４９】図４０の続き。
【図５０】それぞれ、８．７ｋｂの断片、ｃｏｂＦ−ｃｏｂＭ、の遺伝子の各の解読配列が示されている。これらの配列によりエンコードされるＣＯＢＦ−ＣＯＢＭの配列はそれらの配列の下に見える。凡例は図４０〜図４９についての凡例と同一である。注。ＣＯＢＦは位置７３６に位置するＡＴＧにおいて開始するとして示した；位置７５１に位置するＡＴＧはこのタンパク質の真の開始コドンである。
【図５１】図５０の続き。
【図５２】図５０の続き。
【図５３】図５０の続き。
【図５４】図５０の続き。
【図５５】図５０の続き。
【図５６】図５０の続き。
【図５７】図５０の続き。
【図５８】図５０の続き。
【図５９】図５０の続き。
【図６０】図５０の続き。
【図６１】図５０の続き。
【図６２】図５０の続き。
【図６３】図５０の続き。
【図６４】図５０の続き。
【図６５】図５０の続き。
【図６６】コビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼにより触媒される反応。ＣＡＤＡＳは、コビリン酸の周辺のアセテート鎖ａおよびｃのカルボン酸官能性をアミド化してコビリン酸ジアミドを生成する反応を触媒する；酵素試験において使用するアミン基のドナーはＬ−グルタミンである；それは脱アミン反応のときＬ−グルタミン酸を生成する。Ｘはコバルトの軸方向のリガンドであり、互いに異なることができる。
【図６７】ＳＰ2ＭＴにより触媒される反応。ＳＰ2ＭＴはメチルがＳＡＭからジヒドロシロヒドロコリンまたはプレコリン−２に転移してプレコリン−３を生成する反応を触媒する。メチル基はポルフィリン環系の位置Ｃ−２０に転移される。
【図６８】ヒドロゲノビリン酸およびヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドの構造。
【図６９】ＳＡＭに対するＣＯＢＡおよびＣＯＢＦの親和性。曲線は、このカラムに適用した各タンパク質についてのＴＳＫ−１２５カラムから出る放射能を任意の単位で与える。保持時間は分で示し、そして遊離ＳＡＭに相当する放射能のピークは１０分３０秒の時間で観測である。
【図７０】ＣＯＢＡおよびＣＯＢＩの配列の比較。強い相同性の領域１、２および３のみが表されている。＝のしるしは同一残基の間に配置され、そして−のしるしは相同性の残基の間に配置されている（ＨＫＲ、ＬＩＶＭ、ＡＧＳＴ、ＹＦＷ、ＤＥＱＮＢＺ、Ｐ、Ｃ）。
【図７１】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のタンパク質ＣＯＢＡおよびＥ．ｃｏｌｉのＣＹＳＧの一次配列の比較。整列はカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）、１９８４のプログラムに従い実施した。＝のしるしは同一残基の間に配置され、そして−のしるしは相同性の残基の間に配置されている（ＨＫＲ、ＬＩＶＭ、ＡＧＳＴ、ＹＦＷ、ＤＥＱＮＢＺ、Ｐ、Ｃ）。
【図７２】Ｅ．ｃｏｌｉのＣＹＳＧとシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢタンパク質（ＣＯＢＡ、ＣＯＢＦ、ＣＯＢＩ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＬおよびＣＯＢＭ）との配列の比較。比較は、ＣＹＳＧ、ＣＯＢＡおよびＣＯＢＩの間に存在する、強い相同性の領域１、２および３に関する。相同性を示す領域のタンパク質の配列の中の位置はこの図面に表されている。相同性残基の次の群を考慮した：ＨＫＲ、ＬＩＶＭ、ＡＧＳＴ、ＹＦＷ、ＤＥＱＮＢＺ、Ｐ、Ｃ。同一位置における少なくとも３つの相同性残基が存在する場合、これらのアミノ酸をボックスで囲んだ。
【図７３】プラスミドｐＸＬ１１４８およびｐＸＬ１１４９の構成。ｐＸＬ１１４８は次のようにして構成する：ｃｏｂＨおよびｃｏｂＩを含有する８．７ｋｂの１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片を精製し、そしてＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩリンカーを、それぞれ、ＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ末端に配置する。次いで、この断片を広い宿主範囲のプラスミドｐＸＬ５９（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）のＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩ部位の間に挿入して、プラスミドｐＸＬ１１４８を生成する。
ｐＸＬ１１４９はｐＸＬ１１４８と同様に構成が、ただし最初に精製した断片はｐＸＬ１１４８のために使用した小さい４００ｂｐのＳｓｔＩ断片をさらに含有する断片の代わりに１．５ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片である。次いで、断片を同一の処理に付し、そして同じようにｐＸＬ５９の中にクローニングする。
１、ＲＳＦ１０１０（Ｄｅ Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８）のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片；２、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片；３、ｌａｃＺのプロモーター、オペレーター、翻訳開始部位および最初の８つの非必須コドンをもたないＥ．ｃｏｌｉのラクトースオペロンを含有するＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８３）；４、シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｄａ）ＫＴ２４４０のＳａｕ３ＡＩ断片（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；ｏｒｉ、複製起源；ｎｉｃ、緩和部位；Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝子；ｍｏｂ、移動化に必須な位置（Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ。
【図７４】記載したように１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥの中で精製した菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＫＴ２３０、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１１４８、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１１４９。バクテリアをＰＳ４培地の中で４日間培養し、次いで全体のタンパク質のリゼイトを作った。レーン１、ＳＣ５１０Ｒｉｆr；レーン２、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１１４９；レーン３、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１１４８；レーン４、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＫＴ２３０。分子量のマーカーの分子量を示す。ＣＯＢＩおよびＣＯＢＨタンパク質が移動する位置を示す。
【図７５】プラスミドｐＸＬ１４９６およびｐＸＬ１５４６の構成。プラスミドｐＸＬ１４９６はＥ．ｃｏｌｉの中のＣＯＢＦタンパク質の過度の発現を可能とし、そしてプラスミドｐＸＬ１５４６はシュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕ ｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の中の過度の発現を可能とする。
２．２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ断片を切除し、そして８．７ｋｂの断片を精製する。それをファージＭ１３ｍｐ１９のＥｃｏＲＩにおいてクローニングしてプラスミドｐＸＬ４０５を生成する。次いで、ＮｄｅＩ部位を、前述したように、この断片の位置７３３における特異的突然変異により導入する；このようにして、ＮｄｅＩ部位はｃｏｂＦ遺伝子の仮定した開始コドン上で正確に存在する。これにより得られた新しいプラスミドをｐＸＬ１４０６と表示する。１．５ｋｂのＮｄｅＩ−ＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片は、その仮定した開始コドンから出発するｃｏｂＦ遺伝子を含有し、適当な酵素で部分的に消化した後、精製し、そしてプラスミドｐＸＬ６９４の適当な断片と結合する（Ｅ．ｃｏｌｉの発現シグナルを含有する１２０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＮｄｅＩ断片−テキストを参照−およびアンピシリン抵抗性遺伝子、このプラスミドの複製機能およびまたＥ．ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネーターを含有する３．１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＳｐｈＩ断片、このテキストに記載されている）。これにより構成されたプラスミドをｐＸＬ１４９６と表示する。
ｐＸＬ１５４６は次のようにして構成する：ｐＸＬ１４９６の２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片を適当な酵素で部分的に消化して精製する；この断片はＥ．ｃｏｌｉの発現シグナル、引き続いてｃｏｂＦ遺伝子および次いでｃｏｂＧ遺伝子を含有し、この部分それ自体の次に、このテキストに記載するように、Ｅ．ｃｏｌｉのｒｒｎＢオペロンのターミネーターが存在する。この断片を図７９に記載するようにマルチ宿主プラスミドｐＫＴ２３０（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）の中にクローニングする。Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳｓｔＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；Ｋｍr、カナマイシン抵抗性遺伝子；Ａｍｐ、アンピシリン抵抗性遺伝子。
【図７６】記載したように１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥの中で分析したＳＣ５１０Ｒｉｆr、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＫＴ２３０、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１５４６の全体のタンパク質。バクテリアをＰＳ４培地の中で４日間培養し、次いで全体のタンパク質のリゼイトを作った。レーン１、ＳＣ５１０Ｒｉｆr；レーン２、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＫＴ２３０；レーン３、ＳＣ５１０ＲｉｆrｐＸＬ１５４６。分子量マーカーの分子量を示す。ＣＯＢＦタンパク質が移動する位置を示す。
【図７７】記載したように１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥの中で分析した菌株Ｅ．ｃｏｌｉおよびＥ．ｃｏｌｉ Ｂ ｐＸＬ１４９６の全体のタンパク質。レーン１、トリプトファンの不存在下に培養したＥ．ｃｏｌｉ ｐＸＬ１４９６；レーン２、トリプトファンの存在下に同一条件下に培養したＥ．ｃｏｌｉ ｐＸＬ１４９６；レーン３、トリプトファンの不存在下に培養したＥ．ｃｏｌｉ；レーン４、トリプトファンの存在下に同一条件下に培養したＥ．ｃｏｌｉ。分子量マーカーの分子量を示す。ＣＯＢＦタンパク質が移動する位置を示す。
【図７８】プラスミドｐＸＬ５２５およびｐＸＬ３６８の構成。プラスミドｐＸＬ３６８は次のようにして構成する：２．４ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＣｌａＩ断片（ｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有する）をプラスミドｐＸＬ５５６から精製し、これにより末端にＢａｍＨＩ部位およびＸｂａＩ部位をもつこの断片を得ることができる；この断片をｐＸＬ２０３のＢａｍＨＩおよびＸｂａＩ部位の中にクローニングする。
ｐＸＬ５２５の構成のために、ＸｂａＩリンカーを８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の右の末端に位置するＥｃｏＲＩ部位に付加する；次いでこの８．７ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片を、ｐＸＬ５５６から由来しそしてｃｏｂＡおよびｃｏｂＥを含有する２．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片と共クローニングする。括弧内に示す制限部位は、Ｅ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で処理後消失した部位に相当する。
１．ＲＳＦ１０１０（Ｄｅ Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８）のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ；２、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片；ｏｒｉ、複製起源；ｎｉｃ、緩和部位；ｍｏｂ、移動化に必須な位置；Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝子；(Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ.、１９８１）；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；ｔｅｔ、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；ＡｍｐRおよびＡｍｐ、アンピシリン抵抗性遺伝子。
【図７９】グラム陰性バクテリアにおいて広い宿主範囲を有する不適合性群Ｑのプラスミド。これらのプラスミドは前の刊行物（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）に記載されており、そして本発明において使用する。
１．ＲＳＦ１０１０（Ｄｅ Ｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８）のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片；２．ｐＡＣＹＣ１７７（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片；３．ｌａｃＺのプロモーター、オペレーター、翻訳開始部位および最初の８つの非必須コドンをもたないＥ．ｃｏｌｉのラクトースオペロンを含有するＢａｍＨＩ−ＳｓｔＩ断片（Ｃａｓａｄａｂａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８３）；４．シュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｄａ）ＫＴ２４４０のＳａｕ３ＡＩ断片（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；ｏｒｉ、複製起源；ｎｉｃ、緩和部位；Ｋｍ’、カナマイシン抵抗性遺伝子；Ｓｍr、ストレプトマイシン抵抗性遺伝子；ｍｏｂ、移動化に必須な位置（Ｂａｇａｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ。
【図８０】実施例７に記載する分割系上の異なるコリノイド標準（１ｍｇ／標準）の保持時間。使用するカラムはヌクレオシル（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ）Ｃ−１８カラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）である。各吸収ピークについて、数字は下に記載するコリノイドに対応して示す。保持時間は横座標として示し、そして３７１ｎｍにおける吸収は縦座標として示す。
１．コビリン酸；２．コビリン酸ａ−アミド；３．コビリン酸ｇ−アミド；４．コビリン酸ａ，ｇ−ジアミド；５．コビリン酸ｃ−アミド；６．コビリン酸ｃ，ｇ−ジアミド；７．コビリン酸ａ，ｃ−ジアミド；８．コビリン酸トリアミド；９．コビリン酸テトラアミド；１０．コビリン酸ペンタアミド；１１．コビル酸；１２．ＧＤＢ−コビナミド；１３．コビナミドホスフェート；１４．コビナミド；１５．シアノコバラミン５’−ホスフェート；１６．シアノコバラミン。
【図８１】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の４７４８ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、図６に表す制限地図の断片の左から右への向きに相当する左から右への方向に５’から３’に読むべきである。
【図８２】図８１の続き。
【図８３】図８１の続き。
【図８４】図８１の続き。
【図８５】図８１の続き。
【図８６】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の３８５５ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、図６に表す制限地図の断片の左から右への向きに相当する左から右への方向に５’から３’に読むべきである。
【図８７】図８６の続き。
【図８８】図８６の続き。
【図８９】図８６の続き。
【図９０】図８６の続き。
【図９１】４７４８ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩ断片の６つのリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。４ａ．ヌクレオチド２００〜８００に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム１４の同定を可能とする。それは位置６６０におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３７９におけるＴＧＡ BR>ノおいて終わる。４ｂ．ヌクレオチド８００〜１５００に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム１５の同定を可能とする。それは位置９２５におけるＧＴＧにおいて開始し、そして位置１４４０におけるＴＡＡにおいて終わる。４ｃ．ヌクレオチド１４５０〜２６００に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム１６の同定を可能とする。それは位置１５１２におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置２５１０におけるＴＧＡにおいて終わる。４ｄ．ヌクレオチド２５００〜４６５０に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム１７の同定を可能とする。それは位置２６１６におけるＴＧＡにおいて開始し、そして位置４５１１におけるＴＧＡにおいて終わる。
【図９２】図９１の続き。
【図９３】３８５５ｂｐの BR>RａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片の６つのリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。５ａ．ヌクレオチド１〜９０５に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム１８の同定を可能とする。それは位置８０９におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１０８におけるＴＧＡにおいて終わる。５ｂ．ヌクレオチド９５５〜２１０５に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム１９の同定を可能とする。それは位置１９７１におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１０６３におけるＴＡＡにおいて終わる。５ｃ．ヌクレオチド２０００〜３３ｆ０に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム２０の同定を可能とする。それは位置２０９９におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３１５５におけるＴＡＧにおいて終わる。５ｄ．ヌクレオチド３２５０〜３８５５に相当する配列の分析。この分析はオープンリーディングフレーム２１の同定を可能とする。それは位置３３４４におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３７５７におけるＴＧＡにおいて終わる。
【図９４】図９３の続き。
【図９５】ｐＸＬ１５４からのプラスミドｐＸＬ２３３、ｐＸＬ８４３およびｐＸＬ１５５８の構成。
プラスミドを次の方法で構成する。切頭ｃｏｂＳ遺伝子および上流の配列を含有する３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ１５４から切除し、次いで精製し、そしてｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ部位にクローニングする。これにより構成されたプラスミドをｐＸＬ２３３と表示する。ｃｏｂＴ遺伝子および下流する配列を含有する３．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩ−ＸｈｏＩ断片をｐＸＬ１５４から部分的消化により切除しそして精製する。ｃｏｂＳ遺伝子および上流の配列を含有する４．３ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ１５４から切除および精製し、次いで上の３．５ｋｂの断片に結合する。これにより得られたほぼ８ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＸｈｏＩをｐＸＬ５９のＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ部位の中にクローニングして、プラスミドｐＸＬ８４３を生成する。プラスミドｐＸＬ１５５８を次の方法で構成する：１２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片をｐＸＬ１５４から切除し、そして精製し、次いで末端をＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片でフィルインする。このインサートをＥｃｏＲＩで消化したｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）の中にクローニングし、次いでＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で処理して、末端を平滑にする。括弧内に示す制限部位はクローニングの間に消失した部位に相当する。１、ＲＳＦ１０１０(Ｄｅｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ.、９７８)のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片；２、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；
Ｔｅｔ、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；Ｋｍr、カナマイシン抵抗性遺伝子；Ｓｍr，ストレプトマイシン抵抗性遺伝子。
【図９６】ｐＸＬ１５４の１２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩの中へのトランスボゾンＴｎ５Ｓｐの挿入の研究。
トランスボゾンの挿入を、ｐＸＬ１５５８の中へクローニングされた１２ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ上にマッピングする。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr中の染色体の挿入をボックスで囲み、これは菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆrの中に導入されない。プラスまたはマイナスのしるしを各挿入の下に示し、この挿入を有する菌株のＣｏｂ表現型を示す。プラスミドｐＸＬ１５５８：：Ｔｎ５Ｓｐによる菌株Ｇ２０３５の相補性の不存在（または相補性）を、各挿入より下にマイナス（またはプラス）で示す。図９５に記載するプラスミドのインサートを示す。これらのプラスミドの上に位置しそしてトランスボゾンの挿入と整列したプラス（またはマイナス）のしるしは、プラスミドによるトランスボゾン突然変異した菌株の相補性（または不存在）を線図的に示す。配列から推定されるオープンリーディングフレームを、また、この図面に記載する（ＯＲＦ１４〜１７、ならびに対応するｃｏｂ遺伝子（ｃｏｂＳおよびｃｏｂＴ））。Ｅ：ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｘ：ＸｈｏＩ。
【図９７】プラスミドｐＸＬ１２８６、ｐＸＬ１３０３、ｐＸＬ１３２４、ｐＸＬ１４９０ＢおよびｐＸＬ１５５７およびｐＸＬ５１９の構成。配列決定した断片の位置は、この図面の上部のクラスターの制限地図に見える；それは３．９ｋｂのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢａｍＨＩ断片である。プラスミドは次の方法で構成する。ｃｏｂＵ遺伝子および下流を含有する２ｋｂのＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ５１９から切除し、次いで精製し、ｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ部位においてクローニングして、プラスミドｐＸＬ１２８６を生成する。切頭したｃｏｂＶ遺伝子、ｃｏｂＵ遺伝子および下流の配列を含有する２．７ｋｂのＳｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＸＬ５１９上で切除し、次いで精製し、そしてｐＫＴ２３０のＳｓｔＩおよびＥｃｏＲＩにおいてクローニングして、プラスミドｐＸＬ１３２４を生成する。切頭ｃｏｂＶ遺伝子および上流の配列を含有する１．６ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩをｐＸＬ５１９から切除し、次いでｐＫＴ２３０のＳｓｔＩ部位においてクローニングして、ｐＸＬ１３０３を発生させる。３．８５ｋｂのＳｓｔＩ−ＳｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を、ＢａｍＨＩでｐＸＬ５１９で完全に消化し、そしてＳｓｔＩで部分的に消化した後、精製する。次いで、この断片をｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩおよびＳｓｔＩ部位においてクローニングして、ｐＸＬ１４９０Ｂを発生させる。プラスミド１ｐＸＬ５５７を次の方法で構成する：９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＸＬ５１９から切除し、そして精製し、次いでＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片でフィルインする。このインサートをＥｃｏＲＩで消化したｐＲＫ２９０（Ｄｉｔｔａ ｅｔ ａｌ．、１９８１）の中にクローニングし、次いでＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡポリメラーゼＩの大きい断片で処理して末端を平滑にする。括弧内に示す制限部位は、クローニングの間に消失した部位に相当する。１、ＲＳＦ１０１０（Ｄｅｇｒａｆｆ ｅｔ ａｌ．、１９７８）のＰｓｔＩ−ＳｓｔＩ断片；２、ｐＡＣＹＣ１７７(Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ.、１９８１）のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ；Ｃ、ＣｌａＩ；Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｈ、ＨｉｎｄＩＩＩ；Ｐ、ＰｓｔＩ；Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｓａ、ＳａｌＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；Ｘｂ、ＸｂａＩ；Ｔｅｔr、テトラサイクリン抵抗性遺伝子；Ｋｍr、カナマイシン抵抗性遺伝子；Ｓｍr，ストレプトマイシン抵抗性遺伝子。
【図９８】ｐＸＬ５１９の９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサートの挿入の研究。トランスボゾンの挿入を、ｐＸＬ１５５７の中にクローニングされた９ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩ−ＢａｍＨＩインサート上でマッピングする。菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆrの中への染色体の挿入をボックスで囲み、そうでないものは菌株ＳＢＬ２７Ｒｉｆrの中に導入される。プラスまたはマイナスのしるしは各挿入の下に示し、この挿入を有する菌株のＣｏｂ表現型を示す。プラスミドｐＸＬ１５５７：Ｔｎ５Ｓｐによる菌株Ｇ２０４０の相補性の不存在（または相補性）を、各挿入より下にマイナス（またはプラス）で示す。図９５に記載するプラスミドのインサートを示す。これらのプラスミドの上に位置しそしてトランスボゾンの挿入と整列したプラス（またはマイナス）のしるしは、プラスミドによるトランスボゾン突然変異した菌株の相補性（または不存在）を線図的に示す。配列から推定されるオープンリーディングフレームを、また、この図面に記載する（ＯＲＦ１８〜２１）、ならびに対応するｃｏｂ遺伝子（ｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ））。
【図９９】４．８ｋｂの断片の遺伝子の各々、それぞれ、ｃｏｂＸ、ｃｏｂＳおよびｃｏｂＬ、の解読配列を示す。これらの配列によりエンコードされるＣＯＢＸ、ＣＯＢＳおよびＣＯＢＴタンパク質の配列は、それぞれのｃｏｂＸ、ｃｏｂＳおよびｃｏｂＴの下に見られる。凡例は図４０〜図４９についてのそれと同一である。
【図１００】図９９の続き。
【図１０１】図９９の続き。
【図１０２】図９９の続き。
【図１０３】図９９の続き。
【図１０４】図９９の続き。
【図１０５】図９９の続き。
【図１０６】３．９ｋｂの断片の遺伝子の各々、それぞれ、ｃｏｂＵおよびｃｏｂＶ、の解読配列を示す。これらの配列によりエンコードされるＣＯＢＵおよびＣＯＢＶタンパク質の配列は、それぞれのｃｏｂＵおよびｃｏｂＶの下に見られる。凡例は図４０〜図４９についてのそれと同一である。
【図１０７】図１０６の続き。
【図１０８】図１０６の続き。
【図１０９】図１０６の続き。
【図１１０】Ａ、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ３ｂおよびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ ｐＸＬ１９３７の全体のタンパク質。レーン１、ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ ｐＥＴ３ｂ；レーン２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＬｙｓＳ ｐＸＬ１９３７。Ｂ、１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ中で分析した菌株菌株Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ１２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ１２ ｐＸＬ１８７４およびＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＸＬ１８７５。レーン１、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１；レーン２、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＸＬ１８７４；レーン３、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１ ｐＸＬ１８７５。
マーカーの分子量は示されている。過度に発現したタンパク質に相当するバンドは矢印で示す。
【図１１１】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１３１４４ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、図１２９に表す制限地図の断片の左から右の向きに相当する左から右の方向において５'から３'に読むべきである。
【図１１２】図１１１の続き。
【図１１３】図１１１の続き。
【図１１４】図１１１の続き。
【図１１５】図１１１の続き。
【図１１６】図１１１の続き。
【図１１７】図１１１の続き。
【図１１８】図１１１の続き。
【図１１９】図１１１の続き。
【図１２０】図１１１の続き。
【図１２１】１１１の続き。
【図１２２】図１１１の続き。
【図１２３】図１１１の続き。
【図１２４】図１１１の続き。
【図１２５】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１３１４４ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片の制限地図。存在する制限部位の１または２以上の位置を配列決定した断片上の切断した番号の増加する順序で示す；位置は図１１１〜図１２４に表す配列に相当する。
【図１２６】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）の１３１４４ｂｐのＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＳａｌＩ−ＢｇｌＩＩ−ＢｇｌＩＩ断片の６つのリーディングフレームについてのステンドン（Ｓｔａｄｅｎ）およびマクラチラン（ＭａｃＬａｃｈｌａｎ）（１９８２）のプログラムを使用する、コドンの優先性に基づいて解読フレームの確率の分析。同一の解読鎖に属するフレームについて、最も可能性があるフレームは、停止コドンにより中断されていない点線がこのフレームのための確率の線より下に配置されているフレームである。
１．ヌクレオチド１〜２２６６に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２２が同定できる。それは位置４２９におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１８８４におけるＴＧＡにおいて終わる。
２．ヌクレオチド２２６６〜４０００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２３が同定できる。それは位置３３６４におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置３８８６におけるＴＧＡにおいて終わる。
３．ヌクレオチド３８００〜５０００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２４が同定できる。それは位置３８９２におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置４９５４におけるＴＧＡにおいて終わる。
４．ヌクレオチド５０００〜９０００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２５が同定できる。それは位置５０６０におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置８８８５におけるＴＧＡにおいて終わる。
５．ヌクレオチド９０００〜９７００に延びる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２６が同定できる。それは位置９０３４におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置９６７６におけるＴＧＡにおいて終わる。
６．ヌクレオチド９６００〜１３１４４延にびる配列。この分析により、オープンリーディングフレーム２７、２８、２９および３０が同定できる。それらは、ことに、位置９６７８、１０８９５、１１６５６および１３０５９におけるＡＴＧにおいて開始し、そして位置１０１０１、１０３０４、１２１８１および１２３６６におけるＴＧＡにおいて終わる。オープンリーディングフレーム２８および３０は、すべての他のオープンリーディングフレームに相当する解読鎖に対して相補性の鎖上に存在する。
【図１２７】図１２６の続き。
【図１２８】図１２６の続き。
【図１２９】１３．４ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ−ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片、９．１ｋｂのＥｃｏＲＩ断片の中へのトランスボゾンＴｎ５Ｓｐの挿入の位置、プラスミドｐＸＬ１８９のインサートの中のトランスボゾンＴｎ５の挿入の位置ならびに菌株ＳＣ５１０Ｒｉｆr：Ｔｎ５Ｓｐの相補性についての実験の間に使用した種々のプラスミドのインサート。プラスミドによる突然変異ＳＣ５１０Ｒｉｆr：：Ｔｎ５Ｓｐの相補性は、（＋）−親のＳＣ５１０Ｒｉｆr−のレベルの５％〜１００％−、（・）−部分的相補性、ＳＣ５１０Ｒｉｆr−のレベルの０．５〜５％、あるいは（−）−相補性の不存在、すなわち、ＳＣ５１０Ｒｉｆr−より１０００倍少ない、プラスミドのインサートを線図的に示す線より直ぐ上に位置し、そして対応する突然変異の挿入部位と整列する。プラスミドｐＸＬ１８９のインサートの中へのトランスボゾンＴｎ５の挿入のマッピングより下において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）突然変異Ｇ６３２およびＧ６３３についてのこれらの突然変異のプラスミドの相補性（＋）または相補性の不存在（−）が示されている。この図面の右の部分上に、異なるプラスミドによる突然変異Ｇ６２２、Ｇ６２３およびＧ６３０（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）の相補性を示す表が存在する；（＋）−完全な相補性、親のＳＣ５１０Ｒｉｆr−のレベルの１００％−、（・）−部分的相補性、ＳＣ５１０Ｒｉｆr−のレベルの１０〜５０％、あるいは（−）−相補性の不存在。
挿入を示す異なるプラスミドは次のようにして構成する（断片はｐＸＬ１５６またはｐＸＬ１５７から切除する）：
ｐＸＬ６１８はｐＫＴ２３０の同一部位においてクローニングした２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎｅｔ ａｌ．、１９８１）；
ｐＸＬ５９３はｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩ部位においてクローニングした３．１ｋｂのＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；
ｐＸＬ６２３はｐＸＬ５９のＢａｍＨＩ−ＳａｌＩ部位においてクローニングした１．９ｋｂのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ断片に相当する（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔａｌ．、１９８９）；
ｐＸＬ１９０９はｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩ部位においてクローニングした８．４ｋｂのＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；
ｐＸＬ２２１はｐＸＬ５９の同一部位においてクローニングした１．６ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＣｌａＩ断片に相当する（この断片がクローニングされたＣｌａＩ部位はｐＸＬ５９のマルチ部位のＣｌａＩ部位である）（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔａｌ．、１９８９）；
ｐＸＬ１９０８および１９３８は同一挿入、すなわち、ＸｂａＩリンカーが付加された、６．５ｋｂのＸｈｏＩ−ＢａｍＨＩ−ＢａｍＨＩ断片に相当する；このインサートはｐＸＬ４３５のＸｂａＩ部位において両者の向きにクローニングする（Ｃａｍｅｒｏｎ ｅｔ ａｌ．、１９８９）；図面上に位置した矢印は２つのプラスミドのインサートの末端に関するカナマイシン抵抗性遺伝子の位置を示す；
ｐＸＬ２０８はｐＫＴ２３０のＢａｍＨＩ部位においてクローニングした５．２ｋｂのＢａｍＨＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；
ｐＸＬ２９７はｐＫＴ２３０のＥｃｏＲＩ部位においてクローニングした９．１ｋｂのＥｃｏＲＩに相当する（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ ｅｔ ａｌ．、１９８１）；
断片の配列決定により定められたオープンリーディングフレーム（ＰＲＦ）（ＯＲＦ２２〜３０）、ならびに対応するｃｏｂ遺伝子が示されている；矢印は転写の極性を示す。
Ｅ、ＥｃｏＲＩ；Ｂ、ＢａｍＨＩ；Ｂｇ、ＢｇｌＩＩ；Ｃｌ、ＣｌａＩ；Ｓａｕ、Ｓａｕ３ＡＩ；Ｘ、ＸｈｏＩ；
【図１３０】１３．４ｋｂの断片の遺伝子の各々、それぞれ、ｃｏｂＱ、ｃｏｂＰおよびｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂＯの解読配列を示す。これらの配列によりエンコードされるＣＯＢＱ、ＣＯＢＰ、ＣＯＢＷ、ＣＯＢＮおよびＣＯＢＯタンパク質の配列は、それぞれのｃｏｂＱ、ｃｏｂＰおよびｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂＯの下に見られる。凡例は図４０〜図４９についてのそれと同一である。
【図１３１】図１３０の続き。
【図１３２】図１３０の続き。
【図１３３】図１３０の続き。
【図１３４】図１３０の続き。
【図１３５】図１３０の続き。
【図１３６】図１３０の続き。
【図１３７】図１３０の続き。
【図１３８】図１３０の続き。
【図１３９】図１３０の続き。
【図１４０】図１３０の続き。
【図１４１】図１３０の続き。
【図１４２】Ａ−メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）のＳＵＭＴのＮＨ2末端の配列およびオリゴヌクレオチド９２３、９４６、９４７；−、この位置において、残基が決定することができないことを意味する；アンチセンスオリゴヌクレオチドについて、配列の下に示したアミノ酸は示したアンチコドンに相当する。Ｂ−オリゴヌクレオチド９４６および９４７をもつメタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）のＳＵＭＴの構造遺伝子に対して内部の断片の酵素の増幅の調製。
【図１４３】組み換え複製の形態ｐＧ１０の構成。増幅により得られた６１５ｂｐの断片をＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、次いで記載したように精製した。次いで、この断片を同一酵素で消化したファージＭ１３ｍｐ１９の複製形態と結合する。組み換えクローンをこのテキストに記載されているように見いだす。
【図１４４】種々の酵素で消化し、アガロースゲルの電気泳動により分割し、次いで前述したようにナイロン膜上に移した。この膜を前述したようにｐＧ１０プローブとハイブリダイゼーションさせる。１、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＢｇｌＩＩ；２、ＫｐｎＩ−ＢｇｌＩＩ；３、ＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ；４、ＢｇｌＩＩ−ＰｓｔＩ。このプローブとハイブリダイゼーションする異なる断片の大きさはｋｂで示す。
【図１４５】メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）の９５５ｂｐの断片の両者の鎖のヌクレオチド配列。上部に位置する鎖は、左から右の方向に５’から３’に読む。
【図１４６】９５５ｂｐの配列から得られたメタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）のｃｏｒＡ遺伝子の解読配列。ＣＯＲＡタンパク質の一次配列は、また、示されている。アミノ酸はそれらのコドンの上に示されており、そして停止コドンは星印で表示されている。メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）のＣＯＲＡタンパク質の主な物理的性質、すなわち、アミノ酸組成、数および百分率、分子量、極性の指数、等電点および１ｍｇ／ｌの精製したタンパク質を含有する溶液の２８０ｎｍにおける光学密度。メタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）のＣＯＲＡタンパク質の親水性プロフィルは；このプロフィルはホップ（Ｈｏｐｐ）およびウッヅ（Ｗｏｄｄｓ）（１９８１）のに基づいて得られた。正の値は親水性であるタンパク質の領域に相当する。アミノ酸の位置は横座標として示し、そして親水性指数の値は縦座標として示されている；この値が正であるとき、これはタンパク質がこの領域において親水性であることを示す。
【図１４７】図１４６の続き。
【図１４８】図１４６の続き。
【図１４９】シュードモナス・デニトリフィカンス（Ｐ．ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ）のＣＯＢＡおよびメタノバクテリウム・イバノビイ（Ｍ．ｉｖａｎｏｖｉｉ）のＣＯＲＡのタンパク質の比較。タンパク質はカネヒサ（Ｋａｎｅｈｉｓａ）（１９８４）のプログラムにより整列した。＝、同一のアミノ酸；−、相同性アミノ酸、上で定義した基準に基づく（図７１および図７２参照）。
【図１５０】プラスミドｐＸＬ１８３２およびｐＸＬ１８４１の構成。記載され、この図面に配置されている凡例により、この構成に従うことができる。
【図１５１】図１５０の続き。

Claims (32)

  1. コバラミンおよびコバミドのいずれか一方または両方の生合成に関与するポリペプチドをコードし、そして
    ・図４０、図４２、図４４、図４６、図４８、図５０、図５２、図５４、図５６、図５８、図６０、図６２、図６４、図１３６〜１３８、図１４０、図１３２、図１３０、図１００、図１０２、図１０７、図１０９、図１３４、図１０５および図１４６に示す、ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣ、ｃｏｂＤ、ｃｏｂＥ、ｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬ、ｃｏｂＭ、ｃｏｂＮ、ｃｏｂＯ、ｃｏｂＰ、ｃｏｂＱ、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＴ、ｃｏｂＵ、ｃｏｂＶ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＸおよびｃｏｒＡ遺伝子から選ばれる２種もしくはそれ以上の遺伝子のセット、
    ・遺伝暗号の縮重から生ずるこれらのＤＮＡの相同体、および
    ・これらのＤＮＡまたはこれらのＤＮＡの断片とハイブリダイゼーションし、そしてコバラミンおよびコバミドのいずれか一方または両方の生合成に関与するポリペプチドをコードする、天然、合成または組み換え由来のＤＮＡ、
    から選択されることを特徴とする精製されたＤＮＡ。
  2. 請求項１に記載のＤＮＡを含有する精製された遺伝子。
  3. 請求項１および２項のいずれかに記載の少なくとも１つのＤＮＡを含有することを特徴とする組み換えＤＮＡ。
  4. 該ＤＮＡが発現シグナルのコントロール下に配置されていることを特徴とする請求項３に記載の組み換えＤＮＡ。
  5. 発現シグナルが該ＤＮＡと由来または源が同種または異種であることができることを特徴とする請求項４に記載の組み換えＤＮＡ。
  6. 発現プラスミドの一部分を形成することを特徴とする請求項３〜５のいずれかに記載の組み換えＤＮＡ。
  7. 請求項１に記載の少なくとも１つのＤＮＡ、およびそれらの発現を可能にするＤＮＡを含有することを特徴とするプラスミド。
  8. ・請求項３〜６のいずれかに記載の組み換えＤＮＡ、
    ・複製系、および
    ・少なくとも１つの選択可能なマーカー
    を含有することを特徴とする請求項７に記載のプラスミド。
  9. ・ｃｏｂＡ、ｃｏｂＢ、ｃｏｂＣおよびｃｏｂＥ遺伝子を保有する、図３７に示すインサートを含有するプラスミドｐＸＬ１５００、
    ・図３６に示すｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ７２３、
    ・ｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子を保有する、図３７に示すインサートを含有するｐＸＬ３０２、
    ・ｃｏｂＢおよびｃｏｂＣ遺伝子を保有する、図３７に示すインサートを含有するプラスミドｐＸＬ１３９７、
    ・図７８に示すｃｏｂＡおよびｃｏｂＥ遺伝子を含有するｐＸＬ３６８、
    ・図３６に示すｃｏｂＥ遺伝子を含有するｐＸＬ５４５、
    ・スペクチノマイシン−耐性遺伝子が挿入されたプラスミドｐＸＬ５４５に相当するプラスミドｐＸＬ４５４Ω、
    ・図３８に示すｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬおよびｃｏｂＭ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ２５３、
    ・図３８に示すｃｏｂＦ、ｃｏｂＧ、ｃｏｂＨ、ｃｏｂＩ、ｃｏｂＪ、ｃｏｂＫ、ｃｏｂＬおよびｃｏｂＭ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ３６７、
    ・図７３に示すｃｏｂＨおよびｃｏｂＩ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ１１４８、
    ・図７３に示すｃｏｂＨ遺伝子を含有するｐＸＬ１１４９、
    ・図７５に示すｃｏｂＦ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ１４９６およびｐＸＬ１５４６、
    ・図７８に示すｃｏｂＡ、ｃｏｂＥおよびｃｏｂＦ〜ｃｏｂＭ遺伝子を含有するｐＸＬ５２５、
    ・図９５に示すｃｏｂＸ、ｃｏｂＳおよびｃｏｂＴ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ８４３、
    ・ｃｏｂＶ遺伝子を保有する、図８６〜８８に示す配列の位置２５１〜２２３４により同定される断片Ｂｇ１ＩＩ−ＸｈｏＩを含有するプラスミドｐＸＬ６９９、
    ・図９７に示すｃｏｂＵ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ１３２４、
    ・ｃｏｂＱを保有する、図１２９に示すインサートを含有するプラスミドｐＸＬ６１８、
    ・ｃｏｂＰを保有する、図１２９に示すインサートを含有するプラスミドｐＸＬ６２３、
    ・図１２９に示すｃｏｂＰおよびｃｏｂＷ遺伝子を含有するプラスミドｐＸＬ５９３、および
    ・図１２９に示すｃｏｂＰ、ｃｏｂＷ、ｃｏｂＮおよびｃｏｂＯ遺伝子を含有するｐＸＬ１９０９、
    から選択されることを特徴とする請求項７に記載のプラスミド。
  10. 請求項１〜６のいずれかに記載のＤＮＡまたは請求項７〜９のいずれかに記載のプラスミドが導入されている細胞。
  11. コビル酸のコビンアミドへの転化に関与することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＣおよびｃｏｂＤ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  12. 図４４及び図４６に示すＣＯＢＣおよびＣＯＢＤペプチド配列を含有することを特徴とする請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン：プレコリン−２メチルトランスフェラーゼ（ＳＰ2ＭＴ）活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＩ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  14. 図５６に示すＣＯＢＩペプチド配列を含有することを特徴とする請求項１３に記載のポリペプチド。
  15. コビリン酸および／またはヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドシンターゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＢ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  16. 図４２に示すＣＯＢＢペプチド配列を含有することを特徴とする請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. プレコリン−８ｘムターゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＨ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  18. 図５４に示すＣＯＢＨ配列を含有することを特徴とする請求項１７に記載のポリペプチド。
  19. ニコチネートヌクレオチド：ジメチルベンズイミダゾールホスホリボシルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＵ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  20. 図１０７に示すＣＯＢＵペプチド配列を含有することを特徴とする請求項１９に記載のポリペプチド。
  21. コバラミン−５'−ホスフェートシンターゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＶ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  22. 図１０９に示すＣＯＢＶペプチド配列を含有することを特徴とする請求項２１に記載のポリペプチド。
  23. コビル酸シンターゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＱ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  24. 図１３０に示すＣＯＢＱペプチド配列を含有することを特徴とする請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. プレコリン−６ｘリダクターゼ活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＫ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  26. 図６０に示すＣＯＢＫペプチド配列を含有することを特徴とする請求項２５に記載のポリペプチド。
  27. コビンアミドのＧＤＰ−コビンアミドへの転化に関与することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＰ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  28. コビンアミドキナーゼおよびコビンアミドホスフェートグアニリルトランスフェラーゼ活性を有することを特徴とする請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. 図１３２に示すＣＯＢＰペプチド配列を含有することを特徴とする請求項２８記載のポリペプチド。
  30. ヒドロゲノビリン酸ａ，ｃ−ジアミドのコビリン酸ａ，ｃ−ジアミドへの転換活性を有することを特徴とする請求項１に記載のｃｏｂＮ遺伝子によってコードされるポリペプチド。
  31. 図１３６〜１３８に示すＣＯＢＮペプチド配列を含有することを特徴とする請求項３０に記載のポリペプチド。
  32. 図１４６、図４２、図４４、図４６、図４８、図５０、図５２、図５４、図５６、図５８、図６０、図６２、図６４、図１３６〜１３８、図１３２、図１３０、図１００、図１０２、図１０７、図１０９、図１３４および図１０５に示す、ＣＯＲＡ、ＣＯＢＢ、ＣＯＢＣ、ＣＯＢＤ、ＣＯＢＥ、ＣＯＢＦ、ＣＯＢＧ、ＣＯＢＨ、ＣＯＢＩ、ＣＯＢＪ、ＣＯＢＫ、ＣＯＢＬ、ＣＯＢＭ、ＣＯＢＮ、ＣＯＢＰ、ＣＯＢＱ、ＣＯＢＳ、ＣＯＢＴ、ＣＯＢＵ、ＣＯＢＶ、ＣＯＢＷおよびＣＯＢＸのタンパク質から選択されることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ配列によってコードされるポリペプチド。
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