KR100200542B1 - 바이오틴의 생물공학적 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 유전자들이 전사 단위체에 배열되어있는, 장내세균으로부터의 바이오틴 생합성에 관여할 수 있는 바이오B, 바이오F, 바이오C, 바이오D 및 바이오A를 포함하는 DNA 단편 또는 그의 동일한 기능의 유전적 변종 및 돌연변이에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 DNA 단편 및 플라스미드를 함유하는 미생물, 및 상기 미생물을 사용하는 바이오틴 제조방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 제조합 유전물질을 함유하는 미생물인, 장내 세균에서 바이오틴 대사경로의 유전자를 발현하는 재조합 유전물질, 및 바아오틴의 생물공학적 제조방법에서의 상기 미생물의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 세포-프리 시스템에서 바이오틴 합성효소에 의한 탈리오바이오틴(dethiobiotin)의 전환을 함유하는 바이오틴 제조방법에 관한 것이다.
바이오틴 (비타민 H)는 사람 및 동물에게 중요한 비타민이고, 이의 결핍은, 예를들면, 지루성피부염, 피부염, 식욕감퇴 및 피로를 유발할 수 있다. 따라서, 바이오틴은 사람 및 동물 음식에 유용한 첨가제이다.
합성 유기화학적 방법에 의한 바이오틴의 제조는 힘들고 비용이 비싸다. 상기의 이유로 인해, 글루코스와 같은 저가의 출발물질로부터 미생물의 도움으로 바이오틴이 합성될 수 있는 생물공학적 방법에 관심이 증가하고 있다.
에쉐리키아 콜라이 (이후, E.coli로 칭함)는 글리세롤 또는 글루코스와 같은 단순한 탄소원으로부터 출발하여 바이오틴을 합성할 수 있는 미생물이다 (제 1 도). E.coli에서 바이오틴의 합성을 주관하는 유전자는 다섯가지 유전자 바이오A, 바이오B, 바이오C, 바이오D 및 바이오F(이후, 바이오 유전자로 칭함)을 포함하고 이미 클론된 사람에게 존재한다[Gupta et al., Gene 1 : 331-345; 1977]. 상기 유전자는 바이오A 및 바이오B 유전자 사이에 위치하는 프로모터-오퍼레이터 영역에 의해 두가지 다른 방향으로 전사된다. 통상적인 유전자 지도에 관련하여, 바이오B, 바이오F, 바이오C 및 바이오D 유전자는 프로모터-오퍼레이터 영역의 오른쪽에 있고, 바이오A 는 왼쪽에 있다. 프로모터-오퍼레이터 영역의 왼쪽에 있는 DNA 는, 바이오A 유전자의 하류에, 158 아미노산을 갖는 폴리펩티드를 코드하며 바이오A 유전자와 함께 전사되는 ORFI(ORF = 개방 판독 구조) 로 칭하는 또다른 유전자를 함유한다[Otsuka et al., J. Biol. Chem., 263, 19577-19585; 1988]. 후자 유전자의 기능은 아직 알려지지않았다. 살로넬라속 또는 시트로박터속의 예와 같은, 장내세균과로부터 다른 균주는 E.coli-유사 구조의 바이오틴 오페론을 갖는다 [Shiuan and Campbell, Gene 67: 203-211; 1988].
E.coli 의 클론된 바이오틴 오페론으로 전환된 미생물을 사용하여 수행되는 바이오틴의 생물공학적 제조방법은 이미 공개되었다. 상기 방법은 글루코스로부터 출발하여 수행된다. EP-B-236 429 호에는, 예를들면, E.coli 의 바이오틴 오페론으로, 바이오A/바이오R 유전자에 변이된 숙주생물로 전환된 전환된 미생물이 기재된다.
EP-A-316 229 호에는 아세테이트를 적게 생성하며 마찬가지로 클론된 바이오틴 오페론으로 전환된 E.coli 돌연변이체가 기재된다.
EP-A-449 724 호에는 바이오틴 오페론으로 전환되고 또한 글루코스 소비가 적은 돌연변이체인 미생물이 개시된다.
EP-A-226 240 호에는 바실러스 스페리쿠스 에서의 바이오틴 합성에 관여하는 유전자 클로닝 및 상기를 기재로 하는, 바이오틴 제조방법이 개시된다. 상기 방법은, 바실러TM 스페리쿠스 대사에 의해, 고가의 피멜산으로부터 출발하여 수행되어야 한다.
그러나, 개시된 생물공학적 방법에서 수득된 수율은, 아직 경제적인 관점에서 만족스럽지 않다.
그러므로, 바이오틴의 보다 높은 수율이 가능하고, 그러므로 보다 경제적인 바이오틴의 생물공학적인 제조방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다.
상기 목적은 장내세균으로부터 바이오B, 바이오F, 바이오C, 바이오D 및 바이오A 유전자를 함유하는 DNA 단편 및 벡터, 또는 그들의 기능적으로 동일한 변종 및 돌연변이를 사용하여 달성하는 것이고, 상기 유전자들은 전사 단체위체로서 조직된다.
전사 단위체는, 상기 연관에서 일방의 유전자가 전사 방향으로 배열하고 일반적인 전사 조절하에서 연속적인 전사체로 전사하는 DNA 서열을 의미하고, DNA 서열은, 관련 유전자외에, 프로모터 및 리보좀 결합부위와 같은 유전자 조절인자를 포함하며, 이는 유전자 발현을 위해 필수적이다.
기능적으로 동일한 유전적 변종 및 돌연변이는 고유 유기체, 즉 장내세균의 야생형 유전자로부터 유도된 유전자를 의미하고, 공지된 유전자 암호의 퇴화의 범주에서 염기 교환을 한다. 상기 형태의 염기 교환은 천연의 기원 또는 예를들어, 유전자 서열이 발현이 일어나는 특별한 미생물의 바람직한 코돈의 사용에 적용하기 위해 인위적으로 발생시킬 수 있다. 또한 유전자 변종 및 돌연변이는 염기의 결실, 도입 및 치환 또는 상기 변형된 서열의 유전자 생성물이 그의 기능을 기본적으로 유지하도록 하는 코돈을 포함한다. 서열은 특히 55 ∼ 66℃의 온도 및 0.03 ∼ 0.3 M의 염 함량의 보통의 혼성 조건하에서, 야생형 서열과 높은 유사성 정도를 갖는, 예를들어 야생형 서열과 70% 이상 혼성되는 서열을 포함한다.
제1도는 바이오틴 생합성의 대사 경로의 효소를 나타낸다.
제2도는 플라스미드 pBO30 의 구조도를 나타낸다.
제3도는 플라스미드 pBO30, pBO30A-9 및 pBO30A-15 의 바이오D 유전자의 3' 말단 부분 및 바이오A 유전자 5' 말단 (파선 화살표; 바이오A 출발 코돈을 밑줄긋고, 바이오D 정지 코돈은 점선으로 나타낸다)대한 DNA 서열과 함께 플라스미드 구조에서 상대적인 제한 효소의 절단 위치, 및 바이오A 유전자의 샤인-달가노 (Shine-Dalgano, SD) 서열을 나타낸다. 잠재적인 스템-루프 구조는 실선 화살표로 표시한다.
제4도는 사용된 제한효소의 절단 위치, 특히 샤인-달가노 서열(SD) 및 바이오B 출발 코돈(Met)을 나타내는, 증진된 리보좀 결합 부위를 구성하기위해 플라스미트 pbioB : : lacZ-2 로부터 출발하는 바이오B 유전자의 상류 서열을 변형시키는 단계를 나타낸다. 바이오B 유전자의 상류 서열 및 바이오B 유전자의 5' 말단을 표사한다. 파선은 삽입된 올리고 뉴클리오티드 985E를 표시한다. 교차되는 뉴클레오티드가 원칙적으로 존재하여야 하지만 플라스미드 pbioB : : lacZ/985E 및 플라스미드 pbioB : : lacZ/9 및 그로부터 유도된 pbioB : : lacZ/16 에서는 결실되고, 이는 BamHI 부위 (BamHI)가 손실을 초래한다. 필-인 ; 클리노우 폴리머라제로 채워진다.
제5도는 플라스미드 pBO30A-15/9△ 및pBO30A-15/9 orfI의 구조도를 나타낸다.
제6도는 바이오틴 생합성을 코드하는 플라스미드 pBO30A-15/9에서 유전자의 DNA 서열 및 아미노산 서열과 함께 유전자 조절요소(SD:샤인-달가노 서열)을 나타낸다. 바이오D15 유전자의 COOH 말단에 있는 이탤릭체의 아미노산은 E.coli의 바이오D 유전자의 야생형 서열과 비교하여 치환체를 나타낸다.
제7도는 플라미스드 pBO74-13 및 pBO3 으로부터 출발하는 플라스미드 pBO74△B 의 구조도를 나타내고; 화살표는 tac 프로모터 및 바이오 유전자의 위치 및 방향을 나타낸다. 플라스미드의 벡터 성분은 고딕체로 나타낸다. 파선은 바이오B 유전자의 삭제 정도를 나타낸다.
제2도 및 제5도에서의 약호: A : Act Ⅱ; B: BamH Ⅰ; Bg: Bgl Ⅱ; C: Cla Ⅰ; E: EcoR Ⅰ; H: Hind Ⅲ; K: Kpn Ⅰ; N: Nco I; Nr: Nru Ⅰ; P: Pst Ⅰ; S: Sno Ⅰ; Sa: Sal Ⅰ; Se: Sse Ⅰ; Sp: Sph Ⅰ; Ss: Ssp Ⅰ; 및 X: Xba Ⅰ. 필-인 : 클리노우 폴리머라제로 열성 3' 말단을 충진; mbn: 멍빈 뉴클리아제; Bal31 : 엑소뉴클리아제 Bal31 로 DNA 의 점진적인 삭제. 플라스미드의 벡터 성분은 고딕체로 나타낸다. 플라스미드에서 다른 어두운 부분은 다음의 클로닝 단계의 각 경우에서 사용된다. 화살표는 바이오 유전자의 위치 및 방향을 나타낸다.
본 발명에서 DNA 단면 및 벡터를 구축하기 위해, 바이오틴 오페론의 유전자는 처음에 적합한 미생물의 염색체로부터 편의상 단리하고 다음으로 단일 전사 단위체로 조직하기 위해 프로모터 및 리보좀 결합위치와 같은 유전자-조절인자의 조절하에서 함께 연관된다. 바이오 유전자를 단리시키기 위해 사용될 수 있는 출발물질은 예를들어, 에쉐리키아속, 살모넬라속 또는 시트로박터속과 같은 장내세균과로 부터의 세균주이다. 출발 물질은 편의상 가장 특징적인 에쉐리키아 콜라이종의 미생물이다.
본 발명의 DNA 단편 및 벡터의 구축은, 예를들면, E.coli와 같은 적합한 미생물의 유전자 은행으로부터 출발할 수 있고, 이로부터 그의 바이오 유전자 또는 그의 단편은 바이오 유전자의 부분적 서열을 함유하는 표지된 뉴클레오티드로 혼성시켜 공지된 방법으로 단리 및 클론시킬 수 있다. 다음으로, 단리 및 클론된 바이오 유전자는 단일 전사 단위체로서 존재하기 위해 통상의 프로모터 조절하에서 공지된 DNA 재조합법에 의해 연관된다. 바이오 유전자는 바이오B, 바이오F, 바이오C 및 바이오D 유전자의 하류에 바이오A 유전자가 위치하도록 서열시키는 것이 편리하고, 이는 이미 E.coli의 야생형 오페론에서 전사 단위체로 존재한다. 바이오B 유전자는, 바이오틴 합성효소중 전체 바이오틴 합성 경로의 주요 효소를 코드하는데, 탈티오바이오틴이 바이오틴으로의 전환은 아직가지 5-단계의 바이오틴 합성 경로의 속도-결정단계를 나타내기 때문이다. 바이오B 유저자는 그러므로 편의상 전사 단위체내에서 첫번째 유전자이고, 이는 상기 유전자의 최적 발현이 프로모터에 근접하여 일어날 수 있기 때문이다 (제 2, 4, 5 및 6 도).
바이오A 유전자를 함유하는 E. coli 의 야생형 바이오틴 오페론에서 두번째 전사 단위체는 또다른 유전자인, 158 개의 아미노산을 가지는 폴리펩티드를 코드하는 ORFI,를 포함한다. ORFI 유전자가 존재하지 않는 발현 플라스미드로 수행한 실험은 상기 유전자가 정상적인 발효조건하에서 바이오틴 생합성에는 주요하지 않다는 것을 보여준다. 그러나, 아직까지 기능이 공지되지 않은 상기 폴리펩티드가 또한 특정 조건하에서 바이오틴 합성에 역할을 하다는 것을 제외시킬 수는 없다. 본 발명의 DNA 단편에서 ORFI 유전자의 존재가 절대적으로 필수적인 것은 아니므로, 편의상의 구체화에 있어서 바이오 유전자를 갖는 전사 단위체는 더불어 또한 ORFI 유전자를 포함한다 (제 2, 5 및 6도).
본 발명의 DNA 단편 및 벡터에서 바이오 유전자는 E. coli의 천연 바이오틴 프로모터의 조절하에서는 유리하지 않다. 반대로, 전사를 증진시키기 위해, 바이오 유전자를 강력한 외부 프로모터의 조절하에 편의상 위치시킨다. 프로모터의 선택은 예를들면, 지속성 또는 유도성 발현이 요구되는지, 또는 발현이 일어나는 미생물과 같은 바람직한 발현 조건에 의존한다. 적합한 프로모터의 예로는 파지 람다의 프로모터, PL및 PR[Schauder et al., Gene 52: 279-283; 1987], 인접한 조절유전자 xylR 과 함께 슈도모나스 퓨티다의 TOL 플라스미드의 프로모터 pxylS [Franklin et al., J. Bacteriol. 154: 676-685; 1983], trc 프로모터 [Amann et al., Gene 69: 301-315; 1988], trp 프로모터 [Amann et al., Gene 25: 167-178; 1983], 정지상태에서 활성화되는 바실러스 서브틸리스의 프로모터 pdeg, [Dahl et al., J. Bacteriol. 173: 1539-1547; 1991] 및 프로모터 lacUV5 [Amann et al., Gene 25: 167-178; 1983] 가 있다. 바람직하게 선택된 프로모터는 tac 프로모터, trp 프로모터 및 lacUV5 프로모터의 혼성이고, 이는 구성성 또는 유도성 프로모터로서 사용될 수 있다 [Russell and Bennett, Gene 20: 231-243; 1982].
상기 기재된 바람직한 서열에서 바이오A 유전자의 발현은 또한 전사 단위체내에서 지속적인 바이오D 및 바이오A 유전자사이의 거리가 가능한한 짧을수록 즉, 바람직하게는 50 bp (염기쌍) 보다 적을수록 증진될 수 있다. 놀랍게도, 탈티오바이오틴 (DTB) 합성효소의 COOH 말단을 코드하는, 바이오D 유전자의 3' 말단의 서열이 동시에 하기에 바이오A 유전자의 리보좀 결합부위를 포함하는 경우, 발현이 특히 높다는 것을 발견하였다. 그들이 동시에 바이오D 및 바이오A 유전자의 판독 구조가 중첩되는 것이 유리하다. 상기의 상황은 바이오D 유전자의 3' 말단을 바이오A 유전자의 상류 리보좀 결합부위로, 및 적절한 경우 바이오A 유전자의 5' 말단으로 대체시키는 방법으로 바이오A 유전자의 5' 말단과 바이오D 유전자에 대한 리보좀 결합부위를 함께 접합시켜 수행될 수 있다(제3도 및 제6도; 서열 ID 번호; 1, 6 및 8-15). 상기 효과는 접합된 DTB 합성 효소의 COOH 말단이 효소의 활성을 잃지않고 교환될 수 있으므로 보다 더욱 놀랍다. 유사한 중첩은 또한 바이오B, 바이오F, 바이오C 및 바이오D 유전자의 판독 구조사이의 E. coli의 야생형 바이오틴 오페론에서 발견된다.
바이오B 유전자의 발현은 또한 리보좀 결합부위를 바이오B 유전자의 상부에 최적위치시키므로서 최적화될 수 있다. 상기는 바이오B 유전자가 이미 예를들어 tac 프로모터와 같은 강력한 프로모터의 조절하에서 있는 구축으로부터 출발하는 것을 편의상 필요로한다. 바이오B 유전자의 리보좀 결합위치의 최적화, 즉 샤인-달가노 서열 및 구조 유전자의 5' 말단으로 부터의 거리의 교대는, DNA 재조합의 통상의 방법에 의해 일어날 수 있다. 해독상 특정한 리보좀 결합부위의 영향은 지금까지 공지된 방법, 예를들면 유전자를 lacZ 유전자로 시험되도록 하는 유전자 접합 및 발생성의 반응물 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토피라노시드 (X-Gal) 와의 분석으로 측정될 수 있다.
전사 단위체에서 바이오 유전자를 포함하는 DNA 단편은 공지된 DNA 재조합 방법에 의해 수 많은 벡터에 결합시킬 수 있다. 예를들면, 플라스미드 pBO30A-15/9 (제5도 및 제6도, 서열 ID 번호: 1 및 6; 실시예 1.5.2) 및 pBO47 (실시예 1.7) 은 상기의 방법으로 수득된다. 플라스미드 pBO30A-15/9를 수탁번호가 각각 DSM 7246 및 7247 인 E. coli XL1-블루(Blue) 및 E. coli BM 4162 로서 Deutsche Sammlug fr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 에 1992 년 9 월 28 일자로 수탁하고, 수탁번호 DSM 8554 인 E. coli ED 8767 로서 1993 년 9 월 17 일자로 수탁했다. 플라스미드 pBO47을 수탁번호 DSM 8555 인 아그로박테리움/리조비움종 HK4 로서 Deutsche Sammlug fr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH 에 1993 년 9 월 17 일자로 수탁했다.
선택된 벡터의 성질에 의존하여, 바이오틴 합성 경로의 효소 유전자는 각종 유기체에서 발현될 수 있다. 적합한 벡터는 특정 숙주 스펙트럼를 가지는 벡터 및 광범 숙주 스펙트럼(넓은 숙주 범위 을 가지는 벡터이다.
예를 들어 E. coli 같은 특정한 숙주 스펙트럼을 갖는 벡터의 예로는, pBR322 [Bolivar et al., Gene 2: 95-113; 1977], pUC18/19 [Yanisch-Perron et al., Gene 33: 103-119; 1985], pK18/19 [Pridmore, Gene 56: 309-312; 1987] 및 pRA95 [Nycomed Pharma AS, Hvidovre, Denmark 로 부터 수득] 이다.
넓은 숙주 범위 벡터를 수용할 수 있는 벡터는 그람-음성 세균에 적합한다. 상기의 넓은 수주 범위벡터의 예로는 pRK290 [Ditta et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 7347-7351], pKT240 [Bagdasdrian et al., Gene 26: 273-282; 1983], pLAFR1 [Long et al., Nature 298: 485-488; 1982] 및 pRK290X [Alvarez-Morales et al., Nucl. Acid. Res. 14: 4207-4227; 1986] 과 같은 pRK290 의 유도체, pMMB66EH[Frste et al., Gene 48: 119-131; 1986] 또는 pGSS33 [Sharpe, Gene 29: 93-102; 1984]와 같은 pKT240 의 유도체이다.
발효용 증식성 균주를 생성하기위해, 즉 바이오틴 제조용 균주, 는 본 발명에 따른 DNA 단편을 발현에 적합한 바람직한 숙주 균주로 주입시켜야 한다. 바이오 유전자의 발현에 적합한 미생물은, 바람직하게는 폭넓은 반응물질 스펙트럼을 갖는 균주로서, 예를들면, 장내세균, 바람직하게는 종으로서 에쉐리키아, 또는 라조비움, 아크로박테리움, 리조비움/아크로박테리움, 아시네토박터, 아조토박터, 슈도모나스 및 코마모나스의 미생물이 있다. 특히 바람직한 미생물은 E. coli 리조비움/아크로박테리움종, HK4 (EP-B 158 194 호에 기재), 슈도모나스 멘도시나, 슈도모나스 아에루기노사 또는 아시네토박터 칼코라세티쿠스종이 있다. 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 벡터 분자상에 또는 그의 크로모좀으로 통합시켜 함유할 수 있다. DNA 단편을 미생물로의 주입은 예를들면, 전환 또는 접합에 의해 일어날 수 있다. 선택된 미생물은 본 발명의 DNA 단편을 함유하는 벡터로 공지된 방법에 의해 편의상 전환된다. 적합한 증식 균주의 예로는 각각이 플라스미드 pBO30A-15/9를 함유하는 E. coli XL1-Blue, E. coli BM4062 및 E. coli ED8767 (DSM 7246, DSM 7247 및 DSM 8554) 및 플라스미드 pBO47을 가지는 아크로박테리움/리조비움종 HK4 (DSM 8555) 이다.
전환된 숙주 균주는 숙주 균주가 벡터상 또는 DNA 단편에 존재하는 표식 유전자에 의해 저항성을 갖는 항생제를 첨가한 선택성 영양배지로부터 편의상 단리시킨다.
바이오틴의 생명공학적 제조방법은 본 발명의 벡터 또는 DNA 단편을 함유하는 미생물을 사용하여 수행한다. 바이오틴 제조방법은 특정 미생물의 성장물질로서 적합한 탄소원으로부터 출발하는 배양액에서 통상적인 방법으로 수행되고 마침내 바이오틴으로 전환된다. 탄소원으로서 예를들면 글루코스 또는 글리세롤의 단순 당분자가 특히 적합한다. 따라서, 예를들면, 영향 효모 배지(NYB: 영양배지 No. 2, 옥소이드, 25 g/l; 효모 추출물, 옥소이드, 5 g/l) 또는 글리세롤 및 글루코스 최소배지와 같은 시판되는 배지를 성장 배지로서 사용하는 것이 가능하다.
바이오틴 제조인, 발효는 소위 공급-배치법으로, 즉 배양액을 누출시키지않아도, 연속적으로 또는 간헐적으로, 신선한 영양물을 함유하며 일정부피의 유동적 공급하는 배치 발효를 수행하는 것이 바람직하다. 상기 유형의 방법에서 공급 으로서 특정한 생물량 성장에 적합한 각종의 유입속도로 글리세롤 용액을 공급하는 것이 바람직하다.
발효는 특정 미생물에 의해 생리적으로 내성된 pH 및 온도의 범위에서 수행된다. pH는 6 내지 8의 범위내 및 온도는 20 내지 45℃의 범위내가 적합하다.
바이오틴 수율은 또한 배지에서 영양물을 다양화시키므로서 및 통상적인 방법으로 특정한 미생물의 발효조건을 적응시키므로서 증진될 수 있다.
본 발명은 또한 바이오틴 합성 효소를 사용하는 세포-프리 시스템에서 탈티오바이오틴을 바이오틴의 전환을 포함하는 바이오틴 제조방법에 관한 것이고, 이중 전환은 티아민 피로포스페이트, NADPH, S-아데노실메티오닌, Fe2+이온, 시스테인 및 아스파라긴, 아스파산, 글루타민 및 세린으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 아미노산의 존재하에서 수행된다.
바이오틴 합성효소는 정제된 형태로 또는 세포 주출물의 형태로 사용될 수 있다. 세포 추출물 또는 정제된 바이오틴 합성효소는 바이오틴 합성효소를 고가로 발현하는 균주, 예를들면 플라스미드 pBO30A-15/9를 갖는 E. coli XL1-Blue (DSM 7246) 으로부터 수득하는 것이 편리하다. 세포 추출물의 제조 및, 적절하게는 바이오틴 합성효소의 정제는 생화학적으로 통상적인 방법, 예를들면 세포의 균질화법, 겔 여과법, 황산암모늄 분획법 및 이온 교환 크로마토그래피로 수행될 수 있다.
바이오틴 합성효소를 사용하는 세포-프리 시스템에서 탈티오바이오틴을 바이오틴으로의 전환은 조인자 및 아미노산을 첨가하여 전환을 수행하는 경우에 있어서만 양호한 수율로서 수행될 수 있다.
전환을 위해 필요한 조인자는 S-아데노실메티오닌 (SAM), 티아민 피로포스페이트 (TPP), 환원된 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 포스페이트 (NADPH) 및 Fe2+이온을 포함한다. 조인자는 1 내지 500μM 의 농도로 첨가하는 것이 편리하다. 또한, 디티오트레이톨(DTT) 혼합물을 0.1 내지 10mM의 농도를 첨가하는 것이 편리하다.
전환을 위해 요구되는 아미노산을 황 공급체로서 시스테인, 및 아스파라긴, 아스파산, 글루타민 및 세린으로 구성된 군으로부터 하나 이상의 아미노산이다. 아스파산은 아스파산염으로 첨가하는 것이 바람직하다. 시스테인은 10 내지 500μM 의 농도로, 및 다른 아미노산은 1 내지 50mM의 농도로 첨가하는 것이 편리하다.
또한, 탈이오바이오틴의 바이오틴으로의 전환은 플라보독신 및 페레독신(플라보독신)-NADP+환원효소의 존재하에서만 정제된 바이오틴 합성효소를 사용하여 수행된다고 알려졌다. 그러므로, 바이오틴 합성효소가 세포 추출물의 형태로 사용되지 않는 경우에 특히, 전환을 위해 플라보독신 및 페레독신 (플라보독신)-NADP+환원효소을 첨가하는 것이 적합하다. 플라보독신 및 페레독신 (플라보독신)-NADP+(EC No. 1. 18. 1. 2)는 공지된 방법, 예를들어 황산암모늄 분획법 및 다음으로 이온 교환 크로마토그래피로 수득될 수 있는 단백질로 알려져 있고, E. coli의 세포 추출물으로 부터의 바이오틴 합성효소의 발현과는 독립적이다. 그러므로서, 예를들면, 고가로 바이오틴 합성효소가 발현되는 플라스미드 pBO30A-15/9를 갖는 E. coli XL1-Blue (DSM 7246), 및 바이오틴 합성효소 유전자 바이오B 가 삭제된 플라스미드 pBO74△B를 갖는 E. coli XL1-Blue (DSM 7245) 로부터 플라보독신 및 페레독신 (플라보독신)-NADP+환원효소를 단리하는 것이 가능하다 (제7도). 플라스미드 pBO74△B 는 수탁번호DSM 7245인 E.coli XL1-Blue 로서 Deutsche Sammlug furMikroorganismen und Zellkulturen GmbH, D-3300 Braumdchweig, Nascheroderweg 1b 에 1992 년 9월 28 일자로 수탁했다.
탈티오바이오틴의 바이오틴으로의 전환을 위해, 바이오틴 합성효소 이외에 다른 단백질이 필요하다는 것이 부가으로 발견되었고, 이는 E. coli 세포 추출물에 정상적으로 존재한다. 상기 단백질들은 황산암모늄 분획법에 의해 E. coli 세포 추출물로부터 45% 황산암모늄 포화상태에서 수득될 수 있는 단백질 분획에 존재한다. 플라스미드 pBO74△B를 갖는 E. coli XL1-Blue (DSM 7245) 으로부터 상기 형태의 단백질 분획을 단리하여 나타난 바와 같이, 바이오틴 합성의 발현은 상기 단백질의 존재를 위해, 및 수득하기 위해 필수적인 것은 아니다. 황산암모늄 분획한 후 수득한 침전은, 예를들어, 이온 교환 크로마토그래피 및 겔 여과 크로마토그래피와 같은 크로마토그래비법에 의해 또한 정제될 수 있다. 그러므로, 특히, 바이오틴 합성효소가 세포추출물의 형태로 사용되지않는 경우, 탈티오바이오틴의 바이오틴으로의 전환의 위환 혼합물에 상기 기재된 바처럼 수득될 수 있는 단백질 분획을 첨가하는 것이 적절하다.
전환은 적절하게는 효소가 생리적으로 할성화되는 pH 및 온도의 범위내의 적합한 완충 시스템에서, 바람직하게는 6∼9 의 pH 범위 및 4 내 지 50℃ 의 온도에서 수행된다.
본 발명은 하기의 실시예에서 또한 설명된다.
일반적 방법 :
제조업자의 지시에 따라 제한 효소를 3∼5 단위/μg DNA 으로 사용한다. 제한 절단부위의 결합을 위한 DNA 링커(Boehringer Mannheim 사 시판, FRG), 및 예를들어, DNA/DNA 혼성을 위한 탐침으로서 및 서열분석 반응을 위한 프라이머 로서 사용되는 합성 올리고뉴클레오티드(Microsynth, Windisch 사 시판, 스위스연방)의 표지 및 인산화는, Sambrook et al. 의 문헌 [Molecular Cloning: A laboratory manual. 2nd edition, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY; 11.31 and 5.68; 1989)에 의해 기재된 바와 같이 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제에 의해 수행된다. 연결 반응은 제조업자의 지시에 따라, T4 폴리뉴클레오티드 키나아제에 의해 수행된다.
DNA 서열분석은 Sanger et al. 의 체인-종말법 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 5463-5467; 1977]에 의해 수행된다. 모든 서열 분석 반응은 제조업자의 방법에 따라 미합중국 Biochemical 사 (Cleveland, OH, USA) 제 시쿼나제 키드(sequenase kit)에 의해 수행된다. 시쿼나제 (버전 2.0, 유전적으로 제조된 T7 DNA 폴리머라제)는 600 염기쌍 이상의 DNA 서열을 용이하게 판독할 수 있는 균질한 형태로 수득되고; dGTP 대신 뉴클레오티드 dITP를 사용하는 경우 GC-풍부 DNA 영역에서의 압착을 쉽게 파괴할 수 있다. 염기분석 반응용으로 사용되는 주형은, 원칙적으로, 벡터 M13mp18/19 (Yanisch-Perron et al., 1985, ibid) 또는 pBluescript KS+/SK+(apRlacZ' ; Stratagene 으로 부터 수득, La Jolla, 캐나다)의 단일-가닥 형태이고, 이는 Messing 의 문헌[Methods Enzymol. 101: 20-79; 1983] 에 기재된 바와 같이 단리한다. 이중-가닥 플라스미드 DNA 염기분석을 위해, 플라스미드 DNA 는 CsCl 농도구배 또는 Gene Clean (BIO 101, La Jolla, 캐나다) 에 의해 정제된다. α[35S]-dATP(NEN-Du Pont, NEG-034H) 는 방사능 표지된 뉴클레오티드로서 사용된다.
전기영동에 의한 분획법은 7 M 우레아 및 1 x TBE (90mM 트리스, 90mM 붕산, 2.5mM EDTA) 완충용액 함유 통상적인 4% 또는 6% 비스/아클릴아미드 겔, 또는 7 M 우레아 및 1.2 x TBE 완충용액을 함유하는 5% HydroLink Long Ranger (AT Biochem, Malvern, PA, USA, via Chemie Brunschwig, Basel) 의 겔상에서 수행한다. 겔은 550mm 의 길이 및 0.2mm 의 두께이고; 전기영동은 2100 V 의 전압 및 60℃의 온도의 항온장치를 갖춘 LKB 매크로포어 기구로 수행된다. 겔을 Whatman 3 MM 페이퍼 상에서 건조시키고 후지 RX 또는 애머샴 하이퍼 필름(Amersham Hyperfilm) βmax X-레이 필름으로 감광시킨다.
염색체외 DNA 는 Birnboiom 및 Doly [Nucl. Acid. Res. 7: 1513-1523; 1979]의 신속 알칼린 SDS (Miniprep) 방법에 의해 비교적 적은 양으로 단리되거나, 또는 Clewell 및 helsinki [Proc. Natl. Acad. Sci USA 42: 1159-1166; 1969]의 변형된 방법에 의한 염화세슘 밀도 구배 원심분리법으로 더 많은 양의 단리를 수행한다. 또한, 퀴아젠 팩(QIAGEN pack, DIAGEN 사제, Dussldorf (FRG))이 사용된다.
플라스미드 DNA를 E. coli로 전입시키기위해, 세포를 50mM CaCl 중에서 Cohen et al [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2110-2114; 1972]의 방법에 의해 감응하도록 제조한다. 플라스미드 DNA 의 전입 및 플라스미드-정착된 클론의 선택은 Sambrook et al. [1989; ibid. 1.82 - 1.84]에 기재된 바와 같이 수행된다.
단일 전사 단위체 중 E. coli 바이오틴 오페론의 클로닝
1.1 pBO1 및 M13bioD 의 구축
바이오 유전자를 클로닝하기 위해, 염색체 DNA를 E. coli DSM 498 (K12 야생형; Deutsche Sammlug fr Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) 로 부터 단리한다. 단리는 Hahn 및 Hennecke 의 문헌[Mol. Gen. Genet. 193: 46-52; 1984] 에 기재된 바와 같이 필히 수행한다. 다음으로, E. coli DSM 498 로 부터의 완전 DNA 2μg을 제한 효소 Pst Ⅰ 으로 절단한다. DNA 단편을 통상적인 방법으로 수평 0.7% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 분획하고 (Sambrook et al., 1989, ibid.; 6.19 내지 6.9) 및 유전자 스크린 (Gene Screen) 막 (nylon membranes from NEN-Du Pont) 으로 전이시킨다 [Southern, J. Mol. Biol., 98: 503-517; 1975]. 80℃ 의 진공 오븐에서 2 시간 동안 보온하여 건조된 필터상에 DNA를 고정시킨다. DNA 단편과 바이오 오페론의 동일성을 확인하기 위해, 바이오B 유전자 (Otsuka, A. J., Dissertation, University of California, San Diego, CA.; 1978)의 5' 말단의 서열에 상응하는, 25 뉴클레오티드-길이의 합성된 올리고뉴클레오티드인 서열 5'-GGCTCACCGCCCACGCTGGACATTG-3'을 탐침으로서 필터-결합된 DNA 와 혼성시킨다. 상기의 목적을 위해, 처음으로 상기 올리고뉴클레오티드 40 pmol을 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 v-[32P]-ATP(75μCi) 로 말단-표지시킨다. 필터-결합된 DNA를 방사능 표진된 탐침으로의 혼성을 Sambrook et al. 의 문헌 [1989, ibid, 9.52-9.55] 에 기재된 바와 같이, 실행한다. 상기 목적을 위해, DNA를 처음에 5 x Denhardt's 용액 (1 x Denhardt' s 용액 : 0.02% 소형철알부민, 0.02% 피콜, 0/01 % 폴리비닐피롤리돈), 6 x SSC 완충액 (1 x SSC : 150mM NaCl, 15mM 시트르산나트륨, pH 7.2) 및 150μg/ml 연어 정자 DNA으로 2 시간 동안 예비혼성시키고난 다음, 2 x Denhardt' s 용액 :6 x SSC, 0.5% SDS, 150μg/ml 연어 정자 DNA 로 18 시간 동안 혼성시키고, 2 x SSC, 0.1% SDS 로 2 시간 동안 세척하고 최종적으로 30 분씩 4회 세척한다. 온도는 모든 단계에서 65℃ 이다. 상기 써던 블랏에서 표지된 올리고뉴클레오티드를 5.4kb- 길이 Pst Ⅰ 단편으로 혼성시킨다.
상기 5.4kb Pst Ⅰ 단편을 바이오 오페론에 클론시키기 위해, 처음에 E. coli DSM 498 로 부터의 완전 DNA 50μg을 Pst Ⅰ 으로 절단하고 상기와 같은 0.7% 아가로즈 겔로 분획한다. 4.5kb 내지 6.5kb 크기의 단편을 겔로부터 잘라낸후 투석관에서 전기투석법에 의해 단리한다. 약 0.6μg의 상기 단편을 0.6μg 의 Pst Ⅰ - 절단 벡터 pHE3 와 연결시킨다 [Hennecke et al. Gene 19: 231-234; 1982]. 상기 벡터는 클로람페니콜 저항성 (CmR)을 갖는 유전자, pACYC184로 부터의 ColEl 레크리콘 (Chang and Cohen, J. Bacteriol, 134: 1141-1156; 1978) 및 PstⅠ 부위를 갖는 페닐알라닌-tRNA 합성효소를 위한 E. coli 유전자 pheS를 함유한다.
50 mM CaCl2중 E. coli RR28 (Hennecke et al., 1982, ibid.)의 감응세포 0.2 ml을 상기 연결 혼합물로 전입시킨다. E. coli RR28 은 염색체에서 변이된 pheS 유전자를 가지므로 성장배지에서 p-플루오로페닐알라닌 (pFphe) 에 저항성을 갖는다. 반면, RR28 이 pheS 야생형 유전자를 갖는 플라스미드 pHE3를 수용하는 경우, 균주는 pHphe 에 민감하다. DAN 단편의 pHE3의 PstⅠ 절단부위로의 삽입은 pheS 야생형 유전자를 절단하고; 재조합된 플라스미드를 갖는 RR28 은 그러므로 pHphe-저항성(pFpheR)을 갖는다. 전입된 세포를 pHphe 최소 배지 (7.1 g/l Na2HPO4, 13.6g/l KH2PO4, 0.014 g/1 CaCl2x 2H2O, 0.25 g/l MgSO4, 1.58 g/1 (NH4)2SO4, 15 g/l 아가, 4 g/l 글루코스, 0.005 g/1 티아민, 0.05/l 루이신, 0.05 g/1 프롤린, 0.2 g/l D, L-p-플루오로페닐알라닌, 0.02 g/1 클로람페니콜; Hennecke et al., 1982, ibid)에 평판시키고 pheS 유전자에 삽입된 플라스미드 pHE3 (CmR)(pFpheR)를 함유하는 약 2500 CmRpFpheR클론이 단리된다. 상기 클론중 600 개는 20㎍/ml의 Cm을 함유하는 영양배지 (NA) 평판 (NA : 40g/1 의 혈액 아가 염기 (옥소이드), 5 g/1의 효모 추출물 (옥소이드)) 위에 까는 니트로셀룰로스 필터위로 레플리카 복사된다. 세포를 용해시켜 자유로와진 DNA를 결합시킬수 있도록 콜로니 (3∼5 mm 지름) 가 자라는 필터를 Grunstein 및 Hogness 의 문헌 [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72: 3961-3965; 1975] 에 기재된 바와 같이 처리한다. 용해되어 고정된 E. coli 세포를 갖는 필터를 상기-기재된 25 뉴클레오티드 길이 및32P-표지된 바이오B 올리고뉴클레오티드와 혼성시킨다. 혼성은 Sambrooks et al. 의 문헌 [1989, ibid, 11.00]에 기재된 바와 같이 콜로니 혼성을 위한 변형된 방법, 즉 예비혼성, 혼성 및 4 x Denhardt's 용액, 6 x SSC, 100μg/ml 연어 정자 DNA에서 일차 세척한 다음, 2 x SSC로 6회 세척, 에 따라 수행된다. 온도는 65℃ 이다. 3개의 클론이 바이오B 올리고뉴클레오티드와 결합하고; 5.4kb-길이의 PstⅠ 단편을 갖는 플라스미드 pBO1 (제2도)를 상기 클론중 하나로부터 단리시킨다.
제한 분석 및 공표된 데이터 (Szybalski 및 Szybalsik, Gene 19: 93-103; 1982)와의 비교는 pBO1가 바이오D를 제외하고 바이오 오페론의 유전자를 모두 함유한다는 것을 나타낸다.
바이오D 유전자를 클론하기위해, pBO1 로부터의 520 bp-길이의 SphⅠ/PstⅠ 단편으로 구성된 바이오C 및 바이오D 유전자의 일부분인 탐침이 사용된다. 상기 단편은 아가로조겔로부터 단리되고, 0.2μg 의 단리된 단편은 DNA 폴리머라제 Ⅰ의 닉(nick)- 해독[Boehringer Mannheim 사제, FRG; E. coli로 부터의 전효소; 소위 콘버그(Kornberg) 폴리머라제가 DNase Ⅰ과 함께 사용된다] 및 25μCi dml α-[32P]-dATP (NEN-Du Pont 사 제, NEG-012H)에 의해 방사능 표지된다 [Sambrook et al., 1989, ibid. 10.8]. SspⅠ에 의해 생성된 E. coli DSM 498 염색체의 제한효소 단편을 상기 탐침으로 하는 써던 블랏에서의 혼성은, 한편으로는 pBO1으로 부터 공지된 바이오F 및 바이오C 의 1.6 kb SspⅠ 단편을, 다른 한편으로는 바이오D 의 1.1 kb SspⅠ 단편 및 인접한 uvrB 유전자의 서열을 나타낸다 [Sancar et al., Cell 28: 523-520; 1982].
1.1 kb SspⅠ 단편을 클론시키기 위해, 다시 한번 유전자 은행을 제조한다. 상기 목적을 위해, 30 μg의 E. coli DSM 498 로 부터의 DNA을 SspⅠ로 절단하고 0.7% 아가로즈 겔에서 분획시킨다. 0.9kb 내지 1.3kb 크기의 단편으로 절단하여 0.7% 아가로즈 겔에서 전기영동한다.
0.5μg 의 상기 단편들을 0.5 μg 의 SmaⅠ-절단 파아지 벡터 M13mp19(Yanisch-Perron et al., 1985, ibid.) 와 연결시킨다. 상기 연결 혼합물을 Messing 의 방법 [Methods Enzymol., 101: 20-79; 1983] 에 의해 E. coli JM109 (Yanisch-Perron et al., 1985, ibid.)로 감염시키는데 사용된다. 삽입 (LacZ-표현형)을 갖는 150 파아지를 단리하고 NYB 배지에서 성장시킨다. E. coli 세포를 가라앉힌 후, 각각의 50μl 상층액중의 파아지를 Schleicher Schll사의 미니 폴트(minifold) I 기구를 사용하여 니트로셀룰로스 필터 (Schleicher Schll BA 85) 로 도트 블랏 (dot blot)한다. 파아지를 변성시키기 위해, 필터를 0.1M NaOH/1.5 M NaCl 완충용액으로 5 분간 처리한 다음 0.5 M 트리스-HCl, pH 7.5/2.5 M NaCl (5분)으로 중성화시킨다. DNA를 80℃로 가온하여 필터에 고정시킨다 (2 시간). 필터를 문헌 [Sambrook et al., 1989, ibid., 9.52-9.55]에 기재된 바와 같이 방사능 표지된 520 bp-길이 SphⅠ/PstⅠ 단편으로 60℃에서 혼성시킨다. 상기의 방법으로, 바이오D 유전자를 함유하는 상기-기재된 1.1 kb SspⅠ 단편을 포함한 파아지 클론 M13bioD를 확인한다(제2도).
1.2 pBO2 의 구축
각각의 경우에 있어서, 0.5μg 의 플라스미드 pBO1 및 0.5㎍의 파아지 M13bioD를 제한효소 noⅠ 및 HindⅠⅡ로 절단하고, 일체의 혼합물로써 재연결시킨다. 상기 혼합물을 E. coli RR28로의 전입후, 재조합 플라스미드를 제한효소 분석에 의해 조사한다. 하나의 플라스미드, pBO2를 설별하여 (제2도), 이중 바이오D 유전자의 부분을 함유하는 pBO1 의 일종의 약 1.5kb - 길이 SnoⅠ/HindⅡ 단편 및 벡터 pHE3의 비필수 서열을 M13bioD 로 부터의 0.95 kb - 길이 SnoⅠ/HindⅡ 단편으로 치환시킨다. 분석은 플라스미드 pBO2가 E. coli 내에 존재하는 완전한 바이오 오페론과 함께 바이오D 하류의 uvrB 프로모터 (Sancar et al., Cell 28: 523-530; 1982)의 서열을 포함한다는 것을 나타낸다.
1.3 pBO3 및 pBO6의 구축
pBO2를 갖는 E. coli RR28은 잘 성장하지 않고 NA 평판에서 pBO1 보다 눈에 띄게 작은 콜로니를 형성하는것이 관찰되었다. 상기에 가능한 이유로 pBO2의 uvrB 서열이 있다. 상기의 uvrB 서열을 제거하기 위해 20μg 의 pBO2 DNA를 HindⅡ로 절단하여 150 μ1의 Bal31 완충용액(600 mM NaCl, 12.5 mM MaCl3, 12.5 ml CaCl2, 1 mM EDTA, 20 mM 트리스-HCl, pH 7.2)에 흡수시킨다. 그리고나서, 직선형 프라스미드의 절두 단계를 위해서, Bal31(Alteromonas espejiani 로 부터 Boehringer Mannheim, FRG)를 첨가한다. 30℃에서 3, 6, 9, 12 및 15분간 향온시킨 후, 분주를 각각 30μl 씩 제거하고, 각각의 경우에 2 μl의 0.5M EGTA (에틸렌 글리콜-비스-(2-아미노에틸)테르라아세트산), pH 7.5을 첨가하여 Bal31 반응을 중단시키고, 및 다음으로 페놀 추출한다. 분주를 40μl의 멍빈 뉴클리아제 완충용액 (30 mM 아세트산 나트륨, 50mM NaCl, 1 mM ZnCl2, 5% 글리세롤, pH 4.6)에 첨가하고, 멍빈 뉴클리아제(Boehringer Mannhime, FRG)를 37℃에서 10분간 처리하여 쌍을 이루지않는 단일-가닥 말단을 제거하여 비특이성 평체말단을 생성시킨다.
Bal31의 처리는 uvrB 서열 뿐아니라 pHE3의 필수 서열을 제거한다. 상기의 이유로, Bal31로 절두된 pHE3의 벡터 DNA 이 부분을 제거시키기 위해 절두된 pBO2 플라스미드를 멍빈 뉴클레아제 처리 후 EcoRI으로 절단한다. 고유한 벡터 서열은 BamHI으로 제한, 멍빈 뉴클리아제 처리 및 EcoRI으로 또다른 제한 후, pBO2로 부터 단리시키고 이전의 pHE3의 삭제된 필수 벡터 서열인 1.5kb DNA 단편에 처리된 pBO2 플라스미드를 연결시켜 재생성시킨다. 상기 연결은 벡터의 Cm 저항성을 완전히 회복시키므로, 온전한 플라스미드는 Cm 저항성을 부여하는 그들의 성질에 의해 확인될 수 있다.
E.coli RR28을 연결혼합액으로 전입시키고, 20μg/ml 의 Cm 을 함유하는 NA 평판배지에 플레이트한다. 전형적인 pBO2 처럼 작고, 천천히 성장하는 콜로니, 및 크고, 정상적으로 성장하는 콜로니가 관찰된다. pBO2 분량 당 큰 콜로니의 수는 Bal31 배양 기간에 따라 증가한다.
플라스미드 DNA를 22 개의 정상적으로 성장하는 콜로니로부터 단리시키고, 제한효소 분석 및 서열분석에 의해 조사한다. uvrB 영역이 각각 약 330bp 및 410 bp 삭제되었으나 여전히 완전한 바이오D 유전자를 갖는 플라스미드 pBO3 및 pBO6를 상기 방법으로 수득한다.
1.4 전사 단위체 중 바이오 유전자의 클로닝
1.4.1 pBO22 의 구축 : 바이오B 전단의 tac 프로모터
바이오B 전단에 적합한 프로모터를 결합시키기 위해, 바이오BFCD 유전자 전단의 불필요한 야생형 프로모터를 제거해야 한다. 이는 NcoⅠ으로의 절단에 의해 수행될 수 있고, 이는 동시에 바이오B 유전자의 개시코돈을 노출시킨다. 본 경우에서, 선택된 프로모터는 tac 프로모터(Russell and Bennetrt, 1982, ibid.)이고, 이는 구조성 및 유도성 프로모터로서 사용될 수 있고, E.coli 뿐아니라 많은 그람-음성 세균에서도 매우 양호한 활성을 갖기 때문이다.
tac 프로모터, 및 HindⅢ 및 BamHI 의 말단을 갖는 DNA 단편은 파마시아-LKB 사 (Uppsala, Sweden) 으로부터 구입하고, HindⅢ 및 BamHI-절단된 플라스미드 pUC18(Yanisch-Perron et al., 1985, ibid.)로 삽입시킨다. 플라스미드 pUC18/tac 가 생성된다. (제2도). 그리고 나서, 상기 플라스미드 8μg을 BamHI으로 절단하여, 결여된 3' 말단을 채우기 위해, 각각의 경우에 100μM dATP, dGTP, dCTP, 및 dTTP를 첨가한 클리노우 폴리머라제 완충용액 (20 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl2, 6mM β-메르캅토에탄올)중에서 클리노우 폴리머라제(E.coli의 DNA 폴리머라제 I ; Boehringer Mannheim FRG)와 함께 항온시킨다. AatⅡ로의 두번째 제한효소반응을 다음으로 수행한다. 상기의 방법에서 tac 프로모터를 갖는 0.55kb-길이의 DNA 단편을 단리시키는 것이 가능하다.
바이오B, 바이오F, 바이오C 유전자 및 바이오D 유전자의 5' 말단을 갖는 3.2kb 단편은 pBO1 으로부터 단리시킨다. 상기의 목적을 위해, 8μg의 pBO1을 NcoI으로 절단시키고, 다음으로, 결여된 3' 말단을 채우기위해, 상기와 같이 클리노우 폴리머라제로 처리한다. PstI 으로의 두번째 제한효소반응을 다음으로 수행하고, 생성된 3.2kb 단편을 단리시킨다. 마지막으로, 4μg의 벡터 pHE3을 Psti 및 AatⅡ으로 절단시키고, pHE3으로부터의 P15A 레플리콘 (Hennecke et al., 1982, ibid.)을 단리시킨다.
상기 세개의 단편을 하나의 혼합물중에 동량의 부착단 및 평체말단의 연결을 위해 T4 리가아제 (Boehringer Mannheim, FRG) 로 처리하며, 각각의 경우에서 PstI 부착단과 PstI 부착단 및 AstⅡ 부착단과, AatⅡ 부착단의 연결 및 클리노우 폴리머라제 처리후, BamHI 및 NcoI의 평체말단을 연결시킨다. BamHI 및 NcoI 절단부위는 클리노우 폴리머라제를 사용하여 채워진 BamHI 말단과 동일한 방법으로 처리된 NcoI 말단을 연결하여 재성성된다. E.coli RR28은 상기 연결 혼합물로 전입되고, CmR으로 선별된다. Cmr에 대한 피전환체으로 부터의 플라스미드 DNA를 제한효소분석에 의해 조사한다. tac 프로모터가 바이오B 유전자 전단에 위치한 플라스미드 pBO21 (제2도)는 상기의 방법으로 수득된다. 플라스미드 벡터 pHE3 및 pUC18으로부터의 불필수 서열을 갖는 pBO21로부터의 1.5kb-길이의 HindⅢ 단편의 삭제는 pBO22를 생성한다 (제2도 ).
1.4.2 pBO27 및 pBO28 의 구축
5μg의 pBO22를 PstⅠ으로 절단하고, 부착 PstⅠ 말단을 멍빈 뉴클리라제로 처리하여 평체말단으로 절두시킨다. SnoI으로 절단한 다음 생성된 6.8kb-길이 DNA 단편을 단리시킨다. 바이오D 유전자의 3' 말단을 갖는 0.76 kb DNA 말단을 ClaI 으로 제한효소 처리후 5μg 의 pBO3 으로부터 단리시키고, 클리노우 폴리머라제를 사용하여 부착 ClaI 말단을 채우고 SnoI 으로 제한효소 처리한다. 두대의 DNA 단편을 T4 DNA 리가아제를 사용하여 연결한 다음, 연결 혼합액을 E. coli에 전입시킨다. 클로람페니콜로의 선별 후, 플라스미드 pBO27을 제한효소 분석 후, CmR을 갖는 피변형체로부터 수득한다. 상기 플라스미드는 전사 단위체내에 바이오B, 바이오F, 바이오C 유전자 및 완전한 바이오D 유전자와 함께 tac 프로모터를 함유한다 ( 제2도 ).
pBO27에서 BamHI 절단 부위를 삭제하기 위해, 5μg의 pBO27을 BamHI으로 절단하고, 상기 기재한 바아 같이 클리노우 폴리머라제 및 뉴클레오티드 dGTP 와 함께 항온시킨다음, 멍빈 뉴클리아제로 처리한다. 상기 DNA를 T4 DNA 리가아제로 연결반응하고, E.coli DH5 에 전입시켜 (Hanahan, J. Mol. Biol. 166: 557-580; 1983) BamHI 절단 부위가 삭제된 플라스미드 pBO28을 수득하고, 반면, NcoI 절단 부위는 남아있다 (제2도).
1.4.3 M13bio18 및 M13bio18/13의 구축
바이오A 유전자 선단의 불필요한 야생형 프로모터를 삭제하기 위해, 처음에 바이오B, 바이오F, 바이오A 및 ORFI 유전자를 갖는 4.4.kb 단편을 5μg 의 pBO3를 BglⅡ 및 KpnI으로 제한효소 처리하여 단리시킨다. 0.5μg 의 상기 단편을 0.5μg 의 BamHI- 및 KpnI-절단된 파아지 벡터 M13mp18 에 연결시킨다 (Yanisch-Perron et al., 1985, ibid). 상기 혼합액의 E. coli JM109 로의 전입후(Yanisch-Perron et al., 1985, ibid.), 삽입부를 가진 재조합된 파아지 클론을 Messing 방법 (1983, ibid.)에 의해 기재된 바와 같이 확인한다; 상기 클론으로 부터의 이중-가닥 파아지 DNA를 단리시키고 제한효소 분석에 의해 조사한다. 상기 방법에서, 생성된 4.4kb 단편을 갖는 파아지 M13bio18이 수득된다 (제2도).
파이지 M13bio18 의 이중-가닥 DNA 25μg을 NcoI 으로 제한효소 처리하여 직쇄화시키고, 160μl의 Bal31 완충용액중에 흡수시킨다음, Bal31을 첨가하여 바이오D 프로모터를 삭제시킨다. 25μl 의 각 분량을 실온에서 20, 40, 60, 80, 100 및 120 초 동안 향온시킨 후에 제거하고, 2μl의 0.5 M EGTA, pH 7.5를 첨가하고, 페놀 추출하여 Bal31 반응을 중단시킨다. 각각의 경우에서, 3 분량을 혼합하여 바이오B 및 바이오F 유전자를 삭제하기 위해, Xbal 으로 절단한다. 다음으로, DNA를 부착 5' 말단을 펴에 말단으로 채우기위해 클리노우 폴리머라제로 처리한다. 상기 방법으로 처리된 DNA를 재연결시키고, E.coli JM109 에 연결된 DNA를 전입시킨다. 단일-가닥 DNA를 24 파아지 클론으로부터 단리시키고 (Messing, 1983, ibid.), 바이오A 유전자의 5' 말단에서 DNA 서열은 Sanger et al. 의 방법으로 분석한다. (1977; ibid.). 바이오A 유전 전단에 양생형 프로모터를 삭제하고, 동이에 바이오A 유전자로부터 26 bp 상류에 SalⅠ 절단부위를 갖는 파이지 클론 M13bio18/13을 상기 방법으로 수득한다 (제2도).
1.4.4 M13bioDA의 구축
전사 단위체의 바이오D 및 바이오A 유전자를 배열하기위해, 5μg의 플라스미드 pBO6 (제2도)를 SphI 및 SalI으로 절단한다. 바이오D 유전자 및 SalI 말단까지 바이오D 유전자 하류의 72bp DNA를 함유하는 생성된 0.97 kb-길이 DNA 단편을 단리한다. DNA 단편을 T4 리가아제로 연결하고, E. coli JM109로 전입시킨다. 이중-가닥 파아지 DNA를 24 재조합 클론으로부터 단리시키고 제한효소 분석을 통해 특성화시킨다. 바이오D 및 바이오A 유전자가 98bp 거리만큼 떨어진 클론 M13bioDA를 상기의 방법으로 수득한다(제2도).
1.4.5 pBO30의 구축
바이오 유전자 전단에 tac 프로모터를 갖는 전사 단위체를 구축하기 위해, M13bioDA로부터 5μg의 DNA를 EcoRI 으로 절단하고,폴리머라제로 처리하여 상기와 같은 부착 EcoRI 말단을 채우고나서 SnoI으로 절단한다. 바이오D, 바이오A 및 ORFI 유전자를 갖는 생성된 2.5 kb-길이 DNA 단편을 단리시킨다. 5μg의 플라스미드 pBO28(제2도)를 SalI으로 절단하고, 멍빈 뉴클리아제로 처리하여 부착 SalI 말단을 삭제한 다음 SnoI 으로 절단한다. 백터 DNA, tac 프로모터 및 바이오BFC를 갖는 6.7kb-길이 DNA 단편을 단리시킨다.
단리된 DNA 단편을 T나 DNA 리가아제로 연결시키고, 바이오틴-영양요구변이 균주 E. coli SA291 (Cleary and Campbell, J. Banteriol. 112: 830-839; 1972)에 상기 연결 혼합액을 전입시킨다. 플라스미드에 완전한 바이오틴 오페론을 갖는 클론을 20㎍/ml 의 Cm 및 8㎍/ml 의 아비딘을 함유하는 NA 평판배지위에 깔아서 선별한다. 상기 클론으로 부터의 플라스미드는 제한효소 분석에 의해 검토한다. 바이오B, 바이오F, 바이오C, 바이오D 및 바이오A 유전자, 및 전사 단위체에 tac 프로모터를 함께 갖는 ORFI 유전자를 함유하는 플라스미드 pBO30을 상기 방법으로 단리시킨다(제2도).
1.5 바이오 유전자의 증진된 발현을 갖는 플라스미드의 구축
1.5.1 pBO30-A 및 pBO30A-15의 구축
바이오A 유전자에 의해 코드되는 DAPA 아미노트랜스퍼라제는 플라스미드 pBO30을 갖는 E. coli DS410 (Dougan and Sheratt, Mol. Gen. Genet. 151: 151-160; 1977)의 미니세포에서 바이오틴 합성을 위한 다른 효소보다 비교적 더 약하게 발현된다. 바이오A 유전자의 발현을 증진시키기 위해, 스템-루프(stem-loop) 구조와 같은 가능한 저해 서열을 삭제하기 위해 엑소뉴클리아제 Bal31 로 바이오D 유전자 및 바이오A 유전자 사이의 거리를 단축시킨다. 상기의 목적을 위해, 25μg 의 pBO30을 SalI으로 절단시키고나서 엑소뉴클리아제 Bal31 및 상기 기재된 클리노우폴리머라제로 처리한다. SalI 절단부위는 합성된 올리고뉴레오티드와 SalI 링커인 서열 5'-CGTCGACG-3' 과 연결하여 재생성시킨다. DNA를 SalI 및 SnoI 으로 절단한 다음, 3' 말단이 절두되고 약 640 bp의 길이인 바이오D 단편을 단리시킨다. 상기 단편은 pBO 30으로 이루어진 8.25kb 크기의 단편과 연결되어 있고, 이것은 SalI 및 SnoI으로 상기 플라스미드를 절단한 후, 단리될 수 있고, 불변의 바이오A 유전자를 함유하고 있다.
상기 바이오틴-영양 요구 변이 균주 E. coli SA 291 은, 60μg/ml Cm과 5μg/ml 아비딘을 갖는 NA 평단 배지위에서 결함이 없는 바이오D 유전자를 갖는 클론을 선별하기 위해, 상기 연결 혼합액을 전입시켰다. 제한 효소 분석을 통해 조사된 클론 중 26개를 수득하였다. SalI 부위로부터 위로 영역의 명백한 단축 작용을 갖은 클론 중 8개의 클론은 DNA 서열 분석을 통해 더 정확하게 특징된다. 상기 클론 중 5 개에서 바라던대로 바이오D 및 바이오A 유전자 사이의 DNA의 약 20 내지 45bp가 소실된다. E. coli 미니 세포에서 상기 클론은 실제로 pBO30 에 비해 인자 2만큼 상승된, 바이오A 유전체의 발현을 일으킨다. 이와같이 증진된 발현을 갖는 플라스미드를 위한 예는 이와 같이 얻은 플라스미드 pBO 30A-9이다 (제3도).
놀랍게도, 그외 3개의 플라스미드가 단리되고, 이것 내에 바이오D 유전자 및 바이오A 유전자 사이의 DNA의 70 내지 90bp가 소실된다. 그러므로 상기 소실은 바이오D 유전자까지 충분하다. 이로 부터 (i) 효소 활성의 커다란 변화없이 DTB-합성효소의 각각 다른 COOH-말단과 (ii) 바이오A 레저라스터를 갖는 변경된 바이오D 유전자의 겹침이 결과한다. 이러한 방식으로 예를들면 바이오D 유전자-돌연변이 바이오D 15를 갖는 플라스미드 pBO 30A-15가 수득된다 (제 3, 5 및 6 도). pBO 30A-15를 갖는 E. coli 미니 세포에서 바이오A 발현은 pBO 30과 비교할 때 인자 4 만큼 상승되었다.
바이오DA 영역의 DNA 서열 및 여기에서 파생된, 플라스미드 pBO30, pBO30A-9 및 pBO30A-15의 아미노산 서열이 제3도에 명시된다 (서열 ID 번호 9-16).
1.5.2 바이오B 유전자 앞의 증진된 리보좀 결합 부위를 갖는 플라스미드의 구축
바이오B 유전자의 해독을 증진하기 위해, 이 유전자의 발현은 pBO30에서 예를 들어 바이오D 유전자의 발현보다 분명히 더 약화되고, tac 프로모터와 리보좀 결합 부위를 포함하는 상기 서열은 pBO 30에서 바이오B 유전자의 위로 변형되고, 상기 리보좀 결합 부위는 클론된 tac 프로모터 단편에 포함되어 있다. 게다가, 가변의 서열을 가진, 합성의, 소위 혼합된 또는 믹스된 올리고뉴클레오티드가 유전자 바이오B 앞에 놓였다. 양호한 리보좀 결합 부위의 간단한 선택을 위해, 해독한 바이오B : : lacZ 유전자 융합, pbio30 : : lacZ-2를 가진 시험 플라스미드가 이용되었다. p 바이오B: :lacZ-2는 벡터 부분에, 리보좀 결합 부위를 갖는 tac 프로모터에서, 그리고 유전자 바이오B의 5'-말단에서 플라스미드 pBO 22와 동일하다(제2도). 그러나, 바이오B-구조 유전자의 뉴클레오티드 326에 따른 NruI-절단 부위에 바이오 유전자의 3'-말단과 나머지 바이오 유전자가 소실되고 E. coli의 lacZ 유전자가 형성되었으므로 (Casadaban et al., Methods Enymol. 100 : 293-308; 1983), 바이오B 및 lacZ 는 올바른 라저라스터에서 바이오B: :lacZ 융합 보호의 발현을 위해 융합되었고, NruI 절단 부위가 재생성되었다.
플라스미드 pbioB: :lacZ-2 안에 여러 단계로 서열 5'-CATGGAATCCTCCACTGATCAGTAC-3'를 갖는 올리고뉴클레오티드 985가 삽입된다 (제4도). 게다가 pbioB : : lacZ-2는 먼저 BamHI으로 절단된 다음, 상기 언급된 바처럼 교착 BamHI 말단이 클리노우 폴리머라제로 충진된다. 이러한 단계의 경우에 분명히 잔여 구아닌은 비특이하게 소실되고, 이것은 나중의 플라스미드에서 BamHI-절단 부위의 손실을 결과한다. KpnI 링커를 삽입한 후, E. coli XL1-블루 [Bullock et al., Biotechniques 5: 376-379; 1987]에 연결 혼합액을 전입시켰고 플라스미드 pbioB : : lacZ/KpnI는 단리되었다. 상기 플라스미드는 NcoI 으로 부분적으로 절단된 후 KpnI으로 절단된다. 올리고뉴클레오티드 985 E 와의 결합 후 두 번째 DNA-스트링 (String)은 클리노우 폴리머라제로 충진된다. E. coli XL1-블루의 전입 및 20μg/ml Cm, 30μg/ml X-Gal 및 0.5 mM IPTC(이소프로필티오갈락토시드)를 갖는 NA 평판 배치 위에서 선택한 후, 상기 플라스미드 pbioB : : lacZ/985E가 단리될 수 있다 (제4도).
리보좀 결합 부위가 제한 효소를 통해 KpnI 및 SpeI으로 삭제되고 3 개의 서로 다른 혼합된 올리고뉴클레오티드 SD17, SD 19 및 SD 21을 통해 대체 되도록하여, 플라스미드 pbioB : : lacZ/985E를 계속 변화시킨다 (제 4 도). 상기 올리고뉴클레오티드에 연결시킨 후, 두 번째 가닥의 갭은 클리노우 폴리머라제와의 항온반응에 의해 채원진다. E. coli XL-Blue 세균 세포에 상기 DNA를 전입시키고 20μg/ml의 Cm, 30μg/ml 의 X-Gal 및 0.5mM IPTG를 함유하는 NA 평판 배지에 상기와 같이 깐다. 상기 매질에서 암청색 콜로니를 형성하는, 바이오B : : lacZ 융합 단백질의 우수한 발현을 갖는 20 클론은, 선별되고, 상기 클론의 β-갈락토시다제 활성은 Miller 방법 (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., pages 352-355; 1972)에 의해 기재된 효소 분석에 의해 측정된다. 상기 목적을 위해, 바이오 : : lacZ 플라스미드를 갖는 E. coli균주는 600nm에서의 광학밀도(OD600) 약 0.5 까지 액체 배지에서 예비 배양시켰다.
최고의 β-갈락토시다제 활성은 p바이오b : : lacZ-2 와 비교할 때, β-갈락토시다제 활성이 2.1, 3.4 및 5.9의 인자로 각각 증가하는 p바이오B : : lacZ/985E, p바이오B : : lacZ/16 및 p바이오B : : lacZ/9에 의해 나타난다(제4도). 상기 플라스미드에서 바이오B 유전자에 대한 최적의 리보좀 결합부위의 DAN 서열은 Sanger et al. (1977, ibid.) 의 방법에 의해 결정된다.
전사 단위체에서 최적의 리보좀 결합부위를 바이오 유전자와 결합시키기 위해, 각각의 경우에서 5μg의 p바이오B : : lacZ/985E, p바이오B : : lacZ/16 및 p바이오B : : lacZ/9는 ClaI 및 NruI 으로 절단하고, tac 프로모터를 갖는 550 bp-길이 DNA 단편, 특정 리보좀 결합 부위 및 바이오B 유전자의 5' 말단을 단리시킨다. 동시에, 5μg의 플라스미드 pBO30△A(제5도)는 ClaI 및 NruI 으로 절단하고, 7.7 kb-길이 DNA단편을 단리시킨다. pBO30으로부터 유래된 pBO30△A에서, 대부분의 바이오A 유전자를 갖는 SalI/BamHI 단편 및 저해되는 NruI 절단부위를 삭제한다 (제5도). 두개의 단편을 연결시키고, 재조합 플라스미드를 갖는 클론을 단리시킨다. 플라스미드 pBO30△A/9, pBO30△A/16 및 pBO30△A/985 는 상기의 방법으로 수득된다. 제 5 도는 p바이오B: : lacZ/9로 부터의 리보좀 결합부위를 갖는 pBO30△A/9의 예에서 처럼 상기 형태의 구축을 나타낸다.
각각 2μg의 플라스미드 pBO30△A/9, pBO30△A/16 및 pBO30△A/985E를 SnoI 및 KonI 으로 절단하고, 부분으로만 절단시키기 위해 KpnI은 적은 양으로 사용한다. 각각의 경우에서, 벡터 DNA, tac 프로모터, 증진된 리보좀 결합부위를 갖는 바이오D 유전자 및 바이오FC 유전자를 함유하는 6.6kb-길이 DNA 단편이 단리된다. 플라스미드 pBO30△A-15(4μg)을 SnoI 및 NcoI로 절단하고, 바이오DA-ORFI 유전자를 갖는 2.8kb 단편을 연결시키고, E. coli RR28 에 연결혼합액을 전입시킨다. 완전한 바이오틴 오페론을 갖는 재조합 플라스미드를 제한효소 분석에 의해 확인한다. 플라스미드 pBO30A-15, pBO30A-15/16 및 pBO30A-15/985E는 상기의 방법으로 수득된다. 상기 모두는 플라스미드 p바이오B : : lacZ/9, p바이오B : : lacZ/16 및 p바이오B : : lacZ/985E 각각으로 부터의 상응하는 최적의 리보좀 결합부위를 갖는 pBO30A-15로부터 최적의 바이오DA 영역을 함유한다. tac 프로모터 및 바이오B 유전자에 직접 연결된 최적의 리보좀 결합부위를 조합하여 효율적인 발현을 나타내는, 즉 상기 플라스미드에서의 유전자 조절인자는 하기의 서열을 갖는다 :
제5도는 pBO30A-15/9 구조의 예에서 최적의 리보좀 결합부위와 함께 바이오B, 바이오F, 바이오C, 바이오D 및 바이오A 유전자를 함유하는 플라스미드의 구조를 나타낸다.
pBO30A-15/9에서 바이오 유전자의 완전한 전사 단위체는 서열화된다. 서열 및 그로부터 유래된 유전자 생성물은 제6도에 서술된다(서열 ID 번호:1-8).
1.6 pBO30A-9△orfI의 구축
2μg 의 플라스미드 pBO30△A/9를 상기 처럼 SnoI 및 KpnI 으로 절단하고, 6,6 kb-길이 DNA 단편을 단리시킨다. 4μg 의 플라스미드 pBO30A-15를 SspI으로 절단한다. 생성된 직쇄 DNA와 5'-CGGTACCG-3' 인 KpnI 링커의 연결은 바이오A 유전자의 하류에 새로운 KpnI 위치의 삽입을 생성한다. SnoI 으로의 절단 후, 바이오DA 유전자를 갖는 2.1 kb 단편을 단리시킨다. 단리된 DNA 단편을 연결시키고, E. coli RR28 에 연결 혼합액을 전입시킨다. 바이오BFCDA 유전자를 갖는 재조합 플라스미드를 제한효소분석으로 확인한다. ORFI 유전자가 삭제된 pBO30A-15/9△orfI를 상기의 방법으로 수득한다(제5도).
1.7 플라스미드 pBO47의 구축
5μg의 플라스미드 pBO30A-15/9를 제한효소 XbaI 및 EcoRI 으로 절단한다. tac 프로모터 및 바이오틴 오페론을 갖는 5.8kb 크기의 생성된 제한 단편을 단리시키고, 다음으로 넓은-숙주 범위 플라스미드 pPK290X (Alvarez-Morales et al., Nucl. Acid. Res. 14, 4207-4227, 1986: XhoI 제한위치의 삭제 및 동일한 부위에서 Xbal 위치를 삽입에 의해 변형된다)에 연결시키고, 이는 Xbal 및 EcoRI으로 절단된다. 연결 혼합액을 E. coli S17-1(Simon et al., Biotechnology 1: 784-791; 1983)에 전입시키는데 사용한다. 재조합 플라스미드는 제한효소분석에 의해 특징화되고; pRK290X 에 결합된 바이오틴 오페론을 함유하는 플라스미드 pBO47을 상기의 방법으로 수득한다.
플라스미드 pBO47을 균주 E. coli S17-1/pBO47과의 접합에 의해 세균 균주 리조비움/애그로박테리움종 HK4, 슈도모나스 몬도시나, 슈도모나스 애루기노사 PA01 (Holloway, J. Gen. Microbiol. 13: 572-581; 1955) 및 아시네토박터 칼코아세티쿠스 DSM 588로 전이시킨다.
1.8 pBO74△B의 구축
바이오B 유전자가 삭제된 플라스미드 pBO74△B의 구축은 플라스미드 pBO74-13 으로부터 출발하여 수행한다 (제7도). 플라스미드 pBO74-13 은 pBO30과 동일한 DNA 축조 블럭으로 구성된다 (제2도). 그러나, 플라스미드 pBO74-13 내부의 바이오 유전자는 상이하다.
5μg의 플라스미드 pBO74-13를 SmaI으로 절단한다. 페놀/클로로포름으로 추출한 후, 플라스미드 DNA를 SphI으로 절단하고, 벡터 DNA tac 프로모터 및 바이오A-ORFI 및 바이오CD 유전자를 함유하는 6kb 단편을 단리시킨다. 18μg의 플라스미드 pBO3 (제2도)를 SspI 및 SphI 으로 절단하고, 바이오F 유전자 및 바이오C 유전자의 부분을 갖는 1.66kb 단편을 단리시킨다. 단리된 단편들을 함께 연결시키고 E. coli RR28 에 연결 혼합액을 전입시킨다. 재조합 플라스미드는 제한 효소 분석에 의해 분석한다. 바이오B 유전자의 삭제에 의해 플라스미드 pBO74-13 와는 다른 플라스미드 pBO74△B는 상기의 방법으로 수득한다 (제7도).
[실시예 2]
체내의 바이오틴 발효
2.1 Escherichia coli 생산성 균주와의 체내의 바이오틴 발효
pBO30A-15/9 (DSM 7246)을 갖는 E. coli 균주 XL1-Blue의 세포를 650nm 에서의 광학밀도 (OD650)가 20이 될 때까지 유가 배치배양법으로 37℃, 30시간 동안 글리세롤 최소배지 (배양 초에 3% 글리세롤)에서 20ℓ MBR 발효기를 사용하여 배양시킨다. 플라스미드 pBO30A-15/9의 존재는 예비배양액(3ℓ의 글리세롤 최소배지)에 클로람페니콜(50μg/ml)을 첨가 및 발표의 배치상에 의해 확인한다. 글루코스 또는 숙시네이트(배치 발효상 초에 0.4%)와 같은 다른 탄소원을 사용하는 것이 실용적이다. 세포의 대사활성은 잇따른 그의 특이적 산소 수득율에 의한다. 발표동안 바이오틴의 생성은 락토바실러스 플란타룸(E. DeMoll and W. Shive, Anal. Chem. 158: 55-58, 1986)으로의 바이오에세이를 사용하여 발효 배지에서 바이오틴 수준을 적정한다.
상기 경우의 탈이온화수 중 50 %강도 글리세롤용액에서, 탄소원을 바이오매스의 특정한 성장에 적합한 다양한 유입율로 공급한다. OD 가 OD 1에서 OD 2로 증가하기 위한 배양액의 리터당 2g의 글리세롤의 경험적 수치는 글리세롤의 공급 속도를 근거로 사용된다.
발효기의 pH는 40% 강 H3PO4또는 25% 강 NH3를 펌핑하여 pH 7로 자동 조절된다. 통기는 바이오매스의 특정한 성장에 따라 10∼25 L(STP)/분 으로 공기를 불어넣고 교반기를 300∼700 rpm 으로 회전시켜 조절한다. 15 내지 40% 사이의 산호 포화도를 목적으로 한다. 배출 공기의 산소함량 및 CO2함량은 상자성적으로 측정되고 각기 적외선을 사용한다. 발효기의 온도는 37℃로 조절된다. 37℃에서, 배양주를 20 의 OD650까지 2.5시간의 더블링 시간을 성장한 다음 정지한다.
발효 동안, 35mg/l 의 D(+)-바이오틴이 25시간 내에 축적된다. E. coli 균주에서, 가치있는 바이오틴 합성은 성장중인 배양액에서만 일어날 수 있다.
또한 적합한 생산성 균주는 pBO30A-15/9(DSM 8554)를 갖는 E. coli ED8767 (N. E. Murray et al., Mol. Gen. Genet. 150: 53-61; 1975) 또는 pBO30A-15/9 (DSM 7247)를 갖는 E. coli BM4062 (D. F. Barker and A. M. Campbell, J. Bacteriol. 143: 789-800; 1980)이다.
유사한 방법으로 플라스미드 pBO3, pBO30 및 pBO30A-15/9△RFI가 시험되고 바이오틴 생산성이 측정된다. 하기의 표 1은 E. coli S17-1(야생형, 염색체상의 바이오틴 유전자) 및 E. coli S17-1/pBO3 (야생형 오페론과 같은 상이한 전사와는 다른 플라스미드의 바이오틴 유전자)와 비교하여, 전사 단위체에 바이오 유전자를 갖는, 플라스미드 pBO30, pBO30A-15/9 및 RFI를 갖는 균주의 바이오틴 생산성에 있어 대단한 향상을 나타낸다. 또한 실험은 ORFI 유전자의 부재는 바이오틴 생산성에 영향을 주지않는다는 것을 나타낸다.
글리세롤 최소 배치 배지(탈이온화된 HO 중)
a) 미량 원소 SLF의 농축용액(탈이온화 H2O 중)
b) Fe-EDTA의 농축용액(탈이온화 H2O)
항생제 공급 : (최종 농도)
100μg/ml 앰피실린 (나트륨염, Fluka) 및 50μg/ml 클로람페니콜(Fluka)
2.2 애그로박테리움/리조비움 생산성 균주 HK4/pBO47의 체내 바이오틴발효
바이오틴 생산성 플라스미드 pBO47 (DSM 8555)를 갖는 바이오틴 영양요구성 균주 애그로박테리움/리조비움종 NK4의 세포는 OD650가 70이 될 때까지 L-글루탐산/베타인 최소배지에서 유가-배치법으로 30℃의 2ℓ MBR 발효기에서 배양된다. HK4/pBO47는 성장이 매우 느릴때 조차도 (세포유지 성장), 상당히 안정된 바이오틴 합성율에 의해 특성화된다. 상기의 이유로, 상기의 실험에서 바이오매스의 배양은 대단히 감고된 탄소 공급의 오랜 유지상(500 시간)이 잇따른다.
지수 증식기를 지나 OD650가 12에 도달한 후, 장기간-지속 느린 성장 또는 세포유지 성장하도록 글루코스/베타인 공급 (탈이온수에 용해된 360g/l의 베타인)을 느린 속도(1.5ml/시간)으로 공급한다. 150-시간의 시간점에서, Fe2+글루토네이트를 최종농도가 100 mg/l이 되도록 발효기에 공급한다. 200, 360 및 550-시간의 시간점에서는, 10 ml의 염용액 및 1.36ml 의 표준 비타민용액을 공급한다.
발효기의 pH는 85% 강인산 또는 3M 수산화칼륨 용액을 펌핑하여 7로 자동조절한다. 통기는 산소팽압이 1∼4mg/l이 되도록 바이오 매스의 특정한 성장에 따라서 1∼3 L(stp)/분으로 공기를 주입하고 300∼1,000rpm으로 교반기를 회전하여 조절한다. 발효기의 온도는 30℃로 조절한다. 배양주응 5.6시간의 더블링 시간에 지수 증식상으로 및 300 시간의 더블링 시간에 극히 제한된 공급한 상으로 성장한 후, 세포유지 성장으로 전환된다.
발효의 초기에, 200 시간 및 415 시간 후, 디아미노펠라곤산을 배양액 (DAPA; 최종 농도 200μg/Ml로 2회, 마지막으로 최종농도 100㎍/ml)에 첨가한다. HK4 그자체는 바이오틴-영양요구주이다. 균주는 바이오틴 전구체 DAPA 로부터 탈티오바이오틴을 생성할 수 있고, 그것을 최종적으로 높은 수율의 D(+)-바이오틴으로 전환시킬 수 있다. 100mg/l의 D(+)-바이오틴이 축적된다. 여기에서 놀랄만한 사실은 상기 합성이 비-성장 세포에 의 압도적으로 수행된다.
글루탐산/베타인 최소배지
하기의 물질들이 1.25 리터의 탈이온수에 용해되거나 또는 첨가된다:
31.25g의 L-글루탐산 모노나트륨염 x H2O
12.g의 베타인
0.2g의 CaCl2
1.0g의 MgCl2x 6H2O
1.25g의 K2SO4
1.25ml의 미량 원소 SLF (실시예 2.1)
1.87ml의 Fe-EDTA (실시예 2.1)
0.25ml의 테트라시클린 (70% 에탄올 중 10mg/ml)
염 용액
0.3g의 CaCl2
0.16g의 MgCl2x 6H2O
0.2g의 K2SO4
200μl의 SLF (실시예 2.1)
300μl의 진한 HCl
(10 ml 의 탈이온화된 H2O에 용해)
표준 비타민 용액 (탈이온화된 H2O)
10 mg/l 피리독살 히드로클로라이드
5 mg/l 리보플라빈
5 mg/1 니코틴아미드
5 mg/l 티아민 히드록클로라이드
2 mg/1 바이오틴
5 mg/1 판토텐산
5 mg/1 4-아미노벤조산
2 mg/l 폴산
5 mg/1 비타민 B12
[실시예 3]
탈티오바이오틴으로부터 출발하는 바이오틴의 생성
(체외의 바이오틴 합성의 측정)
3.1 E. coli 세포 추출물의 생성
상기의 경우에서 플라스미드 pBO30A-15/9 를 갖는 E. coli XL1-Blue(DSM 7246)의 추출물 (추출물 Z) 및 플라스미드 pBO74△B를 갖는 E. coli XL1-Blue의 추출물(DSM 7245: 추출물 W)이 생성된다: 상기의 목적을 위해, 미생물 세포는 20g/l의 영양 브로소, 5g/l의 효모 추출물 및 20mg/l의 Cm을 함유하는 배지중 37℃, 800 l의 부피로 OD600가 2 까지 배양한다. 세포를 여과시킨 다음 5,000 x g로 15 분간 원심분리시켜 수거한다.
세포-프리 추출물을 생성하기 위해, 세포를 100mM HEPES 완충용액으로 세척하고, 동일한 완충용액에 재현탁시켜 OD600가 약 1,000이 되도록 조절하고 DNAse로 처리한다. 세포는 다음으로 100,000 pa의 지속적인 세포 분쇄기를 사용하여 파괴한다. 균등질을 20,000 x g 로 30분간 원심분리시키고 생성된 상층액을 -80℃에서 보관한다. 바이오틴 합성효소 반응을 직접적으로, 또는 세파덱스 G25M PD-10 의 컬럼(Pharmacia, 컬럼 부피 : 9.1ml)으로의 겔 여과에 의한 정제 후에 측정(에세이) 하기위해 추출물 Z가 사용되는 것이 가능하다. 추출물 W는 바이오틴 합성효소 반응의 에세이에 직접 사용하거나 또는 실시예 3.3 에서와 같이 분획되어진다.
3.2 바이오틴 합성효소 반응의 체외 에세이 (표준 에세이)
체외 에세이는14C-표지된 탈리오바이오틴 (0.1μCi: 1.95 나노몰)의14C-표지된 바이오틴으로의 반응 또는35S-표지된 시스테인 (20μCi: 1.32 나노몰)으로 비표지된 탈티오바이오틴의35S-표지된 바이오틴으로의 바이오틴 합성효소에 의한 반응을 연구한다. 상기 동안 형성된14C-바이오틴 또는35S-바이오틴의 측정은 추출후, 온라인 (on-line) 라디오케미칼 감지기상에서의 정량적 HPLC 에 의해 또는 박막 크로마토그래피에 의한 반정량적으로 및 오토라디오그래피에 의한 X-선 필름의 사용에 의해 용이하게 가능하다.
전형적인 표준 에세이는 세포-프리 추출물 Z 또는 W, 반응에 따라 표지된 또는 비표지된 탈티오바이오틴, 또는 단독으로 또는 서로 조합되어 그로부터 정제된 단백질 분획(실시예 3.7-33.9), 및/또는 SAM(92μM), Fe 글루코네이트 (200 μM), NADPH (100μM), TPP (100μM), DTT(1 mM) 및/또는 아미노산의 조합과 같은 통상적인 조인자를 포함한다.
분석되는 단백직 분획, 조인자 또는 아미노산을 최종 부피 250μl에 첨가한다. 향온을 4 내지 50℃ 사이에서 수행한다. 37℃에서 1 시간 동안 향온시킨 후, 수중 12 중량%의 트리클로로아세트산(TCA)를 첨가하여 반응을 중단한다. 침전된 단백질을 윈심분리하고 상층액을 메탄올(1 ml), 물 (1 ml) 및 수중 아세트산 (부피당 1%) 으로 평형화시킨 C18고체상 추출 컬럼(MACHEREY-NAGEL, 100mg)에 적하한다. 0.5ml의 메탄올로 탈티오바이오틴 및 바이오틴을 용출시키기 위해 상기 컬럼은 다음으로 1ml의 1% 강 아세트산 및 1 ml의 물로 세척한다. 생성된 시료는 진공 건조시킨 다음 정량적 분석을 위해 HPLC 로 25μl를 주입시키기 위해 30μl의 HPLC 완충용액 A (25mM KH2PO4, 5mM 테트라부틸 암모니움 클로라이드, pH 3.4)에 재현탁시킨다. HPLC 조건은 하기와 같다 Shandon Hypersil BDS C18컬럼 (입자 크기 : 5㎛, 컬럼 크기 10mm x 2.0mm), 흐름 속도 0.35 ml/분, 온도 40℃, 용리액: 아세토니트릴의 부피당 10%의 HPLC 완충용액 A.
용출되는 기류를 신틸에이션 측정 용액(Zinsser Quickszint Flow 303: 흐름 속도: 1.25ml/분)과 혼합시키고, 형성된 반응하지 않는14C-탈티오바이오틴 및14C-바이오틴, 또는 형성된35S-바이오틴은 감지되거나 정량된다(온라인 방사능활성 감지기:Berthold).
또달리, 시료는 박막-크로마토그래피 및 오토라디오그래피에 의해 반정량적으로 분석된다. 상기 목적을 위해, 시료는 10% 아세트산, 65% 메탄올 및 25% 물을 포함하는 혼합물 20ml에 재현탁시키고, 2.5㎕. 는 실리카겔 고성능 TLC 평판(E. Merck, Darmstadt). 평판 배지는 클로로모름(17 ml), 메탄올 (3 ml) 및 포름산(0.2 ml)을 포함하는 이동상으로 전개된다. 크로마토그래피 후, 평판배지를 건조시킨 다음 X-선 필름에 밤새 노출시킨다.
3.3 아미노산의 존재하에서 바이오틴 합성효소 반응
탈염화된 세포-프리 추출물 Z가 실시에 3.2 에 따라 탈티오바이오틴과, 및 조인자 SAM, TPP, NADPH 및 Fe 글루코네이트와 함께 배양되는 경우, 탈티오바이오틴의 바이오틴으로의 전환은 관찰되지 않는다. 실시예 3.4에서 특정된 조인자를 갖는 시스테인 (332 μM) 및 아스파라긴(15mM) 또는 시스테임 및 아스파테이트 (15mM) 또는 시스테인 및 글루타민 (15mM) 또는 시스테인 및 세린 (15mM)을 세포-프리 추출물에 첨가하면, 바이오틴 생성이 감지될 수 있다.
1) 탈염화
2) 조인자 : SAM, Fe , TPP, NADPH
3) 시스테인+아스파라긴 또는 시스테인+아스파테이트 또는
시스테인+글루타민 또는 시스테인+세린
3.4 하나 이상의 통상적인 조인자의 존재하에서 바이오틴 합성효소 반응
실시예 3.3에 기재된 것과 같은 동일한 탈염화된 세포 추출물을 L-시스테인, 아스파라긴, 탈티오바이오틴, SAM, TPP, NADPH 및 Fe 글루코네이트와 함께 배양하는 경우, 탈티오바이오틴이 바이오틴으로 전환된다. 바이오틴 합성효소 반응에 대한 상기 조인자들의 효과를 시험하기 위해, 그들을 단독으로 또는 서로의 조합으로 사용한다. 상기 모든 조인자들의 조합만이 바이오틴 합성효소 활성을 나타낸다. 조인자가 하나라도 없는 경우, 바이오틴 합성효소 활성은 측정될 수 없고, 이는 모든 조인자들이 바이오틴 합성효소 활성을 위해 필요하다는 것이다(실시예 3.3 표 Ⅱ).
3.5 바이오틴 합성효소의 정제
바이오틴 합성효소를 첨가하여, 몇몇의 단백질이 탈티오바이오틴을 바이오틴으로 전환하기 위해 관여한다는 것을 증명하기 위해, 처음에 세포-유기된 추출물 Z으로 황산암모늄 분획법을 수행한다. 상기는 4℃에서 30분간 교반하면서 25% 황산암모늄을 포화하여 수행된다. 그리고나서, 혼합물을 30분간 10,000 x g로 원심분리하고, 생성된 펠렛을 버린다. 생성된 상충액을 70%황산암모늄으로 포화시키고, 이에 의해 바이오틴 합성효소가 침전된다. 침전물을 소량의 100mM HEPES 완충용액(pH 7.5)에 재현탁시키고, 탈염(Sephadex G25M PD-10)시키고 100mM∼1M의 연속적인 농도구배의 HEPES 완충용액(pH 7.5)으로 음이온 교환 크로마토그래피(Q-Sepharose Fast-Flow, Pharmacia)에 의해 정제한다. 바이오틴 합성효소 활성을 갖는 분획을 농축(Amicon ultrafiltration cell, YM-10 membrane) 시키고, 이미 기재된 바와 같이 탈염화시킨 다음, Q-세파로즈 Hi-Load 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Pharmcia: 1 mM DTT 및 0∼1 M NaCl 농도구배를 함유하는 20mM 트리스 완충용액(pH 7.5))으로 재크로마토그래피한다. 높은 바이오틴 합성효소 활성을 갖는 분획을 모으고, 농축하여 탈염화시킨다. 상기의 분획에서, 바이오틴 합성효소는 바이오틴 합성효소 활성을 위해 필요한 다른 단백질과 더 이상 섞이지않는다.
정제 공정 동안 바이오틴 합성효소 활성을 측정하기 위해, 에세이 혼합물에 추출물 W를 첨가하는 것이 필요하다 (실시예 3.2). 따라서, 바이오틴 합성효소 외의 다른 단백질이 탈티오바이오틴의 바이오틴으로의 전환에 관여한다.
3.6 추출물 W로부터의 단백질의 분획
상기의 목적을 위해, 추출물은 45% 및 55% 황산암모늄 포화도로 지속적으로 침전시킨다. 황산암모늄의 첨가 후, 혼합물을 4℃, 30분간 교반하고, 다음으로 10,000 x g에서 30분간 원심분리시킨다. 45% 황산암모늄 포화도에서 수득된 침전물을 100mM HEPES 완충용액(pH 7.5)에 재현탁시킨다. 다음으로, 45% 침전물, 55% 침전물 및 55% 상충액의 분량을 제거하고 탈염화 (Sephadex G25M PD-10 컬럼) 시킨다. 개별의 분획율 실시예 3.2에 기재된 바와 같이 각각 및 서로 조합하여 에세이한다.
바이오틴 합성효소에 필요한 2 분획율 수득한다. 상기 분획은 하기와 같다 :
- 45% 황산암모늄 포화도로 부터의 침전물
- 55% 황산암모늄 포화도로 부터의 침전물
3.7 플라보독신의 정제 및 확인
추출물 W 로부터의 55% 황산암모늄 포화 후에 생성된 상충액(실시예 2.2)을 탈염(Sephadex G25M PD-10 컬럼)시킨 다음 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Q-Sephadex Fast-Flowl (Pharmcia))에 적하한다. 상기 컬럼은 이전에 1mM DTT를 함유하는 20mM 트리스 완충용액(pH 7.5)로 평형시켰다. 결합되지 않은 물질을 상기 완충용액으로 세척하여 제거된다. 컬럼에 결합된 단백질을 연속적인 NaCl 농도구배 (0∼1 M)로 용출된다. 용출된 단백질 분획을 모으고, 농축하고 (Amicon ultrafiltration cell, YM-10 membrane), 탈염화시키고 (Sephadex G25M PD-10), 다음으로 20 mM 트리스 완충용액(pH. 7.0, 1mM DTT 함유)로 평형시킨 모노 Q 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에서 정제시킨다. 정제된 분획을 SDS PAGE로 조사한다.
정제 공정중 요구되는 단백질을 함유하는 분획을 확인하기 위해 바이오틴 합성효소 에세이 시스템(실시예 3.2)은 정제된 바이오틴 합성효소, 단백질 또는 45% 황산암모늄 침전의 침전물로 부터의 단백질들, 아미노산(실시예 3.3) 및 저분자량 조인자(실시예 3.4)로 수행한다. 바이오틴 합성효소 활성은 요구되는 단밸질을 함유하는 분획에서만 측정될 수 있다.
다음으로, 상기 단백질의 아미노산 서열은 하기와 같이 측정된다. 단백질은 6 M 구아니딘 HCl 완충용액에서 4시간 동안 DTT로 환원된다. 생성된 시료는 요오드아세트산으로 카로복시메틸화된 다음 0.1% 이탄산암모늄에 대해 48 시간 동안 투석한다. 시료를 건조시킨 다음 7M 우레아 완충용액에서 돼지 트립신으로 절단시키고, 펩티드는 역상 HPLCDP 의해 분리된다. E. coli 플라보독신에 상응하는 DNA 서열을 갖는 2 펩티드를 확인하는 것이 가능하다. 상기의 정제 공정에 의해 균질한 플라보독신을 수득하는 것이 가능하다.
3.8 페레독신 (플라보독신)-NADP 리덕타제의 정제 및 확인
추출물 W를 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Q-Sepharose Fast-Flow (Pharmicia))에 적하한다. 상기 컬럼을 1mM TTP를 함유하는 20mM 트리스 완충용액(pH 7.5)으로 평형화시킨다. 컬럼에 결합된 단백질을 연속적인 NaCl 농도구배(0∼1M)으로 용출시킨다. 용출된 단백질 분획을 모으고, 실시예 3.7에서 처럼, 농축하고, 탈염화시키고 모노-Q 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼에 적하한다. 상기 컬럼에 결합된 단백질을 연속적인 NaCl 농도구배(20mM 트리스 완충용액 중 0∼0.4M)으로 용출시킨다. 모은 용출된 단백질 분획 (이미 기재된 바처럼 농축되고 탈염)을 다음으로 수퍼로스 12 프렙. 겔 여과 크로마토그래피 컬럼(Pharmcia; 20 mM 트리스 완충용액으로 평형) 및 세파크릴 HR100 겔 여과 컬럼 (Pharmcia; 20 mM 트리스 완충용액으로 평형)에 적하한다. 20mM 트리스 완충용액으로 용출 후, 또다른 균질 단백질을 수득하는 것이 가능하다 (SDS PAGE 로 조사). 상기 단백질을 함유하는 분획은 실시예 3.7에 기재된 에세이 시스템과 유사한 것으로 확인되었다. 바이오틴 합성효소 활성은 상기 분획의 첨가 후에만 측정된다.
상기 단백질의 N-말단의 아미노산의 서열을 확인하기 위해, 정제된 단백질을 직접 서열화시킨다. 단백질은 페레독신(플라보독신)-NADP 리덕타제의 것에 상응하는 N-말단 아미오산 서열을 갖는다. 상기 정제 공정에 의해 페레독신(플라보독신)-NADP 리덕타제를 균질하게 수득하는 것이 가능하다.
3.9 바이오틴 합성효소 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질의 강화
정제된 바이오틴 합성효소 (실시예 3.2)는 정제된 플라보독신 플러스 페레독신(플라보독신)-NADP 리덕타제 및 필요한 조인자를 갖는, 및 아미노산을 갖는 바이오틴 합성효소 활성이 없다. 활성을 성취하기 위해, 45% 황산암모늄 분획에서의 또다른 단백질 또는 단백질을 찾는다.
상기 단백질 또는 상기 단백질들은 45%의 포화도인 황산암모늄 침전물에 의해 세포-프리 추출물 W로부터 수득한다. 생성된 단백질 펠렛을 2mM DTT 및 TPP (1g/l)을 함유하는 pH 7.5의 20mM 트리스 완충용액에 재현탁시킨 다음 PD-10 컬럼 (Pharmcia) 로 탈염화시킨다. 탈염된 물질을 이전에 2mM DTT 및 TPP (1 g/l)을 함유하는 pH 7.5의 20mM 트리스 완충용액으로 평형시킨 음이온 교환 크로마토그래피 컬럼(Q-Sepharose HP Hi-Load)에 적하한다. 요구된 활성을 갖는 단백질 분획을 연속적인 NaCl 농도구배(0 mM ∼ 600mM)로 용출한다. 상기 단백질 분획은 다음으로 겔 여과 크로마토그래피 (Sephacryl HR-100 컬럼, Pharmcia)에 의해 더 정제시킨다. 그로 부터 수득한 단백질 펠렛을 100mM HEPES 완충용액(pH 7.5)에 재현탁시킨 다음 이미 기재된 바처럼 탈염화시킨다. 단백질 용액을 그로부터 수득하고 실시예 3.2에 기재된 바처럼 체외 에세이에 사용된다.
3.10 플라보독신, 페레독신(플라보독신)-NADP 리덕타제, 바이오틴 합성효소 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 아미노산 및 통상적인 조인자의 존재하에서 바이오틴 합성효소 반응
플라보독신, 페레독신(플라보독신)-NADP 리덕타제 및 바이오틴 합성효소 반응에 관여하는 단백질 또는 단백질들을 세포-프리 추출물 Z에 첨가한다. 단백질, 조인자 및 아미노산의 첨가는 바이오틴 합성효소 활성의 증가를 일으킨다 (표 3).
3. 11 플라보독신, 페레독신(플라보독신)-NADP 리덕타제, 바이오틴 합성효소 반응에 관여하는 하나 이상의 단백질, 하나 이상의 아미노산 및 통상적인 조인자의 조합의 존재하에서 정제된 바이오틴 합성효소와의 바이오틴 합성효소 반응
정제된 바이오틴 합성효소와의 바이오틴 합성효소 반응에 대한 상기 성분들의 효과를 시험하기 위해, 단독으로 또는 서로의 조합으로 사용된다. 조인자들은 실시예 3,4 에서와, 아미노산은 실시예 3.3 에서와 동일한 양으로 사용된다. 모든 상기의 성분들이 존재하는 경우, 탈티오바이오틴은 정제된 바이오틴 합성효소로 바이오틴으로 완전하게 전환된다. 상기 성분들중 하나라도 없는 경우, 활성은 측정될 수 없다. 그러므로, 모든 상기의 성분이 탈티오바이오틴을 바이오틴으로 전화하기 위해 요구된다(표 3).
서열 목록
(1) 일반 정보 :
(ⅰ) 출원인 :
(A) 성명 : 론자 아. 게.
(B) 거리 : 문헨슈타인슈트라쎄 38
(C) 도시 : 바젤
(E) 스위스 연방
(F) 우편번호 : 4002
(ⅱ) 제목 : 바이오틴의 생물공학적 제조방법
(ⅲ) 서열 번호 : 19
(ⅳ) 컴퓨터 판독 형태 :
(A) 매체 형태 : 플로피 디스크
(B) 컴퓨터 : IBM PC 적합
(C) 작동 시스템 : PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어 : PatentIn Release 바이오1.0.
버전 바이오1.25(EPA)
(ⅵ) 우선 출원 :
(A) 출원 번호 : CH 3124/92
(B) 출원일 : 1992 년 10 월 2 일
(ⅴ) 우선 출원 :
(A) 출원 번호 : CH 2134/93
(B) 출원인 : 1993 년 7 월 15 일
(2) 서열 ID 번호에 대한 정보 : 1:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 5,872 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 형태 : DNA (게놈)
(ⅲ) 가설 : 무
(ⅲ) 안티센스 : 무
(ⅵ) 원 공급원 :
(A) 유기체 : Escherichia coli
(B) 균주 : DSM498
(ⅶ) 직접 공급원 :
(B) 클론 : pBO30A-15/9
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : CDS
(B) 위치 : 117 . .1157
(C) 확인 방법 : 실험
(D) 이외 정보 : /코돈 출발= 117
/생성물= 바이오틴 합성효소
/증 거: 실 험
/유전자= 바이오B
/번 호= 1
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : CDS
(B) 위치 : 2295 . . 3050
(D) 이외 정보 : /코돈 출발= 2295
/기능=피멜로일-읾 합성에 관여
/생성물= 단백질
/유전자= 바이오C
/번 호= 3
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : CDS
(B) 위치 : 3750 . . 5039
(C) 확인 방법 : 실험
(D) 이외 정보 : /코돈 출발= 3750
/EC 번호= 2 . 6 . 1 . 62
/생성물= DAPA 합성효소
/증 거: 실 험
/유전자= 바이오A
/번 호= 5
/표준명= S-아데노실-L-메티오닌 : 8-아미노- 7-옥소 노나노에이트 아미노트랜스포
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : CDS
(B) 위치 : 5098 . .5574
(C) 확인 방법 : 실험
(D) 이외 정보 : /코돈 출발= 5098
/증 거: 비공지, 바이오틴 합성에 관여
/생성물= 단백질
/증 거: 실험
/유전자= ORFT
/번 호= 6
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : -10 시그날
(B) 위치 : 45. .49
(C) 확인 방법 : 실험
(D) 이외 정보 : /증 거 : 실 험
/표준명 : 프로모터 ptac
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : - 35 시그날
(B) 위치 : 23. . 28
(D) 이외 정보 : /표준명 : 프로모터 ptac
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : RBS
(B) 위치 : 105. .119
(C) 확인 방법 : 실험
(D) 이외 정보 : /증 거 : 실 험
/표준명 : 바이오B RBS 번호 9
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : RBS
(B) 위치 : 2284. .2297
(D) 이외 정보 : /표준명 : 바이오C RBS
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : RBS
(B) 위치 : 3742. .3752
(D) 이외 정보 : /표준명 : 바이오A RBS
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : RBS
(B) 위치 : 5088. .5100
(D) 이외 정보 : /표준명 : ORFI RBS
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : 터미네이터
(B) 위치 : 5583. .5644
(D) 이외 정보 : /표준명 = 로-독립적인 전사 터미네이터
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : 스템 루프
(B) 위치 : 5583 .. 5605
(ⅸ) 특징 :
(A) 명칭 : 프로모터
(B) 위치 : 1 . . 96
(C) 확인 방법 : 실 험
(D) 이외 정보 : /기 능 : 프로모터 ptac
/증 거= 실험
(ⅸ) 공 보 :
(H) 문서 번호 : WO 87/01391 B1
(I) 출원일 : 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일 : 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 1:
(2) 서열 ID 번호 : 2에 대한 정보:
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 346 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 2 :
(2) 서열 ID 번호: 3 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 251 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 3 :
(2) 서열 ID 번호: 4 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 429 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 4 :
(2) 서열 ID 번호: 5 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 158 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 5 :
(2) 서열 ID 번호: 6 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 5,872 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(B) 균주: DSM498
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론: pBO30A15-9
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 1154 . . 2308
(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보: /코돈 출발= 1154
/EC 번호= 2 . 3 . 1 . 47
/생성물= KAPA 합성효소
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/유전자= 바이오F
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/표준명= 8-아미노-7-옥소노나노에이트 합성효소
(ⅸ) 특징
(A) 명칭: CDS
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(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보: /코돈 출발= 3043
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/번 호= 4
/표준명= 탈티오바이오틴 합성효소
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 1141 . . 1156
(D) 이외 정보: /표준명= 바이오F RBS
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 3030 . . 3045
(D) 이외 정보: /표준명= 바이오D RBS
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 BI
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열기재: 서열 ID 번호: 6 :
(2) 서열 ID 번호: 7 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 384 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 7 :
(2) 서열 ID 번호: 8 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 236 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 8 :
(2) 서열 ID 번호: 9 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 143 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 형상: 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(Ⅲ) 안티센스: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론:PBO30
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 1 . . 24
(D) 이외 정보: /부분
/EC 번호= 6 . 3 . 3 . 3
/생성물=탈티오바이오틴 합성효소
/유전자=바이오D
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 120 . . 143
(D) 이외 정보: /부분
/코돈 출발= 120
/EC 번호= 2 . 6 . 1 . 62
/생성물=DAPA 합성효소
/유전자=바이오A
/슈도
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 111 . . 122
(D) 이외 정보:
/표준명= 바이오A RBS
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: 스템 루프
(B) 위치: 38 . . 85
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 B1
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 9 :
(2) 서열 ID 번호: 10 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 8 아미노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 10 :
(2) 서열 ID 번호: 11 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 7 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 11 :
(2) 서열 ID 번호: 12 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 93 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥 : 이중
(D) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(Ⅲ) 안티센스: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론:PBO30A-9
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 1 . . 24
(D) 이외 정보: /부분
/EC 번호= 6 . 3 . 3 . 3
/생성물=DTB 합성효소
/유전자=바이오D
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 70 . . 93
(D) 이외 정보: /부분
/코돈 출발= 70
/EC 번호= 2 . 6 . 1 . 62
/생성물=DAPA 합성효소
/유전자=바이오A
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 61 . . 72
(D) 이외 정보:
/표준명= 바이오A RBS
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 B1
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 12 :
(1) 서열 ID 번호: 13 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 8 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 14 :
(2) 서열 ID 번호: 14 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 7 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 14 :
(2) 서열 ID 번호: 15 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 77 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(Ⅲ) 안티센스: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론:PBO30A-15
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 1 . . 57
(D) 이외 정보: /부분
/코돈 출발= 1
/기 능= 변형된 3 ' 말단
/EC 번호= 6 . 3 . 3 . 3
/생성물=DTB 합성효소
/유전자=바이오D
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: CDS
(B) 위치: 54 . . 77
(D) 이외 정보: /부분
/코돈 출발= 54
/EC 번호= 2 . 6 . 1 . 62
/생성물=DAPA 합성효소
/유전자=바이오A
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 45 . . 56
(D) 이외 정보:
/표준명= 바이오A RBS
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 B1
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 15 :
(2) 서열 ID 번호: 16 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 18 아마노산
(B) 종류 : 아미노산
(C) 형상 : 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: 단백질
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 16 :
(2) 서열 ID 번호: 17 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 125 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 형상: 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(Ⅲ) 안티센스: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론:PBO30A-15/985E
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: -10 시그날
(B) 위치: 45 . . 49
(D) 이외 정보:
/표준명= 프로모터 ptac
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: 프로모터
(B) 위치: 1 . . 96
(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보:
/기 능= 프로모터 ptac
/증 명= 실험
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 B1
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 17 :
(2) 서열 ID 번호: 18 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 126 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 형상: 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(Ⅲ) 안티센스: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론: pBO30A-15/16
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: 프로모터
(B) 위치: 1 . . 96
(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보:
/표준명= 프로모터 ptac
/증 명= 실험
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 105 . . 123
(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보:
/증 명= 실험
/표준명= 바이오B RBS 번호 16
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 B1
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 18 :
(2) 서열 ID 번호: 19 에 대한 정보 :
(ⅰ) 서열 특징:
(A) 길이 : 122 염기쌍
(B) 종류 : 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 형상: 직쇄
(ⅱ) 분자 종류: DNA (게놈)
(ⅲ) 가설: 무
(Ⅲ) 안티센스: 무
(ⅳ) 원공급원:
(A) 유기체: Escherichia coli
(ⅶ) 직접 공급원:
(B) 클론: pBO30A-15/9
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: 프로모터
(B) 위치: 1 . . 96
(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보:
/기 능= 프로모터 ptac
/증 명= 실험
(ⅸ) 특징:
(A) 명칭: RBS
(B) 위치: 105 . . 119
(C) 확인 방법: 실험
(D) 이외 정보:
/증 명= 실험
/표준명= 바이오B RBS 번호 9
(ⅹ) 공보 정보:
(H) 문서 번호: WO 87/01391 B1
(I) 출원일: 1986 년 8 월 26 일
(J) 공보일: 1993 년 4 월 7 일
(xi) 서열 기재: 서열 ID 번호: 19 :
Claims (17)
- 유전자들이 하나의 전자 단위체에 바이오 B, F, C, D 및 A 순의 일방의 전사 방향으로 배열되고 일반 프로모터로부 터 전사되는 것을 특징으로 하는, 장내세균으로부터의 바이오틴 생합성 유전자인 바이오B, 바이오 F, 바이오C, 바이오D 및 바이오A를 포함하는 DNA 단편.
- 제 1 항에 있어서, 장내세균이 에쉐리키아속, 살모넬라속 및 시트로박터속으로 구성된 군으로부터 선택된 DNA 단편.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 장내세균이 에쉐리키아 콜라이종으로부터 선택된 DNA 단편.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 일반 프로모터가 tac 프로모터인 DNA 단편.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바이오B 유전자에 직접 연관된 전사 단위체의 유전자-조절인자가 하기의 서열을 포함하는 DNA 단편:
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바이오B 유전자에 직접 연관된 전사 단위체의 유전자-조절인자가 하기의 서열을 포함하는 DNA 단편:
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바이오B 유전자에 직접 연관된 전사 단위체의 유전자-조절인자가 하기의 서열을 포함하는 DNA 단편:
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 전사 단위체에서 지속성인 바이오D 및 바이오A 유전자 사이의 거리가 50bp 이하인 DNA 단편.
- 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 바이오D 및 바이오A 유전자가 바이오D 유전자의 3' 말단의 바이오A 유전자의 리보좀 결합부위를 포함하도록 배열된 DNA 단편.
- 수탁번호가 각각 DSM 7246, DSM 7247 및 DSM 8554로 기탁된 에쉐리키아 콜라이 XL1-블루(Blue), 에쉐리키아 콜라이 BM4062 또는 에쉐리키아 콜라이 ED8767 내의 팔라스미 pBO30A-15/9.
- 수탁번호 DSM 8555로 기탁된 애그로박테리움/리조비움종 HK4 내의 플라스미드 pBO47.
- 수탁번호가 각각 DSM 7246, DSM 7247 및 DSM 8554로 기탁된, 플라스미드 pBO30A-13/9를 각기 함유하는 에쉐리키아 콜라이 XL1-블루, 에쉐리키아 콜라이 BM4062 및 에쉐리키아 콜라이 ED8767.
- 수탁번호가 DSM 8555로 기탁된 플라스미드 pBO47을 함유하는 애그로박테리움/리조비움종 HK4.
- 제 12 항 또는 제 13 항에 기재된 미생물을 대사될 수 있는 탄소원을 함유하는 배지에서 배양하여 상기 탄소원을 바이오틴으로 발효시키는 것을 특징으로 하는 바이오틴 합성을 위한 생물공학적 방법.
- 전환이 티아민 파이로포스페이트, NADPH, S-아데노실메티오닌, Fe2+이온, 시스테인, 및 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민 및 세린으로 구성된 군으로 부터의 하나 이상의 다른 아미노산의 존재하에서 수행되는 세포-프리 시스템에서의 바이오틴 합성효소에 의한 탈티오바이오틴에서 바이오틴으로의 전환을 포함하는 바이오틴 제조방법.
- 제 15 항에 있어서, 전환이 플라보독신 및 페레독신(플라보독신)-NADP+리덕타제의 존재하에서 수행되는 바이오틴 제조방법.
- 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 전환이 에쉐리키아 콜라이의 세포 추출물의 45% 포화된 황산암모늄 침전물에 의해 수득될 수 있는 단백질 분획의 존재하에서 수행되는 바이오틴 제조방법.
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