JP2810016B2 - 制御可能な発現系、調節タンパク質、これをコードする遺伝子、発現カセット、それを含有する微生物、タンパク質の製造方法及び微生物の製造方法及び宿主株 - Google Patents
制御可能な発現系、調節タンパク質、これをコードする遺伝子、発現カセット、それを含有する微生物、タンパク質の製造方法及び微生物の製造方法及び宿主株Info
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、制御可能な発現
系、その製造方法及び使用に関する。
系、その製造方法及び使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】近代の遺伝子技術の重要な応用範囲は、
組み換え生産システムの使用下で特定のタンパク質の生
産である。このような組み換え生産システムは、少なく
とも２つの成分、つまりａ）タンパク質生産のために細
胞機構を提供する宿主、及びｂ）生産すべきタンパク質
についてコードする組み換えＤＮＡからなる。
組み換え生産システムの使用下で特定のタンパク質の生
産である。このような組み換え生産システムは、少なく
とも２つの成分、つまりａ）タンパク質生産のために細
胞機構を提供する宿主、及びｂ）生産すべきタンパク質
についてコードする組み換えＤＮＡからなる。
【０００３】公知の宿主系は、例えば微生物、動物、植
物又は真核細胞培養である。大量の組み換えタンパク質
の製造のために、宿主系として有利に微生物、例えば菌
又はバクテリア、特に有利にE. coliが使用される。
物又は真核細胞培養である。大量の組み換えタンパク質
の製造のために、宿主系として有利に微生物、例えば菌
又はバクテリア、特に有利にE. coliが使用される。
【０００４】特定のタンパク質の生産のための遺伝子情
報を有する組み換えＤＮＡは、宿主の染色体中へ組み込
まれているか、又はエピソームで、プラスミド、コスミ
ド又はファージ、もしくはウイルスの形で存在する。生
産すべきタンパク質についての遺伝子情報の他に、組み
換えＤＮＡは調節エレメント、いわゆるプロモーターを
有しており、このプロモーターは、構造遺伝子発現の最
初の工程、ＤＮＡ−配列のＲＮＡへの転写のために必要
である。プロモーター（特定の短いＤＮＡ−部位）は、
ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＤＮＡ−配列のＲＮＡへの転写
を触媒する酵素）に対する認識部位として利用される。
報を有する組み換えＤＮＡは、宿主の染色体中へ組み込
まれているか、又はエピソームで、プラスミド、コスミ
ド又はファージ、もしくはウイルスの形で存在する。生
産すべきタンパク質についての遺伝子情報の他に、組み
換えＤＮＡは調節エレメント、いわゆるプロモーターを
有しており、このプロモーターは、構造遺伝子発現の最
初の工程、ＤＮＡ−配列のＲＮＡへの転写のために必要
である。プロモーター（特定の短いＤＮＡ−部位）は、
ＲＮＡ−ポリメラーゼ（ＤＮＡ−配列のＲＮＡへの転写
を触媒する酵素）に対する認識部位として利用される。
【０００５】プロモーターは、タンパク質の１つのグル
ープに対して認識箇所又は結合箇所として利用されるＤ
ＮＡ−部位と頻繁に機能的に組み合わさっており、これ
は多様な刺激に依存して、プロモーターの活性に影響を
及ぼし、従ってレギュレーターと呼ばれる。このような
レギュレーターとその結合箇所との結合により、それと
結合したプロモータが活性化する（アクチベーター；Ak
tivator）か又は抑制されることができる（リプレッサ
ー；Repressor）。組み換えタンパク質の生産のための
遺伝子技術のシステムにおいて、目的タンパク質の生産
を制御するためにこのようなリプレッサー／プロモータ
ー相互作用が使用される。
ープに対して認識箇所又は結合箇所として利用されるＤ
ＮＡ−部位と頻繁に機能的に組み合わさっており、これ
は多様な刺激に依存して、プロモーターの活性に影響を
及ぼし、従ってレギュレーターと呼ばれる。このような
レギュレーターとその結合箇所との結合により、それと
結合したプロモータが活性化する（アクチベーター；Ak
tivator）か又は抑制されることができる（リプレッサ
ー；Repressor）。組み換えタンパク質の生産のための
遺伝子技術のシステムにおいて、目的タンパク質の生産
を制御するためにこのようなリプレッサー／プロモータ
ー相互作用が使用される。
【０００６】このように工業的に使用されるシステムの
例は、ｌａｃ−及びｔａｃ−プロモーターであり、この
プロモーターはいわゆるｌａｃ−リプレッサータンパク
質の結合により不活性化されるプロモーターである。ラ
クトース又はラクトース類似物質、例えばＩＰＴＧを添
加した場合、リプレッサーはその結合箇所から解離す
る；プロモーターに対して遠位にある遺伝子の発現の誘
導が引き起こされる。
例は、ｌａｃ−及びｔａｃ−プロモーターであり、この
プロモーターはいわゆるｌａｃ−リプレッサータンパク
質の結合により不活性化されるプロモーターである。ラ
クトース又はラクトース類似物質、例えばＩＰＴＧを添
加した場合、リプレッサーはその結合箇所から解離す
る；プロモーターに対して遠位にある遺伝子の発現の誘
導が引き起こされる。
【０００７】もう一つの工業的に使用される調節システ
ムは、ｔｒｐ−プロモーターとｔｒｐ−リプレッサータ
ンパク質との組み合わせからなる。トリプトファンの存
在においてのみ、リプレッサーはプロモーターと結合
し、プロモーターを不活性化する。
ムは、ｔｒｐ−プロモーターとｔｒｐ−リプレッサータ
ンパク質との組み合わせからなる。トリプトファンの存
在においてのみ、リプレッサーはプロモーターと結合
し、プロモーターを不活性化する。
【０００８】組み換えタンパク質の工業的生産のため
に、このシステムは多くの欠点を有している。このシス
テムの誘導又は抑制のために使用される物質は、これが
代謝可能な物質、例えばラクトース又はトリプトファン
である場合に、高価であり、入手が困難である。調節タ
ンパク質とプロモーターとのモル比は発現系の抑制性
（Reprimierbarkeit）に著しく影響する。プロモーター
が過剰の場合、このような系は完全には抑制可能でな
い、それというのも、リプレッサーが尽きる（austitri
eren）ためである。ｌａｃ−リプレッサーに依存するプ
ロモーターは、更にリプレッサーのモル過剰の場合、完
全に誘導できない。
に、このシステムは多くの欠点を有している。このシス
テムの誘導又は抑制のために使用される物質は、これが
代謝可能な物質、例えばラクトース又はトリプトファン
である場合に、高価であり、入手が困難である。調節タ
ンパク質とプロモーターとのモル比は発現系の抑制性
（Reprimierbarkeit）に著しく影響する。プロモーター
が過剰の場合、このような系は完全には抑制可能でな
い、それというのも、リプレッサーが尽きる（austitri
eren）ためである。ｌａｃ−リプレッサーに依存するプ
ロモーターは、更にリプレッサーのモル過剰の場合、完
全に誘導できない。
【０００９】ドイツ連邦共和国特許出願公開（ＤＥ−Ａ
１）第３９２６０７６号明細書（ＣＡ−Ａ−２０１５０
４６に相当）には、組み換えタンパク質の生産のために
ｐｆｌ−プロモーターの使用が記載されている。このE.
coli特有のプロモーターは調節タンパク質ＦＮＲの存
在で嫌気性の条件下でピルベートにより誘導され、酸素
により抑制される。ｌａｃ−、ｔａｃ−又はｔｒｐ−プ
ロモーターと比較して、ｐｆｌ−プロモーターは工業的
に簡単でかつ安価に誘導化できることが利点である。こ
の調節は発酵の開始時にプロモーターの活性を酸素の供
給により抑制することにより行われる。後の対数的な成
長期間において、高い細胞量により、自動的に酸素制限
が生じ、この酸素制限は発酵技術的に強化されるか又は
調節することができる。さらにこの宿主微生物の成長期
間中でピルベートが形成され、これは発現を強化する。
場合により、誘導の向上のために更に外的にピルベート
を添加することができる。
１）第３９２６０７６号明細書（ＣＡ−Ａ−２０１５０
４６に相当）には、組み換えタンパク質の生産のために
ｐｆｌ−プロモーターの使用が記載されている。このE.
coli特有のプロモーターは調節タンパク質ＦＮＲの存
在で嫌気性の条件下でピルベートにより誘導され、酸素
により抑制される。ｌａｃ−、ｔａｃ−又はｔｒｐ−プ
ロモーターと比較して、ｐｆｌ−プロモーターは工業的
に簡単でかつ安価に誘導化できることが利点である。こ
の調節は発酵の開始時にプロモーターの活性を酸素の供
給により抑制することにより行われる。後の対数的な成
長期間において、高い細胞量により、自動的に酸素制限
が生じ、この酸素制限は発酵技術的に強化されるか又は
調節することができる。さらにこの宿主微生物の成長期
間中でピルベートが形成され、これは発現を強化する。
場合により、誘導の向上のために更に外的にピルベート
を添加することができる。
【００１０】他のプロモーターと比較したこの利点にも
係わらず、このプロモーターは、組み換えタンパク質の
工業的製造のために限定的に適しているにすぎない。ｐ
ｆｌ−プロモーターの使用の際に、酸素の存在で組み換
えタンパク質の発現を誘導することは不可能である。し
かし、E. coliの場合指数的成長期間の間の好気性成長
において生じる宿主の最大合成効率を、組み換えタンパ
ク質の生産のために利用するのが好ましい。ｐｆｌ−プ
ロモーターは好気性条件下では誘導できないにも係わら
ず、このプロモーターは酸素の存在で基本活性を示す、
つまり、ｐｆｌ−プロモーターは完全に抑制できない。
好気性条件下でのｐｆｌ−プロモーターの最小反応性
は、最適誘導条件（ピルベートを用いて嫌気性）下での
このプロモーターの活性の５〜１０％である。ＦＮＲ−
調節タンパク質及びｐｆｌ−プロモーターからなるこの
調節システムは、従って、工業的に簡単に及び安価に制
御できるシステムであるが、完全に抑制できず、全ての
成長条件下で誘導できない。全ての他の公知の工業的に
使用されるプロモーターシステムと同様に、従って、ｐ
ｆｌ−プロモーターも構造遺伝子又は組み換え遺伝子の
発現のために限定的に適しているだけである。
係わらず、このプロモーターは、組み換えタンパク質の
工業的製造のために限定的に適しているにすぎない。ｐ
ｆｌ−プロモーターの使用の際に、酸素の存在で組み換
えタンパク質の発現を誘導することは不可能である。し
かし、E. coliの場合指数的成長期間の間の好気性成長
において生じる宿主の最大合成効率を、組み換えタンパ
ク質の生産のために利用するのが好ましい。ｐｆｌ−プ
ロモーターは好気性条件下では誘導できないにも係わら
ず、このプロモーターは酸素の存在で基本活性を示す、
つまり、ｐｆｌ−プロモーターは完全に抑制できない。
好気性条件下でのｐｆｌ−プロモーターの最小反応性
は、最適誘導条件（ピルベートを用いて嫌気性）下での
このプロモーターの活性の５〜１０％である。ＦＮＲ−
調節タンパク質及びｐｆｌ−プロモーターからなるこの
調節システムは、従って、工業的に簡単に及び安価に制
御できるシステムであるが、完全に抑制できず、全ての
成長条件下で誘導できない。全ての他の公知の工業的に
使用されるプロモーターシステムと同様に、従って、ｐ
ｆｌ−プロモーターも構造遺伝子又は組み換え遺伝子の
発現のために限定的に適しているだけである。
【００１１】ブロムクイスト他（Blomquist et al., J.
Bact. (1993) Vol 175(5), S. 1392 - 1404）により、
クレブシエラ−テリゲナ（Klebsiella terrigena）から
の２，３−ブタンジオールオペロン（ｂｕｄ−オペロ
ン）のＤＮＡ−配列が記載されている。クレブシエラ−
テリゲナ中に２，３−ブタンジオールの形成が、低いｐ
Ｈ値により、アセテートの存在で及び酸素制限の際に誘
導されることは公知である。ブロムクイスト他は、２，
３−ブタンジオール形成のために必要なタンパク質をコ
ードする遺伝子が、酸素制限により転写を誘導するオペ
ロンを形成することを示した。この文献は、酸素の存在
でのプロモーターの誘導に関する記載を含んでいない。
Bact. (1993) Vol 175(5), S. 1392 - 1404）により、
クレブシエラ−テリゲナ（Klebsiella terrigena）から
の２，３−ブタンジオールオペロン（ｂｕｄ−オペロ
ン）のＤＮＡ−配列が記載されている。クレブシエラ−
テリゲナ中に２，３−ブタンジオールの形成が、低いｐ
Ｈ値により、アセテートの存在で及び酸素制限の際に誘
導されることは公知である。ブロムクイスト他は、２，
３−ブタンジオール形成のために必要なタンパク質をコ
ードする遺伝子が、酸素制限により転写を誘導するオペ
ロンを形成することを示した。この文献は、酸素の存在
でのプロモーターの誘導に関する記載を含んでいない。
【００１２】
【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、宿主
微生物の全ての成長条件下で工業的に簡単に制御できる
発現が可能である発現系を提供することであった。
微生物の全ての成長条件下で工業的に簡単に制御できる
発現が可能である発現系を提供することであった。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明の対象は、トラン
ス作用調節タンパク質（in trans wirkendes Regulator
protein）及びそのタンパク質により活性化可能なプロ
モーターを有する、アセテート、ｐＨ値及び酸素により
制御可能な発現系において、調節タンパク質が、少なく
とも７５％までアミノ酸配列Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：１と
同種であるアミノ酸配列を有し、プロモーターが少なく
とも９５％までＤＮＡ配列Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：２の塩
基３１５〜３９７と同種であることを特徴とする発現系
である。
ス作用調節タンパク質（in trans wirkendes Regulator
protein）及びそのタンパク質により活性化可能なプロ
モーターを有する、アセテート、ｐＨ値及び酸素により
制御可能な発現系において、調節タンパク質が、少なく
とも７５％までアミノ酸配列Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：１と
同種であるアミノ酸配列を有し、プロモーターが少なく
とも９５％までＤＮＡ配列Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：２の塩
基３１５〜３９７と同種であることを特徴とする発現系
である。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明による発現系は、発現系の
制御下で０〜５％の酸素部分圧ｐＯ2で、６．０〜６．
５のｐＨ値で、４０〜６０ｍＭの濃度でのアセテートの
存在で、任意の構造遺伝子を最大に発現する。
制御下で０〜５％の酸素部分圧ｐＯ2で、６．０〜６．
５のｐＨ値で、４０〜６０ｍＭの濃度でのアセテートの
存在で、任意の構造遺伝子を最大に発現する。
【００１５】本発明による発現系は、工業的に、大規模
でも簡単に実施可能な、安価な、組み換え遺伝子生成物
の発現の調節を、生産株（Produzentenstaemme）の成長
期間及び育成培地のＯ2含有量に依存せずに初めて可能
にする。
でも簡単に実施可能な、安価な、組み換え遺伝子生成物
の発現の調節を、生産株（Produzentenstaemme）の成長
期間及び育成培地のＯ2含有量に依存せずに初めて可能
にする。
【００１６】本発明の対象は、更に、酸素制限で及びア
セテートの存在で及びｐＨ６．０〜ｐＨ６．５の育成培
地のｐＨ値で、クレブシエラ−テリゲナ（ＤＳＭ２６８
７）からのｂｕｄ−プロモーターの最適な活性化を示す
ことを特徴とする調節タンパク質である。
セテートの存在で及びｐＨ６．０〜ｐＨ６．５の育成培
地のｐＨ値で、クレブシエラ−テリゲナ（ＤＳＭ２６８
７）からのｂｕｄ−プロモーターの最適な活性化を示す
ことを特徴とする調節タンパク質である。
【００１７】上記に使用した意味での酸素制限とは、０
〜５％の部分圧ｐＯ2であると解釈される。アセテート
濃度は、この条件で有利に４０〜６０ｍＭである。
〜５％の部分圧ｐＯ2であると解釈される。アセテート
濃度は、この条件で有利に４０〜６０ｍＭである。
【００１８】有利に、本発明による調節タンパク質は、
少なくとも７５％までがアミノ酸配列Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎ
ｏ：１と同種であるアミノ酸配列である。
少なくとも７５％までがアミノ酸配列Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎ
ｏ：１と同種であるアミノ酸配列である。
【００１９】特に有利な実施態様において、本発明によ
る調節タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｓｅ
ｑ．ＩＤ−Ｎｏ：１を有している。このような調節タン
パク質は以後ＢｕｄＲとする。
る調節タンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｓｅ
ｑ．ＩＤ−Ｎｏ：１を有している。このような調節タン
パク質は以後ＢｕｄＲとする。
【００２０】発現系のプロモーターは任意のＤＮＡ−領
域を有することができ、この領域はＢｕｄＲを活性化す
る条件下で、この領域に対してすぐ下流（downstream）
にある遺伝子の転写のＢｕｄＲ−依存性の開始を引き起
こす。ＢｕｄＲを最大に活性化させる生理学的条件は、
０〜５％の酸素部分圧ｐＯ2、４０〜６０ｍＮの濃度の
アセテートの存在及び６．０〜６．５のｐＨ値である。
域を有することができ、この領域はＢｕｄＲを活性化す
る条件下で、この領域に対してすぐ下流（downstream）
にある遺伝子の転写のＢｕｄＲ−依存性の開始を引き起
こす。ＢｕｄＲを最大に活性化させる生理学的条件は、
０〜５％の酸素部分圧ｐＯ2、４０〜６０ｍＮの濃度の
アセテートの存在及び６．０〜６．５のｐＨ値である。
【００２１】このプロモーターは有利に少なくとも９５
％までＤＮＡ−配列ＩＤ−Ｎｏ：２中の塩基３１５〜４
５６と同種であるＤＮＡ−配列を有する。
％までＤＮＡ−配列ＩＤ−Ｎｏ：２中の塩基３１５〜４
５６と同種であるＤＮＡ−配列を有する。
【００２２】特に有利な実施態様において、このプロモ
ーターは、塩基３１５〜３９７の範囲内のＤＮＡ配列Ｉ
Ｄ−Ｎｏ：２を有する。このようなＤＮＡ−領域は以後
ｂｕｄ−プロモーターとする。
ーターは、塩基３１５〜３９７の範囲内のＤＮＡ配列Ｉ
Ｄ−Ｎｏ：２を有する。このようなＤＮＡ−領域は以後
ｂｕｄ−プロモーターとする。
【００２３】本発明による調節タンパク質のための遺伝
子は、完全に化学的に又は酵素的に試験管内でＳｅｑ．
ＩＤ−Ｎｏ：１に開示された配列につき合成されるか、
又は２，３−ブタンジオールを生成する微生物から単離
することができる。
子は、完全に化学的に又は酵素的に試験管内でＳｅｑ．
ＩＤ−Ｎｏ：１に開示された配列につき合成されるか、
又は２，３−ブタンジオールを生成する微生物から単離
することができる。
【００２４】本発明による調節タンパク質は、有利に、
この種の入手可能な遺伝子の発現により得ることができ
る。従って、本発明は、本発明による調節タンパク質に
ついてコードする遺伝子にも関する。
この種の入手可能な遺伝子の発現により得ることができ
る。従って、本発明は、本発明による調節タンパク質に
ついてコードする遺伝子にも関する。
【００２５】本発明による調節タンパク質についてコー
ドする遺伝子のクローニングは、有利にいわゆるリポー
ター株（Reporterstamm）の使用下で行われる。転写−
アクチベーターについてのリポーター株の組立は、当業
者に公知である。このような株は、ｂｕｄ−プロモータ
ーの転写制御下で有利に簡単に検出されるタンパク質に
ついての遺伝子を含有する。このようなリポーター株に
ついての例は、E. coli BL 142（例５及び７参照）であ
る。
ドする遺伝子のクローニングは、有利にいわゆるリポー
ター株（Reporterstamm）の使用下で行われる。転写−
アクチベーターについてのリポーター株の組立は、当業
者に公知である。このような株は、ｂｕｄ−プロモータ
ーの転写制御下で有利に簡単に検出されるタンパク質に
ついての遺伝子を含有する。このようなリポーター株に
ついての例は、E. coli BL 142（例５及び７参照）であ
る。
【００２６】リポーター遺伝子として、有利にプラスミ
ドｐＲＳ５５２（Simons et al. (1987), Gene, Vol 5
3, p. 85 - 96）上のβ−ガラクトシダーゼについて
の、当業者に公知の遺伝子が使用される。
ドｐＲＳ５５２（Simons et al. (1987), Gene, Vol 5
3, p. 85 - 96）上のβ−ガラクトシダーゼについて
の、当業者に公知の遺伝子が使用される。
【００２７】本発明による調節タンパク質についてコー
ドする遺伝子のクローニングのために、このようなリポ
ーター株中へ、本発明による調節タンパク質を生成する
微生物からの遺伝子バンク（Genbank）が導入される。
この遺伝子バンクの組立及びその単離は、当業者に同様
に公知である。
ドする遺伝子のクローニングのために、このようなリポ
ーター株中へ、本発明による調節タンパク質を生成する
微生物からの遺伝子バンク（Genbank）が導入される。
この遺伝子バンクの組立及びその単離は、当業者に同様
に公知である。
【００２８】リポーター株を用いたクローニング方法も
当業者に公知である。これは、例えば Casadaban & Coh
en (1979) Proc. Natil. Acad. Sci. USA Vol. 76, No.
9, pp.4530-4533）に記載された方法で行うことができ
る。
当業者に公知である。これは、例えば Casadaban & Coh
en (1979) Proc. Natil. Acad. Sci. USA Vol. 76, No.
9, pp.4530-4533）に記載された方法で行うことができ
る。
【００２９】この必要とされるタンパク質を生成するク
ローンの検出のために、遺伝子バンクから、ｐＨ６．５
でアセテートの存在でリポーター遺伝子を誘導するよう
なクローンが単離される。リポーター遺伝子としてβ−
ガラクトシダーゼを使用する場合に、インジケータープ
レートは、例えば染料Ｘ−Ｇａｌを有している。リポー
ター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを使用する場
合、Ｘ−Ｇａｌ含有のインジケータープレート上で深く
暗青色になるようなクローンは本発明による調節タンパ
ク質についての遺伝子を有している。
ローンの検出のために、遺伝子バンクから、ｐＨ６．５
でアセテートの存在でリポーター遺伝子を誘導するよう
なクローンが単離される。リポーター遺伝子としてβ−
ガラクトシダーゼを使用する場合に、インジケータープ
レートは、例えば染料Ｘ−Ｇａｌを有している。リポー
ター遺伝子としてβ−ガラクトシダーゼを使用する場
合、Ｘ−Ｇａｌ含有のインジケータープレート上で深く
暗青色になるようなクローンは本発明による調節タンパ
ク質についての遺伝子を有している。
【００３０】本発明の有利な実施態様において、調節タ
ンパク質についての遺伝子は、エンテロバクター又はク
レブシエラの属の微生物の遺伝子バンクから、有利にク
レブシエラ−テリゲナ（DSM-Deutschen Sammlung fuer
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder
Weg 1b, D-38124 Braunschweigから、ＤＳＭ２６８７
の表示で購入することができる）から単離される。クレ
ブシエラ−テリゲナは国際寄託所（Internationalen Hi
nterlegungsstelle）で、ブタペスト条約に従ってＤＳ
Ｍ９８８３の受理番号で前記の番地で寄託されている。
ンパク質についての遺伝子は、エンテロバクター又はク
レブシエラの属の微生物の遺伝子バンクから、有利にク
レブシエラ−テリゲナ（DSM-Deutschen Sammlung fuer
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder
Weg 1b, D-38124 Braunschweigから、ＤＳＭ２６８７
の表示で購入することができる）から単離される。クレ
ブシエラ−テリゲナは国際寄託所（Internationalen Hi
nterlegungsstelle）で、ブタペスト条約に従ってＤＳ
Ｍ９８８３の受理番号で前記の番地で寄託されている。
【００３１】基本的に、微生物、例えば２，３−ブタン
ジオールを生成する微生物、特に２，３−ブタンジオー
ルを生成する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）からの
微生物から、調節タンパク質のための遺伝子を単離する
ことができる。
ジオールを生成する微生物、特に２，３−ブタンジオー
ルを生成する腸内細菌科（Enterobacteriaceae）からの
微生物から、調節タンパク質のための遺伝子を単離する
ことができる。
【００３２】この発現系のために適したプロモーターの
製造方法は、当業者に公知であり、従って詳細に説明し
ない。本発明によるプロモーター活性を媒介するＤＮＡ
−断片のこのような製造方法は、Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．
２に記載された配列情報の使用下での化学的又は酵素的
に「新規の（de novo）」の合成である。
製造方法は、当業者に公知であり、従って詳細に説明し
ない。本発明によるプロモーター活性を媒介するＤＮＡ
−断片のこのような製造方法は、Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．
２に記載された配列情報の使用下での化学的又は酵素的
に「新規の（de novo）」の合成である。
【００３３】このプロモーターのもう一つの製造方法
は、当業者に公知の、Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．２に記載さ
れた配列情報の使用下での突然変異誘発法を用いた任意
のＤＮＡ−断片の変性を包含する。
は、当業者に公知の、Ｓｅｑ．ＩＤ．Ｎｏ．２に記載さ
れた配列情報の使用下での突然変異誘発法を用いた任意
のＤＮＡ−断片の変性を包含する。
【００３４】このプロモーターのもう一つの製造方法
は、２，３−ブタンジオールを生成する微生物の遺伝子
バンクからのプロモーターの単離を包含する。２，３−
ブタンジオールを生成する微生物は、一般に公知であ
り、公然と入手可能である。例えばこの属の代表は、エ
ンテロバクター、セラチア、エルウィニア及びクレブシ
エラである。この方法の場合、少なくとも、ｂｕｄ−オ
ペロンの上流の調節領域、構造遺伝子の前の５′にある
ＤＮＡ−領域（この領域は構造遺伝子の発現を調節する
因子を有している）をこのような有機体から公知の方法
で単離する。調節因子を有していない共に単離された部
分は、場合により公知の方法で除去される（例１４参
照）。
は、２，３−ブタンジオールを生成する微生物の遺伝子
バンクからのプロモーターの単離を包含する。２，３−
ブタンジオールを生成する微生物は、一般に公知であ
り、公然と入手可能である。例えばこの属の代表は、エ
ンテロバクター、セラチア、エルウィニア及びクレブシ
エラである。この方法の場合、少なくとも、ｂｕｄ−オ
ペロンの上流の調節領域、構造遺伝子の前の５′にある
ＤＮＡ−領域（この領域は構造遺伝子の発現を調節する
因子を有している）をこのような有機体から公知の方法
で単離する。調節因子を有していない共に単離された部
分は、場合により公知の方法で除去される（例１４参
照）。
【００３５】有利に、プロモーターを含有するＤＮＡ−
断片は、エンテロバクター又はクレブシエラの属のバク
テリアの遺伝子バンクから、特に有利にクレブシエラ−
テリゲナ（ＤＳＭ２６８７）の遺伝子バンクから単離さ
れる。
断片は、エンテロバクター又はクレブシエラの属のバク
テリアの遺伝子バンクから、特に有利にクレブシエラ−
テリゲナ（ＤＳＭ２６８７）の遺伝子バンクから単離さ
れる。
【００３６】本発明のもう一つの対象は、この発現系に
適したプロモーターが、発現すべき組み換えタンパク質
の構造遺伝子と機能的（funktionell）に結合している
ことを特徴とする発現カセットである。
適したプロモーターが、発現すべき組み換えタンパク質
の構造遺伝子と機能的（funktionell）に結合している
ことを特徴とする発現カセットである。
【００３７】発現カセットの有利な実施態様において、
プロモータ領域と発現すべき構造遺伝子との間に、リボ
ソーム結合部位を含有する、転写されるが翻訳されない
領域がある。
プロモータ領域と発現すべき構造遺伝子との間に、リボ
ソーム結合部位を含有する、転写されるが翻訳されない
領域がある。
【００３８】本発明による発現カセットは、例えば、当
業者に公知の方法で、プロモーターを発現すべき構造遺
伝子の５′−末端の前にクローニングされることにより
製造される。
業者に公知の方法で、プロモーターを発現すべき構造遺
伝子の５′−末端の前にクローニングされることにより
製造される。
【００３９】本発明は、更に、本発明による発現カセッ
トを含有する微生物に関する。
トを含有する微生物に関する。
【００４０】この発現カセットは、この場合、微生物の
ゲノム中へ組み込まれ、これはしかし少なくとも１個の
ベクター上にエピソーム状（episomal）で存在すること
ができる。有利に、この発現カセットはエピソーム状で
少なくとも１個のベクター上に存在する。
ゲノム中へ組み込まれ、これはしかし少なくとも１個の
ベクター上にエピソーム状（episomal）で存在すること
ができる。有利に、この発現カセットはエピソーム状で
少なくとも１個のベクター上に存在する。
【００４１】最初に挙げられた実施態様において、本発
明による発現カセットは、前記の方法を用いて宿主有機
体のゲノム中へ組み込まれる。
明による発現カセットは、前記の方法を用いて宿主有機
体のゲノム中へ組み込まれる。
【００４２】第２として挙げられた、有利な実施態様に
おいて、この発現カセットは宿主有機体中でエピソーム
状でベクター、いわゆる発現ベクター上に存在する。本
発明による発現カセットのベクター上への組み込みは、
通常当業者に公知の方法により行われる。適当なベクタ
ー分子は、当業者に公知である。このようなベクターの
例は当業者に公知のベクターｐＪＦ１１８（Fuerste et
al. (1986), Gene Vol 48, 119 - 131）及びその誘導
体である。
おいて、この発現カセットは宿主有機体中でエピソーム
状でベクター、いわゆる発現ベクター上に存在する。本
発明による発現カセットのベクター上への組み込みは、
通常当業者に公知の方法により行われる。適当なベクタ
ー分子は、当業者に公知である。このようなベクターの
例は当業者に公知のベクターｐＪＦ１１８（Fuerste et
al. (1986), Gene Vol 48, 119 - 131）及びその誘導
体である。
【００４３】本発明は、更に、本発明による発現系の製
造方法に関し、この発現系は任意の微生物中へ、場合に
より、本発明による調節タンパク質についての少なくと
も１個の遺伝子及び／又は場合により少なくとも１個の
本発明による発現カセットが導入され、その結果それぞ
れの微生物中には、引き続き、本発明による調節タンパ
ク質についての少なくとも１個の遺伝子及び本発明によ
る発現カセットが存在することを特徴とする。
造方法に関し、この発現系は任意の微生物中へ、場合に
より、本発明による調節タンパク質についての少なくと
も１個の遺伝子及び／又は場合により少なくとも１個の
本発明による発現カセットが導入され、その結果それぞ
れの微生物中には、引き続き、本発明による調節タンパ
ク質についての少なくとも１個の遺伝子及び本発明によ
る発現カセットが存在することを特徴とする。
【００４４】従って、本発明は、本発明による発現系を
含有する微生物にも関する。
含有する微生物にも関する。
【００４５】本発明による発現系は、例えば、本発明に
よる調節タンパク質についての少なくとも１種の遺伝子
を有する任意の微生物中へ、本発明による発現カセット
を導入することにより製造することができる。
よる調節タンパク質についての少なくとも１種の遺伝子
を有する任意の微生物中へ、本発明による発現カセット
を導入することにより製造することができる。
【００４６】本発明による発現系の製造方法の場合、も
ちろん本発明による調節タンパク質についての遺伝子を
含有するような微生物を使用するのが有利である。
ちろん本発明による調節タンパク質についての遺伝子を
含有するような微生物を使用するのが有利である。
【００４７】この方法の場合、本発明による調節タンパ
ク質についての遺伝子を有するエンテロバクター又はク
レブシエラの属の微生物が特に有利である。
ク質についての遺伝子を有するエンテロバクター又はク
レブシエラの属の微生物が特に有利である。
【００４８】この方法において、クレブシエラ−テリゲ
ナ（ＤＳＭ２６８７）を使用するのが特に有利である。
ナ（ＤＳＭ２６８７）を使用するのが特に有利である。
【００４９】更に、この方法の場合、本発明による発現
カセットのための宿主株として、本発明による調節タン
パク質についての遺伝子が当業者に公知の方法で導入さ
れている微生物を使用するのが特に有利である。この調
節タンパク質をコードする導入された遺伝子は、この場
合、エピソーム状で存在するか、又は宿主の染色体中へ
組み込まれていることができる。
カセットのための宿主株として、本発明による調節タン
パク質についての遺伝子が当業者に公知の方法で導入さ
れている微生物を使用するのが特に有利である。この調
節タンパク質をコードする導入された遺伝子は、この場
合、エピソーム状で存在するか、又は宿主の染色体中へ
組み込まれていることができる。
【００５０】調節タンパク質をコードする導入された調
節タンパク質がエピソーム状で存在する場合に、有利
に、発現カセットも有している同じベクター分子上に局
在（lokalisieren）している。その他に、本発明による
調節タンパク質についての導入された遺伝子及び本発明
による発現カセットが、当業者に公知のような２つの異
なるが、相補的なベクター分子上に、宿主有機体の１つ
の細胞中に同時に存在するような配置であるのも有利で
ある。
節タンパク質がエピソーム状で存在する場合に、有利
に、発現カセットも有している同じベクター分子上に局
在（lokalisieren）している。その他に、本発明による
調節タンパク質についての導入された遺伝子及び本発明
による発現カセットが、当業者に公知のような２つの異
なるが、相補的なベクター分子上に、宿主有機体の１つ
の細胞中に同時に存在するような配置であるのも有利で
ある。
【００５１】一般的な実施態様において、宿主株に調節
タンパク質をコードする遺伝子が付加的に導入されてい
る発現系の組立のために、宿主株としてグラム陽性又は
グラム陰性バクテリアが使用される。
タンパク質をコードする遺伝子が付加的に導入されてい
る発現系の組立のために、宿主株としてグラム陽性又は
グラム陰性バクテリアが使用される。
【００５２】このような発現系のための宿主株として、
腸内細菌科のバクテリア、特に有利にエシェリキア及び
サルモネラの属のようなものを使用するのが特に有利で
ある。このような発現系のための宿主株としてエシェリ
キア−コリ（Escherichia coli）の使用が特に有利であ
る。
腸内細菌科のバクテリア、特に有利にエシェリキア及び
サルモネラの属のようなものを使用するのが特に有利で
ある。このような発現系のための宿主株としてエシェリ
キア−コリ（Escherichia coli）の使用が特に有利であ
る。
【００５３】本発明のもう一つの対象は、本発明による
発現系のための宿主株としてＦｎｒ陰性微生物の使用で
ある。天然のＦｎｒ陰性微生物を使用するのが有利であ
る。本発明による発現系のための宿主株として、ｆｎｒ
−遺伝子が当業者に公知の方法により不活性化されてい
るような微生物の使用が特に有利である。このような特
に有利な微生物の例は、E. coli RM101 (Sawers und Su
ppmann, (1992), J. Bacteriol. Vol 174, S. 3473 - 3
478)及びこれから誘導された全ての誘導体である。
発現系のための宿主株としてＦｎｒ陰性微生物の使用で
ある。天然のＦｎｒ陰性微生物を使用するのが有利であ
る。本発明による発現系のための宿主株として、ｆｎｒ
−遺伝子が当業者に公知の方法により不活性化されてい
るような微生物の使用が特に有利である。このような特
に有利な微生物の例は、E. coli RM101 (Sawers und Su
ppmann, (1992), J. Bacteriol. Vol 174, S. 3473 - 3
478)及びこれから誘導された全ての誘導体である。
【００５４】本発明のもう一つの対象は、本発明による
発現系を有する微生物を使用することを特徴とする微生
物を用いたタンパク質の生産のための発酵方法である。
発現系を有する微生物を使用することを特徴とする微生
物を用いたタンパク質の生産のための発酵方法である。
【００５５】本発明による発酵の際に、最大の誘導効果
を達成すべき場合、本発明による発現系を有する微生物
を、＞ｐＨ７．０のｐＨ値で、好気性条件下で、アセテ
ートの外部添加なしで培養する。任意の時点で、酸素部
分圧ｐＯ2を０〜５％の値に制限し、培地のｐＨ値をｐ
Ｈ６．０〜６．５に調節し、アセテートを４０ｍＭ〜６
０ｍＭの最終濃度に添加することにより、本発明による
発現カセットの一部である組み替えタンパク質について
の遺伝子の発現を最大に誘導することができる。
を達成すべき場合、本発明による発現系を有する微生物
を、＞ｐＨ７．０のｐＨ値で、好気性条件下で、アセテ
ートの外部添加なしで培養する。任意の時点で、酸素部
分圧ｐＯ2を０〜５％の値に制限し、培地のｐＨ値をｐ
Ｈ６．０〜６．５に調節し、アセテートを４０ｍＭ〜６
０ｍＭの最終濃度に添加することにより、本発明による
発現カセットの一部である組み替えタンパク質について
の遺伝子の発現を最大に誘導することができる。
【００５６】この３つの刺激の異なる値の適当な組み合
わせにより、更に簡単に、融合遺伝子（Fusiongen）の
発現を著しく弱いから著しく強いまでの中間段階で段階
的に誘導することが可能である。正確に段階づけられた
誘導ができるということは、原則として著しく望まし
く、それにより、例えば発現レベルを、目的タンパク質
がいわゆる封入体（Einschlusskoerperchen）として析
出しない程度の目的タンパク質の量が生成される程度に
調節することができる。
わせにより、更に簡単に、融合遺伝子（Fusiongen）の
発現を著しく弱いから著しく強いまでの中間段階で段階
的に誘導することが可能である。正確に段階づけられた
誘導ができるということは、原則として著しく望まし
く、それにより、例えば発現レベルを、目的タンパク質
がいわゆる封入体（Einschlusskoerperchen）として析
出しない程度の目的タンパク質の量が生成される程度に
調節することができる。
【００５７】著しく弱い誘導を引き起こす誘導条件は、
例えば、＞６．５のｐＨ値、アセテートの外部添加（４
０ｍＭまで）及び１０％より多い部分圧ｐＯ2を有する
酸素の存在の組み合わせである。
例えば、＞６．５のｐＨ値、アセテートの外部添加（４
０ｍＭまで）及び１０％より多い部分圧ｐＯ2を有する
酸素の存在の組み合わせである。
【００５８】本発明による発現系の利点は、酸素の存在
（ｐＯ2＞５％）でも、育成培地のｐＨ値をｐＨ６．０
に減少させ、アセテートを添加（４０〜６０ｍＭ）する
ことにより、相応する融合遺伝子の発現の著しい誘導が
可能である。
（ｐＯ2＞５％）でも、育成培地のｐＨ値をｐＨ６．０
に減少させ、アセテートを添加（４０〜６０ｍＭ）する
ことにより、相応する融合遺伝子の発現の著しい誘導が
可能である。
【００５９】
【実施例】次の実施例は、本発明を図面と共に詳説す
る。
る。
【００６０】実施例中に使用されたプラスミドの組立及
び発現研究のための一般： １． 全ての嫌気性の育成は、血清瓶（Serumflasche
n）中でBalch und Wolfe (1976), Appl. Environ. Micr
obiol. Vol. 32, p. 781 - 791により実施した。好気性
の育成はエルレンマイヤーフラスコ中で著しく振盪しな
がら行った（このフラスコは、最大で１／１０の前記の
容量で充填された）。培養は３７℃でインキュベートさ
れた。
び発現研究のための一般： １． 全ての嫌気性の育成は、血清瓶（Serumflasche
n）中でBalch und Wolfe (1976), Appl. Environ. Micr
obiol. Vol. 32, p. 781 - 791により実施した。好気性
の育成はエルレンマイヤーフラスコ中で著しく振盪しな
がら行った（このフラスコは、最大で１／１０の前記の
容量で充填された）。培養は３７℃でインキュベートさ
れた。
【００６１】２． 好気性の育成のための培地：ＴＧＹ
ＥＰ（トリプトン１％、酵母抽出液０．５％、グルコー
ス０．４％、Ｋ−ホスフェート１００ｍＭ、０．１Ｍの
リン酸カリウム−緩衝液で６．０〜８．０にｐＨ値を調
節）；好気性の育成のための培地：ＴＧＹＥＰ（ｐＨは
前記のように調節）；１Ｍの原液から４０ｍＭにＮａ−
アセテート誘導物質の添加。
ＥＰ（トリプトン１％、酵母抽出液０．５％、グルコー
ス０．４％、Ｋ−ホスフェート１００ｍＭ、０．１Ｍの
リン酸カリウム−緩衝液で６．０〜８．０にｐＨ値を調
節）；好気性の育成のための培地：ＴＧＹＥＰ（ｐＨは
前記のように調節）；１Ｍの原液から４０ｍＭにＮａ−
アセテート誘導物質の添加。
【００６２】ｋ−ファージを用いた作業のため、クレッ
カー他（Kleckner et al. (1978),Genetics Vol 90, p.
427 - 450）による培地を使用した。
カー他（Kleckner et al. (1978),Genetics Vol 90, p.
427 - 450）による培地を使用した。
【００６３】３． 抗生物質は、染色体コードした耐性
（chromosomal kodierte Resistenzen）のために次の濃
度で添加した：アンピシリン、１００μｇ／ｍｌ；クロ
ラムフェニコール、３０μｇ／ｍｌ；カナマイシン、５
０μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン、２０μｇ／ｍｌ若し
くは１５μｇ／ｍｌ： ４． 染色体ＤＮＡの製造をアウスベル他（Ausubel et
al. (1987), Current protecols in molecular biolog
y, Vol 1, Greene Publishing Associates and Wiley-I
nterscience, New York）の方法により、プラスミド−
ＤＮＡの製造をホルメス及びキグレー（Holmes and Qui
gley (1981), Anal. Biochem Vol 114, S.193 - 197）
の方法により行った。
（chromosomal kodierte Resistenzen）のために次の濃
度で添加した：アンピシリン、１００μｇ／ｍｌ；クロ
ラムフェニコール、３０μｇ／ｍｌ；カナマイシン、５
０μｇ／ｍｌ；テトラサイクリン、２０μｇ／ｍｌ若し
くは１５μｇ／ｍｌ： ４． 染色体ＤＮＡの製造をアウスベル他（Ausubel et
al. (1987), Current protecols in molecular biolog
y, Vol 1, Greene Publishing Associates and Wiley-I
nterscience, New York）の方法により、プラスミド−
ＤＮＡの製造をホルメス及びキグレー（Holmes and Qui
gley (1981), Anal. Biochem Vol 114, S.193 - 197）
の方法により行った。
【００６４】５． プラスミド−ＤＮＡを有する使用し
た株の形質転換を、他に記載のない限り、標準方法（Ma
niatis et al. (1982), Molecular cloning, A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
ring Harbor, N.Y., S. 249 -255）により行った。
た株の形質転換を、他に記載のない限り、標準方法（Ma
niatis et al. (1982), Molecular cloning, A Laborat
ory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Sp
ring Harbor, N.Y., S. 249 -255）により行った。
【００６５】６． β−ガラクトシダーゼ−活性の測定
は、ミラー（Miller (1972) Experiments in molecular
genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, N.Y., S. 352 - 355）により行った。酵素
活性はミラー単位（Miller units）で記載した。
は、ミラー（Miller (1972) Experiments in molecular
genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spr
ing Harbor, N.Y., S. 352 - 355）により行った。酵素
活性はミラー単位（Miller units）で記載した。
【００６６】７． クレブシエラ−テリゲナＤＳＭ２６
８７のｌａｃ-−突然変異型の生産は、ミラー（Miller
(1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
S. 121 - 124）による非指向性（ungerichtet）のＵＶ
−突然変異誘発により行われる。この照射は３１８μＷ
／ｃｍ2の強度で８０秒行った。突然変異の安定性はニ
トロソグアニジンを用いたインキュベーション（Miller
(1972) Experiments in molecular genetics, Cold Sp
ring Harbor, N.Y., S. 125 -129）により復帰突然変異
（Reversion）に関して試験した。クレブシエラにとっ
て典型的な物質交換反応の制御の後に、他の試験のため
に株ＫＴ１４が選択された。
８７のｌａｃ-−突然変異型の生産は、ミラー（Miller
(1972) Experiments in molecular genetics, Cold Spr
ing Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.
S. 121 - 124）による非指向性（ungerichtet）のＵＶ
−突然変異誘発により行われる。この照射は３１８μＷ
／ｃｍ2の強度で８０秒行った。突然変異の安定性はニ
トロソグアニジンを用いたインキュベーション（Miller
(1972) Experiments in molecular genetics, Cold Sp
ring Harbor, N.Y., S. 125 -129）により復帰突然変異
（Reversion）に関して試験した。クレブシエラにとっ
て典型的な物質交換反応の制御の後に、他の試験のため
に株ＫＴ１４が選択された。
【００６７】８． ｂｕｄＡ−ｌａｃＺ−融合体のE. c
oliの染色体への組み込みは、シモンズ他（Simons et a
l. (1987), Gene Vol 53, S. 85 - 96）の方法により行
った。株E. coli MC4100（F-, araD139, D(argF-lac)U1
69, ptsF25, deoCl, relAl,flbB5301, rpsL150, l-）
（Casadaban und Cohen (1979), Proc Nat Acad Sci US
A, Vol 76, S. 4530 - 4533）から出発して、次の被形
質導入体が得られた：ＢＬ１４２及びＢＬ１。株E. col
i RM101（fnr-）（Sawers und Suppamann (1992)J. of
Bacteriology 174, 11pp. 3474 - 3478）から出発して
株ＢＬ１２の被形質導入体が得られた。
oliの染色体への組み込みは、シモンズ他（Simons et a
l. (1987), Gene Vol 53, S. 85 - 96）の方法により行
った。株E. coli MC4100（F-, araD139, D(argF-lac)U1
69, ptsF25, deoCl, relAl,flbB5301, rpsL150, l-）
（Casadaban und Cohen (1979), Proc Nat Acad Sci US
A, Vol 76, S. 4530 - 4533）から出発して、次の被形
質導入体が得られた：ＢＬ１４２及びＢＬ１。株E. col
i RM101（fnr-）（Sawers und Suppamann (1992)J. of
Bacteriology 174, 11pp. 3474 - 3478）から出発して
株ＢＬ１２の被形質導入体が得られた。
【００６８】９． 酵素による試験管内でのＤＮＡの反
応は、他に記載のない限り、マニアティーズ（Maniatie
s et al. (1982), Molecular cloning, A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H
arbor, N.Y. S. 98 - 148により実施した。
応は、他に記載のない限り、マニアティーズ（Maniatie
s et al. (1982), Molecular cloning, A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring H
arbor, N.Y. S. 98 - 148により実施した。
【００６９】出発ベクター： １． ｐＵＣ１９（Yanisch-Perron et al. (1985), Ge
ne Vol 33, S. 103 - 119） ２． ｐＢＲ３２２（Bolivar et al. (1977), Gene Vo
l 2, S. 95 - 113） ３． ｐＲＳ５５２（Simons et al. (1987), Gene Vol
53, S. 85 - 96） ４． ｐＪＦ１１８ＨＥ（Fuerste et al. (1986), Gen
e Vol 48, S. 119 - 131） ５． ｐＣＭ１００（Binder et al. (1986), Gene Vol
47, S. 269 - 277） ファージ：ｋＲＳ４５（Simons et al. (1987), Gene V
ol 53, S. 85 - 96） １０． 合成オリゴヌクレオチドはトプラープ社（Firm
a Toplab, Martinsried,Germany）から取り寄せた。実
施例中で使用されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド
配列は次の第１表にまとめた：
ne Vol 33, S. 103 - 119） ２． ｐＢＲ３２２（Bolivar et al. (1977), Gene Vo
l 2, S. 95 - 113） ３． ｐＲＳ５５２（Simons et al. (1987), Gene Vol
53, S. 85 - 96） ４． ｐＪＦ１１８ＨＥ（Fuerste et al. (1986), Gen
e Vol 48, S. 119 - 131） ５． ｐＣＭ１００（Binder et al. (1986), Gene Vol
47, S. 269 - 277） ファージ：ｋＲＳ４５（Simons et al. (1987), Gene V
ol 53, S. 85 - 96） １０． 合成オリゴヌクレオチドはトプラープ社（Firm
a Toplab, Martinsried,Germany）から取り寄せた。実
施例中で使用されたオリゴヌクレオチドのヌクレオチド
配列は次の第１表にまとめた：
【００７０】
【表１】
【００７１】１１． ＤＮＡの制限、変調（Modifikati
on）及び配列分析のための酵素は、ベーリンガー・マン
ハイム社（Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim)）、
ファルマシア（Pharmacia (Freiburg)）、ニュー・イン
グランド・ビオラブス（New England Biolabs (Schwalb
ach)）及びパーキン・エルマー・セツス（Perkin Elmer
Cetus (Langen)）から取り寄せた。
on）及び配列分析のための酵素は、ベーリンガー・マン
ハイム社（Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim)）、
ファルマシア（Pharmacia (Freiburg)）、ニュー・イン
グランド・ビオラブス（New England Biolabs (Schwalb
ach)）及びパーキン・エルマー・セツス（Perkin Elmer
Cetus (Langen)）から取り寄せた。
【００７２】放射性物質はアメルシャム・ブッフラー
（Amersham Buchler (Braunschweig)）又はニュー・デ
ュポン（NEW Du Pont (Dreieich)）から入手した。
（Amersham Buchler (Braunschweig)）又はニュー・デ
ュポン（NEW Du Pont (Dreieich)）から入手した。
【００７３】化学薬品類（Feinchemikalien）はメルク
社（Merck (Darmstadt)）、シグマ社（Sigma (Muenche
n)）、セルバ社（Serva (Heidelberg)）、フルカ社（Fu
lka (Neu-Ulm)）及びビオモル社（Biomol (Muenchen)）
から入手した。
社（Merck (Darmstadt)）、シグマ社（Sigma (Muenche
n)）、セルバ社（Serva (Heidelberg)）、フルカ社（Fu
lka (Neu-Ulm)）及びビオモル社（Biomol (Muenchen)）
から入手した。
【００７４】例１： ｂｕｄＡ−プロモーター断片とｌ
ａｃＺ−遺伝子との翻訳結合（translationelle Kopplu
ng） オリゴヌクレオチドのオリゴ１及びオリゴ２（第１表）
（このヌクレオチド配列はBlomquist et al. (J. Bact.
(1993) Vol 175(5), S. 1392 - 1404)から公開された
クレブシエラ−テリゲナからのｂｕｄ−オペロンの配列
から誘導される）を用いて、クレブシエラ−テリゲナ
（ＤＳＭ２６８７）からの染色体ＤＮＡからの２２３ｂ
ｐの大きさの断片を合成ＰＣＲにより増幅した（アニー
リング：５８℃で３０ｓ；鎖長延長：７２℃で６０ｓ；
鎖の分離：９４℃で３０ｓ；２５サイクル）。得られた
断片はＳｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：２のヌクレオチド配列の２
４７〜４５６の位置にわたり延びており、ＢｕｄＡの１
０個のＮ末端アミノ酸残基（図７Ａ参照）についての配
列情報、並びにｂｕｄＡ−出発コドンの上流にある１７
８のヌクレオチドの配列情報を含有し、これはｂｕｄ−
オペロンの機能的に活性のプロモーターを有している。
ａｃＺ−遺伝子との翻訳結合（translationelle Kopplu
ng） オリゴヌクレオチドのオリゴ１及びオリゴ２（第１表）
（このヌクレオチド配列はBlomquist et al. (J. Bact.
(1993) Vol 175(5), S. 1392 - 1404)から公開された
クレブシエラ−テリゲナからのｂｕｄ−オペロンの配列
から誘導される）を用いて、クレブシエラ−テリゲナ
（ＤＳＭ２６８７）からの染色体ＤＮＡからの２２３ｂ
ｐの大きさの断片を合成ＰＣＲにより増幅した（アニー
リング：５８℃で３０ｓ；鎖長延長：７２℃で６０ｓ；
鎖の分離：９４℃で３０ｓ；２５サイクル）。得られた
断片はＳｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：２のヌクレオチド配列の２
４７〜４５６の位置にわたり延びており、ＢｕｄＡの１
０個のＮ末端アミノ酸残基（図７Ａ参照）についての配
列情報、並びにｂｕｄＡ−出発コドンの上流にある１７
８のヌクレオチドの配列情報を含有し、これはｂｕｄ−
オペロンの機能的に活性のプロモーターを有している。
【００７５】ＰＣＲ−出発ヌクレオチドのオリゴ１及び
オリゴ２により導入されたＢａｍＨＩ−制限認識位置の
使用下で、ＢａｍＨＩを有するＰＣＲ−生成物の分解の
後で、２１９ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を単離し、Ｂａ
ｍＨＩで切断されたベクターｐＵＣ１９中でクローン化
された。正確なヌクレオチド配列、並びにインサート
（Insert）のオリエンテーションは、二本鎖配列分析
（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74(12), pp. 5463 - 5467）により試験した。これから
生じた構造はｐＢＵ１（図１）とされた。
オリゴ２により導入されたＢａｍＨＩ−制限認識位置の
使用下で、ＢａｍＨＩを有するＰＣＲ−生成物の分解の
後で、２１９ｂｐの大きさのＤＮＡ断片を単離し、Ｂａ
ｍＨＩで切断されたベクターｐＵＣ１９中でクローン化
された。正確なヌクレオチド配列、並びにインサート
（Insert）のオリエンテーションは、二本鎖配列分析
（Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
74(12), pp. 5463 - 5467）により試験した。これから
生じた構造はｐＢＵ１（図１）とされた。
【００７６】ｐＢＵ１上のｂｕｄ−プロモーターと、プ
ロモーター活性のためのリポーター遺伝子としてのｌａ
ｃＺ−遺伝子とを組み合わせるためにｐＢＵ１からのＢ
ａｍＨＩ−断片を、プロモーター試験−ベクターｐＲＳ
５５２のＢａｍＨＩ−切断位置へ再クローン化（umklon
ieren）した。得られた構造のプラスミドｐＢＴＬ１４
２（図２）は、ＢｕｄＡの１０個のＮ末端アミノ酸残
基、それに続く２個のアミノ酸残基からなるリンカーを
介して引き続き９番からのアミノ酸残基のＬａｃＺから
なる融合タンパク質（図３、Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：３及
び４）についてコードし、この転写は、ｂｕｄＡの前の
１５８ｂｐに含まれる調節エレメントによってのみ制御
される。
ロモーター活性のためのリポーター遺伝子としてのｌａ
ｃＺ−遺伝子とを組み合わせるためにｐＢＵ１からのＢ
ａｍＨＩ−断片を、プロモーター試験−ベクターｐＲＳ
５５２のＢａｍＨＩ−切断位置へ再クローン化（umklon
ieren）した。得られた構造のプラスミドｐＢＴＬ１４
２（図２）は、ＢｕｄＡの１０個のＮ末端アミノ酸残
基、それに続く２個のアミノ酸残基からなるリンカーを
介して引き続き９番からのアミノ酸残基のＬａｃＺから
なる融合タンパク質（図３、Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：３及
び４）についてコードし、この転写は、ｂｕｄＡの前の
１５８ｂｐに含まれる調節エレメントによってのみ制御
される。
【００７７】例２： クレブシエラ−テリゲナＫＴ１４
中のｐＢＴＬ１４２上のｂｕｄ−プロモーター断片によ
るβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 クレブシエラ−テリゲナ（同族系）中のｐＢＴＬ１４２
上のｂｕｄ−プロモーターの機能的試験のために、クレ
ブシエラ−テリゲナＫＴ１４（ｌａｃＺ−）を、電気泳
動（Fiedler und Wirth (1988) Analytical Biochemist
ry 170, pp. 38- 44）によりｐＢＴＬ１４２を用いて形
質転換させた。発現試験のために、その際に得られた形
質転換株（Klebsiella terrigena KT14/pBTL142)を、第
２表に示された条件下で培養した。この場合、生成され
るβ−ガラクトシダーゼ−活性（第２表）（これはミラ
ー（Miller）による細胞−リゼイト(Lysate)から測定さ
れる）は、それぞれの条件下でのｂｕｄ−プロモーター
の活性についての直接的な尺度である。
中のｐＢＴＬ１４２上のｂｕｄ−プロモーター断片によ
るβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 クレブシエラ−テリゲナ（同族系）中のｐＢＴＬ１４２
上のｂｕｄ−プロモーターの機能的試験のために、クレ
ブシエラ−テリゲナＫＴ１４（ｌａｃＺ−）を、電気泳
動（Fiedler und Wirth (1988) Analytical Biochemist
ry 170, pp. 38- 44）によりｐＢＴＬ１４２を用いて形
質転換させた。発現試験のために、その際に得られた形
質転換株（Klebsiella terrigena KT14/pBTL142)を、第
２表に示された条件下で培養した。この場合、生成され
るβ−ガラクトシダーゼ−活性（第２表）（これはミラ
ー（Miller）による細胞−リゼイト(Lysate)から測定さ
れる）は、それぞれの条件下でのｂｕｄ−プロモーター
の活性についての直接的な尺度である。
【００７８】
【表２】
【００７９】例３： 誘導される条件下及び誘導されな
い条件下での発酵の際のクレブシエラ−テリゲナＫＴ１
４／ｐＢＴＬ１４２中のβ−ガラクトシダーゼ−タンパ
ク質の発現 フェルメンターのタイプ：Biostat ED（B. Braun Biote
ch, Melsungen, Deutschland） 充填容量：７ｌ。
い条件下での発酵の際のクレブシエラ−テリゲナＫＴ１
４／ｐＢＴＬ１４２中のβ−ガラクトシダーゼ−タンパ
ク質の発現 フェルメンターのタイプ：Biostat ED（B. Braun Biote
ch, Melsungen, Deutschland） 充填容量：７ｌ。
【００８０】培地：ＫＨ2ＰＯ4：１．５ｇ／ｌ；（ＮＨ
4）2ＳＯ4：５．０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ：０．５ｇ／ｌ；
ＦｅＳＯ4×２Ｈ2Ｏ：０．０７５ｇ／ｌ；Ｎａ3シトレ
ート×２Ｈ2Ｏ：１．０ｇ／ｌ；トリプトン（Oxoid）：
５ｇ／ｌ；酵母抽出液（Oxoid）：２．５ｇ／ｌ；グル
コース：１２ｇ／ｌ；カナマイシン：５０ｍｇ／ｌ 培地のｐＨ：均一に６．０（６Ｎ ＮＨ4ＯＨ、もしく
は４Ｎ Ｈ3ＰＯ4で調節） 温度：３０℃ 通気：この育成を全発酵工程にわたり均一に１分当たり
４ｌの空気を通気した。ＯＤ600＝２０の光学密度が達
成されるまで、ｐＯ2＝４０％の均一な酸素−部分圧を
４５０〜９００ｒｐｍの速度で撹拌しながら保持した。
ＯＤ600＝２０の達成の際に、１時間の間にｐＯ2を撹拌
速度の減少によりｐＯ2＝０％に調節し、４８時間保持
した。
4）2ＳＯ4：５．０ｇ／ｌ；ＮａＣｌ：０．５ｇ／ｌ；
ＦｅＳＯ4×２Ｈ2Ｏ：０．０７５ｇ／ｌ；Ｎａ3シトレ
ート×２Ｈ2Ｏ：１．０ｇ／ｌ；トリプトン（Oxoid）：
５ｇ／ｌ；酵母抽出液（Oxoid）：２．５ｇ／ｌ；グル
コース：１２ｇ／ｌ；カナマイシン：５０ｍｇ／ｌ 培地のｐＨ：均一に６．０（６Ｎ ＮＨ4ＯＨ、もしく
は４Ｎ Ｈ3ＰＯ4で調節） 温度：３０℃ 通気：この育成を全発酵工程にわたり均一に１分当たり
４ｌの空気を通気した。ＯＤ600＝２０の光学密度が達
成されるまで、ｐＯ2＝４０％の均一な酸素−部分圧を
４５０〜９００ｒｐｍの速度で撹拌しながら保持した。
ＯＤ600＝２０の達成の際に、１時間の間にｐＯ2を撹拌
速度の減少によりｐＯ2＝０％に調節し、４８時間保持
した。
【００８１】誘導：ｐＯ2＝０％の達成の際に、誘導す
べきフェルメンターにアセテートを４０ｍＭの最終濃度
まで添加した。
べきフェルメンターにアセテートを４０ｍＭの最終濃度
まで添加した。
【００８２】β−ガラクトシダーゼ−活性を誘導の２４
時間及び４８時間に測定した。
時間及び４８時間に測定した。
【００８３】
【表３】
【００８４】例４： E. coli ＦＭ４２０中のｐＢＴＬ
１４２上のｂｕｄＡ−プロモーター断片によるβ−ガラ
クトシダーゼ−タンパク質の発現 E. coli ＦＭ４２０をｐＢＴＬ１４２で形質転換させた
後、引き続く発現試験の際に第４表に記載した値が測定
された。
１４２上のｂｕｄＡ−プロモーター断片によるβ−ガラ
クトシダーゼ−タンパク質の発現 E. coli ＦＭ４２０をｐＢＴＬ１４２で形質転換させた
後、引き続く発現試験の際に第４表に記載した値が測定
された。
【００８５】
【表４】
【００８６】異種系において、ｂｕｄ−プロモーターの
明らかな誘導は確認できない。E. coliは、完全な発現
及び調節のために必要な転写因子（Transkriptionsfakt
or）を有していない、つまりｐＢＴＬ１４２上に存在す
る、シス作用因子は単独では、クレブシエラ−テリゲナ
（例２）中で観察されるE. coli中の発現挙動を媒介す
るために十分ではない。
明らかな誘導は確認できない。E. coliは、完全な発現
及び調節のために必要な転写因子（Transkriptionsfakt
or）を有していない、つまりｐＢＴＬ１４２上に存在す
る、シス作用因子は単独では、クレブシエラ−テリゲナ
（例２）中で観察されるE. coli中の発現挙動を媒介す
るために十分ではない。
【００８７】例５： プラスミドｐＢＴＬ１４２上のｂ
ｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ−翻訳融合物の、E. coli ＭＣ４
１００のゲノム中への組み込み 染色体中へのｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ−融合物の組み込
みは、シモンズ他（Simons et al. (1987), Gene Vol 5
3, S. 85 - 96）の方法により行った。E. coliＭＣ４１
００中のｐＢＴＬ１４２の形質転換及び引き続くｋＲＳ
４５での感染により、この翻訳融合物はE. coli ＭＣ４
１００の遺伝子へ組み込まれる。効果的な組み込みは形
質導入されたカナマイシン耐性につき試験された。ＵＶ
照射の後に得られたｋＢＴＬ１４２のリゼイト（精製さ
れたファージ系列(gereinigtePhagenlinie）はE. coli
ＭＣ４１００の新たな形質導入に利用され、こうして組
立られた株を、E. coli ＢＬ１４２とした。
ｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ−翻訳融合物の、E. coli ＭＣ４
１００のゲノム中への組み込み 染色体中へのｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ−融合物の組み込
みは、シモンズ他（Simons et al. (1987), Gene Vol 5
3, S. 85 - 96）の方法により行った。E. coliＭＣ４１
００中のｐＢＴＬ１４２の形質転換及び引き続くｋＲＳ
４５での感染により、この翻訳融合物はE. coli ＭＣ４
１００の遺伝子へ組み込まれる。効果的な組み込みは形
質導入されたカナマイシン耐性につき試験された。ＵＶ
照射の後に得られたｋＢＴＬ１４２のリゼイト（精製さ
れたファージ系列(gereinigtePhagenlinie）はE. coli
ＭＣ４１００の新たな形質導入に利用され、こうして組
立られた株を、E. coli ＢＬ１４２とした。
【００８８】例６： E. coli ＢＬ１４２中での染色体
の組み込まれた遺伝子によるｂｕｄＡ′−ｌａｃＺ′−
タンパク質の発現 全ての育成はｐＨ６．５で実施した。
の組み込まれた遺伝子によるｂｕｄＡ′−ｌａｃＺ′−
タンパク質の発現 全ての育成はｐＨ６．５で実施した。
【００８９】
【表５】
【００９０】前記した成長条件下で僅かな基本発現が確
認されたが、嫌気環境及びアセテート−添加により明ら
かな誘導は確認されなかった。
認されたが、嫌気環境及びアセテート−添加により明ら
かな誘導は確認されなかった。
【００９１】例７： クレブシエラ−テリゲナからの、
E. coli中のｂｕｄＡ−プロモーターを活性化するタン
パク質をコードする遺伝子のクローニング クレブシエラ−テリゲナＤＳＭ２６８７からの染色体Ｄ
ＮＡを単離し、Ｓａｕ３Ａで部分的に消化させた（０．
０２単位／μｇＤＮＡ、３７℃で２０分）。３〜１０ｋ
ｂの間の断片を電気泳動による分離により単離し、Ｂａ
ｍＨＩで線状化したベクターｐＢＲ３２２中へ連結させ
る。E. coli ＪＭ１０９を形質転換し、引き続き調製し
た後に得られたプラスミド−プールを、クレブシエラ−
テリゲナの遺伝子バンクとして利用した。
E. coli中のｂｕｄＡ−プロモーターを活性化するタン
パク質をコードする遺伝子のクローニング クレブシエラ−テリゲナＤＳＭ２６８７からの染色体Ｄ
ＮＡを単離し、Ｓａｕ３Ａで部分的に消化させた（０．
０２単位／μｇＤＮＡ、３７℃で２０分）。３〜１０ｋ
ｂの間の断片を電気泳動による分離により単離し、Ｂａ
ｍＨＩで線状化したベクターｐＢＲ３２２中へ連結させ
る。E. coli ＪＭ１０９を形質転換し、引き続き調製し
た後に得られたプラスミド−プールを、クレブシエラ−
テリゲナの遺伝子バンクとして利用した。
【００９２】ｂｕｄ−プロモーターをアセテートの存在
で活性化するトランス作用因子をコードするプラスミド
の同定のために、E. coli ＢＬ１４２を、クレブシエラ
−テリゲナからの遺伝子バンクと共に電気泳動を用いて
形質転換させた（Fiedler und Wirth (1988) Analytica
l Biochemistry 170, pp. 38 - 44）。形質転換した部
分を、いわゆるインジケータープレート（リン酸カリウ
ムで緩衝させた、グルコース０．４％、アセテート４０
ｍＭ、Ｘ−Ｇａｌ １ｍＭ及びアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を有するＴＧＹＥＰ−寒天（ｐＨ６．５））
上に置き、３７℃でインキュベートした。E. coli ＢＬ
１４２はこのインジケータープレート上で著しく弱いβ
−ガラクトシダーゼ−活性（第５表）のために明青色の
コロニーを形成する。それに対してクローンは形質転換
の後で暗青色のコロニーを形成する。これは、クレブシ
エラ−テリゲナからの約１．８ｋｂの大きさのＳａｕ３
Ａ−断片を有するプラスミドｐＢＡＫ１（図４）を含有
する。他の分析のために、ｐＢＡＫ１からの１．８ｋＢ
の大きさのＨｉｎｄＩＩＩ−断片（図４参照）を単離
し、この断片は、ベクターｐＢＲ３２２の３５０ｂｐの
大きさの断片及びクレブシエラ−テリゲナからの１．４
５ｋｂの大きさの断片を含有する；この断片のオーバー
ハングする末端はクレノウ−ポリメラーゼで補充され
る。引き続き、この断片を両方のオリエンテーションで
ＳｍａＩで線状化されたプラスミドｐＵＣ１９中へ連結
させる。インジケータープレート上で同様にE. coki Ｂ
Ｌ１４２のコロニーの青色の染色により示される、これ
から生じたプラスミドを、ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１
６（図５及び６）とした。
で活性化するトランス作用因子をコードするプラスミド
の同定のために、E. coli ＢＬ１４２を、クレブシエラ
−テリゲナからの遺伝子バンクと共に電気泳動を用いて
形質転換させた（Fiedler und Wirth (1988) Analytica
l Biochemistry 170, pp. 38 - 44）。形質転換した部
分を、いわゆるインジケータープレート（リン酸カリウ
ムで緩衝させた、グルコース０．４％、アセテート４０
ｍＭ、Ｘ−Ｇａｌ １ｍＭ及びアンピシリン（１００μ
ｇ／ｍｌ）を有するＴＧＹＥＰ−寒天（ｐＨ６．５））
上に置き、３７℃でインキュベートした。E. coli ＢＬ
１４２はこのインジケータープレート上で著しく弱いβ
−ガラクトシダーゼ−活性（第５表）のために明青色の
コロニーを形成する。それに対してクローンは形質転換
の後で暗青色のコロニーを形成する。これは、クレブシ
エラ−テリゲナからの約１．８ｋｂの大きさのＳａｕ３
Ａ−断片を有するプラスミドｐＢＡＫ１（図４）を含有
する。他の分析のために、ｐＢＡＫ１からの１．８ｋＢ
の大きさのＨｉｎｄＩＩＩ−断片（図４参照）を単離
し、この断片は、ベクターｐＢＲ３２２の３５０ｂｐの
大きさの断片及びクレブシエラ−テリゲナからの１．４
５ｋｂの大きさの断片を含有する；この断片のオーバー
ハングする末端はクレノウ−ポリメラーゼで補充され
る。引き続き、この断片を両方のオリエンテーションで
ＳｍａＩで線状化されたプラスミドｐＵＣ１９中へ連結
させる。インジケータープレート上で同様にE. coki Ｂ
Ｌ１４２のコロニーの青色の染色により示される、これ
から生じたプラスミドを、ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１
６（図５及び６）とした。
【００９３】例８： ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１６上
のｂｕｄＡ−プロモーターを活性化する調節タンパク質
についての遺伝子の配列分析 ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１６上のインサートの、サン
ガー他（Sanger et al. (1977), Proc Natl Acad Sci U
SA Vol 74, S. 5463 - 5467）による配列分析のため
に、インサートをそれぞれエキソヌクレアーゼＩＩＩで
短縮した。ベクター保護としてＳａｃＩでの制限を利用
し、エキソヌクレアーゼの攻撃はｐＵＣ１９（Henikoff
(1984), Gene Vol 28, S. 351 - 359）中のマルチプル
クローニング−部位（multiplen Klonierngs-site）の
Ａｓｐ７１８−切断箇所で行った。Ｔ７−ＤＮＡ−ポリ
メラーゼ（Pharmacia, Freiburg）を用いた配列反応
は、著しいコンプレッション（Kompression）を避ける
ためにｄＧＴＰ及びｄＩＴＰを用いて平行して実施され
た。ｐＵＣ−ベクターに対して特別の市販されたユニバ
ーサル−配列開始オリゴヌクレオチド（Universal-Sequ
enzierstartoligonukleotid）を使用した。ｐＢＡＫ１
４及びｐＢＡＫ１６上のクレブシエラ−テリゲナからの
このＤＮＡ−インサートについて、次のヌクレオチド配
列（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：２）が測定された：
のｂｕｄＡ−プロモーターを活性化する調節タンパク質
についての遺伝子の配列分析 ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１６上のインサートの、サン
ガー他（Sanger et al. (1977), Proc Natl Acad Sci U
SA Vol 74, S. 5463 - 5467）による配列分析のため
に、インサートをそれぞれエキソヌクレアーゼＩＩＩで
短縮した。ベクター保護としてＳａｃＩでの制限を利用
し、エキソヌクレアーゼの攻撃はｐＵＣ１９（Henikoff
(1984), Gene Vol 28, S. 351 - 359）中のマルチプル
クローニング−部位（multiplen Klonierngs-site）の
Ａｓｐ７１８−切断箇所で行った。Ｔ７−ＤＮＡ−ポリ
メラーゼ（Pharmacia, Freiburg）を用いた配列反応
は、著しいコンプレッション（Kompression）を避ける
ためにｄＧＴＰ及びｄＩＴＰを用いて平行して実施され
た。ｐＵＣ−ベクターに対して特別の市販されたユニバ
ーサル−配列開始オリゴヌクレオチド（Universal-Sequ
enzierstartoligonukleotid）を使用した。ｐＢＡＫ１
４及びｐＢＡＫ１６上のクレブシエラ−テリゲナからの
このＤＮＡ−インサートについて、次のヌクレオチド配
列（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：２）が測定された：
【００９４】
【外９】
【００９５】
【外１０】
【００９６】測定されたヌクレオチド配列（Ｓｅｑ Ｉ
Ｄ−Ｎｏ：２）から、２９０個のアミノ酸からなるタン
パク質（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：１）についてコードする
明らかな読み取り領域（ヌクレオチド３８５〜１２５
４）を導き出すことができた。この明らかな読み取り領
域から導き出されたアミノ酸配列を次に記載する：
Ｄ−Ｎｏ：２）から、２９０個のアミノ酸からなるタン
パク質（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：１）についてコードする
明らかな読み取り領域（ヌクレオチド３８５〜１２５
４）を導き出すことができた。この明らかな読み取り領
域から導き出されたアミノ酸配列を次に記載する：
【００９７】
【外１１】
【００９８】ｂｕｄ−プロモーター調節する活性の活性
に基づき、このタンパク質はＢｕｄＲ（Ｂｕｄ−レギュ
レーター）として表される。ｂｕｄＲの転写方向は、ｂ
ｕｄ−オペロンの方向に対して逆方向であり、ｂｕｄ−
オペロンとｂｕｄＲとの間に、単に１０６ｂｐの遺伝子
間の領域があるにすぎない（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：２中
のヌクレオチド２７９〜３８４）。従って、ｂｕｄ−オ
ペロン及びｂｕｄＲは、２，３−ブタンジオールの生成
に関与する酵素の合成のための異なるオリエンテーショ
ンのレギュロン（divergent orientiertes Regulon）を
形成する（図７）。
に基づき、このタンパク質はＢｕｄＲ（Ｂｕｄ−レギュ
レーター）として表される。ｂｕｄＲの転写方向は、ｂ
ｕｄ−オペロンの方向に対して逆方向であり、ｂｕｄ−
オペロンとｂｕｄＲとの間に、単に１０６ｂｐの遺伝子
間の領域があるにすぎない（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：２中
のヌクレオチド２７９〜３８４）。従って、ｂｕｄ−オ
ペロン及びｂｕｄＲは、２，３−ブタンジオールの生成
に関与する酵素の合成のための異なるオリエンテーショ
ンのレギュロン（divergent orientiertes Regulon）を
形成する（図７）。
【００９９】例９： E. coli ＢＬ１４２／ｐＢＡＫ１
中の染色体で存在するｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ−翻訳融
合物によるβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 ｌａｃ+表現形（青色の染色）を生じる遺伝子バンクの
プラスミドによる、染色体のコードするｂｕｄＡ′−｀
ｌａｃＺ−融合物の誘導性は次の例により表される。全
ての育成はｐＨ６．５で行った。
中の染色体で存在するｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ−翻訳融
合物によるβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 ｌａｃ+表現形（青色の染色）を生じる遺伝子バンクの
プラスミドによる、染色体のコードするｂｕｄＡ′−｀
ｌａｃＺ−融合物の誘導性は次の例により表される。全
ての育成はｐＨ６．５で行った。
【０１００】
【表６】
【０１０１】例１０： ｂｕｄＲの完全な配列及びｂｕ
ｄＲ及びｂｕｄＡの間の遺伝子間領域とを合わせたｂｕ
ｄＡ′−｀ｌａｃＺ−融合物の組立 オリゴヌクレオチドのオリゴ１及びオリゴ３（第１表）
を用いて、ｐＢＡＫ１６（ｐＵＣ１９−誘導体）からの
対称性ＰＣＲを介して１０２７ｂｐの大きさの断片を増
幅した（図７）。ＰＣＲ−開始ヌクレオチドのオリゴ１
及びオリゴ３により導入されたＢａｍＨＩ−制限認識位
置の使用下で、ＢａｍＨＩでのＰＣＲ−生成物の分解に
より１０２３ｂｐの大きさのＤＮＡが単離され、Ｂａｍ
ＨＩで切断されたベクターｐＲＳ５５２中へクローニン
グする。インサートの正確なオリエンテーションはサン
ガー他（Sanger et al. (1977), Proc Natl Acad Sci U
SAVol 74, p. 5463 - 5467）の配列分析により試験し
た。これから生じる組立物はｐＲＢＬ２（図８）とし
た。
ｄＲ及びｂｕｄＡの間の遺伝子間領域とを合わせたｂｕ
ｄＡ′−｀ｌａｃＺ−融合物の組立 オリゴヌクレオチドのオリゴ１及びオリゴ３（第１表）
を用いて、ｐＢＡＫ１６（ｐＵＣ１９−誘導体）からの
対称性ＰＣＲを介して１０２７ｂｐの大きさの断片を増
幅した（図７）。ＰＣＲ−開始ヌクレオチドのオリゴ１
及びオリゴ３により導入されたＢａｍＨＩ−制限認識位
置の使用下で、ＢａｍＨＩでのＰＣＲ−生成物の分解に
より１０２３ｂｐの大きさのＤＮＡが単離され、Ｂａｍ
ＨＩで切断されたベクターｐＲＳ５５２中へクローニン
グする。インサートの正確なオリエンテーションはサン
ガー他（Sanger et al. (1977), Proc Natl Acad Sci U
SAVol 74, p. 5463 - 5467）の配列分析により試験し
た。これから生じる組立物はｐＲＢＬ２（図８）とし
た。
【０１０２】プラスミドｐＲＢＬ２は、ＢｕｄＲについ
ての完全な遺伝子、ｂｕｄＲ及びｂｕｄＡの間の完全な
遺伝子間領域、並びに１０個のＮ−末端ＡＳ−残基、そ
れに続く２個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して
接続するＬａｃＺの９番目からのアミノ酸残基（これは
ｐＢＴＬ１４２上にも含まれている）（図３）からなる
融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する。
ての完全な遺伝子、ｂｕｄＲ及びｂｕｄＡの間の完全な
遺伝子間領域、並びに１０個のＮ−末端ＡＳ−残基、そ
れに続く２個のアミノ酸残基からなるリンカーを介して
接続するＬａｃＺの９番目からのアミノ酸残基（これは
ｐＢＴＬ１４２上にも含まれている）（図３）からなる
融合タンパク質をコードする遺伝子を含有する。
【０１０３】例１１： E. coli ＭＣ４１００のゲノム
中へのｂｕｄＲの組み込み 付加的にプラスミドｐＲＢＬ２上のｂｕｄＲの配列を有
するｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ融合体のE. coli ＭＣ４１
００の染色体中への組み込みは、シモンズ他（Simons e
t al. (1987), Gene Vol 53, p. 85 - 96）の方法によ
り行われる。E.coli ＭＣ４１００中でのｐＲＢＬ２の
形質転換及びE. coli ＭＣ４１００／ｐＲＢＬ２のλＲ
Ｓ４５での引き続く感染により、この融合体はE. coli
ＭＣ４１００の染色体中へ組み込まれた。効果的な組み
込みは形質導入されたカナマイシン−耐性について試験
した。ＵＶ−照射した後に得られたＲＢＬ２（生成され
たファージ系列）のリゼイトを、E. coli ＭＣ４１００
の新たな形質導入のために利用し、このように組立られ
た株E. coliをＢＬ２とした。
中へのｂｕｄＲの組み込み 付加的にプラスミドｐＲＢＬ２上のｂｕｄＲの配列を有
するｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ融合体のE. coli ＭＣ４１
００の染色体中への組み込みは、シモンズ他（Simons e
t al. (1987), Gene Vol 53, p. 85 - 96）の方法によ
り行われる。E.coli ＭＣ４１００中でのｐＲＢＬ２の
形質転換及びE. coli ＭＣ４１００／ｐＲＢＬ２のλＲ
Ｓ４５での引き続く感染により、この融合体はE. coli
ＭＣ４１００の染色体中へ組み込まれた。効果的な組み
込みは形質導入されたカナマイシン−耐性について試験
した。ＵＶ−照射した後に得られたＲＢＬ２（生成され
たファージ系列）のリゼイトを、E. coli ＭＣ４１００
の新たな形質導入のために利用し、このように組立られ
た株E. coliをＢＬ２とした。
【０１０４】例１２： E. coli ＢＬ２中にある染色体
のｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ融合体によるβ−ガラクトシ
ダーゼ−タンパク質の発現 ｂｕｄＲの簡単なコピーによりE. coliの染色体中のｂ
ｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ融合遺伝子の発現に関して達成さ
れた調節を第７表に記載した。全ての育成はＴＧＹＥＰ
−培地中でｐＨ６．５で行われた。
のｂｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ融合体によるβ−ガラクトシ
ダーゼ−タンパク質の発現 ｂｕｄＲの簡単なコピーによりE. coliの染色体中のｂ
ｕｄＡ′−｀ｌａｃＺ融合遺伝子の発現に関して達成さ
れた調節を第７表に記載した。全ての育成はＴＧＹＥＰ
−培地中でｐＨ６．５で行われた。
【０１０５】
【表７】
【０１０６】例１３： E. colil ＢＬ２／ｐＢＴＬ１
４２中のβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 プラスミドコードされたｂｕｄＡ′−ｌａｃＺ′−融合
遺伝子の染色体のコードされたＢｕｄＲの誘導は第８表
に示した。
４２中のβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 プラスミドコードされたｂｕｄＡ′−ｌａｃＺ′−融合
遺伝子の染色体のコードされたＢｕｄＲの誘導は第８表
に示した。
【０１０７】
【表８】
【０１０８】例１４： プラスミドｐＢＴＬ１４２上の
ｂｕｄＡ−プロモーター部位の５′−領域の段階的な欠
失 ｂｕｄＲにより活性可能なもう１つのプロモーター活性
有するをｂｕｄ−プロモーターの最小のヌクレオチド領
域を測定するために、プラスミドｐＢＴＬ１４２上に存
在する５′−側のプロモーターを段階的に短くした。こ
のために、ｐＢＵ１はインサートの５′−末端でＥｃｏ
ＲＩでの制限により線状化し、Ｂａｌ３１−エキソヌク
レアーゼ（Boehringer Mannheim）と３０℃でインキュ
ベートした（０．３単位／μｇ ＤＮＡ）（Schaffner
et al., 1976）。５′−のオーバーハングしたＤＮＡ−
末端は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウ断片により
補充され、ＥｃｏＲＩ−リンカー（オリゴ４（第１
表））が取り付けられる。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
の制限により、断片は電気泳動により分離され、適当な
長さの断片を溶離し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで前処
理されたベクターｐＲＳ５５２中へ導入した。欠失組立
（Deletionkonstrukten）中のインサートの５′−末端
は配列分析により測定された。選択されたクローン（ｐ
ＢＴＬ６〜ｐＢＴＬ１２４）は第９表に記載されてい
る。
ｂｕｄＡ−プロモーター部位の５′−領域の段階的な欠
失 ｂｕｄＲにより活性可能なもう１つのプロモーター活性
有するをｂｕｄ−プロモーターの最小のヌクレオチド領
域を測定するために、プラスミドｐＢＴＬ１４２上に存
在する５′−側のプロモーターを段階的に短くした。こ
のために、ｐＢＵ１はインサートの５′−末端でＥｃｏ
ＲＩでの制限により線状化し、Ｂａｌ３１−エキソヌク
レアーゼ（Boehringer Mannheim）と３０℃でインキュ
ベートした（０．３単位／μｇ ＤＮＡ）（Schaffner
et al., 1976）。５′−のオーバーハングしたＤＮＡ−
末端は、ＤＮＡ−ポリメラーゼＩのクレノウ断片により
補充され、ＥｃｏＲＩ−リンカー（オリゴ４（第１
表））が取り付けられる。ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで
の制限により、断片は電気泳動により分離され、適当な
長さの断片を溶離し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで前処
理されたベクターｐＲＳ５５２中へ導入した。欠失組立
（Deletionkonstrukten）中のインサートの５′−末端
は配列分析により測定された。選択されたクローン（ｐ
ＢＴＬ６〜ｐＢＴＬ１２４）は第９表に記載されてい
る。
【０１０９】
【表９】
【０１１０】例１５： プラスミドｐＢＴＬ６〜ｐＢＴ
Ｌ１４２上の短縮されたｂｕｄＡ−プロモーター断片に
よるβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 短縮クローン（Verkuerzungsklonen)を用いた発現試験
は、宿主株としてクレブシエラ−テリゲナＫＴ１４中で
実施した。全ての育成はｐＨ６．５で行った：
Ｌ１４２上の短縮されたｂｕｄＡ−プロモーター断片に
よるβ−ガラクトシダーゼ−タンパク質の発現 短縮クローン（Verkuerzungsklonen)を用いた発現試験
は、宿主株としてクレブシエラ−テリゲナＫＴ１４中で
実施した。全ての育成はｐＨ６．５で行った：
【０１１１】
【表１０】
【０１１２】例１６： E. coli ＢＬ１２及びE. coli
ＢＬ１２ｍ／ｐＵＦＲ１中のβ−ガラクトシダーゼタン
パク質の発現 嫌気性物質代謝のE. coli独自の誘導物質、Ｆｎｒの、
ｂｕｄ−プロモーターのｂｕｄＲ−依存性活性への影響
を試験するために、プラスミドｐＲＢＬ２（図８）上の
ｂｕｄＲ並びにｂｕｄＡ′−ｌａｃＺ′−翻訳融合物
を、例１１からの方法と同様に、λＲＳ４５を用いた形
質導入によりｆｎｒ陰性のE. coli ＲＭ１０１の染色体
中へ組み込んだ。この場合に得られた株を、E. coli Ｂ
Ｌ１２とした。可能なＦｎｒ−効果を試験するために、
E. coli ＢＬ１２を付加的に、機能性のｆｎｒ−遺伝子
（funktionelles fnr - Gen）を有するプラスミドｐＵ
ＦＲ１（Sawers udn Suppmann (1992) J. of Bacteriol
ogy 174, 11 pp. 3474 - 3478）を用いて形質転換させ
た。
ＢＬ１２ｍ／ｐＵＦＲ１中のβ−ガラクトシダーゼタン
パク質の発現 嫌気性物質代謝のE. coli独自の誘導物質、Ｆｎｒの、
ｂｕｄ−プロモーターのｂｕｄＲ−依存性活性への影響
を試験するために、プラスミドｐＲＢＬ２（図８）上の
ｂｕｄＲ並びにｂｕｄＡ′−ｌａｃＺ′−翻訳融合物
を、例１１からの方法と同様に、λＲＳ４５を用いた形
質導入によりｆｎｒ陰性のE. coli ＲＭ１０１の染色体
中へ組み込んだ。この場合に得られた株を、E. coli Ｂ
Ｌ１２とした。可能なＦｎｒ−効果を試験するために、
E. coli ＢＬ１２を付加的に、機能性のｆｎｒ−遺伝子
（funktionelles fnr - Gen）を有するプラスミドｐＵ
ＦＲ１（Sawers udn Suppmann (1992) J. of Bacteriol
ogy 174, 11 pp. 3474 - 3478）を用いて形質転換させ
た。
【０１１３】
【表１１】
【０１１４】例１７： α−ＣＧＴａｓｅ−構造遺伝子
とのｂｕｄ−レギュレーター系との機能的接続（funkti
onelle Kopplung） ＣＧＴａｓｅ−発現プラスミドｐＢＵＤ２００の組立の
ため、第１表に示されたオリゴヌクレオチドのオリゴ５
〜オリゴ９を使用した。
とのｂｕｄ−レギュレーター系との機能的接続（funkti
onelle Kopplung） ＣＧＴａｓｅ−発現プラスミドｐＢＵＤ２００の組立の
ため、第１表に示されたオリゴヌクレオチドのオリゴ５
〜オリゴ９を使用した。
【０１１５】Ａ） ｐＢＵＤ１００の組立 完全なｂｕｄＲ−遺伝子及びｂｕｄＡ−プロモーターを
有するＤＮＡ−断片（ＳＥＱ ＩＤ−Ｎｏ：２中の２８
１〜１３００のヌクレオチド）を、オリゴヌクレオチド
のオリゴ５及びオリゴ６（第１表）を用いて、原型−Ｄ
ＮＡとしてプラスミドｐＢＡＫ１６の使用下でＰＣＲを
用いて増幅させ、制限エンドヌクレアーゼＮｒｕＩ及び
ＮｃｏＩで分解した。
有するＤＮＡ−断片（ＳＥＱ ＩＤ−Ｎｏ：２中の２８
１〜１３００のヌクレオチド）を、オリゴヌクレオチド
のオリゴ５及びオリゴ６（第１表）を用いて、原型−Ｄ
ＮＡとしてプラスミドｐＢＡＫ１６の使用下でＰＣＲを
用いて増幅させ、制限エンドヌクレアーゼＮｒｕＩ及び
ＮｃｏＩで分解した。
【０１１６】クレブシエラ−オキシトカ（Klebsiella o
xytoca）Ｍ５ａ１からのα−ＣＧＴａｓｅの構造遺伝子
の増幅のために、オリゴヌクレオチドのオリゴ７及びオ
リゴ８（第１表）を出発オリゴヌクレオチドとして使用
し、並びにプラスミドｐＣＭ１００（Binder et al. (1
986), Gene Vol 47, p. 269 - 277）を原型−ＤＮＡと
して使用した。増幅されたＤＮＡ断片を制限エンドヌク
レアーゼＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩを用いて分解した。
xytoca）Ｍ５ａ１からのα−ＣＧＴａｓｅの構造遺伝子
の増幅のために、オリゴヌクレオチドのオリゴ７及びオ
リゴ８（第１表）を出発オリゴヌクレオチドとして使用
し、並びにプラスミドｐＣＭ１００（Binder et al. (1
986), Gene Vol 47, p. 269 - 277）を原型−ＤＮＡと
して使用した。増幅されたＤＮＡ断片を制限エンドヌク
レアーゼＮｃｏＩ及びＥｃｏＲＩを用いて分解した。
【０１１７】両方のＰＣＲ−断片を、一緒に、ＮｒｕＩ
及びＥｃｏＲＩを用いて分解したベクターｐＪＦ１１８
ＨＥ中へ連結した（図９）。その際に得られたプラスミ
ドをｐＢＵＤ１００とした。
及びＥｃｏＲＩを用いて分解したベクターｐＪＦ１１８
ＨＥ中へ連結した（図９）。その際に得られたプラスミ
ドをｐＢＵＤ１００とした。
【０１１８】Ｂ） 指向性の突然変異誘発によるｐＢＵ
Ｄ２００の組立 ＮｃｏＩ−認識位置を介してｂｕｄＡ−プロモーター及
びα−ＣＧＴａｓｅ−構造遺伝子を連結させるためにｐ
ＢＵＤ１００の組立の際に生じた３つの点突然変異を、
ｐＢＵＤ１００上のα−ＣＧＴａｓｅ−遺伝子の有効な
翻訳を可能にするために復帰させた（図１０）。
Ｄ２００の組立 ＮｃｏＩ−認識位置を介してｂｕｄＡ−プロモーター及
びα−ＣＧＴａｓｅ−構造遺伝子を連結させるためにｐ
ＢＵＤ１００の組立の際に生じた３つの点突然変異を、
ｐＢＵＤ１００上のα−ＣＧＴａｓｅ−遺伝子の有効な
翻訳を可能にするために復帰させた（図１０）。
【０１１９】デング及びニコロフ（Deng & Nickoloff
(1992), Anal. Biochem. Vol. 200,p. 81 ff）による指
向性の突然変異誘発により突然変異誘発オリゴとしてオ
リゴ９（第１表）の使用下で、ＤＮＡ−配列をｂｕｄＡ
もしくはα−ＣＧＴａｓｅのオリジナル配列に関する移
行の範囲内で適合させた。突然変異誘発された塩基の位
置は図１０（Ｓｅｑ ＩＤ．Ｎｏ：５及び６）から推知
できる。この突然変異誘発されたプラスミドはｐＢＵＤ
２００とされた。
(1992), Anal. Biochem. Vol. 200,p. 81 ff）による指
向性の突然変異誘発により突然変異誘発オリゴとしてオ
リゴ９（第１表）の使用下で、ＤＮＡ−配列をｂｕｄＡ
もしくはα−ＣＧＴａｓｅのオリジナル配列に関する移
行の範囲内で適合させた。突然変異誘発された塩基の位
置は図１０（Ｓｅｑ ＩＤ．Ｎｏ：５及び６）から推知
できる。この突然変異誘発されたプラスミドはｐＢＵＤ
２００とされた。
【０１２０】例１８： α−ＣＧＴａｓｅ−活性の測定
のための酵素試験 ＣＧＴａｓｅの活性の測定は、カンドゥッシオ他（Cand
ussio et al. in Eur.J. Biochem. (1990) 191, S. 177
- 185）に記載された方法により行った。
のための酵素試験 ＣＧＴａｓｅの活性の測定は、カンドゥッシオ他（Cand
ussio et al. in Eur.J. Biochem. (1990) 191, S. 177
- 185）に記載された方法により行った。
【０１２１】デンプン１グラム当たりそれぞれ２単位の
試験すべきＣＧＴａｓｅを、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ２０ｍ
Ｍ ｐＨ７．２及びＣａＣｌ2 ５ｍＭからなる緩衝液
中の可溶性デンプン（Merck, Darmstadt）の５％（ｗ／
ｖ）の溶液と、４５℃で特定の時間インキュベートし
た。引き続き、この反応をメタノール１．５容量部の添
加により完了させた。未反応の残留デンプンを、４℃で
の１時間のインキュベートにより析出させ、遠心分離
（１０分、１２０００×ｇ）により分離した。得られた
生成物をヌクレオシル(Nukleosil 10-NH2)カラム（Mach
erey & Nagel, Dueren）でのＨＰＬＣにより測定し、そ
の際、特定のシクロデキストリン（Wacker-Chemie, Mue
nchen）を標準として用いた。
試験すべきＣＧＴａｓｅを、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ２０ｍ
Ｍ ｐＨ７．２及びＣａＣｌ2 ５ｍＭからなる緩衝液
中の可溶性デンプン（Merck, Darmstadt）の５％（ｗ／
ｖ）の溶液と、４５℃で特定の時間インキュベートし
た。引き続き、この反応をメタノール１．５容量部の添
加により完了させた。未反応の残留デンプンを、４℃で
の１時間のインキュベートにより析出させ、遠心分離
（１０分、１２０００×ｇ）により分離した。得られた
生成物をヌクレオシル(Nukleosil 10-NH2)カラム（Mach
erey & Nagel, Dueren）でのＨＰＬＣにより測定し、そ
の際、特定のシクロデキストリン（Wacker-Chemie, Mue
nchen）を標準として用いた。
【０１２２】例１９： E. coli ＷＣＭ１０５中でのプ
ラスミドｐＢＵＤ２００上のｂｕｄ−レギュレーター／
プロモーター系によるα−ＣＧＴａｓｅの発現 α−ＣＧＴａｓｅの酸素、ｐＨ値及び／又はアセテート
により制御可能な生産のために、例１６に記載された発
現プラスミドｐＢＵＤ２００をE. coli 分泌株（Sekret
ionsstamm）中へ形質転換した。この株は欧州特許（Ｅ
Ｐ３３８４１０）に記載されたようにE. coli ＤＳ４１
０から製造された。
ラスミドｐＢＵＤ２００上のｂｕｄ−レギュレーター／
プロモーター系によるα−ＣＧＴａｓｅの発現 α−ＣＧＴａｓｅの酸素、ｐＨ値及び／又はアセテート
により制御可能な生産のために、例１６に記載された発
現プラスミドｐＢＵＤ２００をE. coli 分泌株（Sekret
ionsstamm）中へ形質転換した。この株は欧州特許（Ｅ
Ｐ３３８４１０）に記載されたようにE. coli ＤＳ４１
０から製造された。
【０１２３】制御可能なα−ＣＧＴａｓｅ−生成物の検
出のために、リン酸カリウムで緩衝させた完全培地（ｐ
Ｈ６．５もしくはｐＨ８．０でのＴＧＹＥＰ；Begg et
al.(1977), FEMS Microbiol. Lett. Vol 2, p. 47 - 5
0）中で３７℃で、グルコース０．４％（ｗ／ｖ）及び
場合により４０ｍＭの酢酸ナトリウムの添加下で培養し
た。嫌気性の培養を、バラッハ及びボルフェ（Balach u
nd Wolfe (1976)）の技術により血清フラスコ中で行っ
た。０．８〜１．０の間のＯＤ６００の場合、細胞は遠
心分離により５０００×ｇで分離された。細胞不含の培
養上澄液を、例１５に記載したように、その中に含まれ
るα−ＣＧＴａｓｅ−活性の測定のために使用した。こ
の結果は第１２表にまとめた：
出のために、リン酸カリウムで緩衝させた完全培地（ｐ
Ｈ６．５もしくはｐＨ８．０でのＴＧＹＥＰ；Begg et
al.(1977), FEMS Microbiol. Lett. Vol 2, p. 47 - 5
0）中で３７℃で、グルコース０．４％（ｗ／ｖ）及び
場合により４０ｍＭの酢酸ナトリウムの添加下で培養し
た。嫌気性の培養を、バラッハ及びボルフェ（Balach u
nd Wolfe (1976)）の技術により血清フラスコ中で行っ
た。０．８〜１．０の間のＯＤ６００の場合、細胞は遠
心分離により５０００×ｇで分離された。細胞不含の培
養上澄液を、例１５に記載したように、その中に含まれ
るα−ＣＧＴａｓｅ−活性の測定のために使用した。こ
の結果は第１２表にまとめた：
【０１２４】
【表１２】
【０１２５】配列表 配列番号：１（Seq ID No: 1） （Ａ） 配列の長さ：２９０アミノ酸 （Ｂ） 配列の型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数： （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：タンパク質 起源： （Ａ） 微生物：クレブシエラ−テリゲナ（Klebsiella
terigena） （Ｂ） 株：ＤＳＭ２８６７ 配列：Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ： １
terigena） （Ｂ） 株：ＤＳＭ２８６７ 配列：Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ： １
【０１２６】
【外１２】
【０１２７】
【外１３】
【０１２８】配列番号：２（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：
２） （Ａ） 配列の長さ：１４５３塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：２本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ 起源： （Ａ） 微生物：クレブシエラ−テリゲナ（Klebsiella
terigena） （Ｂ） 株：ＤＳＭ２８６７ 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＡＫ１４／１６ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 2
２） （Ａ） 配列の長さ：１４５３塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：２本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ 起源： （Ａ） 微生物：クレブシエラ−テリゲナ（Klebsiella
terigena） （Ｂ） 株：ＤＳＭ２８６７ 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＡＫ１４／１６ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 2
【０１２９】
【外１４】
【０１３０】
【外１５】
【０１３１】配列番号：３（Seq ID No: 3） （Ａ） 配列の長さ：３９塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：２本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＴＬ１４２及びｐＲＢＬ２ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ： ３
【０１３２】
【外１６】
【０１３３】配列番号：４（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：
４） （Ａ） 配列の長さ：１３アミノ酸 （Ｂ） 配列の型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数： （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ペプチド 断片の種類：線状断片 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＴＬ１４２及びｐＲＢＬ２ 配列：Seq ID No: 4
４） （Ａ） 配列の長さ：１３アミノ酸 （Ｂ） 配列の型：アミノ酸 （Ｃ） 鎖の数： （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ペプチド 断片の種類：線状断片 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＴＬ１４２及びｐＲＢＬ２ 配列：Seq ID No: 4
【０１３４】
【外１７】
【０１３５】配列番号：５（Seq ID No: 5） （Ａ） 配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：２本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＵＤ１００ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 5
【０１３６】
【外１８】
【０１３７】配列番号：６（Seq ID No: 6） （Ａ） 配列の長さ：２９塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：２本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：ゲノム−ＤＮＡ 直接の起源： （Ｂ） クローン：ｐＢＵＤ２００ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 6
【０１３８】
【外１９】
【０１３９】配列番号：７（Seq ID No: 7） （Ａ） 配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類： 他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ１ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 7
【０１４０】
【外２０】
【０１４１】配列番号：８（Seq ID No: 8） （Ａ） 配列の長さ：２５塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ２ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 8
【０１４２】
【外２１】
【０１４３】配列番号：９（Seq ID No: 9） （Ａ） 配列の長さ：３３塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ３ 配列：Seq ID No: 9
【０１４４】
【外２２】
【０１４５】配列番号：１０（Seq ID No: 10） （Ａ） 配列の長さ：１０塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ４ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ： １０
【０１４６】
【外２３】
【０１４７】配列番号：１１（Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ：
１１） （Ａ） 配列の長さ：４３塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ５ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 11
１１） （Ａ） 配列の長さ：４３塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ５ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 11
【０１４８】
【外２４】
【０１４９】配列番号：１２（Seq ID No: 12） （Ａ） 配列の長さ：３７塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ６ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 12
【０１５０】
【外２５】
【０１５１】配列番号：１３（Seq ID No: 13） （Ａ） 配列の長さ：４０塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ７ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 13
【０１５２】
【外２６】
【０１５３】配列番号：１４（Seq ID No: 14） （Ａ） 配列の長さ：４１塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ８ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Seq ID No: 14
【０１５４】
【外２７】
【０１５５】配列番号：１５（Seq ID No: 15） （Ａ） 配列の長さ：３６塩基対 （Ｂ） 配列の型：ヌクレオチド （Ｃ） 鎖の数：１本鎖 （Ｄ） トポロジー：線状 配列の種類：他の核酸 （Ａ） 記載：／ｄｅｓｃ＝「合成ＤＮＡ」 直接の起源： （Ｂ） クローン：オリゴ９ ゲノム中の位置： （Ｃ） 単位：ｂｐ 配列：Ｓｅｑ ＩＤ Ｎｏ： １５
【０１５６】
【外２８】
【図１】ｐＢＵ１のプラスミドマップ
【図２】ｐＢＴＬ１４２のプラスミドマップ
【図３】ｐＢＴＬ１４２及びｐＲＢＬ２上のｂｕｄＡ′
−ｌａｃＺ′−転写位置のヌクレオチド配列（Ｓｅｑ
ＩＤ−Ｎｏ：３）及びアミノ酸配列（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎ
ｏ：４）
−ｌａｃＺ′−転写位置のヌクレオチド配列（Ｓｅｑ
ＩＤ−Ｎｏ：３）及びアミノ酸配列（Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎ
ｏ：４）
【図４】ｐＢＡＫ１のプラスミドマップ
【図５】ｐＢＡＫ１４のプラスミドマップ
【図６】ｐＢＡＫ１６のプラスミドマップ
【図７】Ａ クレブシエラ−テリゲナ（ＤＳＭ２６８
７）のゲノム中のｂｕｄ−領域の遺伝子の大きさ及び相
対的オリエンテーション（ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｏｒｉｅ
ｎｔｉｅｒｕｎｇ） Ｂ ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１６上に含まれるＤＮＡ
−断片 Ｃ クレブシエラ−ＤＮＡのＰＣＲ−増幅のために使用
されるオリゴヌクレオチドの位置（例１及び１０参照）
７）のゲノム中のｂｕｄ−領域の遺伝子の大きさ及び相
対的オリエンテーション（ｒｅｌａｔｉｖｅ Ｏｒｉｅ
ｎｔｉｅｒｕｎｇ） Ｂ ｐＢＡＫ１４及びｐＢＡＫ１６上に含まれるＤＮＡ
−断片 Ｃ クレブシエラ−ＤＮＡのＰＣＲ−増幅のために使用
されるオリゴヌクレオチドの位置（例１及び１０参照）
【図８】ｐＲＢＬ２のプラスミドマップ
【図９】ｐＢＵＤ１００の組立（例１７参照）
【図１０】指向性の突然変異誘発の前（ｐＢＵＤ１０
０；Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：５）及び後（ｐＢＵＤ２０
０；Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：６）のｂｕｄ−ＤＮＡ−ＣＧ
Ｔａｓｅ−構造遺伝子の転写範囲に関するヌクレオチド
配列
０；Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：５）及び後（ｐＢＵＤ２０
０；Ｓｅｑ ＩＤ−Ｎｏ：６）のｂｕｄ−ＤＮＡ−ＣＧ
Ｔａｓｅ−構造遺伝子の転写範囲に関するヌクレオチド
配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:22） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:22） (72)発明者 フェレーナ シュレンゾーク ドイツ連邦共和国 イスマニング オス カル−メスター−シュトラーセ ７ (72)発明者 アントン カンドゥシオ ドイツ連邦共和国 ミュンヘン ザンク ト−アウグスティヌス−シュトラーセ 69 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ)
Claims (11)
- 【請求項１】 トランス作用調節タンパク質及びそのタ
ンパク質により活性化可能なプロモーターを包含する、
アセテート、ｐＨ値及び酸素により制御可能な発現系に
おいて、調節タンパク質が、Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：１ 【外１】 【外２】 のアミノ酸配列を包含し、プロモーターはＤＮＡ−配列
Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：２ 【外３】 【外４】 の塩基３１５〜３９７までであるＤＮＡ−配列を包含す
ることを特徴とする制御可能な発現系。 - 【請求項２】 任意の構造遺伝子を発現系の制御下で０
〜５％の酸素部分圧ｐＯ２、６．０〜６．５のｐＨ値及
び４０〜６０ｍＭの濃度のアセテートの存在で最大に発
現する請求項１記載の制御可能な発現系。 - 【請求項３】 酸素制限で、アセテートの存在で、及び
ｐＨ６．０〜ｐＨ６．５の育成培地のｐＨ値で、クレブ
シエラ−テリゲナ（ＤＳＭ２６８７）からのｂｕｄ−プ
ロモーターの最適な活性化が生じることを特徴とする調
節タンパク質。 - 【請求項４】 Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ．１ 【外５】 【外６】 のアミノ酸配列を包含する請求項３記載の調節タンパク
質。 - 【請求項５】 請求項３又は４記載のタンパク質につい
てコードする遺伝子。 - 【請求項６】 Ｓｅｑ．ＩＤ−Ｎｏ：２ 【外７】 【外８】 の塩基３１５〜３９７までであるＤＮＡ−配列を包含す
るプロモーターが、発現すべき異種タンパク質の構造遺
伝子と機能的に結合していることを特徴とする発現カセ
ット。 - 【請求項７】 請求項６記載の少なくとも１種の発現カ
セットを含有する微生物。 - 【請求項８】 請求項１記載の少なくとも１種の発現系
を含有する微生物。 - 【請求項９】 請求項７又は８記載の微生物を使用する
ことを特徴とする微生物を用いてタンパク質を製造する
ための発酵方法。 - 【請求項１０】 任意の微生物中へ場合により請求項４
又は５記載の調節タンパク質についての少なくとも１種
の遺伝子及び／又は場合により請求項７記載の少なくと
も１種の発現カセットが導入されることを特徴とする請
求項８記載の微生物の製造方法。 - 【請求項１１】 Ｆｎｒ陰性微生物である請求項１記載
の発現系のための宿主株。
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